Физиологические исследования

102
ВЕСТНИК УДМУРТСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2011. Вып. 4
БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
Физиологические исследования
УДК 616:612.017.1(045)
А.С. Маркова, И.В. Меньшиков, Л.В. Бедулева, Н.Н. Бушмелева, Н.Г. Казакова, К.Г. Веретенникова
КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИММУННОГО
ОТВЕТА МАТЕРИ НА АНТИГЕНЫ ОТЦА И УСТАНОВЛЕНИЯ ТОЛЕРАНТНОСТИ
ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ
Рассмотрена клинико-диагностическая ценность методов определения иммунного ответа матери на антигены
отца и установления толерантности при беременности. Показана значимость методов диагностики иммунопатологии беременности, в основе которых лежат нарушения в механизмах иммунорегуляции взаимоотношений
«мать – плод».
Ключевые слова: привычное невынашивание беременности, методы, антитела, антиидиотипические антитела,
толерантность.
Выяснение механизмов иммунорегуляции, обеспечивающих успешное течение беременности,
является центральной проблемой иммунологии репродукции [1]. Известно, что при физиологическом
течении беременности у 83,3% женщин происходит сенсибилизация лимфоцитов к антигенам плода.
Тогда как у беременных с привычным невынашиванием сенсибилизации клеток не происходит или
бывает значительно слабее [2]. Эти и другие факты позволили исследователям сделать заключение о
том, что при нормальной беременности происходит сенсибилизация иммунной системы матери на
антигены отца, и это является необходимой «пусковой» реакцией, определяющей дальнейшее течение беременности и установление толерантности к плоду [3; 4], отсутствие такой реакции ассоциировано с синдромом привычного невынашивания беременности [5; 6]. Современные исследования показывают, что до 80% случаев невынашивания беременности неясного генеза обусловлены иммунными факторами, и правильно подобранные методы лечения позволят добиться рождения доношенного ребенка при таких нарушениях [3; 7; 8]. Поэтому важно иметь методы диагностики иммунопатологий беременности, в основе которых лежат нарушения в механизмах иммунорегуляции, определяющих иммунные отношения «мать – плод».
Эта задача может быть решена с помощью методов, позволяющих определять 1) реакцию иммунной системы матери против HLA антигенов отца [9] и 2) реакцию установления толерантности к
плоду, как двух важных этапов реакции иммунной системы матери при беременности.
Известно, что в сыворотках женщин с нормально протекающей беременностью обнаруживаются цитотоксические антитела, направленные против отцовских HLA антигенов [7; 8]. Поэтому в качестве метода для определения реакции иммунной системы матери против HLA антигенов отца можно
воспользоваться лимфоцитотоксическим тестом.
Сегодня механизмы установления толерантности иммунной системы матери по отношению к
антигенам отца недостаточно изучены. В то же время известно, что важную роль в них играют антиидиотипические антитела и лимфоциты как факторы специфической негативной регуляции аутореактивных лимфоцитов [10]. В связи с этим предлагается определять установление толерантности к антигенам отца по уровню антиидиотипических антител.
Цель данной работы: определить клинико-диагностическую ценность методов исследования
иммунного ответа матери против HLA антигенов отца и установления толерантности к плоду.
Задачи исследования
1. Определить уровень иммунного ответа матери против HLA антигенов отца при нормальной
беременности и привычном невынашивании.
2. Определить наличие антиидиотипических антител к антителам против антигенов отца у
женщин с нормально протекающей беременностью и с синдромом привычного невынашивания.
Материалы и методика исследования
Исследование проходило в рамках совместного проекта ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет» и БУЗ «Перинатальный центр МЗ УР».
Клинико-диагностическая ценность методов определения…
БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
103
2011. Вып. 4
Всего в исследовании участвовало 24 пары: 16 здоровых пар (1-я группа) и 8 пар с привычным
невынашиванием (2-я группа).
Для определения антител к антигенам отца в сыворотке беременных женщин использовали
лимфотоксический тест. Принцип метода заключается в том, что лимфоциты мужа в присутствии сыворотки беременной жены, содержащей антитела против HLA антигенов отца, и комплемента морской свинки теряют жизнеспособность, которую оценивают с помощью трипанового синего. Доля
мертвых клеток отражает наличие антител против HLA антигенов отца в крови беременной женщины. В контроле вместо сыворотки жены использовали сыворотку другой беременной женщины.
