выявление и идентификация

Реклама
2010
ÖÈÒÎËÎÃÈß
Ò î ì 52, ¹ 10
ÂÛßÂËÅÍÈÅ È ÈÄÅÍÒÈÔÈÊÀÖÈß ÎÏÓÕÎËÅÀÑÑÎÖÈÈÐÎÂÀÍÍÛÕ ÀÍÒÈÃÅÍÎÂ
 ÑÎÑÒÀÂÅ ÔÐÀÊÖÈÈ, ÎÁÎÃÀÙÅÍÍÎÉ ÏËÀÇÌÀÒÈ×ÅÑÊÈÌÈ ÌÅÌÁÐÀÍÀÌÈ
ÊËÅÒÎÊ ÀÑÖÈÒÍÎÉ ÃÅÏÀÒÎÌÛ ÇÀÉÄÅËÀ
© Í. Ï. Òåðþêîâà,1,* Î. À. Ìèðãîðîäñêàÿ,2 Ì. Â. Ñåðåáðÿêîâà,3 Â. À. Èâàíîâ1
1 Èíñòèòóò öèòîëîãèè ÐÀÍ,
àíàëèòè÷åñêîãî ïðèáîðîñòðîåíèÿ ÐÀÍ, Ñàíêò-Ïåòåðáóðã,
è 3 ÔÃÓ Íàó÷íî-èññëåäîâàòåëüñêèé èíñòèòóò ôèçèêî-õèìè÷åñêîé ìåäèöèíû, Ìîñêâà;
* ýëåêòðîííûé àäðåñ: [email protected]
2 Èíñòèòóò
Í. Ï. Òåðþêîâà, Î. À. Ìèðãîðîäñêàÿ è äð.
Ñ ïîìîùüþ îïóõîëåñïåöèôè÷åñêîé êðîëè÷üåé èììóíîñûâîðîòêè â ñîñòàâå ôðàêöèè, îáîãàùåííîé
ïëàçìàòè÷åñêèìè ìåìáðàíàìè êëåòîê àñöèòíîé ãåïàòîìû Çàéäåëà êðûñû, âûÿâëåíû è âûäåëåíû íà èììóíîñîðáåíòå îïóõîëåàññîöèèðîâàííûå àíòèãåíû ñ ìîë. ìàññàìè îêîëî 45, 57, 80 è 130 êÄà. Ñ ïîìîùüþ
ìàññ-ñïåêòðîìåòðè÷åñêîãî àíàëèçà áåëêè èäåíòèôèöèðîâàíû êàê b1-ñóáúåäèíèöà èíòåãðèíà, ýêòîíóêëåîòèäíàÿ ïèðîôîñôàòàçà/ôîñôîäèýñòåðàçà 3 (E-NPP3), áàñèãèí, ýïèòåëèàëüíàÿ ìîëåêóëà êëåòî÷íîé àäãåçèè (EpCAM), a-ôåòîïðîòåèí (AFP) è áåëêè-øàïåðîíû — ðåãóëèðóåìûé ãëþêîçîé ïðîòåèí 78 (GRP78)
è ïðîòåèí äèñóëüôèäèçîìåðàçà (PDI) A1. Îáñóæäàþòñÿ âîïðîñû, êàñàþùèåñÿ îñîáåííîñòåé ôóíêöèîíèðîâàíèÿ ýòèõ áåëêîâ â îïóõîëåâûõ êëåòêàõ è áèîëîãèè êëåòîê àñöèòíîé ãåïàòîìû Çàéäåëà.
Âûÿâëåíèå è èäåíòèôèêàöèÿ îïóõîëåàññîöèèðîâàííûõ àíòèãåíîâ
Ê ë þ ÷ å â û å ñ ë î â à: ãåïàòîìà, ìàññ-ñïåêòðîìåòðè÷åñêèé àíàëèç, îïóõîëåàññîöèèðîâàííûå àíòèãåíû, îïóõîëåèíèöèèðóþùèå êëåòêè, ýïèòåëèàëüíàÿ ìîëåêóëà êëåòî÷íîé àäãåçèè, ýïèòåëèàëüíî-ìåçåíõèìíûé ïåðåõîä.
Ï ð è í ÿ ò û å ñ î ê ð à ù å í è ÿ: ÃÊ — ãåïàòîöåëëþëÿðíàÿ êàðöèíîìà, ÌÏ — ìàòðèêñíûå ìåòàëëîïðîòåèíàçû, ÌÑ-àíàëèç — ìàññ-ñïåêòðîìåòðè÷åñêèé àíàëèç, ÏÀÀà — ïîëèàêðèëàìèäíûé ãåëü, ÝÌÏ —
ýïèòåëèàëüíî-ìåçåíõèìíûé ïåðåõîä, AFP — a-ôåòîïðîòåèí, E-NPP3 — ýêòîíóêëåîòèäíàÿ ïèðîôîñôàòàçà/ôîñôîäèýñòåðàçà 3, EpCAM — ýïèòåëèàëüíàÿ ìîëåêóëà êëåòî÷íîé àäãåçèè, GRP78 — ðåãóëèðóåìûé ãëþêîçîé ïðîòåèí 78, MAP-êèíàçà — ìèòîãåíàêòèâèðóåìàÿ ïðîòåèíêèíàçà, PDI — ïðîòåèí äèñóëüôèäèçîìåðàçà.
õîëåàññîöèèðîâàííûå àíòèãåíû ìîãóò áûòü èñïîëüçîâàíû â êà÷åñòâå ïîòåíöèàëüíûõ ìàðêåðîâ èëè âîçìîæíûõ
ìèøåíåé ïðè ðàçðàáîòêå íîâûõ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ïðåïàðàòîâ è èììóíîòåðàïèè. Ýòèì îáúÿñíÿåòñÿ àêòóàëüíîñòü èññëåäîâàíèé, íàïðàâëåííûõ íà èäåíòèôèêàöèþ
ìîëåêóë íàðóæíûõ ìåìáðàí îïóõîëåâûõ êëåòîê è âûÿñíåíèå èõ ðîëè â ïðîöåññå êëåòî÷íîé ìàëèãíèçàöèè.
Äëÿ èçó÷åíèÿ ðàçëè÷íûõ àñïåêòîâ áèîëîãèè îïóõîëåé
øèðîêî èñïîëüçóþòñÿ êóëüòèâèðóåìûå ëèíèè òðàíñôîðìèðîâàííûõ êëåòîê è ïåðåâèâàåìûå îïóõîëè.  íàøåé ëàáîðàòîðèè èçó÷åíèå ôåíîìåíà àíòèãåííîé äèâåðãåíöèè
ïðè îïóõîëåâîì ðîñòå ïðîâîäèòñÿ íà êëåòêàõ êðûñèíîé
ïåðåâèâàåìîé àñöèòíîé ãåïàòîìû Çàéäåëà, êîòîðûå ïðîëèôåðèðóþò â âèäå êëåòî÷íûõ îáðàçîâàíèé (îñòðîâêîâ,
èëè êîìïëåêñîâ), áîëåå èëè ìåíåå çíà÷èòåëüíûõ ïî ðàçìåðàì. Àíàëèç ïîïóëÿöèè êëåòîê àñöèòíîé ãåïàòîìû Çàéäåëà ïîêàçàë, ÷òî ïî ðÿäó ïðèçíàêîâ êàæäûé îñòðîâîê âåäåò ñåáÿ êàê îäíîðîäíûé êëîí (Çàéäåëà, 1963).
Çàäà÷à ïðåäïðèíÿòîãî íàìè èññëåäîâàíèÿ çàêëþ÷àåòñÿ â âûÿâëåíèè è èäåíòèôèêàöèè ïîâåðõíîñòíûõ îïóõîëåàññîöèèðîâàííûõ àíòèãåíîâ êëåòîê àñöèòíîé ãåïàòîìû
Çàéäåëà, ïîçâîëÿþùèõ îõàðàêòåðèçîâàòü ýòó ïåðåâèâàåìóþ îïóõîëü è îòâåòèòü íà âîïðîñ î ïðèðîäå ìíîãîêëåòî÷íûõ êîìïëåêñîâ â àñöèòè÷åñêîé æèäêîñòè êðûñ.
 íàñòîÿùåå âðåìÿ ñòàíîâèòñÿ î÷åâèäíûì, ÷òî ãåïàòîöåëëþëÿðíàÿ êàðöèíîìà (ÃÊ) ÿâëÿåòñÿ ãåòåðîãåííîé ïî
ñâîèì áèîëîãè÷åñêèì õàðàêòåðèñòèêàì ãðóïïîé îïóõîëåé, ïîäòèïû êîòîðîé õàðàêòåðèçóþòñÿ ãåíåòè÷åñêîé ãîìîãåííîñòüþ (Laurent-Puig et al., 2001; Katoh et al., 2007).
Ïðåäïîëàãàåòñÿ, ÷òî ñóùåñòâóþùàÿ ãåòåðîãåííîñòü ÃÊ
ÿâëÿåòñÿ ñëåäñòâèåì àêòèâàöèè ðàçëè÷íûõ ñèãíàëüíûõ
ïóòåé, òàêèõ êàê p53, RB1, Wnt, TGFb è Ras, â ïðîöåññå
êàíöåðîãåíåçà è(èëè) èõ ïðîèñõîæäåíèÿ îò êëåòîê, íàõîäÿùèõñÿ íà ðàçíûõ ñòàäèÿõ äèôôåðåíöèðîâêè, — ñòâîëîâûõ êëåòîê, êëåòîê-ïðåäøåñòâåííèêîâ èëè çðåëûõ ãåïàòîöèòîâ (Lee et al., 2006).
Öåëü íàøèõ èññëåäîâàíèé ñîñòîèò â èçó÷åíèè áèîëîãèè îïóõîëåâûõ êëåòîê, ñîñòàâà è îñîáåííîñòåé ôóíêöèîíèðîâàíèÿ áåëêîâ èõ ïîâåðõíîñòíûõ ìåìáðàí. Êîìïîíåíòû íàðóæíûõ ìåìáðàí îïðåäåëÿþò òàêèå êà÷åñòâà ìàëèãíèçèðîâàííûõ êëåòîê, êàê àäãåçèâíîñòü è ïîäâèæíîñòü,
èíâàçèâíîñòü è ñïîñîáíîñòü ê ìåòàñòàçèðîâàíèþ. Ïðîöåññ îïóõîëåâîé ïðîãðåññèè ñîïðîâîæäàåòñÿ ïîòåðåé
êëåòêàìè ðÿäà òêàíåñïåöèôè÷åñêèõ àíòèãåíîâ è ïðèîáðåòåíèåì îïóõîëåàññîöèèðîâàííûõ àíòèãåíîâ, êîòîðûå
ëèáî ñèíòåçèðóþòñÿ de novo, ëèáî îòëè÷àþòñÿ ïîâûøåííûì óðîâíåì ñèíòåçà ïî ñðàâíåíèþ ñ íîðìàëüíîé ãîìîëîãè÷íîé îïóõîëè òêàíüþ.  ìåäèöèíñêîé ïðàêòèêå îïó827
828
Í. Ï. Òåðþêîâà, Î. À. Ìèðãîðîäñêàÿ è äð.
