изменение состава клеточных популяций и уровня

Реклама
2010
ÖÈÒÎËÎÃÈß
Ò î ì 52, ¹ 2
ÈÇÌÅÍÅÍÈÅ ÑÎÑÒÀÂÀ ÊËÅÒÎ×ÍÛÕ ÏÎÏÓËßÖÈÉ
È ÓÐÎÂÍß ÀÊÒÈÂÍÛÕ ÔÎÐÌ ÊÈÑËÎÐÎÄÀ Â ÊÐÎÂÈ
È Â ÀÑÖÈÒÈ×ÅÑÊÎÉ ÆÈÄÊÎÑÒÈ ÎÏÓÕÎËÅÍÎÑÈÒÅËß
© Þ. Â. Øàòàëèí,1, 2 À. À. Íàóìîâ,1 Ì. Ì. Ïîöåëóåâà1, 2,*
Þ. Â. Øàòàëèí, À. À. Íàóìîâ, Ì. Ì. Ïîöåëóåâà
Èçìåíåíèå ñîñòàâà êëåòî÷íûõ ïîïóëÿöèé è óðîâíÿ àêòèâíûõ ôîðì êèñëîðîäà
1
Èíñòèòóò òåîðåòè÷åñêîé è ýêñïåðèìåíòàëüíîé áèîôèçèêè ÐÀÍ, Ïóùèíî, Ìîñêîâñêàÿ îáë.,
è 2 Ïóùèíñêèé ãîñóäàðñòâåííûé óíèâåðñèòåò;
* ýëåêòðîííûé àäðåñ: [email protected]
Íà ìîäåëè òðàíñïëàíòèðîâàííîé àñöèòíîé ãåïàòîìû Çàéäåëÿ ïðîâåëè äåòàëüíîå èññëåäîâàíèå èçìåíåíèé ñîñòàâà êëåòî÷íîé ïîïóëÿöèè è óðîâíÿ àêòèâíûõ ôîðì êèñëîðîäà (ÀÔÊ) â çîíå ðîñòà îïóõîëè
è â ïëàçìå êðîâè îïóõîëåíîñèòåëÿ. Óñòàíîâëåíî, ÷òî â ïëàçìå êðîâè è â çîíå ðîñòà îïóõîëè ñêëàäûâàþòñÿ ðàçëè÷íûå îêèñëèòåëüíî-âîññòàíîâèòåëüíûå óñëîâèÿ. Òàê, â ïëàçìå êðîâè èç-çà ãèïåðàêòèâíîñòè ëåéêîöèòîâ è ðîñòà èõ ÷èñëà ðàçâèâàåòñÿ ñèëüíûé îêèñëèòåëüíûé ñòðåññ, ñîïðÿæåííûé ñ ïîðàæåíèåì çäîðîâûõ êëåòîê, à ñ äðóãîé ñòîðîíû, â çîíå ðîñòà îïóõîëè íàáëþäàåòñÿ óìåíüøåíèå êîíöåíòðàöèè ìàêðîôàãîâ, êèñëîðîäà è óðîâíÿ ÀÔÊ. Òàêèå óñëîâèÿ ñïîñîáñòâóþò èíòåíñèâíîìó ðîñòó îïóõîëåâûõ êëåòîê.
Ê ë þ ÷ å â û å ñ ë î â à: ïîëèìîðôíîÿäåðíûå ëåéêîöèòû, òó÷íûå êëåòêè, ìàêðîôàãè, ãèñòàìèí, îêèñëèòåëüíûé ñòðåññ.
Ï ð è í ÿ ò û å ñ î ê ð à ù å í è ÿ: ÀÔÊ — àêòèâíûå ôîðìû êèñëîðîäà, ÏÌßË — ïîëèìîðôíîÿäåðíûå
ëåéêîöèòû, ÕË — õåìèëþìèíåñöåíöèÿ, PBS — ôîñôàòíî-ñîëåâîé áóôåðíûé ðàñòâîð.
Èçâåñòíî, ÷òî äåéñòâèþ ñèñòåìû åñòåñòâåííîé ðåçèñòåíòíîñòè èëè âðîæäåííîãî èììóíèòåòà ïîäâåðæåíû
áàêòåðèè, âèðóñû, à òàêæå ïîâðåæäåííûå, ìóòàíòíûå,
ñòàðåþùèå è îïóõîëåâûå êëåòêè. Àðñåíàë ñðåäñòâ çàùèòû, èñïîëüçóåìûõ îðãàíèçìîì, âêëþ÷àåò â ñåáÿ êàê êëåòî÷íûå, òàê è ãóìîðàëüíûå ôàêòîðû. Òàê, â ïåðâîî÷åðåäíóþ ðåàêöèþ íà ïîÿâëåíèå îïóõîëåâûõ êëåòîê ïîìèìî
íàòóðàëüíûõ êèëëåðíûõ êëåòîê âîâëåêàþòñÿ ãëàâíûì îáðàçîì ìàêðîôàãè, ìîíîöèòû è íåéòðîôèëû, îáëàäàþùèå öèòîòîêñè÷åñêîé è èììóíîñóïðåññîðíîé àêòèâíîñòüþ (Swann, 2007). Èìåþùèåñÿ â ëèòåðàòóðå äàííûå è
èññëåäîâàíèÿ íàøåé ëàáîðàòîðèè ïîçâîëÿþò óòâåðæäàòü,
÷òî ôàãîöèòû (ÏÌßË è ìàêðîôàãè), îäíè èç îñíîâíûõ
êîìïîíåíòîâ íåñïåöèôè÷åñêîãî èììóíèòåòà, âîâëå÷åíû
â çàùèòíûå ìåõàíèçìû îðãàíèçìà, êîòîðûå àêòèâèðóþòñÿ
ïðè ðàçâèòèè îïóõîëè (Ackermann, 1989; Kok et al., 1990;
Pustovidko et al., 2000). Ýòà çàùèòà îñóùåñòâëÿåòñÿ ïðåèìóùåñòâåííî ïóòåì íàðàáîòêè è (èëè) ñåêðåöèè ôàãîöèòèðóþùèìè êëåòêàìè ðàçëè÷íûõ ñîåäèíåíèé — ôåðìåíòîâ è õèìè÷åñêè àêòèâíûõ íèçêîìîëåêóëÿðíûõ ñîåäèíåíèé, íàöåëåííûõ íà ðàçðóøåíèå îïóõîëåâûõ
êëåòîê îðãàíèçìà. Ýòè ýôôåêòîðíûå êëåòêè îñóùåñòâëÿþò ñâîþ ðàçðóøèòåëüíóþ ôóíêöèþ áëàãîäàðÿ îáðàçîâàíèþ àêòèâíûõ ôîðì êèñëîðîäà (ÀÔÊ) âî âíåêëåòî÷íîé
ñðåäå — â ïëàçìå êðîâè, â àñöèòå è ìåæòêàíåâîì ïðîñòðàíñòâå.
