На правах рукописи Маркова Виталия Александровна
advertisement
На правах рукописи Маркова Виталия Александровна СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ Ф У Н К Ц И О Н А Л Ь Н Ы Х СВОЙСТВ Н Е Й Т Р О Ф И Л Ь Н Ы Х ГРАНУЛОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ И М У К О З А Л Ь Н Ы Х СЕКРЕТОВ У ЗДОРОВЫХ М У Ж Ч И Н И ЖЕНЩИН 14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Челябинск - 2014 Работа выполнена в научно-исследовательском институте иммунологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации Научный руководитель: Заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Долгушин Илья Ильич Официальные оппоненты: Имельбаева Эльвира Аркамовиа - доктор биологических наук, профессор, ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России, кафедра лабораторной диагностики НПО, профессор Колупаев Виталий Анатольевич - доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Уральский государственный университет физической культуры», кафедра теории и методики лыжного спорта, профессор Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение науки Институт иммунологии и физиологии отделения Российской академии наук бюджетное Уральского Защита состоится «19» июня 2014 года в часов на заседании Диссертационного совета Д 208.117.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 454092, г.Челябинск, ул. Воровского, 64. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации и на сайте www.chelsma.ru. Автореферат разослан « » 2014 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук Ю.С. Шишкова poou.ni'.r n>> гоС'.'ДА'Ч-1 1-й Ы1Ь! .'(ji l-.KA ?.01 <1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования и степень ее разработанности Нейтрофильные гранулоциты я&іяются ключевыми клетками врожденного иммунитета, их основной функцией является уничтожение патогенных микроорганизмов, таких как бактерии, грибы и паразиты, а так же предотвращение их распространения в организме (Papayannopoulos V., Staab D., Zychlinsky A. Neutrophil elastase enhances sputum solubilization in cystic fibrosis patients receiving DNase therapy. PLoS One., 2011. Vol. 6, № 12. P. 125-131.). Это профессиональные охотники за микробами, обладающие самой высокой подвижностью среди всех клеток организма (Шмагель К.В., Черешнев В.А. Клетки врожденного иммунитета. Пермь, 2011. 241 е.). Более века исследователи всего мира изучают строение и физиологию нейтрофилъных гранулоцитов, биохимический состав их гранул, структуру синтезируемых ими метаболитов и роль этих клеток в регуляции иммунного ответа (Тотолян A.A., Фрейдлин И.С. Клетки иммунной системы. Москва: Наука, 2000. 231 е.; Федотова Г.Г. Морфофункциональное исследование нейтрофилов в условиях эндотоксикоза: автореф. дис. ... д-ра биол. наук. Саранск, 2007. 39 е.). Нейтрофилы оснащены богатым набором рецепторов, которые позволяют чутко и дифференцированно реагировать на малейшие изменения окружающей среды (Семенов Б.Ф., Зверев В.В. Концепция создания быстрой иммунологической защиты от патогенов. Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2007. № 4. С. 93-100.; Hoffmann J.A. The immune response of Drosophila. Nature. 2003. Vol. 426. P. 33-38.) Они первыми приходят в очаг воспаления, где проявляют разнообразные виды активности (Шмагель К.В., Черешнев В.А. Клетки врожденного иммунитета. Пермь, 2011. 241 е.). Подготовленный нейтрофил может оказывать свое действие на объект, вызвавший его активацию, различными способами: фагоцитировать и уничтожать его в фаголизосомах или выделять наружу бактерицидные продукты, которые представляют собой содержимое гранул (Долгушин И.И., Бухарин О.В. Нейтрофилы и гомеосгаз. Екатеринбург: Изд-во УрОРАН, 2001.256 с.). Нейтрофильные гранулоциты являются самыми многочисленными из лейкоцитов. Их количество в периферической крови поддерживается на постоянном уровне благодаря притоку из костного мозга (Nathan С. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol., 2006. № 6. P. 173-182.). Большая часть нейтрофильных гранулоцитов функционирует в тканевых депо и в секретах слизистых оболочек: цервикальной и вагинальной слизи, бронхоальвеолярном секрете, слюне, слизи, покрывающей кишечный эпителий (Долгушин И.И., Андреева Ю.С., Савочкина А.Ю. Нейтрофильные внеклеточные ловушки и методы оценки функционального статуса нейтрофилов. М.: Изд-во РАМН, 2009. 208 е.; Bain ton D.F. Morphology of neutrophils, eosinophils and basophils. Williams Hematology. 5th ed. 1995. P. 753-765.). При этом на поверхности слизистых оболочек встречается большое количество жизнеспособных и функционально активных нейтрофильных гранулоцитов (Телешева Л.Ф. Иммунологические факторы секретов репродуктивного тракта женщин: дис. д-ра мед. наук. Челябинск, 2000. 41 е.; Савочкина А.Ю. Иммунологические показатели в диагностике хронического цервицита и при его сочетании с хроническим эндометритом: дис. канд. мед. наук. Челябинск, 2006. 148 е.). 2., Нейтрофилы цервикального секрета активнее, чем нейтрофилы слюны и вагинального секрета, проявляют свою лизосомальную активность, в большем количестве и интенсивнее участвуют в процессе фагоцитоза, а также имеют более высокий кислородзависимый потенциал. Пирогенал и форбол-миристат-ацетат усиливают фагоцитарную, лизосомальную и внутриклеточную кислородзависимую бактерицидную активность нейтрофшіьных гранулоцитов мукозальных секретов. 