автореферат_Костюкова_МН 4_4_14
advertisement
На правах рукописи Костюкова Мария Николаевна ЗНАЧЕНИЕ РЕЦЕПТОРА ИНТЕРЛЕЙКИНА-6 НА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМЫ 14.01.12 — онкология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва — 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н. Н. Блохина» Российской академии медицинских наук Директор — академик РАН и РАМН, профессор Давыдов Михаил Иванович Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Тупицын Николай Николаевич доктор медицинских наук, профессор Османов Евгений Александрович Официальные оппоненты: Пинегин Борис Владимирович Доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «ГНЦ институт иммунологии» ФМБА России, заведующий отделом иммунодиагностики и иммунокоррекции Спиридонова Вера Алексеевна Доктор биологических наук, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова, старший научный сотрудник отдела хроматографического анализа Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава РФ Защита диссертации состоится «_____» ____________ 2014 г. в «____» часов на заседании диссертационного совета Д001.017.02 ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН. Адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, 23. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24). Автореферат разослан «_____» _______________ 2014 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор Барсуков Юрий Андреевич ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы Воздействие цитокинов на пролиферацию и дифференцировку клеток костного мозга является мощным фактором гемопоэза и играет центральную роль в опухолевой прогрессии. Так, для многих В-клеточных неоплазий показано резкое повышение уровня основного фактора дифференцировки В-клеток интерлейкина-6 (IL-6). При этом клетки определенных типов опухолей требуют для пролиферации наличия высокой концентрации экзогенного IL-6, то есть являются IL-6-зависимыми. К таким опухолям относится множественная миелома. Показано, что при множественной миеломе передача сигнала с участием IL-6 является центральным механизмом опухолевой прогрессии. Выработка IL-6 при множественной миеломе поддерживается как функционированием аутокринной петли на опухолевых плазматических клетках, так и стромальным микроокружением костного мозга. Действие IL-6 на клетки опосредуется образованием рецепторного комплекса с участием трансмембранных молекул – лиганд-связывающей молекулы IL-6Rα (CD126, gp80, α-цепь) и трансдуцерной молекулы gp130 (CD130, β-цепь), которые образуют рецептор интерлейкина6. Исследовательскими группами получены несколько десятков моноклональных антител к внеклеточным доменам IL-6Rα и gp130 и описаны функциональные свойства соответствующих им специфических эпитопов. Методология использования широкого спектра моноклональных антител послужила мощным инструментом для изучения структуры рецептора и передачи им сигнала в живых клетках. Несмотря на это, данные об экспрессии IL-6Rα и gp130 на мембране клеток множественной миеломы, а также об особенностях регуляции малочисленными. опухолевого Основную роста сложность в рецептором получении интерлейкина-6, этих сведений остаются составляют гетерогенность и широкий диапазон уровня экспрессии рецептора интерлейкина-6 на различных экспериментальных клеточных линиях множественной миеломы, а также на опухолевых клетках больных множественной миеломой. Существенно различаются по уровню экспрессии рецептора интерлейкина-6 также опухолевые клетки, присутствующие в одном образце костного мозга больного. Кроме того, уровень экспрессии молекул рецептора интерлейкина-6 во многих случаях очень низкий. Таким образом, несмотря на непосредственное участие рецептора интерлейкина-6 в передаче пролиферативного и антиапоптотического сигналов опухолевыми клетками множественной миеломы, на настоящий момент не было проведено значимых систематических исследований взаимосвязи рецептора интерлейкина-6 с аберрантными характеристиками плазматических клеток. 3 Комплексное исследование значения рецептора интерлейкина-6 на мембране опухолевых клеток при множественной миеломе, а также оценка взаимосвязей клинических проявлений этого заболевания с экспрессией рецептора интерлейкина-6 представляют на сегодняшний день актуальное направление как в клиническом, так и в молекулярно-биологическом аспектах, и ведут к более глубокому пониманию факторов опухолевой прогрессии множественной миеломы. Цель исследования Изучить значение рецептора интерлейкина-6 на опухолевых клетках множественной миеломы. Задачи исследования 1. Изучить с помощью моноклональных антител активационные состояния цепей рецептора интерлейкина-6 gp130 и IL-6Rα. 2. Дать количественную оценку компонентам рецепторного комплекса на клетках модельных миеломных культур. 3. Описать влияние IL-6 на компоненты рецепторного комплекса gp130 и IL-6Rα на экспериментальных моделях, а также на опухолевых клетках больных множественной миеломой. 4. Определить частоту и уровни экспрессии рецептора интерлейкина-6 на опухолевых клетках больных множественной миеломой. 5. Охарактеризовать взаимосвязь экспрессии рецептора интерлейкина-6 с аберрантным иммунофенотипом плазматических клеток. 6. Исследовать взаимосвязь наличия ДНК вируса HHV-8 в клетках костного мозга больных и экспрессии рецептора интерлейкина-6 на опухолевых плазматических клетках. Научная новизна Впервые подробно описан на клеточных линиях множественной миеломы, а также воспроизведен на клетках костного мозга больных множественной миеломой селективный механизм обратимого подавления интерлейкином-6 экспрессии его рецептора. Этот механизм проясняет способ функционирования IL-6 на опухолевых клетках в качестве фактора роста. Впервые изучены уровень и характер экспрессии IL-6Rα на клетках больных множественной миеломой во взаимосвязи с иммунологическими и морфологическими 4 характеристиками опухолевого субстрата; выявлены новые закономерности на уровне клинической картины и иммунофенотипа. Показано, что уровень экспрессии CD126 коррелирует с количеством проплазмоцитов в составе опухоли, ассоциирован с выраженностью плазмоцитоза, и не коррелирует с аберрантной экспрессией CD45 и CD56. Впервые дифференцированно рассмотрены особенности экспрессии рецептора IL-6 на клетках с наличием и отсутствием на мембране специфического плазмоклеточного антигена CD138 (синдекана-1). Показано существенное различие уровней CD126 на этих двух субпопуляциях опухолевых клеток. Экспрессия CD126 на клетках CD138+ более интенсивная; наличие CD126 на этих клетках взаимосвязано с увеличением количества клеток CD45- и CD56+. Уровень CD126 на клетках CD138- коррелирует с аберрантной экспрессией CD19. Показано, что инфицированность вирусом герпеса человека 8 типа связана с усилением экспрессии CD126 на мембране опухолевых плазматических клеток. Научно-практическая значимость работы Основную научно-практическую значимость настоящей работы составляют 4 аспекта. 