РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СИБИРСКОЕ
реклама
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР КЛИНИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ На правах рукописи ЗАЙЦЕВА Наталья Сергеевна МЕХАНИЗМЫ ВЛИЯНИЯ ГИПЕРОСМОТИЧЕСКИХ РАСТВОРОВ ПРЕПАРАТА «РАПАН» НА ПРОЦЕССЫ ПРОЛИФЕРАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВАНИЯ КЕРАТИНОЦИТОВ IN VITRO 14.03.03 – патологическая физиология 03.03.04 – гистология, цитология, клеточная биология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: академик РАН, профессор, доктор медицинских наук Шкурупий Вячеслав Алексеевич Новосибирск 2014 2 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ARE - антиоксидант-респонсивный элемент CFSE - карбоксифлуоресцеин DiOC6 - 3,3′-дигексилоксакарбоцианин йодид DMSО - диметилсульфоксид DHE - дигидроэтидий MTT - бромид 3-(диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолия NAD(P)H - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный NADH - никотинамидадениндинуклеотидфосфат PBS - фосфатно-солевой буфер PI - йодид пропидия (Propidium iodide) TGF - трансформирующий фактор роста TMRM - тетраметилродамин (Tetramethylrhodamine) АФК - активные формы кислорода ИФА - иммуноферментный анализ ГР - гиперосмотический раствор 3 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. 11 Клеточные модели и модели живого эквивалента кожи для изучения кератиноцитов in vitro 1.3. 11 Применение гиперосмотических растворов для лечения хронических воспалительных заболеваний кожи 1.2. 5 Клеточный цикл 1.3.1. Сигналинг клеточного цикла 13 17 17 1.3.2. Влияние гиперосмотического воздействия на клеточный цикл 1.4. 19 Апоптотическая гибель клеток при гиперосмотическом воздействии 1.5. Процесс дифференцирования кератиноцитов 20 23 1.5.1. Маркеры дифференцирования кератиноцитов 25 1.5.2. Процесс аутофагии в кератиноцитах 27 1.6. Цитоскелет клетки и его роль в реализации ответа на гиперосмотическое воздействие 1.7. Адаптация клеток к гиперосмотическому воздействию 1.8. Активные формы кислорода в клетке в физиологическом состоянии и при стрессе 1.9. 30 33 36 Внутриклеточная сигнальная система Nrf2/Keap1/ARE. Участие в стресс-опосредованном ответе и дифференцировании клеток 39 1.10. Роль транскрипционного фактора NF-κB в клетке 44 1.11. Роль цитокинов в формировании эпидермиса 48 Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ 50 Глава 3. СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 58 3.1. Исследование жизнеспособности клеток 58 3.2. Исследование апоптотической и некротической гибели клеток после гиперосмотического воздействия 3.3. Исследование пролиферативной активности и клеточного 59 4 цикла кератиноцитов в ответ на гиперосмотическое воздействие 62 3.4. Исследование процессов дифференцирования кератиноцитов 68 3.5. Исследование особенностей продукции активных форм кислорода кератиноцитами при гиперосмотическом воздействии 75 3.6. Исследование активации сигнальной системы Nrf2/Keap1/ARE в кератиноцитах при гиперосмотическом воздействии 81 3.7. Характеристика актинового и тубулинового цитоскелета кератиноцитов при гиперосмотическом воздействии 88 3.8. Исследование продукции цитокинов ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНО-α, ИЛ-10 и активности транскрипционного фактора NF-κB в ответ на гиперосмотическое воздействие 91 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 98 ВЫВОДЫ 100 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 102 5 ВВЕДЕНИЕ Актуальность работы Кожа образует внешний покров организма, обеспечивая защиту от негативного влияния окружающей среды: дегидратации, механического повреждения, попадания инфекционных агентов, Кроме выполнения защитных функций кожа депонирует кровь, обеспечивает терморегуляцию и газообмен, – т.е. является одним из важнейших факторов поддержания гомеостаза. Кожа состоит из эпидермиса, дермы и гиподермы, образующих единую морфофункциональную систему. Фибробласты дермы и антигенпрезентирующие клетки эпидермиса – клетки Лангерганса – участвуют в процессе пролиферации и дифференцирования кератиноцитов, посредством цитокинов, в первую очередь – факторов роста, а кератиноциты, в свою очередь, способны изменять пролиферативную активность клеток соединительной ткани дермы [Maas-Szabowski N. et al., 1999; Lim C.P. et al., 2009]. В результате обеспечивается сбалансированность структуры и функций эпидермиса и дермы при физиологической и репаративной регенерации. В норме сбалансированные по времени и масштабам процессы пролиферации и последующего дифференцирования кератиноцитов направлены от базального к роговому слою, что обеспечивает формирование эпидермального барьера, главная функция которого состоит в защите внутренней среды организма от нежелательных влияний факторов внешней среды. Ряд распространенных хронических заболеваний кожи, таких как псориаз и атопический дерматит, проявляется формированием стойких очагов патологических высыпаний (локальных воспалительных проявлений). Это приводит к нарушению эпидермального барьера, что связано с чрезмерной активацией пролиферации кератиноцитов, наряду с угнетением их дифференцирования в результате хронического воспаления в дерме [Tschachler E., 2007; Bieber T., Novak N., 2009]. Лечение хронических заболеваний кожи высокоминерализованными природными водами (бальнеотерапия) приводит к уменьшению проявление воспаления, улучшению гидратации рогового слоя и снижению шероховатости эпидермиса [Harari M., et al., 2000; Proksch E., et al., 2005]. 6 В клинике ФГБУ «НЦКЭМ» СО РАМН показана высокая эффективность высокоминерализованных растворов при лечении больных атопическим дерматитом. Применение препарата «Рапан», полученного из рапы озера Малое Островное Краснозерского района Новосибирской области, приводит к снижению интенсивности острых проявлений заболевания и его пролиферативной фазы – акантозов, наряду с активацией дифференцировочных процессов, что приводит к нормализации барьерной функции эпидермиса [Лузгина Н.Г. и др., 2006; Новиков А.И. и др., 2006; Лузгина Н.Г. и др., 2009]. Однако эти исследования носят описательный характер и не затрагивают механизмов, детерминирующих получаемые эффекты. Есть основания полагать, что терапевтические эффекты высокоминерализованных растворов реализуются в результате развития гиперосмотического стресса кератиноцитов. Однако этому явлению посвящены лишь отдельные исследования. Известно, что гиперосмотическое воздействие вызывает резкое повышение концентрации внутриклеточных ионов Ca2+, что сопряжено с торможением пролиферации кератиноцитов [Dascalu A. et al., 2000]. Кроме того, гиперосмотическое воздействие может вызывать дегидратацию клетки, что моделирует процесс обезвоживания эпидермиса на воздухе, и может являться одним из механизмов, запускающих процессы дифференцирования кератиноцитов. В работах in vitro показано, что при обезвоживании клеток под воздействием сорбитола в различных концентрациях усиливается экспрессия ряда кератинов (К1, К10) и других маркеров дифференцирования кератиноцитов, таких как трансглутаминаза-1, инволюкрин и филаггрин [Mammone T. et al., 2007], что свидетельствует о стимулирующем влиянии гиперосмотического воздействия на процессы дифференцирования кератиноцитов. Кроме того, показано, что дифференцирование кератиноцитов может быть связано с активацией процессов генерации активных форм кислорода (АФК) [Chamulitrat W. et al., 2004]. Экзогенное воздействие стрессора может нарушать физиологический окислительно-восстановительный баланс клеток и запускать активацию редокс-чувствительных сигнальных систем, в частности фактора транскрипции Nrf2, обладающего не только гомеостатической, но и дифференцировочной функцией. Так, установлено, что Nrf2, действуя в синергизме с фактором Notch1 [Wakabayashi N. et al., 2010а; Wakabayashi N. et al., 2010b], индуцирует дифференцирование в клетках [Lin H.Y. et al., 2011]. Однако прямая связь редокс-чувствительных сиг- 7 нальных систем в инициации и реализации гиперосмотического стресса не описана в литературе. Другой потенциальной мишенью гиперосмолярных воздействий на клетку являются белки цитоскелета, которые должны подвергаться структурной реорганизации во время гипертонического «сжатия» и приводить к изменению клеточного сигналинга с активацией адаптивного ответа клетки. К примеру, в клетках эндотелия изменение структуры цитоскелета, вызванное механическим давлением на клетки, ассоциирована с продукцией провоспалительных цитокинов и связано с развитием воспалительного ответа клетками [Zampetaki A. et al., 2005]. Реализация позитивных эффектов гиперосмотических растворов может осуществляться различными механизмами, обеспечивающими адаптацию клетки к обезвоживанию и гиперосмотическому стрессированию. Поскольку в естественных условиях утрата воды клетками может колебаться в различных пределах, представляет интерес выяснение механизмов клеточного ответа как в процессах гомеостазирования в норме, так и при патологических состояниях. Понимание этих механизмов, наряду с получением новых фундаментальных данных, в дальнейшем позволит разрабатывать методы направленной модуляции структурно- функционального состояния эпидермального барьера человека. Цель и задачи исследования Целью работы было исследование механизмов гиперосмотического воздействия препарата «Рапан» на кератиноциты и их роль в модуляции процессов пролиферации и дифференцирования в условиях in vitro. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи: 1. Исследовать влияние гиперосмотического воздействия растворов препарата «Рапан» различных концентраций на жизнеспособность кератиноцитов линии HaCaT и их пролиферативную активность. 2. Исследовать индукцию дифференцирования кератиноцитов, различных вариантов клеточной гибели и процессов аутофагии в ответ на гиперосмотическое воздействие. 3. Исследовать продукцию активных форм кислорода и изменение трансмембранного митохондриального потенциала в кератиноцитах при гиперосмотическом воздействии. 8 4. Исследовать активацию редокс-чувствительной сигнальной системы Nrf2/Keap1/ARE в кератиноцитах при гиперосмотическом воздействии. 5. Исследовать влияние гиперосмотического воздействия на реорганизацию цитоскелета кератиноцитов. 6. Исследовать in vitro продукцию цитокинов ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНО-α, ИЛ-10 и активность транскрипционного фактора NF-κB в кератиноцитах в ответ на гиперосмотическое воздействие. Научная новизна работы Впервые установлено, что элиминация кератиноцитов в ответ на гиперосмотическое воздействие растворами препарата «Рапан» осуществляется процессом аутофагии, но не апоптозом. Получены данные о торможении клеточного цикла кератиноцитов в стадии G1/G0 после гиперосмотического воздействия растворами препарата «Рапан», в отличие от классического торможения клеточного цикла в стадиях G2/M в условиях гиперосмотического воздействия. Установлено, что воздействие гиперосмотических растворов препарата «Рапан» на кератиноциты приводит к быстрому усилению продукции АФК и падению трансмембранного митохондриального потенциала, что впервые указывает на прямую связь гиперосмотического и окислительного стресса в кератиноцитах и приводит к активации редокс-чувствительной системы Nrf2/Keap1/ARE в ответ на гиперосмотическое воздействие. Впервые показано, что гиперосмотическое воздействие сопряжено с ингибированием транскрипционного фактора NF-κB. Кроме того, воздействие гиперосмотическими растворами влияет на продукцию ИЛ-6 в кератиноцитах, в зависимости от сроков воздействия на клетки, не оказывая при этом влияния на продукцию ИЛ1β, ФНО-α, ИЛ-10. Научно-практическая значимость работы Полученные результаты могут быть полезны в практике научных исследований, касающихся понимания механизмов влияния гиперосмотических растворов на основные функции жизненного цикла клеток, в частности кератиноцитов: пролиферации (регенерации), дифференцирования и видов клеточной гибели некрозом, апоптозом и, возможно, через механизмы аутофагии. 9 Данные, полученные в проведенных экспериментах, могут быть полезны при преподавании патологической физиологии, по разделам физиология кожи, процессы пролиферации и воспаления, патофизиологии стресса (окислительный стресс, как составляющий элемент ответной реакции организма на стрессирующее воздействие), а также для преподавания в области клеточной биологии в разделе: влияние осмотических воздействий на процессы пролиферации и дифференцирования. Результаты, полученные в диссертационном исследовании, уточняют механизмы позитивных эффектов гиперосмотических растворов, в частности препарата «Рапан», на процессы воспаления в коже, что в значительной степени позволяет отойти от эмпирических подходов в лечении целого ряда заболеваний кожи, характеризующихся хроническим воспалением с выраженным отечным и гиперрегенераторными компонентами в период их обострений. Основные положения, выносимые на защиту 1. Гиперосмотические растворы, в зависимости от их концентраций, продолжительности воздействия, а также физиологического состояния кератиноцитов на момент воздействия (стадия клеточного цикла), способны модулировать основные биологические процессы: пролиферацию, дифференцирование и клеточную гибель, – через механизмы гомеостазирования, включающие процессы окислительного стресса и сигнальные функции АФК, а также активацию редоксчувствительной сигнальной системы Nrf2/Keap1/ARE. 2. Гиперосмотические растворы способны модулировать состояние ци- тоскелета кератиноцитов (актина и тубулина) через активацию малой ГТФазы Rac1, что сопряжено с изменением активности транскрипционного фактора NF-κB, не изменяя продукции цитокинов ИЛ-1β и ФНО-α, ИЛ-10, однако индуцируя изменение продукции ИЛ-6 в зависимости от времени экспозиции гиперосмотического воздействия. Апробация работы Результаты работы представлены и обсуждены на Пятой Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторноприспособительных процессов» 12-14 апреля 2011, г. Новосибирск; на Шестой Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» 16-17 апреля 2013, г. Новосибирск. 10 Публикации По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России для публикации материалов диссертационных исследований. Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, 3 глав, включающих обзор литературы, описание материала и методов исследования, изложения собственных результатов и их обсуждения, заключения; выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 272 источника (15 отечественных и 257 зарубежных). Материалы диссертации изложены на 122 страницах машинописного текста и иллюстрированы 28 рисунками. Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (Соглашение № 8788), с использованием оборудования ЦКП «Современные оптические системы». Благодарности. Автор благодарит своего научного руководителя д.м.н., академика РАН Шкурупия В.А. за помощь в написании работы и ценные советы. Кроме того, автор выражает свою глубочайшую благодарность всему коллективу лаборатории молекулярных механизмов физиологии и патологии клетки, в особенности Чечушкову А.В. и Кожину П.М. за помощь на всех этапах работы и моральную поддержку. 11 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Применение гиперосмотических растворов для лечения хронических воспалительных заболеваний кожи Лечение хронических воспалительных заболеваний кожи с использованием стероидов, антигистаминных препаратов, иммуносупрессантов хорошо исследовано. Однако такая терапия имеет множество побочных эффектов и ограниченную терапевтическую эффективность при продолжительном лечении [Fisher D.A., 1995; Abramovits W., Perlmutter A., 2006]. При этом эффективность бальнеотерапии с применением высокоминерализированных вод при ряде воспалительных заболеваний кожи продемонстрирована во многих работах [Boer J. et al., 1982; Denda M., et al., 1999; Denda M. et al., 2003; Goldman M.P. et al., 2007]. Результаты бальнеотерапии с использованием гиперосмотических растворов солей Мертвого моря демонстрируют высокую эффективность при лечении больных атопическим дерматитом [Harari M. et al., 2000]. В результате бальнеотерапии улучшались барьерные функции эпидермиса, увеличивалась гидратация рогового слоя, уменьшалась шероховатость эпидермиса и проявления воспаления [Proksch E. et al., 2005]. Выраженность положительных эффектов увеличивалась при одновременном воздействии растворов различных солей [Denda M. et al., 1999; Matz H. et al., 2003]. Разбавленный солевой концентрат из воды Мертвого моря и растворы солей (хлориды и бромиды натрия, калия, магния) обратимо ингибировали клеточную пролиферацию в культуре кератиноцитов [Shani J. et al., 1987]. Бромиды оказывали более выраженный ингибирующий эффект, чем хлориды, а соли калия были более эффективными, чем соли натрия и магния, но эффект бромида и хлорида магния был более продолжительным [Levi-Schaffer F. et al., 1996]. При воздействии водных высокоминерализованных растворов наблюдали снижение количества активированных Т-лимфоцитов в эпидермисе и дерме, снижение экспрессии кератиноцитами комплексов гистосовместимости второго типа, уменьшение количества клеток Лангерганса [Gruner S. et al., 1990]. В экспериментальных моделях in vitro, моделирующих воспалительные заболевания в коже, показано снижение продукции провоспалительных цитокинов кератиноцитами в ответ на действие высокоминерализованными водами [Lee H.P. et al., 2012]. 12 Гистологические изменения в коже под воздействием высокоминерализованных вод включали снижение толщины мальпигиева слоя, уменьшение гиперплазии кератиноцитов. Клеточная пролиферация сохранялась только в базальном слое, нормализовалась экспрессия кератина-16 [Hodak E. et al., 2003]. Схожими эффектами обладало воздействие глубоководной морской воды [Bak J.P. et al., 2012]. Близкой по составу к воде Мертвого моря является высокоминерализованная рапа озера Малое Островное, Краснозерского района Новосибирской области, применяемая в виде стандартизованного продукта «Рапан» (производство СИБТЕХВАС, г. Новосибирск). По ионно-солевому составу рапа этого озера – сульфатно-хлоридная, натриево-магниевая с минерализацией 182,8 г/дм3 и щелочной реакцией среды (рН 7,9-8,5). Согласно бальнеологическому заключению Томского НИИ курортологии, она отнесена к 8 бальнеологической группе минеральных вод, предназначенных для наружного применения. После курса лечения препаратом «Рапан» в течение 6 недель у больных атопическим дерматитом наблюдали полный или значительный регресс кожных высыпаний. При гистологическом исследовании биоптатов, взятых у больных после лечения, морфологическая картина соответствовала стадии затухающего обострения или ремиссии. Участки спонгиоза были единичными или вовсе отсутствовали, явлений отека почти не наблюдали. Количество инфильтратов значительно снижалось, они присутствовали преимущественно в сосочковом слое дермы. Состав инфильтратов соответствовал продуктивной стадии воспаления. Наблюдали снижение количества лимфоцитов и увеличение количества фибробластов. Тучные клетки были единичными и без признаков дегрануляции. Очаги фиброза присутствовали чаще в сосочковом слое, ближе к базальной пластинке эпидермиса. Акантоз соответствовал слабой степени выраженности с единичными митозами в базальном слое [Лузгина Н.Г. и др., 2006; Новиков А.И. и др., 2006] Обсуждая позитивные эффекты природных вод на организм человека, выделяют общие и местные реакции, развивающиеся в коже. Полагают, что воздействие гиперосмотических растворов оказывает влияние на экстерорецепторы кожи, что влечет за собой активацию каскада нейрорефлекторных, эндокринных, иммунных реакций, которые и формируют, в конечном счете, противовоспалительные мест- 13 ные и системные эффекты бальнеопроцедур [Зеленецкая В.С., Андреев С.В., 1992; Давыдова О.