Ìàòåðèàë è ìåòîäèêà
 îïûòàõ èñïîëüçîâàëè áåñïîðîäíûõ êðûñ-ñàìöîâ
ìàññîé 120—150 ã (ïèòîìíèê «Ðàïïîëîâî» ÐÀÌÍ). Ñóñïåíçèþ ãåïàòîöèòîâ èç ïå÷åíè èíòàêòíûõ êðûñ ãîòîâèëè
â ñîîòâåòñòâèè ñ ðåêîìåíäàöèÿìè Íàçàðîâà ñ ñîòðóäíèêàìè (1989). Êëåòêè ïåðåâèâàåìîé ãåïàòîìû Çàéäåëà îñàæäàëè èç àñöèòà êðûñû öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 50 g â òå÷åíèå 15 ìèí è îòìûâàëè 0.15 Ì NaCl èëè ñðåäîé DMEM.
Îïóõîëåñïåöèôè÷åñêóþ èììóíîñûâîðîòêó ïîëó÷àëè
ïóòåì èììóíèçàöèè êðîëèêîâ ôðàêöèåé, îáîãàùåííîé
ïîâåðõíîñòíûìè ìåìáðàíàìè ôëîòèðóþùèõ ìíîãîêëåòî÷íûõ àãðåãàòîâ ãåïàòîìû Çàéäåëà, ðîñò êîòîðûõ â òå÷åíèå 1 ìåñ ïîääåðæèâàëè in vitro â ñðåäå DMEM (Áèîëîò,
Ðîññèÿ), ñîäåðæàùåé 10 % ñûâîðîòêè êðîâè ïëîäîâ êîðîâû è 80 ìêã/ìë ãåíòàìèöèíà, â àòìîñôåðå 5 % CO2 ïðè
37 °Ñ. Èññëåäîâàíèÿ ïðîâîäèëè ñ èñïîëüçîâàíèåì ôðàêöèè IgG, âûäåëåííîé íà CNBr-àãàðîçå ñ èììîáèëèçèðîâàííûì áåëêîì À èç îïóõîëåñïåöèôè÷åñêîé èììóíîñûâîðîòêè ïîñëå 3-é è 4-é ðåèììóíèçàöèé êðîëèêà è òðèæäû èñòîùåííîé ãîìîãåíàòîì ïå÷åíè êðûñ.  êà÷åñòâå
êîíòðîëÿ èñïîëüçîâàëè ôðàêöèþ IgG, âûäåëåííóþ èç ñûâîðîòêè êðîâè èíòàêòíîãî êðîëèêà. Êîíöåíòðàöèÿ áåëêà
âî ôðàêöèÿõ IgG ñîñòàâëÿëà îêîëî 5 ìã/ìë.
Ôðàêöèè, îáîãàùåííûå ïëàçìàòè÷åñêèìè ìåìáðàíàìè èññëåäóåìûõ êëåòîê, âûäåëÿëè ïî ìåòîäó Õåôôíåðà ñ
ñîòðóäíèêàìè (Haeffner et al., 1980). Áåëîê âî ôðàêöèÿõ
îïðåäåëÿëè ïî ìåòîäó Ìàðêâåëëà ñ ñîòðóäíèêàìè (Markwell et al., 1978). Ñïåöèôè÷íîñòü ïîëó÷åííîé èììóíîñûâîðîòêè â îòíîøåíèè àíòèãåíîâ ïëàçìàòè÷åñêèõ ìåìáðàí
êëåòîê àñöèòíîé ãåïàòîìû Çàéäåëà îïðåäåëÿëè ìåòîäîì
èììóíîôåðìåíòíîãî àíàëèçà, êàê îïèñàíî ðàíåå (Òåðþêîâà è äð., 1996).
Äëÿ âûÿâëåíèÿ ïîâåðõíîñòíûõ îïóõîëåàññîöèèðîâàííûõ àíòèãåíîâ áåëêè ôðàêöèé ïëàçìàòè÷åñêèõ ìåìáðàí ïîäâåðãàëè SDS-ýëåêòðîôîðåçó â 7%-íîì ïîëèàêðèëàìèäíîì ãåëå (ÏÀÀÃ) è ïîñëåäóþùåìó èììóíîáëîòèíãó (Laemmli, 1970). Äëÿ îïðåäeëeíèÿ ìîë. ìàññû áeëêîâ
èñïîëüçîâàëè íàáîð ìàðêåðîâ ñëåäóþùåãî ñîñòàâà (â
êÄà): êàðáàíãèäðàçà — 29, îâàëüáóìèí — 45, àëüáóìèí — 67, ôîñôîðèëàçà b — 97.4, b-ãàëàêòîçèäàçà — 116
è ìèîçèí — 205 (Sigma, ÑØÀ).
Âûäåëåíèå îïóõîëåàññîöèèðîâàííûõ àíòèãåíîâ ïðîâîäèëè íà èììóíîñîðáåíòå ñ èñïîëüçîâàíèåì â êà÷åñòâå
ëèãàíäà IgG èç îïóõîëåñïåöèôè÷åñêîé èììóíîñûâîðîòêè. Áåëêè ôðàêöèé, îáîãàùåííûõ ïëàçìàòè÷åñêèìè ìåìáðàíàìè ãåïàòîìû Çàéäåëà, ëèçèðîâàëè 2%-íûì Òðèòîíîì
Õ-100 â 0.01 Ì íàòðèé-ôîñôàòíîì áóôåðíîì ðàñòâîðå,
ñîäåðæàùåì 0.15 Ì NaCl è 0.001 Ì ôåíèëìåòèëñóëüôîíèëôòîðèäà (ðÍ 7.4), íà ëüäó â òå÷åíèå 20 ìèí. Ñîëþáèëèçàò öåíòðèôóãèðîâàëè ïðè 10 000 g â òå÷åíèå 30 ìèí,
êîíöåíòðàöèþ NaCl â ñóïåðíàòàíòå óâåëè÷èâàëè äî 0.5 Ì
è ñîåäèíÿëè ñ èììóíîñîðáåíòîì íà 90 ìèí ïðè 4 °Ñ. Ñîðáåíò òùàòåëüíî îòìûâàëè îò íåñâÿçàâøåãîñÿ áåëêà áóôåðíûì ðàñòâîðîì, ñîäåðæàùèì 0.5 Ì NaCl è 0.5 % Òðèòîíà Õ-100. Áåëîê, ýëþèðóåìûé ñ èììóíîñîðáåíòà
0.05%-íûì äèýòèëàìèíîì (ðÍ 11.5) â ïðèñóòñòâèè äåòåðãåíòà, îñàæäàëè òðèõëîðóêñóñíîé êèñëîòîé ïðè ê/ê 5 %,
ïðîìûâàëè àöåòîíîì è ðàçäåëÿëè ñ ïîìîùüþ SDS-ýëåêòðîôîðåçà â 7%-íîì ÏÀÀÃ. Ïî îêîí÷àíèè ýëåêòðîôîðåçà ãåëü ôèêñèðîâàëè è îêðàøèâàëè ñåðåáðîì, êàê îïèñàíî ðàíåå (Òåðþêîâà è äð., 2005). Âûÿâëåííûå áåëêîâûå
ïîëîñû âûðåçàëè èç ÏÀÀÃ è îáðàáàòûâàëè òðèïñèíîì
â ñîîòâåòñòâèè ñ ìåòîäè÷åñêèìè ðåêîìåíäàöèÿìè, ðàçðàáîòàííûìè Øåâ÷åíêî ñ ñîàâòîðàìè äëÿ ïðîâåäåíèÿ
ìàññ-ñïåêòðîìåòðèè (Shevchenko et al., 1996). Ìàññ-ñïåêòðîìåòðè÷åñêèé àíàëèç (ÌÑ-àíàëèç) âûïîëíÿëè íà òàíäåìíîì âðåìÿïðîëåòíî-âðåìÿïðîëåòíîì MALDI-ìàñññïåêòðîìåòðå UltraflexII (Bruker Daltonics, Ãåðìàíèÿ) â
ðåæèìå ïîëîæèòåëüíûõ èîíîâ ñ èñïîëüçîâàíèåì ðåôëåêòðîíà. Èäåíòèôèêàöèþ áåëêîâ ïðîâîäèëè ìåòîäîì ïåïòèäíîãî ôèíãåðïðèíòà (peptide mass fingerprint, èëè «îòïå÷àòêîâ ïàëüöåâ»). Òî÷íîñòü îïðåäåëåíèÿ ìîíîèçîòîïíûõ ìàññ ïåïòèäîâ ïîñëå äîêàëèáðîâêè ìàññ-ñïåêòðîâ ïî
èçâåñòíûì ïèêàì àâòîëèçà òðèïñèíà ñîñòàâëÿëà 0.005 %.
Ïðîáû â îáúåìå 1 ìêë íàíîñèëè íà ìèøåíü, äîáàâëÿëè
0.5 ìêë ðàñòâîðà ìàòðèöû — 2,5-äèãèäðîêñèáåíçîéíîé
êèñëîòû â êîíöåíòðàöèè 20 ìêã/ìêë â 20%-íîì âîäíîì
àöåòîíèòðèëå ñ äîáàâëåíèåì 0.5 % òðèôòîðóêñóñíîé êèñëîòû. Ôðàãìåíòàöèþ îòäåëüíûõ ïåïòèäîâ ïðîâîäèëè â
òàíäåìíîì ðåæèìå Lift, òî÷íîñòü îïðåäåëåíèÿ ìîíîèçîòîïíûõ ìàññ èîíîâ ñîñòàâëÿëà 0.5 Äà. Ïîèñê áåëêîâ â áàçå
äàííûõ UniProtKB (SwissProt+ TrEMBL) ñðåäè áåëêîâ
êðûñ ïðîâîäèëè ïðè ïîìîùè ïðîãðàììû Mascot (matrixscience.com, ÑØÀ) ñ óêàçàííîé âûøå òî÷íîñòüþ ñ äîïóùåíèåì îêèñëåíèÿ ìåòèîíèíîâ êèñëîðîäîì âîçäóõà è àëêèëèðîâàíèÿ öèñòåèíîâûõ îñòàòêîâ àêðèëàìèäîì. Ñîâîêóïíûé ïîèñê ïî ñïåêòðàì òðèïòè÷åñêèõ ãèäðîëèçàòîâ
áåëêà è ñïåêòðîâ ôðàãìåíòàöèè îòäåëüíûõ ïåïòèäîâ áûë
ñäåëàí ñ èñïîëüçîâàíèåì ïðîãðàììû Biotools v.3 (Bruker
Daltonics, Ãåðìàíèÿ).
Ðåçóëüòàòû è îáñóæäåíèå
Äëÿ îáíàðóæåíèÿ â ñîñòàâå íàðóæíûõ ìåìáðàí êëåòîê àñöèòíîé ãåïàòîìû Çàéäåëà îïóõîëåàññîöèèðîâàííûõ
àíòèãåíîâ ìû ïîëó÷èëè êðîëè÷üþ îïóõîëåñïåöèôè÷åñêóþ èììóíîñûâîðîòêó ïðîòèâ ôðàêöèè, îáîãàùåííîé
ïëàçìàòè÷åñêèìè ìåìáðàíàìè ôëîòèðóþùèõ ìíîãîêëåòî÷íûõ àãðåãàòîâ. Ïî äàííûì èììóíîôåðìåíòíîãî àíàëèçà è èììóíîáëîòèíãà (ðèñ. 1, 2), ïîñëå òùàòåëüíîãî èñòîùåíèÿ ãîìîãåíàòîì ïå÷åíè ïîëó÷åííàÿ èììóíîñûâîðîòêà ïðàêòè÷åñêè íå âñòóïàåò âî âçàèìîäåéñòâèå ñ
ïðåïàðàòîì íàðóæíûõ ìåìáðàí ãåïàòîöèòîâ èíòàêòíûõ
Ðèñ. 1. Îïðåäåëåíèå ñâÿçûâàíèÿ îïóõîëåñïåöèôè÷åñêîé èììóíîñûâîðîòêè ñ àíòèãåíàìè ôðàêöèé, îáîãàùåííûõ ïëàçìàòè÷åñêèìè ìåìáðàíàìè ãåïàòîìû Çàéäåëà (1) è ãåïàòîöèòîâ
èíòàêòíûõ êðûñ (2), ìåòîäîì èììóíîôåðìåíòíîãî àíàëèçà.
