влияние однократного сеанса гипертермии в in vitro на

ВЛИЯНИЕ ОДНОКРАТНОГО СЕАНСА ГИПЕРТЕРМИИ В IN VITRO
НА ЭКСПРЕССИЮ И ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ
НЕКОТОРЫХ МАРКЕРОВ ХИМИОРЕЗИСТЕНТНОСТИ
Р. С. Исмаил-заде, Т.В. Шман, В.П.Савицкий, В.В. Федосенко
ГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии и
гематологии», г. Минск
Ключевые слова: опухолевые клеточные линии, гипертермия, MDR1,
P-gp, апоптоз.
В экспериментах in vitro изучено влияние гипертермии (+42ºС, 120
мин) на экспрессию гена MDR1, а также экспрессию и функциональную
активность кодируемого им белка P-gp в опухолевых клетках линии IM-9 и
резистентной сублинии IM-9/Tax. Результаты экспериментов показали, что
однократная гипертермическая обработка клеток приводит к временному
увеличению уровня экспрессии гена MDR1 как в случае исходной линии IM9, так и в случае линии резистентной к таксотеру IM-9/Tax. Для линии IM-9
после проведения гипертермии наблюдали временное увеличение экспрессии
белка P-gp с тенденцией к нормализации через 40 часов после воздействия,
тогда как функциональная активность после проведения гипертермии
снижалась постоянно. В то же время для линии IM-9/Tax не было выявлено
значительного
влияния
гипертермии
на
уровень
экспрессии
и
функциональной активности P-gp. Установлено повышение уровня апоптоза
клеток исходной линии и ее резистентной сублинии при сочетанном
воздействии гипертеримии и этопозида.
EFFECT OF A SINGLE HYPERTHERMIA TREATMENT ON
EXPRESSION AND FUNCTIONAL ACTIVITY OF SOME DRUG
RESISTANCE MARKERS IN VITRO
R.S. Ismail-zade, T.V. Shman, V.P. Savitski, V.V. Fedosenko
Key words: tumor cell lines, hyperthermia, MDR1 gene, P-gp, apoptosis.
In this study we investigated the influence of hyperthermia on MDR1 gene
expression and P-glycoprotein expression and function in IM-9 cell line and its
resistant to Taxoter subline IM-9/Tax. We found that a single exposure to
hyperthermia (+42ºС, 120 min) temporarily increased the expression level of
MDR1 gene in IM-9 cell line as well as in its resistant subline IM-9/Tax. Pglycoprotein expression level in IM-9 cell line temporarily increased tending to
normalize 40 hours after hyperthermia completion. According to our findings,
functional activity of P-gp in IM-9 cell line after hyperthermia steadily decreases.
We did not register any significant changes in P-gp expression and function after
IM-9/Tax subline exposure to hyperthermia. Combination of hyperthermia with
Etoposide results in elevation of apoptosis level in IM-9 cell line and IM-9/Tax
subline.
. ВВЕДЕНИЕ
В
клинической
онкологии
резистентность
к
противоопухолевым
препаратам является основной причиной неудач в терапии больных со
злокачественными опухолями. Научные данные подтверждают генетическую
детерминированность
химиорезистентности
в
большинстве
случаев.
Присущая опухолевой ткани генетическая нестабильность приводит к
спонтанной генерации химиорезистентного клона вследствие молекулярногенетических изменений [1].
Феномен множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) впервые
был описан в 1983 году Ling V. c соавторами [2]. Механизмы МЛУ могут
быть различными: сниженная аккумуляция цитотоксического агента;
изменения в мишени агента; усиление репарации ДНК и другие. Снижение
внутриклеточной концентрации химиопрепаратов может быть результатом
как изменения проникновения препарата в клетку, так и ускоренное его
выведение из клетки. Актуальным для развития МЛУ является ускоренный
выброс цитостатика из клетки, что связывают со сверхэкспрессией таких
протеинов как P-gp170/MDR1, MRP, LRP [3, 4]. P-гликопротеин (P-gp) – это
170 кДа мембранный гликопротеин, относящийся к семейству ABC (ATPbinding cassette) транспортеров и кодируется геном MDR1 (multidrug
resistance 1) [5,6]. Повышенная экспрессия P-gp помимо снижения
2
внутриклеточной концентрации химиопрепарата может иметь и другой
биологический эффект, так как опухолевая прогрессия и метастазирование
[7]. Некоторые лекарственные препараты (верапамил, циклоспорин) снижают
эффект P-gp in vitro. Однако клинические испытания еще не доказали
целесообразности применения этих препаратов в плане преодоления МЛУ
[8]. В литературе имеются единичные клинические данные о влиянии
гипертермии и химиопрепаратов на экспрессию P-gp [9,10].