3. В популяции нейтрофильных гранулоцитов периферической крови можно выделить две субпопуляции клеток с высокими и низкими показателями прямого свсторассеивания. Данные субпопуляции нейтрофилов различаются по экспрессии на своей поверхности рецепторов CD1 lb и CD95. Научная новизна В работе впервые определено количество внеклеточных ловушек, присутствующее у здоровых мужчин и женщин в составе слюны, а также у женщин в первую и вторую фазы менструального цикла в вагинальном и цервикальном секретах. Установлено, что при сравнении мукозальных секретов между собой наибольшее количество внеклеточных ловушек содержится в слюне у женщин. Количество внеклеточных ловушек в мукозальных секретах репродуктивного тракта у женщин зависит от фазы менструального цикла. Показано, что пирогенал и форбол-миристат-ацетат индуцируют образование нейтрофильных внеклеточных ловушек в слюне, цервикальном секрете, вагинальном секрете и у нейтрофилов, выделенных из периферической крови на двойном градиенте фиколл-верографина. Установлено, что нейтрофилы цельной крови и лейкоцитарной взвеси не формируют внеклеточные ловушки даже после воздействия экзогенных факторов микробной и немикробной природы. В работе показано, что факторы микробной и немикробной природы влияют на морфологический состав популяции нейтрофильных гранулоцитов мукозальных секретов, а так же увеличивают функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов слизистых оболочек независимо от пола обследуемых лиц и фазы менструального цикла у женщин. Впервые проведено разделение популяции нейтрофильных гранулоцитов периферической крови на субпопуляции по показателям объема и массы, а так же определена экспрессия рецепторов C D l l b и CD95 на нейтрофилах в различных субпопуляциях. Теоретическая и практическая значимость работы Проведенные исследования позволяют расширить представление о роли нейтрофильных гранулоцитов в антимикробной защите слизистых оболочек, в частности, их способности к фагоцитозу и образованию внеклеточных ловушек. Результаты исследования расширяют знание о физиологии нейтрофилов, их функциональных возможностях, рецепторном аппарате и гетерогенности популяции. Полученные данные вносят существенный вклад в понимание роли внеклеточных ловушек в реализации врожденного иммунитета. Внедрение результатов исследования в практику Результаты исследования внедрены в лабораторную диагностику НИИ иммунологии ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации и используются в учебном процессе на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «ЮжноУральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Конкурсная поддержка исследования В 2012 году научно-исследовательская работа по теме диссертационного исследования победила на областном конкурсе научно-исследовательских работ студентов, аспирантов и молодых ученых высших учебных заведений, расположенных на территории Челябинской области. Публикации Соискатель имеет 35 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано 33 научные работы общим объёмом 5,06 печатных листов, в том числе 22 - в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций. Соискателем опубликованы 9 работ в материалах всероссийских и международных конференций и 2 - в других научных журналах и изданиях. Объем и структура диссертации Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, иллюстрирована 24 таблицами, 6 рисунками и содержит введение, обзор литературы, главу с описанием материалов и методов исследования, три главы собственных исследований, заключение, выводы, список литературы. Указатель литературы включает 88 отечественных и 115 зарубежных источников. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Исследование проводилось на базе НИИ иммунологии ЮУГМУ в период с 2010 по 2012 год. В нем приняли участие 30 практически здоровых мужчин и 30 практически здоровых небеременных женщин в первую и вторую фазы менструального цикла, чей возраст варьировался от 18 до 35 лет. Критериями включения в исследование являлись добровольное согласие на обследование, оформленное в письменном виде, отсутствие хронических заболеваний, приема гормональных препаратов и перенесенных вирусных заболеваний в течение последних трех месяцев. У всех обследуемых доноров материалом для исследования являлась периферическая венозная кровь, которую забирали из локтевой вены в вакуумную пробирку с гепарином в качестве антикоагулянта (12-30 ME гепарина на 1мл крови), а также слюна, забор которой проводили в одноразовые пробирки в объеме 3 мл, с добавлением 1 мл физиологического раствора в течение 5 минут. У женщин дополнительно производили забор цервикального и вагинального секретов на 7-10 и 21-23 дни менструального цикла. Лейкоцитарную взвесь получали из гепаринизированной крови после седиментации эритроцитов. Для получения чистой фракции нейтрофилов 4 мл гепаринизированной периферической крови смешивали с 6 мл стерильного физиологического раствора, полученную смесь наслаивали на градиент плотности растворов фиколла-верографина. Плотность верхнего слоя - 1,075-1,077г/см3, нижнего - 1,093-1,095г/см3. Через 40 минут центрифугирования при 1500 об/мин на границе градиентов образовывалось кольцо гранулоцитов, которое аккуратно собирали и дважды отмывали от градиента стерильным физиологическим раствором по 7 минут. Затем клетки доводили до концентрации 5х] О6 клеток/мл и использовали в исследовании. Эксперимент проводили in vitro и для активации клеток применяли лекарственный препарат пирогенал (Филиал «Медгамал» ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, г. Москва, Россия), в концентрации 0,02 мкг/мл, которая соответствует разовой терапевтической дозе и препарат форбол-12-миристат-ІЗацетат (Fluka, США) в концентрации 7,5 цМ/мл. Все пробы инкубировали в одинаковых условиях при температуре 37°С в течение 30 минут. Оценку внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов мукозальных секретов проводили с помощью НСТтеста в модификации Маянского А.Н. и Виксмана М.К. (1979). Изучение способности нейтрофильных гранулоцитов мукозальных секретов к фагоцитозу проводили по методу Фрейдлин И.