007810 Область изобретения

007810
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к области терапевтической иммунотерапии и, в частности, к области активной иммунотерапии, направленной на отрицательную регуляцию аутологических («собственных») белков и других слабо иммуногенных антигенов. Изобретение, таким образом, относится к новым и улучшенным иммуногенным вариантам мультимерных белков, а также к необходимым инструментам для получения таких вариантов. Изобретение, кроме того, относится к способам иммунотерапии,
а также к композициям, которые могут использоваться с такими способами.
Предпосылки изобретения
Применение активной иммунотерапии («вакцинации») в качестве средства лечения или ослабления
заболевания в течение последних 2 десятилетий вызвало растущий интерес.
Примечательно, что применение активной иммунотерапии в качестве средства нарушения толерантности к аутологичным белкам, которые каким-то образом относятся к патологическому (и другим
нежелательным) физиологическому состоянию, известно с конца семидесятых годов, когда сообщалось о
первых экспериментах по вакцинам против фертильности.
Вакцины против аутологических антигенов традиционно получают путем «иммуногенизации» относящихся к проблеме собственных белков, например, путем химического связывания («конъюгации») с
большим чужеродным и иммуногенным белком-носителем (ср. патент США 4161519) или получением
конструкций слияния аутологичного белка и чужеродного белка-носителя (ср. WO 86/07 383). В таких
конструкциях несущая часть иммуногенной молекулы ответственна за предоставление эпитопов для Тхелперных лимфоцитов («Тн-эпитопов»), что делает возможным нарушение аутотолерантности.
Позднейшие исследования показали, что хотя такие стратегии действительно могут обеспечить нарушение толерантности против аутологичных белков, возникает некоторое количество проблем. Наиболее важным является тот факт, что при иммунном ответе, который индуцируется с течением времени,
будут доминировать антитела, направленные против несущей части иммуногена, поскольку реакционная
способность против аутологичного белка часто снижен, эффект, который особенно выражен, когда носитель ранее служил в качестве иммуногена: данный феномен известен как подавление носителем (ср., например, Kaliyaperumal et al. 1995., Eur. J. Immunol. 25, 3375-3380). Однако при использовании терапевтической вакцинации обычно необходимо повторно иммунизировать несколько раз в год и поддерживать
данное лечение в течение нескольких лет, и это также приводит к ситуации, где иммунный ответ против
несущей части будет все больше и больше доминировать над вкладом иммунного ответа против аутологичной молекулы.
Дальнейшие проблемы, имеющие место при использовании технологии гаптен-носитель для нарушения аутотолерантности, представляют собой отрицательные стерические эффекты, оказываемые носителем на часть, относящуюся к аутологичному белку, в таких конструкциях: доля доступных Вклеточных эпитопов, которая напоминает конформационные профили, наблюдаемые в нативном аутологичном белке, часто снижена вследствие простого экранирования или маскировки эпитопов или вследствие конформационных изменений, индуцированных в собственной части иммуногена. Наконец, очень
часто бывает трудно охарактеризовать молекулу гаптен-носитель достаточно подробно.
В WO 95/05849 предоставлено усовершенствование указанных выше стратегий гаптен-носитель.
Продемонстрировано, что собственные белки, куда встроен, по меньшей мере, один чужеродный Тнэпитоп, способны нарушить толерантность в отношении аутологичного белка. Внимание было сфокусировано на сохранении третичной структуры аутологичного белка, чтобы убедиться, что максимальное
количество аутологичных В-клеточных эпитопов будет сохранено в иммуногене, несмотря на введение
чужеродного Тн-элемента. Данная стратегия в общем показала себя как исключительно успешная в том,
что индуцированные антитела составляли широкий спектр, а также характеризовались высоким сродством, и в том, что иммунный ответ имел раннее начало и более высокий титр по сравнению с тем, что наблюдался при иммунизации традиционной несущей конструкцией.
В WO 00/20027 предоставлено развитие указанного выше принципа.
Обнаружено, что введение единичных Тн-эпитопов в кодирующую последовательность собственных белков может индуцировать цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), которые специфично взаимодействуют с клетками, экспрессирующими собственный белок. Технология по WO 00/20027 также предоставляет комбинированное лечение, где индуцируются антитела и CTL: в данных осуществлениях еще
требуется, чтобы иммуногены сохраняли существенную часть В-клеточных эпитопов.
В WO 95/05849 и WO 98/46642 описана вакцинная технология, которая подходит для отрицательной регуляции активности TNFα: (фактор некроза опухоли α), цитокина, вовлеченного в патологию некоторых заболеваний, таких как диабет I типа, ревматоидный артрит и воспалительные заболевания кишечника. В обоих описаниях раскрыто сохранение третичной структуры мономерного TNFα при встрече
данной молекулы с иммунной системой.
WO 00/65058 относится к отрицательной регуляции интерлейкина 5 (IL5), молекулы, участвующей
в активации действия эозинофильных гранулоцитов, значимой в патогенезе некоторого количества заболеваний дыхательных путей, таких как хроническая астма. Описано, что отрицательная регуляция может
-1-
007810
осуществляться посредством технологии вакцинации полипептидами, живых вакцин и технологии вакцинации нуклеиновыми кислотами, и, кроме того, описано, что сохранение В-клеточных эпитопов значимо при индукции иммунного ответа против IL5.
Даже несмотря на то, что описанные выше технологии предоставляли весьма многообещающие результаты, имеются некоторые факторы, которые могут вступить в действие при достижении жизнеспособности вакцинного подхода для преодолении заболевания. Одним из данных факторов является уровень экспрессии иммуногенного белка.
Например, для того, чтобы вакцина с нуклеиновой кислотой была функциональной, клетки, трансфицированные in vivo конструкцией, кодирующей «иммуногенизированный» аутологичный белок,
должны быть способны к экспрессии иммуногена в достаточных количествах для индукции подходящего
иммунного ответа. Также основанные на полипептидах вакцины требуют, чтобы иммуногенный белок
мог продуцироваться в удовлетворительных количествах по способу промышленной ферментации. Однако часто наблюдается, что даже небольшие изменения аминокислотной последовательности известного белка могут оказывать драматическое действие на количество белка, которое может быть получено.
Далее, стабильность генетически модифицированных белковых последовательностей может также
быть меньшей, чем оптимальная (как в плане срока хранения, так и в плане стабильности in vivo).
Наконец, когда собственный белок, который требуется подвергнуть отрицательной регуляции,
представляет собой гетерополимер или гомополимер, не обязательно происходит так, что вариант мономерной единицы данного белка способен индуцировать антитела, которые достаточно специфичны в
отношении нативной конформации полимерного белка.
Цель изобретения
Целью изобретения является предоставление улучшенных иммуногенных аналогов полимерных аутологичных белков, а также предоставление улучшенных способов индукции гуморального иммунитета
против таких полимерных аутологичных белков. Дальнейшей целью является предоставление иммуногенных аналогов собственных белков, которые обладают улучшенной стабильностью и проявляют улучшенные характеристики при экспрессии в гетерологичных клетках хозяина. Наконец, целью изобретения
также является предоставление способов и мер, которые могут использоваться при получении или использовании улучшенных иммуногенов.
Сущность изобретения
При продукции крупномасштабных количеств рекомбинантного белка в бактериальных клетках хозяина часто требуется, чтобы продукт экспрессии стал доступным в виде телец включения внутри бактерий. Причин этого несколько: например, выходы экспрессии обычно заметно выше, если белок экспрессирован в виде нерастворимых телец включения, и очистка белка также облегчена, поскольку требуемый
продукт экспрессии легко и удобно отделяется от растворимого белка из бактериальной ферментации.
При экспрессии рекомбинантного белка в качестве нерастворимых телец включения, часто бывает
необходимым подвергать продукт экспрессии различным способам рефолдинга белка для получения его
в биологически активной форме, но это обычно приемлемо даже несмотря на то, что такая стадия приводит к некоторой потере общего рекомбинантного белка, который никогда не свертывается в правильную
биологически активную форму.
Однако при продукции рекомбинантных иммуногенных вариантов неиммуногенных собственных
белков необходимо вводить Тн-эпитопы и таким образом первичная структура белкового продукта становится измененной по сравнению с нативным собственным белком. Авторами настоящего изобретения
выяснено, что даже слабейшие из изменений делают традиционный подход экспрессии в тельцах включения с последующим рефолдингом непрактичным: после рефолдинга выходы белка, который сохранил
удовлетворительную долю В-клеточных эпитопов по сравнению с нативным собственным белком, часто
очень малы, и данная проблема возрастает со сложностью рассматриваемого белка.
В настоящее время обнаружено, что конструирование и воздействие на экспрессию белковых конструкций, которые продуцируются в бактериях в виде растворимого белка, является лучшим способом
получения иммуногенных вариантов собственных белков: даже несмотря на то, что последующие стадии
очистки становятся более сложными, поскольку нужно удалить другие растворимые белки, конечный
очищенный и верно свернутый продукт получают со значительно более высоким выходом по сравнению
с традиционным подходом, указанным выше. И, что очень важно, очищенные белки, полученные экспрессией такого типа, проявляют невиданную до сих пор способность сохранять В-клеточные эпитопы
нативного собственного белка, из которого они происходят.
Коротко, по настоящему изобретению экспрессия растворимых вариантов белков является превосходным критерием отбора при начальном отборе иммуногенных вариантов собственного белка, которые
подходят для целей вакцинации.
Для достижения цели экспрессии растворимого белка таких иммуногенизированных собственных
белков (и других белков, в первичную структуру которых были введены изменения) могут варьироваться
несколько параметров: мультимерные белки, которые трудно объединить, могут продуцироваться путем
стабилизации их структуры на мономерном уровне и также путем получения мономерных имитаций
-2-
007810
мультимера, и также простые мономерные белки могут стабилизироваться по указанным здесь инструкциям.
Другим важным фактором являются условия ферментации: открытия в лаборатории авторов настоящего изобретения, например, показали, что ферментация бактерий при температурах более низких,
чем обычно используемые для получения высокоуровневой экспрессии, заметно способствуют продукции растворимых форм белковых вариантов.
Авторами настоящего изобретения обнаружено, что получение «мономеризованных» форм IL5 и
TNFα может предоставлять иммуногенные молекулы, обладающие высокой стабильностью, отличной
иммуногенностью и требуемыми характеристиками продукции. В частности, выход белка является неожиданно высоким при экспрессии рекомбинантных полипептидов, составленных двумя мономерами
hIL5, объединенными пептидным линкером, и включающих чужеродные Т-хелперные эпитопы. Полагают, что данное открытие может применяться в общем по отношению к мультимерным белкам, четвертичная структура которых позволяет сшить их мономерные версии.
Полагают, что настоящая технология особенно подходит для получения иммуногенов для нарушения аутотолерантности в отношении аутологичных белков, поскольку введение пептидного линкера может элегантно комбинироваться с предоставлением чужеродных Т-хелперных эпитопов при сохранении
в то же время 3D-структуры мультимерного белка (например, сохранение обоих элементов из третичной
и четвертичной структуры такого белка путем наложения исходной четвертичной структуры на новую
третичную структуру в мономерном белке).
Следовательно, в одном широком аспекте изобретение относится к иммуногенному аналогу полимерного белка, где указанный полимерный белок состоит (в природе) по крайней мере из 2 мономерных
единиц, которые не объединены посредством пептидной связи, где указанный аналог
a) содержит существенные фрагменты по меньшей мере 2 мономерных единиц указанного полимерного белка, где указанные существенные фрагменты объединены посредством пептидных связей через пептидный линкер,
b) содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, связывающую МНС
класс II, которая гетерологична в отношении полимерного белка, и
c) может продуцироваться в виде единственного продукта экспрессии из клетки, несущей экспрессирующий вектор, кодирующий данный аналог.
Авторами настоящего изобретения также обнаружено, что некоторое количество конкретных манипуляций в аминокислотной последовательности мономерного TNFα приводит к предоставлению мономерных молекул, которые иммуногенны и способны достигать функциональной четвертичной структуры, и это означает, что данные молекулы обладают такой высокой степенью сохранения третичной
структуры, что они могут спонтанно образовывать функциональные, связывающие рецептор димеры и
триммеры, и также что данные мономеры продуцируются в бактериях как растворимые белки.
Некоторые из данных манипуляций, которые проведены с белком TNFα, как полагают, могут в общем использоваться для белков, из которых требуется стабилизированная третичная структура по сравнению с нативным белком.
Конкретный аспект изобретения относится к некоторому числу вариаций в структуре мономера
TNFα, которые по существу не деструктивны, так что они позволяют происходить правильному фолдингу мономеров TNFα, при введении в то же время по крайней мере одной аминокислотной последовательности, связывающей МНС класса II. Например, было обнаружено, что вставка чужеродного Тнэпитопа может быть сделана в одной конкретной петлевой структуре в нативном TNFα без отрицательного влияния на характеристики экспрессии белка или на способность мономера образовывать функциональный димер или тример TNFα.
Следовательно, значимая часть изобретения относится к иммуногенному аналогу человеческого
TNFα, где аналог включает в себя по меньшей мере одну чужеродную аминокислотную последовательность, связывающую МНС класса II, и, кроме того, обладает такими характеристиками, что является мономером человеческого TNFα или мономеризованным аналогом TNFα по настоящему изобретению, куда в гибкую петлю 3 встроена или замещена по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность, и/или мономером человеческого TNFα или мономеризованным аналогом TNFα по настоящему изобретению, куда введен по меньшей мере один дисульфидный
мостик, который стабилизирует 3D-структуру мономера TNFα, и/или мономером человеческого TNFα
или мономеризованным аналогом TNFα по настоящему изобретению, где подвержена делеции любая из
аминокислот 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9 на N-конце, и/или мономером человеческого TNFα или мономеризованным аналогом TNFα по настоящему изобретению, где по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность встроена или замещена в петлю 1 в положении
интрона, и/или мономером человеческого TNFα или мономеризованным аналогом TNFα по настоящему
изобретению, где по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность введена как часть области искусственного стебля на N-конце человеческого TNFα,
-3-
007810
и/или мономером человеческого TNFα или мономеризованным аналогом TNFα по настоящему изобретению, где по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность введена так, что она стабилизирует мономерную структуру путем увеличения гидрофобности
поверхности взаимодействия тримера, и/или мономером человеческого TNFα или мономеризованным
аналогом TNFα по настоящему изобретению, где по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС
класса II аминокислотная последовательность, фланкированная остатками глицина, встроена или замещена в аминокислотную последовательность TNFα, и/или мономером человеческого TNFα или мономеризованным аналогом TNFα по настоящему изобретению, где по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность встроена или замещена в D-E-петлю, и/или
мономером человеческого TNFα или мономеризованным аналогом TNFα по настоящему изобретению,
где по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность
встроена или замещена между двумя идентичными подпоследовательностями человеческого TNFα,
и/или мономером человеческого TNFα или мономеризованным аналогом TNFα по настоящему изобретению, где по меньшей мере один солевой мостик в человеческом TNFα усилен или замещен дисульфидным мостиком, и/или мономером человеческого TNFα или мономеризованным аналогом TNFα по
настоящему изобретению, где растворимость и/или стабильность в плане протеолиза усилена путем введения мутаций, которые имитируют кристаллическую структуру мышиного TNFα, и/или мономером
человеческого TNFα или мономеризованным аналогом TNFα по настоящему изобретению, где потенциальная токсичность снижена или отменена путем введения по меньшей мере одной точечной мутации.
В общем, было обнаружено, что все наиболее подходящие иммуногенные аналоги по изобретению
представляют собой те, что являются растворимыми белками уже на стадии, на которой их продуцируют
и выделяют в растворимой форме из их рекомбинантных клеток хозяина.
По изобретению далее предоставляются фрагменты нуклеиновой кислоты (такие как фрагменты
ДНК), кодирующие такие иммуногенные аналоги и также векторы, содержащие такие фрагменты ДНК.
Изобретение также относится к трансформированным клеткам, подходящим для получения данных
аналогов.
Изобретение, кроме того, предоставляет иммуногенные композиции, охватывающие аналоги или
векторы по изобретению.
Также изобретение относится к способам лечения, где мультимерные белки подлежат отрицательной регуляции, и к лечению конкретных заболеваний, относящихся к конкретным мультимерным белкам.
Описание чертежа
На чертеже представлен экспрессирующий вектор клеток насекомых p2ZOP2f.
Последовательность вектора установлена в SEQ ID NO: 60. Вектор содержит участок множественного клонирования (MCS) ниже промотора OрIЕ2 и выше поли А-хвоста OpIE2 (OpIE2pA).
Маркерный ген устойчивости к зеацину (ZeoR) находится под контролем второго промотора OpIE2.
Подробное описание изобретения
Определения
Далее некоторое количество терминов, используемых в настоящей спецификации и формуле изобретения определяются и подробно объясняются для выяснения пределов изобретения.
Термины «Т-лимфоцит» и «Т-клетка» используются взаимозаменяемо для лимфоцитов тимусного
происхождения, которые ответственны за различные клеточно-опосредованные иммунные ответы, а
также за хелперную активность при гуморальном иммунном ответе. Сходным образом, термины «Влимфоцит» и «В-клетка» используют взаимозаменяемо для продуцирующих антитело лимфоцитов.
«Полимерный белок» определяется здесь как белок, который содержит по меньшей мере две полипептидные цепи, которые не объединены конец в конец пептидной связью (термин «мультимерный белок» используется с ним взаимозаменяемо). Следовательно, полимерные белки могут являться полимерами, состоящими из нескольких полипептидов, которые собраны вместе в полимерную форму посредством дисульфидных связей и/или нековалентного связывания. Также данный термин охватывает процессированные предбелки и пробелки, которые после процессинга охватывают по меньшей мере два
свободных С-конца и по меньшей мере 2 свободных N-конца. Наконец, данный термин охватывает временно существующие комплексы по меньшей мере между двумя полипептидами, которые могут образовать нестабильный, но при этом биологически активный молекулярный объект, который характеризуется
отличающейся 3-мерной структурной.
«Иммуногенный аналог» (или «иммуногенизированный» аналог или вариант) подразумевается
здесь для обозначения единичного полипептида, который охватывает существенные части информации
последовательности, находящейся в полном полимерном белке. То есть, данный белковый аналог охватывает одну полипептидную цепь, в то время полимерный белок охватывает по меньшей мере 2 полипептидные цепи. Следует заметить, что аналог может представлять вариацию мономерной субъединичной структуры полимеров, но в таком случае иммуногенный аналог способен образовывать полимерные
белковые комплексы, которые напоминают нативный полимер.
-4-
007810
«Мономеризованный» аналог или вариант полимерного белка в настоящем контексте представляет
собой единичный полипептид, который содержит в ковалентно связанной форме через пептидную связь
по меньшей мере 2 полипептидные цепи, находящиеся в полимерном белке в природе, где данные 2 полипептидные цепи не связаны пептидной связью.
«Существенный фрагмент» или мономерная единица мультимерного белка, как подразумевается,
означает часть мономерного полипептида, которая составляет по меньшей мере часть мономерного полипептида, достаточную для образования домена, который свертывается, по существу, в ту же 3Dконформацию, что может иметь место в мультимерном белке.
«Полипептид IL5», как подразумевается здесь, означает полипептиды, характеризующиеся аминокислотной последовательностью белков IL5, происходящих от людей и других млекопитающих. Также в
пределы данного термина входят негликозилированные формы IL5, которые получены в прокариотической системе, как и формы, характеризующиеся варьирующими профилями гликозилирования, например, вследствие применения дрожжей и других не относящихся к млекопитающим эукариотических систем экспрессии. Следует, однако, заметить, что при использовании термина «полипептид IL5» подразумевается, что указанный полипептид обычно не является иммуногенным, когда он представляется подлежащему обработке животному. Иными словами, полипептид IL5 представляет собой собственный белок или ксеноаналог такого собственного белка, который обычно не дает начало иммунному ответу против IL5 у указанного животного.
«Полипептид TNFα», как подразумевается здесь, означает полипептиды, характеризующиеся аминокислотной последовательностью белков TNFα, происходящих от людей и других млекопитающих.