1) Методологический: представлен комплексный способ оценки слабой экспрессии рецептора IL-6 на мембране, применимый в анализе клинических данных, а также в исследованиях других слабо экспрессированных молекул. На линиях множественной миеломы показана возможность иммунологического разграничения активированного (димеризованного) и неактивированного состояний рецепторов IL-6. 2) Фундаментальный: выявлен и подтвержден на клиническом материале механизм селективной обратной регуляции интерлейкином-6 экспрессии рецептора интерлейкина6 на клетках множественной миеломы. 3) Экспериментальный: полученные в работе результаты анализа иммунофенотипа клеток линий множественной миеломы являются платформой для экспериментального изучения особенностей неопластических плазматических клеток. 4) Клинический: обоснована необходимость дифференцированного рассмотрения CD138+ и CD138- субпопуляций плазматических клеток, различающихся в отношении экспрессии рецептора IL-6, иммунологических параметров опухоли и взаимосвязей с характеристиками клинической картины. Учет данных субпопуляций опухолевых клеток как новой клинической категории может применяться для оценки прогноза и выбора стратегии противоопухолевого лечения. 5 Основные положения, выносимые на защиту 1. При использовании моноклональных антител к внеклеточным доменам цепей рецептора IL-6 (gp130 и IL-6Rα) возможно иммунологическое цитофлуориметрическое разграничение эффектов, связанных с активацией рецептора, его ресинтезом и интернализацией. 2. На опухолевых клетках множественной миеломы имеет место эффект обратной регуляции экспрессии цепей рецептора IL-6Rα и gp130 интерлейкином-6. 3. Уровень экспрессии CD126 на опухолевых плазматических клетках является преимущественно низким, строго коррелирует с долей проплазмоцитов в костном мозге, а также ассоциирован с выраженностью плазмоцитоза. 4. Наличие экспрессии CD126 на мембране плазматических клеток сопутствует проявлению аберрантных иммунологических характеристик: увеличению доли клеток с CD45-, CD19-, CD56+. В то же время отсутствует линейная зависимость уровней экспрессии CD126 и аберрантных маркеров. 5. Существует статистически достоверное различие экспрессии CD126 на клетках субпопуляций CD138+ и CD138-: клетки CD138- экспрессируют CD126 в меньшей степени (в отношении частоты экспрессии, р=0,001 и по уровню экспрессии, р=0,003). 6. Значение рецептора IL-6 на мембране клеток CD138+ и CD138- различается: только для клеток CD138+ показана взаимосвязь между присутствием CD126 на мембране и высокими уровнями плазмоцитоза, проплазмоцитов, высокой экспрессией CD56, низкой экспрессией CD45 и наличием аберрантного иммунофенотипа плазматических клеток CD45-/CD19-/CD56+. 7. Наличие на мембране рецептора IL-6 ассоциировано с иммуноморфологическими параметрами костного мозга в большей степени, чем уровень его экспрессии. 8. Инфицированность клеток костного мозга вирусом HHV-8 ассоциирована с усилением экспрессии CD126 на опухолевых плазматических клетках (р<0,05). Апробация диссертации Апробация диссертации состоялась 21 января 2014 года на совместной конференции отделения химиотерапии гемобластозов, лаборатории клинической иммунологии опухолей, лаборатории иммунологии гемопоэза НИИ клинической онкологии, отделения химиотерапии гемобластозов НИИ детской онкологии и гематологии, лаборатории механизмов регуляции иммунитета, лаборатории генетики опухолевых клеток НИИ канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН, кафедры онкологии, кафедры детской онкологии РМАПО. 6 Публикации по теме диссертации По теме диссертации опубликовано 3 статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 4 сообщения на российских и международных конференциях. Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста, состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Список литературы содержит 160 источников, из которых 6 отечественных и 154 иностранных. Работа иллюстрирована 24 рисунками и 21 таблицей. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Клеточные линии. В работе использованы IL-6-зависимые иммортализованные клеточные линии множественной миеломы XG-1 и XG-2, культивируемые в присутствии экзогенного IL-6; субклон XG-2PA, полученный селекцией в присутствии рост- стимулирующих антител B1 и I2 (B1+I2 – зависимые); мышиные пре-В-клетки BAF130/190, трансфицированные кДНК gp130 и рецептора лейкозингибирующего фактора LIFR (LIFзависимые); IL-6-независимые клеточные линии множественной миеломы IM9 и RPMI8226. Антитела. Функциональные свойства цепей рецептора IL-6 изучали с применением панелей мышиных моноклональных антител (МКА) к различным эпитопам внеклеточных доменов gp130 и IL-6Rα человека. Анти-gp130 МКА: A1, A2, A3, B1, B2, I1, I2, C1, C2, C3, C7, D1, D2, D3, E1, E2, F4, G2, G4 и анти-IL-6Rα МКА: M91, M195, M5, M182 и М164 (INSERM U475, Франция). Для регистрации антител в реакции непрямой флуоресценции клетки инкубировали с мечеными фрагментами иммуноглобулинов F(ab’)2-FITC. Исследования клинического материала проводили с использованием диагностической панели МКА (BD, США): CD38-PerCP (клон HIT-2), CD138-FITC (клон MI-15) и конъюгированных с РЕ МКА к CD45 (клон HI30), CD19, CD56, CD3 (клон UCHT1, изотип IgG1) и CD126 (клон М5, изотип IgG1). Тип моноклональности опухолевых клеток определяли с помощью κ-PE/λ-FITC реагента. Изотипическими контролями являлись IgG1PE и IgG1-биотин. Регуляцию экспрессии рецептора IL-6 собственным лигандом изучали в присутствии анти-IL-6 МКА, клон B-E8 (Diaclone, Франция). Культивирование клеточных линий. Клетки линий RPMI8226 и IM9 культивировали среде RPMI-1640, содержащей глутамин, телячью эмбриональную сыворотку и гентамицин, 7 в стерильных флаконах 25см2 при 37°С, 5% СО2, во влажной атмосфере. Пересевали клетки каждые 2-4 дня при плотности 1х106 кл/мл. Для экспериментов использовали клетки в логарифмической фазе роста. Клетки линий XG-1 и XG-2 (IL-6-зависимые), XG-2PA (B1+I2зависимые), BAF130/190 (LIF-зависимые) культивировали в описанных выше условиях, но с добавлением в среду при пересеве необходимых ростовых факторов: IL-6 5 пМ (0,1 нг/мл), B1 и I2 по 0,5 мкг/мл каждое, LIF 10 пМ, соответственно. Характеристика клинического материала. В исследование включены образцы костного мозга 27 больных множественной миеломой (ММ), проходивших лечение в отделении химиотерапии гемобластозов ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН в 2010-2013 гг. Медиана возраста больных на момент исследования составила 61 год. Медиана уровня плазмоцитоза - 15,2% от общего количества миелокариоцитов. Морфологическая характеристика аспиратов костного мозга, включающая подсчет миелограммы, выполнена в морфо-цитохимической группе лаборатории иммунологии гемопоэза (рук. проф., д.м.н. М.