Целью нашей работы было изучение влияния гипертермии на
индукцию апоптоза опухолевых клеток, экспрессирующих P-gp; оценка
влияния гипертермии на уровень экспрессии MDR1 гена, экспрессию и
функциональную активность P-gp in vitro.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Клеточные линии. В работе использовали лимфобластоидную
клеточную линию человека IM-9, а также ее резистентные сублинии IM9/Vcr, IM-9/Tax, любезно предоставленные профессором Свирновским А.И.
[11]. Клетки культивировали в среде RPMI-1640 c добавлением 10 % ЭТС,
смеси антибиотиков и L-глутамина во влажной атмосфере 5% СО2 при +37оС.
Определение экспрессии Р-gp170. Экспрессию P-gp определяли с
использованием специфических моноклональных антител (МКА) 17F9,
меченных
FITC
(Becton
Dickinson,
BD)
методом
проточной
цитофлуориметрии на аппарате FACScan (BD). В качестве изотипического
контроля
использовали
моноклональные
антитела
IgG1-FITC.
Анализировали не менее 10000 клеток в каждом образце с использованием
программы CellQuestPro. В связи с низкой плотностью экспрессии P-gp,
дополнительно к определению процента позитивных клеток и интенсивности
экспрессии белка, рассчитывали коэффициент D с помощью теста
Колмогорова-Смирнова. Коэффициент отражает различия в распределении
по
интенсивности
флуоресценции
клеток,
меченых
изотипическим
контролем и МКА 17F9 [12].
3
Определение
функциональной
активности
Р-gp
170.
Функциональную активность P-gp оценивали по накоплению клетками
липофильного флуоресцентного зонда 5,5',6,6'-тетрахлоро-1,1',3,3'-тетраэтилбензими-дазол-карбоцианина
использованием
иодида
специфического
(JC-1,
Molecular
модулятора
активности
Probes)
с
P-gp
–
циклоспорина А (CsA). Аналогично анализу экспрессии P-gp, статистический
анализ функциональной активности проводили с использованием теста
Колмогорова-Смирнова. Рассчитывали коэффициент D, представляющий
собой величину, отражающую различия в накоплении клетками JC-1 в
присутствии CsA и без него. Высокие значения этого коэффициента
свидетельствуют о повышенной активности P-gp в клетках [13].
Определение экспрессии MDR1 гена методом относительной
количественной ПЦР. Экстракцию тотальной РНК проводили с помощью
коммерческого набора для выделения тотальной РНК Gen Elute Mammalian
Total RNA Miniprep Kit (Sigma). Количество и качество выделенной РНК
определяли с помощью спектрофотометра Gene Quant RNA/DNA Calculator
(GE Healthcare) и электрофореза в агарозном геле. Реакцию обратной
транскрипции выполняли немедленно после выделения РНК с помощью
набора для синтеза кДНК Advantage RT-for-PCR Kit (BD), согласно
протоколу изготовителя. Уровень экспрессии гена MDR1 определялся
методом относительной количественной полимеразной цепной реакции
(ПЦР) в режиме реального времени (iCycler, BioRad), с использованием
клеточной линии IM-9 в качестве контроля и калибратора. Для нормализации
количества кДНК вносимой в реакцию использовался нормальный ген GUS.