Также в пределы данного термина входят негликозилированные формы TNFα, которые получены в прокариотической системе, как и формы, характеризующиеся варьирующими профилями гликозилирования,
например, вследствие применения дрожжей и других не относящихся к млекопитающим эукариотических систем экспрессии. Следует, однако, заметить, что при использовании термина «полипептид TNFα»
подразумевается, что указанный полипептид обычно не является иммуногенным, когда он представляется подлежащему обработке животному. Иными словами, полипептид TNFα представляет собой собственный белок или ксеноаналог такого собственного белка, который обычно не дает начало иммунному
ответу против TNFα у указанного животного.
«Аналог IL5» представляет собой полипептид IL5, который был подвергнут изменениям в его первичной структуре и/или ассоциирован с элементами из других видов молекул. Такое изменение может,
например, быть в виде слияния полипептида IL5 с подходящим партнером слияния (например, изменение в первичной структуре, задействующее исключительно С- и/или N-концевые добавления аминокислотных остатков), и/или оно может быть в виде вставок, и/или делеций, и/или замен в аминокислотной
последовательности полипептида IL5. Также данный термин охватывает дериватизированные молекулы
IL5, ср. с обсуждением модификаций IL5, приведенным ниже.
«Аналог TNFα» представляет собой полипептид TNFα, который был подвергнут изменениям в его
первичной структуре и/или ассоциирован с элементами из других видов молекул. Такое изменение может, например, быть в виде слияния полипептида TNFα с подходящим партнером слияния (например,
изменение в первичной структуре, задействующее исключительно С- и/или N-концевые добавления аминокислотных остатков), и/или оно может быть в виде вставок, и/или делеций, и/или замен в аминокислотной последовательности полипептида TNFα. Также данный термин охватывает дериватизированные
молекулы TNFα, ср. с обсуждением модификаций TNFα, приведенным ниже.
Следует понимать, что аналоги IL5 и TNFα также охватывают мономерные варианты, которые содержат существенные части полных мультимерных белков IL5 и TNFα.
При использовании здесь аббревиатур «IL5» и «TNFα» они предназначены для ссылок на аминокислотные последовательности зрелых IL5 и TNFα, IL5 и TNFα дикого типа (также обозначены здесь
как «IL5m» и «IL5wt», а также «TNFam» и «TNFawt»), соответственно. Зрелый IL5 человека обозначен
как hIL5, hIL5m или hIL5wt, а мышиный зрелый IL5 обозначен mIL5, mIL5m или mIL5wt, и сходный порядок используется для TNFα. В случаях, где ДНК-конструкция содержит информацию, кодирующую
лидерную последовательность или другой материал, это обычно ясно из контекста.
Термин «полипептид» в настоящем контексте, как подразумевается, означает короткие пептиды от
2 до 10 аминокислотных остатков, олигопептиды от 11 до 100 аминокислотных остатков, или полипептиды длиной более 100 аминокислотных остатков. Более того, данный термин также, как подразумевается, охватывает белки, т.е. функциональные биомолекулы, включающие в себя по меньшей мере один
полипептид; когда они включают в себя по меньшей мере два полипептида, они могут образовывать
комплексы, быть ковалентно связанными, или могут не быть ковалентно связанными.
Полипептид(-ы) в белке могут быть гликозилированными и/или липоилированными, и/или могут
содержать простетические группы.
Термин «подпоследовательность» означает любой последовательный участок по меньшей мере из 3
аминокислот, или, когда это существенно, по меньшей мере из 3 нуклеотидов, происходящих непосред-5-
007810
ственно из встречающихся в природе аминокислотных последовательностей или последовательностей
нуклеиновой кислоты IL5, соответственно.
Термин «животное» в настоящем контексте, как подразумевается, означает вид животного (преимущественно, млекопитающего), такой как Homo sapiens, Canis domesticus, и т.д., и не просто одно конкретное животное. Однако данный термин также означает популяцию животных такого вида, поскольку
важно, чтобы субъекты, иммунизированные по способу изобретения все несли примерно один и тот же
IL5, что позволяет иммунизировать данных животных одним(-и) и тем(-и) же иммуногеном (-ами). Если,
например, генетические варианты IL5 или TNFα существуют в разных популяциях людей, может оказаться необходимым применять различные иммуногены в данных различных популяциях, чтобы смочь
преодолеть аутотолерантность в отношении IL5 и TNFα, соответственно, в каждой популяции. Специалисту ясно, что животное в настоящем контексте представляет собой живое существо, которое имеет
иммунную систему. Предпочтительно, что животное является позвоночным, таким как млекопитающее.
Под термином «отрицательная регуляция» здесь понимают снижение биологической активности
мультимерного белка (например, путем препятствия взаимодействию между мультимерным белком и
биологически значимыми партнерами связывания с данной молекулой). Отрицательная регуляция может
достигаться посредством различных механизмов; среди них наиболее простым является простое препятствие для активного участка мультимерного белка за счет связывания антитела. Однако в объем данного
изобретения также входит то, что связывание антитела приводит к удалению мультимерного белка клетками захвата (такими как макрофаги или другие фагоцитарные клетки).
Выражение «эффективное представление ... иммунной системе», как подразумевается, означает, что
иммунная система животного подвергается иммуногенной стимуляции контролируемым образом.
Как будет указано ниже в описании, такая стимуляция иммунной системы может осуществляться
несколькими путями, наиболее значимым из которых являются вакцинация полипептидом, содержащим
«фармакцины» (т.е., вакцину, которую вводят для лечения или подавления текущего заболевания) или
вакцинация «фармакциной» на основе нуклеиновой кислоты. Важным результатом, которого нужно достигнуть, является контроль иммунокомпетентных клеток антигеном иммунологически эффективным
образом, в то время как конкретный способ достижения данного результата менее важен для идеи изобретения, лежащей в основе настоящего изобретения.
Термин «иммунологически эффективное количество» характеризуется значением, обычно принятым в данной области, т.е. это количество иммуногена, способное индуцировать иммунный ответ, который значительно затронет патологические агенты, обладающие иммунологическими характеристиками
данного иммуногена.
При использовании выражения, что IL5, TNFα или другой собственный белок был «модифицирован», здесь подразумевается химическая модификация полипептида, который составляет остов собственного белка. Такая модификация может, например, представлять собой дериватизацию (например, алкилирование, ацилирование, эстерификацию и т.д.) конкретных аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности, но как понятно из следующего ниже описания, предпочтительные модификации охватывают изменения первичной структуры аминокислотной последовательности (или добавления
к ней).
При обсуждении «аутотолерантности в отношении аутологичного белка» понимают, что поскольку
относящийся к проблеме мультимерный белок представляет собой собственный белок в подлежащей
вакцинации популяции, нормальные субъекты в популяции не развивают иммунного ответа против него;
нельзя, однако, исключать, что некоторые редкие субъекты в популяции животных могут продуцировать
антитела против нативного мультимера, например, как часть аутоиммунного нарушения. Во всяком случае, вид животного в норме является аутотолерантным только в отношении своего собственного мультимера, но нельзя исключать того, что аналоги, происходящие из других видов животных или из популяции, имеющей отличный фенотип, также будут вызывать толерантность у указанного животного.
«Чужеродный Т-клеточный эпитоп» (или: «чужеродный Т-лимфоцитарный эпитоп») представляет
собой пептид, который способен связываться с молекулой МНС и который стимулирует Т-клетки у видов животных, поэтому вводят альтернативный термин. Предпочтительные Т-клеточные эпитопы по
изобретению являются «общими» эпитопами (или «универсальными» или «широкого интервала действия»), т.е. эпитопами, которые связываются с существенной долей конкретного класса молекул МНС у
вида или популяции животных. Известно лишь очень ограниченное число таких «общих» Т-клеточных
эпитопов, и они подробно обсуждаются ниже. Следует заметить, что чтобы иммуногены, которые используют по настоящему изобретению, были эффективными как можно в большей доле популяции животных, может быть необходимым 1) встроить несколько чужеродных Т-клеточных эпитопов в тот же
самый аналог или 2) получить несколько аналогов, где каждый аналог имеет встроенный особый общий
эпитоп. Также следует отметить, что концепция чужеродных Т-клеточных эпитопов также охватывает
применение скрытых Т-клеточных эпитопов, т.е. эпитопов, которые происходят из собственного белка и
которые проявляют иммуногенные свойства только когда существуют в выделенной форме, не являясь
частью указанного собственного белка.
-6-
007810
«Чужеродный Т-хелперный лимфоцитарный эпитоп» (чужеродный Тн-эпитоп) представляет собой
Т-клеточный эпитоп, который связывается с молекулой МНС класса II, и может представляться на поверхности антигенпредставляющей клетки (АРС), связанной с молекулой МНС класса II.
"Связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность, которая гетрологична мультимерному белку», таким образом, представляет собой связывающий МНС класса II пептид, который не
существует в указанном мультимерном белке. Такой пептид, если он также действительно чужероден в
отношении вида животного, несущего мультимерный белок, представляет собой чужеродный Тн-эпитоп.
«Функциональная часть» (био)молекулы в настоящем контексте, как подразумевается, означает
часть молекулы, ответственную по меньшей мере за один из биохимических или физиологических эффектов, проявляемых данной молекулой. В данной области хорошо известно, что многие ферменты и
другие эффекторные молекулы содержат активный участок, ответственный за эффекты, проявляемые
указанной молекулой. Другие части данной молекулы могут служить для цели увеличения стабильности
или растворимости и поэтому могут оставаться вне внимания, если данные цели не относятся к контексту конкретного осуществления настоящего изобретения. Однако по настоящему изобретению предпочтительно задействовать как можно большую часть полимерной молекулы, поскольку при использовании
описанных здесь мономеров фактически демонстрировалась повышенная стабильность.
Термин «адъювант» характеризуется своим обычным значением в области вакцинной технологии,
т.е. это вещество или композиция материалов, которая 1) сама по себе не способна вызвать специфический иммунный ответ против иммуногена вакцины, но который 2) тем не менее способен усиливать иммунный ответ против иммуногена. Или, иными словами, вакцинация одним адъювантом не обеспечивает
иммунный ответ против иммуногена, вакцинация иммуногеном может дать или не дать начало иммунному ответу против иммуногена, но комбинация вакцинации иммуногеном и адъювантом индуцирует
иммунный ответ против иммуногена, который является более сильным, чем ответ, индуцированный одним иммуногеном.
«Нацеливание молекулы» в настоящем контексте, как подразумевается, обозначает ситуацию, в которой
молекула после введения животному преимущественно обнаруживается в конкретной(-ых) ткани(-ях) или
предпочтительно ассоциирована с конкретными клетками или клеточными типами. Данный эффект может
осуществляться некоторым количеством путей, включая составление молекулы в композицию, облегчающую
нацеливание или введение в молекулу групп, которые способствуют нацеливанию. Данные варианты будут
обсуждаться подробно ниже.
«Стимуляция иммунной системы» означает, что вещество или композиция материалов проявляет
общий, неспецифический иммуностимулирующий эффект. Некоторое количество адъювантов и предполагаемых адъювантов (таких как некоторые цитокины) наделены способностью стимулировать иммунную систему. Результатом применения иммуностимулирующих средств является повышенная «боевая
готовность» иммунной системы, и это означает, что одновременная или последовательная иммунизация
иммуногеном индуцирует существенно более эффективный иммунный ответ по сравнению с отдельным
использованием данного иммуногена.
Характеристика иммуногенных аналогов по изобретению
Полимерные белки, являющиеся мишенями описанных здесь стратегий, могут представлять собой
как гомополимеры, так и гетерополимеры. Как будет ясно из примеров, наиболее важной чертой первого
аспекта изобретения является то, что интересующий полимерный белок может «мономеризироваться»
без введения существенных изменений в трехмерную структуру мультимерного белка. Следовательно,
конкретная функция мультимерного белка не важна для сущности настоящего изобретения - только
структурные характеристики белка влияют на решение, является ли он подходящим кандидатом для
применения настоящего подхода по первому аспекту изобретения. Например, если N-конец одного из
мономеров в мультимерном белке характеризуется пространственной близостью к С-концу другого мономера в мультимере, связывание данных двух конкретных мономеров через пептидную связь может
осуществляться без введения существенных изменений относительно структуры нативного мультимерного белка. Если, с другой стороны, концы далеко разнесены, для воплощения настоящего изобретения
требуется, чтобы большая часть по меньшей мере одного из мономеров не имела отношения в плане иммуногенных целей изобретения или чтобы связывание между мономерными субъединицами могло выполняться длинным линкерным пептидом без оказания отрицательного воздействия на иммуногенные
характеристики белка.
Во втором аспекте изобретения «иммуногенизацию» мономерной единицы собственного белка
проводят таким образом, что полученный в результате вариант мономера еще способен образовывать
часть полимерного белка, который обладает четвертичной структурой нативного полимерного собственного белка.
Предпочтительно, если иммуногенный аналог по изобретению экспонирует в существенных фрагментах существенную долю В-клеточных эпитопов, находящихся в соответствующих мономерах, которые являются частью полимерного белка. Существенная доля В-клеточных эпитопов, как подразумевается здесь, означает долю В-клеточных эпитопов, которые антигенно характеризуют мультимерный белок по сравнению с другими белками. Предпочтительно, чтобы существенные фрагменты экспонировали
-7-
007810
по существу все В-клеточные эпитопы, находящиеся в соответствующих мономерах, когда данные фрагменты являются частью полимерного белка; конечно, может быть необходимо введение малых изменений в последовательность мономера. Например, аминокислотная последовательность, происходящая из
мономерной единицы может модифицироваться посредством вставки, замены, делеции или добавления
так, чтобы снизить токсичность аналога по сравнению с мультимерным белком и/или ввести связывающую МНС класса II последовательность аминокислоты, если нежелательно, чтоб данная последовательность располагалась в линкере.
Особенно предпочтительное осуществление относится к иммуногенному аналогу по изобретению,
где каждая из существенных долей содержит по существу полную аминокислотную последовательность
каждой мономерной единицы, или в качестве непрерывной последовательности, или в виде последовательности, содержащей вставки. То есть, только несущественные части последовательности мономерных
единиц теряются из аналога, например, в случаях, когда последовательность не вносит вклад в третичную структуру мономерной единицы или в четвертичную структуру мультимерного белка. Однако данное осуществление позволяет провести замену или вставку в мономер, покуда сохраняется 3D-структура
мультимерного белка. Следовательно, особенно предпочтительно, если иммуногенный аналог является
таким, что в нем представлены аминокислотные последовательности всех мономерных единиц полимерных белков, и особенно предпочтительным является, если аналог охватывает полные аминокислотные
последовательности (всех) мономеров, составляющих полимерный белок, будь то неизмененные последовательности или последовательности, содержащие вставки.
Таким образом, как оказывается, предпочтительным является, чтобы 3-мерная структура полного
полимерного белка, по существу, сохранялась в аналоге.
Демонстрация сохранения существенной доли В-клеточных эпитопов или даже 3-мерной структуры
мультимерного белка, которая подвергается описанной здесь модификации, может достигаться различными путями. Одним из них является простое получение поликлональной антисыворотки, направленной
против мультимера (например, антисыворотки, полученной от кролика) и последующее применение
данной антисыворотки в качестве тестового реагента (например, в конкурентном ELISA) против продуцированных модифицированных белков. Модифицированные версии (аналоги), которые взаимодействуют с антисывороткой в той же степени, как это делает мультимер, следует считать имеющими ту же 3Dструктуру, что и мультимер, в то время как аналоги, проявляющие ограниченную (но, тем не менее, значимую и специфичную) реакционноспособность с такой сывороткой, как полагают, сохраняют существенную долю изначальных В-клеточных эпитопов.
Альтернативно, может осуществляться отбор моноклональных антител, способных реагировать с
различными эпитопами на мультимере, и они могут использоваться в качестве панели для тестирования.
Данный подход имеет преимущество в том, что он предоставляет 1) картирование эпитопов мультимера
и 2) картирование эпитопов, которые остаются на полученных аналогах.
Конечно, третьим подходом является разрешение 3-мерной структуры мультимера (ср. выше) и ее
сравнение с разрешенной трехмерной структурой полученных аналогов. Трехмерная структура может
быть разрешена с помощью исследований дифракции рентгеновского излучения и ЯМР-спектроскопии.
Дальнейшая информация, касающаяся третичной структуры, может до некоторой степени быть получена
из исследований кругового дихроизма, которые имеют то преимущество, что полипептид требуется лишь
в чистом виде (в то время как дифракция рентгеновского излучения требует предоставления кристаллизованного полипептида, а ЯМР требует предоставления изотопных вариантов полипептида) для получения полезной информации о третичной структуре данной молекулы. Однако для получения решающих
данных окончательно необходимы дифракция рентгеновского излучения и ЯМР, поскольку круговой
дихроизм может предоставить только непрямые доказательства правильной 3-мерной структуры посредством информации об элементах вторичной структуры.
Иммуногенный аналог по изобретению может содержать пептидный линкер, который вводит или
участвует в образовании в аналоге по меньшей мере одной связывающей МНС класса II аминокислотной
последовательности, которая гетерологична в отношении мультимерного белка. Это, в частности, может
использоваться в тех случаях, когда не требуется изменение аминокислотной последовательности, соответствующей мономерным единицам мультимерного белка. Альтернативно, пептидный линкер может
быть лишенным связывающей МНС класса II аминокислотной последовательности и не участвовать в ее
образовании в животных вида, из которого происходит мультимерный белок; это обычно может делаться
в случаях, когда необходимо использовать очень короткий линкер или где предпочтительным является,
например, сделать потенциально токсичный аналог нетоксичным путем введения связывающего МНС
класса II элемента в активный участок. Оба данные осуществления могут комбинироваться с введением
точечных мутаций, которые детоксицируют молекулу, если это необходимо.
Предпочтительно, чтобы связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность связывала большую часть молекул МНС класса II из видов животных, откуда происходит мультимерный белок, т.е. связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность была универсальной или общей.
-8-
007810
Также, конечно, важно, чтобы данная последовательность служила своей цели как Т-клеточный
эпитоп в видах, для которых иммуноген предназначен в качестве составляющего компонента вакцин.
Существует некоторое количество встречающихся в природе «общих» Т-клеточных эпитопов, которые
активны в большой доле субъектов вида животных или популяции животных, и их предпочтительно вводят в состав вакцины, снижая таким образом необходимость в очень большом количестве различных
аналогов той же вакцины. Следовательно по меньшей мере одну связывающую МНС класса II аминокислотную последовательность предпочтительно выбирают из природных Т-клеточных эпитопов и искусственных связывающих МНС класса II аминокислотных последовательностей. Особенно предпочтительными последовательностями являются природные Т-клеточные эпитопы, выбранные из эпитопов
столбнячного анатоксина, таких как Р2 (SEQ ID NO: 3) или Р30 (SEQ ID NO : 5), эпитопа дифтерийного
анатоксина, эпитопа гемагглютинина вируса гриппа и эпитопа CS P. falciparum.
В течение лет идентифицировано некоторое количество других общих Т-клеточных эпитопов. Особенно пептиды, способные связывать большую часть молекул HLA-DR, кодируемых различными аллелями HLA-DR, идентифицировали, и они представляют собой все возможные Т-клеточные эпитопы,
подлежащие введению в аналоги, используемые по настоящему изобретению. Ср. также эпитопы, обсуждаемые в следующих ссылках, которые все включены сюда в качестве ссылки: WO 98/23635 (Frazer I.H.
et al., переуступлено The University of Queensland); Southwood S et. al, 1998, J. Immunol. 160: 3363-3373
Sinigaglia F. et al., 1988, Nature 336: 778-780; Chicz R.M. et al., 1993, J. Exp. Med 178: 27-47 ; Hammer J. et
al., 1993, Cell 74: 197-203; and Falk K. et al., 1994, Immunogenetics 39: 230-242. Последняя ссылка также
относится к лигандам HLA-DQ и -DP. Все эпитопы, перечисленные в данных 5 ссылках, рассматриваются природные эпитопы-кандидаты, подлежащие применению по настоящему изобретению, как и эпитопы, которые характеризуются общими мотивами с указанными эпитопами.