Ðàíåå íàìè áûëè îáíàðóæåíû ðåçêèå èçìåíåíèÿ â
ñïîñîáíîñòè ïîëèìîðôíîÿäåðíûõ ëåéêîöèòîâ êðîâè
(ÏÌßË) ïðîäóöèðîâàòü ÀÔÊ â ïðîöåññå ðàçâèòèÿ òðàíñïëàíòèðîâàííîé îïóõîëè (Ïîöåëóåâà è äð., 2005). Íà ïåð-
âîé ñòàäèè ýòà ñïîñîáíîñòü ñëåãêà ñíèæåíà, à â
äàëüíåéøåì ìíîãîêðàòíî óñèëèâàåòñÿ. Îäíàêî ýòî íå âåäåò ê ãèáåëè îïóõîëåâûõ êëåòîê. Ñîçäàþòñÿ óñëîâèÿ, ïðè
êîòîðûõ îïóõîëåâàÿ êëåòêà íà÷èíàåò ðàçìíîæàòüñÿ.  íàñòîÿùåå âðåìÿ âîïðîñ î ìåõàíèçìàõ âçàèìîîòíîøåíèÿ
ýôôåêòîðíûõ è îïóõîëåâûõ êëåòîê íà âñåõ ôàçàõ îïóõîëåâîãî ðîñòà îñòàåòñÿ îòêðûòûì. ×òîáû ïðèáëèçèòüñÿ ê
ðåøåíèþ ýòîãî âîïðîñà, íåîáõîäèìî îõàðàêòåðèçîâàòü
óñëîâèÿ, êîòîðûå âîçíèêàþò â îðãàíèçìå îïóõîëåíîñèòåëÿ.  ñâÿçè ñ ýòèì áûëè èññëåäîâàíû äèíàìè÷åñêèå èçìåíåíèÿ ñîñòàâà êëåòî÷íûõ ïîïóëÿöèé, èõ àêòèâíîñòü è
óðîâåíü îêèñëèòåëüíîãî ñòðåññà â çîíå ðîñòà îïóõîëè è â
ïëàçìå êðîâè îïóõîëåíîñèòåëÿ.
Ìàòåðèàë è ìåòîäèêà
 ðàáîòå èñïîëüçîâàëè b-ãëþêîçó, ëþìèíîë, ôîðáîë-12-ìèðèñòàò-13-àöåòàò (ÔÌÀ), ñðåäó RPMI-1640,
HEPES, Percoll, TRIS-HCl, ôèêîëë, âåðîãðàôèí (ÀãàòÌåä, Ðîññèÿ), ãåïàðèí (Ñïîôà, Ïðàãà), Na2HPO4, NaH2PO4, NaCl, êðàñèòåëü Ðîìàíîâñêîãî, òðèïàíîâûé ñèíèé
(ÄèàÊîí, Ðîññèÿ) è äèãèäðîêâåðöèòèí (ÈÁÏ ÐÀÍ, Ðîññèÿ).
Î á ú å ê ò î ì èññëåäîâàíèÿ ñëóæèëà ìîäåëü ðàçâèòèÿ
àñöèòíîé ãåïàòîìû Çàéäåëÿ. Ìîäåëü ðàçâèòèÿ àñöèòíûõ
îïóõîëåé óäîáíà äëÿ èññëåäîâàíèÿ âçàèìîäåéñòâèÿ êëåòîê íåñïåöèôè÷åñêîãî èììóíèòåòà è ðàçâèâàþùåéñÿ îïóõîëè.  ýêñïåðèìåíòàõ in vivo èñïîëüçîâàëè êðûñ-ñàìöîâ
ëèíèè Âèñòàð ìàññîé 200—220 ã.
131
132
Þ. Â. Øàòàëèí, À. À. Íàóìîâ, Ì. Ì. Ïîöåëóåâà
Êëåòêè ãåïàòîìû Çàéäåëÿ (ÀÃÇ) ò ð à í ñ ï ë à í ò è ð îë è â áðþøíóþ ïîëîñòü æèâîòíîãî ïóòåì ââåäåíèÿ 1 ìë
ðåñóñïåíäèðîâàííûõ â ñîëåâîì áóôåðå êëåòîê â êîíöåíòðàöèè 1$107 êë./ìë. Ïðîäîëæèòåëüíîñòü æèçíè æèâîòíîãî ñ òðàíñïëàíòèðîâàííîé îïóõîëüþ ñîñòàâëÿëà
12—14 ñóò.