Б. и др., 2002; Matz H. et al., 2003]. Выделяют два основных фактора модуляции функционального статуса клеток кожи, определяющих позитивные эффекты применения высокоминерализованных растворов: фактор осмолярности и фактор качественного минерального состава воды. Так, положительные эффекты воды Мертвого моря связывают с высокой осмолярностью и повышенным содержанием солей магния [Greiner J., Diezel W., 1990; Levi-Schaffer F. et al., 1996], а позитивные эффекты йодобромных вод – с высоким содержанием ионов йода и брома, способных проникать в организм человека и оказывать гуморальные эффекты [Дацковский Я. С., 2002]. Вместе с тем, сопоставимые клинические эффекты (в виде преимущественного влияния на продуктивную фазу воспалительного процесса в коже) различных по минеральному составу высококонцентрированных природных вод предполагают и единые (сопоставимые, вероятно, неспецифические) механизмы их формирования. Единственным параметром, объединяющим высокоминерализованные воды различных природных источников по достигаемым результатам лечения, является высокая осмолярность растворов, по-видимому, играющая ключевую роль в формировании позитивных эффектов у больных с хроническими заболеваниями кожи и, в частности, больных атопическим дерматитом. Однако патогенетические механизмы развития этих эффектов требуют дальнейшего изучения. Для исследования различных клеточных процессов и механизмов их реализации удобным является использование клеточных моделей in vitro, поскольку in vivo исследования такого рода позволяют судить о них только опосредованно, что не дает корректных выводов с учетом центральных системных механизмов регуляции ответной реакции (воспаления) на нетравматическое повреждение кожи и её клеток при ряде заболеваний. 1.2 Клеточные модели и модели живого эквивалента кожи для изучения кератиноцитов in vitro Эпидермис – самый верхний, наружный слой кожи представлен многослойным плоским ороговевающим эпителием, состоящим из кератиноцитов. Кератиноциты плотно связаны между собой десмосомами и содержат кератиновые филаменты. В эпидермисе в более глубоком слое находятся немногочисленные мелано- 14 циты, внутриэпидермальные макрофаги – клетки Лангерганса, а также нейроэндокринные клетки кожи – Клетки Меркеля [Быков В.Л., 1999; Кузнецов С.Л. и др., 2012]. Дерма – средний, соединительнотканный слой, лежащий под эпидермисом, отграничен от него базальной мембраной. Дерма представлена двумя слоями – сосочковым и сетчатым. Сосочковый слой содержит коллагеновые и эластические волокна, между которыми расположены кровеносные сосуды, нервные окончания и клеточные элементы: фибробласты, гистиоциты, тканевые базофилы (в основном вокруг капилляров). Сетчатый слой представлен грубыми коллагеновыми волокнами, фиброцитами, а также клеточными элементами сосочкового слоя, но в меньшем количестве. Нижний слой – гиподерма, или подкожная жировая клетчатка, содержит кровеносные сосуды, нервные окончания, потовые железы и волосяные фолликулы. Она образована соединительнотканными рыхлыми волокнами, между которыми залегают дольки жировой ткани, образованной крупными адипоцитами [Быков В.Л., 1999]. Первые сообщения о культивировании клеток кожи появились еще в 40-х годах. Однако до середины 70-х годов фибробласты соединительной ткани были единственными диплоидными клетками человека, культивируемыми на протяжении многих пассажей. Возможность культивирования эпителиальных клеток, в частности кератиноцитов, появилась в 1975 году, благодаря методике Рейнвальда и Грина [Rheinwald J.G., Green H., 1975a; Rheinwald J.G., Green H., 1975b]. В дальнейшем данная методика заложила основы практического использования клеток кожи в медицинских исследованиях, в частности для моделирования отдельных слоев кожи и для создания цельных живых ее эквивалентов, что нашло применение в трансплантологии [Kirsner R.S., 1998]. Современные «живые эквиваленты кожи» представляют собой тканеинженерные конструкции на основе кератиноцитов, фибробластов и коллагеновой матрицы [Ehrlich H.P., 2004]. Такие модели используют как для изучения морфологических процессов в коже, так и для исследования патологических состояний, например при вирусном инфицировании [Andrei G. et al., 2010]. Одна из первых таких конструкций была предложена в 1983 году: кератиноциты выращивали на поверхности гелеобразного «дермального эквивалента», со- 15 стоявшего из смеси коллагена, плазмы, ростовой среды и фибробластов кожи [Bell E. et al., 1983]. Преимуществом дермального эквивалента является то, что клетки в нем находятся в активном функциональном состоянии, близком к таковому в коже [Bernerd F., 2005]. В США был лицензирован и разрешен к применению в клинической практике первый коммерческий тканевой продукт, состоящий из коллагеновой матрицы и донорских аллогенных фибробластов и кератиноцитов, – Apligraf [Kirsner R.S., 1998; Trent J.F., Kirsner R.S., 1998]. Другой одобренный двуслойный живой эквивалент кожи HSE (кератиноциты на коллагеновом матриксе с живыми фибробластами) с успехом использовался для лечения язв «диабетической стопы» – во всех случаях в течение 12–32 дней была получена 100% эпителизация. Эффект определялся синтезом и выделением живыми клетками импланта 15 различных факторов роста/цитокинов, запускающих процесс регенерации, что было установлено в предварительном лабораторном эксперименте [Brem H. et al., 2003]. Культивирование сложных трехмерных клеточных композиций позволяет изучать процессы репарации и не заменимо в случае трансплантологии. Однако выращивание живых эквивалентов кожи имеет свои особенности и сопряжено с множеством сложностей. Для моделирования эпидермального слоя кератиноциты выделяют из фрагментов донорской кожи, полученных в ходе хирургических косметологических операций. Кератиноциты получают ферментативной обработкой кожи диспазой по методу Рейнвальда и Грина [Rheinwald J.G., Green H., 1975a]. В целом, выделение и культивирование кератиноцитов весьма затратный по времени процесс, кроме того, возникает проблема стандартизации получаемых результатов из-за использования клеток различных доноров (кожа пациентов разного пола, возраста и с различных участков тела). Поэтому для моделирования эпидермального пласта с целью изучения морфофункционального состояния клеток, а также проницаемости эпидермального барьера удобным материалом служат перевиваемые клеточные линии кератиноцитов [Garach-Jehoshua O. et al., 1998; Schoop V.M. et al., 1999]. В качестве моделей кератиноцитов человека in vitro часто используют клеточную линию HaCaT, полученную из спонтанно трансформированных эпители- 16 альных клеток кожи взрослого человека [Boukmap P. et al., 1988]. Клетки линии HaCaT используют для изучения процессов, происходящих в эпидермисе как в физиологическом, так и в патологическом состоянии. Кератиноциты HaCaT сохраняют дифференцировочный потенциал в культуре и в определенных условиях экспрессируют классические маркеры дифференцирования кератиноцитов, такие как цитокератины-1 и -10, инволюкрин и филаггрин [Boukmap P. et al., 1988; Micallef L. et al., 2009]. Клеточная линия HaCaT является удобной моделью для изучения не только дифференцирования кератиноцитов, но и пролиферативных процессов, а также апоптотической гибели клеток [Micallef L. et al., 2009; Yang H.B. et al., 2014]. Клетки данной линии способны полноценно дифференцироваться и образовывать многорядные упорядоченные пласты. Это свойство делает их удобной модельной системой для изучения процессов формирования эпидермального пласта [Schoop V.M. et al., 1999] и даже для формирования эпидермиса при пересадке [Breitkreutz D. et al., 1998]. Кроме того, кератиноциты HaCaT используют и в качестве модели воспалительных заболеваний в коже, изучая особенности продукции цитокинов [Lee H.P. et al., 2012]. После формирования плотного монослоя в кератиноцитах линии HaCaT усиливается экспрессия белков, характерных для верхних слоев эпидермиса [Ryle C.M. et al., 1989; Kato M. et al., 1995; Garach-Jehoshua O. et al., 1998]. Так, если принять во внимание распространенную теорию возникновения жизни в водных бассейнах различной осмотической концентрации в условиях жесткого воздействия ультрафиолетовых лучей, образования активных форм кислорода и прочих стрессоров, то можно полагать, что важнейшими факторами естественного отбора были механизмы поддержания внутриклеточного гомеостаза, предполагающие приспособление к средам различной осмотической концентрации. Эти механизмы закреплены в геноме клеток современных организмов в большей или меньшей степени в функции регулирования внутриклеточных сигнальных систем. На наш взгляд, в наибольшей степени «близость» к «праклеткам» сохранили макрофаги и кератиноциты. Для понимания механизмов действия гиперосмотических растворов, в частности растворов препарата «Рапан», на кератиноциты человека необходим многосторонний взгляд на проблему, с исследованием фундаментальных клеточных процессов и работы различных сигнальных систем клетки. 17 1.3 Клеточный цикл 1.3.1 Сигналинг клеточного цикла Сигналы, индуцирующие клеточное деление, многообразны и запускают большое количество внутриклеточных сигнальных каскадов [Uhlmann F. et al., 2011; Becker W., 2012; Fisher D. et al., 2012]. В ответ на стимуляцию ростовыми факторами и митогенами в клетке активируются три главных пути сигнальной трансдукции: 1. Сигнальные пути, функционирующие по типу митоген-активируемых протеинкиназ (MAPK). MAPK – сборная группа белков, включающая три небольших семейства протеинкиназ: p38, JNK/SAPK (c-Jun N-terminal kinase/Stressactivated protein kinase) и ERK (Extracellular signal-regulated kinase). В большинстве случаев активация протеинкиназ семейства ERK связана с жизнедеятельностью клетки и стимуляцией пролиферации, а активация протеинкиназ семейств р38 и JNK – с индукцией апоптоза, причем конечная киназа в этом каскаде фосфорилирует множество субстратов [Fisher D. et al., 2012], контролирующих транскрипцию, клеточный цикл или перестройку цитоскелета [Xia Z. et al., 1995]. 2. Семейство протеинкиназ C (Protein kinase C, PKC), состоит из нескольких фосфолипид-зависимых протеинкиназ. PKC регулируются множеством метаболических параметров, важнейшими из которых являются фосфолипиды и кальций внутри клетки. Главным регулятором PKC является диацилглицерол (DAG), благодаря которому PKC активируются в комплексах на внутренней поверхности цитоплазматической мембраны клетки. Активированные PKC потенциально могут фосфорилировать множество внутриклеточных субстратов, регулирующих пролиферацию и дифференцирование. Какой из ответов будет реализован в клетке, зависит от типа мишеней PKC, доступных в данной клетке [Kaibuchi K. et al., 1985; Vermeulen K. et al., 2003]. 3. Путь JAK/STAT (Janus kinase/signal transducers and activators of transcription) активируется в результате взаимодействия цитокинов с представителями суперсемейства цитокиновых рецепторов. Эти рецепторы не содержат протеинкиназных доменов, но в результате взаимодействия с лигандом претерпевают конформационные изменения, в результате которых образуют комплексы с JAKбелками. Последние, оказавшись в комплексе с рецептором, фосфорилируют друг 18 друга и, далее, становясь активными киназами, фосфорилируют белки семейства STAT, которые транслоцируются в ядро и модулируют транскрипцию генов, отвечающих за дифференцировку клеток [Goldsby R. et al., 2003]. После получения сигнала, запускающего деление, клетка вступает в активную фазу клеточного цикла, которую разделяют на 4 фазы: 1. G1-фаза, в ходе которой клетка готовится к синтезу ДНК. В конце этой стадии клетка проходит специальную «проверку» на готовность к синтезу (точка рестрикции), в случае успешности которой клетка переходит в следующую стадию. 2. В ходе S-фазы происходит синтез ДНК и удвоение генома. 3. В ходе G2-фазы клетка готовится к делению и производит «проверку» синтезированной ДНК с помощью ферментов репарации. 4. В ходе М-фазы клетки подвергаются делению митозом или мейозом. Полученные в результате деления дочерние клетки входят в G1- или G0-фазу. Переход от одной стадии к другой контролируется группой циклинзависимых киназ (CDK). Они фосфорилируют клеточные субстраты, ответственные за переход в каждую фазу клеточного цикла. CDK активируются при связывании с белками, циклинами, уровень экспрессии которых изменяется в различных фазах клеточного цикла. Такое связывание приводит к активации CDK посредством фосфорилирования или дефосфорилирования [Pines J., 1994; Fisher D. et al., 2012]. Скорость деления клеток и клеточного цикла регулируется очень строго, что необходимо для нормального роста, дифференцирования и обновления тканей. Кроме циклин-зависимых киназ за переходы между фазами клеточного цикла ответственны ряд других циклинов. Циклины D-типа – первые циклины, реагирующие в ответ на внешние факторы. Их уровень низок в G1, но возрастает к моменту перехода G1/S, далее медленно снижаясь на протяжении всего клеточного цикла [Matsuhime H. et al., 1992]. Циклин D активирует CDK4 и CDK6. В переходе G1/S возрастает уровень циклина E, который в начале S-фазы быстро деградирует. Этот циклин регулирует CDK2 и CDK3. В начале S-фазы нарастает уровень циклина А, который активирует CDK2. Предполагается, что комплекс циклин A/CDK2 принимает непосредственное участие в репликации ДНК [Bell S.P., Dutta A., 2002]. В ходе митоза главную регуля- 19 торную роль берет на себя циклин B, который в комплексе с CDK2 образует MPF (M-phase/maturation promoting factor). В ходе анафазы циклин B деградирует, что позволяет клетке перейти из митоза в G1. Таким образом, регуляция клеточного цикла – процесс сложный и многоступенчатый, включающий активацию различных сигнальных путей и вовлекающий множество посредников. Влияние на клетку стрессирующих факторов и изменение клеточного гомеостаза может приводить к изменению динамики клеточного цикла, что играет важную роль в адаптивной реакции как конкретной клетки, так и клеточной популяции в целом. 1.3.2 Влияние гиперосмотического воздействия на клеточный цикл Способность клетки реагировать на изменение осмотического давления окружающей среды является базовым свойством живых клеток, приобретённым во время длительной эволюции в процессе адаптации. Одной из реакций на гиперосмотическое воздействие является арест клеточного цикла. Остановка клеточного цикла позволяет клетке развить адаптивный ответ и избежать возможных мутаций. В экспериментах с использованием повышенных концентраций NaCl или мочевины показан арест на всех этапах клеточного цикла. Клетки из стадии G1 не могут перейти к репликации ДНК, в S-фазе прекращается репликация ДНК, а в G2-фазе клетка не может перейти к митозу и деления не происходит [Michea L. et al., 2000]. Продолжительность клеточного ареста связана с концентрацией вещества, создающего осмотическое давление, а также со стадией клеточного цикла, во время которой клетка подвергается данному воздействию. К примеру, на клетках почечного эпителия показано, что арест клеточного цикла в стадиях G1 и S продолжается недолго и зависит от активации белка р53, регулирующего клеточный цикл [Dmitrieva N. et al., 2001]. При этом клетки накапливаются преимущественно в G2стадии [Michea L. et al., 2000], а белок р53 принимает участие в запуске апоптоза, вызванного повреждениями ДНК, активацией онкогенов и гипоксией [Vousden K.H. et al., 2000]. Задержка в S-стадии клеточного цикла подразумевает участие ATM/ATR киназ, активирующих р53 [Giono L.E., Manfredi J.J., 2006]. Задержка в G2-стадии зависит от активации стресс-киназы p38 [Dmitrieva N.I. et al., 2002], а также наблюда- 20 ется при УФ-облучении [Bulavin D.V. et al., 2001]. Стресс-активируемая киназа р38 запускает каскад активации транскрипционных факторов, таких как ATF2 и MEF2C, играющих важнейшую роль в пролиферативных процессах, наряду с c-Jun киназой и белком р53 [Garrington T.P., Johnson G.L., 1999]. Для выхода из ареста клеточного цикла клетка должна адаптироваться к новым условиям. В случае эффективной адаптации клеточный цикл восстанавливается, и клетка продолжает пролиферировать. Скорость развития адаптивной реакции напрямую связана с осмолярностью. К примеру, в экспериментах с повышением концентрации NaCl до 400-500 мосмоль/л H2O пролиферация поддерживалась на таком же уровне, как в случае 300 мосмоль/л H2O, соответствующему физиологическому осмотическому давлению на клетку, однако пролиферация тормозилась при последующем повышении концентрации [Michea L. et al., 2000]. Торможение клеточного цикла, вызываемого мочевиной, имеет схожий характер [Irarrazabal C.E. et al., 2004]. Таким образом, изменения осмотической концентрации (осмолярности) окружающей среды, независимо от осмолита, приводит к торможению клеточного цикла на разных стадиях, чаще всего в стадии G2 [Dmitrieva N.I. et al., 2002]. Применяя гиперосмотическое воздействие на клетки, можно модулировать фундаментальные процессы, детерминирующие скорость пролиферации клеточной популяции и, возможно, дифференцирование клеток, а также процессы клеточной гибели. 1.4 Апоптотическая гибель клеток при гиперосмотическом воздействии При достижении определенного осмотического давления в окружающей среде происходит массовая гибель клеток путем апоптоза вследствие неспособности развить адаптивный ответ [Wang L. et al., 2011]. Данный процесс может занимать достаточно долгое время в зависимости от механизмов индукции апоптоза и характеризуется последовательными внутриклеточными событиями, отражающими прогрессию апоптоза [Henseleit U. et al., 1996; Mitra R.S. et al., 1997; Gniadecki R. et al., 1997; Galvez A. et al., 2001]. Стоит отметить, что критический уровень гиперосмотического воздействия не одинаков среди разных типов клеток. Так, к примеру, для клеток линии mIMCD3 летальным уровнем является осмотическая концентрация 700 мосмоль/л H2O при добавлении NaCl, а для клеток HeLa – 900 мосмоль/л H2O [Michea L. et al., 21 2002]. Происходит быстрая деполяризация митохондрий, снижение соотношение Bcl2/Bax белков и истощение митохондриальной АТФ. В клетках роговицы индукция апоптоза происходит при осмотической концентрации 500 мосмоль/л H2O [Wang L. et al., 2011]. Гибнущие клетки демонстрируют классические признаки апоптоза: конденсация хроматина, фрагментация ДНК, появление апоптотических телец [Michea L. et al., 2000; Galvez A., et al. 2001]. Апоптотическая гибель кератиноцитов является одним из вариантов ответа на повреждение клеток или изменения функционального статуса клетки в норме и при патологии и служит для элиминации таких клеток из популяции [Polakowska R.R., Haake A.R., 1994; Keep O. et al., 2011]. Гибель кератиноцитов путем апоптоза является критической точкой в балансе процессов пролиферации, дифференцирования и образования рогового слоя в коже. Кроме того, апоптоз кератиноцитов служит важнейшим защитным механизмом в коже, устраняя клетки с мутациями, которые неизбежно накапливаются в результате воздействия ультрафиолетовых лучей и окислительного стресса [Raj D. et al., 2006]. Выделяют два основных сигнальных пути реализации апоптоза: внутренний митохондриальный путь [Bernardi P. et al., 1999; Matsuyama S., Reed J.C., 2000; Mammucari C., Rizzuto R., 2010] и внешний рецептор-опосредованный путь [Jin Z., El-Deiry W.S., 2005; Sayers T.J., 2011]. Митохондриальный сигнальный путь апоптоза реализуется в результате выхода апоптогенных белков из межмембранного пространства митохондрий в цитоплазму клетки. Этот процесс может осуществляться двумя путями: за счёт разрыва митохондриальной мембраны или вследствие открытия высокопроницаемых каналов на внешней мембране митохондрий [Гордеева А. В. и др., 2004]. Разрыв внешней мембраны митохондрий объясняется увеличением объема митохондриального матрикса. Данный процесс связан с раскрытием пор митохондриальной мембраны, приводящим к снижению мембранного потенциала и набуханию митохондрий вследствие осмотического дисбаланса [Гордеева А. В. и др., 2004; Mammucari C., Rizzuto R., 2010]. Раскрытие пор стимулируют следующие факторы: неорганический фосфат; каспазы; SH-реагенты; истощение клеток восстановленным глутатионом; образование активных форм кислорода; разобщение окислительного фосфорилирования протонофорными соединениями; увеличение содержания Ca2+ в цито- 22 плазме; воздействие церамидов; истощение митохондриальной АТФ и др. [Гордеева А. В. и др., 2004]. Наряду со специфически апоптозными белками, в цитоплазму выходит цитохром С. Там он связывается с Apaf1 (apoptotic protease activating factor 1) и формирует апоптосомный комплекс, инициирующий активацию каспазного каскада. В итоге происходит олигомеризация 7 субъединиц трансформированного белка Apaf1 с участием цитохрома С и прокаспазы-9 [Chandra J. et al., 2000]. Так образуется апоптосома, активирующая каспазу-9. Высвобождающийся из межмембранного пространства митохондрий флавопротеин AIF является эффектором апоптоза, действующим независимо от каспаз [Susin S.A. et al., 1999]. Рецептор-зависимый сигнальный путь начинается с активации на плазматической мембране сигнальных комплексов «индуцирующих смерть». Эти комплексы образуются при воздействии, а в дальнейшем при взаимодействии определенных внеклеточных лигандов, например Fas или TNF (tumor necrosis factor) с белками семейства рецепторов фактора некроза опухолей (TNFR) [Oleinick N.L. et al., 2002]. При связывании лигандов они активируют каспазу-8, образуя сигнальный комплекс, содержащий «рецептор смерти», адаптеры TRADD (TNFR1-associated protein with death domain) или FADD (Fas-associated protein with death domain) и профермент каспазы-8 [Diker-Cohen T. et al., 2003]. Активированная каспаза-8 высвобождается в цитоплазму и там инициирует протеазный каскад, активирующий эффекторные каспазы, в частности и каспазу 3 [Hirata H. et al., 1998; Sayers T.J., 2011], которая служит точкой пересечения рецепторного и митохондриального путей активации каспаз [Гордеева А. В. и др., 2004]. Существует доказательство того, что в условиях гиперосмотического стресса могут реализовываться оба пути апоптотической гибели клеток. В пользу внутреннего, митохондриального пути апоптоза в ответ на гиперосмотическое воздействие свидетельствует то, что оно приводит к митохондриальной дисфункции. Это было показано на клетках 3Т3 и Jurkat при воздействии сорбитолом [Desai B.N. et al., 2002]. В пользу внешнего, рецепторного пути свидетельствуют данные, полученные на клетках HeLa, в которых наблюдалась кластеризация и интернализация рецепторов к ФНОа при воздействии сорбитолом 900 мосмоль/л H2O [Rosette C., Karin M., 1996]. 