Альтернативно, эпитоп может представлять собой любой искусственный Т-клеточный эпитоп, который способен связывать большую часть молекул МНС класса II. В данном контексте пептиды-пан-DRэпитопы («PADRE») , описанные в WO 95/07707 и в соответствующей статье Alexander J et al., 1994, Immunity 1: 751-761 (оба описания включены сюда в качестве ссылки), представляют собой интересные
кандидаты в эпитопы, подлежащие применению по настоящему изобретению. Следует заметить, что
наиболее эффективные пептиды PADRE, описанные в данных работах, несут D-аминокислоты на С- и Nконцах для улучшения стабильности при введении. Однако настоящее изобретение первично относится к
введению относящихся к проблеме эпитопов в качестве части аналога, который затем должен быть расщеплен ферментативно внутри лизосомального компартмента АРС для обеспечения последующей презентации в контексте молекулы МНС-II, и поэтому нецелесообразно включать D-аминокислоты в состав
эпитопов, используемых по настоящему изобретению.
Одним из особо предпочтительных пептидов PADRE является тот, что характеризуется аминокислотной последовательностью AKFVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 7) или ее иммунологически активной
подпоследовательностью. Этот и другие эпитопы, обладающие сходным отсутствием рестрикции МНС,
являются предпочтительными Т-клеточными эпитопами, которые должны быть представлены в аналогах, применяемых в способе по изобретению. Такие сверхобщие эпитопы обеспечивают наиболее простые осуществления изобретения, где лишь один модифицированный IL5 представляется иммунной системе вакцинированного животного.
Предпочтительные осуществления изобретения охватывают модификацию путем введения по
меньшей мере одного чужеродного иммунодоминантного Тн-эпитопа.
Понятно, что проблема иммунодоминантности Тн-эпитопа зависит от интересующего вида животного. Используемый здесь термин «иммунодоминантность» просто относится к эпитопам, которые вызывают значимый иммунный ответ у вакцинированного субъекта, но хорошо известным фактом является
то, что Тн-эпитоп, иммунодоминантный у одного субъекта, не обязательно является иммунодоминантным у другого субъекта того же вида, даже хотя он может связывать молекулы МНС-II у последнего
субъекта.
Как указано выше, введение чужеродного Т-клеточного эпитопа может осуществляться путем введения вставки, добавления, делеции или замены по меньшей мере одной аминокислоты. Конечно, обычной ситуацией является введение более одного изменения аминокислотной последовательности (например, вставка целого Т-клеточного эпитопа или замена на него), но важная цель для достижения состоит в
том, чтобы аналог после процессинга антигенпредставляющей клеткой (АРС), вызывал представление
такого Т-клеточного эпитопа в связи с молекулой МНС класса II на поверхности АРС. Так, если аминокислотная последовательность мономерной единицы в подходящей позиции содержит некоторое количество аминокислотных остатков, которые также могут находиться в чужеродном Тн-эпитопе, то введение
чужеродного Тн-эпитопа может осуществляться путем предоставления оставшихся аминокислот чужеродного эпитопа посредством вставки, добавления, делеции или замены аминокислот. Иными словами,
не является необходимым введение полного Тн-эпитопа путем вставки или замены.
По настоящему изобретению аналог также может образовывать часть более крупной молекулы, с
которой он связан по меньшей мере одним функциональным радикалом, наличие которого не имеет отрицательного воздействия в значительной степени на доступность аналога для антитела. По природе та-9-
007810
кие радикалы (которые могут быть слиты с аналогом) могут предназначаться для нацеливания модифицированной молекулы на антигенпредставляющую клетку (АРС) или В-лимфоцит, для стимуляции иммунной системы и для оптимизации представления иммунной системе данного аналога.
Радикалы нацеливания обычно выбирают из группы, состоящей, по существу, из специфичного связывающего партнера для специфичного поверхностного антигена В-лимфоцита или для специфичного
поверхностного антигена АРС, такого как гаптен или углевод, для которых имеется рецептор на Влимфоците или АРС. Иммуностимулирующие радикалы могут быть выбраны из группы, состоящей из
цитокина, гормона и белка теплового шока.
Радикал, оптимизирующий представление, может быть выбран из группы, состоящей из группы
липида, такого как пальмитоильная группа, миристильная группа, фарнезильная группа, геранилгеранильная группа, GPI-якоря и N-ацилдиглицеридной группы.
Подходящий цитокин представляет собой интерферон у (IFN-γ), Flt3L, интерлейкин 1 (IL-1), интерлейкин 2 (IL-2), интерлейкин 4 (IL-4), интерлейкин 6 (IL-6), интерлейкин 12 (IL-12), интерлейкин 13 (IL13), интерлейкин 15 (IL-15) и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GMCSF) или эффективную часть любого из них.
Предпочтительный белок теплового шока представляет собой HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 и
кальретикулин (CRT), или эффективную часть любого из них.
Предпочтительно, чтобы количество вставок, делеций, замен или добавлений аминокислот составляло по меньшей мере, 2, например 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 и 25 вставок, замен, добавлений или делеций.
Более того, предпочтительно, чтобы количество аминокислот вставок, замен, добавлений или делеций не превышало 150, например, максимум 100, максимум 90, максимум 80 и максимум 70. Особенно
предпочтительно, чтобы количество аминокислот замен, вставок, делеций или добавлений не превышало
60, и, в частности, чтобы данное количество не превышало 50 или даже 40. Наиболее предпочтительное
количество составляет не более 30. Относительно аминокислот добавлений следует заметить, что при
том, что полученная в результате конструкция находится в виде полипептида слияния, их количество
часто заметно превышает 150.
Предпочтительные осуществления изобретения охватывают модификации путем введения по крайней мере одного чужеродного иммунодоминантного Тн-эпитопа (= «чужеродной связывающей МНС
класса II аминокислотной последовательности»). Следует понимать, что вопрос иммунодоминантности
Тн-эпитопа зависит от интересующего вида животного. Используемый здесь термин «иммунодоминантность» просто относится к эпитопам, которые у вакцинированного субъекта вызывают значимый иммунный ответ, но хорошо известным фактом является то, что Тн-эпитоп, иммунодоминантный у одного
субъекта, не обязательно является иммунодоминантным у другого субъекта того же вида, даже хотя он
может связывать молекулы MHC-II у последнего субъекта.
Другим значимым моментом является явление рестрикции Тн-эпитопов по МНС. В общем встречающиеся в природе Тн-эпитопы рестрицированы по МНС, т.е. конкретный пептид, составляющий Тнэпитоп эффективно связывается лишь с подмножеством молекул МНС класса II. Это, в свою очередь,
обладает тем эффектом, что в большинстве случаев применение одного конкретного Тн-эпитопа приводит к получению вакцинного компонента, эффективного только у части популяции, и в зависимости от
размера данной части может быть необходимым вводить больше Тн-эпитопов в одну и ту же молекулу,
или, альтернативно получать многокомпонентную вакцину, где компоненты представляют собой варианты, которые отличаются друг от друга по природе вводимых Тн-эпитопов.
Если рестрикция используемых Т-клеток по МНС вообще неизвестна (например, в ситуации, в которой вакцинируемое животное характеризуется малоизученным набором МНС), часть популяции животных, покрываемая конкретной вакцинной композицией, может определяться посредством следующей
формулы:
где pi представляет собой частоту в популяции особей, отвечающих на i-тый чужеродный Т-клеточный
эпитоп, представленный в вакцинной композиции, и n представляет собой общее число чужеродных Тклеточных эпитопов в вакцинной композиции. Так, вакцинная композиция, содержащая 3 чужеродных
Т-клеточных эпитопа, характеризующихся частотами ответа в популяции, составляющими 0,8, 0,7, и 0,6,
соответственно, будет давать 1-0,2x0,3x0,4=0,976 т.е., 97,6% популяции по статистике будут развивать
опосредованный MHC-II ответ на данную вакцину.
Указанная выше формула не применима в ситуациях, где для используемых пептидов известен более или менее точный профиль рестрикции по МНС. Если, например, конкретный пептид связывает
только с человеческими молекулами MHC-II, кодируемыми аллелями HLA-DR DR1, DR3, DR5 и DR7, то
применение данного пептида вместе с другим пептидом, который связывает остальные молекулы MHCII, кодируемые аллелями HLA-DR, будет обеспечиваться 100%-ное перекрывание интересующей популяции. Сходным образом, если второй пептид связывается только с DR3 и DR5, добавление данного пеп- 10 -
007810
тида не увеличит покрытия вовсе. Если основывать расчет ответа популяции исключительно на рестрикции МНС Т-клеточных эпитопов в вакцине, часть популяции, покрываемая конкретной вакцинной композицией, может определяться посредством следующей формулы:
где φj представляет собой сумму частот в популяции аллельных гаплотипов, кодирующих молекулы
МНС, которые связывают любой из Т-клеточных эпитопов в вакцине и которые относятся к j-тому из 3
известных локусов HLA (DP, DR и DQ) ; практически, вначале определяют, какие молекулы МНС распознают каждый Т-клеточный эпитоп в вакцине, а после этого данные молекулы МНС перечисляют по типу (DP, DR и DQ); затем индивидуальные частоты различных перечисленных аллельных гаплотипов
суммируют для каждого типа с получением φ1, φ2 и φ3.
Может произойти так, что значение pi в формуле II превышает соответствующее теоретическое значение пi:
где сумма частот в популяции аллельных гаплотипов, кодирующих молекулы МНС, которые связываются с i-тым Т-клеточным эпитопом вакцины и которые принадлежат к j-тому из 3 известных локусов HLA
(DP, DR и DQ). Это означает, что 1-пi из популяции представляет собой частоту отвечающих субъектов
fresidual_i = (pi - пi)/(1-пi). Поэтому формула III может быть адаптирована так, что получится формула V:
где число l-fresidual_i установлено на ноле, если оно отрицательное. Следует заметить, что формула V требует, чтобы все эпитопы были картированы по гаплотипу против идентичных наборов гаплотипов.
Поэтому при выборе Т-клеточных эпитопов для введения в аналог по изобретению важно получить
всю доступную информацию о данных эпитопах: 1) частота субъектов в популяции, отвечающих на каждый эпитоп, 2) данные рестрикции по МНС, и 3) частота имеющих отношение к проблеме гаплотипов.
Следует заметить, что предпочтительные аналоги по изобретению содержат модификации, результатом которых является полипептид, включающий в себя участки, обладающие идентичностью по последовательности, равной по меньшей мере 70% по отношению к мономерным единицам мультимерного
белка или его подпоследовательностям, составляющим в длину по меньшей мере 10 аминокислот. Предпочтительны более высокие значения идентичности, например по меньшей мере 75% или даже по меньшей мере 80% или 85%. Идентичность по последовательности для белков и нуклеиновых кислот может
быть рассчитана как (Nref - Ndif) • 100/Nref, где Ndif представляет собой общее число неидентичных остатков в двух последовательностях при выравнивании и где Nref представляет собой число остатков в одной
из последовательностей. Следовательно, последовательность ДНК AGTCAGTC будет обладать идентичностью по последовательности, равной 75%, в отношении последовательности ААТСААТС (Ndif=2 и
Nref=8).
Наконец, для окончательного доказательства того, что аналог по изобретению все-таки является
эффективным в качестве иммуногена, могут проводиться различные тесты для предоставления необходимого подтверждения, см. также подробности, указанные в приведенных здесь примерах. В данном
контексте также делается ссылка на обсуждение или идентификацию подходящих для применения аналогов IL5 в WO 00/65058: данное описание может использоваться для верификации применимости аналога (происходящего из IL5 или иного) относительно технологии по настоящему изобретению.
Предпочтительными мультимерами, которые могут использоваться по технологии настоящего изобретения, являются IL5 и TNFα.
Основанные на IL5 конструкции
Для hIL5 было обнаружено, что конструкции, имитирующие структуру природного димера hIL5 и в
то же время содержащие чужеродные Тн-элементы, предоставляют превосходные результаты по сравнению с конструкциями, основанными на мономерной структуре, например, по сравнению с конструкциями, описанными WO 00/65058, особенно когда доходит до уровней экспрессии и реакционной способности антисывороток, полученных против данных конструкций.
Предпочтительные конструкции, основанные на IL5, представляют собой те, где аналог выбран из
группы, состоящей из
- двух полноразмерных мономеров IL5, соединенных пептидным линкером, который содержит по
меньшей мере одну связывающую МНС класса II аминокислотную последовательность, и
- двух полноразмерных мономеров IL5, соединенных инертным пептидным линкером, из которых
по меньшей мере один мономер IL5 содержит гетерологичную связывающую МНС класса II аминокислотную последовательность.
- 11 -
007810
Такой аналог может обладать линейной структурой IL-Lm-IL или ILm-Li-ILn, или IL-Li-ILm или IL-LiILm или ILm-Lm-ILn, где «IL» представляет собой полную аминокислотную последовательность мономерного зрелого IL5, «ILm» и «ILn», которые могут быть идентичными или неидентичными, обозначают по
существу полную аминокислотную последовательность мономерного зрелого IL5, включающую в себя
гетерологичную связывающую МНС класса II аминокислотную последовательность, Lm представляет
собой пептидный линкер, содержащий по меньшей мере одну связывающую МНС класса II аминокислотную последовательность в аналоге или вносящий в нее вклад, и «Li» представляет собой инертный
пептидный линкер, который не содержит по меньшей мере одну связывающую МНС класса II аминокислотную последовательность в аналоге и не вносит в нее вклад. Особенно предпочтительно, чтобы Lm, ILm
и ILn содержали эпитопы Р2 и/или Р30 столбнячного анатоксина или содержали PADRE, и Li представлял
собой диглициновый линкер. Однако Li может представлять собой любой неиммуногенный линкерный
пептид, который не образует связывающих МНС класса II последовательностей.
Наиболее предпочтительными осуществлениями являются аналоги hIL5, содержащие зрелую аминокислотную последовательность, указанную в любом из SEQ ID NO: 9, 11, 13 и 15.
Предпосылки, связанные с TNFα
Фактор некроза опухолей (TNF, TNFα, кахектин, TNFSF2) представляет собой мощный паракринный и эндокринный медиатор воспалительных и иммунных функций. TNFα цитотоксичен для многих
клеток, особенно в комбинации с гамма-интерфероном. TNFα впервые был идентифицирован в 1975 г. и,
как было продемонстрировано, инициировал некроз и регрессию опухолей. Противораковый эффект
позднее исследовали подробно, но обработка им в качестве лечения злокачественных опухолей не имела
успеха, хотя до сих пор проводятся испытания по лечению злокачественных опухолей с использованием
TNFα. TNFα позже был открыт как причина кахексии, и было обнаружено, что TNF проявляет свою
функцию через опосредованный рецептором процесс. Идентифицировали два различных рецептора
TNFα (TNFR55 и TNFR75), которые опосредуют цитотоксический и воспалительный эффекты TNFα.
TNFα индуцирует и закрепляет воспалительные процессы во время хронических воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит (RA) и, как предполагается, играет критическую роль при аллергиях и псориазе. Блокирование сигнала TNFα растворимыми рецепторами, рецепторспецифичными
ингибиторами, отрицательной регуляцией продукции TNFα или моноклональными антителами против
TNFα представляет собой привлекательные формы лечения с целью противодействия биологическим
эффектам положительной регуляции и передачи сигнала TNFα.
Из результатов, полученных при лечении растворимыми рецепторами TNFα и моноклональными
антителами против TNFα, очевидно, что лечение, направленное против TNFα, имеет успех при некоторых заболеваниях, таких как RA и болезнь Крона. Антилечение, направленное против TNFα, считается
безопасным и эффективным.
К настоящему времени для клинического применения одобрены два антагониста TNFα, ремикад
(Infliximab, Centocor/Johnson & Johnson) и энбрел (Etanercept, Immunex).
Ремикад представляет собой химерное мышиное-человеческое моноклональное антитело IgG1, направленное против растворимого и ассоциированного с клетками TNFα. Ремикад блокирует связывание
TNF с его эндогенным рецептором TNFα клеточной поверхности. Управление по санитарному надзору
за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) одобрило ремикад в октябре 1998 г. для применения при умеренной до тяжелой или характеризующейся свищами болезни Крона, устойчивой к общепринятым способам лечения. Данное показание было расширено до того, что стало включать в себя дополнительное применение с метотрексатом при ревматоидном артрите, устойчивом к лечению одним
метотрексатом, и с июля 2002 г. поддерживающую терапию при болезни Крона.
Энбрел представляет собой рекомбинантный белок, состоящий из внеклеточной части человеческого рецептора TNFα, слитого с Fc-частью человеческого IgG1. Энбрел ингибирует активность TNFα, служа в качестве капкана для рецептора TNFα. FDA одобрило энбрел для применения при ревматоидном
артрите в ноябре 1998 г. Более 350000 пациентов обрабатывали данными антагонистами TNFα. Обзор
клинической эффективности и информацию по безопасности данных средств получают непрерывно, и
инфекции и другие связанные с иммунитетом неблагоприятные явления остаются основным вопросом
для антагонистов TNFα, последняя оценка безопасности опыта, полученного после маркетинга, осуществленная FDA и Комитетом по патентованным медицинским продуктам (СРМР), подтверждает, что способы лечения, направленные против TNFα, имеют предпочтительный и благоприятный с точки зрения
риска баланс, несмотря на то, что требуются маркировочные изменения, включая изменения при серьезных инфекциях.
По сравнению с установленными способами лечения, направленными против TNFα, предложенная
здесь иммунотерапия против TNFα имеет преимущества, заключающиеся в вакцинациях микрограммовыми количествами и менее частых инъекциях для поддержания высокого титра против TNFα in vivo по
сравнению с обширными инфузиями моноклональных антител. Позитивными следствиями являются
меньший риск развития побочных эффектов и менее дорогостоящая терапия. Также полагают, что при- 12 -
007810
родный ответ поликлональных антител будет действовать в качестве более эффективного отрицательного регулятора TNFα, чем другие способы лечения, направленные против TNFα.
TNFα транслируется в виде белка-предшественника длиной 233 аминокислот и секретируется в виде тримерного трансмембранного белка типа II, который расщепляется специфичными металлопротеазами до тримерного растворимого белка, где каждая идентичная мономерная субъединица состоит из 157
аминокислот (ее аминокислотная последовательность указана в SEQ ID NO: 17). TNFα человека не гликозилирован, в то время как TNFα мыши содержит один участок N-гликозилирования. Мономер TNFα
характеризуется молекулярной массой 17 кДа, в то время как тример имеет теоретическую MW, равную
52 кДа, хотя перекрестно связанный тример обладает подвижностью, соответствующей 43 кДа, в SDSPAGE. TNFα содержит два цистеина, которые стабилизируют структуру, образуя внутримолекулярный
дисульфидный мостик. Как N-, так и С-конец TNFα значимы для его активности.
С-конец особо чувствителен, поскольку делеция трех, двух и даже одной аминокислоты решающим
образом снижает растворимость и биологическую активность. Значимой аминокислотой является Leul57,
который образует стабилизирующий солевой мостик между двумя мономерами тримера. С другой стороны, делеция первых восьми аминокислот повышает активность в 1,5-5 раза, тогда как делеция первых
девяти аминокислот сохраняет активность полноразмерного белка. TNFα является хорошо изученным
белком, и идентифицированы многие внутри- и межмолекулярные взаимодействия, которые ведут к образованию тримера и связыванию рецептора.
Следовательно, в природе TNFα человека (SEQ ID NO: 17) существует как димер и тример, но данная молекула в обоих случаях хорошо подходит в качестве мишени-кандидата по настоящему изобретению.
Основанные на TNFα конструкции
Предпочтительный аналог TNFα выбран из группы, состоящей из
1) двух или трех полноразмерных мономеров TNFα, объединенных конец в конец пептидным линкером, где по меньшей мере один пептидный линкер содержит по меньшей мере одну связывающую
МНС класса II аминокислотную последовательность, и 2) двух или трех полноразмерных мономеров
TNFα, соединенных конец в конец инертным пептидным линкером, где по меньшей мере один из мономеров содержит по меньшей мере одну чужеродную связывающую МНС класса II аминокислотную последовательность или по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС класса II аминокислотная
последовательность слита с N- или С-концевым мономером, необязательно посредством инертного линкера.