Âûäåëåíèå êëåòîê è àíàëèç êëåòî÷íûõ
ï î ï ó ë ÿ ö èé. Íåéòðîôèëû èç öèðêóëèðóþùåé êðîâè
êðûñ âûäåëÿëè ïî ìåòîäó Ëîáàøåâñêîãî (1983) â ãðàäèåíòå ïëîòíîñòè ôèêîëë-âåðîãðàôèíà. Ìàêðîôàãè è êëåòêè
ãåïàòîìû Çàéäåëÿ èç àñöèòè÷åñêîé æèäêîñòè ðàçäåëÿëè
íà ãðàäèåíòå ïëîòíîñòè Percoll-NaCl íà ãðàíèöå ïëîòíîñòè 1.116 è 1.070 ã/ìë ñîîòâåòñòâåííî. Ñîäåðæàíèå ìàêðîôàãîâ âî ôðàêöèè ñîñòàâëÿëî 90—95 %.
Ñîñòàâ êëåòî÷íûõ ïîïóëÿöèé â êðîâè îïðåäåëÿëè ïî
ìàçêàì, îêðàøåííûì Àçóðîì II—ýîçèíîì ïî ìåòîäó Ðîìàíîâñêîãî (Ìåíüøèêîâ, 1987), è íà ãåìàòîëîãè÷åñêîì
àíàëèçàòîðå êðîâè (Coulter A T8, Beckman). Ñîñòàâ êëåòî÷íîé ïîïóëÿöèè â àñöèòè÷åñêîé æèäêîñòè îïðåäåëÿëè
ïî ìàçêàì, îêðàøèâàÿ ïðåïàðàòû ïî ìåòîäó Ïàïïåíãåéìà
(Ñåì÷åíêî è äð., 2006) è öèòîìåòðè÷åñêèì ìåòîäîì ïî
ñâåòîðàññåèâàíèþ (Partec PAS III, Ãåðìàíèÿ). Àíàëèç ïîïóëÿöèé êëåòîê ïî ðàçìåðàì, ãðàíóëÿðíîñòè è ôàçàì êëåòî÷íîãî öèêëà ïðîâîäèëè ìåòîäîì ïðîòî÷íîé öèòîìåòðèè íà ïðîòî÷íîì öèòîôëóîðèìåòðå Partec PAS III (Partec,
Ãåðìàíèÿ).
Î ï ð å ä å ë å í è å ï à ð à ì å ò ð î â î ê è ñ ë è ò å ë ü í îã î ñ ò ð å ñ ñ à â ê ð î â è è à ñ ö è ò è ÷ å ñ ê î é æ è ä ê î ñ ò è.
Óðîâåíü ÀÔÊ â àñöèòè÷åñêîé æèäêîñòè îïðåäåëÿëè ìåòîäîì õåìèëþìèíåñöåíöèè (ÕË). Äëÿ ýòîãî â êþâåòó
ñ äîáàâêîé ëþìèíîëà (0.125 ìêÌ) ïîìåùàëè 0.5 ìë ñâåæåîòîáðàííîé àñöèòè÷åñêîé æèäêîñòè è ðåãèñòðèðîâàëè óðîâåíü ÕË-ñèãíàëà â òå÷åíèå 10 ìèí. Äëÿ ïîñòðîåíèÿ êàëèáðîâî÷íîé êðèâîé ê îáðàçöó àñöèòè÷åñêîé æèäêîñòè (0.5 ìë) âíîñèëè 100 ìêë 4%-íîãî ãëóòàðàëüäåãèäà
ñ öåëüþ èíãèáèðîâàíèÿ ÀÔÊ-ãåíåðèðóþùåé àêòèâíîñòè
ôàãîöèòîâ. ×åðåç 10 ìèí ê îáðàçöó äîáàâëÿëè ëþìèíîë
(250 ìêÌ) è ðåãèñòðèðîâàëè ÕË-îòâåò. Äëÿ íîðìèðîâàíèÿ îòâåòà ê àñöèòè÷åñêîé æèäêîñòè äîáàâëÿëè ðàñòâîð
H2O2 â äèàïàçîíå êîíöåíòðàöèé 1 íÌ—1 ìêÌ. Êàëèáðîâî÷íûå çíà÷åíèÿ èñïîëüçîâàëè äëÿ ñîïîñòàâëåíèÿ ñ ýêñïåðèìåíòàëüíûìè çíà÷åíèÿìè.
Óðîâåíü ÀÔÊ â êðîâè îïðåäåëÿëè ôëóîðåñöåíòíûì
ìåòîäîì ñ èñïîëüçîâàíèåì â êà÷åñòâå çîíäà AmplexRed.
Îáðàçåö êðîâè îáúåìîì 1 ìë ôèêñèðîâàëè 4%-íûì ãëóòàðàëüäåãèäîì, äîáàâëÿëè ôëóîðåñöåíòíûé çîíä â êîíöåíòðàöèè 10 ìêÌ, çàòåì èíêóáèðîâàëè ïðè 37 °Ñ â òå÷åíèå 1
èëè 2 ÷. Ôëóîðåñöåíöèþ îáðàçöîâ ïëàçìû êðîâè ðåãèñòðèðîâàëè ïðè 570 íì (Mohanty et al., 1997).
Ðèñ. 1. Èçìåíåíèå êîíöåíòðàöèè ëåéêîöèòîâ â êðîâè æèâîòíîãî â ïðîöåññå ðàçâèòèÿ îïóõîëè.