Для
расчета
относительного
количества
РНК
исследуемого
гена
использовался метод стандартных разведений. Стандартные кривые для
исследуемого и нормального гена в каждой реакции строились по четырем
10-кратным разведениям кДНК, выделенной из клеточной линии IM-9 до
проведения гипертермии. Амплификация проводилась в конечном объёме
реакционной смеси равном 25 мкл, содержащем кДНК, Platinum Quantitative
4
PCR SuperMix-UDG (Invitrogene, конечная концентрация MgCl2 была
повышена до 4мМ), 300нМ каждого из праймеров и 200нМ TaqMan пробы. В
работе были использованы ранее описанные праймеры и проба для MDR1
[14] и GUS [15].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В качестве модельных клеточных линий нами была выбрана
лимфобластоидная клеточная линия IM-9 и полученные на ее основе
сублинии, резистентные таксотеру IM-9/Tax и винкристину IM-9/Vcr. Эти
сублинии отличаются от родительской по ряду параметров, одним из
которых является повышенная экспрессия гликопротеина P-gp на клеточной
мембране. Различия в экспрессии гликопротеина на клетках родительской и
резистентных сублиний представлены на рисунке 1.
А
1
10 0
10 1
2
10 2
FL1-H
В
1
10 0
10 1
2
FL1-H
10 2
Рисунок 1 - Уровень экспрессии P-gp на клетках клеточных линий IM-9
(A) и IM-9/Tax (В). 1 – интенсивность флуоресценции изотипического
контроля; 2 – интенсивность флуоресценции специфических к антител.
5
Помимо увеличенной экспрессии P-gp сублиния IM-9/Tax также
характеризуется
гликопротеина.
повышенной
Результаты
функциональной
сравнения
активностью
функциональной
этого
активности
гликопротеина на клетках исходной и резистентной сублинии представлены
на рисунке 2. Из рисунка видно, что резистентная сублиния IM-9/Tax в
меньшей степени накапливает субстрат гликопротеина флуоресцентный
краситель JC-1 по сравнению с исходной линией IM-9, что демонстрирует
увеличенную активность P-gp в резистентных к таксотеру клетках.
А
1
10 0
2
10 1
102
FL2-H
10 3
104
103
10 4
В
1
100
2
10 1
10 2
FL2-H
Рисунок 2 - Функциональная активность P-gp клеток клеточных линий IM9 (A) и IM-9/Tax (В).
Функциональную активность клеток определяли в тесте по накоплению
флуоресцентного красителя JC-1 методом проточной цитофлуориметрии.
1 – контроль (неокрашенные клетки); 2 – окрашенные клетки
Таким образом, сублиния IM-9/Tax характеризуется повышенной
экспрессией и функцией P-gp. Результаты количественной ПЦР также
показали, что клетки сублинии IM-9/Tax характеризуются повышенным
уровнем экспрессии гена MDR1, кодирующего этот белок. Аналогично,
6
резистентная к винкристину сублиния IM-9/Vcr также характеризуется
увеличенной
экспрессией
гена
MDR1,
повышенной
экспрессией
и
функциональной активностью гликопротеина P-gp по сравнению с исходной
линией IM-9.
С целью обоснования возможности использования гипертермии для
терапии
опухолей,
характеризующихся
химиорезистентностью,
ассоциированной с увеличенной экспрессией P-gp, мы исследовали уровень
апоптоза, индуцированного гипертермией и этопозидом, на клетках линии
IM-9 и резистентной к винкристину сублинии IM9/Vcr. Для этого клетки
линий IM-9 и IM-9/Vcr инкубировали в двух режимах: при 37 оС и 42оС в
течение двух часов, затем к клеткам добавляли цитостатический препарат
этопозид (5 мкМ) и инкубировали 24 часа, после чего определяли количество
апоптотических клеток. На рисунке 3 представлены результаты исследования
апоптоза,
индуцированного
гипертермией,
этопозидом,
а
также
их
совместным действием.
