исследование поверхностных гетероорганных антигенов

Реклама
2008
ÖÈÒÎËÎÃÈß
Ò î ì 50, ¹ 2
ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍÈÅ ÏÎÂÅÐÕÍÎÑÒÍÛÕ ÃÅÒÅÐÎÎÐÃÀÍÍÛÕ ÀÍÒÈÃÅÍÎÂ
ÃÅÏÀÒÎÌÍÛÕ ÊËÅÒÎÊ ÊÐÛÑÛ, Ó×ÀÑÒÂÓÞÙÈÕ
 ÏÐÎÖÅÑÑÅ ÊËÅÒÎ×ÍÎÉ ÏÐÎËÈÔÅÐÀÖÈÈ
© Í. Ï. Òåðþêîâà, Ã. È. Áëèíîâà, Þ. Ì. Ðîçàíîâ, Â. À. Èâàíîâ
Í. Ï. Òåðþêîâà, Ã. È. Áëèíîâà è äð.
Èññëåäîâàíèå ïîâåðõíîñòíûõ ãåòåðîîðãàííûõ àíòèãåíîâ ãåïàòîìíûõ êëåòîê êðûñû
Èíñòèòóò öèòîëîãèè ÐÀÍ, Ñàíêò-Ïåòåðáóðã;
ýëåêòðîííûé àäðåñ: [email protected]
Ïðîäîëæåíî èçó÷åíèå àíòèãåííîé äèâåðãåíöèè êëåòîê ãåïàòîöåëëþëÿðíûõ îïóõîëåé êðûñ, îáóñëîâëåííîé ýêñïðåññèåé íîðìàëüíûõ àíòèãåíîâ, ïðèñóùèõ äåôèíèòèâíûì òêàíÿì ïî÷åê, òàê íàçûâàåìûõ ãåòåðîîðãàííûõ ïî÷å÷íûõ àíòèãåíîâ. Ñ ïîìîùüþ èììóíîñûâîðîòêè óçêîé ñïåöèôè÷íîñòè â ñîñòàâå ôðàêöèé ïëàçìàòè÷åñêèõ ìåìáðàí êëåòîê àñöèòíîé ãåïàòîìû Çàéäåëà è êóëüòèâèðóåìûõ êëåòîê ãåïàòîìû ÍÒÑ âûÿâëåíû ãåòåðîîðãàííûå àíòèãåíû 110—115 è 125—130 êÄà; ãåòåðîîðãàííûé àíòèãåí
75—80 êÄà îáíàðóæåí òîëüêî äëÿ êëåòîê ãåïàòîìû Çàéäåëà. Ìåòîäàìè ðàäèîèçîòîïíîãî àíàëèçà è ïðîòî÷íîé ÄÍÊ-öèòîìåòðèè ïîêàçàíî ó÷àñòèå ýòèõ ãåòåðîîðãàííûõ àíòèãåíîâ â ïðîöåññå êëåòî÷íîé ïðîëèôåðàöèè.
Ê ë þ ÷ å â û å ñ ë î â à: àíòèãåííàÿ äèâåðãåíöèÿ, ãåïàòîìà, êàíöåðîãåíåç, îïóõîëåàññîöèèðîâàííûå
àíòèãåíû.
Ï ð è í ÿ ò û å ñ î ê ð à ù å í è ÿ: ÃÊ — ãåïàòîêàðöèíîìà, ÈÔÀ — èììóíîôåðìåíòíûé àíàëèç, ÌÀ —
ìîíîêëîíàëüíûå àíòèòåëà, ÏÀÀÃ — ïîëèàêðèëàìèäíûé ãåëü, ÑÏÊ — ñûâîðîòêà ïëîäà êîðîâû, ÝÔÐ —
ýïèäåðìàëüíûé ôàêòîð ðîñòà.
ìûøèíîé ãåïàòîìû 22à, à òàêæå ìîíîñëîéíûõ êóëüòèâèðóåìûõ êëåòîê êðûñû — ãåïàòîì ÍÒÑ è 27, ìèîãåííûõ
êëåòîê L8 è L6J1 (Ôåëü, 1990; Òåðþêîâà è äð., 1996,
2007). Ìåòîäîì èììóíîáëîòèíãà ïîêàçàíî, ÷òî àíòèïî÷å÷íàÿ ñûâîðîòêà âçàèìîäåéñòâóåò ñ àíòèãåíàìè ôðàêöèé
ïëàçìàòè÷åñêèõ ìåìáðàí êëåòîê êðûñèíûõ ãåïàòîì Çàéäåëà è ÍÒÑ ñ ìîë. ìàññàìè 200—210 è 43 êÄà, èäåíòèôèöèðîâàííûìè ìåòîäîì ìàññ-ñïåêòðîìåòðèè êàê ëàìèíèí-8/9 è â-àêòèí ñîîòâåòñòâåííî (Òþðÿåâà è äð., 2005;
Òåðþêîâà è äð., 2007). Êðîìå òîãî, àíòèïî÷å÷íàÿ ñûâîðîòêà ñâÿçûâàåòñÿ ñ êîìïîíåíòîì 116 êÄà êëåòîê ãåïàòîìû ÍÒÑ è ñ êîìïîíåíòàìè 105—110 è 125—130 êÄà êëåòîê ãåïàòîìû Çàéäåëà, êîòîðûå â îòäåëüíûõ ýêñïåðèìåíòàõ ñëèâàþòñÿ â îäíó øèðîêóþ ïîëîñó 105—130 êÄà; â
îáðàçöàõ êëåòîê ãåïàòîìû Çàéäåëà òàêæå îïðåäåëÿåòñÿ
àíòèãåí 75—80 êÄà, îòñóòñòâóþùèé â èíòàêòíûõ ãåïàòîöèòàõ è ãåïàòîìå ÍÒÑ.
 ñâîþ î÷åðåäü èììóíîñûâîðîòêà óçêîé ñïåöèôè÷íîñòè â ðåàêöèè íåïðÿìîé èììóíîôëóîðåñöåíöèè âûçûâàåò
ñâå÷åíèå òîëüêî áàçàëüíûõ ìåìáðàí èçâèòûõ êàíàëüöåâ
ïî÷åê êðûñû è ïðèìåðíî 98 % êëåòîê ãåïàòîìû Çàéäåëà,
íå âûçûâàÿ òàêîâîãî íè íà ñðåçàõ ïå÷åíè, íè íà ïîâåðõíîñòè èçîëèðîâàííûõ ãåïàòîöèòîâ èíòàêòíûõ âçðîñëûõ
êðûñ (Èâàíîâ, 1982; Ôåëü, 1990). Íàñòîÿùåå èññëåäîâàíèå íàïðàâëåíî íà äàëüíåéøåå èçó÷åíèå ýêñïðåññèè ãåòåðîîðãàííûõ àíòèãåíîâ, ñâîéñòâåííûõ äåôèíèòèâíîé òêàíè ïî÷åê, íà ïîâåðõíîñòè ãåïàòîìíûõ êëåòîê ñ èñïîëüçîâàíèåì èììóíîñûâîðîòêè óçêîé ñïåöèôè÷íîñòè.
Ôåíîìåí àíòèãåííîé äèâåðãåíöèè îïóõîëåâûõ êëåòîê
ÿâëÿåòñÿ òèïè÷íûì ïðîÿâëåíèåì íàðóøåíèÿ öèòîäèôôåðåíöèðîâêè ïðè êàíöåðîãåíåçå è îáóñëîâëåí ýêñïðåññèåé
îïóõîëåàññîöèèðîâàííûõ ãåòåðîîðãàííûõ àíòèãåíîâ, ò. å.
àíòèãåíîâ, ñâîéñòâåííûõ íîðìàëüíûì äåôèíèòèâíûì
òêàíÿì, íå ãîìîëîãè÷íûì èññëåäóåìîé îïóõîëè (Ôåëü,
1990). Çàäà÷à íàñòîÿùåãî èññëåäîâàíèÿ çàêëþ÷àåòñÿ â âûÿâëåíèè, èäåíòèôèêàöèè è îïðåäåëåíèè áèîëîãè÷åñêîé
ðîëè ãåòåðîîðãàííûõ àíòèãåíîâ, ïðèñóùèõ äåôèíèòèâíîé òêàíè ïî÷åê è àññîöèèðîâàííûõ ñ ïëàçìàòè÷åñêèìè
ìåìáðàíàìè êëåòîê ãåïàòîöåëëþëÿðíûõ îïóõîëåé êðûñ.