Ïðèâåäåíû ñðåäíèå çíà÷åíèÿ è èõ ñðåäíåñòàòèñòè÷åñêèå îòêëîíåíèÿ,
÷èñëî ýêñïåðèìåíòîâ è êîýôôèöèåíò Ñòüþäåíòà (X ± Sx, n = 8, P < 0.05).
Êðèâàÿ 1 — èçìåíåíèå êîíöåíòðàöèè íåéòðîôèëîâ, êðèâàÿ 2 — ìîíîöèòîâ, êðèâàÿ 3 — ýîçèíîôèëîâ, êðèâàÿ 4 — áàçîôèëîâ â ïëàçìå.
ñ ýòèì ìû èññëåäîâàëè äèíàìèêó ÷èñëåííîñòè ëåéêîöèòîâ êðîâè â ïðîöåññå ðàçâèòèÿ ãåïàòîìû Çàéäåëÿ â îðãàíèçìå æèâîòíîãî. Êàê âèäíî íà ðèñ. 1, ðàçâèòèå îïóõîëè
ñîïðîâîæäàåòñÿ ïîâûøåíèåì â êðîâè óðîâíÿ íåéòðîôèëîâ (â 6—7 ðàç) è ìîíîöèòîâ (â 4—5 ðàç), â òî âðåìÿ êàê
êîíöåíòðàöèÿ áàçîôèëîâ è ýîçèíîôèëîâ ïðàêòè÷åñêè íå
èçìåíÿåòñÿ. Ïîäîáíîå èçìåíåíèå ÷èñëà ëåéêîöèòîâ â êðîâè ãîâîðèò îá óñèëåíèè èììóííîé ðåàêöèè â ïðîöåññå
ðàçâèòèÿ îïóõîëè, ÷òî ñîãëàñóåòñÿ ñ äàííûìè, ïîëó÷åííûìè ðÿäîì àâòîðîâ ïðè èññëåäîâàíèè äðóãèõ âèäîâ îïóõîëåé (Ïîöåëóåâà è äð., 1999).  íàñòîÿùåå âðåìÿ ïðè÷èíû, ïðèâîäÿùèå ê óâåëè÷åíèþ ÷èñëà ÏÌßË ó æèâîòíûõ-îïóõîëåíîñèòåëåé, íåÿñíû. Ìîæíî ïîëàãàòü, ÷òî
òàêîé ïðè÷èíîé ìîæåò áûòü óâåëè÷åíèå óðîâíÿ ãåìàòîïîýòè÷åñêîãî ôàêòîðà ðîñòà G-CSF èëè GM-CSF, ïîñêîëüêó
ïîêàçàíà êîððåëÿöèÿ ÷èñëà ëåéêîöèòîâ è óðîâíÿ G-CSF â
öèðêóëèðóþùåé êðîâè (Chen et al., 2000). Ñëåäóåò îòìåòèòü, ÷òî ãåìàòîïîýòè÷åñêèå ôàêòîðû ðîñòà ìîãóò íå
Ðåçóëüòàòû è îáñóæäåíèå
Äëÿ îïèñàíèÿ ïðîöåññîâ, ïðîòåêàþùèõ â êðîâè è â
àñöèòè÷åñêîé æèäêîñòè, âåñü ïåðèîä ðàçâèòèÿ îïóõîëè
óäîáíî ðàçäåëèòü íà 3 ôàçû: íà÷àëüíóþ (èëè ïåðâóþ,
1—4 ñóò), âòîðóþ (5—8 ñóò) è òðåòüþ (èëè òåðìèíàëüíóþ
ôàçó, 9—12 ñóò). Ýòèìè ôàçàìè ìû è áóäåì îïåðèðîâàòü
äàëåå.
Èçìåíåíèå ñîñòàâà ôðàêöèè ëåéêîöèòîâ
â ê ð î â è î ï ó õ î ë å í î ñ è ò å ë ÿ. Ðàçâèòèå îïóõîëåâîãî
ïðîöåññà â îðãàíèçìå ñîïðîâîæäàåòñÿ êëåòî÷íûìè è ãóìîðàëüíûìû ðåàêöèÿìè íåñïåöèôè÷åñêîãî èììóííîãî
îòâåòà.  ÷àñòíîñòè, íàáëþäàåòñÿ èçìåíåíèå àêòèâíîñòè,
÷èñëåííîñòè è ëîêàëèçàöèè ýôôåêòîðíûõ êëåòîê.  ñâÿçè
Ðèñ. 2. Èçìåíåíèå êîíöåíòðàöèè ýðèòðîöèòîâ, ãåìîãëîáèíà è
âåëè÷èíû ãåìàòîêðèòà â êðîâè â ïðîöåññå ðàçâèòèÿ îïóõîëè.
Êðèâàÿ 1 — èçìåíåíèå ñîäåðæàíèÿ ãåìîãëîáèíà â ýðèòðîöèòàõ, êðèâàÿ
2 — ãåìàòîêðèò, %, êðèâàÿ 3 — èçìåíåíèå ÷èñëà ýðèòðîöèòîâ.
Èçìåíåíèå ñîñòàâà êëåòî÷íûõ ïîïóëÿöèé è óðîâíÿ àêòèâíûõ ôîðì êèñëîðîäà
133
Ðèñ. 3. Èçìåíåíèå îáúåìà àñöèòè÷åñêîé æèäêîñòè, ÷èñëà ðàçíûõ êëåòîê è ïðîäóöèðóåìîãî ãèñòàìèíà â çîíå ðîñòà îïóõîëè â îðãàíèçìå îïóõîëåíîñèòåëÿ.