А. Френкель). Выделение фракции мононуклеарных клеток костного мозга из биопсийного материала проводили с использованием лизирующего буферного раствора (Becton Dickinson) согласно рекомендуемому протоколу. Определение аберрантного иммунофенотипа опухолевых клеток больных ММ. Использовали диагностическую панель первично меченых МКА: CD38-PerCP, CD138-FITC (маркеры плазматических клеток), а также меченые фикоэритрином (РЕ) МКА: CD45-PE, CD19-PE, CD56-PE, CD3-PE (отрицательный контроль), CD126-PE. Для анализа методом трехцветной проточной цитометрии клетки окрашивали CD38, CD138 и РЕ- конъюгированным МКА. Пробоподготовку проводили по стандартной методике. Анализ проводили на проточных цитофлуориметрах FACScan (Becton Dickinson, США) и EPIC XLMCL (Becton Coulter, США). Накапливали по 50000-500000 событий для каждого образца. Для анализа данных использовали программы WinMDI 2.8 и FCS3. Изучение регуляции экспрессии рецептора IL-6 его лигандом. Клетки линий XG-1, XG-2, RPMI8226 культивировали в присутствии и в отсутствии IL-6. Методом непрямой цитофлуориметрии оценивали изменения различных эпитопов gp130 и IL6Rα субъединиц рецептора с помощью соответствующих МКА в течение 1-3 суток роста в условиях депривации IL-6. Инкубацию клеток с цитокином после депривации проводили при +4°C либо при +37°С в течение 1, 5, 15, 30 и 60 минут. Нейтрализацию IL-6 в клиническом материале проводили в стерильных условиях при 37°С, 5% СО2 и высокой влажности. 500 мкл аспирата костного мозга инкубировали 0, 3, 24 ч в присутствии 100 мкг/мл анти-IL-6 8 МКА, клон B-E8, отбирали стерильно для анализа 150 мкл инкубированного с МКА препарата; мононуклеарную фракцию клеток окрашивали анти-CD3-PE (контроль) и антиCD126-PE МКА с использованием стандартной методики. Количественное определение экспрессии молекул рецептора. Абсолютное количество молекул IL-6Rα и gp130 определяли методом проточной цитометрии с помощью набора реагентов QIFIKIT в условиях полного насыщения препарата соответствующими МКА. Для каждого независимого эксперимента строили калибровочную кривую с использованием 4-8 концентраций стандартизированных микросфер, конъюгированных с заданным числом молекул флуорофора (рис. 1). Сравнивали с экспериментальными значения logMFI – логарифма среднего значения флуоресценции, полученные для микросфер. Расчет количества эпитопов (молекул, N) проводили на основе линейной функции калибровочной кривой по формуле: N = a•logMFI + b, где a и b – константы для данного Рисунок 1. - Калибровочная кривая для количественного определения мембранных антигенов с использованием стандартизированных микросфер QIFIKIT. эксперимента, а MFI – среднее значение интенсивности флуоресценции для данного антитела. Анализ данных, полученных методом проточной цитометрии. При обработке данных, полученных на клеточных линиях при одноцветном окрашивании, события представляли в координатах прямого и бокового рассеяния и выделяли основную популяцию живых клеток. В выбранном гейте строили гистограммы распределения флуоресцентного сигнала по количеству событий; в одном рисунке наложением получали два и более пиков (рис. 2 А). Анализ данных с трехцветным окрашиванием образцов начинали с выявления популяции плазматических клеток из общего числа миелокариоцитов костного мозга путем гейтирования. Выделяли в координатах CD38/SSC клетки с высокой экспрессией CD38 (рис. 2 Б). Выбранные клетки рассматривали в координатах CD38/CD138, формировали популяции опухолевого пула CD38+, CD38+/CD138+, CD38+/CD138- (рис. 2 В, Г). Экспрессию аберрантных маркеров ММ CD45, CD19, CD56, а также CD126 характеризовали на основе доли антиген-позитивных клеток. Логическую границу наличия экспрессии устанавливали по совокупности визуального разделения пула клеток на «экспрессирующий» и «неэкспрессирующий», клеток, отсекаемых границей сигнал/шум по экспрессии CD3 и по расположению границы пула Т-лимфоцитов. По гистограммам распределения уровней экспрессии находили среднее геометрическое для этих величин. 9 А Б В Г Рисунок 2. - Обработка цитофлуориметрических данных: А. Наложение гистограмм, соответствующих флуоресцентному сигналу клеток с выбранными параметрами образцов и окрашенных F(ab’)2-FITC (отрицательный контроль, закрашенный пик) и анти-gp130/F(ab’)2-FITC (незакрашенный пик); Б, В, Г: Выделение анализируемых популяций плазматических клеток костного мозга больного ММ: Б: гейт R1 в координатах CD38-PerCP/SSC; В: гейты R2 CD38+/CD138+ и R3 - CD38+/CD138- в координатах СD38-PerCP/CD138-FITC; Г: популяция плазматических клеток гейта R1 костного мозга в координатах CD38-PerCP/CD126-PE. Экспрессию рецептора IL-6 представляли для каждой из трех групп клеток CD38+, CD38+/CD138+, CD38+/CD138- в виде характеристик: а) доли CD126-позитивных клеток (%CD126+), б) среднего значения флуоресценции MFI, в) среднего геометрического значения Gmean, г) соотношения средних геометрических значений сигнал/шум MFR = Gmean(CD126)/Gmean(CD3), д) непараметрического коэффициента D КолмогороваСмирнова, полученного при статистическом анализе распределений флуоресценции клеток, окрашенных МКА к CD126 и CD3 (отрицательный контроль). Выявление генов вируса HHV-8 в опухолевых клетках. Аликвоты интактного костного мозга больных ММ объемом 100 мкл использовали для выявления ДНК вируса герпеса человека 8 типа (HHV-8) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для этого выделяли ДНК, исследовали ее на наличие трех генов, специфичных для HHV-8: К1, кодирующего трансмембранный вирусный белок, vIL-6 (К2) – аналога человеческого IL-6, и ORF26, кодирующего капсидный белок. Контрольным геном служил человеческий ген глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GADPH). Продукты реакции разделяли с помощью ДНК-электрофореза в 1,7% агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Результаты анализа регистрировали визуально в трансиллюминаторе. 10 Статистическая обработка данных проведена с применением пакета программ SPSS Statistics, версия 17.0. Для количественной оценки взаимосвязей между параметрами рассчитывали коэффициент корреляции Пирсона. Достоверность различий рассчитывали с помощью точного критерия Фишера или критерия Стьюдента. Статистически достоверными принимали различия с p<0,05. Анализ данных, не описывающихся нормальным распределением, а также для категоризованных параметров, проводили с помощью непараметрических методов χ2 «хи квадрат» с построением таблиц сопряженности и сравнения выборок по Манну-Уитни, при этом рассчитывали медианы значений. Построение графиков функций выполняли в программе GraphPad Prizm 5.0. Метод Колмогорова-Смирнова применяли для выявления слабой экспрессии рецептора IL-6. Рассчитывали коэффициент D, коррелирующий с величиной экспрессии, в программе CellQuest (Becton Dickinson) на основе исходных данных проточной цитофлуориметрии формата .fcs 1.0. Для всех полученных значений D оценивали уровень достоверности. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Функциональные особенности внеклеточных доменов субъединиц рецептора интерлейкина-6 gp130 и IL-6Rα 1.1. Изменение активационных состояний IL-6Rα и gp130 под действием IL-6 (функциональный эпитопный анализ) Для работы сформировали панель моноклональных антител (МКА) к gp130 и IL-6Rα цепям рецептора интерлейкина-6 таким образом, чтобы они оказывали различное воздействие на пролиферацию клеток, связываясь с разными эпитопами молекул рецептора (согласно данным литературы). Отобранные по этому принципу МКА: анти-gp130 A1, B1, C2, анти-IL-Rα M195, М91 составили характеристическую экспериментальную панель дальнейшего исследования. Присутствие в ростовой среде IL-6 во всех экспериментах на клеточных линиях XG-1 и XG-2, и фактора роста клеток XG-2PA МКА (B1+I2) приводило к существенному уменьшению детектируемых количеств эпитопов обеих цепей рецептора IL-6, то есть к изменению количества молекул рецептора на мембране. В попытке исключить интернализацию и ресинтез цепей рецептора эксперименты проводили при температуре 0°С в присутствии азида натрия, угнетающего клеточное дыхание и останавливающего физиологические процессы в клетке, что позволило выявить биохимические реакции на мембране клетки. В данных условиях некоторые эпитопы: A1, B1, M195 оставались воспроизводимо чувствительными к воздействию IL-6 (рис. 3). 11 Рисунок 3. - Окрашивание клеток XG-2 анти-gp130 (А1, В1) и анти-IL-6Rα (М195) МКА до (пунктирная линия) и после (точечная линия) инкубации с IL-6. Сплошная линия – изотипический контроль. Изменения детектируемых количеств эпитопов А1, В1, М195, выраженные как ∆FL (величина смещения пика в сторону изотипического контроля, рис. 3) носят строго дозозависимый характер при изменении концентрации IL-6, что иллюстрируют классические кривые ингибирования (рис. 4). Коэффициент ЕС50 отражает концентрацию IL-6, при которой его воздействие составляет половину от максимального. 20 20 A1 20 B1 ∆ FL ∆ FL 10 10 5 5 -2 0 2 4 0 -2 6 0 2 4 6 log [IL-6] log [IL-6] 10 5 0 0 M195 15 15 15 ∆ FL EC50 = 1.8 ng/ml EC50 = 1.1 ng/ml EC50 = 3.2 ng/ml 0 1 2 3 4 5 log [IL-6] Рисунок 4. - Анализ дозозависимого воздействия IL-6 на эпитопы А1 и В1 молекулы gp130 и на эпитоп M195 молекулы IL-6Rα. При выявлении сайтов димеризации рецептора интерлейкина-6 gp130 – гомодимеризации (gp130-gp130) и объединения gp130 с IL-6Rα на клетках XG-2PA, фактором роста которых служит пара антител-агонистов рецептора IL-6 – B1+I2, изучено изменение доступности эпитопов рецептора для связывания с различными МКА в присутствии и в отсутствии IL-6, в том числе продемонстрировано отсутствие перекрестного блокирования между эпитопами молекулы gp130 стимулирующих рост клеток МКА B1, I1, I2 и не стимулирующих МКА А1, С2. Варьирование условий преинкубации клеток с ростовыми факторами выявило эффекты интернализации и ресинтеза обеих цепей рецептора. Показано существенное функциональное различие между эпитопами А1 и С2 (рис.5). При гомодимеризации gp130 в присутствии МКА B1+I2 (1 мин, 37°С) маскируется МКА A1, при димеризации gp130 c участием IL-6Rα происходит снижение уровня эпитопа М195, 12 находящегося в сайте связывания IL-6 молекулой IL-6Rα. При этом уровни эпитопов С2 gp130 и М91 IL-6Rα, находящихся вне функциональных сайтов взаимодействия с IL-6 и димеризации gp130, не изменяются. К группе эпитопов, не претерпевающих изменений при активации рецептора IL-6, также отнесены эпитопы групп С (С3, С7), D (D1, D3), E (E1, E2) для gp130 и эпитопы M5, M91 - для IL-6Rα. Рисунок 5. - Детекция димеризации рецептора интерлейкина-6. Закрашенный пик – изотипический контроль, сплошная зеленая линия – изначальная экспрессия, голубая пунктирная линия – количество доступных эпитопов после преинкубации с не стимулирующей димеризацию парой МКА B1+I1 (отрицательный контроль), розовая пунктирная линия – количество доступных эпитопов после преинкубации с парой МКА-агонистов рецептора IL-6 - B1+I2. Поскольку, согласно данным литературы, МКА А1 блокирует рост клеток, инициируемый любым цитокином семейства gp130, то оно связывается в сайте гомодимеризации рецептора IL-6; аналогично, В1 связывается в сайте взаимодействия gp130 и IL-6Rα. Наблюдаемые в присутствии IL-6 воспроизводимые изменения количеств эпитопов А1 и В1 gp130 свидетельствуют о нахождении цепей рецептора в закрытой для антител, димеризованной конформации, то есть в активационном состоянии, при котором произошли связывания gp130-gp130 и IL-6Rα-gp130 соответственно. МКА М182 блокирует при связывании c IL-6Rα передачу сигнала IL-6 в процессе гетеродимеризации gp130-IL-6Rα, а МКА М195 - при непосредственном взаимодействии IL-6Rα с IL-6. Обобщая полученные результаты, все описанные ранее типы эпитопов gp130 и IL-6Rα можно разделить на две группы – маркеры цепей рецептора, не зависящие от его активационного статуса (анти-gp130 МКА групп С, D, E, G; анти-IL-6Rα МКА М5, М91) и маркеры определенных состояний образования олигомерного рецепторного комплекса (антиgp130 МКА групп A, B, I, F; анти-IL-6Rα МКА М195, M182). 1.2. Определение абсолютных количеств молекул рецептора интерлейкина-6 на мембране клеток миеломных линий Количественная оценка экспрессии рецептора интерлейкина-6 выполнена на основе калибровки сигнала флуоресценции с помощью стандартизованных микросфер QIFIKIT, 13 конъюгированных с заданным количеством флуорохрома. Миеломные клеточные линии существенно различаются по экспрессии рецептора IL-6 (рис. 6). Количества молекул IL-6Rα gp130 IL-6Rα RPMI8226 и gp130 коррелируют; gp130 IL-6Rα XG-2 на мембране в нескольких экспериментах мы наблюдали тенденцию gp130 IL-6Rα XG-1 5000 слабому преобладанию IL-6Rα. Уровень экспрессии 0 к 10000 15000 20000 25000 30000 этих цепей для интерлейкин-зависимых линий Уровеньэкспрессии (n, количество молекул/кл) XG-1 Рисунок 6. – Уровни экспрессии цепей рецептора интерлейкина-6 на клетках миеломных линий RPMI8226, XG-2, XG-1. и ниже, XG-2 чем существенно для IL-6– независимой линии RPMI8226. 1.3. Регуляция экспрессии рецептора интерлейкина-6 его лигандом на клеточных линиях ММ При культивировании IL-6-зависимых клеток в отсутствие цитокина отмечено воспроизводимое существенное усиление экспрессии молекул gp130 и IL-6Rα. В присутствии IL-6 наблюдается существенное снижение уровней экспрессии gp130 и IL-6Rα. Влияние IL-6 на отмытые от цитокина клетки изучено на трех клеточных линиях и в зависимости от времени интерлейкиновой депривации (табл. 1). Т а б л и ц а 1 - Количество молекул gp130 и IL-6Rα на миеломных клеточных линиях при обычных условиях культивирования и при различных сроках депривации IL-6 Рецептор Клеточная Стандартное культивирование линия 1 Дни депривации IL-6 2 3 gp130 XG-1 0 3500 - 4500 4500-6000 6000-7000 XG-2 1500-2000 7000-10000 6000-7500 4000-6000 RPMI8226* 15000-25000 25000-30000 10000-12500 8000-10000 IL-6Rα XG-1 0 3500 700 1500 XG-2 4500 18000 7500 2500 RPMI8226* 23000 25000-30000 10500 8000-10000 * Примечание: RPMI8226 не является IL-6-зависимой линией и может служить контролем. Обратный эффект – снижение экспрессии субъединиц gp130 и IL-6Rα в присутствии IL-6 после культивирования клеток в условиях цитокиновой депривации - изучен для различных эпитопов на трех клеточных линиях. С помощью количественной оценки экспрессии рецептора выявлены различия между количествами эпитопов, оставшихся свободными для связывания МКА после воздействия IL-6 на клетки (рис. 7). 