Ðàáîòà âûïîëíåíà ñ èñïîëüçîâàíèåì èììóíîñûâîðîòêè
óçêîé ñïåöèôè÷íîñòè, ïîëó÷åííîé ïóòåì èììóíèçàöèè
êðîëèêîâ ïîëîñàìè ïðåöèïèòàöèè, îáðàçîâàííûìè â àãàðå ìåæäó ëèçàòîì ôðàêöèè ïëàçìàòè÷åñêèõ ìåìáðàí ãåïàòîìû Çàéäåëà è îðãàíîñïåöèôè÷åñêîé àíòèïî÷å÷íîé
ñûâîðîòêîé.
Ðàíåå ïîêàçàíî, ÷òî îðãàíîñïåöèôè÷åñêàÿ àíòèïî÷å÷íàÿ ñûâîðîòêà, ïîëó÷åííàÿ ïðîòèâ «êëåòî÷íûõ òåíåé» ïî÷åê êðûñû, ïðè îáðàáîòêå ñðåçîâ ïî÷êè â ðåàêöèè íåïðÿìîé èììóíîôëóîðåñöåíöèè âûçûâàåò ÿðêîå ñâå÷åíèå â
áàçàëüíûõ ìåìáðàíàõ è ùåòî÷íîé êàåìêå èçâèòûõ êàíàëüöåâ ïî÷êè, òîãäà êàê ïðè îáðàáîòêå ñðåçîâ ïå÷åíè
ôëóîðåñöåíöèè êëåòî÷íûõ ñòðóêòóð íå íàáëþäàåòñÿ
(Èâàíîâ è äð., 1975). Â òî æå âðåìÿ óñòàíîâëåíî àêòèâíîå
âçàèìîäåéñòâèå àíòèïî÷å÷íîé ñûâîðîòêè ñ àíòèãåíàìè
ïëàçìàòè÷åñêèõ ìåìáðàí êëåòîê ïåðåâèâíûõ îïóõîëåé —
êðûñèíûõ ãåïàòîìû Çàéäåëà è ðàáäîìèîñàðêîìû ÐÀ-2,
165
166
Í. Ï. Òåðþêîâà, Ã. È. Áëèíîâà è äð.
Ìàòåðèàë è ìåòîäèêà
 îïûòàõ èñïîëüçîâàëè áåñïîðîäíûõ êðûñ-ñàìöîâ
ìàññîé 120—150 ã (ïèòîìíèê «Ðàïïîëîâî» ÐÀÌÍ). Ñóñïåíçèþ ãåïàòîöèòîâ èç ïå÷åíè èíòàêòíûõ êðûñ ïîëó÷àëè
â ñîîòâåòñòâèè ñ ðåêîìåíäàöèÿìè Íàçàðîâà ñ ñîòðóäíèêàìè (1989). Êëåòêè ïåðåâèâíîé ãåïàòîìû Çàéäåëà îñàæäàëè èç àñöèòà êðûñû öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 50 g â òå÷åíèå 15 ìèí è îòìûâàëè ðàñòâîðîì Ðèíãåðà (8.5 ã NaCl,
0.25 ã NaHCO3 è 0.3 ã CaCl2 íà 1 ë H2O, pH 7.0—7.2). Êóëüòóðà êðûñèíûõ êëåòîê ãåïàòîìû ÍÒÑ ïîëó÷åíà èç Ðîññèéñêîé êîëëåêöèè êëåòî÷íûõ êóëüòóð (Èíñòèòóò öèòîëîãèè ÐÀÍ, Ñàíêò-Ïåòåðáóðã); êëåòêè âûðàùèâàëè â ñðåäå
DMEM ñ äîáàâëåíèåì 10 % ñûâîðîòêè ïëîäà êîðîâû
(ÑÏÊ).
Èììóíîñûâîðîòêó óçêîé ñïåöèôè÷íîñòè ïîëó÷àëè
ïðîòèâ ïîëîñ ïðåöèïèòàöèè, îáðàçîâàííûõ â àãàðå ìåæäó
ëèçàòîì ôðàêöèè, îáîãàùåííîé ïëàçìàòè÷åñêèìè ìåìáðàíàìè ãåïàòîìû Çàéäåëà, è îðãàíîñïåöèôè÷åñêîé àíòèïî÷å÷íîé ñûâîðîòêîé. Èññëåäîâàíèÿ ïðîâîäèëè ñ
ôðàêöèåé IgG, âûäåëåííîé íà CNBr-àãàðîçå ñ èììîáèëèçèðîâàííûì áåëêîì A, èç èììóíîñûâîðîòêè óçêîé ñïåöèôè÷íîñòè ïîñëå 2-é ðåèììóíèçàöèè êðîëèêîâ.  êà÷åñòâå
êîíòðîëÿ èñïîëüçîâàëè ôðàêöèþ IgG, î÷èùåííóþ èç ñûâîðîòêè êðîâè íåèììóíèçèðîâàííîãî êðîëèêà. Êîíöåíòðàöèÿ áåëêà âî ôðàêöèÿõ IgG ñîñòàâëÿëà îêîëî 5 ìã/ìë.
Äëÿ èçó÷åíèÿ ïîâåðõíîñòíûõ àíòèãåíîâ èììóíîõèìè÷åñêèìè ìåòîäàìè êóëüòèâèðóåìûå êëåòêè ÍÒÑ ñíèìàëè ñ ïëàñòèêà ìåõàíè÷åñêèì ïóòåì áåç èñïîëüçîâàíèÿ
òðèïñèí-âåðñåíà. Òåñòèðîâàíèå ïîâåðõíîñòíûõ àíòèãåíîâ íà æèâûõ êëåòêàõ ïðîâîäèëè ìåòîäîì íåïðÿìîé èììóíîôëóîðåñöåíöèè ïî Ëåæíåâîé (1968). Äëÿ ýòîãî 2$106
êëåòîê â 0.5 ìë ðàñòâîðà Ðèíãåðà èíêóáèðîâàëè 15 ìèí
ïðè 37 °Ñ ñ èììóíîñûâîðîòêîé èëè ñ ñûâîðîòêîé èíòàêòíîãî êðîëèêà â ðàçâåäåíèè 1 : 10. Êëåòêè ïðîìûâàëè è îáðàáàòûâàëè îñëèíîé èììóíîñûâîðîòêîé ïðîòèâ èììóíîãëîáóëèíîâ êðîëèêà, ìå÷åííîé èçîòèîöèàíàòîì ôëóîðåñöåèíà.
Ôðàêöèè, îáîãàùåííûå ïëàçìàòè÷åñêèìè ìåìáðàíàìè èññëåäóåìûõ êëåòîê, âûäåëÿëè ïî ìåòîäó Õåôôíåðà ñ
ñîòðóäíèêàìè (Haeffner et al., 1980). Áåëîê âî ôðàêöèÿõ
îïðåäåëÿëè ïî ìåòîäó Ìàðêâåëëà ñ ñîòðóäíèêàìè (Markwell et al., 1978). Êîëè÷åñòâåííàÿ õàðàêòåðèñòèêà âçàèìîäåéñòâèÿ èììóíîñûâîðîòêè ñ àíòèãåíàìè ôðàêöèé ïëàçìàòè÷åñêèõ ìåìáðàí ïîëó÷åíà ìåòîäîì èììóíîôëóîðåñöåíòíîãî àíàëèçà (ÈÔÀ), êàê îïèñàíî ðàíåå (Òåðþêîâà è
äð., 1996). Áåëêè ôðàêöèé ïëàçìàòè÷åñêèõ ìåìáðàí ðàçäåëÿëè ìåòîäîì ýëåêòðîôîðåçà â 7%-íîì ïîëèàêðèëàìèäíîì ãåëå (ÏÀÀÃ), ñîäåðæàùåì 0.1 % äîäåöèëñóëüôàòà
íàòðèÿ, è ãåòåðîîðãàííûå îïóõîëåàññîöèèðîâàííûå àíòèãåíû âûÿâëÿëè ìåòîäîì èììóíîáëîòèíãà, êàê îïèñàíî ðàíåå (Laemmli, 1970; Òåðþêîâà è äð., 2007).