Определение антиидиотипических антител проводили методом торможения реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) в смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ). Принцип данного метода
заключается в том, что в присутствии антиидиотипических антител в сыворотке матери при добавлении
гетерологичного комплемента наблюдается подавление РБТЛ матери в однонаправленной смешанной
культуре с лимфоцитами отца. РБТЛ оценивали по уровню потребления глюкозы. Оценка реакции проводится на 3-и и 5-е сутки культивирования лимфоцитов. В контроле вместо сыворотки жены использовали пулированную мужскую сыворотку. Мужские лимфоциты обрабатывали митомицином С, в результате чего клетки не пролиферируют, но сохраняют антигенную активность. Присутствие антиидиотипических антител в сыворотке беременных женщин оценивали по торможению РБТЛ.
Результаты и их обсуждение
Наличие в крови беременной женщины антител против HLA антигенов отца определяли с помощью лимфоцитотоксического теста.
Результаты определения антител против отцовских антигенов у здоровых беременных женщин,
не имеющих в анамнезе спонтанных выкидышей, и у беременных женщин, имеющих в анамнезе
спонтанные выкидыши неясной этиологии, представлены на рис.1.
Рис. 1. Количество мертвых мужских лимфоцитов в лимфоцитотоксическом тесте: 1 – группа здоровых беременных пар; 2 – группа пар с привычным невынашиванием беременности;
*** – достоверность различий между здоровыми парами и парами с привычным невынашиванием
(p<0,001)
Обнаружено, что в крови здоровых беременных женщин присутствуют антитела против HLА
антигенов отца. Антитела против HLA антигенов отца вызывают гибель 90,7±3% несущих эти антигены лимфоцитов, в контроле наблюдается гибель только 8,5±4% мужских лимфоцитов.
В группе с привычным невынашиванием количество мертвых лимфоцитов отца в присутствии
сыворотки беременной жены не отличается от значений в контрольной пробе (10±6% и 9,5±5% соответственно), в которой оценивали количество мертвых лимфоцитов отца в присутствии сыворотки
другой беременной женщины. Это указывает на отсутствие в крови беременных женщин с привычным невынашиванием антител против HLA антигенов отца.
104
2011. Вып. 4
А.С. Маркова, И.В. Меньшиков, Л.В. Бедулева и др…
БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
Таким образом, в крови беременных женщин при физиологически протекающей беременности
обнаруживаются антитела к лимфоцитам отца, что свидетельствует о развитии иммунного ответа
матери на отцовские антигены.
Присутствие в крови беременной женщины антиидиотипических антител к антителам против
антигенов отца определяли методом торможения РБТЛ в СКЛ.
Результаты определения антиидиотипических антител против отцовских антигенов у здоровых
беременных женщин, не имеющих в анамнезе спонтанных выкидышей, и у беременных женщин,
имеющих в анамнезе спонтанные выкидыши неясной этиологии, представлены на рис. 2.
Рис. 2. Потребление глюкозы смешанной культурой лимфоцитов после 5 дней культивирования:
1 – группа здоровых беременных пар; 2 – группа пар с привычным невынашиванием;
** – достоверность различий между здоровыми парами и парами с привычным невынашиванием
(p<0,01)
Из полученных результатов следует, что в контрольной пробе клетки потребляют значительно
больше глюкозы, чем в опыте (2,7±0,5 мМоль/л и 0,9±0,4 мМоль/л соответственно), что свидельствует о торможении РБТЛ в опытной пробе и о наличии антиидиотипических антител против антигенов
отца в крови беременной женщины.
В группе с привычным невынашиванием подавление РБТЛ не наблюдалось. Потребление глюкозы в опытной пробе не отличается от контрольной (0,7±0,5 мМоль/л и 0,8±0,4 мМоль/л соответственно), что указывает на то, что в крови беременных женщин с привычным невынашиванием отсутствуют антиидиотипические антитела к антителам против отцовских антигенов.
В группе с привычным невынашиванием нет значимого различия в опытной и контрольной
пробах по потреблению глюкозы лимфоцитами ввиду того, что нет иммунного ответа матери на антигены отца (отсутствует 1-я реакция), следовательно, отсутствует установление толерантности к
плоду (нет 2-й реакции).
Таким образом, наличие антиидиотипических антител в крови здоровых беременных женщин
свидетельствует об установлении толерантности к плоду, следовательно, о нормальном протекании
беременности в целом.