90
Апоптотические клетки, %
80
70
60
50
40
30
20
10
0
кон
VP-16
кон
37oC
VP-16
42 oC
IM-9
IM-9/Vcr
7
Риcунок 3 - Влияние гипертермии и этопозида на апоптоз опухолевых клеток
Согласно представленным данным гипертермическая обработка клеток
приводит к увеличению количества апоптотических клеток в 4 раза как в
исходной линии IM-9, так и ее резистентном аналоге IM-9/Vcr. Также
установлено повышение уровня апоптоза клеток исходной линии и ее
резистентной сублинии при сочетанном воздействии гипертермии и
этопозида, причем сочетанное воздействие повышенной температуры и
этопозида вызывало дополнительный цитотоксический эффект. Необходимо
отметить, что значимых различий в индукции апоптоза в клетках,
отличающихся
по
степени
наблюдалось.
Таким
химиорезистентность,
резистентности
образом,
на
обусловленная
(IM-9
исследуемых
и
IM-9/Vcr),
клеточных
повышенной
не
моделях
экспрессией
и
функциональной активностью P-gp, не сопровождалась резистентностью
этих
клеток
к
гипертермии.
Усиление
цитотоксического
эффекта
химиопрепаратов с помощью гипертермии было показано на различных
моделях опухолевых клеточных линий. В тоже время некоторые авторы
отмечали
подобный
аддитивный
эффект
только
на
моделях
химиочувствительных клеток и не наблюдали при исследовании клеток с
фенотипом множественной лекарственной резистентности [16]. Однако,
добиться необходимого цитотоксического эффекта в случае резистентных
клеток можно при совместном использовании цитостатиков, гипертермии и
модуляторов активности белков резистентности, например, циклоспорина А
или его аналогов [17].
Известно, что индукция экспрессии MDR1 гена и соответственно P-gp
может быть вызвана различными стрессовыми факторами, в том числе и
тепловым шоком. Таким образом, использование гипертермии в качестве
одного из методов противоопухолевой терапии может иметь побочный
эффект – развитие лекарственной резистентности. Поэтому мы исследовали
8
влияние однократного сеанса гипертермии на уровень экспрессии гена
MDR1, а также экспрессию и функциональную активность P-gp.
Для исследования влияния гипертермии на показатели экспрессии и
функции P-gp клетки подвергали гипертермическому воздействию в течение
2 часов при 42 оС. Анализировали показатели экспрессии гена MDR1,
экспрессии P-gp и его функциональной активности в различные временные
точки: до гипертермии (ГТ), сразу после ГТ (2ч), через 20 часов после ГТ и
через 40 часов после ГТ. На рисунке 4 представлена динамика изменения
уровня экспрессии гена MDR1.
2,6
2,4
Экспрессия MDR1 гена, усл.ед.
Экспрессия MDR1 гена, усл.ед.
2,6
2,2
2
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
до
А
2,4
2,2
2
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
после ГТ после ГТ после ГТ
2ч
20ч
40ч
до
после ГТ 2ч
после ГТ
20ч
после ГТ
40ч
Б
Рисунок 4 - Динамика уровня экспрессии гена MDR1 после проведения
гипертермии (n=3) А – клетки линии IM-9, Б - клетки линии IM-9/Tax.
Согласно представленным данным уровень экспрессии MDR1 гена
возрастает сразу после окончания гипертермии и продолжает увеличиваться
в течение 20 ч, после чего происходит снижение экспрессии гена.
Увеличение экспрессии MDR1 гена в случае исходной линии IM-9 было
более выраженное (2,2 раза) по сравнению с резистентной линией IM-9/Tax
(1,6 раза).
9
На рисунке 5 представлены данные изменения уровня экспрессии P-gp
на поверхности клеточной мембраны после проведения гипертермии.
Данные, полученные для сублинии IM-9/Tax, показывают, что уровень
экспрессии гликопротеина P-gp меняется незначительно после проведения
гипертермии. В целом, наблюдали тенденцию к снижению экспрессии
гликопротеина на поверхности мембраны. Для клеток линии IM-9 показано
незначительное увеличение экспрессии гликопротеина через 2 ч, затем
дальнейшее увеличение (20 ч) и последующее снижение экспрессии P-gp
0,60
Уровень экспрессии P-gp, D
Уровень экспрессии P-gp, D
практически до первоначального уровня.