à — äèíàìèêà ðîñòà îïóõîëåâûõ êëåòîê (1), îáúåìà àñöèòè÷åñêîé æèäêîñòè (2) è èçìåíåíèÿ ÷èñëà ëèìôîöèòîâ (3); á — èçìåíåíèå êîíöåíòðàöèè ìàêðîôàãîâ (1), äèíàìèêà êîíöåíòðàöèè ãèñòàìèíà (2), òó÷íûõ êëåòîê (3) è êîíöåíòðàöèè äåãðàíóëèðóþùèõ òó÷íûõ êëåòîê (4).
òîëüêî óâåëè÷èâàòü ÷èñëî ÏÌßË, íî è îêàçûâàòü ïðÿìîå
âëèÿíèå íà ôóíêöèè ëåéêîöèòîâ ïóòåì ïðàéìèðîâàíèÿ èõ
ÀÔÊ-ãåíåðèðóþùåé àêòèâíîñòè. Íàìè òàêæå îáíàðóæåíî (ðèñ. 2) ñíèæåíèå êîíöåíòðàöèè ýðèòðîöèòîâ â êðîâè,
êîíöåíòðàöèè â íèõ ãåìîãëîáèíà è ñíèæåíèå âåëè÷èíû
ãåìàòîêðèòà â ïðîöåññå ðîñòà îïóõîëè. Ðàçâèòèå àíåìèè â
ïðîöåññå ðîñòà îïóõîëè íàáëþäàåòñÿ òàêæå ïðè íåêîòîðûõ îïóõîëåâûõ çàáîëåâàíèÿõ ÷åëîâåêà è ïîñëå ëó÷åâîé
òåðàïèè (Áðåäåð è äð., 2002).
Èçìåíåíèå ñîñòàâà êëåòî÷íûõ ïîïóëÿöèé àñöèòè÷åñêîé æèäêîñòè â õîäå ðîñòà
î ï ó õ î ë è â á ð þ ø í î é ï î ë î ñ ò è æ è â î ò í î ã î. Â ëèòåðàòóðå îïèñàíî óñèëåíèå ìèãðàöèè ìàêðîôàãîâ (Knowles, Harris, 2007), ëèìôîöèòîâ (Yamaki et al., 1990) è
òó÷íûõ êëåòîê (Ch’ng, 2006) â çîíó ðîñòà ñîëèäíûõ îïóõîëåé. Îäíàêî ìû íå îáíàðóæèëè â ëèòåðàòóðå èññëåäî-
âàíèé, ïîñâÿùåííûõ èçó÷åíèþ äèíàìè÷åñêèõ èçìåíåíèé
÷èñëåííîñòè êëåòî÷íûõ ïîïóëÿöèé â àñöèòå. Îöåíêà ñîîòíîøåíèÿ ìåæäó ýôôåêòîðíûìè è îïóõîëåâûìè êëåòêàìè â àñöèòå íåîáõîäèìà äëÿ âûÿâëåíèÿ èíòåíñèâíîñòè
èììóííîé ðåàêöèè íà ðîñò îïóõîëè â îðãàíèçìå.
Äèíàìèêà èçìåíåíèÿ êîíöåíòðàöèè îïóõîëåâûõ êëåòîê â àñöèòå (ðèñ. 3, à) èìååò îáû÷íûé âèä êðèâîé ñ íàñûùåíèåì è ñ ìàêñèìàëüíîé ñêîðîñòüþ ðîñòà âî âòîðîé
ôàçå ðàçâèòèÿ îïóõîëè. Ïðîöåññ âîçðàñòàíèÿ ÷èñëà îïóõîëåâûõ êëåòîê ñîïðîâîæäàåòñÿ óâåëè÷åíèåì îáúåìà
àñöèòè÷åñêîé æèäêîñòè, êîòîðûé ìîæåò äîñòèãàòü
100—110 ìë. Ìàêðîôàãè è òó÷íûå êëåòêè ìèãðèðóþò â
çîíó ðîñòà îïóõîëè èç áëèçëåæàùèõ òêàíåé. Íàêîïëåíèå
ìàêðîôàãîâ â àñöèòå (ðèñ. 3, á) íà÷èíàåòñÿ ïðàêòè÷åñêè
îäíîâðåìåííî ñ óâåëè÷åíèåì êîëè÷åñòâà îïóõîëåâûõ
êëåòîê, äîñòèãàÿ ìàêñèìóìà â ïåðâîé ôàçå ðàçâèòèÿ îïó-
Ðèñ. 4. Ôèêñèðîâàííûé ïðåïàðàò àñöèòè÷åñêîé æèäêîñòè (à), îêðàøåííûé ïî Ïàïåíãåìó.
à: 1 — òó÷íûå êëåòêè, 2 — ëèìôîöèòû, 3 — îïóõîëåâûå êëåòêè; á — ïðîöåññ äåãðàíóëÿöèè ïîïóëÿöèè òó÷íûõ êëåòîê ñ ìàêñèìóìîì íà 5—7-å ñóò:
1 — òó÷íûå êëåòêè, 2 — ïðîöåññ äåãðàíóëÿöèè òó÷íûõ êëåòîê, 3 — îïóõîëåâûå êëåòêè.
134
Þ. Â. Øàòàëèí, À. À. Íàóìîâ, Ì. Ì. Ïîöåëóåâà
Ðèñ. 5. Èçìåíåíèå óðîâíÿ àêòèâíûõ ôîðì êèñëîðîäà â ïëàçìå êðîâè (à) è àñöèòå (á) â ïðîöåññå ðàçâèòèÿ îïóõîëè â áðþøíîé ïîëîñòè æèâîòíîãî.