Существование связи между отсутствием иммунного ответа матери на антигены отца при беременности послужило основанием для разработки методов терапии женщин, страдающих синдромом
привычного невынашивания [3; 8; 9]. Одним из методов, который активно разрабатывается в последнее время, является лимфоцитотерапия (ЛИТ). Эта технология направлена на преодоление слабой
иммунной реакции матери на антигены отца по причине относительной совместимости супругов по
антигенам HLA [2; 11]. Иммунотерапия лимфоцитами мужа может оказаться эффективной в лечении
привычного невынашивания беременности неясного генеза при сниженной продукции антиидиотипических антител в течение беременности [12; 13]. Несмотря на очевидные положительные результаты немногочисленных исследований, однозначной оценки эффективности лимфоцитотерапии жен-
Клинико-диагностическая ценность методов определения…
БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
105
2011. Вып. 4
щин, страдающих привычным невынашиванием, нет. В основном это связано с тем, что в настоящее
время не существует стандартизированных методов диагностики для показаний ЛИТ, нет методов
оценки эффективности иммунизации матери лимфоцитами, не стандартизована и сама технология
лимфоцитотерапии, нет четких данных о дозе вводимых лимфоцитов и т.д. К тому же остаются неизвестными и механизмы действия данной терапии [1; 10; 14]. Все это является условиями, сдерживающими дальнейшее развитие и совершенствование ЛИТ как технологии. Очевидно, что без выяснения иммунных механизмов установления толерантности на отцовские антигены, которая происходит вслед за развитием иммунного ответа матери на антигены отца, трудно себе представить механизм действия ЛИТ и механизмы иммунопатологии при беременности [15; 16].
Согласно результатам нашего исследования, представленным выше, методы, которые мы использовали, позволяют определить наличие иммунного ответа организма матери против HLA антигенов отца и установление толерантности к плоду. Кроме того, индивидуальный анализ результатов
исследования позволил обнаружить случаи, которые расширяют клинико-диагностические возможности предлагаемых методов, в частности:
1) у пары с привычным невынашиванием при наличии иммунного ответа материнского организма на антигены отца не обнаружили антиидиотипических антител, что свидетельствует о том, что
толерантность к плоду не установлена. По результатам клинической диагностики в анамнезе этой
пары было выявлено иммунное отторжение;
2) у двух из трех исследованных пар с привычным невынашиванием беременности при отсутствии иммунного ответа были обнаружены антиидиотипические антитела. По результатам клинической диагностики в анамнезе этих женщин была выявлена замершая беременность.
Выводы
1. В крови у здоровых беременных женщин присутствуют идиотипические и антиидиотипические антитела, которые свидетельствуют о наличии иммунного ответа матери на антигены отца, установлении толерантности к плоду.
2. У пар с привычным невынашиванием беременности отсутствие идиотипических и антиидиотипических антител указывает на то, что иммунный ответ организма матери на антигены отца не
развивается.
3. Данные методы позволяют оценить уровень иммунного ответа матери на антигены отца,
диагностировать патологии беременности, в основе которых лежат нарушения в системе иммунорегуляции, использовать их в качестве контроля лимфоцитотерапии.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Мамедалиева Н.М. Современные аспекты диагностики и лечения невынашивания беременности: метод.
рекомендации. Алматы, 2002. С. 12.
2. Beer A.E., Kwak J. Reproductive medicine program Finch University of Health Science // Chicago Medical
School. 1999. №3. Р. 132.
3. Mowbray J.F. A controlled trial of immunotherapy with paternal cells in recurrent spontaneous abortion. Inmmunoregulation and fetal survival, Gill T and WegmanT.G. // Eds Oxford Univ. Press. New-York, 1987. Р. 300.
4. Rodger L., Bick M.H. et al. Recurrent miscarriage: causes, evaluation and treatment // Medscape Women's Health.
1998. №3. Р. 3.
5. Говалло В.И. Активность Т-лимфоцитов и их взаимодействие с сывороткой крови женщин при физиологической беременности // Акушерство и гинекология. 1978. №4. С. 8-11.
6. Сидельникова В.М. Привычная потеря беременности. М.: Триада X, 2000. C. 304.
7. Coulam C.B., Stephenson M. et al. Immunotherapy for recurrent pregnancy loss: Analysis of results from clinical
trials. // Amer. J. Reprod. Immunol. 1996. №35. Р. 352-359.
8. Fraser E.J., Grimes D.А. et al. Immunization as therapy for recurrent spontaneous abortion: A review and metaanalysis // Obst. Gynec. 1993. №82. Р. 854-859.
9. Christiansen О.B. Afresh look at the causes and treatments of recurrent miscarriage, especially its immunological
aspects // Hum. Reprod. Update. 1996. №2. Р. 4, 271.
10. Ito К., Tanaka Т., Tsutsumi N., Obata F., Kashiwagi N. Possible mechanisms of immunotherapy for maintaining
pregnancy in recurrent spontaneous aborters: analysis of anti-idiotypic antibodies directed against autologous T-cell
receptors // Human Reproduction. 1999. №3. Р. 650-655.