23 Стоит отметить связь апоптоза и уменьшения клеточного объема в результате гиперосмотического воздействия. Уменьшение клеточного объема является ранним событием, предшествующему выходу цитохрома С и клеточной фрагментации [Okada Y. et al., 2001]. Торможение уменьшения клеточного объема предотвращает апоптоз [Maeno E. et al., 2000]. Во время гиперосмотического «сжатия» первоначальной реакцией клетки является активация процессов, направленных на возвращение к нормальному объему. Происходит активация аквапоринов и ионных переносчиков, во время которой вода и электролиты поступают в клетку, регулируя ее объем [Wehner F. et al., 2003]. Если процессы транспорта ионов и воды не скомпенсированы, то происходит инициация апоптотических событий, что показано на Т-лимфоцитах [Bortner C.D., Cidlowski J.A., 1996; Bortner C.D., Cidlowski J.A., 1998]. Также связь между клеточным сжатием после гиперосмотического воздействия и последующей индукцией апоптоза показана на клетках HeLa и клетках почечных канальцев [Wu K.L. et al., 2003; Maeno E. et al., 2006]. В том случае, если после «сжатия» клеток в ответ на гиперосмос не происходит восстановление ее нормального объема, апоптотические события реализуются в течение нескольких часов [Michea L. et al., 2002; Friis M.B. et al., 2005; Maeno E. et al., 2006]. Таким образом, гиперосмотическое воздействие может являться индуктором апоптоза в различных типах клеток для элиминации поврежденных клеток из популяции. Примечательно, что после кратковременного гиперосмотического воздействия концентрациями, вызывающими апоптоз при длительной экспозиции, происходит возвращение клеток к нормальному функционированию [Friis M.B. et al., 2005]. 1.5 Процесс дифференцирования кератиноцитов Эпидермис представляет собой сложно организованную быстро обновляющуюся клеточную систему, представленную многослойным плоским ороговевающим эпителием, в котором постоянно происходят обновление и специфическая дифференцировка клеток – кератинизация [Кузнецов С.Л. и др., 2012; Fuchs E., 1990]. В модельных системах in vitro реализуются те же самые процессы [Bachelor M. et al., 2014]. 24 Базальный слой эпидермиса включает стволовые и транзиторные клетки, которые начинают интенсивно дифференцироваться. Процесс дифференцирования кератиноцитов начинается с момента, когда клетки базального слоя выходят из клеточного цикла и теряют способность прикрепляться к базальной мембране. Связь с базальной мембраной происходит за счет экспрессии определенных интегринов [Yurchenco P.D., 2011], таких как α2β1, α3β1, α6β6 и других, входящих в состав гемидесмосом [Watt F.M., Jones P.H., 1993]. Интегрины имеют сайты связывания с актином, таким образом обеспечивая взаимодействие цитоскелета клетки с базальной мембраной и компонентами внеклеточного матрикса [Vasiliev J.M., Gelfand I.M., 1973; Wu X., et al., 2006]. Во время перемещения из базального слоя к ороговевающему в кератиноцитах происходит полная реорганизация цитоскелета и кластеров молекул адгезии. При этом цитоскелет выполняет не только функцию «строительных лесов» клетки и субстрата для «заякоревания» интегриновых рецепторов, а является активным участником эпидермального морфогенеза, сигналинга и формирования эпидермального барьера [Simpson C.L. et al., 2011]. Над базальным слоем располагается второй – остистый слой эпидермиса, в котором клетки соединяются между собой и с находящимися в базальном слое кератиноцитами с помощью многочисленных десмосом [Быков В.Л., 1999; Кузнецов С.Л. и др., 2012]. В их цитоплазме усиливаются синтез промежуточных филаментов – кератина, образование из него тонофиламентов, которые соединяются в пучки – тонофибриллы, образуя прочный каркас цитоскелета, обеспечивающего механическую устойчивость для выполнения барьерной функции [Быков В.Л., 1999]. В цитоплазме также формируются структуры – кератиносомы, или ламеллярные гранулы. Они представляют собой ограниченные мембраной скопления пластин, содержащих липиды (холестеринсульфат, церамиды и др.) [Feingold K., Elias P., 2014] и гидролитические ферменты [Fuchs E., 1990]. Над остистым слоем расположен третий, зернистый слой эпидермиса. Он состоит из 3–4 слоев кератиноцитов, в которых синтезируются различные кератины, филаггрин, инволюкрин, лорикрин и кератолинин. Над зернистым слоем располагается четвертый, блестящий слой эпидермиса. Он образован плоскими кератиноцитами, в которых полностью разрушаются ядро и органеллы. Кератогиалиновые гранулы образуют светопреломляющую массу, состоящую из кератиновых фиб- 25 рилл и аморфного матрикса, включающего филаггрин, более толстым становится слой кератолинина под плазмолеммой, между клетками почти исчезают десмосомы [Быков В.Л., 1999]. Постепенно кератиноциты полностью заполняются продольно расположенными кератиновыми фибриллами, скрепленными между собой аморфным матриксом из филаггрина, при этом дифференцирующиеся клетки смещаются в наружный роговой слой [Кузнецов С.Л. и др., 2012; Fuchs E., 1990]. Такая организованная структура эпидермиса позволяет поддерживать эпидермальный барьер и выполнять защитную функцию организма. 1.5.1 Маркеры дифференцирования кератиноцитов Цитокератины – белки промежуточных филаментов. Они являются удобными маркерами для выявления стадий дифференцирования кератиноцитов [Баринов Э.Ф. и др., 2012]. Цитокератины делятся на кислые и щелочные белки, в различных слоях эпидермиса они всегда экспрессируются парами, специфическими для каждого слоя. В ходе дифференцирования от стволовой клетки базального слоя до ороговевающего слоя кератиноцитов происходит перепрограммирование синтеза цитокератинов с одного типа на другой. По определенному набору цитокератинов можно судить о стадии дифференцирования кератиноцитов [Presland R.B., Dale B.A., 2000]. К примеру, кератиноциты базального слоя экспрессируют цитокератины 5 и 14, кератиноциты шиповатого слоя образуют цитокератины 4 и 13, кератиноциты в состоянии дифференцирования, локализованные в поверхностных слоях эпидермиса (зернистый слой), содержат цитокератин 10 [Баринов Э.Ф. и др., 2012]. Инволюкрин и кератолинин образуют белковый слой под плазмолеммой, защищающий ее от действия гидролитических ферментов кератиносом и лизосом. При этом количество кератиносом в кератиноцитах увеличивается, и они выделяются путем экзоцитоза в межклеточные щели, где содержащиеся в них липиды (церамиды, холестеринсульфат и др.) образуют цементирующее вещество. Затем происходит дезинтеграция мембраны, что сопутствует входу ионов Са 2+ в клетку и активации трансглутаминазы-1 – фермента, необратимо связывающего белки рогового конверта, в результате чего образуется прочная оболочка, окружающая кератиновые волокна [Segre J.A., 2006]. Лорикрин – главный белковый компонент клеточной оболочки терминально дифференцированных эпидермальных клеток, составляет до 80% общей массы 26 белков клеточной оболочки, характеризуется высоким содержанием глицина, серина и цистеина. Лорикрин и инволюкрин ковалентно связаны с плазмолеммой. Лорикрин образует поперечные связи с другими молекулами лорикрина и SPRбелками. Образование всех связей опосредовано трансглутаминазой-1 [Candi E. et al., 2005] Филаггрин – ключевой белок, способствующий дифференцированию роговых чешуек и поддержанию барьерной функции эпидермиса. Филаггрин участвует в агрегации кератиновых тонофиламентов, образуя между ними аморфный матрикс. В ходе дифференцирования клеток зернистого слоя увеличивается количество гранул кератогиалина. Гранулы кератогиалина не окружены мембраной и состоят преимущественно из белка профилаггрина. Профилаггрин подвергается дефосфорилированию и протеолитическому расщеплению на пептиды филаггрина. Филаггрин способствует формированию дисульфидных связей между промежуточными филаментами [Jensen J.M., Proksch E., 2009]. Эпидермальная Ca2+-зависимая трансглутаминаза обусловливает образование поперечных связей между глутамином и лизином разных белковых молекул клеточной оболочки в ходе терминального дифференцирования кератиноцитов. Эпидермальная трансглутаминаза-1 (TGM1) катализирует образование связей между лорикрином и инволюкрином [Segre J.A., 2006]. В качестве маркера пролиферации в коже часто используют ki-67 [Dallaglio K. et al., 2013; Abdou A.G. et al., 2013]. Белок ki-67 это ядерный антиген, связанный с клеточной пролиферацией. Во время интерфазы антиген может быть обнаружен исключительно в ядре, в митозе большая часть белка распределяется по поверхности хромосом. Белок ki-67 присутствует во всех активных фазах клеточного цикла (G1, S, G2 и митоз), но отсутствует в покоящихся клетках находящихся на стадии G0, что делает его удобным маркером для определения пролиферативной активности клеточной популяции [Scholzen T., Gerdes J., 2000]. Процесс дифференцирования кератиноцитов из базальных клеток в ороговевающие чешуйки происходит на протяжении всей жизни клеток, как составная часть эпидермальной регенерации, обеспечивающей непроницаемый эпидермальный барьер [Fuchs E., 1990]. Однако по-прежнему мало изучено, что именно является сигналом к терминальному дифференцированию и формированию эпидер- 27 мального барьера. Одним из возможных сигналов может являться обезвоживание и гиперосмотический стресс. В пользу этой теории свидетельствуют исследования о влиянии гиперосмотического воздействия, вызываемого различными концентрациями сорбитола и дихлорида кальция на кератиноциты in vitro. Показано, что воздействие сорбитолом увеличивает уровни мРНК основных маркеров дифференцирования кератиноцитов, таких как трансглутаминаза-1, инволюкрин, филаггрин, а также кератинов K1 и K10 [Mammone T. et al., 2007]. 1.5.2 Процесс аутофагии в кератиноцитах Дифференцировка кератиноцитов и их превращение в корнеоциты описывается некоторыми авторами как специфический тип клеточной смерти, при котором не происходит элиминации погибших клеток макрофагами, как в случае апоптотической гибели. Процесс дифференцирования кератиноцитов сопровождается элиминацией клеточных органелл и накоплением белков, необходимых для формирования рогового слоя. Активную роль в данном процессе играет аутофагия. Аутофагия – это деградация органелл и цитоплазматического материала, которая происходит при участии внутриклеточных мембранных структур и собственных лизосомальных гидролаз. При аутофагии de novo формируются специализированные структуры – аутофагосомы. Это двумембранные образования, внутри которых помещается клеточный материал (органелла и часть цитозоля), подлежащий разрушению. При слиянии аутофагосом с лизосомами образуются макроаутофаголизосомы, где и происходит расщепление подлежащих уничтожению компонентов клетки [Gozuacik D., Kimchi A., 2004]. Стимулами к запуску процессов аутофагии в клетках являются активные формы кислорода, отсутствие факторов роста, нехватка АТФ или аминокислот, наличие в цитоплазме поврежденных органелл, например митохондрий, пероксисом и т.д., в клеточных культурах процессу аутофагии способствует возникновение монослоя и существование контактного торможения [Kondo Y. et al., 2005]. При нехватке питательных веществ клетка начинает утилизировать часть своих цитозольных белков и органелл с помощью аутофагии. В результате при расщеплении этих компонентов в лизосомах или вакуолях в клетке поддерживается необходимый уровень тех соединений, которые нужны ей для жизнедеятельности. 28 Стоит отметить, что в некоторых случаях аутофагия выступает в роли защитного механизма от апоптотической гибели клеток. Так, показано, что если в раковых клетках после индукции апоптоза запустить процесс аутофагии, происходит отмена апоптотической гибели клетки [Kondo Y. et al., 2005; Aymard E. et al., 2011]. Различают три типа аутофагии: микроаутофагию, макроаутофагию и шаперон-зависимую аутофагию. При микроаутофагии макромолекулы и обломки клеточных мембран просто захватываются лизосомой. Таким путем клетка может переваривать белки при нехватке энергии или строительного материала (например, при голодании). Процессы микроаутофагии происходят и при нормальных условиях и в целом не избирательны. Иногда в ходе микроаутофагии перевариваются и органоиды. Так, у дрожжей описана микроаутофагия пероксисом и частичная микроаутофагия ядер, при которой клетка сохраняет жизнеспособность [Klionsky D.J., 2004]. При макроаутофагии участок цитоплазмы (часто содержащий какие-либо органоиды) окружается мембранным компартментом, похожим на цистерну эндоплазматической сети. В результате этот участок отделяется от остальной цитоплазмы двумя мембранами. Такие двумембранные органеллы, окружающие удаляемые органеллы и цитоплазму, называются аутофагосомами. Аутофагосомы соединяются с лизосомами, образуя аутофаголизосомы, в которых органеллы и остальное содержимое аутофагосом перевариваются. Скорее всего, макроаутофагия также не избирательна, хотя часто подчеркивается, что с помощью нее клетка может избавляться от «отслуживших свой срок» органоидов (митохондрий, рибосом и др.) [Shintani T., Klionsky D.J., 2004]. Макроаутофагия сопровождается существенным увеличением экспрессии белка Beclin1 по сравнению с его уровнем при физиологической аутофагии или аутофагии в культурах клеток, вызванной снижением концентрации питательных веществ [Shimizu S. et al., 2004]. Этот белок является своеобразным переключателем между апоптозом и гибелью клетки путем макроаутофагии, и увеличение его экспрессии отмечается на ранних этапах дифференцирования. Третий тип – шаперон-опосредованная аутофагия. При этом способе происходит направленный транспорт частично денатурировавших белков из цитоплазмы сквозь мембрану лизосомы в ее полость, где они перевариваются. Этот тип аутофа- 29 гии, описанный только для млекопитающих, индуцируется состоянием стресса. Шаперон-опосредованная аутофагия происходит при участии цитоплазматических белков-шаперонов семейства hsc-70, вспомогательных белков и LAMP-2, которые служат мембранным рецептором комплекса шаперона и белка, подлежащего транспорту в лизосому [Huang J., Klionsky D.J., 2007]. При аутофагической гибели деятельность аутофагосом и лизосом ведет к тому, что в клетке перевариваются практически все мембранные органеллы. Активированные нуклеазы фрагментируют ДНК ядра, однако не на олигонуклеосомные фрагменты, как это происходит при апоптозе. Аутофагический тип гибели называют также лизосомной клеточной смертью. Аутофагическая гибель отличается следующими признаками: частичная конденсация хроматина; отсутствие фрагментации ядра и клетки на поздних стадиях гибели; отсутствие деградации ДНК до нуклеосомного уровня; увеличение числа аутофагосом и аутофаголизосом; увеличение лизосомной активности; увеличение протяженности аппарата Гольджи, иногда расширение цистерн эндоплазматического ретикулума; длительная сохранность микротрубочек и промежуточных филаментов; возрастание проницаемости митохондрий; отсутствие активации каспаз. В конечном итоге остается клеточный дебрис – остаток клетки, окруженный плазматической мембраной, который фагоцитируется макрофагами [Shintani T., Klionsky D.J., 2004]. В кератиноцитах in vitro показано, что через несколько часов после индукции дифференцирования в клетках линии HaCaT начинает существенно увеличивается количество аутофагосом [Aymard E. et al., 2011]. В процессе аутофагии происходит быстрая элиминация большей части белков клетки, но одновременно отмечается повышение трансляции тех белков, которые необходимы для приобретения фенотипа дифференцированной клетки. Этот процесс контролируется множеством генов и регуляторных белков и происходит на протяжении нескольких циклов деления клетки [Young A. et al., 2009]. Самые последние этапы такого дифференцирования кератиноцитов сопровождаются сокращением размеров клетки и высвобождением кератина. Таким образом, формируется роговой слой эпидермиса, клетки которого полностью лишены органелл и 30 характеризуются строго детерминированным белковым и липидным составом [Deruy E. et al., 2010; Gosselin K. et al., 2009]. 1.6 Цитоскелет клетки и его роль в реализации ответа на гиперосмотическое воздействие Цитоскелет выполняет массу функций: опорную, транспортную, сигнальную. Обеспечивает сокращение, движение, образование контактов, отростков, структурирование поверхности, участие в иммунном ответе, а также в ответе на стрессирующее воздействие. Цитоскелет представлен тремя типами структурных элементов: актиновые микрофиламенты (актин), микротрубочки и промежуточные филаменты. Все три типа структур представляют собой полимеры, которые постоянно наращивают и теряют субъединицы. Динамическая природа полимеров цитоскелета позволяет осуществлять его реорганизацию, образовывать новые или поддерживать функционирование существующих транспортных путей и других процессов, связанных с нуждами клетки [Jordan M.A., Wilson L., 1998]. Актин является одним из самых распространенных белков в клетке и характеризуется высокой консервативностью своей структуры. В клетке актин представлен двумя формами: мономерный (глобулярный G-актин) и фибриллярный (Fактин). Две эти формы находятся в постоянном динамическом равновесии благодаря процессу полимеризации/деполимеризации актиновых микрофиламентов. Основными участниками в процессе реогранизации актина являются малые G-белки, представленные семейством ГТФаз (Ras, Rac, Rho, Cdc42) [Fukata M. et al., 2003]. Малые ГТФазы участвуют в регуляции активности различных MAPKs (mitogen activated proteinkinase), выполняя важную роль в клеточном делении [Militello R., Colombo M.I., 2013] и передаче сигнала на трехкомпонентный протеинкиназный каскад, в котором Rho ГТФазы RhoA, Rac1 и Cdc42 действуют в трех сигнало-проводящих цепях, регулируя формирование различных актиновых структур: пучков стрессовых волокон, ламеллоподий и филоподий соответственно. Rho ГТФазы воздействуют на разные эффекторы, чтобы инициировать прохождение сигналов. Каждая из этих ГТФаз действует как молекулярный переключатель и может находиться либо в активной ГТФ-форме, либо в неактивной ГДФ-форме. 