С. (1986). Определение лизосомальной активности нейтрофилов мукозальных секретов проводили по методу Фрейдлин И.С. (1976). Для количественной оценки уровня внеклеточных ловушек в цельной крови на сухое обезжиренное предметное стекло наносили каплю цельной гепаринизированной венозной крови, затем с помощью чистого шлифовального стекла распределяли кровь по поверхности предметного стекла. Мазки высушивали на воздухе, фиксировали 96% этиловым спиртом и окрашивали по РомановскомуГимзе (Савочкина А.Ю. Нейтрофильные внеклеточные ловушки: механизмы образования, методы обнаружения, биологическая роль : дис. д-ра мед. наук. Челябинск, 2012. 221 е.). Результаты оценивали при помощи световой микроскопии. Для оценки количества внеклеточных ловушек в лейкоцитарной взвеси и чистой фракции нейтрофилов был использован метод индикации HBJ1 при окраске акридиновым оранжевым (Пат. № 2384844 Рос. Федерации Способ обнаружения нейтрофильных ловушек. И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева (Российская Федерация), заявл. 01.04.2008; опубл. 20.03.2010, Бюл. № 8. 7 с). Материал наносили на обезжиренное предметное стекло и добавляли каплю 0,04% раствора акридинового оранжевого, накрывали сверху покровным стеклом и удаляли избытки жидкости фильтровальной бумагой. Учет проводили с помощью люминесцентного микроскопа Nikon eclipse 50і, используя фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм и эмиссию с длинной волны 520 нм. При этом способе окраски оценивали процентное содержание нейтрофилов с сегментированными ядрами, с недифференцированными ядрами и нейтрофильных внеклеточных ловушек. Для оценки количества внеклеточных ловушек в мукозальных секретах полученную суспензию в равном объеме смешивали со сложным красителем, который готовили ex tempo го: 1 мл синьки Эванса в концентрации 1:8000 для окрашивания слизи и жизнеспособных клеток в оранжевый цвет и 1 мл красителя Sytox Green в концентрации 1:500 для окрашивания внеклеточных волокон ДНК и мертвых клеток в зеленый цвет, инкубировали в течение 5 минут в темноте. Из окрашенного материала готовили препарат «раздавленная капля». Учет проводили с помощью люминесцентного микроскопа Nikon eclipse 50і, используя фильтры,' обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм и эмиссию с длиной волны 520 нм. Все структуры были разделены на 4 группы по дифференцированному окрашиванию: 1 группа объединила жизнеспособные клетки ярко-оранжевого цвета; 2 группа — клетки с зеленым ядром и яркооранжевой цитоплазмой, т.е. клетки, вероятно, подвергшиеся алоптозу; 3 іруппа погибшие клетки зеленого цвета; 4 группе - свободнолежащие ярко-зеленые волокна, представляющие собой нити ДНК нейтрофила (нейтрофильные внеклеточные ловушки). Проводили подсчет 100 структур разных групп и определяли процентное содержание каждой морфологической единицы (Пат. № 2463349 Способ обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в мукозальных секретах. И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, А.Ю. Савочкина (Российская Федерация), заявл. 26.01.2009; опубл. 10.10.2012, Бюл. № 28. 6 с). Определение рецепторов C D l l b и CD95 на нейтрофильных гранулоцитах цельной крови проводили методом проточной цитофлюориметрии с использованием одноцветных реагентов CDllb-FITC (BeckamCoulter, США) и CD95-PE (BeckamCoulter, США). Полученные результаты исследования были подвергнуты статистической обработке на ПК под управлением операционной систем Windows Vista с использованием пакета прикладных компьютерных программ Statistica for Windows (v. 8.0). Полученные данные были обработаны общепринятыми методами вариационной статистики и представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (M ± m), п - количество наблюдений в выборке. О достоверности межгрупповых различий судили с помощью непараметрических критериев Манна-Уитни и Вальда-Вольфовица. Проверка статистических гипотез осуществляли при критическом уровне значимости р < 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ На первом этапе исследования была дана оценка процентному соотношению морфологических форм нейтрофильных гранулоцитов и количеству внеклеточных ловушек, входящих в состав слюны у мужчин и женщин, а также сравнение данных показателей слюны, вагинального и цервикального секретов у женщин в зависимости от фазы менструального цикла. В состав слюны у мужчин входят внеклеточные ловушки в количестве 13,4% от общей популяции нейтрофилов, что достоверно выше по сравнению с этим показателем у женщин в первую фазу менструального цикла (9,3%) и значимо ниже по отношению к женщинам во вторую фазу (16,1%) (таблица 1). У мужчин в слюне достоверно выше содержание жизнеспособных и мертвых нейтрофилов и значимо ниже количество нейтрофильных гранулоцитов в состоянии апоптоэа по сравнению с показателями у женщин независимо от фазы менструального цикла. При сравнении морфологических форм нейтрофильных гранулоцитов слюны, цервикального и вагинального секретов у женщин было установлено, что наибольшее количество нейтрофильных внеклеточных ловушек и алоптозных клеток входило в состав секрета слюны, при этом в цервикальном секрете достоверно выше количество жизнеспособных клеток относительно двух других секретов. У женщин во вторую фазу менструального цикла происходило достоверное увеличение количества нейтрофильных внеклеточных ловушек во всех исследуемых мукозальных секретах. Таблица I - Сравнительный анализ содержания нейтрофильных внеклеточных ловушек и жизнеспособных нейтрофилов в различных мукозальыых секретах у здоровых мужчин и женщин, (M ± m) Группа Неіггрофкльные внеклеточные Жизнеспособные нейтрофилы, % .ювушки, % муж жен I жен [I муж жен [ жен II п=30 фаза м.ц. п=30 фаза м.ц. фаза м.ц. фаза м.