Âëèÿíèå ñûâîðîòêè óçêîé ñïåöèôè÷íîñòè íà ïðîëèôåðàöèþ êëåòîê èçó÷àëè ìåòîäàìè ðàäèîèçîòîïíîãî àíàëèçà è ïðîòî÷íîé ÄÍÊ-öèòîìåòðèè. Îïðåäåëåíèå èíòåíñèâíîñòè âêëþ÷åíèÿ 3H-òèìèäèíà â ÄÍÊ îïóõîëåâûõ
êëåòîê âûïîëíÿëè ñëåäóþùèì îáðàçîì. Êëåòêè ãåïàòîìû
ÍÒÑ ñåÿëè â ëóíêè 24-ëóíî÷íîãî ïëàíøåòà ôèðìû Costar
(ÑØÀ) èç ðàñ÷åòà 105 êëåòîê íà 1 ìë ñðåäû ñ äîáàâëåíèåì
ÑÏÊ è èíêóáèðîâàëè â CO2-èíêóáàòîðå ïðè 37 °Ñ ñ äîáàâëåíèåì èììóíîñûâîðîòêè óçêîé ñïåöèôè÷íîñòè èëè
ñûâîðîòêè èíòàêòíîãî êðîëèêà. ×åðåç 1 ñóò ñðåäó óäàëÿëè, êëåòêè ïðîìûâàëè ñðåäîé áåç ÑÏÊ è â ëóíêè âíîñèëè
ïî 0.3 ìë ñðåäû, ñîäåðæàùåé 4 ìêë/ìë 3H-òèìèäèíà
(37 ÌÁê/ìë) è 0.1 % áû÷üåãî ñûâîðîòî÷íîãî àëüáóìèíà.
Ïîñëå 1-÷àñîâîé èíêóáàöèè ïðè 37 °Ñ êëåòêè òðèæäû
ïðîìûâàëè ðàñòâîðîì Õåíêñà, îáðàáàòûâàëè 5%-íîé
òðèõëîðóêñóñíîé êèñëîòîé â òå÷åíèå 30 ìèí, ñïîëàñêèâàëè ðàñòâîðîì Õåíêñà è ëèçèðîâàëè 0.1 N NaOH â òå÷åíèå
20 ìèí. Ðàäèîàêòèâíîñòü â îáðàçöàõ èçìåðÿëè íà ñöèíòèëëÿöèîííîì ñ÷åò÷èêå ôèðìû Beckman. Äëÿ ïðîâåäåíèÿ
àíàëèçà êëåòî÷íîãî öèêëà êëåòêè èíêóáèðîâàëè ñ ñûâîðîòêàìè ïðè òåõ æå óñëîâèÿõ â ÷àøêàõ Ïåòðè îáúåìîì
5 ìë. ×åðåç 1 ñóò êëåòêè ñíèìàëè ñìåñüþ 0.25%-íîãî ðàñòâîðà òðèïñèíà è 0.02%-íîãî ðàñòâîðà âåðñåíà â ñîîòíîøåíèè 1 : 1. Äëÿ àíàëèçà íà ïðîòî÷íîì öèòîìåòðå ïðèãîòàâëèâàëè 0.5—1.0 ìë êëåòî÷íîé ñóñïåíçèè íà 10 ìÌ
ôîñôàòíîì áóôåðå, ñîäåðæàùåì 0.7 ìÌ EDTA (pH 7.5), ñ
êîíöåíòðàöèåé 106 êëåòîê â 1 ìë. Êëåòêè îáðàáàòûâàëè
0.1%-íûì Òðèòîíîì X-100, îêðàøèâàëè îëèâîìèöèíîì è
ýòèäèóì áðîìèäîì â êîíå÷íûõ êîíöåíòðàöèÿõ 20 è
40 ìêã/ìë ñîîòâåòñòâåííî â ïðèñóòñòâèè 15 ìÌ MgCl2.
Îêðàøåííûå êëåòêè àíàëèçèðîâàëè ïîñëå 24-÷àñîâîãî
õðàíåíèÿ ïðè 4 °Ñ. Ïðîòî÷íàÿ ÄÍÊ-öèòîìåòðèÿ âûïîëíåíà ñ èñïîëüçîâàíèåì ëàáîðàòîðíîé ìîäåëè ïðîòî÷íîãî
öèòîìåòðà, ñîçäàííîé íà îñíîâå ìèêðîñêîïà ËÞÌÀÌ â
Èíñòèòóòå öèòîëîãèè ÐÀÍ (Ðîçàíîâ è äð., 1990). Ôëóîðåñöåíöèþ âîçáóæäàëè ñâåòîì ðòóòíîé ëàìïû ÄÐØ-250
÷åðåç ñâåòîôèëüòð ÑÑ-15 (3 ìì), ðåãèñòðàöèþ ïðîâîäèëè
â îáëàñòè ñïåêòðà îò 550 íì. Ãèñòîãðàììû ÄÍÊ áûëè ïîëó÷åíû ñ ïîìîùüþ ìíîãîêàíàëüíîãî àíàëèçàòîðà, ñîåäèíåííîãî ñ ìèêðîêîìïüþòåðîì. Ñêîðîñòü àíàëèçà —
200—300 êëåòîê/ñ; ãèñòîãðàììû ÄÍÊ îáñ÷èòûâàëè ñ ïîìîùüþ ïðîãðàììû BARS v1.04, ñîçäàííîé â ÃÌÏ
«Ìàðò» (1992).
Ðåçóëüòàòû
Ïðîâåäåíî èçó÷åíèå ýêñïðåññèè ãåòåðîîðãàííûõ ïî÷å÷íûõ àíòèãåíîâ íà ïîâåðõíîñòè êëåòîê ãåïàòîöåëëþëÿðíûõ îïóõîëåé êðûñ. Íà ðèñ. 1 ïðåäñòàâëåíû ðåçóëüòàòû òåñòèðîâàíèÿ êëåòîê ìåòîäîì íåïðÿìîé èììóíîôëóîðåñöåíöèè ñ èñïîëüçîâàíèåì èììóíîñûâîðîòêè óçêîé
ñïåöèôè÷íîñòè. Ñâåòÿùèåñÿ ÷åòêèå êîíòóðû êëåòîê àñöèòíîé ãåïàòîìû Çàéäåëà è êóëüòèâèðóåìîé ãåïàòîìû
ÍÒÑ ïîñëå èõ îáðàáîòêè èììóíîñûâîðîòêîé, îòñóòñòâèå
ñâå÷åíèÿ êëåòîê, îáðàáîòàííûõ ñûâîðîòêîé íîðìàëüíîãî
êðîëèêà, ñâèäåòåëüñòâóþò î ñïåöèôè÷åñêîì õàðàêòåðå
âçàèìîäåéñòâèÿ èììóíîñûâîðîòêè ñ ïîâåðõíîñòíûìè àíòèãåíàìè îïóõîëåâûõ êëåòîê.  òî æå âðåìÿ ñâå÷åíèÿ èíòàêòíûõ ãåïàòîöèòîâ, îáðàáîòàííûõ èììóíîñûâîðîòêîé è
ñûâîðîòêîé íåèììóíèçèðîâàííîãî êðîëèêà, íå îòìå÷àåòñÿ.
Êîëè÷åñòâåííàÿ õàðàêòåðèñòèêà âçàèìîäåéñòâèÿ èììóíîñûâîðîòêè óçêîé ñïåöèôè÷íîñòè ñ àíòèãåíàìè ôðàêöèé, îáîãàùåííûõ ïëàçìàòè÷åñêèìè ìåìáðàíàìè èññëåäóåìûõ êëåòîê, ïîëó÷åíà ìåòîäîì ÈÔÀ. Ïðè òèòðàõ
1 : 10—1 : 40 èììóíîñûâîðîòêà àêòèâíî ðåàãèðóåò ñ ïîâåðõíîñòíûìè àíòèãåíàìè êëåòîê ãåïàòîì è ñëàáî ñâÿçûâàåòñÿ ñ ïðåïàðàòîì èíòàêòíûõ ãåïàòîöèòîâ (ðèñ. 2). Òàêèì îáðàçîì, íàáëþäàåòñÿ îïðåäåëåííàÿ ñïåöèôè÷íîñòü
èììóíîñûâîðîòêè â îòíîøåíèè îïóõîëåàññîöèèðîâàííûõ àíòèãåíîâ êëåòîê êðûñèíûõ ãåïàòîì Çàéäåëà è ÍÒÑ.