Âûÿâëåíèå è èäåíòèôèêàöèÿ îïóõîëåàññîöèèðîâàííûõ àíòèãåíîâ
êðûñ. Âìåñòå ñ òåì èììóíîñûâîðîòêà ñïåöèôè÷íà â îòíîøåíèè ïëàçìàòè÷åñêèõ ìåìáðàí îïóõîëåâûõ êëåòîê è âûÿâëÿåò â èõ ñîñòàâå îïóõîëåàññîöèèðîâàííûå àíòèãåíû ñ
ìîë. ìàññàìè îêîëî 45, 57, 80, 130 è äâà âûñîêîìîëåêóëÿðíûõ àíòèãåíà.
Ïðîâåäåíî äâà ýêñïåðèìåíòà ïî âûäåëåíèþ îïóõîëåàññîöèèðîâàííûõ àíòèãåíîâ íà èììóíîñîðáåíòå è èõ
ÌÑ-àíàëèçó. Ïî ðåçóëüòàòàì SDS-ýëåêòðîôîðåçà â
7%-íîì ÏÀÀà ìîë. ìàññà áåëêîâ, ýëþèðîâàííûõ ñ èììóíîñîðáåíòà, ñîîòâåòñòâóåò ìîë. ìàññå îïóõîëåàññîöèèðîâàííûõ àíòèãåíîâ, âûÿâëåííûõ â èììóíîáëîòå, è ñîñòàâëÿåò îêîëî 45, 57, 80 è 130 êÄà (äàííûå íå ïîêàçàíû).
Âìåñòå ñ òåì âûñîêîìîëåêóëÿðíûå êîìïîíåíòû â ýëþàòå
îòñóòñòâóþò. Ðåçóëüòàòû ÌÑ-àíàëèçà âûðåçàííûõ èç ãåëÿ
áåëêîâûõ ïîëîñ, ïîëó÷åííûå ìåòîäîì ïåïòèäíîãî ôèíãåðïðèíòà, ïðåäñòàâëåíû â òàáë. 1. Âèäíî, ÷òî íå ìåíåå
10 òðèïòè÷åñêèõ ïåïòèäîâ êàæäîãî èç èäåíòèôèöèðîâàííûõ íàìè áåëêîâ ñîâïàäàþò ïî ìîíîèçîòîïíîé ìàññå ñ
ïåïòèäàìè ñîîòâåòñòâóþùèõ áåëêîâ èç áàçû äàííûõ. Ïðè
ýòîì «êîýôôèöèåíò äîñòîâåðíîñòè» èäåíòèôèêàöèè
âûøå ïîðîãîâîãî (ïðè çíà÷åíèè score >51 âåðîÿòíîñòü
ñëó÷àéíîãî ñîâïàäåíèÿ P < 0.05). Òàêèì îáðàçîì, â êàæäîé ïîëîñêå ãåëÿ ñ âûñîêîé ñòåïåíüþ äîñòîâåðíîñòè
íàìè îáíàðóæåíî ïî 1—2 ïðîòåèíà. Òåì íå ìåíåå äëÿ 3
áåëêîâ äîïîëíèòåëüíî ïðîâåäåíà ÌÑ—ÌÑ-ôðàãìåíòàöèÿ òðèïòè÷åñêèõ ïåïòèäîâ (òàáë. 2), êîòîðàÿ ïîäòâåðæäàåò ïðàâèëüíîñòü èäåíòèôèêàöèè áåëêîâ ïî èõ ïåïòèäíîìó ôèíãåðïðèíòó.
Èäåíòèôèöèðîâàííûå íàìè îïóõîëåàññîöèèðîâàííûå àíòèãåíû ïðåäñòàâëåíû äâóìÿ áåëêàìè-øàïåðîíàìè — ïðîòåèíîì äèñóëüôèäèçîìåðàçîé À1 è ðåãóëèðóåìûì ãëþêîçîé ïðîòåèíîì 78, ñåêðåòèðóåìûì ãëèêîïðîòåèíîì a-ôåòîïðîòåèíîì è èíòåãðàëüíûìè áåëêàìè —
b1-ñóáúåäèíèöåé èíòåãðèíà, áàñèãèíîì, ýêòîíóêëåîòèäíîé ïèðîôîñôàòàçîé/ôîñôîäèýñòåðàçîé 3 è ýïèòåëèàëüíîé ìîëåêóëîé êëåòî÷íîé àäãåçèè. Ñòîèò îòìåòèòü, ÷òî,
êàê ïðàâèëî, èññëåäîâàíèå ïðîòåîìà ïðåäïîëàãàåò ïðîâåäåíèå ÌÑ-àíàëèçà áåëêîâûõ ïÿòåí, ïîëó÷åííûõ ïîñëå
ðàçäåëåíèÿ èññëåäóåìîãî îáðàçöà ñòàíäàðòíûì ìåòîäîì
2D-ýëåêòðîôîðåçà. Ïðè ýòîì ðåäêî óäàåòñÿ èäåíòèôèöèðîâàòü èíòåãðàëüíûå áåëêè êëåòî÷íûõ ìåìáðàí, èçó÷åíèå
êîòîðûõ îãðàíè÷åíî èõ ãèäðîôîáíîñòüþ è íèçêèì ñîäåðæàíèåì â êëåòêå (Lu et al., 2008).  ïîñëåäíèå ãîäû äëÿ
àíàëèçà èíòåãðàëüíûõ áåëêîâ ðàçðàáàòûâàþòñÿ è âíåäðÿþòñÿ àëüòåðíàòèâíûå òåõíîëîãèè èõ ýôôåêòèâíîãî ðàçäåëåíèÿ (Zhao et al., 2004; Zhang et al., 2006; Braun et al.,
2007; Speers, Wu, 2007). Òî, ÷òî â ïðåäïðèíÿòîì íàìè èñ-
Ðèñ. 2. Âûÿâëåíèå îïóõîëåàññîöèèðîâàííûõ àíòèãåíîâ â ñîñòàâå íàðóæíûõ ìåìáðàí êëåòîê àñöèòíîé ãåïàòîìû Çàéäåëà ìåòîäîì èììóíîáëîòèíãà.
Áåëêè ôðàêöèé, îáîãàùåííûõ ïëàçìàòè÷åñêèìè ìåìáðàíàìè ãåïàòîöèòîâ èíòàêòíûõ êðûñ (à) è îïóõîëåâûõ êëåòîê (á), ðàçäåëÿÿ ìåòîäîì ýëåêòðîôîðåçà â 7%-íîì ÏÀÀà è ïîñëå ïåðåíîñà íà íèòðîöåëëþëîçó îáðàáàòûâàëè îïóõîëåñïåöèôè÷åñêîé èììóíîñûâîðîòêîé. ×èñëà ñëåâà — ìîëåêóëÿðíàÿ ìàññà ìàðêåðíûõ áåëêîâ, êÄà.
ñëåäîâàíèè îïóõîëåàññîöèèðîâàííûå àíòèãåíû, ïðåäâàðèòåëüíî âûäåëåííûå íà èììóíîñîðáåíòå, ðàçäåëÿëè â
ÏÀÀÃ ìåòîäîì îäíîìåðíîãî SDS-ýëåêòðîôîðåçà, ñïîñîáñòâîâàëî óñïåøíîé èäåíòèôèêàöèè íåêîòîðûõ èíòåãðàëüíûõ áåëêîâ.
Ãåïàòîöèòû âçðîñëîé êðûñû ñèíòåçèðóþò b1-ñóáúåäèíèöó èíòåãðèíîâ, áàñèãèí, PDIA1 è E-NPP3. Ïîýòîìó
ïîÿâëåíèå ýòèõ áåëêîâ â ñîñòàâå îïóõîëåàññîöèèðîâàííûõ àíòèãåíîâ, ïî âñåé âèäèìîñòè, ñâÿçàíî ñ ïîâûøåííûì óðîâíåì èõ ñèíòåçà êëåòêàìè ãåïàòîìû Çàéäåëà.
Î÷åâèäíî, ÷òî äëÿ ïîäòâåðæäåíèÿ òàêîé òî÷êè çðåíèÿ íåîáõîäèìî ïðîâåäåíèå äîïîëíèòåëüíûõ èññëåäîâàíèé ñ
Òàáëèöà 1
Èäåíòèôèêàöèÿ îïóõîëåàññîöèèðîâàííûõ àíòèãåíîâ ïîâåðõíîñòíûõ ìåìáðàí
êëåòîê ãåïàòîìû Çàéäåëà ñ ïîìîùüþ ìàññ-ñïåêòðîìåòðèè
Ìîëåêóëÿðíàÿ ìàññà,
êÄà (â ÏÀÀÃ)
130
80
57
45
Íàçâàíèå áåëêà è íîìåð
ïî áàçå UniProtKB/SwissProt
b1-èíòåãðèí, P49134
E-NPP3, P97675
AFP, P02773
GRP78, P06761
PDIA1, P04785
Áàñèãèí, P26453
EpCAM, O55159
829
Ìîëåêóëÿðíàÿ
ìàññà, Äà
Êîëè÷åñòâî
ñîâïàäàþùèõ
ïåïòèäîâ
Score («êîýôôèöèåíò äîñòîâåðíîñòè» èäåíòèôèêàöèè)
92 486
101 423
70 615
72 516
57 413
42 977
36 037
11
13
23
17
10
10
12
57
65
187
111
52
70
70
Í. Ï. Òåðþêîâà, Î. À. Ìèðãîðîäñêàÿ è äð.
830
Òàáëèöà 2
Ñåêâåíèðîâàíèå òðèïòè÷åñêèõ ïåïòèäîâ
ìåòîäîì òàíäåìíîé ìàññ-ñïåêòðîìåòðèè
Íàçâàíèå
áåëêà
E-NPP3
Áàñèãèí
EpCAM
m/z ôðàãìåíòèðóåìîãî
ïåïòèäà
1955.95
1052.56
1891.88
2296.11
Àìèíîêèñëîòíàÿ
ïîñëåäîâàòåëüíîñòü ïåïòèäà
NIPQDFFTFNSEEIVR
GNINVEGPPR
TQDDVDIADVAYYFEK
AQPYNFESLHTALQDTFASR
ïðèìåíåíèåì ñîîòâåòñòâóþùèõ àíòèòåë. Âìåñòå ñ òåì â
ëèòåðàòóðå èìåþòñÿ ñâåäåíèÿ îá ó÷àñòèè ýòèõ áåëêîâ â
îïóõîëåâîé ïðîãðåññèè.