31 Соотношение форм регулируется вспомогательными белками: факторы обмена гуанозиновых нуклеотидов (GEF) ускоряют замену ГДФ на ГТФ, а ,белкиактиваторы ГТФаз (GAP) увеличивают скорость гидролиза ГТФ Rho ГТФазами [Raftopoulou M., Hall A., 2004]. Перестройка актинового цитоскелета начинается с внешнего сигнала и описывается следующей цепочкой событий: внешний стимул и активация рецепторов на поверхности клетки, активация малых G-белков, активация WASP/Scar, активация комплекса Arp2/3 и инициация образования нового филамента, элонгация [Polland T.D. et al., 2000]. Актиновый цитоскелет является обязательным участником системы регуляции генов, связанных с адгезией, во многих моделях ему отведена роль матрицы для сборки сигнальных молекул. Примером этому служит регуляция каскада ERK (extracellular signal-regulated kinase) и указанных ранее MAPK (mitogen activated proteinkinase). Субстратами MAPK являются также и некоторые цитоскелетные белки, относящиеся к классу промежуточных филаментов [Neidhart S. et al., 2001]. Кроме того, давно известно, что актиновый цитоскелет в клетках является основополагающим участником в опосредовании клеточной подвижности и изменения формы, как раз в связи с работой малых ГТФаз [Mitchinson T.J., Cramer L.P., 1996]. Тубулиновые микротрубочки, подобно актиновым микрофиламентам, полярны. Основной структурный белок микротрубочек – тубулин. Он представляет собой гетеродимер α- и β-тубулина. Гетеродимеры образуют цепочки, называемые протофиламентами, которые собираются в микротрубочки. Основная часть микротрубочек в клетке состоит из 13 протофиламентов. Такое строение микротрубочек позволяет им образовывать достаточно жесткие клеточные структуры, позволяющие противостоять сжатию, в то же время микротрубочки способны легко разрушаться, обеспечивая реорганизацию тубулинового цитоскелета [Nogales E., 2000]. Стоит отметить, что для выполнения динамических функций клетке необходимо участие всех компонентов цитоскелета. Так, актиновый цитоскелет и микротрубочки взаимодействуют двумя способами: в присутствии линкеров, связывающих актин и микротрубочки, а также путем совместного функционирования в процессе обмена сигналами и при работе определенных сигнальных путей. К примеру, сборка микротрубочек сопряжена с активацией малой ГТФазы Rac1, которая, в 32 свою очередь, выключает функцию некоторых белков, дестабилизирующих микротрубочки, – образуется положительная обратная связь [Wittmann T., WatermanStorer C.M., 2004]. Деполимеризация микротрубочек активирует малую ГТФазу RhoA. Таким образом, динамика роста или укорочения микротрубочек активирует работу малых ГТФаз, ответственных за перестройку актинового цитоскелета, поэтому любая реорганизация цитоскелета клетки затрагивает оба эти компонента [Rodriguez O.C. et al., 2003]. Тот факт, что актиновые филаменты зачастую сконцентрированы в кортикальном слое цитоплазмы под мембраной, делает их привлекательными кандидатами на роль посредников между изменением формы и объёма клетки. Регуляцию клеточного объёма часто рассматривают как процесс, управляемый исключительно на уровне плазматической мембраны, посредством деятельности различных систем транспорта. Однако в некоторых работах показано важное участие актинового и тубулинового цитоскелета в этом клеточном процессе [Mills J.W. et al., 1994] Изменения в объеме клетки происходят при различных физиологических и патологических состояниях в результате изменения внутри- или внеклеточной осмотических концентраций. Такие изменения могут быть вызваны транспортом метаболитов и ионов, полимеризацией или деполимеризацией субстратов, воздействием на клетки не изотонической среды [Haussinger D., 1996]. К примеру, гиперосмотическое воздействие NaCl на клетки почечного эпителия вызывает образование микротрубочек de novo [Basham J.C. et al., 2001]. Также в качестве механизма адаптации для поддержания клеточного объема служит координированное взаимодействие актина и актин-связывающих белков с плазматической мембраной, предотвращающее резкое изменение объема клетки [Mills J.W. et al., 1994]. Кроме защитной функции, цитоскелет выступает в качестве датчика объема при осуществлении механотрансдукции, посредством передачи сигналов ионным каналам и транспортным молекулам [Henson J.H., 1999; Predersen S.F. et al., 2001]. В экспериментах по гиперосмотическому стрессированию, вызываемому сахарозой, показано, что данное воздействие индуцирует сборку фибриллярного актина de novo в кортикальном слое клетки. Одновременно происходит периферийная транслокация и солокализация кортактина и актин-связывающего белкового комплекса (белок Arp2/3) [Di Ciano C. et al., 2002], являющегося основным в ини- 33 циации элонгации актинового филамента. Доказано, что малые ГТФазы играют ключевую роль в ремоделировании актинового цитоскелета при гиперосмотическом воздействии, которое вызывает их активацию, способствуя перемещению в кортикальную область и солокализации кортактина с Rac1 [Di Ciano C. et al., 2002]. Кроме поддержания клеточной формы и объёма за счет перераспределения белков цитоскелета во время активации малых ГТФаз происходит запуск многих сигнальных механизмов, затрагивающих активацию стресс киназы р38, а также различных транскрипционных факторов, в том числе и NF-κB, участвующих в регуляции клеточных процессов, таких как пролиферация, апоптоз и продукция многих цитокинов. Известно, что реорганизация цитоскелета в ответ на биомеханическое давление на эндотелиальные клетки сосудов, сопровождающееся активацией малых ГТФаз, приводит к активации продукции целого ряда провоспалительных цитокинов [Zampetaki A. et al., 2005]. Таким образом, ремоделинг цитоскелета клеток лежит в основе запуска адаптивной реакции клетки на воздействия окружающей среды. 1.7 Адаптация клеток к гиперосмотическому воздействию Ранее уже было сказано, что гиперосмотическое воздействие приводит к изменению клеточного объема и «сжатию» клетки, сопровождается увеличением концентрации всех внутриклеточных компонентов, в том числе неорганических ионов и макромолекул. Эти процессы инициируют осморегуляторный ответ. Естественным защитным механизмом клетки являются функции, направленные на восстановление и поддержание нормального объема и выравнивание внутриклеточного осмотического давления [Wehner F. et al., 2003]. Поддержание структуры и объема клетки при гиперосмотическом воздействии достигается за счет активации транспортных каналов [O'Neill W.C., 1999] и усиления экспрессии генов, которые кодируют транспортные белки и осмолитгенерирующие ферменты. Осмолиты – это органические и неорганические молекулы, играющие ведущую роль в регуляции клеточного гомеостаза, ответственные за накопление и удержание воды в клетке [Waldegger S., Lang F., 1998]. Клеточное сжатие вызывает перераспределение актина и актин-связывающих белков, в том числе миозина и кофилина, в кортекс клетки, тем самым обеспечивая физическое сопротивление эффектам осмотического сжатия. Нормальный объем клетки явля- 34 ется важной характеристикой не только для поддержания изотонической внутриклеточной среды и клеточной формы, но и для других процессов, таких как межклеточный транспорт, миграция, пролиферация, дифференцирование, клеточная гибель и регулирование внутриклеточного метаболизма [Lang F. et al., 1989; Lang F. et al., 1998; Wehner F. et al., 2003]. «Пассивным» ответом клетки на изменения изотонических свойств окружающей среды является усиление проницаемости специализированных мембранных белков аквапоринов для воды [Maunsbach A.B. et al., 1997]. Далее происходит активация осмолит-транспортных каналов, обеспечивающих движение неорганических и органических осмолитов через плазматическую мембрану. Основную функцию в поддержании физиологических концентраций неорганических осмолитов в клетке выполняют мембранные транспортные системы: Na+/K+ АТФаза – гетеродимерный интегральный белок, осуществляющий АТФзависимый трансмембранный перенос Na+ и K+, обеспечивая поддержание электрохимического и осмотического градиентов одновалентных ионов; Na+/H+ антипортеры – протонные насосы, отвечающие за поддержание стабильного рН в клетке; и Na+, K+, 2Cl– и K+, Cl– котранспортеры, также ответственные за поддержание внутриклеточного гомеостаза моновалентных ионов [Adragna N.C. et al., 2000]. Долгое время неорганические осмолиты – ионы калия, натрия и хлора – считались основными участниками поддержания нормального клеточного объема, однако в дальнейших исследованиях была установлена важная роль органических осмолитов [Junankar P.R., Kirk K., 2000]. Органические осмолиты – это низкомолекулярные органические соединения, полиолы, например миоинозитол, аминокислоты – таурин, глутамин и β-аланин, и метиламины, такие как глицерофорилхолин и бетаин. Они защищают клетки в условиях стресса путем стабилизации структуры белка [Еронина Т.Б. и др., 2005]. Для этого происходит активация экспрессии специфической транспортной системы осмолитов, включающей транспортер бетаин/гамма-амино-n-бутировой кислоты (betaine/gamma-amino-n-butyric acid), натрийзависимый транспортер миоинозитола и транспортер таурина. В экспериментах на клетках линии HaCaT показано, что после гиперосмотического воздействия сорбитолом добавление к клеткам аминокислот: глицина, саркозина, бетаина, таурина и пролина и их липофильных производных – восстанав- 35 ливает пролиферацию, свидетельствуя об осмопротективном действии этих веществ и активации описанных выше транспортных систем органических осмолитов [Warskulat U. et al., 2004]. Кроме транспортных систем осмолитов в ответ на гиперосмотическое воздействие в клетках усиливается экспрессия определенных стресс-активируемых белков, таких как Gadd45 [Chakravarty D. et al., 2002; Tamura R.E. et al., 2012], p53 и различных белков теплового шока [Sheikh-Hamad D. et al., 1994]. Белки Gadd45 – многофункциональные молекулы, выполняющие важную роль в процессах дифференцирования клеток, апоптоза и репарации ДНК [Tamura R.E. et al., 2012]. Белок р53, играющий ключевую роль при прохождении точек контроля клеточного цикла и репарации ДНК, является самым известным опухолевым супрессором, но у него есть многочисленные дополнительные функции [Sullivan K.D. et al., 2012]. Накоплению и активации р53 способствует ДНК-повреждающие агенты. Известно, что гиперосмотический стресс является частой причиной повреждения ДНК. Поэтому в случае, если после такого повреждения репарации ДНК не происходит, активация р53 индуцирует апоптоз в клетке [Dmitrieva N. et al., 2000]. Белки теплового шока (Hsp) представлены группой высококонсервативных белков, которые экспрессируются конститутивно, либо могут индуцироваться стрессорами [Lanneau D. et al., 2010]. Конститутивная экспрессия Hsp обеспечивает упаковку белков и белковых комплексов, а также устранение неправильно упакованных белков, появление которых возможно при гиперосмотическом воздействии на клетки. Кроме того, работа Hsp предотвращает апоптоз посредством ингибирования JNK киназы и выхода цитохрома С из митохондрий, выполняя дополнительную защитную функцию в клетке [Mosser D.D. et al., 1997]. Развитие адаптивного ответа реализуется через активацию многочисленных механизмов, обеспечивающих выживание клетки в условиях меняющейся окружающей среды и возвращение в состояние гомеостаза. Важную роль в поддержании внутриклеточного гомеостаза выполняет окислительно-восстановительный баланс клетки, зависящий главным образом от эндогенных и экзогенных активных форм кислорода и редокс-чувствительных сигнальных систем [Ткачев В.О. и др., 2011; Sena L.A., Chandel N.S., 2012]. 36 Представляется актуальным решение вопроса о возможной связи гиперосмотического воздействия и изменения концентрации активных форм кислорода в клетках и связи этих процессов с реализацией адаптивных функций клетки. 1.8 Активные формы кислорода в клетке в физиологическом состоянии и при стрессе Повышение уровня активных форм кислорода (АФК) в клетках происходит при стрессирующем действии – гипоксии, голодании, инфекциях [Clanton T.L., 2007; Huet O. et al., 2011], а также при стимуляции факторами роста и цитокинами [Finkel T., 2001]. АФК являются внутриклеточными индикаторами изменения условий окружающей среды. Ранее полагали, что резкое повышение АФК приводит к развитию окислительного стресса и необратимому повреждению клеток. Однако увеличение концентрации АФК в клетках связано не только с патологическими процессами, но и с участием во внутриклеточных сигнальных каскадах [Chandel N. et al., 1998; Finkel T., 1998; Rhee S.G. et al., 2000]. Большая часть активных форм кислорода, образующихся в клетках, образуется из супероксид-аниона, который в свою очередь является продуктом одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода в цепи переноса электронов в митохондриях [Genova M.L. et al., 2004] или NADPH оксидазы на плазматической мембране клеток [Cross A.R., Jones O.T., 1991]. АФК, генерируемые с помощью NADPH, в большей степени выполняют защитную функцию и продуцируются специализированными клетками (нейтрофилами, макрофагами) [Nauseef W.M., 2004], в то время как митохондриальные АФК образуются во всех типах клеток в физиологических условиях [Sena L.A., Chandel N.S., 2012]. Известны восемь сайтов образования супероксид-аниона в митохондриях, но только комплекс III цепи переноса электронов и глицерол-3-фосфат дегидрогеназа продуцируют его в межмембранное пространство митохондрий, откуда он достаточно быстро попадает в цитозоль, тогда как остальные сайты депонируют его в митохондриальном матриксе [Brand M.D., 2010]. Из митохондриального матрикса супероксид-анион высвобождается в цитозоль при помощи потенциал-зависимых анионных каналов, однако существенно медленнее [Lustgarten M.S. et al., 2012]. 37 Супероксид-анион является нестабильной молекулой и либо быстро конвертируется в перекись водорода супероксиддисмутазой SOD1 в цитозоле и межмембранном пространстве митохондрий и SOD2 в митохондриальном матриксе, либо взаимодействует с оксидом азота, образуя пероксинитрит. В связи с этим в физиологических условиях, его содержание в клетке мало [Murphy M.P., 2009]. Перекись водорода более стабильна, свободно проникает через мембраны и легко взаимодействует с низкомолекулярными соединениями, содержащими тиоловые группы, что способствует элиминированию перекиси посредством глутатиона [Bienert G.P. et al., 2006]. Супероксид-анион и перекись водорода обладают самостоятельными сигнальными функциями, которые проявляются при повышении их внутриклеточного содержания в ответ на различные стрессирующие воздействия. Обе молекулы взаимодействуют с тиоловыми группам белков, окисляя их с образованием дисульфидных связей, изменяющих активность белка. Однако константы таких реакций для каждой молекулы различны [Winterbourn C.C., Hampton M.B., 2008]. Так, супероксид-анион наиболее активен по отношению к железо-серным белкам, а перекись водорода может взаимодействовать с каталитическими центрами фосфатаз, обратимо окисляя их, что приводит к ингибированию дефосфорилирующей активности этих белков (в частности, это характерно для MAPK-фосфатаз) [Tonks N.K., 2005]. Уменьшение внутриклеточного содержания АФК происходит как вследствие нейтрализации образовавшихся метаболитов, так и посредством снижения образования новых АФК. Наиболее эффективно перекись водорода элиминируется пероксиредоксинами и системой глутатион/глутаредоксин/глутатионпероксидаза [Калинина Е.В. и др., 2008]. Глутатионпероксидаза также участвует в элиминации липидных гидроперекисей, липидных альдегидов и электрофильных ксенобиотиков. В процессе инактивации АФК низкомолекулярные антиоксиданты и кофакторы ферментов подвергаются окислению, и для поддержания их антиоксидантной функции требуется постоянное сопутствующее восстановление, которое обеспечивается за счет окисления NADPH [Pollak N. et al., 2007]. Такая защитная система очень энергозатратна, поскольку требует большого расхода АТФ для синтеза низкомолекулярных антиоксидантов и их восстановления 38 с помощью NADPH, а также экспрессии белков, элиминирующих АФК и их вторичные продукты. В связи с этим, большой интерес вызывает открытие белков семейства UCP (Uncoupling proteins) [Echtay K.S., 2007], которые активируются в ответ на повышенное образование АФК в митохондриях и вызывают утечку протонов из межмембранного митохондриального пространства. UCP1-3 – это интегральные белки, находящиеся на внутренней митохондриальной мембране. В физиологических условиях они связаны с глутатионом митохондриального матрикса и неактивны. Увеличение продукции АФК приводит к разобщению UCP2 и UCP3 с глутатионом, что активирует их, обеспечивая разрыв дыхательной цепи, утечку протонов и снижение трансмембранного митохондриального потенциала, сопровождающегося снижением продукции АФК. По мере элиминации АФК соответствующими ферментами происходит восстановление пула глутатиона в митохондриальном матриксе, и белки UCP вновь ассоциируются с ним, что приводит к их инактивации и нормализации трансмембранного митохондриального потенциала. В случае, если ферментативные системы не справляются с избыточным количеством АФК и их уровень по-прежнему остается критически высоким, длительная активность белков UCP может привести к коллапсу митохондриального потенциала и апоптотической гибели клетки [Mailloux R.J., Harper M., 2011]. Участие митохондриальных АФК в дифференцировке кератиноцитов было показано на мышах, в эпидермисе которых производили селективное нокаутирование митохондриального транскрипционного фактора TFAM, ответственного за экспрессию генов некоторых белков цепи переноса электронов. Митохондрии таких кератиноцитов не генерируют активные формы кислорода, и эпидермис характеризуется существенной задержкой развития. Добавление экзогенной перекиси водорода к культуре первичных кератиноцитов нокаутированных мышей приводит к экспрессии маркеров дифференцирования кератиноцитов, что доказывает регуляторную роль АФК в данном процессе [Hamanaka R.B. et al., 2013]. Интересно то, что кератиноциты, находящиеся в разном физиологическом состоянии, в частности на разных стадиях дифференцирования, не одинаково реагируют на влияние перекиси водорода. К примеру, показано, что воздействие перекиси водорода на кожный лоскут вызывает индукцию апоптоза в клетках базального и гранулярного слоев эпидермиса (в большей степени базального). В то же вре- 39 мя клетки более дифференцированных слоев не подвергаются апоптогенному воздействию перекиси водорода [Zuliani T. et al., 2005]. Кроме того, известно, что стволовые клетки организма (включая и стволовые клетки кожи) находятся в особых «нишах», обеспечивающих минимальное воздействие АФК, что также указывает на их важную роль в развитии дифференцировочных процессов [Wang K. et al., 2013]. Усиление продукции АФК приводит к повышению активности антиоксидантных систем, которое обеспечивается активацией редокс-чувствительного фактора транскрипции Nrf2 [Ткачев В.О. и др., 2011; Chen X.L., Kunsch C., 2004]. Активация Nrf2 опосредуется деградацией его комплекса с репрессорным белком Keap1 и формированием гетеродимеров с maf-белками, позволяет ему связываться с антиоксидант-респонсивными элементами промоторов генов-мишеней (ARE). Показано, что Nrf2 участвует в процессе дифференцирования кератиноцитов [Piao M.S. et al., 2012]. В нормальном эпидермисе активность этого фактора увеличивается в дифференцирующихся клетках, в направлении от базального слоя к роговому, что, вероятно, предохраняет клетки более низко расположенных слоев эпидермиса от разрушительного воздействия АФК, неизбежно образующихся вследствие контакта эпидермиса c внешней средой. В процессе дифференцирования количество АФК в кератиноцитах увеличивается, что приводит к каскаду сигнальных событий и структурных изменений, необходимых для формирования рогового слоя [Hamanaka R.B. et al., 2013]. Прямая связь гиперосмотического воздействия и окислительного стресса клетки показана на дрожжах. В данных исследованиях обнаружено, что гиперосмотическое воздействие приводит к повышению продукции АФК и окислительному стрессу клеток дрожжей [Pastor M.M. et al., 2009]. Однако упоминания о непосредственной связи этих процессов в клетках млекопитающих отсутствуют в литературе. В то же время известно, что гиперосмотическое воздействие сорбитолом на 3Т3-фибробласты и лимфоцитоподобные клетки линии Jurkat вызывает быструю обратимую потерю протонного градиента у митохондрий и снижение трансмембранного митохондриального потенциала [Desai B.N. et al., 2002], что может быть связано с усилением продукции АФК митохондриями. Поэтому исследование возможной индукции окислительного стресса в ответ на гиперосмотическое воздейст- 40 вие является актуальной задачей. Кроме того, необходимо уделить внимание редокс-чувствительным системам, активирующимся в ответ на усиление продукции АФК. 1.9 Внутриклеточная сигнальная система Nrf2/Keap1/ARE. Участие в стресс-опосредованном ответе и дифференцировании клеток Резкое увеличение продукции АФК требует повышения активности антиоксидантных систем, среди которых важную роль играет система Nrf2/Keap1/ARE. Эта сигнальная система активируется в ответ на увеличение продукции АФК после воздействия различных химических агентов, как экзогенных (экзогенные прооксиданты), так и эндогенных (гемовые комплексы, окисленные липопротеины, активные формы кислорода и азота) [Ткачев В.