11. Beer A.E., Billingham R.E., Yon S. Lymphocyte immune therapy in experimental animals-J. // Exp. Med. 1972.
№23. Р. 135, 808-816.
106
А.С. Маркова, И.В. Меньшиков, Л.В. Бедулева и др…
2011. Вып. 4
БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
12. Friel L.A., Lubinski V., Vrdoljak J., Beaman K.D., Kwak J.Y.H., Beer A.E., Gilman-Sachs A. Auto-antibodies induced by paternal lymphoycte immunization in couples with recurrent spontaneous abortions. Presented at the Am.
Society for Reproductive Immunology Meeting Philadelphia // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. №3. Р. 154.
13. Takakuwa K., Kanazawa K. et al. Production of blocking antibodies by vaccination with husband's lympocytes in
unexplained recurrent aborters; the role in succesful pregnancy // Am.J.Reprod. Immunol. Microbiol. 1986. №10. Р. 1.
14. Suciu-Foca N., Reed E. et al. Antiidiotypic antibodies to anti-HLA receptors induced by pregnancy //Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 1983. №80. Р. 830.
15. Lubinski V., Vrdoljak J., Beer A., Beaman K., Gilman-Sachs A. Characterization of antibodies produced in response
to paternal leukocyte immunization in women with recurrent spontaneous abortion. Presented at the American Society
for Immunology of Reproduction Meeting, Charleston. // Chicago Medical School. 1992. №25. Р. 35.
16. Talwar G.P, Singh O., Pal R. et al. A vaccine that prevents pregnancy in women // J.Biochem (Tokyo). 1994. №3.
Р. 596-601.
Поступила в редакцию 21.09.11
A.S. Markova, I.V. Menshikov, L.V. Beduleva, N.N. Bushmeleva, N.G. Kazakova, K.G. Veretennikova
Clinical and diagnostic value of techniques used to define the maternal immune answer to paternal antigens, as
well as a tolerance establishment at pregnancy
We considered the clinical and diagnostic value of definition methods of the maternal immune answer on paternal antigens and a tolerance establishment at pregnancy. The importance of diagnostic techniques used to diagnose the immunopathologies of pregnancy caused by disturbances in mechanisms of the immune-processes' regulation in the relations «a mother – a fetus» was shown.
Keywords: habitual miscarriage of pregnancy, methods, antibodies, anti-idiotypic antibodies, tolerance.
Маркова Анастасия Сергеевна, ассистент
кафедры иммунологии и клеточной биологии
ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет»
426034, Россия, г. Ижевск, ул. Университетская, 1 (корп. 1)
E-mail: nastya19_86@mail.ru
Markova A.S., assistant of immunology
and cell biology department
Udmurt State University
462034, Russia, Izhevsk, Universitetskaya st., 1/1
E-mail: nastya19_86@mail.ru
Меньшиков Игорь Викторович,
доктор биологических наук, профессор
ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет»
426034, Россия, г. Ижевск, ул. Университетская, 1 (корп. 1)
E-mail: miv140560@mail.ru
Menshikov I.V., doctor of biology, professor
Udmurt State University
462034, Russia, Izhevsk, Universitetskaya st., 1/1
E-mail: miv140560@mail.ru
Бедулева Любовь Викторовна,
доктор биологических наук, профессор
ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет»
426034, Россия, г. Ижевск, ул. Университетская, 1 (корп. 1)
E-mail: blv76@mail.ru
Beduleva L.V., doctor of biology, professor
Udmurt State University
462034, Russia, Izhevsk, Universitetskaya st., 1/1
E-mail: blv76@mail.ru
Бушмелева Наталья Николаевна,
кандидат медицинских наук, главный врач
БУЗ «Перинатальный центр МЗ УР»
426039, Россия, г. Ижевск, ул. Воткинское шоссе, 57
Bushmeleva N.N.,
candidate of medical sciences, head doctor
Perinatal Center of Udmurt republic
426039, Russia, Izhevsk, Votkinskoye highway, 57
Казакова Наталья Георгиевна, акушер-гинеколог
БУЗ «Перинатальный центр МЗ УР»
426039, Россия, г. Ижевск, ул. Воткинское шоссе, 57
Kazakova N.G., accoucheur and gynecologist
Perinatal Center of Udmurt republic
426039, Russia, Izhevsk, Votkinskoye highway, 57
Веретенникова Кира Геннадьевна, магистр биологии
ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет»
426034, Россия, г. Ижевск, ул. Университетская, 1 (корп. 1)
Veretennikova K.G., master of biology
Udmurt State University
462034, Russia, Izhevsk, Universitetskaya st., 1/1