Òàê, èçìåíåíèÿ â ñîñòàâå è óðîâíÿõ ýêñïðåññèè èíòåãðèíîâûõ ðåöåïòîðîâ ïðåäñòàâëÿþò ñîáîé õàðàêòåðíûå ïðîÿâëåíèÿ íàðóøåíèé äèôôåðåíöèðîâêè ãåïàòîöèòîâ â ïðîöåññå ãåïàòîêàíöåðîãåíåçà è îïóõîëåâîé ïðîãðåññèè (Ozaki et al., 1998). Èíòåãðèíîâûé ðåïåðòóàð
ãåïàòîöèòîâ íîðìàëüíîé âçðîñëîé ïå÷åíè îãðàíè÷åí ãåòåðîäèìåðàìè a1b1, a5b1 è a9b1. Êëåòêè ÃÊ ñîõðàíÿþò
ñèíòåç a1-ñóáúåäèíèö è de novo ñèíòåçèðóþò a2, a3- è
a6-ñóáúåäèíèöû èíòåãðèíîâ (Volpes et al., 1993). Ïðè
ýòîì îòìå÷àåòñÿ ïîâûøåííûé óðîâåíü ýêñïðåññèè
b1-ñóáúåäèíèöû èíòåãðèíà (Liu et al., 2002). Ëàìèíèíîâûå èíòåãðèíîâûå ðåöåïòîðû a6b1÷åðåç àêòèâàöèþ
ÌÀÐ-êèíàç ïðèâîäÿò ê èçìåíåíèþ àäãåçèâíûõ ñâîéñòâ
îïóõîëåâûõ êëåòîê, óâåëè÷èâàÿ èõ ïîäâèæíîñòü è èíâàçèâíîñòü (Carloni et al., 2001).
Äðóãîé òðàíñìåìáðàííûé ãëèêîïðîòåèí — áàñèãèí — òàêæå îòíîñèòñÿ ê ìîëåêóëàì êëåòî÷íîé àäãåçèè.
Áåëîê ñèíòåçèðóåòñÿ â ïå÷åíè êðûñ â óìåðåííûõ êîëè÷åñòâàõ è ýêñïðåññèðóåòñÿ íà ïîâåðõíîñòè áàçîëàòåðàëüíîãî äîìåíà ïëàçìàòè÷åñêèõ ìåìáðàí ãåïàòîöèòîâ (Kanekura et al., 1991). Áëàãîäàðÿ îñîáåííîñòÿì ñòðóêòóðû òðàíñìåìáðàííîãî äîìåíà áàñèãèí ôîðìèðóåò êîìïëåêñû ñ
íåêîòîðûìè ìåìáðàííûìè áåëêàìè, â òîì ÷èñëå ñ èíòåãðèíàìè. Íåïîñðåäñòâåííàÿ àññîöèàöèÿ áàñèãèíà ñ a3b1 è
a6b1-èíòåãðèíàìè îáíàðóæåíà â ìåñòàõ ìåæêëåòî÷íûõ
êîíòàêòîâ (Jiang, Tang, 2007). Àíàëèç áèîïñèéíîãî ìàòåðèàëà, ïîëó÷åííîãî îò ïàöèåíòîâ ñ ÃÊ, ïîêàçàë, ÷òî óæå
íà ðàííèõ ñòàäèÿõ çàáîëåâàíèÿ îïóõîëåâûå êëåòêè èíòåíñèâíî îêðàøèâàþòñÿ ìîíîêëîíàëüíûìè àíòèòåëàìè ê áàñèãèíó (Mamori et al., 2007). Íà êëåòî÷íûõ ëèíèÿõ ãåïàòîì óñòàíîâëåíî ó÷àñòèå áàñèãèíà â ïðîöåññàõ èíâàçèè è
ìåòàñòàçèðîâàíèÿ, êîòîðîå çàêëþ÷àåòñÿ â èíäóêöèè ñèíòåçà ìàòðèêñíûõ ìåòàëëîïðîòåèíàç (ÌÏ), îáåñïå÷èâàþùèõ äåñòðóêöèþ âíåêëåòî÷íîãî ìàòðèêñà ôèáðîáëàñòàìè
è ñàìèìè îïóõîëåâûìè êëåòêàìè.
Íåñìîòðÿ íà òî ÷òî îñíîâíûì ìåñòîì ëîêàëèçàöèè
áåëêîâ-øàïåðîíîâ ÿâëÿåòñÿ ýíäîïëàçìàòè÷åñêàÿ ñåòü, ãåïàòîöèòû ñåêðåòèðóþò PDIÀ1, êîòîðûé ñâÿçûâàåòñÿ ñ èõ
íàðóæíîé ìåìáðàíîé çà ñ÷åò ýëåêòðîñòàòè÷åñêèõ ñâÿçåé
(Terada et al., 1995). Â ñîñòàâå íàðóæíûõ ìåìáðàí PDI
ïðîÿâëÿåò ñåáÿ êàê ðåäóêòàçà, êîòîðàÿ âîññòàíàâëèâàåò
òèîëîâûå ãðóïïû ïîâåðõíîñòíûõ áåëêîâ è òàêèì îáðàçîì
ðåãóëèðóåò ðàçëè÷íûå ìåõàíèçìû êëåòî÷íîé àäãåçèè (Turano et al., 2002). Ïðè ïå÷åíî÷íîé ïàòîëîãèè â êðîâè ïàöèåíòîâ óâåëè÷èâàåòñÿ óðîâåíü ïðîëèë-4-ãèäðîêñèëàçû,
ñòðóêòóðíîé b-ñóáúåäèíèöåé êîòîðîé ÿâëÿåòñÿ PDI, à ñîäåðæàíèå ýíçèìà â êëåòêàõ ÃÊ ÷åëîâåêà â ñðåäíåì â 9.5
ðàçà ïðåâûøàåò íîðìó (Bolarin et al., 1983).
×ëåíû ñåìåéñòâà ýêòîýíçèìîâ E-NPP îáíàðóæåíû
ïðàêòè÷åñêè âî âñåõ òêàíÿõ, îäíàêî ýêñïðåññèÿ îòäåëüíûõ èçîôîðì îãðàíè÷åíà îïðåäåëåííûìè ñóáñòðóêòóðàìè
è (èëè) êëåòêàìè (Goding et al., 2003). Äëÿ íåêîòîðûõ
ôîðì êàðöèíîì ÷åëîâåêà ïîêàçàíà ñâÿçü ìåæäó ìàëèãíèçàöèåé è ýêñïðåññèåé E-NPP3: åãî ïîâûøåííîå ñîäåðæàíèå íàáëþäàåòñÿ â îïóõîëåâûõ êëåòêàõ è ñûâîðîòêå ïàöèåíòîâ ñ êàðöèíîìîé æåë÷íûõ ïðîòîêîâ è òîëñòîé êèøêè,
ïðè÷åì â ïîñëåäíåì ñëó÷àå àíòèãåí ïðèñóòñòâóåò êàê íà
àïèêàëüíîé, òàê è íà áàçîëàòåðàëüíîé ïîâåðõíîñòè îïóõîëåâûõ êëåòîê (Yano et al., 2003, 2004).  êëåòêàõ ïå÷åíè, ïîäæåëóäî÷íîé æåëåçû è òîíêîé êèøêè ÷åëîâåêà
E-NPP3 îòñóòñòâóåò, íî îáíàðóæèâàåòñÿ â ñîîòâåòñòâóþùèõ òêàíÿõ êðûñ. Ãåïàòîöèòû êðûñ, ïîäîáíî äðóãèì ýïèòåëèàëüíûì êëåòêàì, îáëàäàþò ïîëÿðíîñòüþ è ýêñïðåññèðóþò E-NPP3 èñêëþ÷èòåëüíî íà àïèêàëüíûõ ïîâåðõíîñòÿõ, îáðàçóþùèõ æåë÷íûå êàíàëèêóëû (Maurice et al.,
1988, 1999; Scott et al., 1997). Ïðè íåîïëàñòè÷åñêîé òðàíñôîðìàöèè ãåïàòîöèòîâ â ðàçíîé ñòåïåíè íàðóøàåòñÿ èõ
ïîëÿðíîñòü, òàê ÷òî íà ïîâåðõíîñòè êëåòîê íèçêîäèôôåðåíöèðîâàííûõ ÃÊ, èíäóöèðîâàííûõ 3-ìåòèë-äèìåòèëàìèíîàçîáåíçîëîì, E-NPP3 íå âûÿâëÿåòñÿ, íî ñîõðàíÿåòñÿ
â àïèêàëüíûõ ðàéîíàõ ïîëÿðíûõ êëåòîê àäåíîêàðöèíîì
(Scoazec et al., 1988). Ìîæíî ïðåäïîëîæèòü, ÷òî îáíàðóæåíèå E-NPP3 â ñîñòàâå îïóõîëåàññîöèèðîâàííûõ àíòèãåíîâ êëåòîê àñöèòíîé ãåïàòîìû Çàéäåëà îáúÿñíÿåòñÿ ïîëÿðíîñòüþ êëåòîê, îáðàçóþùèõ îñòðîâêè.
 îòëè÷èå îò ïðåäñòàâëåííûõ âûøå áåëêîâ îñíîâíûì
ìåñòîì ëîêàëèçàöèè øàïåðîíà GRP78 ÿâëÿåòñÿ ýíäîïëàçìàòè÷åñêàÿ ñåòü, è íà ïîâåðõíîñòè íîðìàëüíûõ êëåòîê,
âêëþ÷àÿ ãåïàòîöèòû, GRP78 íå îïðåäåëÿåòñÿ.  ïðîöåññå
îïóõîëåâîãî ðîñòà ñîäåðæàíèå GRP78 â êëåòêàõ ÃÊ óâåëè÷èâàåòñÿ ïðîïîðöèîíàëüíî ñòàäèè çàáîëåâàíèÿ (Fu,
Lee, 2003). Ïîâåðõíîñòíàÿ ëîêàëèçàöèÿ GRP78 ïîêàçàíà
äëÿ êëåòîê íåêîòîðûõ òèïîâ îïóõîëåé (Shin et al., 2003), â
òîì ÷èñëå è äëÿ êëåòîê ãåïàòîìû Çàéäåëà (Òþðÿåâà è äð.,
2005).
Ê ÷èñëó îïóõîëåàññîöèèðîâàííûõ àíòèãåíîâ, ñèíòåç êîòîðûõ â êëåòêàõ ãåïàòîìû Çàéäåëà îñóùåñòâëÿåòñÿ de novo, îòíîñÿòñÿ AFP è EpCAM. AFP ÿâëÿåòñÿ ýìáðèîíàëüíûì áåëêîì, ñèíòåç êîòîðîãî â ãåïàòîöèòàõ
âçðîñëîé ïå÷åíè ïðåêðàùàåòñÿ. Ïðè çëîêà÷åñòâåííîé
òðàíñôîðìàöèè ãåïàòîöèòîâ â 50—70 % ñëó÷àåâ âîçíèêíîâåíèÿ ÃÊ ñèíòåç áåëêà âîçîáíîâëÿåòñÿ, áëàãîäàðÿ
÷åìó AFP ÿâëÿåòñÿ îáùåïðèçíàííûì ìàðêåðîì ýòîãî
òèïà îïóõîëåé. Íåñìîòðÿ íà òî ÷òî AFP îòíîñèòñÿ ê ñåêðåòîðíîìó òèïó áåëêîâ, íå âñå AFP-ïðîäóöèðóþùèå êëåòî÷íûå ëèíèè ãåïàòîì ñåêðåòèðóþò åãî â ñðåäó. Èíòåðåñíî, ÷òî êëåòî÷íûå ëèíèè C, D è H ãåïàòîìû Çàéäåëà âûðàáàòûâàþò ýòîò áåëîê, íî òîëüêî ëèíèÿ H
ñåêðåòèðóåò åãî â ñðåäó (Sarcione, Smalley, 1976). Ïîêàçàíî òàêæå ñóùåñòâîâàíèå ìåìáðàííî-ñâÿçàííûõ ôîðì
AFP, êîòîðûå îïðåäåëÿþòñÿ íà ïîâåðõíîñòè êëåòîê è ìîãóò áûòü âûäåëåíû èç ôðàêöèè ïëàçìàòè÷åñêèõ ìåìáðàí
(Hosokawa et al., 1989). Ïîýòîìó ìîæíî ïðåäïîëîæèòü,
÷òî îáíàðóæåííûé íàìè â ñîñòàâå ôðàêöèè ïëàçìàòè÷åñêèõ ìåìáðàí ãåïàòîìû Çàéäåëà áåëîê îòíîñèòñÿ ê ìåìáðàííî-ñâÿçàííîé ôîðìå AFP.  îòíîøåíèè ôóíêöèé ýòîãî áåëêà â îïóõîëåâûõ êëåòêàõ îñòàåòñÿ ìíîãî íåðåøåííûõ âîïðîñîâ.
