Anti-ENA ProfilePlus EUROASSAY (IgG), EUROIMMUN AG 1 _____________________________________________________________________________________________________ Экстрагируемые ядерные антигены ПрофильПлюс (IgG) (Anti-ENA ProfilPlus EUROASSAY (IgG)) Набор EUROASSAY для определения IgG-аутоантител к экстрагируемым ядерным антигенам в сыворотке или плазме крови человека методом иммуноблота. Номер по каталогу: DА 1590-1003-1 G набор на 30 определений (10 × 3) DА 1590-1005-1 G набор на 50 определений (10 × 5) НАЗНАЧЕНИЕ Набор Anti-ENA ProfilPlus EUROASSAY (IgG) обеспечивает количественное определение in vitro человеческих аутоантител класса IgG к семи различным антигенам: nRNP, Sm, SS-A, SS-B, Scl-70 и Jo-1 в сыворотке и плазме крови. ПОКАЗАНИЯ К ПРИМЕНЕНИЮ: Смешанное заболевание соединительной ткани (MCTD, Sharp-синдром), диссеминированная красная волчанка (SLE), синдром Шегрена, прогрессирующий системный склероз, поли-/дерматомиозит. ПРИНЦИП МЕТОДА Тест Anti-ENA ProfilPlus EUROASSAY (IgG) основан на методе иммуноблотинга. Набор содержит слайды с блотовыми стрипами (2 стрипа на каждом слайде закреплены в своих тестовых зонах). Стрипы содержат аффинно очищенные антигены, нанесенные в виде параллельных полос. Блотовые стрипы инкубируют на первой стадии реакции с образцом разведенной сыворотки или плазмы пациента. В случае, если образец положительный, специфические антитела класса IgG (а также классов IgA и IgM) будут связываться с соответствующими полосами антигенов. Для обнаружения связанных антител проводится вторая инкубация с использованием ферментного конъюгата (антитела к IgG человека, меченные щелочной фосфатазой), который способен вызывать развитие цветной реакции. МАТЕРИАЛЫ И РЕАГЕНТЫ 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Компонент Слайды с тестовыми стрипами, покрытыми антигенами Антигены: nRNP/Sm, Sm, SS-A, SS-B, Scl-70, Jo-1 Положительный контроль (IgG, человеческий), готов к использованию Отрицательный контроль (IgG, человеческий), готов к использованию Ферментный конъюгат Козьи антитела к IgG человека, конъюгированные с щелочной фосфатазой; концентрат 10 х Буфер для образцов Готов к использованию Промывочный буфер 10×концентрат Раствор субстрата Нитроголубой тетразолий/5-бром-4-хлориндолил-фосфат (NBT/BCIP), готов к использованию Инструкция по применению набора Количество 10 слайдов Обозначение SLIDE 1 × 0,2 мл POS CONTROL 1 × 0,2 мл NEG CONTROL 1 × 0,5 мл CONJUGATE 10× 1 × 60 мл 2 × 100 мл SAMPLE BUFFER WASH BUFFER 10× 1 × 4 мл SUBSTRATE 1 буклет – _____________________________________________________________________________________________________ Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2007 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: [email protected] Anti-ENA ProfilePlus EUROASSAY (IgG), EUROIMMUN AG 2 _____________________________________________________________________________________________________ Для проведения теста необходимы Шаблон-подложка для проведения реакции и Кювета для промывки EUROASSAY, которые не поставляются с данным набором. Эти приспособления можно заказать у фирмы EUROIMMUN. Хранение и стабильность набора: Набор следует хранить при температуре от +2 °С до +8 °С. Не замораживать. Невскрытые компоненты набора сохраняют стабильность в течение всего указанного срока годности набора. ПОДГОТОВКА И СТАБИЛЬНОСТЬ РЕАГЕНТОВ Примечание: Температуру всех реагентов необходимо довести до комнатной (от +18 °С до +25 °С) в течение 30 минут перед использованием. После первого использования реагенты сохраняют стабильность в течение указанного срока годности, если они хранятся при температуре от +2 °С до +8 °С и защищены от микробной контаминации. Прочие сведения о стабильности отдельных реагентов указаны ниже. Слайды: Готовы к использованию. Во избежание конденсации влаги на слайдах, не вскрывайте пакет до тех пор, пока он не прогреется до комнатной