Ïî äàííûì ýëåêòðîôîðåçà â 7%-íîì ÏÀÀà è ïîñëåäóþùåãî èììóíîáëîòèíãà èììóíîñûâîðîòêà óçêîé ñïåöèôè÷íîñòè âûÿâëÿåò â ñîñòàâå ôðàêöèé ïëàçìàòè÷åñêèõ
ìåìáðàí êëåòîê ãåïàòîìû Çàéäåëà êîìïîíåíòû 110—115,
125—130 è 75—80 êÄà, òîãäà êàê â ïðåïàðàòàõ êëåòîê ãåïàòîìû ÍÒÑ èììóíîñûâîðîòêà ñâÿçûâàåòñÿ òîëüêî ñ áåëêàìè 110—115 è 125—130 êÄà (ðèñ. 4).
Èññëåäîâàíèå ïîâåðõíîñòíûõ ãåòåðîîðãàííûõ àíòèãåíîâ ãåïàòîìíûõ êëåòîê êðûñû
167
Âëèÿíèå èììóíîñûâîðîòêè óçêîé ñïåöèôè÷íîñòè íà
ïðîëèôåðàöèþ êóëüòèâèðóåìûõ êëåòîê ÍÒÑ îïðåäåëÿëè
ïî âêëþ÷åíèþ 3H-òèìèäèíà â ÄÍÊ è ïóòåì àíàëèçà êëåòî÷íîãî öèêëà íà ïðîòî÷íîì öèòîìåòðå. Êàê âèäíî èç ðåçóëüòàòîâ äâóõ ýêñïåðèìåíòîâ, ïðåäñòàâëåííûõ â òàáë. 1,
âêëþ÷åíèå 3H-òèìèäèíà â ÄÍÊ îïóõîëåâûõ êëåòîê, èíêóáèðîâàííûõ ñ 50 ìêë èììóíîñûâîðîòêè, ñíèæàåòñÿ íà 33
è 14 % ïî ñðàâíåíèþ ñ âêëþ÷åíèåì èçîòîïà â êëåòêè, èíêóáèðîâàííûå ñ ñûâîðîòêîé èíòàêòíîãî êðîëèêà, à ïðè
èíêóáàöèè êëåòîê ñî 100 ìêë èììóíîñûâîðîòêè — íà 47
è 30 % ñîîòâåòñòâåííî. Òàêèì îáðàçîì, 24-÷àñîâàÿ èíêóáàöèÿ êëåòîê ãåïàòîìû ÍÒÑ ñ èììóíîñûâîðîòêîé ïðèâîäèò ê äîçîçàâèñèìîìó è ñòàòèñòè÷åñêè äîñòîâåðíîìó ïîäàâëåíèþ âêëþ÷åíèÿ 3H-òèìèäèíà â ÄÍÊ.
Àíàëîãè÷íî 24-÷àñîâàÿ èíêóáàöèÿ êëåòîê ãåïàòîìû
ÍÒÑ â ïðèñóòñòâèè èììóíîñûâîðîòêè óçêîé ñïåöèôè÷íîñòè ïðèâîäèò ê óâåëè÷åíèþ êîëè÷åñòâà êëåòîê, íàõîäÿùèõñÿ â G1-ôàçå, ïî ñðàâíåíèþ ñ êîíòðîëüíûìè ëóíêàìè,
â êîòîðûõ êëåòêè èíêóáèðîâàëè ñ ñûâîðîòêîé èíòàêòíîãî
êðîëèêà, ò. å. ñâÿçûâàíèå àíòèòåë ñ ïîâåðõíîñòíûìè àíòèãåíàìè 110—115 è 125—130 êÄà ãåïàòîìíûõ êëåòîê
çàìåäëÿåò èõ ïåðåõîä â S-ôàçó (ðèñ. 3; òàáë. 2).
Ðèñ. 1. Âûÿâëåíèå ãåòåðîîðãàííûõ ïî÷å÷íûõ àíòèãåíîâ íà ïîâåðõíîñòè æèâûõ êëåòîê ìåòîäîì íåïðÿìîé èììóíîôëóîðåñöåíöèè.
Ñïåöèôè÷åñêîå ñâå÷åíèå êëåòîê àñöèòíîé ãåïàòîìû Çàéäåëà (à) è êóëüòèâèðóåìîé ãåïàòîìû ÍÒÑ (â), îáðàáîòàííûõ èììóíîñûâîðîòêîé óçêîé
ñïåöèôè÷íîñòè; ñâå÷åíèÿ èíòàêòíûõ ãåïàòîöèòîâ (ä) è êëåòîê, îáðàáîòàííûõ ñûâîðîòêîé íåèììóíèçèðîâàííîãî êðîëèêà (á, ã, å), íå çàðåãèñòðèðîâàíî.
Ðèñ. 2. Îïðåäåëåíèå ñâÿçûâàíèÿ èììóíîñûâîðîòêè óçêîé ñïåöèôè÷íîñòè ñ àíòèãåíàìè ôðàêöèé, îáîãàùåííûõ ïëàçìàòè÷åñêèìè ìåìáðàíàìè êëåòîê ãåïàòîì Çàéäåëà (1) è ÍÒÑ (2), à
òàêæå èíòàêòíûõ ãåïàòîöèòîâ (3) ìåòîäîì èììóíîôåðìåíòíîãî àíàëèçà.
Ðèñ. 3. Àíàëèç êëåòî÷íîãî öèêëà ìåòîäîì ïðîòî÷íîé ÄÍÊ-öèòîìåòðèè.
Êëåòêè ãåïàòîìû ÍÒÑ êóëüòèâèðîâàëè ñ ñûâîðîòêîé èíòàêòíîãî êðîëèêà (à) èëè ñ èììóíîñûâîðîòêîé óçêîé ñïåöèôè÷íîñòè (á).
Í. Ï. Òåðþêîâà, Ã. È. Áëèíîâà è äð.
168
Òàêèì îáðàçîì, ïî-âèäèìîìó, ïðåäñòàâëåííûå äàííûå ïîçâîëÿþò ãîâîðèòü îá ó÷àñòèè ïîâåðõíîñòíûõ ãåòåðîîðãàííûõ îïóõîëåàññîöèèðîâàííûõ àíòèãåíîâ 110—115
è 125—130 êÄà â ïðîöåññå ïðîëèôåðàöèè êëåòîê ãåïàòîìû ÍÒÑ, à èìåííî â ðåãóëÿöèè ïåðåõîäà êëåòîê èç G1-ôàçû â S-ôàçó.
Îáñóæäåíèå
Ðèñ. 4. Âûÿâëåíèå ãåòåðîîðãàííûõ ïî÷å÷íûõ àíòèãåíîâ ìåòîäîì èììóíîáëîòèíãà.
Áåëêè ôðàêöèé, îáîãàùåííûõ ïëàçìàòè÷åñêèìè ìåìáðàíàìè ãåïàòîì
Çàéäåëà (à), ÍÒÑ (á), è èíòàêòíûõ ãåïàòîöèòîâ (â) ðàçäåëÿëè ýëåêòðîôîðåòè÷åñêè â 7%-íîì ÏÀÀà è ïîñëå ïåðåíîñà íà íèòðîöåëëþëîçó îáðàáàòûâàëè èììóíîñûâîðîòêîé óçêîé ñïåöèôè÷íîñòè. ×èñëà ñëåâà — ìîëåêóëÿðíûå ìàññû ìàðêåðíûõ áåëêîâ, êÄà.