14 XG-2 7000 1200 6000 1000 5000 800 RPMI 8226 XG-1 25000 20000 15000 N 600 N N 4000 3000 10000 400 2000 5000 200 1000 0 0 A1 A2 A3 I1 B1 B2 G2 0 A1 A2 A3 I1 B1 B2 A1 G2 A2 I1 B1 B2 G2 Рисунок 7. - Количества (N) различных эпитопов молекул gp130 и IL-6Rα, определяемые на миеломных клеточных линиях XG-2, XG-1, RPMI8226 до (синие столбики) и после (красные столбики) инкубации клеток с IL-6. Влияние IL-6 различается в 1 и в 3 день цитокиновой депривации, причем на клетках с высоким уровнем экспрессии рецептора (XG-2, RPMI8226) этот эффект выражен сильнее (маскирование отдельных эпитопов более 90%). В целом отмечается более резкое снижение количества эпитопов IL-6Rα. Уменьшение количеств всех эпитопов gp130 и IL-6Rα, то есть исчезновение молекул рецептора с мембраны при инкубации с IL-6 связано, в основном, с интернализацией активированного рецепторного комплекса внутрь клетки. При этом претерпевают изменения все характеристические эпитопы, как А1, В1, М195, так и С2 и М91. Таким образом, IL-6 подавляет экспрессию как на IL-6-зависимых, так и на IL-6независимых миеломных клетках человека. Применение принципа дифференцированного описания процессов активации и экспрессии рецептора с рассмотрением специфических активационных состояний с помощью панели МКА позволило нам четко различать эффекты ресинтеза рецептора (накопления молекул, детектируемых всеми МКА), димеризации (исчезновения эпитопов, ассоциированных с активацией рецептора) и интернализации (маскирования всех характеристических эпитопов рецептора) (табл. 2). Т а б л и ц а 2 – Цитофлуориметрическое разграничение процессов активации рецептора интерлейкина-6, его ресинтеза и интернализации ЭПИТОП A1, A3, I1, F2 B1, B2 M195 C2, C7 D2, D3 C9 Эпитопы, не связанные с активацией рецептора M182 M91, M5 Эпитопы, связанные с активацией рецептора АКТИВАЦИЯ ↓ ↓ ↓ ↓ • • • РЕСИНТЕЗ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ - уменьшение количества эпитопов более чем на 50%; ↑ - увеличение количества эпитопов более чем на 50%; • - отсутствие изменений количеств детектируемых эпитопов. ↓ ↓ ↓ ИНТЕРНАЛИЗАЦИЯ Данный принцип позволяет сделать вывод о наличии эффекта значимого увеличения экспрессии новых молекул рецептора в ответ на депривацию IL-6. 15 1.4. Особенности иммунофенотипов клеточных линий ММ с различными уровнями экспрессии рецептора IL-6 При иммунофенотипировании IL-6-независимых клеточных линий ММ выявлены особенности экспрессии IL-6Rα (CD126) в совокупности с основными иммунологическими параметрами клеток ММ (табл. 3). Т а б л и ц а 3 - Экспрессия IL-6Rα и иммунофенотипы клеточных линий множественной миеломы Кл. линия, %СD138- Гейт %CD45+ %CD19+ %CD56+ %CD126+ RPMI8226 0-68%CD138- CD38+/CD138+ CD38+/CD138CD138+ CD138- 7 52 92 93 4 н.о. 85 95 21-43 51 1-37 0,1 80 42 1-44 1,5 IM9 81%CD138- Общелейкоцитарный антиген CD45 имеет тенденцию к более сильной экспрессии на CD138-клетках линий ММ. Также CD138- популяция обладает существенно более низкой экспрессией CD126; при этом уровень экспрессии CD126 на CD138-позитивных клетках остается высоким. представленной не При длительном классическим культивировании вариантом ММ, и клеточной не культуры экспрессирующей IM9, ни плазмоклеточный маркер CD38, ни CD126, характерно появление популяции CD38+/CD126+ клеток. Таким образом, при плазмоклеточных неоплазиях опухолевые клетки могут как утрачивать, так и возобновлять экспрессию СD38, СD138, CD126. 2. Экспрессия рецептора IL-6 на плазмоцитах костного мозга у больных ММ 2.1. Уровень и характер экспрессии CD126 на мембране опухолевых клеток Цитофлуориметрические данные по экспрессии CD126 на мембране опухолевых клеток больных ММ характеризуют рецептор IL-6 как слабо экспрессированный, в то же время в большинстве наблюдений отмечено четкое различие между экспрессией CD126 и отрицательным изотипическим маркером CD3. Методология численного представления цитофлуориметрических данных при слабой экспрессии мембранных молекул, помимо оценки доли рецептор-позитивных клеток (%СD126+), опирается также на расчет характеристик различий сигнал-фон, в том числе MFR (mean fluorescence ratio) соотношения средних значений интенсивности флуоресценции MFI (mean fluorescence intensity) рецептора и контрольного маркера MFR = MFICD126/MFICD3 и непараметрического коэффициента D Колмогорова-Смирнова, рассчитываемого при анализе гистограмм распределения интенсивности флуоресценции CD126 и CD3. Обобщенные характеристики экспрессии рецептора IL-6 на опухолевых клетках больных ММ представлены в табл. 4. 16 Т а б л и ц а 4 - Экспрессия CD126 на опухолевых клетках больных ММ Статистические характеристики Диапазон экспрессии Медиана Наличие CD126(% наблюдений) %СD126+ D MFR 0-67% 5,3% 74% 0,04-0,78 0,29 76% 0,62-4,08 1,21 81% Характер экспрессии CD126 в большинстве наблюдений мономорфный, то есть все клетки составляют одну популяцию с уровнем экспрессии в зоне границы сигнал-шум. Однако в ряде случаев (у 44% пациентов) отмечено также наличие небольших популяций клеток, ярко экспрессирующих CD126. Доля наблюдений, при которых %CD126+ > 10%, составила 37% от общего числа пациентов и 50% от наблюдений с наличием CD126 на мембране. Важным параметром анализа экспрессии рецептора IL-6 явилась категория наличия либо отсутствия рецептора на мембране клеток. В случае процентного выражения уровня CD126 рассматривалась разность сигнал-шум > 0 между средними геометрическими значениями уровней флуоресценции CD126 и отрицательного контроля (CD3). Аналогично, при соотношении сигнал/шум > 1 определено наличие экспрессии для категории MFR. Критерий разграничения наличия и отсутствия экспрессии, описанной в статистических значениях D, заключался в проверке нулевой гипотезы теста Колмогорова-Смирнова при сравнении коэффициента D с критическим значением, рассчитанным индивидуально по каждому пациенту: D крит. = 1,953· n1 + n 2 , где коэффициент 1,953 задан достоверностью n1·n 2 p<0,001, а n1 и n2 – количества событий (клеток), составивших сравниваемые распределения CD126 и CD3 соответственно. Наличие экспрессии CD126 констатировалось при D > Dкрит. Для всех трех методов количественной оценки экспрессии CD126 получены схожие показатели наличия слабой экспрессии CD126 на мембране опухолевых клеток ММ (табл. 4). 2.2. Оценка взаимосвязей экспрессии рецептора IL-6 с клинико-иммунологическими характеристиками опухолевых клеток В число изученных клинико-иммунологических параметров вошли следующие характеристики пула опухолевых клеток: содержание плазмоцитов в костном мозге (в процентном выражении, %РС), наличие и доля морфологически незрелых форм опухолевых клеток – проплазмоцитов (налич.proPC, %proPC), характеристики аберрантного иммунофенотипа: экспрессия диагностических маркеров ММ CD138, CD45, CD19, CD56, наличие инфицированности вирусом герпеса 8-го типа HHV-8, возраст пациентов. Для получения наиболее полной картины взаимосвязей экспрессии CD126 с этими характеристиками были параллельно проанализированы значения %CD126, MFR, D, характеризующие экспрессию CD126, а также данные, описанные в категориях наличия 17 CD126 на мембране (налич.