ц. п=30 п=30 п=30 ті=30 Слюыа 13,36± 9,28± 16, 1* 38,1± 23,33± 24,18± 0,63'"* 0,58 0,96* 2,15"''" 3,36 2.68 Вагинальный 4,4= 7,8± 33,2± 37,1= 0 79»'»* секрет 0,49** 2,06** 1,85** Цервикальный 5,7± 10,3± 48,0± 47,5= секрет 0,79*** 1,41*'*** 2,86*** 3,88*** Примечание для таблиц 1 -3 и - достоверность отличий между показателями у мужчин и женщин в I фазу м.ц. М# - достоверность отличий между показателями у мужчин и женщин во II фазу м.ц. * - достоверность отличий между показателями у женщин в I и II фазу м.ц. ** - достоверность отличий между показателями в слюне и вагинальном секрете *** - достоверность отличий между показателями в слюне и цервикальном секрете **** - достоверность отличий между показателями в вагинальном и цервикальном секрете Также в работе оценивалась функциональная активность. интактыых нейтрофильных гранулоцитов слюны, вагинального и цервикального секретов. При изучении лизосомальной активности нейтрофильных гранулоцитов, входивших в состав секрета слюны, было установлено, что значения этого показателя у мужчин значимо нюке, чем у женщин независимо от фазы менструального цикла (таблица 2). У женщин наибольшие показатели лизосомальной активности по сравнению с другими секретами были выявлены у нейтрофильных гранулоцитов слюны. Лиэосомальная активность нейтрофильных гранулоцитов вагинального и цервикального секретов у женщин во вторую фазу менструального цикла были достоверно ниже, чем в первую. Таблица 2 - Сравнительный анализ лизосомальной активности нейтрофильных гранулоцшов в различных мукозальных секретах у здоровых мужчин и женщин, у .е. (M ± m) Группа • Женщины I фаза Женщины II фаза Мужчины м.ц. м.ц. п=Э0 п=Э0 п=30 38,09±3,91 18,3*0,83""* Слюна 33,8±4,0 9,58±1,15*'** 16,27±1,02** Вагинальный секрет 55,27*3,71**** Цервикальный секрет 24,09±1,35*'**** Было установлено, что показатели активности и интенсивности фагоцитоза, а также фагоцитарное число в слюне у мужчин достоверно выше, чем у женщин (таблица 3). У женщин наибольшее количество нейтрофилов, активно фагоцитирующих чужеродные объекты, содержалось в цервикальном секрете. Активность фагоцитоза у женщин не зависит от фазы менструального цикла. Значения и спонтанного, и индуцированного НСТ-теста нейтрофилов слюны не зависят от пола обследуемых лиц. Наиболее высокие показатели НСТ-теста у женщин определяются у нейтрофилов цервикального неизменными на протяжении всего менструального цикла. секрета и остаются Таблица 3 - Сравнительный анализ фагоцитарной и внутриклеточной кислородзависимой бактерицидной активности нейтрофильных гранулоцитов в мукозальных секретах у здоровых мужчин и женщин, (M ± ш) Группа Слюна Вагинальный секрет Цервикальный секрет Активность фагоцитоза, % МЛ'ж жен жен п=30 I фаза II фаза \!.Ц. м.ц. п=30 п=30 48,5± 39,25= 41,11± 2,55 3,13'" 1,41 39.7± 40.5— 1,57 1.13 45,5± 48,9± 2,22 1,42 « . * / ***/ * * * * Активность сНСТ-теста, % муж жен жен п=30 I фаза II фаза 14,1± 1.2 - - м.ц. м.ц. п=30 19,5і 2,23 20,8± 0,92 25,4± 1,4 *** п=30 20,2± 2,62 20, І± 0,95 26,2± 1,39 **«/ Активность иНСТ-теста, % муж жен жен п=30 1 фаза II фаза ѵ.ц. м.ц. п=30 п=30 28,6± 34,1= 30Д± 2,61 3,64 2,76 39,2і 38,4± 1,03 0,81 49,5± 49,0= 1,04 0,86 *** •*•/ Таким образом, морфологический состав популяции нейтрофилов, а также показатели их функциональной активности в слюне у мужчин и женщин имеют достоверные различия. У женщин популяции нейтрофильных гранулоцитов, входящих в состав слюны, вагинального и цервикального секретов, различаются между собой и по морфологическому составу, и по функциональной активности. Следующим этапом исследования являлось изучение влияния пирогенала и ФМА на процесс формирования внеклеточных ловушек и соотношение морфологических форм нейтрофильных гранулоцитов в слюне, вагинальном и цервикальном секретах, а так же на функциональную активность нейтрофилов. Установлено, что воздействие обоих активаторов приводит к усилению формирования внеклеточных ловушек нейтрофильными гранулоцитами слизистых оболочек репродуктивного тракта женщин и слюны, а так же к снижению количества жизнеспособных клеток (таблица 4). Воздействие пирогенала и ФМА приводит к усилению функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов мукозальных секретов, что выражается в росте показателей лизосомальной активности клеток, а также в увеличении числа клеток, активно захватывающих латексные частицы. В отличие от пирогенала, ФМА приводит к усилению кислородзависимого метаболизма, что выражается в росте показателей НСТ-теста. По всей видимости, не все нейтрофильные гранулоциты мукозальных секретов подвергались активации, на что косвенно указывал тот факт, что, независимо от выбранного активатора, количество внеклеточных ловушек во всех исследованных биологических секретах не превышало 34%, а также не более 62% клеток были способны активно захватывать чужеродные частицы. Таблица 4 - Влияние пирогенала и ФМА на содержание нейтрофильных внеклеточных ловушек и жизнеспособных нейтрофилов в различных мукозальных Группа Слюна Активатор Контроль Пироге нал ФМА Вагинальный секрет Контроль Пирогенал ФМА Цервикальный секрет Кошрот, Пирогенал ФМА Нейгрофильные внеклеточные ловушки, % муж жен I жен II фаза м.ц. фаза м.ц. п=Э0 п=30 п=30 13,4± 9,3± 16,1= 0,63 0.58 0.96 25,2± 26,6± 29,51,69* 0,43» 1,54* 27,1± 31,2= 34,0= 1,91* 1,0* 1,18* 4.4± 7,80,49 0,79 20,4± 23,7= 1,27* 1,12* 22,7± 24,8± 1,61* 1,24* 5,7± 10,3= 0,79 1,41 19,3± 22,6л: 1,09* 1,57* 22,5± 25,2= 1,33* 1.31* Жизнеспособные нейтрофилы, % муж п=30 38,1± 2,15 24,3= 2,19* 22,0= 2,24* - - - - - жен I фаза м.ц. п=30 23,4± 2.54 11,4і 0,87* 9,3= 0,77* 33,2= 2,06 18,4± 2,96* 16,7= 2,35* 48,0= 2,86 33,1 = 3,18* 30,5= 3.8* жен 11 фаза м ц п=30 24,2* 2,68 11,4± 1,66* 1 9,4± ! 