температуры. Не дотрагивайтесь руками до тестовых стрипов. Вскрыв упаковку в первый раз, слайды необходимо немедленно использовать (проводить инкубацию). Не используйте слайды, если герметичность упаковки нарушена. Шаблон-подложка для проведения реакции: Проверьте работу шаблона-подложки: вся ли поверхность в зоне проведения реакции гидрофильна и вся ли поверхность вокруг этой зоны гидрофобна? Промойте обычным хозяйственным моющим раствором с детергентом. Если необходимо, протрите впитывающей бумагой (например, бумажным полотенцем) и промойте большим количеством воды. Время от времени дезинфицируйте, погружая шаблон на 1 час в дезинфицирующий раствор (например, в 3% раствор Sekusept Extra, “Henkel”). Положительная и отрицательная контрольные сыворотки: Готовы к использованию. Ферментный конъюгат: Поставляется в виде 10-кратного концентрата. Отберите необходимое количество жидкости из флакона с концентратом с помощью чистой пипетки и разведите 1:10 буфером для образцов. Например, для проведения анализа на 1 слайде, разведите 30 мкл концентрата ферментного конъюгата в 270 мкл буфера для образцов. Разведенный раствор ферментного конъюгата следует использовать до конца рабочего дня. Буфер для образцов: Готов к использованию. Промывочный буфер: Поставляется в виде 10-кратного концентрата. Необходимое количество концентрата следует отобрать из бутыли чистой пипеткой и растворить (1:10) дистиллированной водой. Например, для каждой постановки анализа, к 20 мл концентрата следует добавить 180 мл воды. Готовый разведенный промывочный буфер следует использовать до конца рабочего дня. Раствор субстрата: Готов к использованию. После отбора необходимого количества реагента из флакона немедленно вновь закройте его, так как раствор чувствителен к свету. Предостережение: Использованная контрольная сыворотка была проверена на наличие HBsAg и антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 методами иммуноферментного анализа и непрямой иммунофлуоресценции и при этом показала отрицательный результат. Тем не менее, все используемые материалы следует считать потенциально опасными и обращаться с ними, соблюдая необходимые меры предосторожности. Некоторые из реагентов ядовиты (буфер, раствор субстрата). Избегайте контакта с кожей. Удаление отходов: Образцы пациентов, контроли и слайды после инкубации следует рассматривать как инфицированные отходы и обращаться с ними соответствующим образом. Остальные реагенты не нужно собирать отдельно, если это не оговорено в действующих официальных инструкциях. ПОДГОТОВКА И СТАБИЛЬНОСТЬ ОБРАЗЦОВ ПАЦИЕНТОВ Материал образцов: Сыворотка или плазма (ЭДТА, гепарин или цитрат) крови человека. Стабильность: Образцы пациентов, предназначенные для исследования этим методом, можно хранить до 14 дней при температуре от +2 оС до +8 оС. Разведенные образцы необходимо использовать в течение одного рабочего дня. Разведение образцов: Образцы пациентов разводят 1:101 буфером для образцов. Например: разведите 10 мкл сыворотки в 1,0 мл буфера для образцов и тщательно перемешайте на вортексе (пипетки для этого не подходят). _____________________________________________________________________________________________________ Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2007 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: [email protected] Anti-ENA ProfilePlus EUROASSAY (IgG), EUROIMMUN AG 3 _____________________________________________________________________________________________________ ПРОЦЕДУРА ИССЛЕДОВАНИЯ: техника TITERPLANE Техника TITERPLANE разработана фирмой EUROIMMUN с целью стандартизации иммунологических анализов: образцы вначале наносят в виде капель на горизонтальную поверхность специального шаблонаподложки в зону проведения реакции. Затем на шаблон, в специальные углубления, помещают слайды, повернутые иммуноблотовыми стрипами к реакционной зоне, поэтому все стрипы сразу