Особый интерес вызывают иммуногенные молекулы TNFα с высокой стабильностью, поскольку
ранее авторами изобретения было обнаружено, что мономерные конструкции на основе TNFα имеют
тенденцию к относительной нестабильности, ср., например, с дискуссией, приведенной ниже.
Таким образом, данный тип конструкции имеет очень много аналогичного с описанными выше
конструкциями на основе IL5.
Продуцировали ген, кодирующий 3 субъединицы TNFα, связанные вместе эпитопами и/или инертными пептидными линкерами способом, параллельным тому, который обсуждался в связи с IL5. Цель
состояла в генерирования вариантов молекул TNFα с конформацией, максимально близкой к таковой для
природного триммера TNFα. Варианты конструировали для эффективного образования нейтрализующих
антител против TNFα дикого типа.
Наиболее подходящие варианты TNFα представляют собой растворимые и стабильные белки в отсутствие детергентов и других видов добавок, которые могут разрушить конформацию белка.
Путем экспрессии трех мономеров, связанных вместе в виде единственной полипептидной цепи с
использованием линкеров и Тн-эпитопов, планируется получить варианты TNFα, более стабильные, нежели существующие ранее иммуногенные варианты TNFα. Это позволит сохранить структуру TNFα за
счет введения необходимых Тн-эпитопов вне стабилизирующих водородных связей, солевых мостиков
или дисульфидных мостиков.
Из рентгеновской кристаллической структуры TNFα видно, что первые 5 остатков N-конца слишком гибки, чтобы позволить определение структуры. С-конец, однако, локализован вблизи середины поверхности взаимодействия мономера и менее гибок. Расстояние между С-альфа-атомами Arg-6 и Leu-157
составляет 10 Å, что соответствует расстоянию 3-4 аминокислотных остатков. Поэтому представляется
возможным связать мономерные субъединицы вместе, но поскольку С-концы локализованы в чувствительном участке, возможно, будет предпочтительным использовать для данной связи гибкие линкеры,
например, глициновые линкеры.
К настоящему времени были сконструированы пять вариантов с использованием подхода «мономеризованного триммера».
Контрольный TNFT0 (тример TNFα номер 0, SEQ ID NO: 22) состоит из трех мономеров, непосредственно связанных вместе 2 отдельными глициновыми линкерами (Gly Gly Gly). TNFT0 сконструирован
так, что он так же стабилен, как тримерный белок дикого типа. Конечно, вместо указанных выше глици- 13 -
007810
новых линкеров могут использоваться другие инертные гибкие линкеры, известные в области белковой
химии, при этом важной характеристикой является то, что гибкий линкер не окажет неблагоприятного
воздействия на способность мономеризованного белка сворачиваться в 3D-структуру, сходную с 3Dструктурой физиологически активного wtTNFα.
Конструкция TNFT0 экспрессируется в виде растворимого белка в Е. coli, и был использован для
получения типовой конструкции TNF-T4 (SEQ ID NO: 57), являющейся вариантом, куда введен связывающий МНС класса II пептид PADRE (SEQ ID NO: 7). В данной конструкции отношение между мономерными единицами и чужеродными эпитопами составляет 1 эпитоп на 3 мономера, вместо 1 эпитопа на
мономер, как в случае ранее предложенных вариантов, которые имели отношение к иммуногенизированным мономерным белкам; тот же случай для SEQ ID NO: 55). Данный факт потенциально оказывает положительное влияние на стабильность тримера. Результатом данного подхода является вариант TNFC2
(SEQ ID NO: 28, ср. ниже), который представляет собой мономер TNFα с эпитопом PADRE в той же позиции, что в TNF Т4.
Параллельно, эпитопы столбнячного анатоксина Р2 и Р30 (SEQ ID NO: 3 и 5, соответственно) использовали в вариантах TNFT1 и TNFT2 (SEQ ID NO: 49 и 51, соответственно), содержащих один эпитоп
в каждой линкерной области, и также в TNFT3 (SEQ ID NO: 59), который содержит один С-концевой
эпитоп и один во второй линкерной области. Белки большей частью сворачиваются от N-конца к Сконцу. Идея, лежащая в основе TNF T3 состоит в том, что первые два N-концевых домена, сворачиваясь
будут функционировать в качестве внутренних шаперонов для третьего домена (мономера) , в состав
которого будут входит эпитопы.
Обнаружено, что, в дополнение к описанной подробно выше технологии, где полимерные белки
«мономеризованы», TNFα (и возможно, многие другие мультимерные белки) позволяет осуществлять
продукцию мономеров, которые 1) содержат по меньшей мере одну стабилизирующую мутацию и/или 2)
содержат по крайней мере одну не происходящую из TNFα связывающую МНС класса II аминокислотную последовательность, где данные мономерные варианты TNFα способны верно сворачиваться в третичную структуру, которая впоследствии позволит образоваться димерным или тримерным белкам
TNFα, обладающим верной четвертичной структурой (что подтверждается тем, что они имеют активность по связыванию рецептора). Следовательно, в данных конструкциях возможно получать варианты
мономерного TNFα, которые не обязательно необходимо продуцировать в виде мономеризованных тримеров, поскольку изменения, введенные в последовательности мономеров, вносят столь ограниченное
нарушение третичной структуры мономера, что может образовываться ди- или тример. В соответствии с
идеями, лежащими в основе настоящего изобретения далее было обнаружено, что все такие варианты
могут экспрессироваться в виде растворимых белков в бактериальных клетках.
Следовательно, возможно получить иммуногенные варианты TNFα по следующим стратегиям, которые могут комбинироваться и которые могут далее комбинироваться с уже обсуждавшимся «подходом
мономеризации» по изобретению (если данные конкретные модификации все являются по природе не
деструктивными).
Стратегия гибкой петли
Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что вставка эпитопа PADRE (SEQ ID NO: 7) в
петлю 3 в положении Gly108-Ala109 представляет собой многообещающий подход для получения вариантов TNFα со структурой, сильно напоминающей нативную молекулу TNFα.
Из кристаллической структуры TNFα сделан вывод, что Тн-эпитоп, встроенный непосредственно в
данной позиции, не имеет каких-либо соседних аминокислотных остатков в непосредственной близости
для взаимодействия с ним. Исследования с TNF34 (SEQ ID NO: 18), первой содержащей PADRE конструкцией, полученной по данному подходу, показали, что примерно 5% экспрессированного белка TNF34
в Е. coli было растворимым, а 95% TNF34 экспрессировалось в виде телец включения, когда бактериальные клетки хозяина выращивали при 37°С, но после адаптации процесса ферментации до температуры
ферментации, равной 25°С, выходы растворимого белка из ферментации были близки к 100%. Следовательно, оптимизация условий роста увеличила выход растворимого белка.
Было получено некоторое количество других конструкций (TNF35-TNF39, SEQ ID NO 23, 24, 25, 26
и 27), где все они зависели исключительно от введения SEQ ID NO: 7 в гибкую петлю 3.
Мутации, увеличивающие стабильность
Введение Тн-эпитопов в гибкую петлю 3 может потенциально дестабилизировать структуру варианта TNFα. Однако данной потенциальной дестабилизации можно противодействовать путем стабилизации
структуры путем введения цистеинов, которые образуют дисульфидный мостик. Цистиновая пара в двух
различных позициях пока не была введена в варианты TNF34-A и TNF34-B (SEQ ID NO: 29 и 30). Также
гибкий N-конец (первые 8 аминокислот), который, как известно, снижает силу взаимодействия с рецептором, одновременно подвергают делеции, в результате чего получают вариант TNF34-C (SEQ ID NO:
31). Дисульфидный мостик вводят в мономер для стабилизации участка вставки эпитопа вместе с имеющимся в природе дисульфидным мостиком (Cys-67 Cys-101). Данная стратегия также стабилизирует и
мономер TNFα как таковой, и мономеризованный ди- или тример.
- 14 -
007810
Другие конструкции
Некоторые другие стратегии использовали для конструирования вариантов растворимых продуктов
экспрессии. TNFX1.1-2 (SEQ ID NO: 32 и 33) основаны на вставках SEQ ID NO:7 в первую петлю TNFα,
где участок вставки локализовался в позиции интрона. В TNFX2.1 (SEQ ID NO: 34) создана искусственная область «стебля», содержащая вставку SEQ ID NO: 7.
Путем мутаций TNFα выявлено, что замены объемных гидрофобных аминокислот, находящихся на
поверхности взаимодействия тримера, стабилизируют структуру тримера. TNFX3.1 и TNFX3.2 (SEQ ID
NO: 35 и 36) являются попытками стабилизировать существующий вариант TNF34.
В TNFX4.1 (SEQ ID NO: 37) использованы диглициновые линкеры для снижения структурного препятствия, воздействующего от пептида PADRE на всю структуру TNF34. В TNFX5.1 (SEQ ID NO: 38)
задействована в качестве точки вставки петлевая структура, находящаяся в молекуле представителя семейства TNF BlyS. TNFX6.1-2, TNF7.1-2 и TNFX8.1 (SEQ ID NO: 39,40, 41, 42 и 43) являются дальнейшими вариантами. TNFX9.1 и TNFX9.2 (SEQ ID NO: 44 и 45) представляют собой варианты TNF34, в
которых задействованы идентичные перекрывающиеся последовательности TNFα из 4-6 аминокислот
перед и после эпитопа. Наконец, два варианта (SEQ ID NO: 46 и 47) содержат собой двойные варианты
Р2/Р30 в том же месте, что пептид PADRE в TNF34.
Кроме того, по кристаллической структуре TNFα сделано наблюдение, что внутри мономера TNFα
присутствует один стабилизирующий солевой мостик между остатками Lys-98 и Glu-116. Солевой мостик по определению представляет собой электростатическое взаимодействие между атомами кислорода
боковых цепей Asp или Glu и положительно заряженными атомами азота боковых цепей в Arg, Lys или
His с межатомным расстоянием менее 7,0 Å. Путем мутаций, заключающихся в сайт-специфической замене Lys-98 на Arg или His в данной позиции, в сочетании с заменами Glu 116 на Asp, может достигаться
усиление стабильности данного солевого мостика и, таким образом, стабильности молекулы тримера.
Также возможно заменить данные солевые мостики дисульфидными мостиками в описанной выше манере.
Было сделано наблюдение, что мышиный TNFα заметно стабильнее, чем человеческий TNFα в
плане растворимости и протеолиза. Улучшение вариантов TNFα охватывает получение сайтспецифических мутантов, так что имитируется кристаллическая структура мышиного TNFα для получения более стабильного в плане протеолиза продукта TNFα.
Из рентгеновских структур человеческого и мышиного TNFα видно, что центр тримера (в середине
трех мономеров TNFα) держится за счет гидрофобных сил, в то время как вершина и дно тримера связаны за счет встречающихся в природе солевых мостиков. Поэтому стабильность тримера TNFα может
быть усилена путем скрининга данных солевых мостиков на предмет более прочных связей.
Наконец, предварительные результаты, полученные с вариантами TNFα по настоящему изобретению, неожиданно продемонстрировали, что данные варианты являются физиологически активными, по
меньшей мере, в смысле их связывания с TNF-рецепторами. Однако, поскольку TNFα является токсичным белком, требуется получить безопасные варианты, которые не вызовут каких-либо побочных эффектов у субъектов, иммунизированных вакциной по изобретению. Поэтому также важным осуществлением изобретения является введение в конструкции детоксицирующих мутаций, если они после тестирования на подходящих моделях токсичности продемонстрируют потенциальную опасность для вакцинированных субъектов.
В данной области известно некоторое количество точечных мутаций, призванных детоксицировать
TNFα или, по меньшей мере, в большой степени снизить его токсичность. Данные точечные мутации,
если это необходимо, вводят в варианты по настоящему изобретению. Особенно предпочтительными
мутациями являются замены, соответствующие в зрелом TNFα заменам Tyr-87 на Ser, Asp-143 на Asn, и
А1а-145 на Arg. Далее, все эффективные мутации, указанные Loetscher, H., Stueber, D., Banner, D., Mackay, F. and Lesslauer, W. 1993 JBC 268 (35) 26350-7, также представляют собой интересные осуществления в рамках осуществлений детоксикации по настоящему изобретению.
В заключение, по настоящему изобретению получали следующие конкретные варианты TNFα:
- 15 -
007810
Используемые числа от N-концевого V в SEQ ID NO: 17 (то есть, от аминокислоты № 2 в SEQ ID
NO: 17). Перед N-концевым валином в некоторых последовательностях находится метионин, использованный для старта трансляции.
Наиболее предпочтительными белковыми конструкциями по изобретению являются те, что представлены любой из SEQ ID NO: 18, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42,
43, 44, 45, 46, 47, 49, 51, 53, 55, 57 и 59, а также любая аминокислотная последовательность, происходящая от них, которая содержит только консервативные аминокислотные замены или детоксицирующие
аминокислотные.
В любом случае значимым осуществлением является то, что все данные варианты TNFα, обсуждаемые выше, могут экспрессироваться в виде растворимых белков в бактериальных клетках, таких как
Е. coli.
Предпочтительным вектором является рЕТ28b+, где целью является экспрессия в Е. coli, p2Zop2F
(SEQ ID NO: 60) является вектором, используемым для экспрессии в клетках насекомых, и рНР1 (или его
коммерчески доступный «близнец» рСI) представляет собой вектор для экспрессии в клетках млекопитающих.
Основные способы лечения, предоставляемые по изобретению
Изобретение относится к способам, посредством которых становится возможной отрицательная регуляция конкретного полимерного белка очень предпочтительным образом.
В общем предоставляется способ отрицательной регуляции полимерного белка у аутологичного хозяина, причем данный способ охватывает осуществление представления иммунной системе животного
иммуногенно эффективного количества по меньшей мере одного иммуногенного аналога по изобретению. Предпочтительно, чтобы аутологичный хозяин представлял собой млекопитающее, наиболее предпочтительно, человеческое существо.
- 16 -
007810
Данный способ может быть воплощен на практике несколькими путями, среди которых одним из
способов выбора является введение белковой вакцины, но также большой интерес вызывает стратегия
вакцинации нуклеиновой кислотой или стратегия вакцинации живой вакциной.
Вакцинация белком/полипептидом и композиция белка/полипептида
При осуществлении представления аналогов иммунной системе животного посредством их введения животному композиция полипептида следует принципам, в общем признанным в данной области.
Получение вакцин, которые в качестве активных ингредиентов содержат пептидные последовательности, в общем, хорошо известно в данной области, примеры чего указаны в патентах США
4608251; 4601903; 4599231; 4599230; 4596792; и 4578770; все они включены сюда в качестве ссылки.
Обычно такие вакцины получают в виде препаратов для инъекций или в виде жидких растворов или суспензий; также могут быть получены твердые формы, подходящие для растворения или суспендирования
в жидкости перед инъекцией. Препарат также может быть эмульгирован. Активный иммуногенный ингредиент часто смешан с наполнителями, которые являются фармацевтически приемлемыми и совместимыми с активным ингредиентом. Подходящими наполнителями, например, являются вода, солевой
раствор, декстроза, глицерин, этанол или тому подобное, и их комбинации. Кроме того, если требуется,
вакцина может содержать малые количества вспомогательных веществ, таких как увлажняющие или
эмульгирующие средства, буферные средства для поддержания рН или адъюванты, которые усиливают
эффективность вакцин; ср. подробное обсуждение адъювантов, приведенное ниже.
Вакцины обычно вводят парентерально, например, путем инъекции, или подкожно, внутрикожно,
интрадермально, субдермально или внутримышечно. Дополнительные композиции, которые подходят
для других способов введения, включают в себя суппозитории и, в некоторых случаях, пероральные,
буккальные, подъязычные, интраперитонеальные, интравагинальные, анальные, эпидуральные, спинальные и внутричерепные препараты.
Традиционные для суппозиториев связующие вещества и носители могут включать в себя, например, полиалкаленгликоли или триглицериды; такие суппозитории могут быть образованы из смесей, содержащих активный ингредиент в интервале от 0,5 до 10%, предпочтительно 1-2%. Пероральные композиции включают в себя такие обычно используемые наполнители такие как, например, фармацевтические марки маннита, лактозы, крахмала, стеарата магния, сахарина натрия, целлюлозы, карбоната магния
и тому подобного. Данные композиции принимают форму растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, препаратов замедленного высвобождения или порошков, и содержат 10-95% активного ингредиента,
предпочтительно 25-70%. Для перорального применения интересным партнером в композиции (и также
возможным партнером для конъюгации) является холерный токсин.
Полипептиды могут быть составлены в вакцину в нейтральной форме или в форме солей. Фармацевтически приемлемые соли включают в себя кислотно-аддитивные соли (образованные со свободными
аминогруппами пептида) и те, которые образованы неорганическими кислотами, такими как, например,
соляная или фосфорная кислоты, или такими органическими кислотами, как уксусная, щавелевая, винная, миндальная, и тому подобные.
Соли, образованные со свободными карбоксильными группами, могут также происходить из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа,
или таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, 2-этиламиноэтанол, гистидин,
прокаин и тому подобное.
Вакцины вводят способом, совместимым с дозированным препаратом, и в таком количестве, которое будет терапевтически эффективным и иммуногенным. Количество, подлежащее введению, зависит
от подлежащего лечению субъекта, включая, например, способность иммунной системы субъекта развивать иммунный ответ, и требуемую степень защиты. Подходящие интервалы дозировки составляют порядка нескольких сотен микрограмм активного ингредиента на вакцинацию, с предпочтительным интервалом примерно от 0,1 до 2000 мкг (хотя рассматриваются даже большие количества в интервале 1-10
мг) , например, в интервале примерно от 0,5 до 1000 мкг, предпочтительно в интервале от 1 до 500 мкг, и
особенно в интервале примерно от 10 до 100 мкг.
Подходящие режимы начального введения и поддерживающих введений также варьируют, но типично характеризуются начальным введением с последующими инокуляциями или другими введениями.
Способ применения может сильно варьировать. Могут использоваться любые общепринятые способы введения вакцины. Они включают в себя пероральное введение твердой физиологически приемлемой основы или физиологически приемлемой дисперсии, парентерально, путем инъекции и тому подобное. Дозировка вакцины зависит от пути введения и варьирует в зависимости от возраста вакцинируемого субъекта и композиции антигена.
Некоторые аналоги вакцины достаточно иммуногены в вакцине, но для некоторых других иммунный ответ усиливают, если вакцина, кроме того, содержит вещество-адъювант.
Известны различные способы достижения эффекта адъюванта в вакцине. Основные принципы и
способы подробно описаны в "The Theory and Practical Application of Adjuvants", 1995, Duncan E. S. Stewart-Tull (ed. ), John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6, и также в "Vaccines: New Generation Immu- 17 -
007810
nological Adjuvants", 1995, Gregoriadis G. et al. (eds.), Plenum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9, причем данные источники включены сюда в качестве ссылки.
Особенно предпочтительным является применение адъюванта, который может демонстрировать
облегчение нарушения аутотолерантности в отношении аутоантигенов; фактически, это существенно в
случаях, где в качестве активного ингредиента аутовакцины применяется немодифицированный IL5.
Неограничивающие примеры подходящих адъювантов выбраны из группы, состоящей из направленного на иммунную систему адъюванта; направленного на иммунную систему адъюванта, такого как
токсин, цитокин и производное микобактерий; масляного препарата; полимера; мицеллообразующего
адъюванта; сапонина; иммуностимулирующего комплексного матрикс (матрикс ISCOM); частицы; DDA;
алюминиевых адъювантов; адъювантов, основанных на ДНК; γ-инулина; и инкапсулирующего адъюванта.
В общем следует отметить, что приведенные выше описания, которые относятся к соединениям и
средствам, используемым в качестве первого, второго и третьего радикала аналогов, также относятся с
внесением необходимых изменений к их применению в адъюванте вакцины по изобретению.