1,16* 1 37,1± j 1,85 24,2± 1,65* 24,9± 2,53* 47,5= 3,88 31,1± 2,12* 27,9± 2,92* Примечание для таблиц 4-5 * - статистические значимые различия при сравнении с контролем ** - статистические значимые различия при сравнении пирогенала и ФМА Следующей задачей являлась оценка количества внеклеточных ловушек, входящих в состав цельной крови, лейкоцитарной взвеси и чистой фрахции нейтрофилов, у мужчин и у женщин в разные периоды менструального цикла. Результаты исследования показали, что у мужчин, а также у женщин в первую и во вторую фазы менструального цикла в неактивированной цельной крови и лейкоцитарной взвеси содержится одинаковое количество нейтрофильных внеклеточных ловушек, данный показатель не превышает 2%. Количество нейтрофильных внеклеточных ловушек в выделенной чистой фракции нейтрофилов составляет 4%, данный показатель не зависит от пола обследуемых лиц и фазы менструального цикла у женщин. Установлено, что после воздействия и пирогеналом, и ФМА число внеклеточных ловушек, образованных нейтрофильными гранулоцитами цельной крови и лейкоцитарной взвеси, оставалось на том же уровне, что и в контроле и не отличалось ни в одной пробе независимо от пола обследуемых лиц и фазы менструального цикла у женщин (таблица 5). После активации 4 пирогеналом и ФМА нейтрофилов, выделенных из периферической крови на двойном градиенте плотности фиколл-верографина, наблюдалось достоверное увеличение количества нейтрофильных внеклеточных ловушек по сравнению с неактивированными клетками. Разницы в количестве HBJ1 между показателями у мужчин и у женщин выявлено не было. Таблица 5 - Влияние пирогенала и ФМА на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами цельной крови, лейкоцитарной взвеси и чистой фракции нейтрофилов у здоровых мужчин и женщин. % (M ± m) Группа Цельная кровь муж п=30 Контроль Пироге нал ФМА 1,25± 0,37 1,41± 0,29 1,17= 0,27 жен ! фаза м.ц. п=30 1,58± 0,36 1,92± 0,43 1,42± 0,31 жен II фаза м.ц. п=30 1,55± 0,4 І,25± 0,3 1,42± 0,29 Лейкоцитарная взвесь муж п-30 2,05± 0,44 1,75± 0,33 2,27± 0,33 жен I фаза м.ц. п=30 2,0± 0,4« 2,07= 0,36 2,15= 0,39 жен 11 фаза м.ц. п=30 1,67= 0,48 1,92= 0,34 2,08± 0,29 Чистая фракция нейтрофилов муж жен жен п=30 1 фаза 11 фаза м.ц. м.ц. п=30 п=30 4,33± 4,17= 4,0± 0,76 0,53 0,58 16,5± 16,83= 16,83± 1,36« 1,27» 1,1* 20,17± 20,75± 24,08± 1,09*'** 1,07*'»* 1,44»'** ГІри проведение анализа на проточном цитофлюориметре было замечено, что популяция нейтрофильных гранулоцитов периферической крови неоднородна но показателям прямого светорассеивания, и в ней .можно выделить две области клеток: первая - нейтрофильные гранулоциты с высокими показателями прямого светорассеивания, получившие сокращенную аббревиатуру ВППС; вторая нейтрофильные гранулоциты с низкими показателями прямого светорассеивания, получившие сокращенную аббревиатуру НППС. После активации нейтрофильных гранулоцитов ФМА происходило перераспределение нейтрофильных гранулоцитов по показателям прямого светорассеивания. Разницы в показателях у мужчин и у женщин выявлено не было. В неактивированном состоянии в популяции нейтрофильных гранулоцитов цельной крови на долю ВППС клеток приходилось 90% от общего числа клеток, 10% составляли НППС нейтрофилы. После активации ФМА наблюдалось увеличение содержания НІІПС нейтрофилов до 33% (рисунок 1)- В Нейтрофилы с в ы с о к и м и показателями прямого сваторассѳиваним • Нейтрофилы с низкими показателями прямого светорассеивания Мухчиьм Жсшцшіы I] м.ц п-30 п-30 Рисунок 1 - Распределение интактных и активированных нейтрофильных гранулоцитов периферической крови по показателям прямого светорассеивания Следующей задачей исследования являлась оценка распределения рецепторов CD1 lb и CD95 на нейтрофильных гранулоцитах периферической крови в субпопуляциях ВППС и НППС нейтрофилов до и после активации. CD1 lbантиген играет роль в миграции макрофагов из кровяного русла в очаг воспаления в процессе иммунного ответа (Patarroyo M. Adhesion molecules mediating recruitment of monocytes to inflamed tissue. Immunobiology. 1994. Vol. 191. P. 474 -477), также является молекулой межклеточной адгезии (Springer Т.А. Adhesion receptors of the immune system. Nature. 1990. Vol. 346. P. 425^434). С095-антиген принадлежит к так называемому семейству рецепторов клеточной гибели и экепрессируется на активированных лейкоцитах (Kabelitz D., Marx S. [et al.]. Rapid modulation of T lymphocyte surface antigens induced by Fas (CD95, APO-1) ligation. Cell. Immunol. 1996. Vol. 1, № 173. P. 108-115). Все нейтрофильные гранулоциты по экспрессии на своей поверхности рецепторов CD1 lb и CD95 были разделены на четыре субпопуляции: - нейтрофилы, экспрессирующие на своей поверхности оба рецептора CD1 lb и CD95 (CD1 lb+CD95+); - нейтрофилы, экспрессирующие на своей поверхности только рецептор CD 11 b (CD 11 b+CD95-); - нейтрофилы, экспрессирующие на своей поверхности только рецептор CD95 (CD1 lb-CD95+); - нейтрофилы, неэкспрессирующие на своей поверхности ни рецептора CD! lb, ни рецептора CD95 (CD1 lb-CD95-). При сравнении субпопуляций ВППС и НТТПС интактных нейтрофильных гранулоцитов было установлено, что входящие в их состав клетки различались между собой по экспрессии на своей поверхности рецепторов CD l i b и CD95. В популяции ВППС нейтрофилов преобладали клетки CD1 lb+CD95- (89%), при этом CDllb-CD95+ нейтрофилов содержалось менее 1%. В популяции НГШС нейтрофильных гранулоцитов 59% клеток не экспрессировали на своей поверхности ни рецептора CD1 lb, ни рецептораCD95 (рисунок 2). • CD11b+CD95+ 0CD11b+CD95- • CD11b-CD95+ QCD11b-CD95- Рисунок 2 - Распределение рецепторов CD1 tb и CD95 на интакпіых и активированных нейтрофильных гранулоцитах: А - интактные нейтрофилы с высокими показателями прямого светорассеивапия; Б - активированные нейтрофилы с высокими показателями прямого светорассеивания; В - интактные нейтрофилы с низкими