приходят в соприкосновение с каплями жидкости и отдельные реакции начинаются одновременно. Расположение и высота капель точно заданы геометрией всей системы. Все наносимые жидкости находятся в огороженном пространстве, поэтому не нужна обычно используемая в таких случаях ”влажная камера”. Шаблон-подложку можно использовать многократно и инкубировать, таким образом, любое количество образцов, размещая их рядом или один за другим, в идентичных условиях. Нанесение Нанесите 50 мкл разведенного образца сыворотки или плазмы крови в каждую реакционную зону шаблона-подложки. Избегайте образования пузырьков воздуха. Распределите таким образом до начала инкубации все образцы, исследуемые в данной постановке анализа. Для удобства нанесения используйте многоканальную пипетку. Инкубация образцов (1-я стадия) Начните все реакции одновременно, поместив предметные стекла в соответствующие углубления шаблона-подложки. Следите, чтобы каждый образец контактировал с тестовым стрипом на предметном стекле и чтобы отдельные образцы не соприкасались друг с другом. Инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре (от +18 °С до +25 °С) на шейкере циркуляторного типа при скорости 300 об/мин. Промывка Ополосните предметные стекла в течение 5 секунд под струей промывочного буфера (используйте стакан или колбу) и вставьте их в стеклянную рамку промывочной кюветы. После размещения всех предметных стекол перенесите рамку в кювету и промывайте в течение 15 минут. Нанесение Нанесите 50 мкл разведенного конъюгата фермента (щелочная фосфатаза, конъюгированная с антителами к IgG человека) в каждую реакционную зону (к тому времени отмытую) шаблона-подложки. Распределите таким образом до начала инкубации все образцы. Инкубация конъюгата (2-я стадия) Извлеките предметные стекла из промывочного буфера, протрите досуха только задний и нижний край и поместите предметные стекла в соответствующие углубления шаблона-подложки. Следите, чтобы каждая капля жидкости контактировала с тестовым стрипом на предметном стекле. Инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре (от +18 °С до +25 °С) на шейкере циркуляторного типа при скорости 300 об/мин. Промывка Повторите процедуру промывки, используя свежую порцию промывочного буфера и промывая в течение 15 минут. Нанесение Нанесите 50 мкл раствора субстрата в каждую реакционную зону (к тому времени отмытую) шаблона-подложки. Распределите таким образом до начала инкубации все образцы. Инкубация с субстратом (3-я стадия) Извлеките предметные стекла из промывочного буфера, протрите досуха только задний и нижний край и поместите предметные стекла в соответствующие углубления шаблона-подложки. Следите, чтобы каждая капля жидкости контактировала с тестовым стрипом на предметном стекле. Инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре (от +18 °С до +25 °С) на шейкере циркуляторного типа при скорости 300 об/мин. Промывка Ополоснуть предметные стекла дистиллированной или деионизированной водой. Высушить на воздухе в течение примерно 15 минут. Визуальная оценка результатов реакции Отметьте интенсивность окрашивания полос в тестовой зоне стрипов. _____________________________________________________________________________________________________ Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2007 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: [email protected] Anti-ENA ProfilePlus EUROASSAY (IgG), EUROIMMUN AG 4 _____________________________________________________________________________________________________ ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ Антигены и их размещение на стрипах: nRNP/Sm Scl-70 Sm Jo-1 SS-A SS-B Контрольная полоса (антитела к IgG человека) Интерпретируют интенсивность окрашивания полос на блотовых стрипах. Внимание: Перед оценкой результатов мембрана должна быть полностью высушена. Положительный результат реакции на контрольной полосе (в нижней части правого стрипа) свидетельствует о правильно проведенных инкубациях. В случае положительного результата анализа (наличие антител к соответствующим антигенам) в зоне расположения антигена появляется синее окрашивание. Интенсивность сигнала зависит от титра антител в образце, с которым проводилась инкубация стрипа. В зависимости от интенсивности сигнала, результаты можно разделить на отрицательные, промежуточные и положительные. Сигнал Результат Нет сигнала Отрицательный Окраска полосы очень слабая Промежуточный Окраска полосы от умеренной до интенсивной Положительный Окраска полосы очень интенсивная, сравнимая с окраской контрольной полосы Сильно-положительный Параллельно с определением аутоантител к растворимым ядерным антигенам с помощью набора EUROASSAY, всегда выполняли также непрямой иммунофлуоресцентный тест. С одной стороны, это обеспечивало проверку достоверности в качестве защиты от ложноположительных результатов, с другой стороны – благодаря использованию клеток Hep-2 EUROIMMUN и, в особенности, замороженных срезов ткани печени приматов, иммунофлуоресцентный тест обеспечивал выявление более широкого спектра аутоантител к клеточному ядру, так как в настоящее время не все ядерные антигены присутствуют в тесте EUROASSAY. ХАРАКТЕРИСТИКИ ТЕСТА Калибрование: Реактивность каждого антигена стандартизовали с помощью референтной сыворотки человека CDC-ANA с номерами лотов от #1 до #10 контрольного центра “Center for Disease Control” (Атланта, США). Данные по реактивности сывороток CDC, полученные с помощью набора Anti-ENA ProfilPlus EUROASSAY (IgG) фирмы EUROIMMUN, суммированы в нижеприведенной таблице: Антиген CDC-1 CDC-2 /rim /SS-B NRNP/S m Пол. Отр. Sm Пол. SS-A CDC-3 CDC-4 CDC-5 CDC-6 CDC-7 RNP Sm Пол. Пол. Пол. Отр. Отр. Отр. Пол. Отр. Пол. Отр. Отр. Пол. Пол. Отр. Отр. SS-B Отр. Пол. Пол. Отр. Scl-70 Отр. Отр. Отр. Jo-1 Отр. Отр. Отр. CDC-8 CDC-9 CDC-10 Scl-70 Jo-1 Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Пол. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Пол. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Пол. SS-A Специфичность этой сыворотки была исследована контрольным центром “Center for Disease Control” по результатам реакции иммунофлуоресценции (субстрат: клетки Hep-2 EUROIMMUN и срезы ткани печени _____________________________________________________________________________________________________ Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2007 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: [email protected] Anti-ENA ProfilePlus EUROASSAY (IgG), EUROIMMUN AG 5 _____________________________________________________________________________________________________ приматов), двойной иммунодиффузии или противоточного иммуноэлектрофореза (сыворотка не в любом случае бывает моноспецифичной). Антигены: На иммуноблотовые стрипы были раздельно нанесены следующие антигены: nRNP/Sm: кролика. Нативный U1-nRNP, очищенный аффинной хроматографией из селезенки теленка и Sm: Нативный Sm, очищенный аффинной хроматографией из селезенки и тимуса быка. SS-A: Нативный SS-A, очищенный аффинной хроматографией из селезенки и тимуса быка. SS-B: Нативный SS-B, очищенный аффинной хроматографией из тимуса теленка и кролика. Scl-70: Нативный Scl-70, очищенный аффинной хроматографией из тимуса быка и кролика. Jo-1: Нативный Jo-1, очищенный аффинной хроматографией из тимуса теленка и кролика. Диапазон определения: Метод EUROASSAY является качественным, диапазон определения не дается. Принято, что предельный титр антител наблюдается при разведении образца 1:101. Перекрестные реакции: Качество используемых антигенных субстратов (антигенов и источников антигенов) гарантирует высокую специфичность наборов EUROASSAY. Данный набор EUROASSAY специфически определяет антитела класса IgG к nRNP/Sm, Sm, SS-A, SS-B, Scl-70, Jo-1. Перекрестных реакций с другими аутоантителами