СD126%, налич.СD126 D), а также наблюдения с относительно высоким уровнем экспрессии рецептора (CD126>10%). Числовые параметры опухолевых клеток рассмотрены с помощью корреляционного анализа по Пирсону. Уровень сопряженности категориальных характеристик (наличие/отсутствие свойства) оценен с помощью построения таблиц сопряженности хи-квадрат. Сравнение рассматриваемых характеристик в группах больных с разными категориальными показателями проведено в тесте Манна-Уитни. 2.3. Экспрессия рецептора IL-6 в субпопуляциях плазмоцитов CD138+ и CD138Одним из стандартных шагов методики обработки цитофлуориметрических данных является обнаружение в пуле миелокариоцитов костного мозга плазматических клеток путем выявления яркой экспрессии специфичных плазмоклеточных маркеров CD38 и CD138. Использование этих двух характеристических молекул существенно увеличивает чистоту анализируемой группы клеток. Однако, согласно данным литературы, CD138 может отсутствовать на опухолевых клетках ММ, причем наличие существенной популяции CD138клеток ассоциировано с плохим прогнозом, высокой вероятностью рецидива и со способностью опухоли к быстрому метастатическому росту. Таким образом, роль CD138 может затрагивать ключевые механизмы выживания и гомеостаза опухолевых клеток, что на настоящий момент слабо изучено. Описание опухолевых клеток только в рамках CD138позитивной популяции делает невозможным рассмотрение части механизмов регуляции опухолевого процесса, связанных с потерей этого маркера. Поэтому одной из важных задач данного исследования стало дифференцированное описание и сравнение экспрессии CD126 и свойств опухолевых клеток в трех различных гейтах: CD38+, CD38+/CD138+, CD38+/CD138-. В таблице 5 приведены общие характеристики опухолевого пула клеток больных ММ. Выборка характеризуется средним уровнем плазмоцитоза, наличием в препаратах значимой доли морфологически незрелых форм клеток плазмоцитарного ряда - проплазмоцитов (proPC) и наличием в 23 случаях из 27 (85% наблюдений) клеток, не экспрессирующих CD138, с широким диапазоном доли этой популяции (от 0 до 74% всего опухолевого клона). Т а б л и ц а 5 - Характеристики опухолевых клеток больных ММ Статистические характеристики %PC %proPC 0,6 - 49% 0 - 27,4% Диапазон 15,2% 2,4% Медиана %CD1380 - 74,2% 3,1% Анализ уровней экспрессии рецептора IL-6 на клетках CD138+ и СD138- в тесте МаннаУитни показал статистически достоверное различие %CD126 (р=0,003), что характеризует экспрессию CD126 на клетках CD138+ как достоверно более высокую по сравнению с его экспрессией на клетках СD138-. 18 2.3.1. Корреляционный анализ уровня экспрессии рецептора интерлейкина-6 и клинических характеристик ММ Численные соотношения уровня экспрессии CD126 и клинико-иммунологических характеристик костного мозга больных ММ получены с помощью оценки линейной корреляции Пирсона в гейтах опухолевых плазмоцитов CD38+, CD38+/CD138+, CD38+/CD138и представлены в таблице 6. Звездочкой отмечены статистически достоверные линейные зависимости параметров (p<0,05). Т а б л и ц а 6 - Корреляционные зависимости между экспрессией рецептора интерлейкина-6 и клиническими характеристиками костного мозга больных ММ (r, коэффициенты корреляции Пирсона) CD38+/CD138+ CD38+ %CD126 1,0 %CD126 0,86* D 0,95* MFR 0,3 %PC 0,49* %proPC -0,3 %CD45+ 0,0 %CD19+ 0,0 %CD56+ -0,1 %CD138- D 1,0 0,8* 0,4 0,41* -0,3 0,1 0,1 0,1 MFR %CD126 1,0 0,81* 1,0 0,96* 0,3 0,3 0,48* 0,5* -0,3 -0,3 -0,2 -0,1 -0,1 0,0 -0,2 -0,1 D MFR 1,0 0,77* 0,2 0,4 -0,1 0,0 0,0 0,2 1,0 0,3 0,46* -0,2 -0,2 -0,2 -0,2 CD38+/CD138%CD126 1,0 0,57* 0,56* 0,0 0,1 0,3 0,39* 0,1 0,3 D MFR 1,0 0,83* 0,3 0,6* 0,0 -0,1 0,2 0,0 1,0 0,56* 0,84* 0,4 0,0 -0,1 -0,1 * - p<0,05 Важным методологическим результатом корреляционного анализа является сходимость (наличие статистически достоверной взаимосвязи) между всеми числовыми характеристиками экспрессии CD126 - %CD126, MFR, D, полученными тремя различными расчетными методами. В гейтах CD38+ и CD38+/CD138+ наблюдается положительная корреляция экспрессии CD126 и количества проплазмоцитов в костном мозге. Несколько иная картина характеризует клетки CD138-: в этом гейте уровень экспрессии CD126 прямо пропорционален как количеству проплазмоцитов, так и уровню плазмоцитоза; кроме того, наблюдается статистически достоверная линейная зависимость экспрессии CD126 от уровня СD19. Показатели клинически значимых аберрантных маркеров, за исключением СD19, не имеют корреляции с CD126, что свидетельствует об относительной независимости сигнальных путей, модулирующих экспрессию CD126 и характеристических молекул ММ. Экспрессия СD126 не коррелирует с количеством клеток CD138-. Учитывая статистически достоверное снижение количества проплазмоцитов при образовании CD138- популяции (р<0,03), мы можем предположить экспрессию CD126 в опухолевом пуле клеток преимущественно на проплазмоцитах, что требует дальнейшего иммунологического подтверждения. 19 2.3.2. Анализ сопряженности клинико-иммунологических характеристик ММ и экспрессии рецептора интерлейкина-6 В непараметрических тестах исследованы закономерности, характеризующие появление или исчезновение CD126 на мембране опухолевых клеток ММ. На основании морфологических данных отдельно рассмотрены группы пациентов со средним (PC>10%) и высоким (PC>30%) плазмоцитозом, группы с наличием, а также c высоким уровнем проплазмоцитов (proPC>10% от всех плазматических клеток). Изучены взаимосвязи в группах пациентов с наличием и отсутствием популяции CD138-, ее средним (CD138->10%), и высоким (CD138->50%), содержанием в пуле опухолевых клеток. Уровни экспрессии аберрантных маркеров CD45, CD19 и CD56 категоризовали по принципу преобладания доли клеток с наличием или отсутствием их экспрессии. Тест хи-квадрат (табл. 7) показал для клеток СD138+, но не CD138-, яркую сопряженность наличия CD126 со всеми аберрантными параметрами плазматических клеток: преобладанием CD45-, CD56+, высоким уровнем плазмоцитоза и проплазмоцитов, а также с отсутствием популяции CD138-, за исключением связи с CD19. Одной звездочкой в таблице отмечены взаимосвязи с p<0,1 (близкие к статистически значимым), двумя звездочками – с p<0,05 (статистически значимые) Т а б л и ц а 7 - Анализ сопряженности клинико-иммунологических характеристик ММ и экспрессии рецептора интерлейкина-6 (таблица коэффициентов хи-квадрат) CD38+/CD138+ CD38+/CD138Налич Налич CD126 Налич Налич CD126 CD126 (%) CD126 (D) >10% CD126 (%) CD126 (D) >10% + 7,6** 10,8** 2,8* 0,006 0,04 1,4 CD45 >50% 2,1 1,8 0,3 0,04 0,09 0,4 CD19+>50% 2,3 5,9** 2,1 1,1 1,7 0,1 CD56+>50% 5,1** 16,8** 0,71 1,8 0,75 0,3 PC>10% 3,25* 3,7* 3,2* 0,002 2,4 0,7 PC>30% 3,9** 9,6** 1,3 0,006 0,75 0,06 Налич proPC 1,5 5** 1,3 0,034 1,7 0,1 proPC>10% 2,9* 0,67 0,34 0,09 0,98 0,002 Налич CD1380,95 4,4** 0,08 