показателями прямого светорассеивания; Г - активированные нейтрофилы с низкими показателями прямого светорассеивания. Поскольку активация нейтрофильных гранулоцитов приводила к изменению их функциональных свойств, то было высказано предположение, что изменения также могут происходить и с рецепторным аппаратом нейтрофилов. Исходя из данного предположения, было изучено распределение рецепторов CD1 lb и CD95 в субпопуляциях ВППС и НГШС нейтрофильных гранулоцитов после активации ФМА. Установлено, что через 30 минут после воздействия ФМА в субпопуляции ВППС нейтрофилов количество клеток, экспрессирующих на своей поверхности только рецептор CD l i b , увеличивалось до 95%, при этом в субпопуляции НПГ1С нейтрофилов у 74% клеток на мембране появлялся рецептор CD95. Таким образом, было установлено, что по своей природе популяция нейтрофильных гранулоцитов неоднородна, и в ней можно выделить две субпопуляции по измерению показателей размера и структуры клеток. После активации происходит перераспределение нейтрофильных гранулоцитов между двумя субпопуляциями, увеличивается количество клеток, имеющих более низкие показатели прямого светорассеивания (меньший размер клеток). Две субпопуляции нейтрофильных гранулоцитов, разделенные по показателям прямого светорассеивания на проточном цитофлюориметре, различаются между собой не только по размеру, массе клеток и рецепторному аппарату, но, по всей видимости, и по набору выполняемых функций. В субпопуляцию нейтрофилов с высокими показателями прямого светорассеивания входят клетки, отвечающие за миграцию клеток в очаг воспаления, распознавание объекта фагоцитоза и, вероятно, за формирование внеклеточных ловушек. Субпопуляцию нейтрофилов с низкими показателями прямого светорассеивания представляют клетки, которые после воздействия раздражителя активируются и уходят в апоптоз. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Полученные в результате проведенного исследования научные факты, ' сформулированные в виде выводов, расширяют представление о роли нейтрофильных гранулоцитов в защите слизистых оболочек, в частности, их способности к фагоцитозу и образованию внеклеточных ловушек. Результаты исследования углубляют знание о физиологии ыейтрофилов, их функциональных возможностях, рецепторном аппарате и гетерогенности популяции. Полученные данные вносят существенный вклад в понимание роли внеклеточных ловушек в реализации врожденного иммунитета выводы 1. Секреты слизистых оболочек помимо нейтрофильных гранулоцитов содержат в своем составе значительное количество внеклеточных ловушек. Количество нейтрофильных внеклеточных ловушек в слюне зависит от пола обследуемых лиц и фазы менструального цикла у женщин. У женщин во вторую фазу менструального цикла в слюне и секретах репродуктивного тракта наблюдается увеличение количества внеклеточных ловушек. 2. Клетки, присутствующие в цервикальном секрете, функционально более полноценны, чем нейтрофилы слюны и вагинального секрета, у них выше лизосомальная, фагоцитарная активность, а также они имеют более высокий кислородзависимый потенциал. Лизосомальная активность нейтрофильных гранулоцитов репродуктивного тракта женщин зависит от фазы менструального цикла: в первую фазу она достоверно выше, чем во вторую. Показатели фагоцитоза и кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов слюны, вагинального и цервикального секретов остаются неизменными на протяжении всего менструального цикла. 3. После активации пирогеналом и форбол-миристат-ацетатом нейтрофильных гранулоцитов мукозальных секретов, происходит увеличение количества внеклеточных ловушек, при этом относительное количество жизнеспособных клеток снижается, растет лизосомальная и фагоцитарная активность, усиливается кислородзависимый метаболизм. 4. В состав цельной крови и лейкоцитарной взвеси входит 2% нейтрофильных внеклеточных ловушек. Количество внеклеточных ловушек в выделенной чистой фракции нейтрофилов составляет 4%, данный показатель не зависит от пола обследуемых лиц и фазы менструального цикла у женщин. Воздействие пирогеналом и форбол-миристат-ацетатом увеличивает количество внеклеточных ловушек в чистой фракции нейтрофилов. Инкубация цельной крови и лейкоцитарной взвеси с пирогеналом и форболмиристат-ацетатом не приводит к росту числа нейтрофильных внеклеточных ловушек. 5. Популяция нейтрофильных гранулоцитов периферической крови неоднородна в своем составе, в ней можно выделить две области клеток: нейтрофилы с высокими и низкими показателями прямого светорассеивания. После активации происходит перераспределение нейтрофильных гранулоцитов между двумя субпопуляциями, увеличивается количество клеток, имеющих более низкие показатели светорассеивания с 10% до 33%. 6. В неактивированом состоянии в субпопуляции нейтрофилов с высокими показателями прямого светорассеивания 89% клеток экспрессируют на своей поверхности только рецептор CD1 lb, после активации уровень экспрессии возрастает до 95%. В субпопуляции нейтрофилов с низкими показателями прямого светорассеивания 59% клеток не несут на своей поверхности ни рецептора CD l i b , ни рецептора CD95, после активации 74% клеток начинают экспресировать на своей поверхности рецептор CD95. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. При оценке функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов мукозальных секретов рекомендуется учитывать пол обследуемых лиц и фазу менструального цикла у женщин. 2. Определение количества внеклеточных ловушек, формируемых нейтрофилами слизистых оболочек, рекомендуется использовать для оценки функционального статуса нейтрофильных гранулоцитов мукозальных секретов. 3. При изучении экспрессии рецепторов на нейтрофильных гранулоцитах периферической крови рекомендуется учитывать гетерогенность популяции нейтрофилов. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Маркова, В.А. Влияние продолжительности воздействия лазера низкой интенсивности с постоянной генерацией импульса на процесс формирования нейтрофильных внеклеточных ловушек / В.А. Маркова, И.И. Долгушин, O.A. Гизиигер // Материалы VII итоговой научно-практической конференции молодых ученых челябинской мед. академии. - Челябинск, 2009. - С. 75-77. 2. Гизиигер, O.A. Оценка количества нейтрофильных внеклеточных ловушек у здоровых доноров разного пола, формирующихся под воздействием лазера низкой интенсивности / O.A. Гизиигер, В.А. Маркова, И.И. Долгушин // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2009. - №2/1 (24). - С. 246-247. 3. Долгушин, И.И. Изучение процесса формирования нейтрофильных внеклеточных ловушек под воздействием лазера низкой интенсивности / И.И. Долгушин, O.A. Гизиигер, В.А. Маркова, К.Г. Ишпахтина // Медицинская иммунология. - 2009. - Т. 11, № 4-5. - С. 312-313. 4. Долгушин, И.И. Нейтрофильные ловушки: методы определения, биологическая роль / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, А.Ю. Савочкина, А.И. Рыжкова, В.А. Маркова, Н А . Васильева // Медицинская наука и образование Урала. -2009. - № 3 . - С. 10-11. 5. Рыжкова, А.И. Изучение воздействия различных концентраций препарата «Интерферон» на образование внеклеточных ловушек нейтрофилами периферической крови / А.И. Рыжкова, Е.А. Мезенцева, О.Б. Прокопьева, Д А . Козочкин, В.А. Маркова // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2010. - №2/1 (29). - С. 264-265. 6. Малышева, Л.Ю. Изучение влияния местного применения циклоферона на формирование нейтрофильных внеклеточных ловушек у пациентов с хроническим верхнечелюстным синуситом / Л.Ю. Малышева, Л.С. Латюшина, Е.Е. Леонова, В.А. Маркова // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2010. - №2/1 (29). - С. 169. 7. Долгушин, И.И. Мониторинг влияния низкоинтенсивного лазерного излучения с постоянной генерацией импульса на нейтрофильные гранулоциты in vitro / И.И. Долгушин, В.А. Маркова, O A . Гизиигер // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - №8. - С. 187-189. 8. Плеханова, E.B. Активация бактерицидной функции нейтрофилов в условиях экспериментального асептического перитонита / Е.В. Плеханова, И.И. Долгушин, В.Э. Цейликман, А.И. Синицкий, Д.А. Козочкин, Е.А. Мезенцева, И.А. Колбин, В.А. Маркова, М.В. Пешикова // Российский аллергологический журнал. - 2010. - №5, Вып.1. - С. 218219. 9. Маркова, В.А. Сравнительный анализ морфологических форм неактивированных и активированных нейтрофилов в слюне здоровых женщин / В.А. Маркова, И.В. Пегушина, Е.В. Плеханова // Материалы 11 международной (IX итоговой) научно-практической конференции молодые ученые. - Челябинск, 2011. - С . 128-131. 10. Маркова, В.А. Формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами слюны у здоровых женщин / В.А. Маркова, И.И. Долгушин, А.Ю. Савочкина, Ю.С. Шишкова // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. - №2/1 (35). - С. 44-45. 11. Пегушина, И.В. Изучение влияния пирогенала на формирование нейтрофильных внеклеточных ловушек в вагинальном секрете здоровых женщин / И.В. Пегушина, И.И. Долгушин, В.А. Маркова, Т.Г. Бондаренко // Вестник Уральской медицинской академической науки. 2011. - №2/2 (35) - С. 51-52. 12. Маркова, В.А. Формирование внеклеточных ловушек активированными и неактивированными нейтрофилами слюны у здоровых женщин в I и И фазу менструального цикла / В.А. Маркова, A.Ю. Савочкина, И.В. Пегушина, Ю.С. Шишкова // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. - №4/1 (38). - С. 141. 13. Савочкина, А.Ю. Оценка эффективности нейтрофильных внеклеточных ловушек / А.Ю. Савочкина, И.И. Долгушин, Ю.С. Шишкова, Т.Г. Смирнова, B.А. Маркова, О.Б. Прокопьева // Известия высших учебных заведений. Уральский регион. - 2011. - №3. - С. 106-109. 14. Долгушин, И.И. Действие препарата пирогенал на формирование нейтрофильных внеклеточных ловушек в цервикальном секрете здоровых женщин / И.И. Долгушин, А.Ю. Савочкина, И.В. Пегушина, В.А. Маркова, Е.В. Плеханова // Областная научно-практическая конференция «Проблемы антибиотикорезистентности. Современные подходы в микробиологической диагностике». - Челябинск, 2011. - С. 38-40. 15. Долгушин, И.И. Анализ морфологических форм активированных и неактивированных нейтрофилов в слюне у здоровых женщин в I и 11 фазу менструального цикла / И.И. Долгушин, В.А. Маркова, А.Ю. Савочкина, И.В. Пегушина, К.В. Никушкина // Областная научно-практическая конференция «Проблемы антибиотикорезистентности. Современные подходы в микробиологической диагностике». - Челябинск, 2011. - С. 40-43. 16. Маркова, В.А. Сравнительный анализ количества нейтрофильных внеклеточных ловушек в слюне у здоровых женщин в зависимости от фазы менструального цикла / В.А. Маркова, А.Ю. Савочкина, Е.В. Плеханова, И.В. Пегушина // Вестник Российского государственного медицинского университета. - Москва, 2012. - №1. - С. 204-205. 17. Маркова, В.А. Определение фагоцитарной функции интактных и активированных нейтрофилов слюны у здоровых женщин в разные периоды менструального цикла / В.А. Маркова, А.Ю. Савочкина, Ю.С. Шишкова, 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. И.В. Пегушина, Е.В. Плеханова, Т.Г. Смирнова, Е.А. Мезенцева // Материалы III международной (X итоговой) научно-практической конференции молодых ученых. - Челябинск, 2012. - С. 194-196. Пегушина, И.В. Метод обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек, выделенных из периферической крови здоровых доноров в агарозном геле / И.В. Пегушина, А.Ю. Савочкина, Ю.С. Шишкова, И.Л. Батурина, В.А. Маркова, Т.Г. Смирнова, О.Б. Прокопьева // Материалы III международной (X итоговой) научно-практической конференции молодых ученых. Челябинск, 2012. - С. 246-248. Савочкина, А.