Применение адъювантов охватывает применение средств, таких как гидроксид или фосфат алюминия (квасцы), обычно используемые в виде 0,05-0,1-процентного раствора в солевом буфере, примеси
синтетических полимеров или Сахаров (например, Carbopol™) , используемые в виде 0,25-процентного
раствора; возможна агрегация белка в вакцине путем обработки нагреванием при температурах, изменяющихся от 70 до 101°С в течение периодов от 30 с до 2 мин, соответственно, и также агрегация посредством перекрестно связывающих агентов. Также может использоваться агрегация путем реактивации обработанными пепсином антителами (Fab-фрагментами) к альбумину, смешивание с бактериальными клетками, такими как С. Parvum, или эндотоксинами или липополисахаридными компонентами
грамотрицательных бактерий, эмульсия в физиологически приемлемых масляных носителях, таких как
маннидмоноолеат (Aracel А) или эмульсия с 20-процентным раствором перфторуглерода (Fluosol-DA),
используемого в качестве блокового замещенного. Также предпочтительным является примешивание
масел, таких как сквален и IFA.
По изобретению интересующим кандидатом на роль адъюванта является DDA (диметилдиоктадециламмония бромид), а также ДНК и γ-инулин, но также интересны полный и неполный адъюванты
Фрейнда, а также сапонины Quillaja, такие как QuilA и QS21, также как и RIBI. Дальнейшие возможные
варианты представляют собой монофосфориллипид A (MPL) , указанные выше С3 и C3d, и мурамилдипептид (MDP).
Также известно, что липосомные препараты обладают адъювантным эффектом, и поэтому липосомные адъюванты являются предпочтительными по изобретению.
Также предпочтительным выбором по изобретению являются адъюванты типа иммуностимулирующего комплексного матрикса (матрикс ISCOM), особенно потому что было показано, что адъюванты
данного типа способны положительно регулировать экспрессию МНС класса II в АРС.
Матрикс ISCOM® состоит из (необязательно разделенных) сапонинов (тритерпеноидов) из Quillaja
saponaria, холестерина и фосфолипида. При смешивании с иммуногенным белком полученный в результате препарат частиц представляет собой препарат, известный под названием частица ISCOM, где сапонин составляет 60-70% мас./мас., холестерин и фосфолипид составляют 10-15% мас./мас., и белок составляет 10-15% мас./мас.
Подробности, касающиеся композиции и применения иммуностимулирующих комплексов могут,
например, быть найдены в указанных выше учебниках, имеющих отношение к адъювантам, но также в
Morein В. et al., 1995, Clin. Immunother. 3: 461-475, a также в Barr I.G. and Mitchell G.F., 1996, Immunol.
and Cell Biol. 74: 8-25 (оба источника включены сюда в качестве ссылки) предоставлена полезная информация по получению полных иммуностимулирующих комплексов.
Другой очень интересной (и, таким образом, предпочтительной) возможностью достижения адъювантного эффекта является применение способа, описанного Gosselin et al., 1992 (что включено сюда в
качестве ссылки). В кратком изложении, презентация имеющего отношение к проблеме антигена, такого
как антиген по настоящему изобретению, может усиливаться за счет конъюгации антигена с антителами
(или антигенсвязывающими фрагментами антител) против Fcγ-рецепторов на моноцитах/макрофагах. В
частности, было продемонстрировано, что конъюгаты между антигеном и антителом против FcγRI усиливают иммуногенность для целей вакцинации.
Другие возможности используют применения направленных и иммуномодулирующих веществ (т.е.,
цитокинов), указанных в формуле изобретения как радикалы для белковых конструкций. В данной связи
также возможно применение синтетических индукторов цитокинов, таких как poly I:C.
Подходящие производные микобактерий выбраны из группы, состоящей из мурамилдипептида,
полного адъюванта Фрейнда, RIBI и сложного диэфира трегалозы, такого как TDM и TDE.
Подходящие направленные на иммунную систему адъюванты выбраны из группы, состоящей из
лиганда CD40 и антител против CD40 или их специфично связывающих фрагментов (ср. обсуждение,
приведенное выше), маннозы, Fab-фрагмента и CTLA-4.
- 18 -
007810
Подходящие полимерные адъюванты выбраны из группы, состоящей из такого углевода, как декстран, PEG, крахмал, маннан и манноза; пластикового полимера, такого как; и латекса, такого как латексные частицы.
Еще одним интересующим способом модулирования иммунного ответа является введение иммуногена (необязательно вместе с адъювантами и фармацевтически приемлемыми носителями и несущими
средствами) в «виртуальном лимфоузле» (VLN) (патентованном медицинском устройстве, разработанном ImmunoTherapy, Inc., 360 Lexington Avenue, New York, NY 10017-6501). VLN (тонкое трубковидное
устройство) имитирует структуру и функцию лимфоузла. Вставка VLN под кожу приводит к образованию участка стерильного воспаления с повышением количества цитокинов и хемокинов. Т- и В-клетки, а
также АРС быстро отвечают на сигналы опасности, мигрируют в участок воспаления и накапливаются в
пористом матриксе VLN. Показано, что необходимая доза антигена, требуемая для развития иммунного
ответа на антиген, при использовании VLN снижена, и что иммунная защита, вызванная вакцинацией с
использованием VLN, превосходила общепринятую иммунизацию с использованием в качестве адъюванта Ribi. Данная технология впервые кратко описана в Gelber С. et al., 1998, "Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts of Immunogens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node", in: "From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, October 12th-15th
1998, Seascape Resort, Aptos, California" .
Ожидается, что вакцина будет вводиться по меньшей мере один раз в год, например по меньшей
мере 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 12 раз в год. Более конкретно, ожидается введение нуждающемуся в этом субъекту
1-12 раз в год, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 раз в год. Ранее было показано, что иммунологическая память, индуцированная использованием предпочтительных аутовакцин по изобретению, не
перманентна, и поэтому иммунная система нуждается в периодической стимуляции аналогами.
Вследствие генетической изменчивости различные субъекты могут реагировать на один и тот же
полипептид иммунными ответами разной силы. Поэтому вакцины по изобретению могут содержать несколько различных полипептидов для усиления иммунного ответа, ср. выше также обсуждение, касающееся выбора введений чужеродных Т-клеточных эпитопов. Вакцины могут включать в себя два или
более полипептида, где все полипептиды являются теми, что определены.
Вакцина может в результате содержать 3-20 различных аналогов, например, 3-10 аналогов. Однако
обычно число аналогов составляет минимум, например, 1 или 2 аналога.
Вакцинация нуклеиновыми кислотами
В качестве очень важной альтернативы классическому введению основанной на пептидах вакцине
технология вакцинации нуклеиновой кислотой (также известная как «иммунизация нуклеиновой кислотой», «генетическая иммунизация» и «генная иммунизация») предоставляет некоторое количество привлекательных характеристик.
Во-первых, в отличие от традиционного вакцинного подхода, вакцинация нуклеиновой кислотой не
требует ресурса потребления крупномасштабной продукции иммуногенного агента (например, в виде
ферментации микроорганизмов, продуцирующих белки, в промышленных масштабах). Более того, не
требуется организовывать очистку и схемы рефолдинга иммуногена. И наконец, поскольку вакцинация
нуклеиновой кислотой относится к биохимическому аппарату вакцинируемого субъекта, для продукции
экспрессированного продукта введенной нуклеиновой кислоты, ожидается, что будет происходить оптимальный посттрансляционный процессинг продукта экспрессии; это особенно важно в случае аутовакцинации, поскольку, как указывалось выше, значимая часть исходных В-клеточных эпитопов полимера в
модифицированной молекуле должна сохраняться, и поскольку В-клеточные эпитопы в принципе могут
составляться из частей любой (био)молекулы (например, углевода, липида, белка и т.д.). Поэтому нативные профили гликозилирования и липоилирования иммуногена могут быть очень важны для иммуногенности в целом, и ожидается, что это гарантируется хозяином, продуцирующим иммуноген.
Следует заметить, что увеличенный уровень экспрессии, наблюдаемый с описанными здесь аналогами, очень значим для эффективности вакцинации ДНК, поскольку уровень экспрессии in vivo является
одним из определяющих факторов для иммуногенной эффективности ДНК-вакцины. Следовательно,
предпочтительное осуществление изобретения относится к эффективному представлению аналога по
изобретению иммунной системе путем введения нуклеиновой(-ых) кислоты(-т), кодирующих аналог, в
клетки животных и к достижению таким образом экспрессии in vivo клетками введенной (-ых) нуклеиновой (-ых) кислоты (-т).
В данном осуществлении введенная нуклеиновая кислота предпочтительно представляет собой
ДНК, которая может находиться в виде голой ДНК, ДНК, объединенной в композицию с заряженными
или незаряженными липидами, ДНК, введенной в липосомы, ДНК, встроенной в вирусный вектор, ДНК,
объединенной в композицию с облегчающим трансфекцию белком или полипептидом, ДНК, объединенной в композицию с направленным белком или полипептидом, ДНК, объединенной в композицию с преципитирующими кальций средствами, ДНК, связанной с молекулой инертного носителя, ДНК, инкапсулированной в полимер, например, в PLGA (ср. технологию микроинкапсулирования, описанную в WO
98/31398) или в хитин или хитозан, и ДНК, объединенной в композицию с адъювантом. В данном контексте отмечено, что практически все соображения, касающиеся применения адъювантов в традицион- 19 -
007810
ном вакцинном препарате, относятся и к препарату ДНК-вакцин. Следовательно, все приведенные здесь
описания, которые относятся к применению адъювантов в контексте основанных на полипептиде вакцин,
относятся с необходимыми изменениями к применению технологии вакцинации нуклеиновой кислотой.
Пути введения и схемы введения основанных на полипептиде вакцин, подробно описанные выше,
также могут применяться для вакцин на основе нуклеиновой кислоты по изобретению, и все приведенные выше обсуждения, касающиеся путей введения и схем введения для полипептидов, прилагаются с
соответствующими изменениями к нуклеиновым кислотам. К этому стоит добавить, что вакцины на основе нуклеиновой кислоты могут подходящим образом вводиться внутривенно и внутриартериально.
Более того, в данной области хорошо известно, что вакцины на основе нуклеиновых кислот могут вводиться путем применения так называемой генной пушки, и, следовательно, также этот и эквивалентные
ему пути введения рассматриваются как часть настоящего изобретения. Наконец, также применение
VLN при введении нуклеиновых кислот, как было описано, дает хорошие результаты, и поэтому данный
конкретный способ введения является особо предпочтительным.
Далее, нуклеиновая (-ые) кислота(-ы), используемые в качестве средства для иммунизации по настоящему изобретению могут содержать области, кодирующие радикалы, определенные в формуле изобретения, например, имеющие вид описанных выше иммуномодулирующих веществ, таких как цитокины, обсуждаемые в качестве подходящих адъювантов. Предпочтительный вариант данного осуществления охватывает наличие области, кодирующей аналог, и области, кодирующей иммуномодулятор, в различных рамках считывания или, по меньшей мере, под контролем различных промоторов. Таким образом избегают того, что аналог или эпитоп будет продуцировать в виде партнера слияния с иммуномодулятором. Альтернативно, могут использоваться два различных нуклеотидных фрагмента, но это менее
предпочтительно из-за преимущества гарантированной совместной экспрессии при наличии обоих кодирующих областей, включенных в состав одной и той же молекулы.
Соответственно, изобретение также относится к композиции для индукции продукции антител против IL5, причем композиция содержит фрагмент нуклеиновой кислоты или вектор по изобретению (ср.
ниже обсуждение нуклеиновых кислот и векторов) и фармацевтически и иммунологически приемлемое
несущее средство, и/или носитель, и/или адъювант, как обсуждается выше.
В обычных обстоятельствах нуклеиновую кислоту вводят в виде вектора, где экспрессия происходит под контролем вирусного промотора. Для более подробного обсуждения векторов и фрагментов
ДНК по изобретению, ср. обсуждение ниже. Также доступны подробные описания, относящиеся к композиции и применению вакцин на основе нуклеиновой кислоты, ср. Donnelly J.J. et al., 1997, Annu. Rev.
Immunol. 15: 617-648 and Donnelly J.J. et al., 1997, Life Sciences 60: 163-172. Обе эти ссылки включен сюда в качестве ссылки.
Живые вакцины
Третьей альтернативой осуществления представления аналогов по изобретению иммунной системе
является применение технологии живых вакцин. При живой вакцинации представление иммунной системе осуществляется путем введения животному непатогенного микроорганизма, который трансформируют фрагментом нуклеиновой кислоты, кодирующим аналог по изобретению или вектором, содержащим такой фрагмент нуклеиновой кислоты.
Непатогенный микроорганизм может быть любым подходящим аттенуированным бактериальным
штаммом (аттенуированным посредством пересева или посредством удаления патогенных продуктов
экспрессии посредством технологии рекомбинантной ДНК), например, BCG Mycobacterium bovis, непатогенным Streptococcus spp., E. coli, Salmonella spp., Vibrio cholera, Shigella, и т.д. Обзоры, имеющие дело
с получением введенных в практику живых вакцин могут, например, обнаруживаться в Saliou Р., 1995,
Rev. Prat. 45: 1492-1496 и Walker P.D., 1992, Vaccine 10: 977-990, причем оба источника включены сюда в
качестве ссылки. Для подробностей по фрагментам нуклеиновой кислоты и векторов, применяемых в
таких живых вакцинах, ср. обсуждение ниже.
В качестве альтернативы бактериальным живым вакцинам обсуждаемые ниже фрагменты нуклеиновой кислоты по изобретению могут быть включены в состав невирулентного вирусного вакцинного
вектора, такого как штамм коровьей оспы или любого другого подходящего поксвируса.
Обычно непатогенный микроорганизм или вирус вводят животному только один раз, но в некоторых случаях может быть необходимо вводить микроорганизм более одного раза в течение жизни для
поддержания протективного иммунитета. Рассматривается даже, что схемы иммунизации, такие как те,
что подробно описаны выше для иммунизации полипептидами, могут использоваться и при использовании живых или вирусных вакцин.
Альтернативно, вакцинация живыми или вирусными вакцинами сочетается с предшествующей или
последующей вакцинацией полипептидами и/или вакцинацией нуклеиновыми кислотами. Например,
возможно осуществить первичную иммунизацию живой или вирусной вакциной с последующими загрузочными иммунизациями с использованием подхода полипептидов или нуклеиновой кислоты.
Микроорганизм или вирус может трансформироваться нуклеиновой(-ыми) кислотой(-ами), содержащими области, кодирующие указанные выше радикалы, например, имеющие вид описанных выше
иммуномодулирующих веществ, таких как цитокины, обсуждаемые как подходящие адъюванты. Пред- 20 -
007810
почтительный вариант данного осуществления охватывает наличие области, кодирующей аналог, и области, кодирующей иммуномодулятор, в различных рамках считывания или, по меньшей мере, под контролем различных промоторов. Таким образом избегают того, что аналог или эпитоп будет продуцировать в виде партнера слияния с иммуномодулятором. Альтернативно, в качестве средств трансформации
могут использоваться два различных нуклеотидных фрагмента.
Конечно, наличие адъювантных радикалов в одной и той же открытой рамке считывания может
предоставить в качестве продукта экспрессии аналог по изобретению, и такое осуществление является
особо предпочтительным по настоящему изобретению.
Комбинированное лечение
Одним из особенно предпочтительных способов осуществления изобретения охватывает применение вакцинации нуклеиновой кислотой в качестве первой (первичной) иммунизации, с последующими
вторыми (стимулирующими) иммунизациями основанной на полипептиде вакциной или живыми вакцинами, как описано выше.
Применение способа по изобретению при лечении заболевания
Точный выбор режима лечения зависит от выбора мультимерного белка, на который оно направлено. Например, при использовании в качестве мишени IL5 к проблеме имеют отношение все состояния,
обсуждаемые в WO 00/65058, а когда мишенью является TNFα, все имеющие к проблеме заболевания/состояния охватывают ревматоидный артрит, ювенильный хронический артрит, спондилартропатии,
полимиозит, дерматомиозит, васкулит, псориаз (бляшки) и псориатический артрит, Mb. болезнь Крона,
хроническое обструктивное легочное нарушение, синдром миелодисплазии, увеит при ревматоидном
артрите, острую дисфункцию легких, астму, гранулематоз Венегера, болезнь раздраженной толстой
кишки, темпоромандибулярное нарушение (болезненное смыкание челюстей), стоматит-остеопороз и
кахексию при злокачественных опухолях, а также другие воспалительные заболевания и другие состояния, рассматриваемые в данной области как связанные с неблагоприятными эффектами TNFα. Поэтому
возможно лечение или ослабление симптомов любых из данных заболеваний путем использования способа отрицательной регуляции активности мультимерного белка по изобретению.
Композиции по изобретению
Изобретение также относится к композициям, которые могут использоваться при воплощении способа по изобретению. Следовательно, изобретение также относится к иммуногенной композиции, содержащей иммуногенно эффективное количество определенного выше аналога, причем указанная композиция далее содержит фармацевтически и иммунологически приемлемый растворитель, и/или несущее
средство, и/или носитель, и/или наполнитель, и, необязательно, адъювант. Иными словами, данная часть
изобретения относится к препаратам аналогов, по существу описанных здесь и выше. Выбор адъювантов, носителей и несущих средств осуществляется в соответствии с обсуждаемым выше, когда это относится к препарату аналогов для вакцинации пептидами.
Аналоги получают по способам, хорошо известным в данной области. Более длинные полипептиды
обычно получают посредством рекомбинантной генной технологии, включающей в себя введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аналог, в подходящий вектор, трансформацию данным вектором подходящего хозяина, экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты (путем культивирования клетки хозяина в подходящих условиях), получение продукта экспрессии из клеток хозяина
или их культуральной надосадочной жидкости и последующую очистку и необязательную дальнейшую
модификацию, например, рефолдинг или дериватизацию. Подробности, касающиеся необходимых инструментов, находятся ниже под заголовком «Фрагменты нуклеиновой кислоты и векторы по изобретению», но также и в примерах.
Более короткие пептиды предпочтительно получают хорошо известными способами жидко- и твердофазного пептидного синтеза.
Однако последние успехи в данной технологии дали возможность для продукции полноразмерных
полипептидов и белков данными средствами, и поэтому также в объеме настоящего изобретения находится получение длинных конструкций синтетическими средствами.
Фрагменты нуклеиновой кислоты и векторы по изобретению
Из указанного выше описания следует понимать, что модифицированные полипептиды могут быть
получены посредством рекомбинантной генной технологии, но также посредством химического синтеза
или полусинтетически; два последних условия особенно применимы, когда модификация состоит в связывании с белковыми носителями (такими как KLH, дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин и
BSA) и небелковыми молекулами, такими как углеводные полимеры, или охватывает это, и, конечно,
также когда модификация охватывает добавление боковых цепей или боковых групп к происходящей из
полимера пептидной цепи. Данные осуществления, как понятно из сказанного выше, не являются предпочтительными.
Для целей рекомбинантной генной технологии и, конечно, также для целей иммунизации нуклеиновой кислотой важными химическими продуктами являются фрагменты нуклеиновой кислоты, кодирующие аналоги (а также комплементарные им последовательности). Следовательно, важная часть изо- 21 -
007810
бретения относится к фрагментам нуклеиновой кислоты, которая кодирует описанный здесь аналог, т.е.
происходящий из полимера искусственный полимерный полипептид, как описано здесь выше. Фрагменты нуклеиновой кислоты по изобретению представляют собой ДНК- или РНК-фрагменты.
Наиболее предпочтительный ДНК-фрагмент по изобретению охватывает последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14, 17, 48, 50, 52, 54, 56 и
58, или последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную любой из них.