Íàèáîëüøèé èíòåðåñ ñ òî÷êè çðåíèÿ èíôîðìàòèâíîñòè ïðåäñòàâëÿåò EpCAM, êîòîðûé ïðèñóòñòâóåò â ñîñòàâå íàðóæíûõ ìåìáðàí êëåòîê íîðìàëüíîãî ýïèòåëèÿ
áîëüøèíñòâà îðãàíîâ, íî îòñóòñòâóåò â ãåïàòîöèòàõ
(Schmelzer, Reid, 2008). EpCAM ÿâëÿåòñÿ òðàíñìåìáðàí-
Âûÿâëåíèå è èäåíòèôèêàöèÿ îïóõîëåàññîöèèðîâàííûõ àíòèãåíîâ
íûì ãëèêîïðîòåèíîì, îïîñðåäóþùèì Ca2+-íåçàâèñèìóþ
ãîìîòèïè÷åñêóþ ìåæêëåòî÷íóþ àäãåçèþ (Balzar et al.,
1999). Îñîáûé èíòåðåñ ïðåäñòàâëÿåò EpCAM êàê ìàðêåð
ñòâîëîâûõ êëåòîê (êëåòîê-ïðåäøåñòâåííèêîâ) ïå÷åíè è
îïóõîëåèíèöèèðóþùèõ êëåòîê ÃÊ. Âûñîêèé óðîâåíü ýêñïðåññèè EpCAM â êëåòêàõ ÃÊ íàáëþäàåòñÿ ïðè àêòèâàöèè Wnt-b-êàòåíèí-ñèãíàëüíîãî ïóòè, êîìïîíåíòîì êîòîðîãî îí ÿâëÿåòñÿ. Èçâåñòíî, ÷òî Wnt-b-êàòåíèí-ñèãíàëèçàöèÿ èãðàåò ðåøàþùóþ ðîëü â ýìáðèîãåíåçå è
ïîääåðæàíèè ðîñòà ñòâîëîâûõ êëåòîê, â ðàçâèòèè è ðåãåíåðàöèè ïå÷åíè (Yamashita et al., 2007). Èçó÷åíèå ýêñïðåññèè EpCAM êëåòêàìè ÃÊ ïðèâîäèò íàñ ê îáñóæäåíèþ
îñíîâíîãî âîïðîñà ãåïàòîêàíöåðîãåíåçà — î ïðèðîäå
êëåòêè, èç êîòîðîé ðàçâèâàåòñÿ îïóõîëü ïå÷åíî÷íî-êëåòî÷íîãî ïðîèñõîæäåíèÿ.
Ñîâðåìåííûå ìåòîäû è ïîäõîäû ìîëåêóëÿðíîé îíêîëîãèè çíà÷èòåëüíî ðàñøèðèëè íàøè ïðåäñòàâëåíèÿ î òîì,
êàê ìîæåò ïðîèñõîäèòü çëîêà÷åñòâåííàÿ òðàíñôîðìàöèÿ
êëåòêè, î íà÷àëüíûõ, ìîëåêóëÿðíî-ãåíåòè÷åñêèõ ýòàïàõ
ïîâðåæäåíèÿ åå íàñëåäñòâåííîãî ìàòåðèàëà. Âìåñòå ñ òåì
äèñêóòèðóþòñÿ ñëåäóþùèå âîïðîñû: îïóõîëü âîçíèêàåò â
ðåçóëüòàòå äåäèôôåðåíöèðîâêè çðåëûõ êëåòîê èëè àðåñòà
äèôôåðåíöèðîâêè ñòâîëîâîé êëåòêè èëè êëåòêè-ïðåäøåñòâåííèêà; ñîäåðæàò ëè îïóõîëè ïîïóëÿöèþ êëåòîê, îáëàäàþùèõ õàðàêòåðèñòèêàìè îïóõîëåâûõ ñòâîëîâûõ êëåòîê, ò. å. îïóõîëåèíèöèèðóþùèõ êëåòîê (Sell, Leffert,
2008); è áóêâàëüíî â ïîñëåäíèé ãîä âñòàë âîïðîñ î ðîëè
ýïèòåëèàëüíî-ìåçåíõèìíîãî ïåðåõîäà (ÝÌÏ), íàáëþäàþùåãîñÿ íà ïîçäíèõ ñòàäèÿõ îïóõîëåâîé ïðîãðåññèè, â ãåíåðàöèè îïóõîëåèíèöèèðóþùèõ êëåòîê, ôîðìèðóþùèõ
ìåòàñòàçû.
 ïå÷åíè ÷åëîâåêà îáíàðóæèâàþòñÿ äâå ïîïóëÿöèè
ïëþðèïîòåíòíûõ êëåòîê-ïðåäøåñòâåííèêîâ ãåïàòîöèòîâ
è õîëàíãèîöèòîâ: ïå÷åíî÷íûå ñòâîëîâûå êëåòêè è èõ ïîòîìêè — ãåïàòîáëàñòû (Schmelzer et al., 2006, 2007). Îáå
ïîïóëÿöèè êëåòîê õàðàêòåðèçóþòñÿ âûñîêèì óðîâíåì ýêñïðåññèè EpCAM, ÷òî ïîçâîëÿåò èñïîëüçîâàòü ýòîò ãëèêîïðîòåèí â êà÷åñòâå ìàðêåðà ñòâîëîâûõ êëåòîê è êëåòîê-ïðåäøåñòâåííèêîâ ïå÷åíè. Íà ïîâåðõíîñòè êëåòîê
ÃÊ EpCAM ïîÿâëÿåòñÿ íà ðàííèõ ýòàïàõ ôîðìèðîâàíèÿ
îïóõîëè è ïðèìåðíî â 35 % ñëó÷àåâ ÃÊ. ßìàøèòà ñ ñîàâòîðàìè (Yamashita et al., 2008) èñïîëüçîâàëè EpCAM äëÿ
âûäåëåíèÿ íîâûõ ïðîãíîñòè÷åñêèõ ïîäòèïîâ ÃÊ: EpCAM-ïîçèòèâíûõ, èìåþùèõ ìîëåêóëÿðíûå õàðàêòåðèñòèêè îáùèå ñ ïå÷åíî÷íûìè ñòâîëîâûìè êëåòêàìè è
êëåòêàìè-ïðåäøåñòâåííèêàìè — ïðèñóòñòâèå öèòîêåðàòèíà 19, c-Kit, EpCAM, àêòèâàöèÿ Wnt-b-êàòåíèí-ñèãíàëüíîãî êàñêàäà — è EpCAÌ-íåãàòèâíûõ, ïðîÿâëÿþùèõ
ñõîäñòâî ñî çðåëûìè ãåïàòîöèòàìè. Ïîñëåäóþùåå äåëåíèå êàæäîé èç ãðóïï íà AFP-ïîçèòèâíóþ è AFP-íåãàòèâíóþ ïîäãðóïïû ïîçâîëÿåò îõàðàêòåðèçîâàòü 4 ïîäòèïà
ÃÊ, ðàçëè÷àþùèõñÿ êëåòî÷íûì ïðîèñõîæäåíèåì è ïðîãíîçîì. Òàê, àâòîðû ïðåäëàãàþò ñëåäóþùóþ íîìåíêëàòóðó: ÃÊ, ïîçèòèâíûå ïî EpCAM è AFP, ðàññìàòðèâàòü
êàê ÃÊ, ïîäîáíûå ïå÷åíî÷íûì ñòâîëîâûì êëåòêàì; ÃÊ,
ïîçèòèâíûå ïî EpCAM è íåãàòèâíûå ïî AFP, — êàê ÃÊ,
ïîäîáíûå ýïèòåëèþ æåë÷íûõ ïðîòîêîâ; ÃÊ, íåãàòèâíûå
ïî EpCAM è ïîçèòèâíûå ïî AFP, — êàê ÃÊ, ïîäîáíûå
ïðåäøåñòâåííèêàì ãåïàòîöèòîâ; ÃÊ, íåãàòèâíûå ïî EpCAM è AFP, — êàê ÃÊ, ïîäîáíûå çðåëûì ãåïàòîöèòàì.
Ïî ìíåíèþ àâòîðîâ, ÃÊ, ïîäîáíûå ïå÷åíî÷íûì ñòâîëîâûì êëåòêàì è ïðåäøåñòâåííèêàì ãåïàòîöèòîâ, âîçíèêàþò â ðåçóëüòàòå àðåñòà äèôôåðåíöèðîâêè êëåòîê-ïðåäøåñòâåííèêîâ è õàðàêòåðèçóþòñÿ àãðåññèâíûì òå÷åíèåì çàáîëåâàíèÿ è ïëîõèì ïðîãíîçîì.
831
Ïðåäïîëàãàåòñÿ, ÷òî EpCAM-ïîçèòèâíûå ÃÊ ìîãóò
áûòü îðãàíèçîâàíû â ñîîòâåòñòâèè ñ èåðàðõè÷åñêîé ìîäåëüþ êàíöåðîãåíåçà, ñîãëàñíî êîòîðîé EpCAM-ïîçèòèâíûå êëåòêè ìîãóò âûñòóïàòü â êà÷åñòâå îïóõîëåèíèöèèðóþùèõ êëåòîê, îáëàäàþùèõ ñïîñîáíîñòüþ äèôôåðåíöèðîâàòüñÿ â EpCAM-íåãàòèâíûå îïóõîëåâûå êëåòêè
(Yamashita et al., 2009). Â ïðîöåññå êóëüòèâèðîâàíèÿ
ôðàêöèè, îáîãàùåííîé EpCAM-ïîçèòèâíûìè êëåòêàìè,
äîëÿ EpCAM-ïîçèòèâíûõ êëåòîê ñîêðàùàåòñÿ äî èñõîäíîãî óðîâíÿ, ÷òî ìîæåò áûòü ðåçóëüòàòîì èõ äèôôåðåíöèðîâêè. Ïðè ýòîì íåáîëüøàÿ ïîïóëÿöèÿ EpCAM-ïîçèòèâíûõ êëåòîê âñåãäà ñîõðàíÿåòñÿ. EpCAM-ïîçèòèâíûå
êëåòêè ëèíèè HuH7 ýôôåêòèâíî ôîðìèðóþò êîëîíèè,
òîãäà êàê EpCAM-íåãàòèâíûå êëåòêè íå îáëàäàþò ýòèì
ñâîéñòâîì.