не обнаружено. Интерференция: Не отмечено изменения аналитических характеристик при исследовании в данном наборе гемолизированных, липемических или желтушных образцов. Вариации результатов в разных опытах и в одном опыте: Вариации результатов в разных опытах оценивали многократным повторным исследованием одних и тех же охарактеризованных образцов в течение нескольких дней, вариации в одном опыте – многократным исследованием охарактеризованных образцов в течение одного дня. В каждом случае интенсивность полос находилась в пределах установленного диапазона. Таким образом, данный тест EUROASSAY показывает очень высокую воспроизводимость в пределах одной постановки и между постановками. Специфичность: Специфичность данного набора EUROASSAY для всех исследованных антигенов составляет 100%. В качестве референтных систем использовали тест EUROIMMUN Anti-ENA ProfilPlus 1 ELISA и тест IIFT (обнаружение антиядерных антител с использованием клеток Hep-2 и срезов ткани печени приматов). Чувствительность: Чувствительность данного набора EUROASSAY для всех исследованных антигенов составляет 100%. В качестве референтных систем использовали тест EUROIMMUN Anti-ENA ProfilPlus 1 ELISA и тест IIFT (обнаружение антиядерных антител с использованием клеток Hep-2 и срезов ткани печени приматов). Референтный интервал: Интервал нормальных значений был определен на 50 здоровых донорах крови. Все доноры показали отрицательный результат при использовании методов EUROASSAY и IIFT (обнаружение антиядерных антител с использованием клеток Hep-2 и срезов ткани печени приматов). КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ Антигены: Антигены nRNP и Sm принадлежат к группе малых рибонуклеопротеинов (snRNP, small nuclear ribonucleoproteins), состоящих из низкомолекулярной РНК с высоким содержанием уридина (U-РНК или URNP) в комплексе с различными белками (с молекулярной массой 9–7- кДа). В этих растворимых ядерных рибонуклеопротеиновых комплексах компонент РНК, в зависимости от его поведения при хроматографии, имеет обозначения от U1 до U6. Белковый компонент содержит семь различных сердцевинных или коровых (core) белков (В, В’, D, E, F, G), U1-nRNP содержит дополнительные специфические для ядерных рибонуклеопротеинов белки (70 К, А, С). Антитела к U1-nRNP направлены против одного или нескольких из этих белков. Напротив, антитела к антигену Sm могут взаимодействовать также с одним или с несколькими коровыми белками. Частицы U-nRNP участвуют в сплайсинге пре-мРНК – они отщепляют не кодируемые последовательности мРНК (интроны) и вставляют кодируемые последовательности мРНК (экзоны), создавая мРНК. Нативный антиген SS-A – малый рибонуклеопротеин, состоящий из одной или нескольких (до пяти) молекул РНК (Y1, Y2, Y3, Y4, Y5; от 80 до 112 оснований) и белка с молекулярной массой 60 кДа. С этим комплексом бывает также связан белок Ro-52 с молекулярной массой 52 кДа. По-видимому, SS-A участвует в _____________________________________________________________________________________________________ Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2007 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: [email protected] Anti-ENA ProfilePlus EUROASSAY (IgG), EUROIMMUN AG 6 _____________________________________________________________________________________________________ процессинге мРНК до молекул, активно участвующих в трансляции. Сыворотка, позитивная по этому антигену, содержит антитела к нативному SS-A (т. е. содержащему белок 60 кДа) и вдобавок – может содержать антитела к белку Ro-52. Отдельно реакции антител с Ro-52 невозможно оценить как SS-Aпозитивные или специфичные для СКВ или синдрома Шегрена, так как с Ro-52 могут давать перекрестные ложноположительные реакции антитела к другим различным аутоантигенам (например, к Jo-1). Антиген SS-B представляет собой фосфопротеин с молекулярной массой 48 кДа. В клеточном ядре он