Òàáëèöà 1
Âëèÿíèå èììóíîñûâîðîòêè óçêîé ñïåöèôè÷íîñòè
íà ñèíòåç ÄÍÊ â êóëüòèâèðóåìûõ êëåòêàõ ãåïàòîìû ÍÒÑ
Âêëþ÷åíèå 3H-òèìèäèíà
â ÄÍÊ êëåòîê ïîñëå èõ
èíêóáàöèè ñ ñûâîðîòêîé
êðîëèêà, èìï/ìèíà
Ôðàêöèÿ IgG
èç ñûâîðîòêè êðîëèêà
Èíòàêòíîãî, 50 ìêë/ìë
6501 ) 676
Èììóíèçèðîâàííîãî, 50 ìêë/ìë
4360 ) 361á 3920 ) 376
4559 ) 834
Èíòàêòíîãî, 100 ìêë/ìë
7644 ) 376
5085 ) 167
Èììóíèçèðîâàííîãî, 100 ìêë/ìë
4066 )
3553 ) 233â
176â
à Ñðåäíåå äëÿ òðåõ ëóíîê. á Ðàçëè÷èÿ ñòàòèñòè÷åñêè äîñòîâåðíû,
P ≥ 0.05 . â Ðàçëè÷èÿ ñòàòèñòè÷åñêè äîñòîâåðíû, P ≥ 0.01.
Òàáëèöà 2
Âëèÿíèå èììóíîñûâîðîòêè óçêîé ñïåöèôè÷íîñòè
íà ðàñïðåäåëåíèå êóëüòèâèðóåìûõ êëåòîê ãåïàòîìû ÍÒÑ
ïî ôàçàì êëåòî÷íîãî öèêëà
Êëåòêè
ÍÒÑ
Ôðàêöèÿ IgG
èç ñûâîðîòêè
êðîëèêà,
100 ìêë/ìë
Äîëÿ êëåòîê â ôàçàõ
êëåòî÷íîãî öèêëà, %à
G1
S
G2 + M
Èíòàêòíîãî
49.0 ) 0.9
33.1 ) 0.1
18.4 ) 0.8
Èììóíèçèðîâàííîãî
56.1 ) 0.3á 28.9 ) 0.5á 15.6 ) 0.3â
à Ñðåäíåå äëÿ òðåõ èçìåðåíèé. á Ðàçëè÷èÿ ñòàòèñòè÷åñêè äîñòîâåðíû, P ≥ 0.01. â Ðàçëè÷èÿ ñòàòèñòè÷åñêè äîñòîâåðíû, P ≥ 0.05
Íàðóøåíèÿ ãåííîé àêòèâíîñòè â ïðîöåññå íåîïëàñòè÷åñêîé òðàíñôîðìàöèè ïðèâîäÿò ê äèñäèôôåðåíöèðîâêå
êëåòîê è èçìåíåíèþ êëåòî÷íîãî ôåíîòèïà. Íàèáîëåå ïîëíîå ïðåäñòàâëåíèå î ñîñòàâå ïîâåðõíîñòíûõ àíòèãåíîâ
îïóõîëåâûõ êëåòîê ñôîðìèðîâàëîñü áëàãîäàðÿ èññëåäîâàíèÿì, âûïîëíåííûì íà íîðìàëüíûõ è ìàëèãíèçèðîâàííûõ ÷åëîâå÷åñêèõ ìåëàíîöèòàõ in situ è íà êóëüòèâèðóåìûõ êëåòêàõ in vitro (Herlyn, Koprowski, 1988). Àâòîðû
ïðîñëåäèëè çà òåì, êàê ïî ìåðå îïóõîëåâîé ïðîãðåññèè íà
íàðóæíîé ìåìáðàíå ìåëàíîöèòîâ óâåëè÷èâàåòñÿ ýêñïðåññèÿ ìîëåêóë, ñâÿçàííûõ ñ èõ àêòèâíîé ïðîëèôåðàöèåé,
ñïîñîáíîñòüþ ê èíâàçèè, ôîðìèðîâàíèåì êëåòî÷íîãî èììóííîãî îòâåòà ñî ñòîðîíû îðãàíèçìà.
Ïîäîáíîãî ðîäà ìíîãîïëàíîâûõ èññëåäîâàíèé ïîâåðõíîñòíûõ êîìïîíåíòîâ êëåòîê ãåïàòîöåëëþëÿðíûõ êàðöèíîì (ÃÊ) â ëèòåðàòóðå ìû íå âñòðå÷àëè. Îäíàêî óñòàíîâëåíî, ÷òî óæå íà ñàìîé ðàííåé ñòàäèè ãåïàòîêàíöåðîãåíåçà â ñîñòàâå ïëàçìàòè÷åñêèõ ìåìáðàí ãåïàòîöèòîâ
ïîÿâëÿåòñÿ ôåðìåíò ìåòàáîëèçìà ãëóòàòèîíà — ãàììà-ãëóòàìèëòðàíñïåïòèäàçà, êîòîðàÿ ðàññìàòðèâàåòñÿ â
êà÷åñòâå îäíîãî èç ìàðêåðîâ íåîïëàñòè÷åñêîé òðàíñôîðìàöèè ãåïàòîöèòîâ (Williams, 1980; Hendrich, Pitot, 1987).
 ýêñïåðèìåíòàõ íà æèâîòíûõ è ïðè èììóíîãèñòîõèìè÷åñêîì èññëåäîâàíèè ïàöèåíòîâ ñ ïàòîëîãèåé ïå÷åíè âûÿâëåíû çíà÷èòåëüíûå èçìåíåíèÿ â ñèíòåçå êîìïîíåíòîâ
âíåêëåòî÷íîãî ìàòðèêñà è àäãåçèâíûõ ìîëåêóë êëåòêàìè
ãåïàòîêàðöèíîì (Rescan et al., 1990, 1991; Volpes et al.,
1991, 1993; Jaskiewicz et al., 1993, 1995; Lietard et al., 1998;
Òþðÿåâà è äð., 2005); íà êëåòî÷íûõ ëèíèÿõ in vitro èçó÷àåòñÿ ðîëü ýòèõ áåëêîâ â ïðîãðåññèè ãåïàòîöåëëþëÿðíûõ
îïóõîëåé (Carloni et al., 1998, 2001; Masumoto et al., 1999).
Êàê ïîêàçàíî â íàñòîÿùåé ðàáîòå, èììóíîñûâîðîòêà
óçêîé ñïåöèôè÷íîñòè âûÿâëÿåò â ñîñòàâå ôðàêöèé, îáîãàùåííûõ ïëàçìàòè÷åñêèìè ìåìáðàíàìè êëåòîê ãåïàòîìû
Çàéäåëà, êîìïîíåíòû 110—115, 125—130 è 75—80 êÄà,
òîãäà êàê â ïðåïàðàòàõ êëåòîê ãåïàòîìû ÍÒÑ èììóíîñûâîðîòêà ñâÿçûâàåòñÿ òîëüêî ñ áåëêàìè 110—115 è 125—
130 êÄà (ðèñ. 3). Òàêèì îáðàçîì, ïðåæäå âñåãî ñëåäóåò îòìåòèòü, ÷òî èììóíîñûâîðîòêà óçêîé ñïåöèôè÷íîñòè íå
âçàèìîäåéñòâóåò ñ ãåòåðîîðãàííûì àíòèãåíîì, èäåíòèôèöèðîâàííûì êàê ëàìèíèí-8/9, è íå ñîäåðæèò àíòèòåë, êîòîðûå ìîãóò ðåàãèðîâàòü ñ ëàìèíèí-ïîäîáíûìè êîìïîíåíòàìè è ïðèâíîñèòü îïðåäåëåííóþ íåîäíîçíà÷íîñòü â
èíòåðïðåòàöèþ ðåçóëüòàòîâ (Kawagushi et al., 1994). Ñëåäîâàòåëüíî, â ôîðìèðîâàíèè ïîëîñ ïðåöèïèòàöèè â àãàðå
ìåæäó àíòèïî÷å÷íîé ñûâîðîòêîé è ëèçàòîì ôðàêöèè
ïëàçìàòè÷åñêèõ ìåìáðàí ãåïàòîìû Çàéäåëà ïðèíèìàþò
ó÷àñòèå äðóãèå ãåòåðîîðãàííûå àíòèãåíû. Íà ïåðâûé
âçãëÿä ðåçóëüòàò ïðåäñòàâëÿåòñÿ íåîæèäàííûì, ïîñêîëüêó ïðåæäå âñåãî àíòèëàìèíèíîâûå àíòèòåëà àêòèâíî ðåàãèðóþò ñ ëàìèíèíîì ôðàêöèé, îáîãàùåííûõ ïëàçìàòè÷åñêèìè ìåìáðàíàìè, ïî ìåðå óâåëè÷åíèÿ òèòðà àíòèïî÷å÷íîé ñûâîðîòêè ïðè ïðîâåäåíèè èììóíîõèìè÷åñêèõ