0,50
0,40
0,30
0,20
0,10
0,00
до
после ГТ после ГТ после ГТ
2ч
20ч
40ч
А
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
до
после ГТ после ГТ после ГТ
2ч
20ч
40ч
Б
Рисунок 5 - Динамика уровня экспрессии гликопротеина P-gp после
проведения гипертермии; А – клетки линии IM-9 (n=3), Б - клетки линии
IM-9/Tax (n=4).
Увеличение экспрессии MDR1 гена в случае исходной линии IM-9
было более выраженное (2,2 раза) по сравнению с резистентной линией IM9/Tax (1,6 раза).
На рисунке 5 представлены данные изменения уровня экспрессии P-gp
на поверхности клеточной мембраны после проведения гипертермии.
Данные, полученные для сублинии IM-9/Tax, показывают, что уровень
экспрессии гликопротеина P-gp меняется незначительно после проведения
гипертермии. В целом, наблюдали тенденцию к снижению экспрессии
10
гликопротеина на поверхности мембраны. Для клеток линии IM-9 показано
незначительное увеличение экспрессии гликопротеина через 2 ч, затем
дальнейшее увеличение (20 ч) и последующее снижение экспрессии P-gp
практически до первоначального уровня. Стоит отметить, что для исходной
линии IM-9 динамики экспрессии гена MDR1 и протеина P-gp совпадают.
Для резистентной сублинии IM-9/Tax динамики экспрессии гена и протеина
не совпадают. На рисунке 6 представлены данные изменения уровня
функциональной активности P-gp после проведения гипертермии.
Функциональная активность, D
Функциональная активность, D
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
до
А
после ГТ
2ч
после ГТ
20ч
после ГТ
40ч
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
до
после ГТ
2ч
после ГТ
20ч
после ГТ
40ч
Б
Рисунок 6 - Динамика функциональной активности гликопротеина P-gp после
проведения гипертермии; А – клетки линии IM-9 (n=3), Б - клетки линии IM9/Tax (n=4).
Данные, полученные для сублинии IM-9/Tax, показывают, что уровень
функциональной активности P-gp меняется незначительно после проведения
гипертермии. В случае c исходной линией IM-9 наблюдали незначительное
снижение функциональной активности P-gp сразу после проведения ГТ,
после чего происходит дальнейшее снижение функции исследуемого
гликопротеина.
11
В литературе имеются неоднозначные данные о влиянии гипертермии
на экспрессию MDR1. Показано, что многократное гипертермическое
воздействие на опухолевые клетки приводит к формированию лекарственной
резистентности [18]. Однако при анализе клинических образцов, полученных
от пациентов с раком прямой кишки до и после гипертермии, не выявлено
увеличение экспрессии гена MDR1 [19].
Таким образом, в результате проведенных нами исследований
установлено, что однократный сеанс гипертермии приводит к временному
увеличению уровня экспрессии гена MDR1 как в случае исходной линии IM9, так и в случае линии резистентной к таксотеру IM-9/Tax. Для линии IM-9
после проведения гипертермии наблюдали временное увеличение экспрессии
белка P-gp с тенденцией к нормализации через 40 часов после воздействия,
тогда как функциональная активность после проведения гипертермии
снижалась постоянно. В то же время для линии IM-9/Tax не было выявлено
значительного
влияния
гипертермии
на
уровень
экспрессии
и
функциональной активности P-gp.
Список использованных источников
1. Coldman, G.H. The genetic origin of drug resistance in neoplasms: implications for
systemic therapy/ G.H. Coldman // Cancer Res. 1984. Vol. 44. P. 3643
2. Multidrug resistant phenotype in Chinese hamster ovary cells / V. Ling [et al.] // Cancer
Treat Rep. 1983.Vol.67. P.866
3. Moscow, G.A. Multidrug resistance / G.A Moscow, K.H. Cowan //J. Natl Inst. 1988. Vol.
80. P.14
4. Dalton, W.S. Mechanisms of drug resistance in hematologic malignancies/ W.S. Dalton //
Semin. in Hematology. 1997. Vol. 34. N4. Suppl.5. P. 3-8.