Фрагменты нуклеиновой кислоты по изобретению обычно встраивают в подходящие векторы с образованием клонирующих или экспрессирующих векторов, несущих фрагменты нуклеиновой кислоты по
изобретению; такие новые векторы также являются частью изобретения. Подробности, касающиеся конструирования данных векторов по изобретению, обсуждаются ниже в контексте трансформированных
клеток и микроорганизмов. Векторы могут в зависимости от цели и типа применения находиться в виде
плазмид, фагов, космид, минихромосом, или вируса, но также и голая ДНК, которая экспрессируется
лишь транзиторно в конкретных клетках, является значимым вектором (и может использоваться для вакцинации ДНК). Предпочтительные клонирующие и зкспрессирующие векторы по изобретению способны
к автономной репликации, что обеспечивает, таким образом, высокую копийность для целей высокоуровневой экспрессии или высокоуровневой репликации для последующего клонирования.
Общий вариант вектора по изобретению содержит следующие черты в 5' → 3'-направлении и функциональной связи: промотор для направления экспрессии фрагмента нуклеиновой кислоты по изобретению, необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую лидерный пептид, обеспечивающий секрецию (во внеклеточную фазу или, где возможно, в периплазму) или встраивание полипептидного фрагмента в мембрану, фрагмент нуклеиновой кислоты по изобретению, и необязательно
последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей терминатор. При работе с экспрессирующими
векторами в штаммах или клеточных линиях-продуцентах для целей генетической стабильности трансформированной клетки предпочтительно, чтобы вектор при введении в клетку хозяина интегрировался в
геном клетки хозяина. При работе с векторами, подлежащими использованию для экспрессии у животных in vivo (т.е., использования вектора при вакцинации ДНК), наоборот, из соображений безопасности
предпочтительно, чтобы вектор не был способен интегрироваться в геном клетки хозяина; обычно используют голую ДНК или неинтегрирующиеся вирусные векторы, выбор которых хорошо известен специалисту в данной области.
Векторы по изобретению используют для трансформации клеток хозяина для продукции модифицированного полипептида IL5 по изобретению. Такие трансформированные клетки, которые также являются частью изобретения, могут быть культивируемыми клетками или клеточными линиями, используемыми для размножения фрагментов нуклеиновой кислоты и векторов по изобретению или используемыми для рекомбинантной продукции модифицированных полипептидов IL5 по изобретению. Альтернативно, трансформированные клетки могут представлять собой штаммы, подходящие для живых вакцин, где фрагмент нуклеиновой кислоты (единственная или множественные копии) встроены так, что
осуществляется секреция или интеграция модифицированного IL5 в бактериальную мембрану или клеточную стенку.
Предпочтительные трансформированные клетки по изобретению представляют собой такие микроорганизмы как бактерии (такие как виды Escherichia [например, Е. coli], Bacillus [например, Bacillus subtilis], Salmonella, или Mycobacterium [предпочтительно, непатогенные, например, М. bovis BCG] ), дрожжи (такие как Saccharomyces cerevisiae) и простейшие. Альтернативно, трансформированные клетки происходят из многоклеточного организма, такого как гриб, являются клетками насекомых, растительными
клетками или клетками млекопитающих. Наиболее предпочтительными являются клетки, происходящие
из человеческого существа, ср. ниже обсуждение клеточных линий и векторов. Последние результаты
показали, что многообещающим является применение коммерчески доступной клеточной линии Drosophila melanogaster (клеточная линия и векторная система Schneider 2 (S2), доступные от Invitrogen) для
рекомбинантной продукции аналогов IL5 по изобретению, и поэтому данная экспрессирующая система
является особенно предпочтительной, и поэтому данный тип системы в общем является предпочтительным осуществлением изобретения.
Для целей клонирования и/или оптимизированной экспрессии предпочтительно, чтобы трансформированная клетка могла реплицировать фрагмент нуклеиновой кислоты по изобретению.
Клетки, экспрессирующие данный нуклеиновый фрагмент, являются предпочтительными используемыми осуществлениями изобретения; они могут использоваться для мелко- и крупномасштабного
получения аналога или, в случае непатогенных бактерий, в качестве вакцинного составляющего живой
вакцины.
При продукции аналогов по изобретению посредством трансформированных клеток удобно, хотя и
не существенно, чтобы продукт экспрессии экспортировался в культуральную среду или находился на
поверхности трансформированной клетки, поскольку оба данных условия облегчают последующую очистку данного продукта экспрессии.
После идентификации эффективной клетки-продуцента предпочтительно на ее основе получить
стабильную клеточную линию, которая будет нести вектор по изобретению и которая будет экспресси- 22 -
007810
ровать фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий модифицированный IL5. Предпочтительно данная
стабильная клеточная секретирует или несет аналог IL5 по изобретению, облегчая таким образом его
очистку.
В общем в связи с конкретными хозяевами используют плазмидные векторы, содержащие репликон и
последовательности контроля, которые происходят из видов, совместимых с клеткой хозяина. Обычно вектор
содержит участок репликации, а также маркерные последовательности, которые способны обеспечивать фенотипическую селекцию трансформированных клеток. Например, Е. coli обычно трансформируют с использованием pBR322, плазмиды, происходящей из видов Е. coli (см., например, Bolivar et al., 1977). Плазмида
pBR322 содержит гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину, и так обеспечивает простое средство
идентификации трансформированных клеток. Плазмида pBR или другая микробная плазмида или фаг также
должна содержать промоторы, которые могут использоваться прокариотическим микроорганизмом для экспрессии, или должна быть модифицирована так, чтобы она содержала данные промоторы.
Те промоторы, что наиболее часто используются в прокариотических конструкциях рекомбинантной ДНК включают в себя промоторные системы β-лактамазы (пенициллиназы) и лактозы (Chang et al.,
1978; Itakura et al., 1977; Goeddel et al., 1979) и триптофановую (trp) промоторную систему (Goeddel et al.,
1979; EP-A-0 036 776). Хотя эти системы наиболее часто используют, открыты и использованы другие
микробные промоторы, и опубликованы подробности, относящиеся к их нуклеотидным последовательностям, что позволяет специалисту функционально лигировать их с плазмидными векторами (Siebwenlist
et al., 1980). Некоторые гены прокариот могут эффективно экспрессироваться в Е. coli с их собственных
промоторных последовательностей, отменяя необходимость добавления другого промотора искусственными средствами.
В дополнение к прокариотам также могут использоваться эукариотические микробы, такие как
дрожжевые культуры, и здесь промоторы должны быть способны направлять экспрессию. Среди эукариотических микроорганизмов чаще всего используют Saccharomyces cerevisiae, или обыкновенные пекарские дрожжи, хотя обычно доступно некоторое количество других штаммов. Для экспрессии в Saccharomyces обычно используют, например, плазмиду YRp7 (Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al., 1979;
Tschemper et al., 1980).
Данная плазмида уже содержит ген trpl, который обеспечивает селективный маркер для мутантного
штамма дрожжей, не способного расти на триптофане, например, АТСС No. 44076 или РЕР4-1 (Jones,
1977). Тогда наличие повреждения trpl, как характеристика генома дрожжевого хозяина, обеспечивает
эффективные условия выявления трансформации по росту в отсутствие триптофана.
Подходящие промоторные последовательности в дрожжевых векторах включают в себя промоторы
для 3-фосфоглицераткиназы (Hitzman et al., 1980) или других ферментов гликолиза (Hess et al., 1968; Holland et al., 1978), таких как енолаза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, гексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфатизомераза, 3-фосфоглицератмутаза, пируваткиназа,
триозофосфатизомераза, фосфоглюкозоизомераза и глюкокиназа. При конструировании подходящих
экспрессирующих плазмид последовательности терминации, ассоциированные с данными генами, также
лигируют в экспрессирующий вектор в 3'-направлении от последовательности, которую требуется экспрессировать, для обеспечения полиаденилирования мРНК и терминации.
Другие промоторы, которые имеют дополнительное преимущество транскрипции, контролируемой
условиями роста, включают в себя промоторную область алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, ферментов деградации, ассоциированных с метаболизмом азота, и указанной выше глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, и ферментов, ответственных за утилизацию мальтозы и галактозы.
Подходящими являются любые плазмидные векторы, содержащие совместимые с дрожжами промоторы,
точку начала репликации и последовательности терминации.
В дополнение к микроорганизмам в качестве хозяев также могут применяться культуры клеток,
происходящих из многоклеточных организмов. В принципе любые такие клеточные культуры могут работать, происходят ли они из позвоночных или из беспозвоночных. Однако наиболее интересными являются клетки позвоночных, и размножение клеток позвоночных в культуре (культура ткани) в последние годы стало рутинной процедурой (Tissue Culture, 1973). Примерами таких подходящих клеток линий
хозяина являются клетки VERO и HeLa, линии клеток яичников китайского хомячка (СНО) и клетки
W138, ВНK, COS-7 293, Spodoptera frugiperda (SF) (коммерчески доступные в виде полных экспрессирующих систем, среди прочих, от Protein Sciences, 1000 Research Parkway, Meriden, CT 06450, США, и от
Invitrogen) линии клеток MDCK. По настоящему изобретению особенно предпочтительной клеточной
линией является клеточная линия насекомых S2, доступная от Invitrogen, PO Box 2312,9704 СН Groningen, Нидерланды.
Экспрессирующие векторы для таких клеток обычно включают в себя (если необходимо) точку начала репликации, промотор, локализованный перед подлежащим экспрессии геном вместе с какими-либо
необходимыми участками связывания рибосомы, участками сплайсинга РНК, участком полиаденилирования и последовательностями терминации транскрипции.
Для применения в клетках млекопитающих функции контроля экспрессирующих векторов часто
предоставляются вирусным материалом. Например, обычно используемые промоторы происходят из
- 23 -
007810
полиомавируса, аденовируса 2, и чаще всего, из обезьяньего вируса 40 (SV40) или цитомегаловируса
(CMV). Ранний и поздний промоторы вируса SV40 особенно применимы, поскольку оба получены просто из вируса в качестве фрагмента, который также содержит точку начала репликации вируса SV40 (Fiers et al., 1978). Также могут использоваться меньшие или большие фрагменты SV40 при обеспечении
того, что будет включена последовательность длиной примерно 250 н.п., простирающаяся от участка
HindIII до участка BglI, локализованного в точке начала репликации вируса. Кроме того, также возможно, и часто желательно использовать промотор или последовательности контроля, в норме ассоциированные с требуемой генной последовательностью при обеспечении того, что такие последовательности
контроля совместимы с системами клетки хозяина.
Точка начала репликации может предоставляться конструированием вектора, чтобы он содержал
экзогенную точку начала репликации, такую как происходящая из SV40 или другого вируса (например,
полиомавирус, аденовирус, VSV, BPV), или может предоставляться механизмом хромосомной репликации клетки хозяина. Если вектор интегрирован в хромосому клетки хозяина, последнего часто бывает
достаточно.
Пример 1. Создание новых 4 конструкций мономера IL5 с двумя эпитопами (Р2+Р30)
IL5 является антипараллельным гомодимером, в котором С концы и N концы мономеров расположены в молекуле вплотную друг к другу. Это дает возможность связать два мономера в одну молекулу,
весьма подобную четвертичной структуре димера дикого типа.
Авторами изобретения предложен подход, который использует либо эпитопы р2/Р30 в качестве
линкера, либо вставку диглицинового линкера как описано ранее у Li et al. 1997, PNAS USA 94 (13):
6694-9.
Использованную во всей исследовательской работе молекулу ДНК, кодирующую природный hIL5,
приобретали в R & D systems (BBG16). Данная ДНК последовательность не включала в себя лидирующую последовательность hIL5; поэтому добавляли синтетическую последовательность ДНК, кодирующую природный лидирующий пептид. Последовательности, кодирующие эпитопы Т-клеток Р2 и Р30
получали из столбнячного анатоксина. Данные последовательности встраивали в природную последовательность гена, предоставляя, таким образом, иммуногенные варианты IL5. Вставки выполняют, сохраняя рамку считывания в гене IL5.
Стратегия клонирования для получения вариантов основана на удлинении праймера или фрагментов ДНК с перекрыванием последовательности. Сперва два набора праймеров с комплементарными 5'
концами, составляющими вставку, удлиняют в двух отдельных реакциях PCR, используя молекулу ДНК
IL5 wt в качестве матрицы и праймер фланкирующего вектора. После этого данные двойные нитевидные
фрагменты, которые также, соответственно, имеют дополнительные 5'-концы, отжигают и удлиняют для
того, чтобы включить полную вставку во вторую PCR. В заключение, фрагмент амплифицируют при
помощи фланкирующих праймеров. Данные вставки затем расщепляют соответствующими эндонуклеазами, как и вектор, и вектор и вставки лигируют совместно. Данная процедура является модификацией
процедуры «соединения посредством перекрывающего продления», описанной Horton et al. 1989 и приведенной в Current protocols in molecular biology (pp. 8.5. 7-9) "Introduction of a point mutation by sequential
PCR steps" Ausabel et al.
Стандартные молекулярно-биологические способы и такие манипуляции с ДНК, как расщепление
ферментами рестрикции, электрофорез в агарозном геле, выращивание и хранение клеток Е. coli проводили с использованием стандартных молекулярно-биологических способов, описанных в лабораторном
руководстве Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T. 1989 и с использованием стандартных протоколов М
& Е.
Пример 2. hIL5.34 и hIL5.35
Для того, чтобы получить эпитопы Т-клеток внутри молекулы, Р2 и Р30 встраивают началом к концу в качестве линкера между двумя мономерами IL5, получая, таким образом, две конструкции hIL5-P30P2-hIL5 (hIL5.34, зрелый пептид в SEQ ID NO: 5 и 6) и hIL5-P2-P30-hIL5 (hIL5.35, зрелый пептид в SEQ
ID NO: 7 и 8): обе конструкции ДНК кодируют лидирующую последовательность природного IL5, приводя в результате к зрелому продукту экспрессии из 266 аминокислот. Продукты трансляции, получающиеся в результате данных конструирований, как подразумевают, сворачиваются в «мономерный димер
IL5", то есть мономерную молекулу, которая имеет третичную структуру, которая очень сильно похожа
на полную трехмерную структуру димерного IL5.
Пример 3. hIL5.36 & ML5.37
На основе предыдущих успешных поколений биологически активной мономерной «имитации димера IL5» посредством вставки диглицинового линкера по J. Li et al. были сконструированы похожие, но
иммуногенные конструкции с дополнительными эпитопами Т-клеток. Таким образом, вариант hIL5.36
имеет структуру зрелого пептида в SEQ ID NO: 9 и 10 и вариант hIL5.37 имеет структуру зрелого пептида в SEQ ID NO: 11 и 12. Обе данные конструкции кодируются лидирующей последовательностью природного IL5, за которой следуют первые 4 аминокислоты в IL5, за которыми, в свою очередь, следует
первый встроенный эпитоп; другой эпитоп расположен на С-конце.
- 24 -
007810
Существует 2 основные причины, по которым N-концевой эпитоп не располагается на N-конце
полной последовательности IL5 в этих двух конструкциях вместо того, чтобы стремиться сохранить последовательность hIL5. Используя лидирующий пептид природного hIL5 совместно с N-концом hIL5,
авторы изобретения гарантируют, что лидирующий пептид будет отщепляться правильно. И, поскольку
N-конец в IL5 составляет подвижную область, он не важен для сохранения трехмерной структуры, полученной в результате конструкции.
Продукты трансляции, полученные в результате данных конструирований, по-видимому, сворачиваются в «мономерный димер IL5», как описано в примере 2.
Пример 4. Уровни экспрессии
Описанные выше аналоги IL5 человека встраивали в множественные вектора, используемые для
конструкций, вакцинации ДНК и рекомбинантной экспрессии в клетках насекомых, млекопитающих или
Е. coli с использованием стандартных способов для данной области.
Главным образом, используя стандартные экспрессионные системы и протоколы для клеток COS
(преходящая экспрессия) и для клеток S2, было обнаружено, что уровни экспрессии были даже лучше,
чем уровни экспрессии, полученные для конструкций, кодирующих белок IL5 дикого типа, и уровни экспрессии также превышали уровни экспрессии, полученные при экспрессии вариантов hIL5, описанных в
WO 00/65058.
Пример 5. Индукция перекрестно взаимодействующих антител против IL5
Описываемые в данный момент аналоги IL5 человека использовали в стандартных протоколах иммунизации мышей. Вкратце, мышей иммунизировали описанными выше вариантами из примеров 2 и 3.
Мышиные антитела против hIL5 выделяли посредством иммуноаффинной хроматографии и их активность против hIL5 сравнивали с активностью мышиных антител, полученных против hIL5 дикого типа.
Результаты указывают на то, что антитела имели более высокий титр и также более высокую аффинность, чем антитела против аналогов, описанных в WO 00/65058.
Предварительные результаты также показали, что имитации мультимера по настоящему изобретению сохраняли, по крайней мере, некоторую специфическую активность IL5.
Пример 6. Получение вариантов TNFα
Синтетическая последовательность ДНК «SMTNFWT3» (SEQ ID NO: 16), кодирующая полипептид
мономера TNFα человека дикого типа (SEQ ID NO: 17), получали в качестве продукта лигирования в
Entelechon GmbH. Последовательность ДНК человеческого hTNFα оптимизировали для экспрессии в Е.
coli согласно Codon Usage Database посредством удаления всех кодонов с частотой менее чем 10% для Е.
coli. Далее последовательность конструировали так, чтобы включить участок рестрикции 5'NcoI для последующих стадий клонирования.
Продукт лигирования SMTNFWT3 вводили в вектор ТОРО Blunt pCR 4, и были трансформированы
клетки DH10B Е. coli. ДНК плазмиды от 10 получившихся в результате клонов SMTNFWT3TOPO очищали, и выбирали пять клонов, содержащих необходимый фрагмент (при анализе путем расщепления
ферментами рестрикции (RE)).
Фрагменты ДНК NcoI/EcoRI из пяти потенциально правильных клонов SMTNFWT3TOPO выделяли и переносили в вектор рЕТ28b (+) и определяли их последовательность. Вставки, делеции или замены
определяли в четырех клонах, поскольку один клон, по-видимому, являлся правильным. Правильную
конструкцию SMTNFWT3pET28 впоследствии использовали в качестве матрицы для получения всех
единичных вариантов TNFα.
Пример 7. Конструкция TNF34
Аминокислотную последовательность эпитопа PanDR (SEQ ID NOs: 7 и 20) вручную «обратно
транслировали» в последовательность ДНК (SEQ ID NO: 19), оптимизированную для экспрессии в Е.
coli, см. ниже, и встраивали в петлю 3 TNFα посредством SOE-PCR.
Полученную в результате конструкцию (последовательность ДНК, кодирующую SEQ ID NO: 18)
помещали в вектор рЕТ28b+ для того, чтобы получить TNF34-pET28b+.
Пример 8. Мономеризованная конструкция тримера
Мономеризованная конструкция тримера основана на 3 областях, кодирующих TNFα, разделенных
или триглициновым линкером и/или областью, кодирующей эпитоп.
Ген TNF-α синтезировали как три отдельные части. Три фрагмента собирали посредством SOEPCR, и собранный ген (SEQ ID NO: 21) клонировали в pCR2.1-TOPO. После подтверждения последовательности выделяли правильный клон. Ген hTNFT_0 gene (SEQ ID NO: 21, кодирующая TNFαGlyGlyGly-TNFα-GlyGlyGly-TNFα, SEQ ID NO : 22, то есть 3 копии SEQ ID NO : 17, разделенные двумя
триглициновыми линкерами) затем переносили в рЕТ28b+ для того, чтобы получить hTNFT_0-pET28b+.
Выделяли правильный клон, последовательность подтверждали и трансформировали в линии Е. coli
BL21-STAR, BL21-G0LD и HMS174.
HTNFT_0-pET28b+ использовали в качестве матрицы для того, чтобы получить следующие четыре
мономеризованных варианта тримера: hTNFT_l, hTNFT_2, hTNFT_3 и hTNFT_4 (SEQ ID NO: 49, 51, 57 и
- 25 -
007810
59) посредством SOE-PCR. Дальнейший вариант (SEQ ID NO: 53) может быть получен подобным образом.
hTNFT_l, hTNFT_2 и hTNFT_3 являются вариантами, включающими в себя эпитопы столбнячного
анатоксина Р2 и Р30 (SEQ ID NO: 3 и 5, соответственно), которые необходимо собирать посредством
двух циклов SOE-PCR. HTNFT_4 представляет собой вариант со вставкой PADRE (SEQ ID NO : 7) и может быть собрана посредством одного цикла SOE PCR. Дальнейший вариант (SEQ ID N0: 55) может
быть получен подобным образом.
hTNFT_4 конструировали посредством описанных выше способов, и в 10 клетках ТОР были обнаружены правильные клоны hTNFT_4-pET28b+, и конструкцию переносили в клетки BL21-STAR и
HMS174.