Ïðèâåäåíû ñðåäíèå çíà÷åíèÿ è èõ ñðåäíåñòàòèñòè÷åñêèå îòêëîíåíèÿ, ÷èñëî ýêñïåðèìåíòîâ è êîýôôèöèåíò Ñòüþäåíòà (X ± Sx, n = 7, P < 0.05).
õîëè (~500 òûñ. êë./ìë), à çàòåì ìîíîòîííî ñíèæàåòñÿ.
Êîíöåíòðàöèÿ òó÷íûõ êëåòîê â àñöèòå âîçðàñòàåò, äîñòèãàÿ ìàêñèìàëüíîãî çíà÷åíèÿ (~100 òûñ. êë./ìë) ê ñåðåäèíå âòîðîé ôàçû. Ýòîò ïåðèîä õàðàêòåðèçóåòñÿ ïàäåíèåì
êîíöåíòðàöèè ìàêðîôàãîâ è ñèëüíûì ðîñòîì îáúåìà àñöèòà. Ñ ðîñòîì êîíöåíòðàöèè òó÷íûõ êëåòîê (ðèñ. 3, á)
óâåëè÷èâàåòñÿ ñòåïåíü èõ äåãðàíóëÿöèè, ÷òî íàãëÿäíî
ïðåäñòàâëåíî íà ðèñ. 4. Äåãðàíóëÿöèÿ òó÷íûõ êëåòîê
(ðèñ. 4, á) âåäåò ê âîçðàñòàíèþ êîíöåíòðàöèè ãèñòàìèíà â
çîíå ðîñòà îïóõîëè. Ãèñòàìèí — ýòî ìåäèàòîð, ñïîñîáñòâóþùèé ðîñòó êàïèëëÿðîâ è óâåëè÷åíèþ èõ ïðîíèöàåìîñòè, ÷òî âåäåò â ñâîþ î÷åðåäü ê óâåëè÷åíèþ îáúåìà àñöèòà.
Òàêèì îáðàçîì, ÏÌßË, ê êîòîðûì îòíîñèòñÿ ïîïóëÿöèÿ êëåòîê, öèðêóëèðóþùèõ â êðîâåíîñíîì ðóñëå, ñîñòîÿùàÿ â îñíîâíîì èç íåéòðîôèëîâ è ìîíîöèòîâ, à òàêæå
ìîíîíóêëåàðíûå ëåéêîöèòû (ìàêðîôàãè) ó÷àñòâóþò êàê â
ðåïàðàòèâíî-âîññòàíîâèòåëüíûõ ðåàêöèÿõ, òàê è â ðåàêöèÿõ îðãàíèçìà íà ðîñò îïóõîëè. Îäíàêî ýòè êëåòêè íóæíû íå òîëüêî â êà÷åñòâå ïðîäóöåíòîâ öèòîòîêñè÷íûõ ñâîáîäíûõ ðàäèêàëîâ è ïðîòåîëèòè÷åñêèõ ôåðìåíòîâ, íî è
îïóõîëåâûì êëåòêàì, êîòîðûì äëÿ ïîëíîöåííîãî ðîñòà
íåîáõîäèì ïîñòîÿííûé ïðèòîê ìèåëîìîíîöèòîâ äëÿ ïîääåðæàíèÿ àíãèîãåíåçà, òðàíñôîðìàöèè ñòðîìû è äëÿ ïîäàâëåíèÿ ïðîòèâîîïóõîëåâûõ ðåàêöèé. Ýòè çàêîíîìåðíîñòè áûëè óñòàíîâëåíû ïðè èññëåäîâàíèè âûäåëåííûõ èç
îïóõîëè ôàêòîðîâ, êîòîðûå àêòèâèðîâàëè ìèåëîïîýç (Deonarain et al., 2003), ìèãðàöèþ â çîíó ðîñòà îïóõîëè (Hiratsuka et al., 2006) è ôóíêöèîíàëüíîå äèôôåðåíöèðîâàíèå ìèåëîìîíîöèòîâ (Iwamoto et al., 2007). Êàê ïîêàçàëè
èññëåäîâàíèÿ, îñíîâíàÿ ìàññà êëåòîê ýòîãî òèïà áûëà
ïðåäñòàâëåíà ìàêðîôàãàìè (Billiau et al., 2005). Îäíèì èç
âàæíûõ ñëåäñòâèé ìèãðàöèè â çîíó ðîñòà îïóõîëè è
ôóíêöèîíàëüíîãî äèôôåðåíöèðîâàíèÿ ýòèõ êëåòîê ÿâëÿåòñÿ òî, ÷òî îíè ìîãóò âûçûâàòü íàðóøåíèå ðàáîòû ëèìôîöèòîâ (Sica, Bronte, 2007).
Èññëåäîâàíèå óðîâíÿ àêòèâíûõ ôîðì
êèñëîðîäà â ïëàçìå êðîâè è àñöèòè÷åñêîé
æ è ä ê î ñ ò è. Ïðè íîðìàëüíîì ôóíêöèîíèðîâàíèè ñèñòåìû âðîæäåííîãî èììóíèòåòà òðàíñôîðìèðîâàííûå êëåòêè íå èìåþò ïåðñïåêòèâû âûæèòü áëàãîäàðÿ îáðàçîâàíèþ
ðàçëè÷íûõ ÀÔÊ (ãèäðîêñèëüíîãî ðàäèêàëà, ñóïåðîêñèäíîãî àíèîíà, ïåðîêñèäà âîäîðîäà) è äåéñòâèþ ëèçîñî-
ìàëüíûõ ôåðìåíòîâ. Íàðóøåíèÿ â ïðîäóêöèè è
äåçàêòèâàöèè ÀÔÊ ñîïðîâîæäàþòñÿ íàêîïëåíèåì îêèñëèòåëüíûõ ïîâðåæäåíèé è ðàçâèòèåì ðàçëè÷íûõ ïàòîëîãè÷åñêèõ ñîñòîÿíèé. Óðîâåíü ÀÔÊ ÿâëÿåòñÿ ðåçóëüòàòîì
êàê ìèíèìóì äâóõ ðàçíîíàïðàâëåííûõ ïðîöåññîâ, à èìåííî íàðàáîòêè ÀÔÊ ôàãîöèòàìè è äåãðàäàöèè ýòèõ ñîåäèíåíèé àíòèîêñèäàíòàìè ïëàçìû êðîâè è àñöèòà.