0,006 1,6 0 CD138->10% 3,4* 4,4** 0,05 0,34 1,1 1,5 CD138 >50% * - p<0,1; ** - p<0,05 Аналогичные закономерности демонстрирует тест Манна-Уитни (табл. 8): в присутствии CD126 на клетках СD138+, но не CD138-, статистически достоверно ослаблена экспрессия CD45 и увеличен уровень CD56; кроме того, CD126 появляется при высоких уровнях проплазмоцитов (р=0,008) и плазмоцитоза (р=0,005). Эффект утраты CD126 клетками СD138+ пациентов более молодого возраста (р=0,012) связан, по-видимому, с биологическими особенностями этих клеток. В этой группе пациентов мы также отметили усиление экспрессии CD45 (p=0,008). Отсутствие описанных закономерностей для клеток 20 CD138- может означать принципиально отличный вклад рецептора CD126 на этих клетках в прогрессию ММ по сравнению с клетками CD138+. Т а б л и ц а 8 - Различия клинико-иммунологических параметров в группах пациентов в зависимости от наличия экспрессии CD126 (достоверности различий, р) Категоризованные параметры CD38+/CD138+ Численные параметры %PC CD38+/CD138- Налич CD126 (%) Налич CD126 (D) CD126 >10% Налич CD126 (%) Налич CD126 (D) CD126 >10% 0,009** 0,002** 0,12 0,46 0,31 0,84 0,008** 0,12 0,012** 0,022** 0,31 0,019** 0,1* 0,41 0,056* 0,18 0,47 0,09* 0,69 0,37 0,3 0,69 0,9 0,15 0,26 0,21 0,21 0,75 1 0,06* 0,89 0,4 0,62 0,23 0,65 0,7 0,57 %proPC 0,19 %CD138 0,3 Возраст 0,11 %CD45+ 0,95 %CD19+ 0,47 %CD56+ * - p<0,1; ** - p<0,05 Таким образом, фактор наличия CD126 на мембране является строгим молекулярным индикатором злокачественной природы клеток множественной миеломы. Отдельно проанализированы эффекты изменения уровня экспрессии CD126 в группах пациентов с различными клинико-иммунологических параметрами костного мозга; достоверности таких различий приведены в таблице 9, обозначения используются так же, как в таблицах 7 и 8. Увеличение уровня CD126 показано в гейте СD138+, но не CD138-, в группах пациентов с преобладанием клеток, не экспрессирующих CD45 (р=0,024) и экспрессирующих CD56 (р=0,09). В CD138+ популяции усиление экспрессии CD126 происходит в условиях выраженного плазмоцитоза (PC>30%, р=0,019), а также при наличии (р=0,085) и увеличении количества (р=0,092) проплазмоцитов. Т а б л и ц а 9 - Различия уровней экспрессии СD126 в группах пациентов в зависимости от клинико-иммунологических параметров (достоверности различий, р) Численные параметры CD38+/CD138+ Категоризо ванные CD45+>50% CD19+>50% %CD126 D MFR %CD126 D MFR 0,024** 0,87 0,048** 0,36 0,62 0,83 0,61 0,82 0,21 0,65 0,65 0,91 0,64 0,75 0,038** 0,3 0,18 0,9 0,6 0,16 0,28 0,25 0,027** 0,5 0,49 0,62 0,68 0,48 0,66 0,79 0,73 0,9 0,66 0,85 0,9 0,47 0,75 0,94 0,21 0,45 0,04** 0,95 0,42 0,53 0,74 0,12 0,06* 0,1* 0,03** 0,62 0,93 0,6 0,09* 0,094* 0,019** 0,085* 0,092* 0,35 0,52 CD138 >10% 0,47 CD138 >50% * - p<0,1; ** - p<0,05 CD56+>50% PC>10% PC>30% Налич proPC proPC>10% Налич CD138- CD38+/CD138- 21 Клетки CD138-, напротив, не обнаруживают влияния экспрессии CD45 и CD56 на уровень CD126, но, тем не менее, взаимосвязаны с повышением уровня проплазмоцитов (proPC>10%, р<0,05). Нельзя в этом контексте исключать возможность паракринной стимуляции экспрессии CD126 на клетках CD138- проплазмоцитами. Очевидно также, что общее свойство всех ассоциированных с усилением экспрессии CD126 параметров – их принадлежность к характеристикам опухолевой прогрессии ММ. 2.3.3. Соотношение уровня экспрессии рецептора интерлейкина-6 с аберрантными иммунофенотипами ММ Аберрантный иммунофенотип (ИФТ) как комплексная характеристика плазматической клетки при ММ позволяет отличить ее от нормальных клеток и является важным диагностическим инструментом. ИФТ нормальных плазмоцитов характеризуется сочетанием CD45+CD19+CD56-; напротив, опухолевые клетки ММ проявляют ИФТ CD45-CD19-CD56+, который обозначен для удобства символом «ИФТ--+». В то же время, в зависимости от биологических характеристик опухоли у разных пациентов могут преобладать клетки с любой из 8 комбинаций аберрантных маркеров. При анализе соответствий отсутствия СD126 80% 70% компонентам здорового ИФТ в сравнении с 60% 50% общим уровнем экспрессии маркеров при ММ 40% показано, 30% 20% что мембране 10% 0% CD45+ CD19+ при отсутствии наблюдается CD126 тенденция на к уменьшению характерной для злокачественных CD56- клеток экспрессии всех трех диагностических + + - Рисунок 8. – Доля CD45 , CD19 , CD56 наблюдений в исследованной выборке больных ММ (сиреневые столбики) и у больных с отсутствием СD126 на опухолевых клетках ММ (голубые столбики). маркеров ММ как на клетках CD138+, так и CD138- (рис. 8). Изучение на клетках CD138+ и CD138- взаимосвязей экспрессии CD126 параметров показало ИФТ и высоко достоверную взаимосвязь уровня экспрессии CD126 и наличия злокачественного ИФТ--+ для клеток CD138+ и отсутствие такой взаимосвязи для клеток СD138-. Статистически достоверно (р=0,045) различается уровень экспрессии CD126+ в группах с наличием и отсутствием ИФТ--+ на клетках CD138+, но не CD138-. Эти данные еще раз подтверждают ассоциацию наличия CD126 на плазматических клетках с их малигнизацией, в то же время показывая более слабое влияние CD126 на свойства CD138-негативных плазмоцитов. Различие долей CD19-позитивных клеток в субпопуляциях CD138+ и CD138- высоко достоверно взаимосвязано с различием уровней экспрессии CD126 на этих клетках (р<0,02) и 22 с отсутствием CD126 на мембране клеток CD138+ (р=0,01). В то же время уровни CD19 и CD126 в пределах гейта CD138+ не взаимосвязаны, однако на клетках CD138- эти параметры высоко коррелируют (r=0,39; р<0,05). Выявлены также взаимосвязи различия CD126 в двух гейтах с изменениями иммунофенотипа в целом (р=0,026). 2.4. Регуляция интерлейкином-6 экспрессии CD126 на мембране опухолевых клеток в аспиратах костного мозга больных ММ Эффект обратной регуляции интерлейкином-6 количества молекул рецептора на мембране клеток миеломных иммортализованных линий, описанный в разделе 1.3, имеет устойчивую воспроизводимость и представляет исследовательский интерес в контексте объяснения принципа функционирования IL-6 в качестве ключевого фактора роста и выживания клеток ММ при низком выявляемом уровне рецептора IL-6 на мембране. Нейтрализация цитокина в аспиратах костного мозга полностью воспроизвела выявленный на клеточных линиях эффект усиления экспрессии рецептора IL-6 (рис. 9). Для связывания цитокина использовали избыток анти-IL-6 МКА B-E8, применяемого в зарубежных клиниках для терапии ММ и не имеющего токсичности. А Б В Рисунок 9. - Усиление экспрессии CD126 плазматическими CD38+ клетками (не закрашенный пик) в сравнении с контролем (закрашенный пик) при депривации IL-6 в аспирате костного мозга больного ММ: А – Исходная низкая экспрессия CD126; Б – инкубация с анти-IL-6 МКА в течение 3 часов; формирование отчетливого пика CD126 происходит уже через 3 часа инкубации с анти-IL-6; В инкубация с анти-IL-6 МКА в течение 24 часов. При депривации IL-6 в течение 3 и 24 часов происходит усиление экспрессии CD126 как на CD138+, так и на CD138- клетках, причем более яркий эффект прослеживается в гейте CD138+. Объемы этих двух субпопуляций, согласно данным литературы, могут изменяться: CD138+ популяция утрачивает синдекан-1 при инкубации препарата костного мозга вследствие апоптотических процессов, в связи с чем накапливаются клетки CD138-. В условиях данного эксперимента, в присутствии анти-IL-6 МКА, напротив, отмечено ингибирование популяции клеток CD138- (снижение доли CD138- с 50% до 20%). 