 ïå÷åíè ýêñïåðèìåíòàëüíûõ æèâîòíûõ òàêæå âûÿâëåíà ïîòåíöèàëüíàÿ ïîïóëÿöèÿ ñòâîëîâûõ êëåòîê (êëåòîê-ïðåäøåñòâåííèêîâ). Íåäèôôåðåíöèðîâàííûå êëåòêè,
êîòîðûå ÷àñòî íàçûâàþò îâàëüíûìè êëåòêàìè èç-çà îâèäíîé (ÿéöåïîäîáíîé) ôîðìû èõ ÿäðà, âîçíèêàþùèå â ðåçóëüòàòå ýêñïåðèìåíòàëüíîãî õèìè÷åñêîãî êàíöåðîãåíåçà, ýêñïðåññèðóþò EpCAM, AFP, CK19, OV-1-àíòèãåí è
a6-èíòåãðèí. Òðàíñïëàíòàöèîííûå ýêñïåðèìåíòû ïîêàçàëè,
÷òî EpCAM-ïîçèòèâíûå êëåòêè ÿâëÿþòñÿ êëåòêàìè-ïðåäøåñòâåííèêàìè, ñïîñîáíûìè âîññòàíàâëèâàòü ïàðåíõèìàòîçíûå êëåòêè ïå÷åíè êðûñ (Yovchev et al., 2007). Ïî äàííûì Îêàáå ñ ñîàâòîðàìè (Okabe et al., 2009), ïîïóëÿöèÿ EpCAM-ïîçèòèâíûõ êëåòîê ïå÷åíè æèâîòíûõ ïðîÿâëÿåò
îñíîâíûå ñâîéñòâà ñòâîëîâûõ êëåòîê — ñïîñîáíîñòü ôîðìèðîâàòü êîëîíèè in vitro è ïðè êëîíàëüíîé ýêñïàíñèè äèôôåðåíöèðîâàòüñÿ â ãåïàòîöèòû è õîëàíãèîöèòû.
Ïðåäñòàâëåíèÿ î ñóùåñòâîâàíèè îïóõîëåèíèöèèðóþùèõ êëåòîê íàõîäÿò ñâîå ïîäòâåðæäåíèå ïðè ðàññìîòðåíèè ïåðåâèâàåìûõ îïóõîëåé, èíäóöèðîâàííûõ ó êðûñ â
ïðîöåññå õèìè÷åñêîãî êàíöåðîãåíåçà (Morris, Wagner,
1968). Ñàì ôàêò, ÷òî êëåòêè ïåðåâèâàåìûõ ÃÊ ìîãóò êóëüòèâèðîâàòüñÿ in vitro è òðàíñïëàíòàáåëüíû, óêàçûâàåò íà
ïðèñóòñòâèå â èõ ñîñòàâå êëåòîê, ïîäîáíûõ ñòâîëîâûì, —
îïóõîëåèíèöèèðóþùèõ êëåòîê. Ïî ìíåíèþ Òðîòòà (Trott,
1974), ïðîïîðöèÿ îïóõîëåèíèöèèðóþùèõ êëåòîê â ïåðåâèâàåìûõ ÃÊ ìîæåò ñîñòàâëÿòü îò 0.1 äî 100 %. Â ëèòåðàòóðå íàì íå óäàëîñü íàéòè èññëåäîâàíèÿ, íàïðàâëåííûå
íà èçó÷åíèå îïóõîëåèíèöèèðóþùèõ êëåòîê ïåðåâèâàåìûõ ÃÊ.
Ñëåäóåò òàêæå îáñóäèòü åùå îäèí íåäàâíî âîçíèêøèé àñïåêò, ñâÿçàííûé ñ èçó÷åíèåì ìåõàíèçìà ìåòàñòàçèðîâàíèÿ îïóõîëåé. Èçâåñòíî, ÷òî àãðåññèâíîñòü è çëîêà÷åñòâåííîñòü îïóõîëåé ïðåæäå âñåãî îïðåäåëÿþòñÿ èõ
ñïîñîáíîñòüþ ê ìåòàñòàçèðîâàíèþ. Óñòàíîâëåíî, ÷òî ïî
ìåðå îïóõîëåâîé ïðîãðåññèè íàðóøàþòñÿ êîíòàêòû ìåæäó ýïèòåëèàëüíûìè êëåòêàìè, êîòîðûå ïðèîáðåòàþò ôåíîòèï ìåçåíõèìíûõ êëåòîê, îáëàäàþùèõ çíà÷èòåëüíîé
ïîäâèæíîñòüþ è èíâàçèâíîñòüþ. Ïåðåõîä êëåòîê îò ýïèòåëèàëüíîé ìîðôîëîãèè ê ìåçåíõèìíîé ïîëó÷èë íàçâàíèå
ýïèòåëèàëüíî-ìåçåíõèìíûé ïåðåõîä (ÝÌÏ). Êëþ÷åâûì
ìîìåíòîì ÝÌÏ ÿâëÿåòñÿ íèçêàÿ ðåãóëÿöèÿ ýêñïðåññèè
àäãåçèâíîãî áåëêà Å-êàäõåðèíà, îáåñïå÷èâàþùåãî ïëîòíûé êîíòàêò ìåæäó ýïèòåëèàëüíûìè êëåòêàìè. Ïðè ñîïîñòàâëåíèè äâóõ êëåòî÷íûõ ëèíèé ÃÊ, ïîëó÷åííûõ îò ïåðâè÷íîé îïóõîëè è ìåòàñòàòè÷åñêîé îïóõîëè, ïîêàçàíî,
÷òî ñâåðõýêñïðåññèÿ âèìåíòèíà, êîìïîíåíòà ïðîìåæóòî÷íûõ ôèëàìåíòîâ, ÿâëÿåòñÿ ìàðêåðîì ìåòàñòàçèðóþùèõ êëåòîê (Hu et al., 2004). ÝÌÏ ñîïðîâîæäàåòñÿ àêòèâàöèåé ðÿäà ñèãíàëüíûõ ïóòåé, â òîì ÷èñëå Wnt-b-êàòåíèíîâîãî è Ras-MAP-êèíàçíîãî (Guarino et al., 2007). Ïðè
832
Í. Ï. Òåðþêîâà, Î. À. Ìèðãîðîäñêàÿ è äð.
ýòîì òàêæå ïðîèñõîäèò èçìåíåíèå àêòèíîâîãî öèòîñêåëåòà, ñâÿçàííîå ñ óâåëè÷åíèåì ïîäâèæíîñòè îïóõîëåâûõ
êëåòîê, âîâëå÷åííûõ â ïðîöåññ ìåòàñòàçèðîâàíèÿ (Popow
et al., 2006). Íà ãåïàòîìå Ìîððèñà 5123 áûëî ïîêàçàíî,
÷òî èíâàçèâíûå îïóõîëåâûå êëåòêè îòëè÷àþòñÿ ïîâûøåííûìè óðîâíÿìè ýêñïðåññèè è ïîëèìåðèçàöèè b-àêòèíà.
Áîëåå òîãî, â îêðóãëûõ âûñîêîìîáèëüíûõ îïóõîëåâûõ
êëåòêàõ àêòèíîâûå ôèëàìåíòû áûëè ñêîíöåíòðèðîâàíû
ïîä ïëàçìàòè÷åñêîé ìåìáðàíîé, ôîðìèðóÿ ñóáêîðòèêàëüíûé «îáðó÷». ÝÌÏ ñïîñîáñòâóåò ðàçâèòèþ ïðîöåññà ìåòàñòàçèðîâàíèÿ, êîòîðûé ïðèâîäèò ê ðàñïðîñòðàíåíèþ ïî
îðãàíèçìó îïóõîëåâûõ êëåòîê è èõ êîëîíèçàöèè â îðãàíå-ìèøåíè. Êàêèìè æå ñâîéñòâàìè äîëæíû îáëàäàòü îïóõîëåâûå êëåòêè, ÷òîáû ñôîðìèðîâàòü ìàêðîñêîïè÷åñêèå
ìåòàñòàçû?  ðàáîòå, âûïîëíåííîé íà îïóõîëåâûõ êëåòêàõ ìîëî÷íîé æåëåçû, ïîêàçàíî, ÷òî áîëüøèíñòâî, åñëè
íå âñå êëåòêè, ãåíåðèðóåìûå âî âðåìÿ ÝÌÏ, ýêñïðåññèðóþò àíòèãåííûå ìàðêåðû, àññîöèèðîâàííûå ñ ôåíîòèïîì
ñòâîëîâûõ êëåòîê, è îáëàäàþò ñïîñîáíîñòüþ ê ñôåðîèäîîáðàçîâàíèþ è ôîðìèðîâàíèþ êîëîíèé â àãàðå (Mani et
al., 2008; Radisky, LaBarge, 2008). Áîëåå òîãî, ýòè êëåòêè
ýêñïðåññèðóþò ìàðêåðû ÝÌÏ, â ÷àñòíîñòè ïîâûøåííûé
óðîâåíü âèìåíòèíà, ôèáðîíåêòèíà, Twist è ðÿä äðóãèõ ìåçåíõèìíûõ ìàðêåðîâ. Ïîõîæèå ðåçóëüòàòû ïîëó÷åíû Ìîðåëåì ñ ñîòðóäíèêàìè (Morel et al., 2008), êîòîðûå ïîêàçàëè, ÷òî êëåòêè ñ õàðàêòåðèñòèêàìè îïóõîëåâûõ ñòâîëîâûõ
êëåòîê ìîãóò áûòü ãåíåðèðîâàíû ýïèòåëèàëüíûìè êëåòêàìè ïîñëå àêòèâàöèè â íèõ Ras—MAPK-ñèãíàëüíîãî
ïóòè è èíäóêöèè ÝÌÏ. Â ýòîé ñâÿçè âîçíèêàåò ðÿä âîïðîñîâ. Âñå ëè îïóõîëåâûå êëåòêè â ñîñòîÿíèè ÝÌÏ ïðåâðàùàþòñÿ â êëåòêè, îáëàäàþùèå ñâîéñòâàìè ñòâîëîâûõ
êëåòîê (êëåòîê-ïðåäøåñòâåííèêîâ), èëè ñóùåñòâóåò íåñêîëüêî ñòàäèé ÝÌÏ? ßâëÿåòñÿ ëè ñòàäèÿ ìåòàñòàçèðîâàíèÿ ñòàäèåé ÝÌÏ, àññîöèèðîâàííîé ñ ãåíåðàöèåé îïóõîëåèíèöèèðóþùèõ êëåòîê?
Âîïðîñ î ïðèðîäå êëåòîê ïåðåâèâíîé àñöèòíîé ãåïàòîìû Çàéäåëà íå ïîäíèìàëñÿ ñ 1963 ã. (Çàéäåëà, 1963),
õîòÿ íàêîïëåííûå ñ òåõ ïîð äàííûå îá ýòèõ êëåòêàõ è
áèîëîãèè îïóõîëåé ïîçâîëÿþò âûäâèíóòü ïðåäïîëîæåíèå
î ïðîèñõîæäåíèè ìíîãîêëåòî÷íûõ îñòðîâêîâ. Ñîãëàñíî
êëàññèôèêàöèè ßìàøèòà ñ ñîòðóäíèêàìè (Yamashita et
al., 2008), ýêñïðåññèÿ EpCAM è AFP êëåòêàìè ïåðâè÷íûõ
ãåïàòîì óêàçûâàåò íà èõ ïðîèñõîæäåíèå îò ñòâîëîâûõ
êëåòîê (êëåòîê-ïðåäøåñòâåííèêîâ), íî òàê ëè ýòî äëÿ ïåðåâèâàåìûõ îïóõîëåé, â òîì ÷èñëå äëÿ ãåïàòîìû Çàéäåëà?