Íà ðèñ. 5, à ïîêàçàíî, ÷òî ê ñåðåäèíå 2-é ôàçû óðîâåíü ÀÔÊ â ïëàçìå ïîâûøàåòñÿ áîëåå ÷åì â 2.5 ðàçà. Ýòîò
ðåçóëüòàò ñîãëàñóåòñÿ ñ óâåëè÷åíèåì óäåëüíîé ÀÔÊ-ãåíåðèðóþùåé àêòèâíîñòè ÏÌßË êðîâè â 4—5 ðàç (Ïîöåëóåâà è äð., 1999) è ñ óâåëè÷åíèåì êîíöåíòðàöèè ëåéêîöèòîâ â 6—7 ðàç.  çîíå àñöèòè÷åñêîé æèäêîñòè íàáëþäàåòñÿ èíàÿ êàðòèíà: îáíàðóæåíî âîçðàñòàíèå óðîâíÿ
ÀÔÊ äî ìàêñèìàëüíûõ çíà÷åíèé (äî 400 íÌ H2O2) â ïåðâîé ôàçå ðîñòà îïóõîëè ñ ïîñëåäóþùèì ýêñïîíåíöèàëüíûì ñíèæåíèåì äî çíà÷åíèé, ýêâèìîëÿðíûõ 3—5 íÌ
H2O2 (ðèñ. 5, á). Äèíàìèêà ñíèæåíèÿ óðîâíÿ ÀÔÊ ñîâïàäàåò ñ ïàäåíèåì ÀÔÊ-ãåíåðèðóþùåé àêòèâíîñòè ìàêðîôàãîâ (Ïîöåëóåâà è äð., 1999) è ñ ðîñòîì ãèïîêñèè â çîíå
îïóõîëè (äàííûå íå ïðåäñòàâëåíû). Ðåçþìèðóÿ âûøåñêàçàííîå, ìîæíî óòâåðæäàòü, ÷òî â ïëàçìå êðîâè è â çîíå
ðîñòà îïóõîëè ñêëàäûâàþòñÿ ðàçëè÷íûå îêèñëèòåëüíî-âîññòàíîâèòåëüíûå óñëîâèÿ. Òàê, â ïëàçìå êðîâè èç-çà
ãèïåðàêòèâíîñòè ÏÌßË ðàçâèâàåòñÿ ñèëüíûé îêèñëèòåëüíûé ñòðåññ, êîòîðûé ñîïðÿæåí ñ ïîðàæåíèåì çäîðîâûõ
êëåòîê (Ïîöåëóåâà è äð., 2005), â òîì ÷èñëå ñàìèõ ôàãîöèòîâ, ñ îäíîé ñòîðîíû, à ñ äðóãîé — â çîíå ðîñòà îïóõîëè
íàáëþäàåòñÿ óìåíüøåíèå êîíöåíòðàöèè ìàêðîôàãîâ, êèñëîðîäà è óðîâíÿ ÀÔÊ, êîòîðûå ñïîñîáñòâóþò ðîñòó îïóõîëåâûõ êëåòîê.
Ðàáîòà âûïîëíåíà ïðè ôèíàíñîâîé ïîääåðæêå Ðîñîáðàçîâàíèÿ ñîãëàñíî òåìàòè÷åñêîìó ïëàíó ÅÇÍ
¹ 1.4.08 è ïðîãðàììû «Ðàçâèòèå íàó÷íîãî ïîòåíöèàëà
âûñøåé øêîëû» (¹ 6663).
Ñïèñîê ëèòåðàòóðû
Áðåäåð Â. Â., Ãîðáóíîâ Â. À., Áåñîâà Í. Ñ. 2002. Àíåìèÿ
ïðè çëîêà÷åñòâåííûõ îïóõîëÿõ. Ñîâðåìåííàÿ îíêîëîãèÿ. 4(3) :
134—136.
Èçìåíåíèå ñîñòàâà êëåòî÷íûõ ïîïóëÿöèé è óðîâíÿ àêòèâíûõ ôîðì êèñëîðîäà
Ëîáàøåâñêèé À. Ë. 1983. Âûäåëåíèå ïîëèìîðôíîÿäåðíûõ
ëåéêîöèòîâ èç ìàëûõ îáúåìîâ êðîâè ïîñëå îñàæäåíèÿ äåêñòðàíîì. Ëàá. äåëî. 1 : 28—31.
Ìåíüøèêîâ Â. Â. (Ðåä.). 1987. Ëàáîðàòîðíûå ìåòîäû èññëåäîâàíèÿ â êëèíèêå: Ñïðàâî÷íèê. Ì.: Ìåäèöèíà. 238 ñ.
Ïîöåëóåâà Ì. Ì., Ïóñòîâèäêî À. Â., Àëàáèí Â. Ñ., Åâòîäèåíêî Þ. Â. 1999. Ãåíåðàöèÿ ðåàêòèâíûõ ôîðì êèñëîðîäà ïîëèìîðôíîÿäåðíûìè ëåéêîöèòàìèâ ïðîöåññå ðàçâèòèÿ ãåïàòîìû â
áðþøíîé ïîëîñòè æèâîòíûõ. Öèòîëîãèÿ. 41(2) : 162—166.