выполняет функцию белка-хелпера для РНК-полимеразы III. Антиген Scl-70, как было установлено, является ферментом ДНК-топоизомеразой-I. Молекулярная масса нативного антигена составляет 100 кДа. Вначале методом Вестерн-блота был обнаружен только продукт метаболизма этого антигена с молекулярной массой 70 кДа. ДНК-топоизомераза-I находится в нуклеоплазме и, в особенно высокой концентрации, в ядрышке. Фермент участвует в репликации и транскрипции двуспиральной ДНК. Антиген Jo-1 идентичен гистидил-тРНК-синтетазе, цитоплазматическому фосфопротеину с молекулярной массой 50 кДа. Он действует в цитоплазме, присоединяя аминокислоту гистидин к соответствующей транспортной РНК. Ассоциированные заболевания: Высокие титры антител к U1-nRNP характерны для смешанного заболевания соединительных тканей (MCTD) или для Шарп-синдрома (Scharp syndrome). Доля этих аутоантител составляет 95% - 100%. Титр антител коррелирует с клинической активностью заболевания. Антитела к U1-nRNP находят также в 30% 40% случаев у пациентов с диссеминированной красной волчанкой (disseminated lupus erythematodes) и почти всегда в комбинации с антителами к Sm. Антитела к Sm имеют высокую специфичность к диссеминированной красной волчанке. Вместе с антителами к двухцепочечной ДНК (dsDNA) они могут считаться патогномоничными признаками этого заболевания, но встречаются только у 20% - 40% пациентов. Антитела к SS-A связаны с различными аутоиммунными заболеваниями. Наиболее часто – у пациентов с синдромом Шегрена (Sjörgen’s syndrome от 40% до 80% случаев), но также при диссеминированной красной волчанке (от 30% до 40% случаев) и при первичном билиарном циррозе (20%) и иногда при активном хроническом гепатите. Кроме этого, практически в 100% случаев красной волчанки у новорожденных (neonatal lupus erythematodes) могут быть найдены антитела к антигену SS-A. Они поступают через плацентарный барьер к плоду и являются причиной воспалительных реакций. У новорожденных младенцев они могут также вызывать врожденную блокаду сердца (congenital heart block). Антитела к SS-B находят почти исключительно у женщин (29:1) при синдроме Шегрена (от 40% до 80% случаев), но также при диссеминированной красной волчанке (от 10% до 20%). При синдроме Шегрена в основном встречается комбинация антител к SS-A и SS-B. Антитела к Scl-70 находят в 25% - 75% случаях у пациентов с прогрессирующим системным склерозом (диффузная форма), в зависимости от использованных методов проверки и степени активности заболевания (Scl = склеродерма). Они не встречаются при ограниченной склеродерме. Антитела к Jo-1 превалируют при полимиозите (25% - 35%). Они часто связаны с интерстициальным легочным фиброзом. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ Список литературы приведен в оригинале инструкции на английском языке. Внимание! Перевод сделан с английского оригинала инструкции. Перед постановкой исследования сверьте номер и дату издания вложенного в набор оригинала с указанными в настоящем переводе (см. внизу справа). При несовпадении номеров или дат обратитесь в «Аналитику» за новым переводом, либо руководствуйтесь оригиналом инструкции. Anti-ENA_IgG_EUROASSAY_DA__1590-1G_rus.doc 27.08.2007 16:28 Оригинал DA_1590-1G_A_UK_C02.doc Version: 29.04.03. 14:05 _____________________________________________________________________________________________________ Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2007 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: [email protected] Anti-ENA ProfilePlus EUROASSAY (IgG), EUROIMMUN AG 7 _____________________________________________________________________________________________________ Техника TITERPLANE _____________________________________________________________________________________________________ Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2007 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: [email protected]