ðåàêöèé. Îäíàêî ìåòîä äâîéíîé äèôôóçèè â àãàðå îñíîâûâàåòñÿ íà èíûõ ïðèíöèïàõ, è, ïî-âèäèìîìó, ñôîðìèðîâàâøèåñÿ ïðåöèïèòàòû îáðàçîâàíû àíòèòåëàìè ê òåì îïó-
Èññëåäîâàíèå ïîâåðõíîñòíûõ ãåòåðîîðãàííûõ àíòèãåíîâ ãåïàòîìíûõ êëåòîê êðûñû
õîëåàññîöèèðîâàííûì ãåòåðîîðãàííûì àíòèãåíàì, êîòîðûå â óñëîâèÿõ íàøåãî îïûòà íàõîäèëèñü ñ íèìè â ýêâèìîëÿðíûõ ñîîòíîøåíèÿõ. Òàêèì îáðàçîì, ðåçóëüòàòû, ïîëó÷åííûå ñ èñïîëüçîâàíèåì èììóíîñûâîðîòêè óçêîé ñïåöèôè÷íîñòè, ïîçâîëÿþò óòâåðæäàòü, ÷òî ïðîöåññ
àíòèãåííîé äèâåðãåíöèè â õîäå íåîïëàñòè÷åñêîé òðàíñôîðìàöèè ãåïàòîöèòîâ íå îãðàíè÷èâàåòñÿ ñåêðåöèåé ëàìèíèíà è âûñîêèì óðîâíåì ýêñïðåññèè â-àêòèíà è ñîïðîâîæäàåòñÿ ñèíòåçîì ïîâåðõíîñòíûõ ãåòåðîîðãàííûõ àíòèãåíîâ 110—115, 125—130 è 75—80 êÄà (äëÿ êëåòîê
ãåïàòîìû Çàéäåëà). Îá ýêñïðåññèè íà ïîâåðõíîñòè êëåòîê
ãåïàòîìû Çàéäåëà ãåòåðîîðãàííûõ ïî÷å÷íûõ àíòèãåíîâ
ñâèäåòåëüñòâóþò òàêæå ðåçóëüòàòû Íàòî è Áóððèëëîíà
(Nato, Bourrillon, 1982). Ìåòîäîì àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè àâòîðû èçîëèðîâàëè èç êëåòîê ãåïàòîìû Çàéäåëà
ãëàâíûé ïîâåðõíîñòíûé ñèàëîãëèêîïðîòåèí 110—
160 êÄà — GP112, êîòîðûé ÿâëÿåòñÿ èíòåãðàëüíûì áåëêîì è îáëàäàåò êîíêàíàâàëèí A-ðåöåïòîðíîé àêòèâíîñòüþ. Èììóíîõèìè÷åñêèé àíàëèç, âûïîëíåííûé ñ èñïîëüçîâàíèåì àíòèñûâîðîòêè ïðîòèâ î÷èùåííîãî ãëèêîïðîòåèíà GP112, ñâèäåòåëüñòâóåò îá îòñóòñòâèè ýòîãî
àíòèãåíà â ñîñòàâå èíòàêòíûõ êëåòîê ïå÷åíè, ñåëåçåíêè,
ëåãêèõ, ïîäæåëóäî÷íîé æåëåçû, êèøå÷íèêà è æåëóäêà, íî
ïðèñóòñòâóåò â òêàíÿõ ïî÷åê è òèìóñà êðûñû. Îäíàêî
ìîë. ìàññà ýòîãî àíòèãåíà, èììóíîïðåöèïèòèðîâàííîãî
èç òêàíåé ïî÷åê è òèìóñà áûëà íèæå, ÷åì òàêîâàÿ GP112
(60 êÄà ïðîòèâ 110—160 êÄà äëÿ î÷èùåííîãî GP112).
Äëÿ ðåøåíèÿ âîïðîñà î ïðè÷àñòíîñòè âûÿâëåííûõ ãåòåðîîðãàííûõ àíòèãåíîâ ê ïðîöåññó êëåòî÷íîé ïðîëèôåðàöèè ìû èçó÷àëè âëèÿíèå èììóíîñûâîðîòêè óçêîé ñïåöèôè÷íîñòè íà âêëþ÷åíèå 3H-òèìèäèíà â ÄÍÊ îïóõîëåâûõ êëåòîê è ïóòåì àíàëèçà èõ êëåòî÷íîãî öèêëà íà
ïðîòî÷íîì öèòîìåòðå. Èññëåäîâàíèå ïðîâîäèëè íà ìîíîñëîéíîé êóëüòóðå êëåòîê ÍÒÑ, íà ïîâåðõíîñòè êîòîðûõ
èììóíîñûâîðîòêà óçêîé ñïåöèôè÷íîñòè âçàèìîäåéñòâóåò
òîëüêî ñ ãåòåðîîðãàííûìè àíòèãåíàìè 110—130 êÄà. Êàê
ïðåäñòàâëåíî â òàáë. 1 è 2, ïî ñðàâíåíèþ ñ êëåòêàìè, èíêóáèðîâàííûìè ñ ñûâîðîòêîé íåèììóíèçèðîâàííîãî êðîëèêà, ÷åðåç 24 ÷ ïîñëå äîáàâëåíèÿ èììóíîñûâîðîòêè â êóëüòóðàëüíóþ ñðåäó ïðîèñõîäÿò ñòàòèñòè÷åñêè äîñòîâåðíîå ñíèæåíèå âêëþ÷åíèÿ 3H-òèìèäèíà â ÄÍÊ êëåòîê
ãåïàòîìû ÍÒÑ è óâåëè÷åíèå èõ äîëè â G1-ôàçå êëåòî÷íîãî öèêëà; ñëåäîâàòåëüíî, ñâÿçûâàíèå èììóíîñûâîðîòêè ñ
ãåòåðîîðãàííûìè àíòèãåíàìè òîðìîçèò ïðîëèôåðàöèþ
ãåïàòîìíûõ êëåòîê. Ñóäÿ ïî ëèòåðàòóðíûì äàííûì, ïîäîáíîãî ðîäà èññëåäîâàíèÿ ïðîâîäÿòñÿ, êàê ïðàâèëî, ñ
ïîìîùüþ ìîíîêëîíàëüíûõ àíòèòåë (ÌÀ). Òàê, Éàãèòà ñ
ñîàâòîðàìè (Yagita et al., 1986) ïîêàçàëè, ÷òî ÌÀ ê ïîâåðõíîñòíîìó ãëèêîïðîòåèíó, ñîñòîÿùåìó èç òÿæåëîé ñóáúåäèíèöû 90—95 êÄà è ëåãêîé ñóáúåäèíèöû 30—35 êÄà,
êóëüòèâèðóåìûõ êëåòîê îïóõîëè ìî÷åâîãî ïóçûðÿ ÷åëîâåêà è êðûñû îêàçûâàþò äîçîçàâèñèìûé èíãèáèòîðíûé
ýôôåêò íà ñèíòåç ÄÍÊ â îïóõîëåâûõ êëåòêàõ è èõ ðîñò,
âûçûâàÿ íåáîëüøóþ àêêóìóëÿöèþ êëåòîê â S-ôàçå. Èíêóáàöèÿ Ò-ëåéêåìè÷åñêèõ êëåòîê ÷åëîâåêà ñ ÌÀ ê ðåöåïòîðó òðàíñôåððèíà òîðìîçèò êëåòî÷íûé ðîñò è íà 7-å ñóò
ïðèâîäèò ê çàäåðæêå êëåòîê â S-ôàçå (Trowbridge, Lopez,
1982).  ñâîþ î÷åðåäü ÌÀ ê ðåöåïòîðó ýïèäåðìàëüíîãî
ôàêòîðà ðîñòà (ÝÔÐ) ÷åëîâåêà áëîêèðóþò àêòèâàöèþ ðåöåïòîðíîé òèðîçèíêèíàçû, ÷òî ïðèâîäèò ê çàìåäëåíèþ
èëè îñòàíîâêå êëåòî÷íîãî öèêëà ñ íàêîïëåíèåì êëåòîê â
G1-ôàçå (Mendelsohn, 1997). Ïðèâëåêàþò âíèìàíèå òàêæå
äàííûå Ðåñêàíà ñ ñîàâòîðàìè (Rescan et al., 2001), êîòîðûå ïðîäåìîíñòðèðîâàëè íà êóëüòóðå êðûñèíûõ ãåïàòîöèòîâ, ÷òî ìèòîãåííûé ñèãíàë îò ÝÔÐ ÷åðåç àêòèâàöèþ
169
ERK2/MAP-êèíàçû óâåëè÷èâàåò óðîâåíü ýêñïðåññèè
â1-èíòåãðèíîâ; ïðè ýòîì ïîëèêëîíàëüíûå àíòèòåëà ïðîòèâ â1-èíòåãðèíîâ âûçûâàþò çàäåðæêó êëåòîê â G1-ôàçå.