Êëåòêè ãåïàòîìû Çàéäåëà ïðîÿâëÿþò õàðàêòåðèñòèêè
ÝÌÏ: ýêñïðåññèðóþò âèìåíòèí (Karavanova et al., 1987),
èìåþò îêðóãëóþ ôîðìó ñ óâåëè÷åííûì ñîäåðæàíèåì
b-àêòèíà â îáëàñòè ïëàçìàòè÷åñêîé ìåìáðàíû, ÷òî ìîæåò
áûòü ïðèçíàêîì ïîâûøåííîé ìîáèëüíîñòè êëåòîê (Òåðþêîâà è äð., 2007). Ðàíåå â ñîñòàâå íåãèñòîíîâûõ áåëêîâ
õðîìàòèíà êëåòîê ãåïàòîìû Çàéäåëà ìû èäåíòèôèöèðîâàëè ERK2-MAP-êèíàçó, ÷òî ñâèäåòåëüñòâóåò îá àêòèâàöèè
â êëåòêàõ Ras-MAPK-ñèãíàëüíîãî ïóòè (Òåðþêîâà è äð.,
2005), ó÷àñòâóþùåãî â èíäóêöèè ÝÌÏ. Ìîæíî ïðåäïîëîæèòü, ÷òî â êëåòêàõ ãåïàòîìû Çàéäåëà èíäóêöèÿ ÝÌÏ
ñâÿçàíà ñ àêòèâàöèåé Wnt-b-êàòåèí-ñèãíàëüíîãî ïóòè è
ãåíåðàöèåé îïóõîëåèíèöèèðóþùèõ EpCAM-ïîçèòèâíûõ
êëåòîê, ôîðìèðóþùèõ êëîíû. Ãåïàòîìà Çàéäåëà ÿâëÿåòñÿ
ïåðåâèâàåìîé îïóõîëüþ, êëåòêè êîòîðîé èñïîëüçóþòñÿ â
ýêñïåðèìåíòàëüíîé îíêîëîãèè áîëåå 50 ëåò, ÷òî óêàçûâàåò íà èõ âûñîêóþ ñïîñîáíîñòü ê ñàìîïîääåðæàíèþ, è
âïîëíå äîïóñòèìî, ÷òî îíè îáîãàùåíû ïîïóëÿöèåé îïóõîëåèíèöèèðóþùèõ êëåòîê. Êëåòêè, ôîðìèðóþùèå êëîíû â àñöèòè÷åñêîé æèäêîñòè, ïðè êóëüòèâèðîâàíèè in vit-
ro ïðèêðåïëÿþòñÿ ê ïëàñòèêó è îáðàçóþò ìîíîñëîé, èçìåíÿÿ ñâîè ìîðôîëîãè÷åñêèå è ìåòàáîëè÷åñêèå õàðàêòåðèñòèêè â ñòîðîíó çðåëûõ ãåïàòîöèòîâ (Staedel, Beck, 1978).
 êëåòêàõ ïîÿâëÿþòñÿ êðóïíûå âêðàïëåíèÿ ãëèêîãåíà, êîòîðûé ÷àñòî àññîöèèðîâàí ñ ìíîãî÷èñëåííûìè ëèïèäíûìè êàïëÿìè. Àâòîðû îòìå÷àþò, ÷òî ïîäîáíûé ôåíîìåí ðåâåðñèè â ìåòàáîëèçìå ãëèêîãåíà ðàíåå íèêîãäà íå
íàáëþäàëñÿ äëÿ îïóõîëåâûõ êëåòîê ïå÷åíè. Ìîæíî ïðåäïîëîæèòü, ÷òî ýòî ÿâëÿåòñÿ ïðîÿâëåíèåì ÷àñòè÷íîé äèôôåðåíöèðîâêè êëåòîê, âîçíèêàþùèõ â ðåçóëüòàòå àñèììåòðè÷íîãî äåëåíèÿ EpCAM-ïîçèòèâíûõ îïóõîëåèíèöèèðóþùèõ êëåòîê, ïðèñóòñòâóþùèõ â ñîñòàâå
ìíîãîêëåòî÷íûõ îñòðîâêîâ. Íà îñíîâàíèè ëèòåðàòóðíûõ
äàííûõ è ðåçóëüòàòîâ ïðîâåäåííûõ íàìè èññëåäîâàíèé â
êà÷åñòâå ðàáî÷åé ãèïîòåçû ìîæíî äîïóñòèòü, ÷òî ãåïàòîìà Çàéäåëà ÿâëÿåòñÿ ïåðñïåêòèâíîé ìîäåëüþ äëÿ èçó÷åíèÿ ïîçäíèõ ýòàïîâ îïóõîëåâîé ïðîãðåññèè, òàêèõ êàê
ÝÌÏ è ìåòàñòàçèðîâàíèå, ÷òî îñòðîâêè ïðåäñòàâëÿþò ñîáîé êëîíû êëåòîê, âîçíèêàþùèå â ïðîöåññå ÝÌÏ. Âûÿâëåíèå EpCAM-ïîçèòèâíîé ïîïóëÿöèè îïóõîëåèíèöèèðóþùèõ êëåòîê ãåïàòîìû Çàéäåëà è èçó÷åíèå èõ áèîëîãèè
ïðåäñòàâëÿåò çàäà÷ó íàøåé äàëüíåéøåé ðàáîòû.
Ñïèñîê ëèòåðàòóðû
Çàéäåëà Ô. 1963. Ïðèìåíåíèå àñöèòíîé ãåïàòîìû äëÿ èçó÷åíèÿ öèòîëîãèè ðàêà. Âîïð. îíêîë. 9 (5) : 25—33.
Íàçàðîâ È. Â., Èâàíîâ Â. À., Ôåëü Â. ß. 1989. Àíòèãåííàÿ
äèâåðãåíöèÿ â ïåðâè÷íîé êóëüòóðå ãåïàòîöèòîâ êðûñ ïîñëå
âîçäåéñòâèÿ ãåïàòîêàíöåðîãåíîì N-äèýòèëíèòðîçàìèíîì. Öèòîëîãèÿ. 31 (3) : 352—355.
Òåðþêîâà Í. Ï., Äåøåâà À. Ñ., Áëèíîâà Ã. È., Ìèðãîðîäñêàÿ Î. À., Èâàíîâ Â. À. 2007. Ñðàâíèòåëüíîå èçó÷åíèå àíòèãåíîâ, àññîöèèðîâàííûõ ñ ïëàçìàòè÷åñêèìè ìåìáðàíàìè ãåïàòîìíûõ è ìèîãåííûõ êëåòîê êðûñû, ñ èñïîëüçîâàíèåì àíòèïî÷å÷íîé ñûâîðîòêè. Öèòîëîãèÿ. 49 (11) : 944—951.
Òåðþêîâà Í. Ï., Èâàøêèíà Ï. À., Ìèðãîðîäñêàÿ Î. À., Èâàíîâ Â. À. 2005. Âûÿâëåíèå è èäåíòèôèêàöèÿ îïóõîëåàññîöèèðîâàííîãî ãåòåðîîðãàííîãî àíòèãåíà ãåïàòîìû Çàéäåëà â ñîñòàâå íåãèñòîíîâûõ áåëêîâ õðîìàòèíà. Öèòîëîãèÿ. 47 (12) :
1048—1054.
Òåðþêîâà Í. Ï., Òþðÿåâà È. È., Ãðàíäèëåâñêàÿ À. Á., Èâàíîâ Â. À. 1996. Ìåìáðàííûå ãåòåðîîðãàííûå àíòèãåíû îïóõîëåé ãåïàòîöåëëþëÿðíîãî è ìèîãåííîãî ïðîèñõîæäåíèÿ. Öèòîëîãèÿ. 38 (10) : 1092—1097.
Òþðÿåâà È. È., Ìèðãîðîäñêàÿ Î. À., ×åðåïàíîâà Î. À., Ïîäîëüñêàÿ Å. Ï., Ñåðåáðÿêîâà Ì. Â., Èâàíîâ Â. À. 2005. Âçàèìîäåéñòâèå ëàìèíèíà ñ êîìïîíåíòàìè ïëàçìàòè÷åñêèõ ìåìáðàí
êëåòîê àñöèòíîé ãåïàòîìû Çàéäåëà. Öèòîëîãèÿ. 47 (12) :
1039—1047.
Balzar M., Winter M. J., de Boer C. J., Litvinov S. V. 1999. The
biology of the 17-1A antigen (Ep-CAM). J. Mol. Med. 77 : 699—
712.
Bolarin D., Andy J. J., Alabi Z. O. 1983. Liver immunoreactive
prolyl hydroxylase protein in human primary hepatocellular carcinoma. Hepatogastroenterology. 30 : 230—232.
Braun R. J., Kinkl N., Beer M., Ueffing M. 2007. Two-dimensional electrophoresis of membrane proteins. Anal. Bioanal. Chem.
389 : 1033—1045.
Carloni V., Mazzocca A., Pantaleo P., Cordella C., Laffi G.,
Gentilini P. 2001. The integrin, alpha6beta1, is necessary for the
matrix-dependent activation of FAK and MAP kinase and the migration of human hepatocarcinoma cells. Hepatology. 34:42—49.
Fu Y., Lee A. S. 2003. Glucose regulated proteins in cancer
progression, drug resistance and immunotherapy. Cancer Biol.
Ther. 5 : 741—744.
Goding J. W., Grobbenb B., Slegers H. 2003. Physiological and
pathophysiological functions of the ecto-nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family. Biochim. biophys. acta. 1638 : 1—19.
Âûÿâëåíèå è èäåíòèôèêàöèÿ îïóõîëåàññîöèèðîâàííûõ àíòèãåíîâ
Guarino M., Rubino B., Ballabio G. 2007. The role of epithelial-mesenchymal transition in cancer pathology. Pathology.
39 : 305—318.
Haeffner E. W., Kolbe K., Schroeter D., Paweletz N. 1980. Isolation of a light and a heavy membrane-fraction of the glycogen-free Ehrlich—Lettre substain. Biochim. biophys. acta. 603 : 36—51.
Hosokawa S., Muramatsu M., Nagaike K. 1989. Detection of
membrane-bound a-fetoprotein in human hepatoma cell lines by
monoclonal antibody 19F12. Cancer Res. 49 : 361—366.
Hu L., Lau S. H., Tzang C. H., Wen J. M., Wang W., Xie D.,
Huang M., Wang Y., Wu M. C., Huang J. F., Zeng W. F.,
Sham J. S., Yang M., Guan X. Y. 2004. Association of vimentin
overexpression and hepatocellular carcinoma metastasis. Oncogene. 23 : 298—302.
Jiang J. L., Tang J. 2007. CD147 and its interacting proteins in
cellular functions. Acta Physiol. Sinica. 59 : 517—523.
Kanekura T., Miyauchi T., Tashiro M., Muramatsu T. 1991.
Basigin, a new member of the immunoglobulin superfamily: genes
in different mammalian species, glycosylation changes in the molecule from adult organs and possible variation in the N-terminal sequences. Cell Struct. Funct. 16 : 23—30.
Karavanova I. D., Troianovskij S. M., Bannikov G. A. 1987.
Expression of vimentin and prekeratins in solid and ascites variants
of Zajdela hepatoma. Biull. Eksp. Biol. Med. 103 : 462—466.
Katoh H., Ojima H., Kokubu A., Saito S., Kondo T., Kosuge T.,
Hosoda F., Imoto I., Inazawa J., Hirohashi S., Shibata T. 2007. Genetically distinct and clinically relevant classification of hepatocellular carcinoma: putative therapeutic targets. Gastroenterology.