О. и др., 2011]. Сигнальная система Nrf2/Keap1/ARE инициирует транскрипцию генов, содержащих в своих промоторах последовательность ARE, количество которых может достигать 10% всех активных генов клетки [Cho H.Y. et al., 2005]. Среди генов, транскрипция которых контролируется Nrf2, наиболее важны белки антиоксидантной защиты, такие как NADPH:хинон оксидоредуктаза-1 (NQO1), NRH:хинон оксидоредуктаза-2 (NQO2), глутатион-S-трансфераза (GST) и другие, относящиеся к ферментам второй фазы метаболизма ксенобиотиков [Kaspar J.W. et al., 2009]. Фактор транскрипции Nrf2 конститутивно не активен, поскольку после трансляции связывается репрессорным белком Keap1, отвечающим за его убиквитинирование и деградацию. Активация Nrf2 происходит, когда комплекс с белком Keap1 диссоциирует вследствие конформационных изменений белка Keap1, происходящих при окислении тиоловых групп нескольких остатков цистеина этого белка [Kobayashi A. et al., 2006; Uruno A., Motohashi H., 2011]. Свободный Nrf2 транслоцируется в ядро благодаря наличию в его структуре домена ядерной локализации, после чего связывается с ARE элементами генов-мишеней. По мере разрешения окислительного стресса, или снижения концентрации индукторов, происходит инактивация Nrf2, экспорт из ядра и последующая деградация [Jain A.K. et al., 2005]. Механизм инактивации Nrf2 и экспорта из ядра не вполне ясен. Известно, что диссоциация комплекса Nrf2-Keap1 происходит при помощи белка протимо- 41 зин-α (PTα), который обладает большим, чем Nrf2 сродством к модифицированному электрофилами Keap1. Одновременно с транслокацией Nrf2, в ядро перемещается и комплекс PTα и Keap1 [Niture S.K., Jaiswal A.K., 2009; Khan H. et al., 2013]. В целом, взаимодействие Nrf2 и Keap1, а также других белков, участвующих в активации и инактивации Nrf2, представляет собой динамический процесс, в котором развитие окислительного стресса приводит к быстрой активации Nrf2 и открытию последовательности ARE в генах-мишенях. Устранение окислительного стресса приводит к снижению транскрипционной активности Nrf2 и удалению его из ядра [Jain A.K. et al., 2005]. Кроме индукции генов антиоксидантной защиты транскрипционный фактор Nrf2 активирует транскрипцию генов множества различных по функции белков, включая белки, регулирующие апоптоз, клеточный цикл и дифференцирование [Morito N. et al., 2003; Shelton P., Jaiswal A., 2013], а также ингибирует транскрипцию генов, например подавляя активацию других факторов транскрипции [Jeong W.S. et al., 2004]. Транскрипционный фактор Nrf2, по-видимому, поддерживает баланс между проапоптотическими и антиапоптотическими факторами так, что активация апоптоза замедляется. Так, показано, что Nrf2 изменяет чувствительность клеток к апоптоз-индуцирующим факторам, связанным с окислительным стрессом. Нокаут Nrf2 в Т-лимфоцитах приводит к повышенной чувствительности клеток к Fasиндуцированному апоптозу [Morito N. et al., 2003]. Механизм индукции апоптоза включает активацию перекисью водорода каспазы-8, а также повреждение митохондриальной мембраны, сопровождающееся коллапсом митохондриального потенциала и высвобождением в цитозоль цитохрома C и проапоптотических факторов [Chandra J. et al., 2000]. Защитная роль Nrf2 в случае индукции апоптоза, вероятно, связана с увеличением количества восстановленного глутатиона в клетке в ответ на повышение продукции кислородных радикалов, происходящее в процессе индукции апоптоза через Fas-рецепторы. Повышение количества восстановленного глутатиона в клетке также является механизмом поддержания пролиферации клеток при активации Nrf2. Этот механизм имеет значение для многих типов клеток, в том числе и для 42 опухолевых, в которых аберрантная экспрессия Nrf2 является одним из факторов, обеспечивающих повышение темпов пролиферации [Ohta T. et al., 2008]. Баланс между выживанием клетки и индукцией апоптоза определяется концентрацией АФК в клетке и степенью выраженности окислительного стресса. Так, возможно, белок Keap1 служит не только репрессором транскрипционного фактора Nrf2, но и цитозольным сенсором окислительного стресса, в свободном состоянии закрепляясь на мембранах митохондрий в комплексе с белком PGAM5, который в случае чрезмерного повышения концентрации кислородных радикалов опосредует пермеабилизацию митохондриальной мембраны и начало апоптоза [Stępkowski T.M., Kruszewski M.K., 2011]. В то же время, прямого влияния на индукцию апоптоза или самостоятельного антиапоптотического эффекта Keap1, по всей видимости, не оказывает. Роль Nrf2 в процессе дифференцирования кератиноцитов в норме, возможно, сводится к элиминации активных форм кислорода, образующихся в ходе дифференцирования; также обнаружено усиление экспрессии подконтрольных Nrf2 белков, таких как HO1 и NQO [Piao M.S. et al., 2012]. При этом двойной нокаут Nrf2 не сказывается на развитии кожи или процессах репарации после повреждения [Keller U. et al., 2006]. С другой стороны, повреждение, сопровождающееся образованием большого количества свободных радикалов, вызванное ультрафиолетовым излучением, в гораздо большей степени требует активности Nrf2/Keap1/ARE [Tian F.F. et al., 2011]. В случае избыточности клеточного ответа, в результате постоянной работы сигнальная система Nrf2/Keap1/ARE может запускать каскады патологических реакций. Например, мыши, нокаутные по Keap1, у которых Nrf2 постоянно активен, погибают на ранних сроках после рождения вследствие гиперкератоза пищевода [Wakabayashi N. et al., 2003]. Аналогичные изменения происходят с кератиноцитами кожи. Интересно, что мыши с сохраненной активностью Keap1, но повышенной экспрессией Nrf2 (полученные путем создания соответствующей линии животных или хронической химической индукцией Nrf2) демонстрируют противоположный фенотип. Мыши были жизнеспособны, гиперкератоза пищевода не отмечалось, но отмечался гиперкератоз кожи. У этих животных наблюдалось существенное нарушение барьерной функции кожи, связанной с нарушением продукции межклеточ- 43 ного матрикса [Schäfer M. et al., 2012]. Это наблюдение указывает на косвенную связь между активностью Nrf2, пролиферацией кератиноцитов и их дифференцированностью. В то же время, Nrf2 может непосредственно контролировать процессы пролиферации и дифференцирования. Так одним из генов мишеней Nrf2 является Notch1 – важный регулятор пролиферации и дифференцирования клеток [Hamanaka R.B. et al., 2013]. У мышей с нокаутом Nrf2 происходит нарушение регенерации печени, связанное со снижением экспрессии Notch1 [Wakabayashi N. et al., 2010а]. Возможно, гиперпролиферация кератиноцитов у мышей с нокаутом Keap1 опосредована повышенной экспрессией Notch1 под действием избыточной активации Nrf2. Дефицит транскрипционного фактора Nrf2 не сказывается на гомеостазе кожи и ее структуре [Keller U. et al., 2006], активность системы Nrf2/Keap1/ARE увеличивается в кератиноцитах, последовательно дифференцирующихся от базального слоя к роговому [Piao M.S. et al., 2011]. Клетки базального слоя эпидермиса более чувствительны к апоптозу, индуцированному перекисью водорода, чем клетки зернистого слоя [Zuliani T. et al., 2005], что может быть связано с повышенным уровнем активности Nrf2 в дифференцирующихся клетках [Carr W.J., Oberly-Deegan R.E., 2011]. Отдельного рассмотрения заслуживает вопрос о возможной взаимосвязи цитоскелета и активации сигнальной системы Nrf2/Keap1. Существуют различные точки зрения на процесс активации данной системы: согласно одной из них, репрессорный белок Keap1, обладающий в собственной структуре актин- связывающими мотивами, может «заякоривать» Nrf2 в цитоплазме, механически препятствуя его перемещению в клеточное ядро и взаимодействию с антиоксидантреспонсивным элементом [Kang M.I. et al., 2004]. Согласно другой точке зрения, локализация комплекса Nrf2/Keap1 в цитоплазме в условиях физиологической нормы обеспечивается за счет динамической регуляции процессов ядерного импорта и экспорта белка Nrf2 [Kaspar J.W. et al., 2009]. Обе точки зрения имеют достаточно хорошую доказательную базу. Вероятным решением этого вопроса является возможность наличия ассоциации элементов сигнальной системы Nrf2/Keap1 c элементами цитоскелета только в определенных типах клеток, например в кератиноцитах, обладающих развитым актиновым цитоскелетом в кортикальном слое – в 44 зоне, где сосредоточены регуляторные элементы, обеспечивающие проведение сигнала от мембранных структур в ядро [Kang M.I. et al., 2004]. В целом, Nrf2/Keap1/ARE является важной системой, обеспечивающей выживание клетки при воздействии неблагоприятных факторов и сопутствующем развитии окислительного стресса. Дефицит активации этой системы может приводить к избыточной гибели клеток, тогда как гиперактивация, напротив, приводит к чрезмерной пролиферации и снижению степени дифференцирования кератиноцитов [Wakabayashi N. et al., 2003]. 1.10 Роль транскрипционного фактора NF-κB в клетке NF-κB является важным редокс-чувствительным транскрипционным фактором, участвующим в поддержании и обеспечении клеточного гомеостаза [Li N., Karin M., 1999]. NF-κB играет важную эволюционно-консервативную роль в иммунной системе, а также влияет на экспрессию генов, связанных с выживанием клетки при стрессе через процессы дифференцирования и пролиферации клеток. Нарушение регуляции этого фактора транскрипции приводит к тяжелым последствиям, включая развитие онкологических, сердечно-сосудистых, аутоиммунных заболеваний [Hayden M.S., Ghosh S., 2011]. В то же время, этот транскрипционный фактор играет важную роль в поддержании гомеостаза и развитии патологий тканей, включая эпителиальные [Seitz C.S. et al., 1998; Wullaert A., Bonnet M.C., 2011]. Активация NF-κB в общем виде происходит, когда в ответ на какой-либо стимул активируется белок IKK, который фосфорилирует IkB, что приводит к его убиквитинированию и деградации. Освободившийся димер NF-κB далее претерпевает ряд модификаций, после чего транспортируется в ядро, где связывается со специфическими последовательностями ДНК [Karin M., 1999]. Обнаружено 5 белков, объединенных в семейство NF-κB: p50, p52, p65, RelB и cRel. Все белки этого семейства способны образовывать гомо- или гетеродимеры друг с другом через домен RHD (Rel Homology Domain), который одновременно служит сайтом распознавания специфических последовательностей ДНК [May M.J., Ghosh S., 1998]. Димеры NF-κB в неактивном состоянии связаны с ингибирующими белками IkB, характеризующимися наличием анкириновых повторов, закрывающих ДНК-связывающие мотивы NF-κB [Hayden M.S., Ghosh S.S., 2012]. 45 Отдельно стоит отметить белки p50 и p52, которые транслируются в виде неактивных прекурсоров p105 и p100, содержащих в своей структуре анкириновые повторы, аналогичные таковым IkB [Caamaño J., Hunter C.A., 2002]. В ходе их созревания до p50 и p52 происходит протеолитическое разрезание прекурсоров. При этом, p100 является одновременно ингибитором субъединицы RelB (поскольку содержит IkB-подобный домен), и его созревание до p52 приводит к формированию активного комплекса p52/RelB [Sun S.C., 2011]. Для активации транскрипции генов мишеней NF-κB необходим домен, активирующий транскрипцию (TAD), который представлен только в p65, c-Rel и RelB субъединицах. Субъединицы p50 и p52, лишенные этого домена, образуют гомодимеры, действуя как репрессоры транскрипции генов, закрывая специфичные сайты ДНК [Cao S. et al., 2006; Hayden M.S., Ghosh S.S., 2012]. В то же время, гетеродимеры p50/RelA(p65) и p52/RelB являются двумя ключевыми гетеродимерами, оказывающими влияние на большую часть генов, контролируемых семейством белков NF-κB. При этом активация p50/RelA называется канонической, так как зависит от деградации IkB, а p52/Rel – неканонической активацией, поскольку активный димер образуется сразу после созревания p52 [Hayden M.S., Ghosh S., 2008]. Канонический путь активируется стимуляцией рецепторов семейства TNF, TLR, цитокиновыми рецепторами TNF, а также генотоксическими агентами. При этом p105 конститутивно процессируется до p50 и объединяется в комплекс c RelA (p65) или c-Rel и IkB, который ингибирует гетеродимер. В субъединице p50, в отличие от RelA в комплексе p50/RelA/IkB открыт домен NLS (Nuclear Localization Signal), что позволяет неактивному комплексу рециркулировать между цитозолем и ядром. Таким образом, в ядре всегда имеется определенное количество неактивных комплексов, что позволяет им быстро связываться с ДНК в случае активации [Hayden M.S., Ghosh S.S., 2012]. Кроме рецептор-опосредованной активации, NF-κB является мишенью для активных форм кислорода. Причем, активируясь за счет деградации IkB в ответ на повышение уровня АФК, NF-κB вызывает транскрипцию целой группы генов антиоксидантных белков: супероксиддисмутазы-1 и -2 (SOD1, SOD2), тяжелую цепь ферритина, каталазу, тиоредоксины-1 и -2, глутатион-S-трансферазу, NADPH дегидрогеназу-1 (NQO1), гемоксигеназу-1 (H1), глутатионпероксидазу-1 и другие. В 46 то же время, являясь ведущим фактором транскрипции, активируемым в клетках иммунной системы при воспалительном ответе, NF-κB запускает экспрессию генов белков, обеспечивающих продукцию активных форм кислорода, в частности NADPH оксидазу NOX2 (gp91 phox), индуцибельную синтазу оксида азота (iNOS), циклооксигеназу-2, гены цитохромов p450 [Morgan M.J., Liu Z., 2011]. АФК могут действовать одновременно как стимуляторы и как ингибиторы NF-κB. Например, они могут стимулировать NF-κB в цитозоле, но ингибируют его ДНК-связывающую активность в ядре [Kabe Y. et al., 2005]. АФК взаимодействуют с белками, участвующим в активации NF-κB, а также с самим транскрипционным фактором. В частности, АФК взаимодействуют с цистеиновыми остатками каталитических центров тирозин-фосфатаз, что приводит к их инактивации. Прямое окисление NF-κB активными формами кислорода приводит к ингибированию ДНКсвязывающей активности [Gloire G., Piette J., 2009]. NF-κB играет важную роль в процессе дифференцирования кератиноцитов в эпидермисе. Его влияние на процессы пролиферации и дифференцирования зависит от степени активации субъединицы p50. В норме, в базальных кератиноцитах активность этой субъединицы снижена и увеличивается по мере дифференцирования клеток. Это, по всей видимости, необходимо для остановки клеточного цикла, поскольку ингибирование данной субъединицы приводит к гиперпролиферации эпидермиса, а увеличение экспрессии субъединицы p50 в базальных кератиноцитах приводит к гипоплазии эпидермиса [Seitz C.S. et al., 1998; Takao J. et al., 2003]. В литературе описаны данные о том, что резистентность дифференцирующихся кератиноцитов к апоптозу, индуцированному перекисью водорода, связана с активацией транскрипционного фактора NF-κB [Shekih M.S., Huang Y., 2003]. Интересно, что в процессе дифференцирования кератиноцитов активность митохондриальной супероксиддисмутазы (SOD2, MnSOD), зависимая от NF-κB, повышается в большей степени, чем каталазы и глутатион-пероксидазы [Bernard D. et al., 2004]. Это приводит к тому, что темпы образования перекиси водорода из супероксид-аниона под действием SOD2 превышают темпы ее элиминации каталазой и глутатион-пероксидазой [Zuliani T. et al., 2005], и митохондрии претерпевают выраженные повреждения вследствие воздействия АФК. Дальнейшие события в клетке приводят к накоплению большого количества поврежденных митохондрий, фе- 47 нотипически похожих на митохондрии при апоптозе. Перекись водорода, свободно диффундируя через мембраны митохондрий, попадает в цитозоль. В этих клетках с одной стороны, отмечается увеличение количества митохондрий, а с другой стороны, митохондрии теряют связь с микротрубочками и накапливаются в перинуклеарной области. Это приводит к тому, что большое количество образующейся перекиси водорода преимущественно повреждает ядерную мембрану и ДНК [Deruy E. et al., 2010]. Одновременно в дифференцирующихся кератиноцитах отмечается экспрессия белков, ассоциированных с процессом аутофагии, в частности Atg4, активируемого перекисью водорода и инициирующего формирование аутофагосом. При этом в клетке появляется цитокератиновая сеть, которая разделяет ее на две основные зоны – кортикальную, лишенную органелл, и центральную, в которой накапливается большое количество LC3B-позитивных вакуолей (аутофагосом), поврежденные митохондрии и ядро [Gosselin K. et al., 2009]. Фактор транскрипции NF-κB регулирует продукцию многих цитокинов в клетке, к ним относятся ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНО-α и ИЛ-10. Причем провоспалительные и противовоспалительные цитокины активируются одним и тем же гетеродимером p50/RelA(p65), а баланс продукции этих цитокинов определяется множеством внешних и внутриклеточных факторов, от которых зависит судьба клетки [Blackwell T.S., Christman J.W., 1997]. Описана связь между активацией транскрипционного фактора NF-κB и повышением уровня продукции ИЛ-6 посредством активации стресс киназы р38 через малые ГТФазы. Ранее это явление уже описывалось [Zampetaki A. et al., 2005] в связи с реогранизацией цитоскелета клетки при биомеханическом стрессе эндотелиоцитов внутри сосудов, приводящем к активации киназы р-38. Кроме того, известно повышение продукции ИЛ-6 в скелетных мышцах после физических упражнений, что также связано с клеточным «сжатием» во время сокращения мышечных клеток [Fischer C. P., 2006]. Эти данные представляют интерес с точки зрения схожего эффекта от гиперосмотического воздействия, в результате которого также происходит клеточное сжатие и, возможны подобные эффекты, индуцирующие повышение продукции некоторых цитокинов. 48 Усиление продукции цитокинов в кератиноцитах может служить одним из механизмов модуляции пролиферативных процессов и дифференцирования клеток в ответ на гиперосмотическое воздействия. 