Íàøà ðàáîòà âûïîëíåíà ñ èñïîëüçîâàíèåì ôðàêöèè IgG,
âûäåëåííîé èç èììóíîñûâîðîòêè óçêîé ñïåöèôè÷íîñòè
ïîñëå 2-é ðåèììóíèçàöèè êðîëèêîâ ïðåöèïèòàòàìè, è,
ñóäÿ ïî ðåçóëüòàòàì ÈÔÀ, ñîäåðæàíèå â íåé àíòèòåë ê ãåòåðîîðãàííûì àíòèãåíàì 110—130 êÄà íåâåëèêî. Ïîýòîìó, íà íàø âçãëÿä, ñòàòèñòè÷åñêè äîñòîâåðíîå ñíèæåíèå
âêëþ÷åíèÿ 3H-òèìèäèíà â êëåòêè ãåïàòîìû ÍÒÑ è óâåëè÷åíèå èõ ñîäåðæàíèÿ â ôàçå G1 ïîä âëèÿíèåì èììóíîñûâîðîòêè ïîçâîëÿþò ïðåäïîëîæèòü, ÷òî ýêñïðåññèÿ ãåòåðîîðãàííûõ îïóõîëåàññîöèèðîâàííûõ àíòèãåíîâ 110—115
è 125—130 êÄà îáóñëîâëåíà èõ ó÷àñòèåì â ïðîöåññå êëåòî÷íîé ïðîëèôåðàöèè.
 çàêëþ÷åíèå îòìåòèì, ÷òî â îòëè÷èå îò ìîíîñëîéíîé êëåòî÷íîé ëèíèè ãåïàòîìû ÍÒÑ êëåòêè àñöèòíîé ãåïàòîöåëëþëÿðíîé êàðöèíîìû Çàéäåëà ñóùåñòâóþò êàê
íåáîëüøèå îñòðîâêè èç äâóõ êëåòîê è áîëåå, ïðè÷åì êîëè÷åñòâî êëåòîê â ýòèõ îáðàçîâàíèÿõ ïðÿìî ïðîïîðöèîíàëüíî âîçðàñòó îïóõîëè (Gupta et al., 1985). Êàðàâàíîâà è ñîàâòîðû (Karavanova et al., 1987) îïèñûâàþò êëåòêè ãåïàòîìû Çàéäåëà êàê ìíîãîêëåòî÷íûå ñôåðè÷åñêèå èëè
ýëëèïñîèäíûå êîìïëåêñû ñ âíóòðåííåé ïîëîñòüþ, â êîòîðîé îáíàðóæèâàåòñÿ ëàìèíèí. Â íàñòîÿùåé ðàáîòå íà
ðèñ. 1, à ïðåäñòàâëåí òèïè÷íûé äëÿ ãåïàòîìû Çàéäåëà
ñôåðîèä ñðåäíèõ ðàçìåðîâ, ñîñòîÿùèé ïî ìåíüøåé ìåðå
èç 10 êëåòîê. Ñôåðè÷åñêèå àãðåãàòû îïóõîëåâûõ êëåòîê
ðàññìàòðèâàþòñÿ â êà÷åñòâå òðåõìåðíîé ìîäåëè in vitro
îïóõîëåâûõ ìèêðîçîí è ðàííèõ, áåññîñóäèñòûõ ýòàïîâ
îïóõîëåâîãî ðîñòà (Sutherland, Durand, 1984), õàðàêòåðèñòèêè êîòîðûõ çíà÷èòåëüíî îòëè÷àþòñÿ îò äâóõìåðíûõ
ìîíîñëîéíûõ êóëüòóð è ïåðñïåêòèâíû äëÿ èçó÷åíèÿ. Íàïðèìåð, ìîæíî ïðåäïîëîæèòü, ÷òî ïîÿâëåíèå íà ïîâåðõíîñòè êëåòîê ãåïàòîìû Çàéäåëà ãåòåðîîðãàííîãî àíòèãåíà
75—80 êÄà îáúÿñíÿåòñÿ åãî âîâëå÷åííîñòüþ â ïðîöåññ
ôîðìèðîâàíèÿ ìíîãîêëåòî÷íûõ àãðåãàòîâ.
Ðàáîòà âûïîëíåíà ïðè ôèíàíñîâîé ïîääåðæêå Ðîññèéñêîãî ôîíäà ôóíäàìåíòàëüíûõ èññëåäîâàíèé (ïðîåêò
04-04-49186).
Ñïèñîê ëèòåðàòóðû
Èâàíîâ Â. À. 1982. Âûÿâëåíèå àññîöèèðîâàííûõ ñ îïóõîëüþ ìåìáðàííûõ àíòèãåíîâ ïî÷å÷íîé ïðèðîäû â ïå÷åíè êðûñ
ïîñëå îäíîêðàòíîãî âîçäåéñòâèÿ 4-äèìåòèëàìèíîàçîáåíçîëîì.
Öèòîëîãèÿ. 249 (9) : 1099.
Èâàíîâ Â. À., Ôåëü Â. ß., Îëåíîâ Þ. Ì. 1975. Î ìåìáðàííûõ àíòèãåíàõ êëåòîê àñöèòíîé ãåïàòîìû Çàéäåëà. Öèòîëîãèÿ.
17 (1) : 24—29.
Ëåæíåâà Î. Ì. 1968. Âûÿâëåíèå ïîâåðõíîñòíûõ àíòèãåíîâ
íà æèâûõ êëåòêàõ ìåòîäîì ôëóîðåñöèðóþùèõ àíòèòåë. Â êí.:
Èììóíîõèìè÷åñêèé àíàëèç. Ì.: Ìåäèöèíà. 189—200.
Íàçàðîâ È. Â., Èâàíîâ Â. Ô., Ôåëü Â. ß. 1989. Àíòèãåííàÿ
äèâåðãåíöèÿ â ïåðâè÷íîé êóëüòóðå ãåïàòîöèòîâ êðûñ ïîñëå
âîçäåéñòâèÿ ãåïàòîêàíöåðîãåíîì N-äèýòèëíèòðîçàìèíîì. Öèòîëîãèÿ 31 (3) : 352—355.
Ðîçàíîâ Þ. Ì., Áàðñêèé È. ß., Ïàïàÿí Ã. Â., Ïëàòóíîâ Ñ. Å.,
Çàáðîäèí À. Ñ. 1990. Ìíîãîïàðàìåòðè÷åñêèé öèòîìåòð-àíàëèçàòîð íà áàçå ìèêðîñêîïà «ËÞÌÀÌ».  êí.: Àâòîìàòèçàöèÿ öèòîëîãè÷åñêèõ èññëåäîâàíèé. Êèåâ: Íàóê. äóìêà. 136—139.
Òåðþêîâà Í. Ï., Äåøåâà À. Ñ., Áëèíîâà Ã. È., Ìèðãîðîäñêàÿ Î. À., Èâàíîâ Â. À. 2007. Ñðàâíèòåëüíîå èçó÷åíèå àíòèãåíîâ, àññîöèèðîâàííûõ ñ ïëàçìàòè÷åñêèìè ìåìáðàíàìè ãåïàòîìíûõ è ìèîãåííûõ êëåòîê êðûñû, ñ èñïîëüçîâàíèåì àíòèïî÷å÷íîé ñûâîðîòêè. Öèòîëîãèÿ. 49 (11) : 944—951.
170
Í. Ï. Òåðþêîâà, Ã. È. Áëèíîâà è äð.