133 : 1475—1486.
Laemmli U. K. 1970. Clevage of structural proteins during the
assembly of the head bacteriophage T4. Nature. 227 : 680—685.
Laurent-Puig P., Legoix P., Bluteau O., Belghiti J., Franco D.,
Binot F., Monges G., Thomas G., Bioulac-Sage P., Zucman-Rossi J.
2001. Genetic alterations associated with hepatocellular carcinomas
define distinct pathways of hepatocarcinogenesis. Gastroenterology. 120 : 1763—1773.
Lee J. S., Heo J., Libbrecht L., Chu I. S., Kaposi-Novak P.,
Calvisi D. F., Mikaelyan A., Roberts L. R., Dematris A. J., Sun Z.,
Nevens F., Roskams T., Thorgeirsson S. S. 2006. A novel prognostic subtype of human hepatocellular carcinoma derived from hepatic progenitor cells. Nat. Med. 12 : 410—416.
Liu L. X., Jiang H. C., Liu Z. H., Zhou J., Zhang W. H.,
Zhu A. L., Wang X. Q., Wu M. 2002. Intergrin gene expression profiles of human hepatocellular carcinoma. World J. Gastroenterol.
8 : 631—637.
Lu B., McClatchy D. B., Kim J. Y., Yates J. R. 2008. Strategies
for shotgun identification of integral membrane proteins by tandem
mass spectrometry. Proteomics. 8 : 3947—3955.
Mamori S., Nagatsuma K., Matsuura T., Ohkawa K., Hano H.,
Fukunaga M., Matsushima M., Masui Y., Fushiya N., Onoda H., Searashi Y., Takagi I., Tagiri H. 2007. Useful detection of CD147
(EMMPRIN) for pathological diagnosis of early hepatocellular carcinoma in needle biopsy samples. World J. Gastroenterol. 13 :
2913—2917.
Mani S. A., Guo W., Liao M. J., Eaton E. N., Ayyanan A.,
Zhou A. Y., Brooks M., Reinhard F., Zhang C. C., Shipitsin M.,
Campbell L. L., Polyak K., Brisken C., Yang J., Weinberg R. A.
2008. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with
properties of stem cells. Cell. 133 : 704—715.
Markwell M. A. K., Haas S. V., Bieber L. L., Tolbert N. E.
1978. A modification of the Lowry procedure to simplify protein
determination in membrane and lipoprotein samples. Anal. Biochem. 87 : 206—210.
Maurice M., Rajho M. N., Bello V., Trugnan G., Ait S. T. 1999.
Polarized expression of type I phosphodiesterases in epithelial
cells. J. Soc. Biol. 193 : 135—138.
Maurice M., Rogier E., Cassio D., Fieldmann G. 1988. Formation of plasma membrane domains in rat hepatocytes and hepatoma
cell lines in culture. J. Cell Sci. 90 : 79—92.
Morel A. P., Liévre M., Thomas C., Hinkal G., Ansieau S., Puisieux A. 2008. Generation of breast cancer stem cells through epithelial-mesenchymal transition. PLoS One. 3 : e2888.
833
Morris H. P., Wagner B. P. 1968. Induction and transplantation of rat hepatomas with different growth rate (including «minimal
deviation» hepatomas). Meth. Cancer Res. IV : 125—152.
Okabe M., Tsukahara Y., Tanaka M., Suzuki K., Saito S., Kamiya Y., Tsujimura T., Nakamura K., Miyajima A. 2009. Potential
hepatic stem cells reside in EpCAM+ cells of normal and injured
mouse liver. Development. 136 : 1951—1960.
Ozaki I., Yamamoto K., Mizuta T., Kajihara S., Fukushima N.,
Setoguchi Y., Morito F., Sakai T. 1998. Differential expression of
laminin receptors in human hepatocellular carcinoma. Gut. 43 :
837—842.
Popow A., Nowak D., Malicka-Blaszkiewicz M. 2006. Actin cytoskeleton and b-actin expression in correlation with higher invasiveness of selected hepatoma Morris 5123 cells. J. Physiol. Pharmacol. 57 : 111—123.
Radisky D. C., LaBarge M. A. 2008. Epithelial-mesenchymal
transition and the stem cell phenotype. Cell Stem Cell. 2 : 511—
512.
Sarcione E. J., Smalley J. R. 1976. Intracellular synthesis of
a-fetoprotein and fibrinogen without secretion by Zajdela at ascites
hepatoma cells. Cancer Res. 36 : 3203—3206.
Schmelzer E., Reid L. M. 2008. EpCAM expression in normal,
non-pathological tissues. Front. Biosci. 13 : 3096—3100.
Schmelzer E., Wauthier E., Reid L.M. 2006. The phenotypes of
pluripotent human hepatic progenitors. Stem Cells. 24 : 1852—
1858.
Schmelzer E., Zhang L., Bruce A., Wauthier E., Ludlow J.,
Yao H. L., Moss N., Melhem A., McClelland R., Turner W., Kulik M., Sherwood S., Tallheden T., Cheng N., Furth M. E.,
Reid L. M. 2007. Human hepatic stem cells from fetal and postnatal
donors. JEM. 204 : 1973—1987.
Scoazec J. Y., Maurice M., Moreau A., Feldmann G. 1988.
Analysis of hepatocyte plasma membrane polarity during rat
azo dye hepatocarcinogenesis using monoclonal antibodies directed against domain-associated antigens. Cancer Res. 48 : 6882—
6890.
Scott L. J., le Delautier D., Meerson N. P., Trugnan G., Goding J. W., le Maurice M. 1997. Biochemical and molecular identification of distinct forms of alkaline phosphodiesterase I expressed
on the apical and basolateral surface of rat hepatocytes. Hepatology. 25 : 995—1002.
Sell S., Leffert H. L. 2008. Liver cancer stem cells. J. Clin. Oncol. 26 : 2800—2805.
Shevchenko A., Wilm M., Vorm O., Mann M. 1996. Mass spectrometric sequencing of proteins from silver-stained polyacrylamide
gels. Anal. Chem. 68 : 850—858.
Shin B. K., Wang H., Yim A. M., Le Naour F., Brichory F.,
Jang J. H., Zhao R., Puravs E., Tra J., Michael C. W., Misek D. E.,
Hanash S.M. 2003. Global profiling of the cell surface proteome of
cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function. J. Biol. Chem. 278 : 7607—7616.
Speers A. E., Wu C. C. 2007. Proteomics of integral membrane
proteins — theory and application. Chem. Rev. 107 : 3687—3714.
Staedel C., Beck J. P. 1978. Resurgence of glycogen synthesis
and storage capacity in cultured hepatoma cells. Cell Differentiation. 7 : 61—71.
Terada K., Manchikalapudi P., Noiva R., Jauregui H. O., Stockert R. J., Schilsky M. L. 1995. Secretion, surface localization, turnover, and steady state expression of protein disulfide isomerase in
rat hepatocytes. J. Biol. Chem. 270 : 20 410—20 416.
Trott K. R. 1974. Tumour stem cells: the biological concept
and its application in cancer treatment. Radiother. Oncol. 30 : 1—5.
Turano C., Coppari S., Altiery F., Ferraro A. 2002. Proteins of
the PDI family: unpredicted non-ER locations and functions. J.
Cell. Physiol. 193 : 154—163.
Volpes R., van den Oord J. J., Desmet J. 1993. Integrins as differential cell lineage markers of primary liver tumors. Amer. J. Pathol. 142 : 1483—1492.
Yamashita T., Budhu A., Forgues M., Wang X. W. 2007. Activation of hepatic stem cell marker EpCAM by Wnt-B-catenin signaling in hepatocellular carcinoma. Cancer Res. 67 : 10 831—
10 839.
Í. Ï. Òåðþêîâà, Î. À. Ìèðãîðîäñêàÿ è äð.
834
Yamashita T., Forgues M., Wang W., Kim J. W., Ye Q., Jia H.,
Budhu A., Zanetti K. A., Chen Y., Qin L. X., Tang Z. Y., Wang X. W.
2008. EpCAM and a-fetoprotein expression defines novel prognostic subtypes of hepatocellular carcinoma. Cancer Res. 68 : 1451—
1461.
Yamashita T., Ji J., Budhu A., Forgues M., Yang W.,
Wang H. Y., Jia H., Ye Q., Qin L. X., Wauthier E., Reid L. M., Minato H., Honda M., Kaneko S., Tang Z. Y., Wang X. W. 2009. EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating
cells with stem/progenitor cell features. Gastroenterology. 136 :
1012—1024.
Yano Y., Hayashi Y., Sano K., Nagano H., Nakaji M., Seo Y.,
Ninomiya T., Yoon S., Yokozaki H., Kasuga M. 2004. Expression
and localization of ecto-nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase I-1 (R-NPP1/PC-1) and -3 (E-NPP3/CD203c/PD-Ibeta/B10/gp130(RB13-6) in inflammatory and neoplastic bile duct diseases. Cancer Lett. 207 : 139—147.
Yano Y., Hayashi Y., Sano K., Shinmaru H., Kuroda Y., Yokozaki H., Yoon S., Kasuga M. 2003. Expression and localization of
ecto-nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase I-3 (E-NPP3/
CD203c/PD-I beta/B10/gp130RB13-6) in human colon carcinoma.
Int. J. Mol. Med. 212 : 763—766.
Yovchev M. I., Grozdanov P. N., Joseph B., Gupta S., Dabeva M. D. 2007. Novel hepatic progenitor cell surface markers in the
adult rat liver. Hepatology. 45 : 139—149.
Zhang L. J., Wang X. E., Peng X., Wei Y. J., Cao R., Liu Z., Xiong J. X., Yin X. F., Ping C., Liang S. 2006. Proteomic analysis of
low-abundant integral plasma membrane proteins based on gels.
Cell. Mol. Life Sci. 63 : 1790—1804.
Zhao Y., Zhang W., Kho Y., Zhao Y. 2004. Proteomic analysis
of integral plasma membrane proteins. Anal. Chem. 76 : 1817—
1823.
Ïîñòóïèëà 12 III 2010
DETECTION AND IDENTIFICATION OF THE TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS
IN THE FRACTION ENRICHED WITH PLASMA MEMBRANES
OF THE ZAJDELA HEPATOMA CELLS
N. P. Teryukova,1, * O. A. Mirgorodskaya,2 M. V. Serebryakova,3 V. A. Ivanov1
1
Institute of Cytology RAS, 2 Institute of Analytical Instrumentation RAS, St. Petersburg,
and 3 Scientific Research Institute of Physical-Chemical Medicine, Moscow;
* e-mail: [email protected]
Tumor-associated antigens 45, 57, 80 and 130 kDa were detected using tumor-specific rabbit immune serum in the fraction enriched with plasma membrane of the rat Zajdela hepatoma cells and isolated on the immunosorbent. Revealed proteins were identified as integrin b-1, ecto-nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase-3 (E-NPP3), basigin, epithelial cell adhesion molecule (EpCAM), a-fetoprotein (AFP) and protein chaperones — glucose-regulated protein 78 (GRP78) and protein disulfide-isomerase (PDI) A1 by mass spectrometry
technique. Functions and characteristics of these proteins in tumor cells and some aspects of the Zajdela hepatoma cells origin are discussed.
K e y w o r d s: hepatoma, mass spectrometry, tumor-associated antigens, tumor-initiating cells, epithelial
cell adhesion molecule, epithelial-mesenchymal transition.
Скачать