Для того, чтобы получить hTNFT_l, hTNFT_2 и hTNFT_3 эпитопы встраивали посредством SOEPCR в очень маленький фрагмент тримера, который встраивали в hTNFT_0-pET28b+ посредством разрезания RE и лигирования.
Пример 9. Стабилизация мутантов TNF34
Для дальнейшей стабилизации описанного выше варианта TNF34-pET28b+, были сконструированы
варианты содержащие включение дополнительного дисульфидного моста, а также мутантную делецию.
Были сконструированы 3 различных варианта:
TNF34-A-pET28b+, содержащий замены Q67C и А111С, TNF34-B-рЕТ28b+, содержащий А96С и
I118C и TNF34-C-pET28b+, который содержит делецию, в большинстве случаев, 8 N-концевых аминокислот; последовательности аминокислот продуктов экспрессии указаны в SEQ ID NO: 20, 30, и 31.
Все 3 конструкции были сделаны при помощи SOE-PCR и клонированы в BL21-STAR, BL21-GOLD
и HMS174, что сопровождалось подтверждением последовательности.
Пример 10. Варианты гибких петель
Для того, чтобы обнаружить вариант, который мог бы проявлять улучшенные характеристики по
сравнению с вариантом TNF34-pET28b+, были сделаны конструкции, где вставку PADRE (SEQ ID NO: 7)
перемещали в гибкую петлю 3 молекулы TNF-α.
Все из них: TNF35-pET28b+, TNF36-pET28b+, TNF37-pET28b+, TNF38-pET28b+, TNF39-pET28b+ и
вариант с PADRE, расположенной на С конце молекулы; TNFC2-pET28b+ были сделаны при помощи
способа SOE-PCR и были клонированы в BL21-STAR, BL21-GOLD и HMS174, что сопровождалось подтверждением последовательности. Последовательности аминокислот продуктов экспрессии указанны в
SEQ ID NO: 23, 24, 24, 26, 27 и 28.
Также для того, чтобы оценить возможность использования клеток насекомых в качестве экспрессионной системы, TNFWT, TNF34, TNF35, TNF36, TNF37, TNF38, TNF39 и TNFC2 переносили в вектор
p2Zop2f (ср. фиг. 1) и экспрессировали в клетки насекомых S2.
Пример 11. Другие конструкции
Было приготовлено большое количество дальнейших вариантов TNFα, все названы TNFX, ср. выше. ДНК, кодирующую данные варианты, получили при помощи SOE-PCR и клонировали непосредственно в рЕТ28b+.
Правильные клоны TNFX трансформировали в BL21-STAR и HMS174 и последовательность впоследствии подтверждали.
Пример 12. Периплазматическая экспрессия
Лидирующую последовательность LTB добавляли в TNF34-рЕТ28b+ непосредственно выше SEQ
ID NO:16 для достижения экспрессии в периплазматическом пространстве.
Пример 13. Экспрессия у млекопитающих
Для того, чтобы проверить экспрессию в клетках млекопитающих, SEQ ID NO:16 и ДНК, кодирующую TNF34 переносили в вектор рНР1, который является вариантом коммерчески доступного вектора pCI (Promega Corporation). pHPl включает в себя ген устойчивости к канамицину в качестве маркера
вместо гена AmpR в pCI.
Пример 14. Совместная экспрессия GroEL и GroES
Экспрессия комплекса шаперонов в Е. coli, GroEL/ES, как раннее было описано, увеличивает экспрессию растворимых мутантов TNFα (Jeong, W et al 1997, Biotechnology letters, vol., 19, no., 6 p. 579582). Для того, чтобы проверить может ли совместная экспрессия GroEL/ES улучшить экспрессию вариантов TNFα, как описано здесь, использовали плазмиду, содержащую оперон GroEL/ES из Е. coli под
контролем его природного промотора. Данную плазмиду совместно трансформировали в HMS174 вместе
с ДНК, кодирующей либо wtTNFα, либо TNF34, либо TNF37. Двойные трансформанты отбирали, помещая их на плашки, содержащие как канамицин, так и карбициллин, которые являются двумя подходящими маркерами селекции. Затем двойные трансформанты идентифицировали посредством анализа RE,
для того, чтобы проверить наличие обеих плазмид в одном и том же самом клоне.
В предварительном эксперименте, клетки выращивали при температуре 37°С до OD600=0,6-1, после чего следовал тепловой шок в течение 30 мин при температуре 42°С. Контрольную фракцию клеток
- 26 -
007810
не подвергали тепловому шоку, и все клетки разбавляли 5 раз в среде LB, содержащей 1 мМ IPTG, и выращивали при температуре 25°С.
Клетки собирали и оба супернатанта и лизаты анализировали на предмет экспрессии TNFα. Для того, чтобы оценить экспрессию GroEL/ES проводили окрашивание кумасси.
В данном эксперименте никакого улучшения при добавлении шаперонов не наблюдали. Это произошло, главным образом, из-за того, что авторы изобретения получили почти 100% растворимого материала в данном эксперименте, даже в отсутствие шаперонов. Впрочем, авторы изобретения проверят
улучшение для других вариантов по изобретению, если они окажутся менее растворимыми вариантами.
Пример 15. Экспрессия Е. coli
Экспрессию растворимых вариантов TNFα в трех различных штаммах Е. coli проверяли в лабораторных ферментерах, а также в колбах для встряхивания. Использованным оборудованием для ферментации являлась Infors fermentor system с рабочим объемом 1 л. Тремя проверяемыми штаммами Е. coli
являлись: HMS174, BL21 STAR и BL21 GOLD. Среда, использованная для ферментации, представляла
собой определенную минимальную среду с глюкозой в качестве единственного источника углерода.
Одна из основных задач заключалась в определении оптимальных параметров процесса ферментации (особенно температуры и концентрации IPTG) с тем, чтобы оптимизировать экспрессию растворимых вариантов TNFα.
Параметры процесса:
Было обнаружено, что одной подходящей схемой являлась следующая схема: концентрация IPTG
равнятся 0,5 мМ и температура при индукции снижается до 25°С. Общее время ферментации находится в
пределах от 14 до 18 ч, включая сюда размножение, индукцию и продукцию белка. Общее время ферментации зависит от роста культуры. Начальная OD600 в ферментере находится обычно в пределах между 0,1-0,3 (2-6 в предварительной культуре), как рассчитано из OD в культуре инокуляции. Индукцию
культуры проводили при OD600=20±l-2 или с девяти до одиннадцати часов после инокуляции. Продукция белка затем происходит в течение от трех до пяти часов.
Альтернативно: экспрессию вариантов TNF-α проводят, воспользовавшись низкотемпературной
культурой для того, чтобы избежать внутриклеточной преципитации белков вариантов с тельцами включения. Рост культуры до необходимой OD осуществляют при той же температуре, что и для действительной индукции для того, чтобы избежать «шока» для клеток при изменении температуры от оптимальной температуры для роста (37°С) до более низкой температуры индукции (25°С). Используя данный метод, полагают, что единственным воздействием, применяемым к клеткам, является действительная индукция посредством IPTG; во всяком случае, этот способ недавно обеспечил значительно улучшенный выход растворимого продукта экспрессии. Создавая небольшие культуры в течение ночи и приготавливая более 1 л среды LB заблаговременно за день, образование материала в больших культурах LB
можно провести приблизительно за 9 ч, в то время как период действительной индукции проходит за
ночь (через 16-20 ч). Следовательно, предпочтительный способ можно описать как нижеследующий:
экспрессию варианта TNFα проводят в 2x2 л колбах для встряхивания с перегородками, содержащих 1 л
среды LB, каждая с единственной модификацией вышеуказанного способа, заключающейся в том, что
клетки (BL21 STAR) выращивают при температуре 25°С до OD436 0,7, после чего клетки индуцируют 1
мМ IPTG и позволяют продуцировать белок в течение 20 ч (все еще при температуре 25°С).
Пример 16. Селекционные анализы
Прямой ELISA рецептора совместно с поликлональным ELISA и цитотоксический анализ с клетками KD-4 и Wehi использовали в качестве анализов первой очереди для скрининга и последующей очистки. Антитела, полученные против вариантов TNFα, использовали для ингибирования связывания
wtTNFα как с рецептором, так и при цитотоксическом анализе, для того, чтобы охарактеризовать качество антитела.
Пример 17. Процедуры очистки
В данном примере подробно описана рекомбинантная продукция и последующая очистка одного из
вариантов TNFα (TNF37). Однако процедура очистки является предпочтительной согласно настоящему
- 27 -
007810
изобретению и будет также применима (с небольшими поправками, соответствующими каждому варианту) для других вариантов TNFα по настоящему изобретению.
Колонию TNF37 штамма BL21 STAR E. coli из плашки с LB и канамицином (60 мг канамицина/л
среды LB, содержащей 1,5% агар) ресуспендируют в 5 мл среды LB (60 мг канамицина/л LB) и выращивают в течение ночи (16 ч) при температуре 37°С, встряхивая с 220 об./мин на шейкере New Braunswick.
2x2 мл данной культуры переносят к 2x1 л LB (60 мг канамицина/л) в колбы для встряхивания с перегородками объемом 2 л и на шейкере New Braunswick при 220 об./мин позволяли клеткам расти до
OD436=0,6-0,8. Данную стадию выполняли при типовых температурах 37 и 25°С, но температуру можно
оптимизировать для каждой культуры.
1 мл 1М IPTG добавляют в каждую колбу и позволяют клеткам расти в течение 16-20 ч. Перед индукцией температура корректировалась до 25°С, если она уже не являлась температурой ферментации.
Клетки собирают в пробирки для центрифуги (500 мл) посредством центрифугирования при 5000
об./мин. в течение 15 мин, используя насадку SLA-3000 в центрифуге Sorvall.
Клетки переносят в одну предварительно взвешенную пробирку для центрифуги объемом 500 мл,
используя 0,9% NaCl, и собирают клетки посредством центрифугирования как и ранее.
Супернатант убирают, и пробирку взвешивают для того, чтобы определить клеточный вес (должно
быть 7-11 г).
Добавляют 200 мл 50 мМ Na2HPO4, рН=7,0 (если клетки ресуспендируют, их следует использовать
сразу же, в ином случае возможно замораживание).
Разрушение клеток, центрифугирование и фильтрация
Механическое разрушение клеток обеспечивает несколько преимуществ над ферментативным разрушением с точки зрения эффективности, надежности и возможности выбора любого буфера, необходимого для последующих стадий очистки. APV-1000 содержат холодным во время работы, добавляя ледяную воду в ячейку для образца до использования и пропуская ледяную воду через устройство между
двумя пассажами образца. Центрифугирование и фильтрация служат для удаления любых частиц или
агрегатов из раствора перед хроматографическим разделением белков. Разрушение клеток и НАхроматографию следует проводить в тот же день, так как это может минимизировать вероятную протеазную активность как следствие отделения их на хроматографической стадии. Процедура разрушения,
центрифугирования и фильтрации осуществляется следующим образом:
Тщательно ресуспендированный клеточный материал переносят в устройство для разрушения клеток (APV-1000). Суспензию клеток тщательно пропускают 2х через устройство для разрушения клеток
(охлаждая на льду после каждого пассажа и пропуская ледяную воду через APV-1000 между пассажами),
используя 700 бар обратного фильтрационного давления (раствор должен быть чистым на этом этапе).
Разрушенные клетки переносят в пробирки для цетрифугирования объемом 500 мл, и клетки крутят
в течение 45 мин при 10000 об./мин на центрифуге Sorvall, используя насадку SLA-3000.
Экстракт (приблизительно 225 мл) пропускают через фильтр 0,22 мкм.
Гидроксиапатитная (НА) хроматография
Гидроксиапатитный гель Bio-Gel HTP (BIO-RAD; № по каталогу 130-0420) является кристаллической формой фосфата кальция, доказавшей себя в качестве уникального средства в разделении таких
белков, как моноклональные антитела и других белков, иначе не способных разделиться посредством
других способов. Тем не менее, по опыту авторов изобретения реологические свойства материала, до
некоторой степени, являются критичными в том смысле, что поток более чем 2 мл/мин увеличивает давление до неприемлемо высокого уровня. Также материал несколько раз разрушался, если совершались
попытки восстановления гидроксидом натрия, как рекомендовано производителем.
Буферы и колонка
Маточный раствор для буфера А+В: 1М Na2HPO4x2H2O, pH=7,0 (рН доводится до 7 при помощи
НСl). Буферы А+В приготавливают разбавлением маточного раствора.
Буфер А: 50 мМ Na2HPO4x2H2O, pH=7,0
Буфер В: 0,3М Na2HPO4x2H2O, pH=7,0
Колонка, заполненная приблизительно до 50-60 мл гидроксиапатитным гелем Bio-Gel HTP (BIORAD; № по каталогу 130-0420) с использованием суспензии в буфере А, и колонка ХК 26/40 (Amersham
Biosciences).
Программа хроматографии
Очистить систему 20 мл при потоке 30 мл/мин.
Уравновешивание: 4 CV буфера А при потоке 2 мл/мин
Загрузить образец через насос (входной канал F в BioCad) (приблизительно 225+5-10 мл, если необходимо заполнение трубок образцом) при потоке 2 мл/мин.
Промыть колонку 1,5 CV буфера А при потоке 2 мл/мин.
Элюирование: Элюировать белок с градиентом 4 CV от 0 до 100% буфера В при потоке 2 мл/мин.
Очистить колонку 2 CV буфера В при потоке 2 мл/мин.
Повторное уравновешивание 4 CV буфера А при потоке 2 мл/мин.
- 28 -
007810
Выбрать фракции, объединить и диализировать при температуре 4°С против 15х объем 20 мМ TrisHCl, 0,075М NaCl, рН 8,0.
Выбор фракций, содержащих TNF37, после НА-хроматографии
НА-хроматографический профиль фракции элюирования в основном состоит из «проходящей»
фракции и одного элюированного пика, который можно разделить на несколько пиков. Фракцию, содержащую TNF37, необходимо выбирать на основе окрашенного кумасси геля полного пика, так как пик,
содержащий TNF37, прямо не опознается. Тем не менее, как результат последующих стадий очистки,
выбор фракций на данном этапе является менее критичным, и возможно удаление загрязняющих веществ
позднее по процедуре. Таким образом, менее консервативный выбор фракций обеспечивает максимальный выход варианта.
Первоначально «проходящую» фракцию проверяли при помощи «дот-блота» на наличие какоголибо TNF37. Это дало положительный результат, который теоретически следует указывать, что значительная часть варианта не связалась с колонкой. Тем не менее, если подвергнуть «проходящую» фракцию очень эффективной катионобменной хроматографии на SP-сефарозе (ср. со следующей стадией), и
фракции анализировать при помощи окрашенных кумасси гелей, то они не содержат какого-либо определяемого варианта TNF37, указывая на некоторую ложноположительную реакцию в «дот-блоте» или на
фракцию варианта, которая связывается совершенно по-другому с SP-сефарозой.
Катионобменная хроматография на SP-сефарозе
SP-сефароза является основной катионобменной стадией, выбранной как следствие довольно высокого расчитанного pI 9,4 варианта по сравнению с pI 7,8 для wtTNFα. Данное увеличение pI является
следствием 2 лизинов, введенных посредсвом эпитопа PADRE. Данная хроматография является очень
эффективной и быстрой для варианта TNF37, и , как ожидают, является пригодной для большого количества других вариантов петель TNFα.
Наносимый образец должен иметь меньшую проводимость, чем 8 мС/см и рН должно быть по
крайней мере 7,7 до возобновления хроматографии на SP-сефарозе, поскольку варьирование этого, по
опыту авторов изобретения, время от времени делало свойства связывания белка различными.
Буферы и колонка
Маточный раствор для буфера А+В: 1М Tris-HCl. pH=8,0.
Буфер А: 20 мМ Tris-HCl, 0,075М NaCl, pH=8,0.
Буфер В: 20 мМ Tris-HCl, 1М NaCl, pH=8,0.
Колонка, заполненная приблизительно 60 мл FF SP-сефарозой (Amersham Biosciences; № по каталогу: 17-0729-01)) с использованием суспензии в буфере А и колонка ХК 26/40 (Amersham Biosciences) .
Программа хроматографии
Очистить систему 20 мл при потоке 30 мл/мин. Уравновешивание: 4 CV буфера А при потоке 4
мл/мин. Загрузить образец через насос (входной канал F в BioCad) (образец + 10 мл, если необходимо
заполнение трубок образцом) при потоке 4 мл/мин.
Промыть колонку 1,5 CV буфера А при потоке 4 мл/мин. Элюирование: Элюировать белок с градиентом 4 CV от 0 до 100% буфера В при потоке 4 мл/мин.
Очистить колонку 2 CV буфера В при потоке 4 мл/мин. Повторное уравновешивание 4 CV буфера
А при потоке 4 мл/мин.
Выбрать фракции, объединить и диализировать при температуре 4°С против 15х объем 20 мМ TrisHCl, 0,075M NaCl, рН 8,0.
Выбор фракций, содержащих TNF37, после хроматографии на SP-сефарозе
Профиль в основном состоит из «проходящей» фракции и нескольких пиков, содержащих белки.
Однако два пика содержат варианты с некоторыми загрязняющими веществами. На данном этапе важно
не включать слишком много фракций с правой стороны пика два, поскольку он по опыту авторов изобретения включает в себя слишком много загрязняющих веществ, которые не удаляются легко в последующих хроматографических стадиях.
Анионобменная хроматография на Q-сефарозе
Анионобменная хроматография на Q-сефарозе является основной анионобменной стадией, выбранной для удаления основных загрязняющих белков, которые с высокой воспроизводимостью сопровождают очистку TNF37, включая НА-хроматографию и хроматографию на SP-сефарозе. Сам вариант
TNF37 не связывается с колонкой, но основные неизвестные загрязняющие вещества связываются. Тем
не менее, возможно выбрать фракции консервативным образом уже на стадии SP-сефарозы, избегая таким способом загрязнения. Тем не менее, это ухудшает выход варианта TNF37 по сравнению с тем, когда
по процедуре используется Q-сефароза, и так как другие минорные загрязнения также удаляются на данной стадии, предпочтительно включать его в общую процедуру. В заключение, стадия Q-сефарозы важна
для очистки варианта 37 и дает даже лучший конечный продукт с высоким выходом.
Буферы и колонка
Маточный раствор для буферов А+В: 1М Tris-HCl. pH=8,0.
Буфер А: 20 мМ Tris-HCl, 0,075М NaCl, pH=8,0.
- 29 -
007810
Буфер В: 20 мМ Tris-HCl, 1М NaCl, pH=8,0.
Колонка, заполненная приблизительно 50-60 мл FF Q-сефарозой (Amersham Biosciences; № по каталогу: 17-0510-01) с использованием суспензии в буфере А и колонка ХК 26/40 (Amersham Biosciences).
Программа хроматографии
Очистить систему 20 мл при потоке 30 мл/мин.
Уравновешивание: 4 CV буфера А при потоке 4 мл/мин.
Загрузить образец через насос (входной канал F в BioCad) (образец + 10 мл, если необходимо заполнение трубок образцом) при потоке 2 мл/мин.
Промыть колонку 3 CV буфера А при потоке 4 мл/мин.
Элюирование: Элюировать оставшийся белок 2 CV 100% буфера В при потоке 4 мл/мин.
Повторное уравновешивание 4 CV буфера А при потоке 4 мл/мин.
Выбрать фракции, объединить и нанести непрседственно на колонку с SP-сефарозой.