Òåðþêîâà Í. Ï., Òþðÿåâà È. È., Ãðàíäèëåâñêàÿ À. Á., Èâàíîâ Â. À. 1996. Ìåìáðàííûå ãåòåðîîðãàííûå àíòèãåíû îïóõîëåé ãåïàòîöåëëþëÿðíîãî è ìèîãåííîãî ïðîèñõîæäåíèÿ. Öèòîëîãèÿ. 38 (10) : 1092—1097.
Òþðÿåâà È. È., Ìèðãîðîäñêàÿ Î. À., ×åðåïàíîâà Î. À., Ïîäîëüñêàÿ Å. Ï., Íîâèêîâ À. Â., Õîäîðêîâñêèé Ì. À., Èâàíîâ Â. À.
2005. Âûÿâëåíèå è èäåíòèôèêàöèÿ ëàìèíèíà â ñîñòàâå ïëàçìàòè÷åñêèõ ìåìáðàí êëåòîê àñöèòíîé ãåïàòîìû Çàéäåëà êðûñ.
Öèòîëîãèÿ. 47 1 : 150—161.
Ôåëü Â. ß. 1990. Àíòèãåííàÿ äèâåðãåíöèÿ îïóõîëåâûõ êëåòîê, îáóñëîâëåííàÿ ýêñïðåññèåé ãåòåðîîðãàííûõ àíòèãåíîâ,
êàê ïðîÿâëåíèå äèñäèôôåðåíöèðîâêè ïðè êàíöåðîãåíåçå. Öèòîëîãèÿ. 32 (5) : 407—421.
Carloni V., Mazzocca A., Pantaleo P., Cordella C., Laffi G.,
Gentilini P. 2001. The integrin, alpha6beta1, is necessary for the
matrix-dependent activation of FAK and MAP kinase and the migration of human hepatocarcinoma cells. Hepatology. 34 : 42—49.
Carloni V., Romanelli R. G., Mercurio A. M., Pinzani M., Laffi G., Cotrozzi G., Gentilini P. 1998. Knockout of alpha6beta1-integrin expression reverses the transformed phenotype of hepatocarcinoma cells. Gastroenterology. 115 : 433—442.
Gupta P. D., Kumar G. K., Khar A. 1985. Cell to cell association in Zajdela ascitic hepatoma. An ultrastructural study. J. Submicrosc. Cytol. 17 : 421—427.
Haeffner E. W., Kolbe K., Schroeter D., Paweletz N. 1980. Isolation of a light and a heavy membrane-fraction of the glycogen-free Ehrlich—Lettre substain. Biochem. biophys. acta. 603 :
36—51.
Hendrich S., Pitot H. C. 1987. Enzymes of glutathione metabolism as biochemical markers during hepatocarcinogenesis. Cancer Metastasis Rev. 6 : 155—178.
Herlyn M., Koprowski H. 1988. Melanoma antigens: immunological and biological characterization and clinical significance.
Annu. Rev. Immunol. 6 : 283—308.
Jaskiewicz K., Chasen M. R. 1995. Differential expression of
transforming growth factor alpha, adhesions molecules and integrins in primary, metastatic liver tumors and in liver cirrhosis. Anticancer Res. 15 : 559—562.
Jaskiewicz K., Chasen M. R., Robson S. C. 1993. Differential
expression of matrix proteins in hepatocellular carcinoma and chronic live. Anticancer Res. 13 : 2229—2230.
Karavanova I. D., Troianovskii S. M., Bannikov G. A. 1987.
Expression of vimentin and prekeratins in solid and ascites variants
of Zajdela hepatoma. Bull. Exp. Biol. Med. 103 : 462—426.
Kawaguchi T., Ono T., Wakabayashi H., Igarashi S. 1994. Cell
surface laminin-like substances and laminin-related carbohydrates
of rat ascites hepatoma and its variants with different lung-colonizing potential. Clin. Exp. Metastasis. 12 : 203—212.
Laemmli U. K. 1970. Clevage of structural proteins during the
assembly of the head bacteriophage T4. Nature. 227 : 680—685.
Lietard J., Loreal O., Theret N., Campion J. P., L’Helgoualch A., Turlin B., Ramee M. P., Yamada Y., Clement B. 1998. La-
minin isoforms in non-tumoral and tumoral human livers. Expression of alpha1, alpha2, beta2 and gamma1 chain mRNA and an alpha chain homologous to the alpha2 chain. J. Hepatol. 28 : 691—
699.
Markwell M. A. K., Haas S. V., Bieber L. L., Tolbert N. E.
1978. A modification of the Lowry procedure to simplify protein
determination in membrane and lipoprotein samples. Anal. Biochem. 87 : 206—210.
Masumoto A., Arao S., Otsuki M. 1999. Role of beta1 integrins
in adhesion and invasion of hepatocellular carcinoma cells. Hepatology. 29 : 68—74.
Mendelsohn J. 1997. Epidermal growth factor receptor inhibition by a monoclonal antibody as anticancer therapy. Clin. Cancer
Res. 3 : 2703—2707.
Nato F., Bourrillon R. 1982. Purification and characterization
of a major cell surface glycoprotein in Zaidela ascites hepatoma
cells which displays a potent concanavalin A receptor activity.
J. Cell. Biochem. 18 : 245—260.
Rescan C., Coutant A., Talarmin H., Theret N., Glaise D., Guguen-Guillouzo C., Baffet G. 2001. Mechanism in the sequential
control of cell morphology and S phase entry by epidermal growth
factor involves distinct MEK/ERK activations. Mol. Biol. Cell. 12 :
725—738.
Rescan P.-V., Clèment B., Yamada Y., Glaise D., Segui-Real B., Baffet G., Guguen-Guillouzo C., Guillouzo A. 1991. Expression of laminin and its receptor LBP-32 in human and rat hepatoma
cells. Hepatology. 13 : 289—296.
Rescan P.-Y., Clèment B., Yamada Y., Segui-Real B., Baffet G.,
Guguen-Guillouzo C., Guillouzo A. 1990. Differential expression
of laminin chains and receptor (LBP-32) in fetal and neoplastic hepatocytes compared to normal adult hepatocytes in vivo and in culture. Amer. J. Pathol. 137 : 701—709.
Sutherland R. M., Durand R. E. 1984. Growth and cellular
characteristics of multicell spheroids. Recent Results Cancer Res.
95 : 24—49.
Trowbridge I. S., Lopez F. 1982. Monoclonal antibody to transferrin receptor-blocks transferrin binding and inhibits human tumor cell growth in vitro. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 79 : 1175—
1179.
Volpes R., van der Oord J. J., Desmet V. J. 1991. Distribution
of the VLA family of integrins in normal and pathological human
liver tissue. Gastroenterology. 101 : 200—206.
Volpes R., van den Oord J. J., Desmet V. J. 1993. Integrins as
differential cell lineage markers of primary liver tumors. Amer.
J. Pathol. 142 : 1483—1492.
Williams G. M. 1980. The pathogenesis of rat liver cancer caused by chemical carcinogens. Biochem. biophys. acta. 605 : 167—
189.
Yagita H., Masuko T., Hashimoto Y. 1986. Inhibition of tumor
cell growth in vitro by murine monoclonal antibodies that recognize
a proliferation-associated cell surface antigen system in rats and humans. Cancer Res. 46 : 1478—1484.
Ïîñòóïèëà 5 VI 2007
INVESTIGATION OF THE SURFACE HETEROORGANIC ANTIGENS OF RAT HEPATOMA CELLS
INVOLVED IN PROCESS OF CELL PROLIFERATION
N. P. Teryukova, G. I. Blinova, Yu. M. Rosanov, V. A. Ivanov
Institute of Cytology RAS, St. Petersburg; e-mail: [email protected]
The investigation of antigenic diversion of hepatoma cells resulting from the expression of heteroorganic
kidney antigens has been continued. Tumor-associated heteroorganic antigens 110—115 and 125—130 kDa were detected by immunoserum of narrow specificity in fractions of plasmatic membranes of cells of rat ascitic hepatoma Zajdela and cultured hepatoma HTC; the antigen 75—80 kDa was revealed only for hepatoma Zajdela
cells. It has been shown by methods of radioisotope analysis and flow DNA-cytometry that heteroorganic antigens 110—130 kDa can be involved in process of cell proliferation.
K e y w o r d s: antigenic diversion, hepatoma, cancerogenesis, tumor-associated antigens.
Скачать