23 Интактность препарата костного мозга в условиях эксперимента в отношении клеточного состава и растворимых факторов означает селективное участие в данном механизме только молекул IL-6, gp130 и IL-6Rα. Данный эффект может лежать в основе механизма регуляции рецептором интерлейкина-6 процессов пролиферации и выживания опухолевых клеток ММ. Таким образом, описан CD126- и gp130-специфичный механизм, обеспечивающий селективное активирование IL-6-сигнализации на опухолевых клетках путем аутокринной или паракринной модуляции экспрессии рецептора интерлейкина-6. 2.5 Взаимосвязь инфицированности HHV-8 с экспрессией CD126 и с морфологическими характеристиками костного мозга больных ММ Ген вирусного IL-6 (vIL-6) был выявлен в клетках аспиратов костного мозга методом ПЦР в 8 случаях из 14 (57%). Взаимосвязь наличия CD126 на мембране клеток ММ и наличия генов HHV-8 (табл. 10) близки к статистически достоверным (отмечены звездочкой) и проявляются на всех клетках (CD138+ и CD138-). Т а б л и ц а 10 – Анализ сопряженности характеристик экспрессии рецептора интерлейкина-6 и инфицированности HHV-8 (таблица коэффициентов хи-квадрат) Категориальные параметры Гейт Налич CD126 (%) Налич CD126 (D) CD126>10% Наличие HHV-8 CD38+/CD138+ CD38+/CD1383,1* 3,1* 3,1* 2,4 2,9* 0 * - p<0,1 В тесте Манна-Уитни установлена статистически достоверная взаимосвязь (p<0,03) между усилением экспрессии CD126 и наличием гена vIL-6 во всех клетках костного мозга больных ММ. В группе больных, инфицированных HHV-8, уровень экспрессии CD126 выше как на клетках субпопуляции CD138+ (р=0,033), так и на клетках CD138- (р=0,02). Эта взаимосвязь, однако, не может быть интерпретирована как прямое воздействие vIL-6 на рецептор ввиду описанного нами механизма обратной регуляции интерлейкином-6 уровня CD126. В то же время, поскольку, по нашим данным, наличие гена vIL-6 высоко достоверно ассоциировано также с наличием проплазмоцитов (р=0,006), то из прямой корреляции уровней CD126 и проплазмоцитов (р<0,001), следует, что вирусный цитокин может активировать продукцию CD126 на клетках ММ и, в частности, на проплазмоцитах. Подводя итог, можно отметить, что комплексная оценка экспрессии CD138, CD126, а также маркеров аберрантного иммунофенотипа (CD45, CD19, CD56) позволяет обозначить иммунологические параметры больных множественной миеломой с различным прогнозом. Предложена для дальнейшего изучения прогностическая модель, основанная на оценке приведенных выше трех параметров. 24 ВЫВОДЫ 1. Иммунологические методы определения специфических эпитопов цепей рецептора интерлейкина-6 IL-6Rα и gp130 позволяют дифференцировать активированные и неактивированные молекулы рецептора на мембране плазматических клеток. 2. Компоненты рецепторного комплекса IL-6Rα и gp130 экспрессированы на клетках множественной миеломы в равной степени. IL-6-зависимые клетки слабо экспрессируют рецептор интерлейкина-6 (0-4000 молекул/клетку), в отличие от IL-6независимых клеток (более 20000 молекул/клетку). 3. На линиях клеток множественной миеломы экспериментально продемонстрирован селективный механизм обратной регуляции интерлейкином-6 экспрессии рецептора интерлейкина-6. Этот механизм подтвержден на опухолевых плазматических клетках костного мозга больных множественной миеломой. 4. Установлено наличие двух субпопуляций плазмоцитов: CD138-позитивной и CD138негативной на клеточных линиях множественной миеломы и у больных множественной миеломой. Эти субпопуляции сосуществуют у одного и того же больного. Экспрессия CD126 на клетках CD138+ и CD138- различается: клетки CD138- экспрессируют рецептор IL-6 в меньшей степени (как в отношении частоты экспрессии, р=0,001, так и по уровню экспрессии, р=0,003). 5. Отсутствие CD138 и снижение экспрессии CD126 на опухолевых клетках напрямую взаимосвязаны с аберрантным иммунофенотипом и, в частности, с экспрессией CD19. В условиях подавления активности интерлейкина-6 (депривации) CD138-негативная популяция ингибируется. Выраженность плазмоцитоза костного мозга и пропорции проплазмоцитов в миелограмме, в отличие от экспрессии аберрантных маркеров (CD45, CD19, CD56), напрямую коррелируют с уровнем CD126 на мембране опухолевых плазматических клеток. 6. Ген вирусного интерлейкина-6 HHV-8 обнаружен в клетках костного мозга 57% больных множественной миеломой. Установлен факт усиления экспрессии рецептора интерлейкина-6 в HHV-8-позитивных наблюдениях. 25 Список работ, опубликованных по теме диссертации в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ 1. Костюкова, М.Н. Функциональные особенности внеклеточных доменов трансдуцерного рецептора gp130 / М.Н. Костюкова, Н.Н. Тупицын // Биохимия. 2011. - Т. 76., № 4. - С. 487-501. 2. Костюкова, М.Н. Плазмобластный вариант множественной миеломы с лимфоидной морфологией злокачественных клеток и экспрессией CD20. Описание наблюдения / М.Н. Костюкова, О.Ю. Якимович, Л.Ю. Гривцова, Н.А. Купрышина, М.А. Френкель, О.М. Вотякова, А.М. Степанова, О.А. Чегринец, Э.Р. Мусаев, А.М. Ковригина, Е.А. Османов, Н.Н. Тупицын // Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика. - 2011. - Т. 4., № 1. - С. 44-49. 3. Калитин Н.Н. Экспрессия рецептора факторов роста эндотелия сосудов VEGFR1 в культурах клеток множественной миеломы: корреляция с иммунофенотипом и лекарственной устойчивостью / Н.Н. Калитин, М.Н. Костюкова, Е.С. Какпакова, Н.Н. Тупицын, А.Ф. Карамышева // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2012. - Т. 153., № 6. - С. 865-868. Другие работы, опубликованные по теме диссертации: 1. Костюкова, М.Н. Gp130 как мишень для модуляции гемопоэтических процессов / М.Н. Костюкова, Н.Н. Тупицын // Онкология и радиология Казахстана. – Алматы, 1113 ноября 2010. - № 3-4. - С. 147. 2. Костюкова, М.Н. Трансдуцер действия цитокинов гликопротеин gp130 / М.Н. Костюкова, Н.Н. Тупицын // Сборник научных трудов научно-практической конференции «Клиническая иммунология, иммуногенетика – междисциплинарные проблемы». - Ташкент, 11-12 октября 2010. – С. 56-57. 3. Kalitin, N. Vascular endothelial growth factor receptor 1 (VEGFR1) gene expression depends on immunophenotype of human multiple myeloma cells / N. Kalitin, M. Kostjukova, E. Kakpakova, N. Tupitsyn, A. Karamysheva // Eur. J. Cancer. – 2011. - 47(1). – Р. S644. 4. Карамышева, А.Ф. Изменения VEGF-зависимых сигнальных систем в процессе злокачественной трансформации / А.Ф. Карамышева, Н.Н. Калитин, М.Н. Костюкова, Н.Н. Тупицын // Сборник тезисов VIII Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток». - Звенигород, 6-9 декабря 2011. - С. 50. 26