1.11 Роль цитокинов в процессах модуляции структуры и функций эпидермиса Повреждение эпидермиса приводит к продукции провоспалительных цитокинов кератиноцитами, ключевыми среди которых являются ИЛ-1β, ИЛ-6 и ФНО-α [Grone A., 2002]. Эти цитокины необходимы для таксиса лейкоцитов в зону воспаления, а также ремоделирования поврежденной зоны. ИЛ-1β, продуцируемый кератиноцитами, сразу после повреждения эпидермиса приобретает паракринные и аутокринные свойства, стимулируя миграцию и пролиферацию кератиноцитов. Кроме того, стимулирует продукцию FGF7 фибробластами и активирует их миграцию [Tang A., Gilcherest B.A., 1996; Sivamani R.K. et al., 2007]. ФНО-α может оказывать различные эффекты в зависимости от своей концентрации и продолжительности воздействия. Так, в малых концентрациях он может индуцировать продукцию FGF7, ростовых факторов макрофагами, стимулируя процессы реэпителизации. Повышение концентрации или продолжительности продукции данного цитокина в ране приводит к пагубным для процессов репарации эффектам, среди которых угнетение продукции внеклеточного матрикса и разрушение вновь образованного за счет стимуляции продукции матриксных металлопротеиназ макрофагами и фибробластами [Barrientos S. et al., 2008]. ИЛ-6, продуцируемый кератиноцитами, стимулирует их пролиферацию паракринным и аутокринным образом [Galucci R.M. et al., 2000]. Показано, что нокаутные по гену ИЛ-6 мыши демонстрируют существенную задержку восстановления целостности кожных покровов после ранения, задержку ангиогенеза и образование коллагена, что свидетельствует о важной роли ИЛ-6 в пролиферации кератиноцитов и формировании кожных покровов [Lin Z.Q. et al., 2003]. В случае патологических состояний, например при псориазе, ИЛ-6 может вызывать гиперпролиферацию в псориатическом эпителии [Atzeni F. et al., 2012]. Показано, что кератиноциты продуцируют ИЛ-10 в ответ на повреждение ультрафиолетовым излучением [Byun J.Y. et al., 2009]. По всей видимости, кератиноциты продуцируют ИЛ-10 в ответ на образование активных форм кислорода при 49 повреждении. В свою очередь, ИЛ-10 блокирует активацию фактора транскрипции NF-κB, что приводит к снижению выраженности продукции провоспалительных цитокинов [Ikeda M. et al., 2002]. Представляет интерес изучение характера продукции выбранной группы цитокинов в ответ на гиперосмотическое воздействие на кератиноциты и вероятной связи этого процесса с адаптивным ответом клетки, а именно: реорганизацией цитоскелета, пролиферативной активностью клеток и дифференцировочными процессами. Кроме того, участие указанных цитокинов в воспалительных процессах кожи в ответ на гиперосмотическое воздействие может быть связано с реализацией позитивных эффектов высокоминерализованных растворов при бальнеотерапии. 50 Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ 1. Клеточная культура. В работе использовали перевиваемые кератиноциты линии HaCaT [Boukmap P. et al., 1988], любезно предоставленные П.П. Лактионовым, ИХБиФМ СО РАН, Новосибирск. 2. Культивирование кератиноцитов Клетки растили в питательной среде F12/DMEM (Invitrogene, США) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота FBS (HyClon, США), 1 мМ L-глютамин, 50 ед/мл пенициллин, 50 ед/мл стрептомицин- пеннициллина в стандартных условиях: в инкубаторе при 5% СО2 атмосфере, температуре 37⁰С и 95% влажности. Рутинное исследование состояния клеточной культуры проводили при помощи инвертированного светового микроскопа AxioVert 40 CFL (Carl Zeiss, Германия), ростовую среду меняли через день. При пассировании клетки рассаживали в соотношении 1:4, при достижении «полумонослоя» – раз в 4-5 дней. Снятие клеток с подложки проводили с использованием 0,25% раствора трипсина (Invitrigene, США). 3. Приготовление гиперосмотических растворов Гиперосмотические растворы (ГР) готовили с использованием препарата «Рапан», полученного из рапы озера Малое Островное, Краснозерского района (производство ЗАО «СИБТЕХВАС», Новосибирск). Химический состав «Рапана» представлен формулой: Cl (59-66) SO4 (32-40)\(Na+К) (79-80) Mg (19-20). По ионно-солевому составу рапа озера сульфатно-хлоридная, натриево-магниевая с минерализацией 182,8 г\дм3 и щелочной реакцией среды (pН 7,9-8,5). Согласно бальнеологическому заключению Томского НИИ курортологии, отнесена к 8 бальнеологической группе минеральных вод, предназначенных для наружного применения. Брали сухую навеску препарата «Рапан» и разводили в полной культуральной ростовой среде для кератиноцитов. В работе использовали три концентрации препарата «Рапан»: 2, 4, 8 г на 1 литр полной ростовой клеточной среды. Время воздействия растворами на клетки варьировали от 10 минут до 24-х часов, в зависимости от проводимого эксперимента: индукцию апоптоза и некроза смотрели через сутки гиперосмотического воздействия (24 ч), а также спустя еще сутки, после устранения гиперосмотического воздействия (48 ч). 51 4. Исследование жизнеспособности кератиноцитов Для определения количества жизнеспособных клеток использовали МТТтест [Twentyman P.R., Luscombe M. 1987; Данлыбаева Г.А. и др., 2012]. Клетки растили в 96-ти луночных плоскодонных культуральных планшетах. После образования клетками «полумонослоя» добавляли гиперосмотические растворы в концентрациях 2, 4, 8 г/л и культивировали в течение 24 ч. По прошествии срока инкубации к клеткам добавляли МТТ (3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Нтетразолий, Sigma-Aldrich, США) в концентрации 0,15 мг/мл. Через 3 ч среду удаляли, а образовавшиеся кристаллы формазана растворяли в 100 мкл диметилсульфоксида (Биолот, Россия) в течение 20 минут при покачивании. Результат оценивали колориметрически, измеряя оптическую плотность растворов при длине волны 540 нм, используя планшетный спектрофотометр BioTek ELx808 (Biotek, США). 5. Определение состояния апотоза и некроза в клетках Исследование клеточной гибели проводили при помощи проточной цитофлуориметрии. Индукцию апоптоза и некроза смотрели через сутки гиперосмотического воздействия (24 ч), а также спустя еще сутки, после устранения гиперосмотического воздействия (48 ч). Для определения типа клеточной гибели исследовали уровень трансмембранного митохондриального потенциала, который определяли с помощью флуоресцентного красителя 3,3'-дигексилоксакарбоцианина йодида, DiOC6 (Invitrogen, США), и целостности клеточной мембраны с помощью интеркалирующего красителя иодида пропидия PI (Sigma, США) [Gorczyca W., 1999]. Кератиноциты после заданного времени гиперосмотического воздействия инкубировали в течение 15 мин при +37˚С в полной культуральной среде, содержащей 40 нМ DiOC6, затем трижды отмывали от избытка красителя раствором фосфатно-солевого буфера PBS (Биолот, Россия) и добавляли раствор PBS, содержащей 10 мкг/мл PI, на 5 минут. Затем после однократного отмывания фосфатносолевым буфером клетки переносили в пробирки для цитометрии, объём доводили до 1 мл раствором FaCSCell (оптимизированный по составу фосфатно-солевой буфер). Измерение интенсивности флуоресценции проводили на приборе FACS Calibur (Becton Dickinson, США), λEm = 520 нм для DiOC6 и λEm = 670 нм для PI, с использованием программного обеспечения СellQuest (BD, США). 52 Клетки с высоким значением интенсивности флуоресценции DiOC6 и неповрежденной клеточной мембраной принимали за жизнеспособные, клетки cо сниженным митохондриальным потенциалом (с низкой интенсивностью флуоресценции DiOC6) и непроницаемые для PI – за находящиеся на ранних стадиях апоптоза, клетки с нарушенной целостностью мембраны (проницаемые для PI) – за некротические клетки. 6. Исследование пролиферативной активности клеток и распределения по стадиям клеточного цикла Исследование проводили методом проточной цитофлуориметрии, через сутки гиперосмотического воздействия (24 ч), а также спустя еще сутки, после устранения гиперосмотического воздействия (48 ч). Для определения пролиферативной активности клеточную суспензию инкубировали в течение 10 мин с 20 мкМ раствором CFSE (Sigma-Aldrich, США) при 37° С в фосфатно-солевом буфере PBS, содержащем 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA, Amresco-Inc., США). После инактивации избытка CFSE раствором PBS клетки ресуспендировали в полной ростовой среде, рассаживали в лунки 6-луночного планшета и растили в течение 24 ч с добавлением гиперосмотических растворов «Рапана» в концентрации 2, 4, 8 г/л, после чего среду удаляли, клетки отмывали раствором PBS и меняли культуральную среду на свежую. Краситель CFSE свободно проникает через плазматическую мембрану клетки и связывается со свободными аминогруппами остатков лизина белков цитоплазмы. После деления клетки краситель равномерно распределяется в цитоплазме дочерних клеток, и интенсивность их флуоресценции становится вдвое ниже, чем у материнской клетки [Lyons AB., 2000]. Таким образом, по степени разведения красителя судили о количестве делящихся клеток и количестве делений, произошедших в культуре с момента начала исследования, используя в качестве контроля клетки, окрашенные СFSE непосредственно перед измерением (т.е. не успевших поделиться и «разбавить» метку). Флуоресценцию CFSE измеряли на проточном цитофлуориметре FACSCalibur, λEm = 520 нм, с использованием программного обеспечения СellQuest. Для изучения распределения клеток по стадиям клеточного цикла измеряли количество внутриядерной ДНК. Для его детекции использовали интеркалирую- 53 щий флуоресцентный краситель иодид пропидия PI, уровень флуоресценции которого пропорционален количеству ДНК, с которым он связался. Это позволяло оценить относительное количество клеток с различным содержанием ДНК и выделить группы клеток, соответствующие различным фазам клеточного цикла: G0/G1, S, G2/M [Collins J.M. et al., 1980]. После культивирования кератиноцитов с гиперосмотическими растворами в течение заданного времени, клетки снимали с подложки 0,25% трипсином, отмывали от культуральной среды раствором PBS, фиксировали в ледяном 70% этаноле в течение 2 ч. Далее инкубировали 15 мин в гипотоническом растворе йодида пропидия (PI, Sigma, США) с РНКазой (Invitrogen, США) (10 мл 0,1% Triton X-100 (Биолот, Россия), 2 мг РНКазы, 20 мкг/мл PI. Флуоресценцию PI определяли на проточном цитофлуориметре FACSCalibur, λEm = 670 нм, с использованием программного обеспечения СellQuest. 7. Определения внутриклеточного содержания различных белков Для определения внутриклеточного содержания различных белков применяли иммунофлуоресцентное окрашивание, с последующим анализом на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе LSM710 (Carl Zeiss, Германия). Время экспозиции с гиперосмотическими растворами. Для исследования процессов дифференцирования кератиноцитов проводили суточное воздействия гиперосмотическим раствором препарата «Рапан» максимальной концентрации (8 г/л), исследование внутриклеточного распределения маркеров дифференцирования проводили спустя 48 часов после прекращения воздействия (для реализации процессов дифференцирования). В случае исследования аутофагии и пролиферативной активности измерения проводили через 24 часа экспозиции непосредственно после эксперимента и еще спустя сутки после устранения воздействия (48 ч). Распределение транскрипционного фактора Nrf2 исследовали через 30 и 120 минут гиперосмотического воздействия, а также через 4 и 24 часа. Распределение субъединиц NF-κB исследовали через 1 и 24 часа воздействия гиперосмотическими растворами. Изменение структуры цитоскелета кератиноцитов проводили через 1 и 24 часа. Приготовление препаратов. 54 Клетки растили на покровных стеклах до состояния «полумонослоя» (чтобы избежать стадии трипсинизации и переноса кератиноцитов на стекла, что может быть сопряжено с изменением физиологического состояния клеток). Для приготовления препаратов клетки после гиперосмотического воздействия фиксировали в 4% растворе забуференного формалина в PBS, пермеабилизировали в растворе 0,125% Тритона Х-100 в течение 3 мин, затем 2 раза отмывали PBS (pH 7,4) и инкубировали с блокирующим буфером (2 мг/мл BSA в PBS) в течение 30 мин для забивки неспецифической сорбции. Все процедуры проводили при комнатной температуре. Далее препараты инкубировали в течение 2 ч с разведенными в блокирующем буфере специфическими антителами. Используемые антитела: Для идентификации маркера пролиферации ki67 использовали: первичные поликлональные антитела кролика anti-Ki67 (ab66155); вторичные флуоресцентномеченные антитела к IgG кролика (ab150085 AlexaFluor 488). Процесс аутофагии исследовали по уровню цитоплазматического белка Beclin1 (anti-Beclin1 ab16998; ab150085 AlexaFluor 488), являющегося инициатором формирования аутофагосом, и количеству аутофагосом, которые идентифицировали по окрашиванию структурного белка LC3B первичными олигоклональными антитела кролика anti-LC3b 710014 (Life Technologies) и вторичными флуоресцентно мечеными антителами к IgG кролика (ab150085 AlexaFluor488). Для определения маркеров дифференцирования кератиноцитов использовали первичные поликлонaльные антитела кролика к филаггрину Anti-Filaggrin antibody (ab24584, Abcam), лорикрину Anti-Loricrin antibody (ab85679, Abcam), цитокератину-5 Anti-Cytokeratin-5 antibody (ab24647, Abcam) и вторичные флуоресцентно меченые антитела к IgG кролика (ab150085 AlexaFluor488). Для идентификации цитокератина 10 использовали мышиные моноклональные антитела Anti-Cytokeratin 10 (ab9025, Abcam) и вторичные флуоресцентно меченые антитела против IgG мыши (ab150115 AlexaFluor 647). Для определения внутриклеточного распределения транскрипционного фактора Nrf2 использовали первичные поликлональные антитела кролика anti-Nrf2 (ab31163); вторичные флуоресцентно-меченные антитела к IgG кролика (ab150085 AlexaFluor 488). Для идентификации белка Keap1 – первичные моноклональные 55 антитела мыши anti-Keap1 (ab150654, Abcam); вторичные флуоресцентно меченые антитела против IgG мыши (ab150115 AlexaFluor 647). Для определения субъединицы p65 транскрипционного фактора NF-κB использовали первичные моноклональные антитела мыши anti-NF-κB p65 antibody (sc-8008), вторичные флуоресцентно меченые антитела против IgG мыши (ab150115 AlexaFluor 647); для определения субъединицы р50 использовали первичные поликлональные антитела кролика аnti-NF-κB p105/p50 antibody (ab7971), вторичные флуоресцентно-меченные антитела к IgG кролика (ab150085 AlexaFluor 488). Исследования актинового и тубулинового цитоскелета. Для выявления тубулина использовали конъюгированные поликлональные антитела anti-ɑ-Tubulin Alexa488 (Molecular Probes®). Актиновый цитоскелет окрашивали реактивом: phalloidin Alexa 532 (Molecular Probes®). Во всех препаратах ядра окрашивали DAPI в антифейде ProlongGold (Invitrogen). Последующий анализ готовых препаратов проводили на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе LSM710(Carl Zeiss, Германия), с использованием программного обеспечения ZEN 2011 (Carl Zeiss, Германия). 8. Методы исследования продукции активных форм кислорода и трансмембранного митохондриального потенциала Исследование проводили с использованием проточной цитофлуориметрии и лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Измерение продукции АФК. Продукцию супероксид-аниона определяли при помощи индикатора дигидроэтидия DHE (Sigma, США), в концентрации 20мкМ. DHE чувствителен к образованию супероксид-аниона (О2¬), окисляясь при взаимодействии с О2¬ этот индикатор образует флуоресцентный продукт. Окисленный DHE, интеркалируя с ДНК, не покидает клетку, и его количество в условиях повышенной продукции АФК с течением времени увеличивается. Продукцию перекиси водорода определяли при помощи H2DCF-DA (Sigma, США), в концентрации - 10мкМ. Окрашивание индикатором DHE проводили в течение 30 минут, окрашивание DCF – в течение 45 минут. Клетки отмывали полной культуральной средой, добавляли гиперосмотический раствор и оставляли на 30 и 120 минут, затем кле- 56 точную суспензию помещали в пробирки для цитометрии, объём доводили до 1 мл раствором FaCSCell, флуоресценцию измеряли на проточном цитофлуориметре FACSCalibur в каналах: FL1 (λEm =520нм), FL2 (λEm = 670 нм), с использованием программного обеспечения СellQuest. Для исследования образования перекиси водорода в реальном времени применяли лазерную сканирующую конфокальную микроскопию. Использовали индикатор H2DCF- [Joshi D.C., Bakowska J.C., 2011] концентрации 7,5 мкМ, записывали базовый уровень флуоресценции в течение 5 минут, после чего добавляли гиперосмотический раствор. Измерение проводили в реальном времени на лазерном сканирующем микроскопе LSM 710 (Carl Zeiss, Германия) в течение 30 мин с шагом сканирования каждые 12 с (для удобства результаты представлены с точками измерения через каждые 4 мин). Для минимизации фототоксического поражения клеток сканирование проводили на малой мощности лазера (1%), 488 нм для H2DCF-DA и 563 нм для TMRM (см. ниже), на малой разрешающей способности микроскопа (256х256 пикселей). Митохондриальный трансмембранный потенциал. Изменение митохондриального потенциала исследовали при помощи потенциал зависимого красителя тетраметилродамина (TMRM) [Joshi D.C., Bakowska J.C., 2011] в концентрации 10 нМ (Sigma, США). Данный краситель чувствителен к минимальным изменениям ∆Ψm и быстро теряет сродство к митохондриальной мембране при падении потенциала. Окрашивание проводили в течение 45 мин, в темноте при комнатной температуре. Далее краситель отмывали раствором PBS и добавляли гиперосмотический раствор. Измерения ∆Ψm проводили с момента добавления гиперосмотического раствора к кератиноцитам на протяжении 30 мин в тех же условиях, что и при определении перекиси водорода в реальном времени. 9. Определение продукции цитокинов Определение продукции цитокинов проводили с использованием иммуноферментного анализа. Кератиноциты культивировали в 12-луночном планшете до получения клеточного монослоя, затем в контрольной группе клеток культуральную среду меняли на свежую, а в экспериментальных группах на культуральную среду, содержащую гиперосмотический раствор в финальной концентрации 8 г/л. Экспозицию 57 проводили в течение 1 часа, затем меняли среду и оставляли на 24 часа. Во второй экспериментальной группе гиперосмотический раствор оставляли на 24 часа. ИФА исследование продукции ИЛ-6, ИЛ-1β, ИЛ-10, ФНО-α проводили с помощью тестсистем для определения соответствующих цитокинов (Вектор-Бест, Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. Измерения проводились на спектрофотометре, ELX 808 (Biotek, США). 10. Статистическая обработка экспериментальных данных Анализ результатов исследования проводился средствами пакета статистических программ STATISTICA 7.0. и GraphPad Prism. Вероятность достоверности различий между исследуемыми показателями экспериментальных групп оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа, c использованием критерия Тьюки. Отличия между сравниваемыми величинами показателей считали достоверными при р < 0,05. Количественные данные представлены как М ± m, где М – средняя, m – ошибка средней. * – обозначены достоверные отличия с контрольной группой. 58 Глава 3. СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Исследование жизнеспособности клеток Для определения жизнеспособности клеток при воздействии гиперосмотическими растворами (ГР) различных концентраций использовали МТТ-тест, результаты которого представлены на Рисунке 1. Рисунок 1. Результаты исследования жизнеспособности кератиноцитов линии HaCaT через 24 часа после гиперосмотического воздействия. Полученные данные свидетельствуют о том, что указанное воздействие приводит к дозозависимому уменьшению количества жизнеспособных клеток в культуре относительно контрольных клеток, культивируемых в полной ростовой среде без добавления гиперосмотических растворов. Следует отметить, что результаты МТТ-теста не являются абсолютным показателем выживаемости клеток в условиях эксперимента, на основании которого судят о клеточной гибели, так как данное исследование выявляет общее количество «дышащих» митохондрий в группах тестируемых клеток. Поэтому наблюдаемое уменьшение количества жизнеспособных клеток в эксперименте может быть вызвано двумя причинами: наличием цитотоксических свойств выбранных растворов, приводящих к клеточной гибели апопто- 59 зом или некрозом, либо цитостатических свойств, приводящих к торможению пролиферации в экспериментальной группе. Для выяснения причин снижения жизнеспособности кератиноцитов в культуре было проведено исследование различных типов клеточной гибели в ответ на гиперосмотическое воздействие. 3.2 Исследование апоптотической и некротической гибели клеток после гиперосмотического воздействия Одним из ключевых событий, происходящих при апоптозе, является пермеабилизация митохондрий и падение трансмембранного митохондриального потенциала, что происходит вследствие утечки протонов межмембранного пространства в цитоплазму [Crompton M., 1999; Mailloux R.J., Harper M., 2011]. Уровень трансмембранного митохондриального потенциала анализировали одновременно с исследованием проницаемости клеточной мембраны, т.к. на ранних стадиях апоптоза последняя остается интактной, а повышение проницаемости мембраны указывает на поздние стадии апоптоза или некротическую гибель клетки [Gorczyca W., 1999]. Измерения проводили с использованием ранее выбранных концентраций при проведении МТТ-теста. Культивирование кератиноцитов с гиперосмотическими растворами в концентрациях 4 и 8 г/л не приводило к индукции апоптоза через 24 часа после воздействия, а спустя 48 часов признаки апоптотической гибели наблюдались лишь у незначительного количества клеток (менее 4% после воздействия ГР в концентрации 8 г/л), что отображено на Рисунке 2. Кроме того, количество некротических кератиноцитов после гиперосмотического воздействия сопоставимо с таковым в контроле, т.