Ïîöåëóåâà Ì. Ì., Ïóñòîâèäêî À. Â., Øàòàëèí Þ. Â., Åâòîäèåíêî Þ. Â. 2005. Öèòîòîêñè÷åñêîå äåéñòâèå ïîëèìîðôíîÿäåðíûõ ëåéêîöèòîâ íà îïóõîëåâûå è íîðìàëüíûå êëåòêè in
vitro è in vivo. Öèòîëîãèÿ. 47 (1) : 1032—1038.
Ñåì÷åíêî Â. Â., Áàðàøêîâà Ñ. À., Íîçäðèí Â. È., Àðòåìüåâ Â. Í. 2006. Ãèñòîëîãè÷åñêàÿ òåõíèêà. Îìñê—Îðåë; Îìñêàÿ
ìåä. àêàäåìèÿ. 206 ñ.
Ackermann M. F., Lamm K. R., Wiengand G. W., Lister M. I.
1989. Antitumor activity of murine neutrophils demonstrated by cytometric analysis. Cancer research. 49 : 528—532.
Billiau A. D., Roskams T., Van Damme-Lombaerts R., Matthys P., Wouters C. 2005. Macrophage activation syndrome: characteristic findings on liver biopsy illustrating the key role of activated, IFN-gamma-producing lymphocytes and IL-6- and TNF-alpha-producing macrophages. Blood. 105 (4) : 1648—1651.
Chen R. L., Reynolds C. P., Seeger R. S. 2000. Neutrophil are
cytotoxic and growth-inhibiting for neuroblastoma cells with and
anti-GD2 antibody but, without cytotoxicity, can be growth-stimulating. Cancer Immunol. Immunother. 48 (1) : 603—612.
Ch’ng S., Wallis R. A., Yuan L., Davis P. F., Tan S. T. 2006. Mast
cells and cutaneous malignancies. Mod. Pathol. Jan. 19 (1) : 149—159.
Deonarain R., Verma A., Porter A. C., Gewert D. R., Platanias L. C., Fish E. N. 2003. Critical roles for IFN-beta in lymphoid
development, myelopoiesis, and tumor development: links to tumor
135
necrosis factor alpha. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 100(23) :
13 453—13 458
Hiratsuka S., Watanabe A., Aburatani H., Maru Y. 2006. Tumour-mediated upregulation of chemoattractants and recruitment of
myeloid cells predetermines lung metastasis. Nat. Cell Biol. 8(12) :
1369—1375.
Iwamoto S., Iwai S., Tsujiyama K., Kurahashi C., Takeshita K.,
Naoe M., Masunaga A., Ogawa Y., Oguchi K., Miyazaki A. 2007.
TNF-alpha drives human CD14+ monocytes to differentiate into
CD70+ dendritic cells evoking Th1 and Th17 responses. J. Immunol. 179(3) : 1449—1457.
Knoles H. J., Harris A. L. 2007. Macrophages and the hypoxic
tumour microenvironment. Front Biosci. 1 (12) : 4298—4314.
Kok P. M., van Kessel A., Verhoef J. 1990. A view to a kill: cytotoxic mechanisms of human polymorphonuclear leukocytes compared with monocytes and natural killer cells. Pathobiology. 58 :
249—264.
Mohanty J. G., Jaffe J. S., Schulman E. S., Raible D. G. 1997.
A highly sensitive fluorescent micro-assay of H2O2 release from activated human leukocytes using a dihydroxyphenoxazine derivative. J. Immunol. Methods. 202 : 133—141.
Pustovidko A., Potselueva M., Evtodienko Yu. 2000. Generation of reactive oxygen species by polymorphonuclear leukocytes
and its modulation by calcium ions during tumor growth. IUBMB
Life. 50 : 69—73.
Sica A., Bronte V. 2007. Altered macrophage differentiation
and immune dysfunction in tumor development. J. Clin. Invest.
117 : 1155—1166.
Swann J. B., Smyth M. J. 2007. Immune surveillance of tumors. J. Clin. Invest. 117 : 1137—1146.
Yamaki T., Uede T., Kikuchi K. 1990. Cellular mechanisms of
tumor rejection in rats. Nat. Immun. Cell Growth Regul. 9 (1) :
1—25.
Ïîñòóïèëà 6 X 2009
VARIATIONS IN CELL POPULATION SIZE AND REACTIVE OXYGEN SPECIES LEVEL
IN THE BLOOD AND THE ASCITES LIQUID OF TUMOR CARRIER
Yu. V. Shatalin,1, 2 A. A. Naumov,1 M. M. Potselueva1, 2, *
1
Institute of Theoretical and Experimental Biophysics RAS, Puschchino, Moscow
and 2 Puschchino, Moscow Region,
* e-mail: [email protected]
Using Seidel ascites hepatoma as a model, we studied in detail changes in cell population size and in the level of reactive oxygen species in the tumor growth zone and in the blood plasma of tumor carrier. It was found
that reduction-oxidation conditions in the blood plasma and in the tumor growth zone were different. Thus, because of hyperactivity and increase in the number of leukocytes, the blood plasma exhibited strong oxidative
stress inducing damage to healthy cells, whereas the tumor growth zone showed the decrease in macrophage
concentration, as well as in oxygen and ROS levels. These conditions favor intensive growth of tumor cells.
K e y w o r d s: polymorphonuclear leukocytes, mast cells, macrophages, histamine, oxidative stress.
Похожие документы
Скачать