Ю. Роль кальциевых каналов в формировании нейтрофильных внеклеточных ловушек / А.Ю. Савочкина, Ю.С. Шишкова, Т.Г. Смирнова, Е.В. Плеханова, В.А. Маркова, К.В. Никушкина, ЕЛ. Куренков // Вестник Уральской медицинской академической науки.- 2012. - №2 (39) - С. 28-29. Долгушин, И.И. Определение фагоцитарной функции нейтрофилов цервикального секрета у здоровых женщин в различные фазы менструального цикла / И.И. Долгушин, И.В. Пегушина, А.Ю. Савочкина, В.А. Маркова, Е.В. Плеханова, Т.Г. Смирнова, Е.А. Мезенцева // Российский иммунологический журнал. — Т.6(14), № 2(1). 2 0 1 2 . - С . 55-56. Маркова, В.А. Особенности кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов слюны у здоровых мужчин при воздействии активаторов различной природы / В.А. Маркова, А.Ю. Савочкина, И.В. Пегушина, Е.В. Плеханова, О.Б. Прокопьева // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2012. - №4 (41). - С. 5253. Долгушин, И.И. Внеклеточный антимикробный механизм защиты нейтрофильных гранулоцитов / И.И. Долгушин, А.Ю. Савочкина, Ю.С. Шишкова, И.В. Курносенко, Т.Г. Смирнова, В.А. Маркова, И.В. Пегушина // Вестник Уральской медицинской академической науки2 0 1 2 . - № 4 ( 4 1 ) - С . 30-31. Плеханова, Е.В. Формирование нейтрофильных внеклеточных ловушек в условиях гипокинетического стресса / Е.В. Плеханова, И.И. Долгушин, В.Э. Цейликман, А.И. Синицин, В.А. Маркова, А.Ю. Савочкина, Е.А. Мезенцева, Т.Г. Бондаренко, И.В. Пегушина, O.A. Гизингер // Медицинский академический журнал. - 2012. - № 3. - С. 90-92. Долгушин, И.И. Метод обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в цервикальном секрете / И.И. Долгушин, А.Ю. Савочкина, Ю.С. Шишкова, Т. Г. Смирнова, И.В. Пегушина, В.А. Маркова, И Л . Батурина // Клиническая лабораторная диагностика. - 2012. - № 9. - С. 23. Шишкова, Ю.С. Разработка метода обнаружения живых и неживых объектов в нативных биопрепаратах с помощью люминесцентной микроскопии / Ю.С. Шишкова, АЛО. Савочкина, И.И. Долгушин, Т.Г. Смирнова, В.А. Маркова, К.В. Никушкина, О.Б. Прокопьева, Е.А. Мезенцева, И.В. Пегушина, М.А. Зотова, К.Е. Пряхина // Российский аллергологический журнал. - 2012.-№ 5 - С.297-298. Маркова, В.А. Кислородэависимый метаболизм интактных и активированных нейтрофильных гранулоцитов слизистых оболочек / В.А. Маркова, Т.Г. Смирнова, А.Ю. Савочкина, К.Е. Прихина И Вестник Российского государственного медицинского университета. - 2013. - № 2. - С. 64-66. 27. Долгушин, И.И. Влияние препарата «Пирогенал» на функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов в системе in vitro / И.И. Долгушин, Т.Г. Смирнова, А.Ю. Савочкина, В.А. Маркова, И.В. Самусева Н Материалы Всероссийской заочной научно-практической конференции с международным участием «Микробиология в современной медицине». Челябинск, 2013. - С. 24-26. 28. Шишкова, Ю.С. Количество внеклеточных ловушек образованных нейтрофильными гранулоцитами цервикалъного секрета в ответ на активацию липополисахаридом / Ю.С. Шишкова, В.А. Маркова. А.Ю. Савочкина, Т.Г. Смирнова, К.Е. ГІряхина // Материалы Всероссийской заочной научно-практической конференции с международным участием «Микробиология в современной медицине». -Челябинск, 2013. - С. 116-120. 29. Маркова, В.А. Показатели внеклеточной и внутриклеточной бактерицидности интактных и активированных нейтрофильных гранулоцитов цервикального секрета / В.А. Маркова // Материалы IV международной (IX итоговой) научно-практической конференции молодых ученых. - Челябинск, 2013. - С. 161-163. 30. Долгушин, И.И. Роль мембран в образовании нейтрофильных внеклеточных ловушек / И.И. Долгушин, А.Ю. Савочкина, Т.Г. Смирнова, A.A. Савельева, В.Б. Маянская, И.В. Самусева, В.А. Маркова // Российский иммунологический журнал. - 2013. - Т. 7 (16), № 2-3. - С. 157. 31. Шишкова, Ю.С. Метод одновременного определения жизнеспособности нейтрофильных гранулоцитов и количества нейтрофильных внеклеточных ловушек в нативных биопрепаратах с помощью люминесцентной микроскопии / Ю.С. Шишкова, А.Ю. Савочкина, Т.Г. Смирнова, В.А. Маркова, К.Е. Пряхина, Е.А. Мезенцева // Российский иммунологический журнал. - 2013. - Т. 7 (16), № 2-3. - С. 180-181. 32. Долгушин, И.И. Сравнительная оценка метода обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в агарозном геле с другими методами их обнаружения в различных биологических жидкостях / И.И. Долгушин, А.Ю. Савочкина, И.В. Самусева, A.A. Савельева, В.А. Маркова, Т.Г. Смирнова, И.Л. Батурина // Российский иммунологический журнал. - 2013. - Т. 7 (16), № 2-3(1). - С. 24-25. 33. Долгушин, И.И. Кислородзависимый метаболизм интактных и активированных нейтрофильных гранулоцитов слюны / И.И. Долгушин, В.А. Маркова, А.Ю. Савочкина, И.В. Пегушина // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2013. - Т. 156, № 8. - С. 206208. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВГГПР - высокие показатели прямого светорассеивания ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота жен - женщины м.ц. - менструальный цикл муж - мужчины НВЛ - нейтрофильные внеклеточные ловушки НГГПР - низкие показатели прямого светорассеивания HCT - нитросиний тетрозолий ФМА - форбол-миристат-ацетат ДЛЯ ЗАМЕТОК На правах рукописи Маркова Виталия Александровна СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ Ф У Н К Ц И О Н А Л Ь Н Ы Х СВОЙСТВ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ И М У К О З А Л Ь Н Ы Х СЕКРЕТОВ У ЗДОРОВЫХ М У Ж Ч И Н И ЖЕНЩИН 14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Подписано в печать 18.04.2014г. Формат 60x90/16. Бумага офсетная. Гарнитура «Times New Roman». Усл. печ. л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ № 552. Цена свободная. Челябинск-2014 It — 755D 201 4 1 6 4 6 0 6