Профиль элюции в основном состоит из «проходящей» фракции и нескольких пиков, содержащих
белок. Иногда «проходящую» фракцию можно разделить на несколько разрешенных пиков без примесей,
все из которых содержат вариант TNF37 и, следовательно, все объединяются. Данная гетерогенность
TNF37, вероятно, разрешится, когда разрешится проблема очевидной протеолитической деградации.
Пример 18. Исследования иммунизации
Материалы:
соль (0,9% NaCl в стерильной воде, Fresenius Kabi Norge AS, Norway);
полный адъювант Фрейнда (Sigma, F-5881,39H8926);
неполный адъювант Фрейнда (Sigma, F-5506,60K8937);
алгидрогель 2% [10 мг Аl/мл] (Brenntag Biosector, Batch 96 (3176));
адъюфос [5 мг Аl/мл] (Brenntag Biosector, Batch 2 (8937));
человеческий TNF дикого типа (Invitrogen номер по каталогу: 10062-024).
KYM-1D4: предоставлен A. Meager (A. Meager, J. Immunol. Methods 1991,144 : 141-143).
Клон 13 WEHI 164: предоставлен Т. Espevik (T. Espevik and J. Nissen-Myer, J. Immunol. Methods
1986,95 : 99-105).
Соль тетразолия (MTS, CellTiter 96 Aqueous one solution; Promega, G3581).
Вращающаяся платформа (Rotamix, Heto, Denmark)
Вортекс (OLE DICH instrumentmakers ApS, Denmark)
Выбор композиции/адъюванта
Очищенные белковые варианты TNFα (в 20 мМ Tris-HCl, 0,075M NaCl, pH 8,0) разбавляют до 0,5
мг/мл солью (0,9% NaCl), группируют (375 мкг/ампулу) и хранят при температуре -20°С до использования при иммунизации.
Для каждого варианта TNF, иммунизации проводят с двумя адъювантами: 1) полный адъювант
Фрейнда (CFA, для первичной иммунизации) и неполный адъювант Фрейнда (IFA, для стимулирующей
иммунизации) и 2) алгидрогель или адъюфос (в данной области адъюванты гидроксида алюминия и
фосфата алюминия, соответственно): их используют как для первичной, так и для стимулирующей инъекций.
Перед первичной иммунизацией принимается решение о выборе либо алгидрогеля, либо адъюфоса
в качестве адъюванта для варианта TNF. Для дальнейшего использования в эксперименте иммунизации
выбирают адъювант с наилучшей способностью адсорбировать вариант TNF. Две аликвоты варианта
TNFα смешивают с равным количеством алгидрогеля и адъюфоса в двух ампулах. Содержимое ампулы
аккуратно перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин на вращающейся платформе.
Затем ампулы центрфугируют при 13000 g в течение 15 мин и супернатант проверяют на наличие растворимого варианта TNF на градиентном (4-12%) SDS-геле. Аликвоту адъювант/вариант, содержащую
по крайней мере три варианта (то есть, где больше вариантов связалось с алюминиевыми частицами)
затем выбирали как наилучший адъювант.
Приготовление эмульгата антиген/адъювант:
Эмульгаты CFA/IFA приготавливают посредством следующей процедуры:
Ампулы с вариантом TNFα [0,5 мг/мл] размораживают, переносят в стерильную ампулу объемом
10 мл и смешивают с равным объемом CFA или IFA. Содержимое ампулы затем перемешивают далее на
вортексе при 3300 об./мин в течение 30 мин при температуре 20°С.
Эмульгаты алгидрогель/адъюфос приготавливают посредством следующей процедуры: алгидрогель/адъюфос разбавляют солью до 1,4 мг Аl/мл.
Ампулы с вариантом TNFα [0,5 мг/мл] размораживают, переносят в стерильную ампулу объемом
10 мл и смешивают с равным объемом алгидрогеля [1,4 мг А1/мл] или адъюфоса [1,4 мг Аl/мл]. Ампулу
затем мешают далее на вращающейся платформе в течение 30 мин при температуре 20°С.
Выбор модели животных
Самок мышей Balb/Са в возрасте шесть-восемь недель иммунизировали с повторениями вариантами TNFα. Образцы крови собирают в разные интервалы, и выделенные сыворотки исследуют на титры
- 30 -
007810
антител против wtTNFα. Мышей заказывают в Taconic Farms, Inc. Acquires M & В A/S, Denmark. До начала эксперимента мышей содержат в помещении для животных Pharmexa в течение одной недели.
Схема иммунизации и дозировка
Группы 10 + 10 мышей иммунизируют каждым вариантом TNFα с CFA/IFA и алгидрогелем/адъюфосом, соответственно. 20 + 20 мышей используют для иммунизации TNFα дикого типа.
При первой иммунизации 50 мкг белка с адъювантом вводят подкожно. Все мыши получают дополнительную стимулирующую иммунизацию подкожно 25 мкг белка с адъювантом через 2, 6 и 10 недель после первой иммунизации.
Образцы крови собирали непосредственно перед первой иммунизацией и через 1 неделю после каждой стимулирующей иммунизации.
Используемые анализы
Биологический анализ цитотоксичности с использованием клеток клона 13 WEHI 164 или клеток
KYM-1D4: данный анализ используют для того, чтобы определить токсичность вариантов TNFα по изобретению. Клетки культивируют в течение 48 ч в присутствии титруемых количеств вариантов TNFα, и
гибель клеток определяли посредством добавления соли тетразолия (MTS), которая биодеградирует в
живых клетках с образованием окрашенного продукта формазана. Цитотоксичность вариантов TNFα
сравнивают с цитотоксичностью человеческого TNFα дикого типа.
Биологический анализ ингибирования цитотоксичности с использованием клеток клона 13 WEHI
164 или клеток KYM-1D4: данный анализ используют для того, чтобы исследовать способность антисывороток, полученных у иммунизированных TNFα мышей, нейтрализовать цитотоксический эффект
TNFα дикого типа. Клетки культивируют в течение 48 ч с титруемыми количествами антисывороток и
постоянной концентрацией человеческого TNFα дикого типа, которая достаточна для индукции клеточной гибели у 50% клеток в отсутствие антисывороток. Клеточную гибель определяли посредством MTS,
как описано выше. Нейтрализующую способность сывороток иммунизированных вариантом TNFα мышей сравнивают с сыворотками, полученными от мышей, иммунизированных человеческим TNFα дикого типа TNFα.
Исследования in vitro
Биологический анализ цитотоксичности с использованием клеток клона 13 WEHI 164 или клеток
KYM-1D4: биологический анализ ингибирования цитотоксичности с использованием клеток клона 13
WEHI 164 или клеток KYM-1D4.
Критерии выбора наилучших иммуногенных конструкций
Варианты TNFα должны проявлять минимальную цитотоксичность. Иммунизация мышей вариантами TNFα должна приводить к образованию антисывороток с лучшей или такой же способностью нейтрализовать цитотоксичность, опосредованную человеческим TNFα дикого типа, в клетках WEHI или
KYM-1D4, как сыворотки, полученные от мышей, иммунизированных человеческим TNFα дикого типа
- 31 -
007810
Список последовательностей
- 32 -
007810
- 33 -
007810
- 34 -
007810
- 35 -
007810
- 36 -
007810
- 37 -
007810
- 38 -
007810
- 39 -
007810
- 40 -
007810
- 41 -
007810
- 42 -
007810
- 43 -
007810
- 44 -
007810
- 45 -
007810
- 46 -
007810
- 47 -
007810
- 48 -
007810
- 49 -
007810
- 50 -
007810
- 51 -
007810
- 52 -
007810
- 53 -
007810
- 54 -
007810
- 55 -
007810
- 56 -
007810
- 57 -
007810
- 58 -
007810
- 59 -
007810
- 60 -
007810
- 61 -
007810
- 62 -
007810
- 63 -
007810
- 64 -
007810
- 65 -
007810
- 66 -
007810
- 67 -
007810
- 68 -
007810
- 69 -
007810
- 70 -
007810
- 71 -
007810
- 72 -
007810
- 73 -
007810
- 74 -
007810
- 75 -
007810
- 76 -
007810
- 77 -
007810
- 78 -
007810
- 79 -
007810
- 80 -
007810
- 81 -
007810
- 82 -
007810
- 83 -
007810
- 84 -
007810
- 85 -
007810
- 86 -
007810
- 87 -
007810
- 88 -
007810
- 89 -
007810
- 90 -
007810
- 91 -
007810
- 92 -
007810
- 93 -
007810
- 94 -
007810
- 95 -
007810
- 96 -
007810
- 97 -
007810
- 98 -
007810
- 99 -
007810
- 100 -
007810
- 101 -
007810
- 102 -
007810
- 103 -
007810
- 104 -
007810
- 105 -
007810
- 106 -
007810
- 107 -
007810
- 108 -
007810
- 109 -
007810
- 110 -
007810
- 111 -
007810
- 112 -
007810
- 113 -
007810
- 114 -
007810
- 115 -
007810
- 116 -
007810
- 117 -
007810
- 118 -
007810
- 119 -
007810
- 120 -
007810
- 121 -
007810
- 122 -
007810
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Иммуногенный аналог TNFα человека, где указанный аналог
a) содержит существенные фрагменты по меньшей мере 2 мономерные единицы указанного TNFα
человека, где указанные существенные фрагменты соединены пептидными связями через пептидный
линкер, указанная мономерная единица TNFα человека имеет аминокислотную последовательность,
представленную остатками 2-158 в SEQ ID NO: 17,
b) содержит по меньшей мере одну связывающую МНС класса II аминокислотную последовательность, которая гетерологична в отношении TNFα человека, и
c) может продуцироваться в виде единственного продукта экспрессии клеткой, несущей экспрессирующий вектор, кодирующий данный аналог.
2. Иммуногенный аналог по п.1, где каждый из существенных фрагментов экспонирует существенную часть В-клеточных эпитопов, находящихся на соответствующих мономерах, когда они являются
частью TNFα человека.
- 123 -
007810
3. Иммуногенный аналог по п.2, где каждый из существенных фрагментов экспонирует, по существу, все В-клеточные эпитопы, находящиеся на соответствующих мономерах, когда они являются частью
TNFα человека.
4. Иммуногенный аналог по п.2 или 3, где аминокислотная последовательность, происходящая из
мономерной единицы, модифицирована посредством вставки, замены, делеции или добавления аминокислот, так что снижается токсичность аналога по сравнению с TNFα человека и/или так что вводится
связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность.
5. Иммуногенный аналог по любому из пп.1-4, где каждая из существенных частей содержит, по
существу, полную аминокислотную последовательность каждой мономерной единицы в виде непрерывной последовательности или в виде последовательности, содержащей вставки.
6. Иммуногенный аналог по любому из предшествующих пунктов, где аминокислотные последовательности всех мономерных единиц TNFα человека представлены в данном аналоге.
7. Иммуногенный аналог по п.6, который содержит полные аминокислотные последовательности
мономеров, составляющих TNFα человека, в виде неизмененных последовательностей или в виде последовательности, содержащей вставки.
8. Иммуногенный аналог по любому из предшествующих пунктов, где пептидный линкер содержит
по меньшей мере одну связывающую МНС класса II аминокислотную последовательность, которая гетерологична в отношении TNFα человека, или участвует в ее образовании в аналоге.
9. Иммуногенный аналог по любому из пп.1-7, где пептидный линкер не содержит связывающую
МНС класса II аминокислотную последовательность и не участвует в ее образовании у людей.
10. Иммуногенный аналог по любому из предшествующих пунктов, где связывающая МНС класса
II аминокислотная последовательность связывает большую часть молекул МНС класса II людей.
11. Иммуногенный аналог по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере одна связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность выбрана из природного Т-клеточного
эпитопа и искусственной связывающей MHC-II последовательности.
12. Иммуногенный аналог по п.10, где природный Т-клеточный эпитоп выбран из эпитопа столбнячного анатоксина, такого как Р2 или Р30, эпитопа дифтерийного анатоксина, эпитопа гемагглютинина
вируса гриппа и эпитопа CS P. falciparum.
13. Иммуногенный аналог по любому из предшествующих пунктов, где трехмерная структура полного TNFα человека, по существу, сохранена.
14. Иммуногенный аналог по любому из предшествующих пунктов, где аналог выбран из группы,
состоящей из
двух или трех полных мономеров TNFα, соединенных конец в конец пептидным линкером, где по
меньшей мере один пептидный линкер содержит по меньшей мере одну связывающую МНС класса II
аминокислотную последовательность,
двух или трех полных мономеров TNFα, соединенных конец в конец инертным пептидным линкером, где по меньшей мере один из мономеров содержит по меньшей мере одну чужеродную связывающую МНС класса II аминокислотную последовательность, или где по меньшей мере одна чужеродная
связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность слита с N- или С-концевым мономером, необязательно, через инертный линкер.
15. Иммуногенный аналог TNFα человека, где данный аналог содержит по меньшей мере одну чужеродную связывающую МНС класса II аминокислотную последовательность, и далее характеризуется
тем, что представляет собой
мономер TNFα человека или аналог по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере
одна чужеродная связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность встроена или замещена в гибкую петлю 3, и/или
мономер TNFα человека или аналог по любому из предшествующих пунктов, куда введен по меньшей мере один дисульфидный мостик, который стабилизирует 3D-структуру мономера TNFα, и/или
мономер TNFα человека или аналог по любому из предшествующих пунктов, где любая из аминокислот 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9 на N-конце подвержена делеции, и/или
мономер TNFα человека или аналог по любому из предшествующих пунктов, где встроена или замещена по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность в петлю 1 в положении интрона, и/или
мономер TNFα человека или аналог по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере
одна чужеродная связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность введена как часть
области искусственного стебля на N-конце TNFα человека, и/или
мономер TNFα человека или аналог по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере
одна чужеродная связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность введена так, что она
стабилизирует мономерную структуру путем увеличения гидрофобности поверхности взаимодействия
тримера, и/или
- 124 -
007810
мономер TNFα человека или аналог по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере
одна чужеродная связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность, фланкированная
остатками глицина, встроена или замещена в аминокислотную последовательность TNFα, и/или
мономер TNFα человека или аналог по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере
одна чужеродная связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность встроена или замещена в D-E-петлю, и/или
мономер TNFα человека или аналог по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере
одна чужеродная связывающая МНС класса II аминокислотная последовательность встроена или замещена между двумя идентичными подпоследовательностями TNFα человека, и/или
мономер TNFα человека или аналог по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере
один солевой мостик в TNFα человека усилен или замещен дисульфидным мостиком, и/или
мономер TNFα человека или аналог по любому из предшествующих пунктов, где растворимость
и/или стабильность в плане протеолиза усилена путем введения мутаций, которые имитируют кристаллическую структуру мышиного TNFα, и/или
мономер TNFα человека или аналог по любому из предшествующих пунктов, где потенциальная
токсичность снижена или отменена путем введения по меньшей мере одной точечной мутации,
где указанный мономер TNFα человека имеет аминокислотную последовательность, представленную остатками 2-158 в SEQ ID NO: 17.
16. Иммуногенный аналог по п.14 или 15, где аминокислотная последовательность аналога выбран
из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 49, 51, 53, 55, 57 и 59, и любую аминокислотную последовательность на их основе, которая содержит только консервативные аминокислотные замены.
17. Иммуногенный аналог по любому из предшествующих пунктов, который может экспрессироваться в виде растворимого белка из бактериальных клеток.
18. Фрагмент нуклеиновой кислоты, который кодирует иммуногенный аналог по любому из предшествующих пунктов, или комплементарный ему фрагмент нуклеиновой кислоты.
19. Фрагмент нуклеиновой кислоты по п.18, который представляет собой фрагмент ДНК.
20. Фрагмент нуклеиновой кислоты по п.18, который содержит последовательность нуклеиновой
кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, 48, 50, 52, 54, 56 и 58, или комплементарную ей последовательность нуклеиновой кислоты.
21. Способ отрицательной регуляции TNFα человека у человека, причем данный способ охватывает
осуществление представления иммунной системе иммунологически эффективного количества по меньшей мере одного иммуногенного аналога по любому из пп.1-17.
22. Способ по п.21, где представление осуществляется путем введения иммуногенного аналога по
любому из пп.1-17 аутологичному хозяину, необязательно, в смеси с адъювантом.
23. Способ по п.22, где адъювант выбран из группы, состоящей из иммуннонаправленного адъюванта; иммуномодулирующего адъюванта, такого как токсин, цитокин и производное микобактерии;
масляного препарата; полимера; мицеллообразующего адъюванта; сапонина; иммуностимулирующего
комплексного матрикса (матрикс ISCOM); частицы; DDA; алюминиевых адъювантов; ДНК-адъювантов;
γ-инулина и инкапсулирующего адъюванта.
24. Способ по любому из пп.21-23, где иммуногенно эффективное количество аналога вводят животному путем, выбранным из парентерального пути, такого как внутрикожный, подкожный и внутримышечный путь; перитонеального; перорального; щечного; подъязычного; эпидурального; спинального;
анального и внутричерепного пути.
25. Способ по п.24, где эффективное количество составляет от 0,5 до 2000 мкг.
26. Способ по п.24 или 25, который охватывает по меньшей мере одно введение в год, например по
меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 6 и по меньшей мере 12 введений в год.
27. Способ по п.21, где представление аналога иммунной системе осуществляется путем введения
нуклеиновой(-ых) кислоты(-т), кодирующей(-их) аналог, в клетки животных и путем достижения таким
образом экспрессии in vivo клетками введенной(-ых) нуклеиновой(-ых) кислоты(-т).
28. Способ по п.27, где введенная(-ые) нуклеиновая(-ые) кислота(-ы) выбрана(-ы) из голой ДНК,
ДНК, объединенной в композицию с заряженными или незаряженными липидами, ДНК, введенной в
липосомы, ДНК, встроенной в вирусный вектор, ДНК, объединенной в композицию с облегчающим
трансфекцию белком или полипептидом, ДНК, объединенной в композицию с направленным белком или
полипептидом, ДНК, объединенной в композицию с преципитирующими кальций средствами, ДНК, связанной с молекулой инертного носителя, ДНК, инкапсулированной в хитин или хитозан, и ДНК, объединенной в композицию с адъювантом, таким как адъюванты по п.23.
29. Способ по п.35 или 36, где нуклеиновые кислоты вводят внутриартериально, внутривенно или
путями по п.24.
- 125 -
007810
30. Способ по любому из пп.27-29, который охватывает по меньшей мере одно введение нуклеиновых кислот в год, например по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере
6 и по меньшей мере 12 введений в год.
31. Способ по п.21, где представление иммунной системе осуществляется путем введения непатогенного микроорганизма или вируса, который переносит фрагмент нуклеиновой кислоты, экспрессирующий и кодирующий аналог.
32. Способ по п.31, где вирус представляет собой непатогенный поксвирус, такой как вирус коровьей оспы.
33. Способ по п.31, где микроорганизм представляет собой бактерию.
34. Способ по любому из пп.31-33, где непатогенный микроорганизм или вирус вводят животному
однократно.
35. Композиция для индукции продукции антител против мультимерного белка, причем данная
композиция содержит
иммуногенный аналог по любому из пп.1-17 и
фармацевтически и иммунологически приемлемый носитель, и/или несущее средство, и/или адъювант.
36. Композиция для индукции продукции антител против мультимерного белка, причем данная
композиция содержит
фрагмент нуклеиновой кислоты по п.19 и
фармацевтически и иммунологически приемлемый носитель, и/или несущее средство, и/или адъювант.
37. Композиция по п.35 или 36, где аналог составлен в композицию, как определено в любом из
пп.22 или 23.
38. Способ получения аналога по любому из пп.1-17, причем данный способ охватывает культивирование клетки хозяина, трансформированной фрагментом нуклеиновой кислоты по п.19, в условиях,
которые способствуют экспрессии фрагмента нуклеиновой кислоты по п.19 и последующего получения
аналога из культуры в виде белкового продукта экспрессии.
39. Способ по п.38, где клетка хозяина представляет собой клетку бактериального хозяина.
40. Способ по п.39, где аналог представляет собой растворимый продукт экспрессии.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 126 -