е. не превышает уровень естественной элиминации кератиноцитов в популяции. 60 Рисунок 2. Результаты исследование гибели кератиноцитов через 24 и 48 часов после гиперосмотического воздействия. 61 Из литературных данных известно, что кератиноциты в условиях in vitro более подвержены индукции апоптоза, чем кератиноциты в коже, например, в ответ на воздействие ультрафиолетом и другими повреждающими факторами [Nickoloff B.J. et al., 2002; Lewis D.A. et al., 2006]. Это связано с тем, что в коже кератиноциты взаимодействуют с белками базальной мембраны, в частности, с ламинином-5, через интегрины α3β1 и α6β4 [Manohar A. et al., 2004; Yurchenco P.D., 2011]. Такое взаимодействие приводит к активации сигнального пути MEK / ERK, обеспечивающего выживание клеток [Jost M. et al., 2001]. Кроме того, реализуются и другие пути защиты от апоптоза, через взаимодействие с ростовыми факторами: NGF (Nerve growth factor) и HGF (Hepatocyte growth factor). Стимуляция с указанными ростовыми факторами приводит к поддержанию высокого уровня противоапоптотических белков Bcl-2 и Bcl-XL в кератиноцитах [Marconi A. et al., 1999] и активации Akt-сигналинга, в результате которого происходит ингибирование проапоптотических белков [Mildner M. et al., 2002]. В условиях in vitro реализация описанных выше механизмов затруднительна в связи с отсутствием базальной мембраны и стимуляции факторами роста. Поэтому отсутствие апоптотических событий может быть объяснено развитием собственных адаптивных реакций, таких как реорганизация цитоскелета [Mills J.W. et al., 1994], активация ионных мембранных каналов [O'Neill W.C., 1999; Adragna N.C. et al., 2000], внутриклеточных осмолитов, активной работы стресс-белков Gadd45 [Chakravarty D. et al., 2002; Tamura R.E. et al., 2012] и белков теплового шока [Sheikh-Hamad D. et al., 1994], что в условиях выбранных концентраций гиперосмотических растворов предотвращает повреждение клетки. Таким образом, на данном этапе исследования было установлено, что выбранные концентрации гиперосмотических растворов препарата «Рапан» не вызывают цитотоксического действия и, как следствие, апоптотической или некротической гибели кератиноцитов. Поэтому уменьшение количества жизнеспособных кератиноцитов в эксперименте, по-видимому, связано с цитостатическим эффектом гиперосмотического воздействия и изменением пролиферативной активности клеток. 62 3.3 Исследование пролиферативной активности и клеточного цикла кератиноцитов в ответ на гиперосмотическое воздействие Для понимания степени выраженности цитостатического эффекта различных концентраций ГР исследовали темпы пролиферации клеток и динамику клеточного цикла. Воздействие на кератиноциты ГР в концентрациях 4 и 8 г/л приводило к торможению пролиферации, что показано на Рисунке 3. Следует пояснить, что на представленных графиках группа «пролиферирующий пул» включает в себя все пролиферирующие клетки, т.е. совершившие 1 деление, более 1-го деления и более 2-х делений. Рисунок 3. Пролиферативная активность кератиноцитов линии HaCaT через 24 и 48 ч после воздействия гиперосмотических растворов различных концентраций. 63 Через 24 часа после воздействия ГР в концентрациях 4 и 8 г/л более 1 деления совершило 35 и 40% клеток в экспериментальных группах, в то время как в контрольных кератиноцитах и при концентрации ГР 2 г/л доля таких клеток составляла 70%. Количество кератиноцитов, прошедших более 2х делений после воздействия ГР также снижалось примерно в два раза по сравнению с контрольными клетками. Таким образом, гиперосмотическое воздействие приводило к концентрационно-зависимому торможению пролиферативных процессов в кератиноцитах. Через 48 часов наблюдали увеличение количества пролиферирующих кератиноцитов в каждой исследуемой группе, что свидетельствует о восстановлении пролиферации после устранения гиперосмотического воздействия и обратимости наблюдаемого эффекта. Концентрационно-зависимое торможение пролиферации в ответ на гиперосмотическое воздействие является адаптивной реакцией клеток и относится к защитным механизмам [Dmitrieva N.I. et al., 2001]. Во-первых, снижение темпов пролиферации кератиноцитов и других клеток позволяет сохранить энергию, необходимую для развития адаптивного ответа и своевременного реагирования для восстановления гомеостаза, что возможно при ограниченной силе гиперосмотического воздействия и напрямую зависит от концентраций действующих растворов. Такой эффект описан для клеток почечного эпителия [Michea L. et al., 2000]. Во-вторых, в случае фатального повреждения клеточных органелл или ДНК, происходящих при высоких концентрациях гиперосмотических растворов, торможение пролиферации предотвращает деление заведомо дефектных клеток и индуцирует апоптоз, в результате которого дефектные клетки устраняются из популяции [Michea L. et al., 2000; Wu K.L. et al., 2003; Friis M.B. et al., 2005]. Существуют различные механизмы, обеспечивающие торможение пролиферации, основой которых является последовательное переключение работы циклинзависимых киназ, активирующих механизмы перехода из одной стадии клеточного цикла в другую [Shackelford R.E. et al., 1999; Uhlmann F. et al., 2011; Lim S., Kaldis P., 2013]. Для выявления этих механизмов исследовали распределения клеток по стадиям клеточного цикла, так как накопление клеток в той или иной стадии ука- 64 зывает на запуск соответствующих сигнальных путей [Becker W., 2012; Fisher D., Kaldis P., 2012; Wang P et al., 2013]. Исследование динамики клеточного цикла, как и в предыдущем эксперименте, проводили через 24 и 48 часов после гиперосмотического воздействия. Обнаружено, что через 24 ч после воздействия гиперосмотическими растворами в концентрации 4 и 8 г/л происходит накопление клеток в фазах G0/G1 (около 80% клеток) и, соответственно, снижение количества клеток, находящихся в фазах S и G2/M, относительно контрольных клеток (Рисунок 4). Арест клеточного цикла на стадии G1 связан с ингибированием циклина D и циклин-зависимых киназ Cdk4/Cdk6, отвечающих за переход из G1 в S-стадию [Pines J., 1994; Shackelford R.E. et al., 1999; Uhlmann F. et al., 2011]. Кроме того, непрохождение клетками точек контроля и арест клеточного цикла в стадии G1 активирует белок р53, отвечающий за последующие апоптотические события [Dmitrieva N. et al., 2001]. В данной ситуации механизмом избегания апоптоза служит переход клеток из G1-стадии в G0. Такой переход реализуется в случае получения антипролиферативного сигнала (которым может являться и гиперосмотическое воздействие) клетками, находящимися в G1-стадии клеточного цикла [Shackelford R.E. et al., 1999]. Еще одним вероятным механизмом, обеспечивающим торможение пролиферации, является активация стресс-киназы р38, которая запускает целый каскад клеточных реакций под действием малых ГТФаз, в частности ГТФазы Rac1. Это приводит к накоплению ингибиторов клеточного цикла и активации р53, но наиболее часто этот механизм реализуется при аресте клеточного цикла на стадиях G2/M [Shimada N. et al., 2009]. Через 48 ч (24 ч экспозиции с ГР и 24 ч культивирования в ростовой среде без ГР) динамика клеточного цикла восстанавливалась во всех экспериментальных группах, что свидетельствует о том, что механизмы ареста клеточного цикла реализуются непосредственно во время воздействия ГР и прекращают свою работу после устранения этого воздействия. Большой разброс значений количества клеток, находящихся в стадии G0/G1 через 48 ч, может быть следствием того, что восстановление динамики клеточного 65 цикла происходит не во всей популяции и часть клеток задерживается в стадии G0, далее подвергаясь дифференцированию [Gandarillas A. et al., 2000]. Рисунок 4. Результаты исследования распределения кератиноцитов по стадиям клеточного цикла после гиперосмотического воздействия. Для проверки гипотезы о накоплении клеток в стадии G0 после торможения пролиферации в ответ на гиперосмотическое воздействие исследовали экспрессию маркера пролиферации ki-67. Данный маркер обнаруживается в делящихся клетках в разном количестве в фазах G1, S, G2 в ядре и в M-фазе ассоциирован с хромосо- 66 мами [Scholzen T., Gerdes J., 2000]. Условным маркером фазы G0 является отсутствие данного белка в клетке. Использование ki-67 позволяет выявить кератиноциты в стадии G0 для определения количества «клеток кандидатов», подвергающихся последующему дифференцированию, так как данному процессу у кератиноцитов предшествует подавление репликации ДНК и остановка клеточного цикла в стадии G0 [Gandarillas A. et al., 2000]. После гиперосмотического воздействия в кератиноцитах HaCaT наблюдали уменьшение количества ki-67 в ядрах и увеличение количества клеток, в ядрах которых ki-67 отсутствовал. Характер распределения белка ki-67 до и после гиперосмотического воздействия представлен на Рисунке 5. Обнаружено, что после воздействия ГР количество кератиноцитов, позитивных по данному маркеру, было вдвое ниже, чем в контроле через 24 ч, и на ¼ ниже через 48 часов (Рисунок 6), т.е. через 24 часа после воздействия ГР половина клеток в культуре находилась в стадии G0 клеточного цикла. При этом увеличение количества ki-67-позитивных клеток, наблюдаемое через 48 часов (т.е. после устранение воздействия ГР), вероятно, связано с восстановлением пролиферации клеток, находящихся в стадиях клеточного цикла, отличных от G0. Рисунок 5. Распределение белка ki-67 в ядрах кератиноцитов. Увеличение х400. 67 Рисунок 6. Изменение экспрессии ki-67 у кератиноцитов после гиперосмотического воздействия. Таким образом, удалось установить, что гиперосмотическое воздействие приводило к торможению пролиферации кератиноцитов и накоплению их в стадии G1/G0 клеточного цикла. После устранения гиперосмотического воздействия происходило восстановление нормальной динамики клеточного цикла, что в целом свидетельствует об обратимости получаемых эффектов, однако часть популяции оставалась в стадии G0, что для кератиноцитов сопряжено с последующим дифференцированием [Gandarillas A. et al., 2000; Micallef L. et al., 2009]. Поэтому можно предположить, что независимо от восстановления пролиферативной активности и динамики клеточного цикла часть популяции кератиноцитов после воздействия гиперосмотическими растворами подвергнется процессам дифференцирования. Такой эффект был обнаружен при использовании гиперосмотических концентраций сорбитола [Mammone T. et al., 2007]. Для проверки этого предположения исследовали экспрессию маркеров дифференцирования в ответ на гиперосмотическое воздействие. 68 3.4 Исследование процессов дифференцирования кератиноцитов Дифференцирование кератиноцитов и их превращение в корнеоциты описано некоторыми авторами как специфический тип клеточной смерти, при котором не происходит элиминации погибших клеток макрофагами, как в случае апоптотической гибели. Процесс дифференцирования кератиноцитов сопровождается элиминацией клеточных органелл и накоплением белков, необходимых для формирования рогового слоя, активную роль в данном процессе играет аутофагия [Aymard E. et al., 2011]. Для обнаружения индукции аутофагии в кератиноцитах исследовали внутриклеточное распределение маркера аутофагии – белка Beclin1, и аутофагосом, выявляемых при помощи их структурного белка LC3B [Yan F.P. et al., 2007]. Через сутки после воздействия гиперосмотическим раствором в концентрации 8 г/л отмечали выраженное увеличение количества цитоплазматического белка Beclin1, что показано на Рисунках 7-8. Усиление экспрессии данного белка происходит в ответ на активацию процесса образования аутофагосом. Рисунок 7. Результат измерения уровня белка Beclin1в кератиноцитах после гиперосмотического воздействия (8 г/л). 69 Рисунок 8. Изменение внутриклеточного распределения белка Beclin1 в кератиноцитах после гиперосмотического воздействия (8 г/л). Увеличение х400. В состав аутофагосом входит структурный белок LC3B [Tanida I. et al., 2004]. В ходе эксперимента было установлено, что этот белок локализуется в везикулярных структурах (аутофагосомах) и в контрольных клетках. Однако количество и размер аутофагосом увеличивается через сутки после воздействия гиперосмотическим раствором (Рисунок 9). Эти данные указывают на начало развития процессов аутофагии у части клеточной популяции, что в данном случае может являться первым звеном в реализации дифференцировочных процессов в кератиноцитах. Известно, что образование аутофагосом в кератиноцитах предшествует терминальному дифференцированию и их превращению в корнеоциты [Aymard E. et al., 2011]. 70 Рисунок 9. Формирование аутофагосом в кератиноцитах после гиперосмотического воздействия (8 г/л). Увеличение х400. Для изучения реализации дальнейших процессов дифференцирования исследовали внутриклеточное распределение белков филаггрина и лорикрина [Candi E. et al., 2005; Jensen J.M., Proksch E., 2009]. Обнаружено, что после суточной экспозиции с гиперосмотическим раствором препарата «Рапан» в концентрации 8 г/л происходит заметное усиление экспрессии исследуемых белков через 48 часов после воздействия (72 часа от начала эксперимента), накопление их в цитоплазме (Рисунок 10). Появлялись островки клеток с повышенным содержанием исследуемых маркеров. На более ранних сроках накопление указанных маркеров не было очевидным, окрашивание носило мозаичный характер и практически не отличалось от такового в контрольных клетках, в которых исследуемые белки обнаруживались в малых количествах. 71 Рисунок 10. Внутриклеточное распределение филаггрина и лорикрина после воздействия гиперосмотическими растворами в концентрации 8 г/л. Увеличение х400. В качестве дополнительных маркеров дифференцирования кератиноцитов были выбраны цитокератины-5 и -10. В эпидермисе в ходе дифференцирования от стволовой клетки базального слоя до кератиноцитов ороговевающего слоя происходит перепрограммирование синтеза цитокератинов [Presland R.B., Dale B. A., 2000]. Кератиноциты базального слоя экспрессируют цитокератин-5. Дифференци- 72 рованные кератиноциты, локализованные в поверхностных слоях эпидермиса, начиная с зернистого, содержат цитокератин-10 [Presland R.B., Dale B.A., 2000]. При изучении распределения цитокератинов-5 и -10 в таких же условиях, что и в случае филаггрина и лорикрина, было установлено изменение в характере распределения данных белков и структуре филаментной сети в цитоплазме (Рисунки 11-12). Рисунок 11. Распределение цитокератинов-5, -10 в контрольных кератиноцитах. Увеличение х400. Мелкая сетчатая структура цитокератинов агрегировала в более плотные кератиновые тяжи. Изменение характера филаментной сети в кератиноцитах обычно сопровождает процесс аутофагии и дифференцирования [Aymard E. et al., 2011]. 73 Рисунок 12. Распределение цитокератинов-5, -10 в кератиноцитах после гиперосмотического воздействия (8 г/л). Увеличение х400. Кроме того, увеличивалось количество кератиноцитов, активно синтезирующих цитокератин-10, с 3% в контрольных клетках до 25% в клетках после гиперосмотического воздействия (Рисунок 13). Следует отметить, что в указанные сроки не происходило ожидаемого сокращения экспрессии цитокератина-5, маркирующего базальные кератиноциты, наряду с усилением экспрессии цитокератина-10, маркирующего дифференцированные клетки. В популяции также присутствуют клетки, экспрессирующие оба цитокератина одновременно, чего не происходит в нормальных кератиноцитах in 74 vivo. Это является особенностью выбранной в качестве модели культуры кератиноцитов [Page S.M., Brownlee G.G., 1998]. Рисунок 13. Распределение цитокератина-10 до и после гиперосмотического воздействия (панорамный снимок 5х5 полей зрения, увеличение х80). В целом, на данном этапе исследования установлено, что воздействие гиперосмотическими растворами усиливает синтез цитокератина-10 примерно у четверти клеточной популяции. Кроме того, происходит усиление экспрессии филаггрина и лорикрина, что свидетельствует об индукции дифференцировочных процессов в кератиноцитах. Полученные результаты согласуются с литературными данными, полученными после гиперосмотического воздействия на кератиноциты сорбитолом [Mammone T. et al., 2007]. Также эти результаты объясняют получаемые позитивные эффекты при бальнеотерапии высокоминерализованными растворами, а именно, восстановление эпидермального барьера [Лузгина Н.Г. и др., 2006; Новиков А.И., и др., 2006; Harari M. et al., 2000], вследствие активации процессов дифференцирования и ингибирования пролиферации кератиноцитов. По-видимому, дифференцированию подверглись те кератиноциты, в которых в ответ на гиперосмотическое воздействие произошел арест клеточного цикла в G0-стадии. Известно, что в нормальных условиях в коже процессу дифференциро- 75 вания кератиноцитов предшествует переход клетки из G1 в G0-стадию [Gandarillas A. et al., 2000]. Дальнейшие исследования были направлены на изучение влияния гиперосмотического воздействия на работу систем, участвующих как в процессах дифференцирования, так и в обеспечении гомеостазирующих функций, формирующих клеточный ответ на изменение условий окружающей среды. 3.5 Исследование особенностей продукции активных форм кислорода кератиноцитами при гиперосмотическом воздействии Активные формы кислорода образуются в клетках в ходе естественного метаболизма дыхательной цепи переноса электронов или системой ферментов NADPH оксидаз. Последние, как правило, выполняют защитную функцию и продуцируются специализированными клетками, в то время как образующиеся в цепи переноса электронов АФК (митохондриальные) являются результатом утечки электронов из комплексов 1 и 3 [Genova M.L. et al., 2001]. Митохондриальные АФК (мАФК) играют важную роль в физиологии клетки, участвуют в инициации и регулировании процессов аутофагии, пролиферации и дифференцирования [Kato M. et al., 1995; Garach-Jehoshua O. et al., 1998; Breitkreutz D. et al., 1998]. А) Результаты исследования продукции АФК на проточном цитофлуориметре. Исследование продукции АФК для выявления раннего клеточного ответа проводили на двух сроках: через 10 и 120 минут после начала гиперосмотического воздействия. Установлено, что уже через 10 минут после начала воздействия гиперосмотическими растворами в концентрациях 4 и 8 г/л происходило увеличение количества детектируемого супероксид-аниона (Рисунок 14.А). Одновременно отмечали увеличение количества перекиси водорода в ответ на гиперосмотические воздействие на концентрациях 2, 4, 8 г/л (Рисунок 14.Б). Через 120 минут после начала эксперимента уровень продукции супероксид-аниона и перекиси водорода клетками восстанавливался до контрольного во всех группах. Большинство АФК в клетке образуется из супероксид-аниона. Вероятно, супероксид-анион под воздействием гиперосмотического раствора в концентрации 2 г/л все же образуется, но в меньшем количестве, чем в случае более высоких концентраций растворов. В результате быстрого конвертирования супероксид-аниона 76 в перекись водорода это количество не может быть детектировано использованным методом. В то же время, данные о продукции перекиси водорода свидетельствуют о том, что гиперосмотическое воздействие всеми выбранными концентрациями сопряжено с повышением продукции гидроперекисей. А Б Рисунок 14. Результат измерения продукции супероксид-аниона (А) и гидроперекисей (Б) кератиноцитами в ответ на гиперосмотическое воздействие. Б) Исследование на конфокальном микроскопе в реальном времени. Исследование продукции АФК при помощи лазерной сканирующей конфокальной микроскопии имеет преимущество перед проточной цитофлуориметрией, 77 так как представляется возможным визуализация качественного распределения продуктов перекисного окисления в кератиноцитах и выявление гетерогенности клеточной популяции по этому признаку. Учитывая, что согласно данным, полученным на проточном цитофлуориметре, усиление продукции АФК происходит достаточно быстро, представлялось полезным исследовать динамику продукции АФК в реальном времени в первые минуты экспозиции с гиперосмотическим раствором. Результат исследования образования АФК в реальном времени представлен только с индикатором перекиси водорода – H2DCF-DA (Рисунок 15). В условиях выбранной методики продукт окисления DHE не детектировался в клетках. В данной части эксперимента использовали максимальную концентрацию гиперосмотического раствора – 8 г/л. Накопление DCF измеряли сразу после начала воздействия ГР на кератиноциты. Установлено, что увеличение концентрации АФК начиналось с первых минут и продолжалось в течение 10 минут, после чего сохранялось постоянным. Измерение проводили в течение 30 минут, поскольку по истечении этого времени начиналось увеличение продукции АФК и в контрольных клетках – по-видимому, изза фототоксического эффекта лазерного облучения [Flock A. et al., 1998]. Рисунок 15. Результат измерения продукции АФК кератиноцитами во время гиперосмотического воздействия. Значения интенсивности флуоресценции нормированы на контроль. Время – в секундах. 