5. Scotto, K.W. Amplification and expression of genes associated with multidrug resistance
in mammalian cells / K.W. Scotto, G.L. Biedler, P.W. Melera //Science. 1986. Vol. 232.
P.751
6. Simon, M. Cell biological mechanisms of multidrug resistance in tumours / M. Simon, M.
Schindler //Proc Natl Acad Sci USA.1994. Vol. 91. P.3497-3504
7. Braddley, G. P-glucoprotein, multidrug resistance and tumor progression/ G. Braddley,
V. Ling //Cancer metastasis Rev. 1994.Vol. 13. P.223
12
8. Dalton, W.S. Is P-glucoprotein a potential target for reversing clinical drug resistance?/
W.S. Dalton // Curr Opin Oncol. 1994. Vol.6. P.595
9. Expression of multidrug resistance genes MVP, MDR1 and MRP1 determined
sequentially before, during and after hyperthermic isolated limb perfusion of soft tissue
sarcoma and melanoma / U. Stein [et al.] // J. Clin Oncol. 2002. V.20. P.3282-92
10. Expression of P-glycoprotein, multidrug resistance-associated protein 1, and lung
resistance-related protein in human soft tissue sarcomas before and after hyperthermic
isolated limb perfusion with tumor necrosis factor-alpha and melphalan / R. Komdeur
[et al.] // Cancer 2001.-Vol.10.-P.1940-1948.
11. Svirnovski, A. Attempts to influence the drug resistance of tumor cells in experimental
system / A. Svirnovski, V. Pasukov // Exp. Oncol. 2005. Vol. 27. P. 43-46.
12. Taylor, B.J. Detection of P-glycoprotein in cell lines and leukemic blasts: failure of select
monoclonal antibodies to detect clinically significant Pgp levels in primary cells/ B.J.
Taylor, D.P. Olson, S.P. Ivy // Leukemia Res. 2001.Vol.25. P.1127-1135.
13. JC-1: a very sensitive fluorescent probe to test P-gp activity in adult acute myeloid
leukemia/ O. Legrand [et al.] // Blood.-2001.-Vol.97.-P.502-508.
14. Evaluation of gene induction of drug-metabolizing enzymes and transporters in primary
culture of human hepatocytes using high-sensitivity real-time reverse transcription PCR /
M. Nishimura [et al.] // Yakugaku Zasshi. 2002. Vol. 122. N.5. P.339-61.
15. Standardization and quality control studies of 'real-time' quantitative reverse
transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease
detection in leukemia - a Europe Against Cancer program / J.Gabert [et al.] // Leukemia.
2003 Vol. 17. N 12 P. 2318-57.
16. Potential interaction between antitubulin agent and temperature: implications for
modulation of multidrug resistance/ C. Dumonet, F. Bodin, Y. Michal // Clin Cancer
Res.1998. Vol. 6. P.1563-1566.
17. Larrivee, B. Modulation of adriamycin cytotoxicity and transport in drug-sensitive and
multidrug-resistant chinese hamster ovary cells by hyperthermia and cyclosporin A / B.
Larrivee, D.A. Averill // Cancer chemother Pharmacol 2000. Vol. 3. P. 219-230.
18. P-glycoprotein is overexpressed and functional in severely heat-shocked hepatoma cells
/ A. Hever-Szabo [et al.] // Anticancer Res.1998.Vol.4 P.3045-3048.
19. Hyperthermia for treatment rectal cancer: evaluation for induction of multidrug
resistance gene (mdr1) expression / U. Stein [et al.] // Int J. Cancer. 1999.Vol. 1. P. 512.
13
Авторы: Р. С. Исмаил-заде,
p/o Лесное, дом 19-160
Т.В. Шман,
г Минск, ул. Лынкова 23г-8
В.П. Савицкий,
г Минск, ул. Богдановича 143-183
В.В. Федосенко
г Минск, ул. Гамарника 3-8
14