78 Примечательно, что после гиперосмотического воздействия наблюдали выраженную гетерогенность клеток по продукции гидроперекисей, области с повышенной продукцией обнаруживали в отдельных скоплениях клеток, а также в кластерах клеток на краю больших клеточных колоний (Рисунок 16). Следует отметить, что в контрольной клеточной популяции также обнаружили гетерогенность по продукции гидроперекисей, что объясняется регуляторной функцией молекул Н2О2, выступающих в роли сигнальных посредников, и их различной концентрацией, в зависимости от физиологического статуса клетки (например, от стадии клеточного цикла) [Sena L.A., Chandel N.S., 2012]. Рисунок 16. Продукция АФК кератиноцитами до и после гиперосмотического воздействия. Интенсивность флуоресценции DCF обозначена цветовым градиентом. Увеличение х400. Данные о продукции АФК, полученные при помощи лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, несколько отличаются от результатов на проточном цитофлуориметре, главным образом количественно (двукратное усиление продукции АФК, детектируемое в реальном времени на конфокальном микроскопе, против трехкратного, детектируемого на проточном цитофлуориметре), что скорее всего связано со специфической пробоподготовкой клеток для цитофлуориметрии, 79 в частности трипсинизацией кератиноцитов для открепления от подложки, что само по себе является стрессирующим воздействием на клетки и дополнительной стимуляцией, усиливающей продукцию АФК. Наряду с этим, исследование динамики продукции АФК на конфокальном микроскопе проводили на специальных культуральных чашках, без ферментативной обработки клеток. В целом, оба метода отражают характер динамики продукции АФК при гиперосмотическом воздействии. Наблюдаемое увеличение продукции АФК кератиноцитами может быть связано с резким повышением внутриклеточного уровня кальция, высвобождающегося из клеточных депо в ответ на дегидратацию [Dascalu A. et al., 2000]. Это, в свою очередь, может приводить к повышению уровня ионов кальция и в митохондриях, что также приводит к усилению продукции АФК [Adam-Vizia V., Starkov A.A., 2010]. Как уже упоминалось ранее, митохондрии являются важным источником АФК, образующихся в цепи переноса электронов на митохондриальных мембранах [Genova M.L. et al., 2004]. Было проведено исследование изменения митохондриального потенциала кератиноцитов ∆Ψm в ответ на гиперосмотическое воздействие. Измерение динамики трансмембранного митохондриального потенциала ∆Ψm проводили на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе в реальном времени, в тех же условиях, что и при измерении АФК, в течение 30 минут, чтобы избежать фототоксического эффекта). Обнаружено, что в первые 5 минут после добавления к культуре клеток гиперосмотического раствора происходило небольшое, но достоверное падение митохондриального потенциала, после чего его уровень значимо не изменялся (Рисунок 17). 80 Рисунок 17. Результат измерения трансмембранного митохондриального потенциала (∆Ψm) кератиноцитов во время гиперосмотического воздействия. Значения интенсивности флуоресценции нормированы на контроль. Время – в секундах. Быстрое падение митохондриального потенциала в ответ на гиперосмотическое воздействие, скорее всего, связано с разобщением цепи переноса электронов, являющегося защитным механизмом клетки, который приводит к постепенному снижению уровня продукции АФК [Mailloux R.J., Harper M., 2011]. Тот факт, что у части популяции кератиноцитов после гиперосмотического воздействия усиливалась экспрессия маркеров дифференцирования, в то время как у других происходило восстановление клеточного цикла, можно объяснить гетерогенностью популяции кератиноцитов в культуре по продукции перекиси водорода, которая является ключевым медиатором терминального дифференцирования кератиноцитов [Deruy E. et al., 2010]. Таким образом, функциональное состояние отдельных клеток определяет последствия гиперосмотического воздействия на эти клетки, проявляющиеся торможением клеточного цикла и дифференцированием либо, напротив, активной пролиферацией. Вместе с тем, кроме разобщения цепи переноса электронов на митохондриальных мембранах, повышенное образование АФК может приводить к активации 81 редокс-чувствительных сигнальных систем клетки, необходимых для их элиминации. Образующиеся в ходе метаболизма клетки АФК являются потенциальной угрозой для целостности клеточных структур и генома. В физиологических условиях эти АФК активно нейтрализуются внутриклеточными антиоксидантными ферментами, среди которых важную роль играют супероксиддисмутаза, пероксиредуктазы, глутатионтрансфераза и другие [Калинина Е.В., 2008]. Резкое увеличение продукции АФК приводит к повышению активности антиоксидантных систем, которое обеспечивается активацией редокс-чувствительного фактора транскрипции Nrf2 [Ткачев В.О. и др., 2011; Chen X.L., Kunsch C., 2004]. В процессе дифференцирования количество АФК в кератиноцитах увеличивается, что приводит к каскаду сигнальных событий и структурных изменений, необходимых для формирования рогового слоя [Piao M.S. et al., 2012]. К таковым относятся транскрипционные факторы Nrf2 и NF-κB, которые играют важную роль в ответе кератиноцитов на повреждение и регулируют процессы пролиферации и дифференцирования [Seitz C.S. et al., 1998; Piao M.S. et al., 2011]. 3.6 Исследование активации сигнальной системы Nrf2/Keap1/ARE в кератиноцитах при гиперосмотическом воздействии Активация Nrf2 опосредуется деградацией его комплекса с репрессорным белком Keap1, после чего происходит транслокация Nrf2 в ядро и формированием гетеродимеров с maf-белками, что позволяет ему связываться с антиоксидантреспонсивными элементами промоторов генов-мишеней [Motohashi H. et al., 2004]. Исследование изменения активности белка Nrf2 проводили через 30 и 120 минут воздействия гиперосмотическим раствором. Эти сроки были выбраны согласно данным полученным при исследовании продукции АФК кератиноцитами. Кроме того, исследования ядерной транслокации Nrf2 проводили через 4 и 24 часа экспозиции. Установлено, что воздействие гиперосмотическим раствором препарата «Рапан» в концентрации 8 г/л приводило к активации транскрипционного фактора Nrf2, перераспределению данного транскрипционного фактора внутри клетки (Рисунок 18) и его накоплению в ядре (Рисунок 19). 82 Рисунок 18. Внутриклеточное распределение транскрипционного фактора Nrf2 в кератиноцитах на разных сроках воздействия гиперосмотическим раствором (8 г/л). Увеличение х400. 83 Рисунок 19. Результат измерения количества транскрипционного фактора Nrf2 в ядрах кератиноцитов на разных сроках воздействия гиперосмотическим раствором (8 г/л). При исследовании характера внутриклеточного распределения Nrf2 и его репрессора Keap1 установлено, что в контрольных клетках транскрипционный фактор Nrf2 находится в равновесном состоянии и обнаруживается как в цитоплазме кератиноцитов, так и в их ядрах. После гиперосмотического воздействия происходит диссоциация комплекса Nrf2/Keap1 и активация транскрипционного фактора Nrf2, о чем свидетельствует его накопление в ядре, то время как Keap1 и в контроле, и в эксперименте остается в цитоплазме (Рисунок 20). Процесс разобщения комплекса Nrf2/Keap1 и импорта транскрипционного фактора в ядро в ответ на гиперосмотическое воздействие происходит довольно быстро. Согласно литературным данным, диссоциация транскрипционного фактора Nrf2 со своим белком репрессором Keap1 происходит за минуты [Kaspar J.W. et al, 2009]. 84 Рисунок 20. Внутриклеточное распределение фактора транскрипции Nrf2 и его репрессорного белка Keap1 в кератиноцитах. Увеличение х400. 85 Таким образом, на данном этапе исследования было установлено, что накопление транскрипционного фактора Nrf2 в ядре начинается достаточно быстро и обнаруживается уже через 30 минут гиперосмотического воздействия на кератиноциты. Максимальный уровень активности Nrf2 наблюдали через 2 часа после начала воздействия ГР, сохраняющийся до 4-х часов. Полученные результаты согласуются с наблюдаемым ранее снижением продукции АФК (Рисунок 14), что свидетельствует об активации ферментов антиоксидантных систем, гены которых находятся под контролем транскрипционного фактора Nrf2 [Kaspar J.W. et al, 2009]. Однако в данном случае нельзя отводить фактору транскрипции Nrf2 основную роль в элиминации АФК, так как, несмотря на его быструю диссоциацию с репрессорным белком Keap1 и транслокацию в ядро, активация генов мишеней и внутриклеточных антиоксидантных ферментов требует большего времени, чем разобщение цепи переноса электронов на мембранах митохондрий, который реализуется за минуты [Desai B.N. et al., 2002]. Поэтому, скорее всего, реализуется синергическое действие активации транскрипционного фактора Nrf2 и разобщения цепи переноса электронов. Примечательно, что в отличие от обнаруженной гетерогенности кератиноцитов по продукции АФК (Рисунок 16) активация транскрипционного фактора Nrf2 происходит во всех клетках в популяции. Репрессорный белок Keap1 распределен по цитоплазме кератиноцитов в контрольных клетках, однако после гиперосмотического воздействия его содержание уменьшается, по-видимому, претерпевая деградацию в протеосомах и ослабляя ингибирование транскрипционного фактора Nrf2 [Kobayashi A. et al., 2006]. Следует отметить, что в экспериментах с длительным гиперосмотическим воздействием на кератиноциты (24 ч) не наблюдали накопление транскрипционного фактора Nrf2 в ядре. По-видимому, это связано с тем, что к указанному сроку Nrf2 выполнил свою функцию в активации генов мишеней, направленных на устранение стрессирующего воздействия на клетку, и связывания Nrf2 c промотором ARE не происходит. Кроме гомеостазирующей функции транскрипционный фактор Nrf2 участвует в процессе дифференцирования кератиноцитов. Так, показано, что в эпидермисе активность этого фактора увеличивается в дифференцирующихся клетках, в на- 86 правлении от базального слоя к роговому [Piao M.S. et al., 2011], что, вероятно, предохраняет клетки более низко расположенных слоев эпидермиса от разрушительного воздействия АФК, неизбежно образующихся вследствие контакта эпидермиса c внешней средой. Отдельного рассмотрения заслуживает возможность взаимосвязи цитоскелета и компонентов сигнальной системы Nrf2/Keap1. Существует несколько гипотез, отражающих модели активации транскрипционного фактора Nrf2 и его разобщения с репрессорным белком Keap1. Есть сведения, что репрессорный белок Keap1, обладающий в собственной структуре актин-связывающими мотивами, может «заякоривать» Nrf2 в цитоплазме, механически препятствуя его перемещению в клеточное ядро и взаимодействию с антиоксидант-респонсивным элементом [Kang M. et al., 2004]. Согласно другим данным, локализация комплекса Nrf2/Keap1 в цитоплазме в условиях физиологической нормы обеспечивается за счет динамической регуляции процессов ядерного импорта и экспорта [Kaspar J.W. et al., 2009]. Вероятным решением данной проблемы является возможность наличия ассоциации элементов сигнальной системы Nrf2/Keap1 c элементами цитоскелета только в определенных типах клеток, например в кератиноцитах, обладающих развитым актиновым цитоскелетом в кортикальном слое – в зоне, где сосредоточены регуляторные элементы, обеспечивающие проведение сигнала от мембранных структур в ядро [Kang M. et al., 2004]. Было проведено исследование солокализации транскрипционного фактора Nrf2 с актиновым цитоскелетом кератиноцитов во время гиперосмотического воздействия (Рисунок 21). 87 Рисунок 21. Солокализация актинового цитоскелета кератиноцитов с Nrf2. Стрелками в контрольных клетках показаны области солокализации. Увеличение х400. 88 В контрольных клетках транскрипционный фактор Nrf2 локализован в основном в цитоплазме, где наблюдали его солокализацию с актиновыми филаментами. При гиперосмотическом воздействии наблюдали разобщение Nrf2 с актиновыми филаментами и его транслокацию в ядро, причем этот эффект был наиболее выражен на максимальной концентрации ГР (8 г/л). В целом, картина распределения Nrf2 однозначно свидетельствует об активации этого транскрипционного фактора в ответ на гиперосмотическое воздействие. Кроме того, получены данные по солокализации Nrf2 с актиновыми филаментами, причем характер их взаимодействия изменялся во время гиперосмотического воздействия, очевидно, из-за конформационных изменений актинового цитоскелета, что может служить дополнительным триггером в активации данного транскрипционного фактора в кератиноцитах. 3.7 Характеристика актинового и тубулинового цитоскелета кератиноцитов при гиперосмотическом воздействии Цитоскелет клетки представлен динамичными структурами, способными быстро реорганизоваться в условиях изменения окружающей среды, что позволяет развить адаптивную реакцию. Проведено исследование актинового и тубулинового компонентов цитоскелета кератиноцитов при гиперосмотическом воздействии. Обнаружено изменение в характере распределения актиновых филаментов в клетках. Наблюдали уменьшение количества стресс-фибрилл и образование в кератиноцитах ламеллоподобного края (Рисунок 22). Кроме того, в цитоплазме клеток во время гиперосмотического воздействия обнаружили большое количество фрагментированных актиновых филаментов, что говорит об активном перераспределении актина внутри клетки во время гиперосмотического воздействия. 89 Рисунок 22. Структура актинового цитоскелета кератиноцитов: А. – контрольные клетки; Б – во время гиперосмотического воздействия. Увеличение х1000. Внутриклеточный контроль за перестройками актинового цитоскелета осуществляется при участии малых ГТФаз. Малые ГТФазы RhoA, Rac1 и Cdc42 действуют в трех сигнал-проводящих цепях, регулируя формирование различных структур актинового цитоскелета: пучков актиновых стресс-фибрилл, ламеллоподий и филоподий соответственно [Raftopoulou M., Hall A., 2004]. 90 Обнаруженный характер перераспределения актина – уменьшение количества стресс-фибрилл и появление ламеллоподобного края – свидетельствует об активации белков подгруппы Rac, а именно Rac1. Примечательно и то, что в этих клетках кроме ламеллоподий образуется фрагментированный актин, распределенный по всей цитоплазме. Подобные структуры встречались в контрольных клетках гораздо реже. За стабилизацию актиновых филаментов отвечают Rho белки, участвующие в образовании стресс-фибрилл. Rho белки стабилизируют миозинсодержащие актиновые филаменты, активируя LIM-киназу, которая ингибирует процессы разрезания и деполимеризации актиновых филаментов [Raftopoulou M., Hall A., 2004]. Поэтому наличие фрагментированных актиновых филаментов также свидетельствует в пользу более активной работы Rac1 киназы над Rho киназой [Bustelo X.R. et al., 2007] во время гиперосмотического воздействия. За реорганизацию микротрубочек отвечают малые ГТФазы, как и в случае актинового цитоскелета [Rodriguez O.C. et al., 2003]. Обнаружено, что при гиперосмотическом воздействии происходит перераспределение микротрубочек на периферию клеток, ближе к краю колонии, и поляризация клеток (Рисунок 23). Рисунок 23. Реорганизация тубулинового цитоскелета кератиноцитов в ответ на гиперосмотическое воздействие. Увеличение х400. 91 Наблюдаемый характер распределения микротрубочек свидетельствует об активации Rac1, так как в отношении тубулина именно эта ГТФаза стимулирует рост микротрубочек во время поляризации клеток [Rodriguez O.C. et al., 2003; Wittmann T., Waterman-Storer C.M., 2004], которую мы наблюдали во время гиперосмотического воздействия. Таким образом, на данном этапе исследования установлено, что гиперосмотическое воздействие приводит к реорганизации актинового и тубулинового цитоскелета клетки, что на молекулярном уровне, по-видимому, характеризуется переключением с преимущественной работы Rho белка на активацию Rac1 белка. Полученные результаты являются полезными данными, т.к. малые ГТФазы семейства Rac играют важную роль в различных внутриклеточных процессах, выступая первым звеном в проведении внутриклеточных сигналов, включая реализацию механизмов адаптивного ответа клетки на воздействия окружающей среды, в частности активацию стресс киназы р38 и транскрипционного фактора NF-κB [Zampetaki A. et al., 2005]. Ранее уже упоминалась особая роль транскрипционного фактора NF-κB в поддержании гомеостаза и формировании различных тканей, включая эпителиальные [Wullaert A., Bonnet M.C., 2011], а также его роль в иммунной системе [Hayden M.S., Ghosh S., 2011], NF-κB регулирует продукцию многих цитокинов в клетке. К ним относятся ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНО-α и ИЛ-10, продуцируемые кератиноцитами и другими клетками [Blackwell T.S., Christman J.W., 1997]. Кроме того, NF-κB является редокс-чувствительным фактором транскрипции, активность которого изменяется в ответ на образование АФК в клетках [Morgan M.J., Liu Z., 2011]. Таким образом, в контексте полученных данных представлялось актуальным исследование активности транскрипционного фактора NF-κB и продукции некоторых цитокинов кератиноцитами в ответ на гиперосмотическое воздействие. 3.8 Исследование продукции цитокинов ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНО-α, ИЛ-10 и активации транскрипционного фактора NF-κB в ответ на гиперосмотическое воздействие Продукцию цитокинов исследовали при помощи иммуноферментного анализа. Измерения проводили через сутки после непрерывного и часового воздействия гиперосмотическими растворами (ГР). В обоих случаях не было отмечено измене- 92 ний в продукции секретируемых ИЛ-1β, ИЛ-10 и ФНО-α (Рисунок 24). Рисунок 24. Результат ИФА продукции цитокинов ИЛ-1β, ИЛ-10, ФНО-α в кератиноцитах в ответ на гиперосмотическое воздействие. Указанные цитокины формируют в коже коммуникационную и регуляторную сеть для взаимодействия клеток между собой. Продукция этих цитокинов резко увеличивается в ответ на механическое повреждение, воздействие антигенов, 93 стимуляторов воспалительных реакций и др. Процесс реагирования запускается с усиления продукции ИЛ-1β и ФНО-α [Лезвинская Е.М. и др., 2003]. Тот факт, что мы не наблюдали развитие подобной реакции, объясняется отсутствием в выбранной модельной системе клеточного повреждения и воспалительного процесса. Однако существенные различия были обнаружены в продукции ИЛ-6 (Рисунок 25). Рисунок 25. Результат ИФА продукции ИЛ-6 в кератиноцитах в ответ на гиперосмотическое воздействие. Этот цитокин продуцируется кератиноцитами HaCaT при культивировании в обычных условиях (концентрация при культивировании в 1 мл культуральной среды, в условиях клеточного монослоя, составляла 20 пг/мл; для удобства результаты представлены в относительных единицах). Часовое воздействие гиперосмотическим раствором приводило к двукратному увеличению концентрации ИЛ-6 через сутки после гиперосмотического воздействия. Полученные данные по повышению продукции ИЛ-6 в кератиноцитах могут объяснять временное обострение воспалительных проявлений в коже (усиление эритемы), наблюдаемое в первые сутки после бальнеопроцедур, применяемых для лечения хронических воспалительных процессов в коже [Новиков А.И. и др., 2006]. Более длительная экспозиция кератиноцитов с гиперосмотическим раствором при- 94 водила к снижению продукции ИЛ-6 по сравнению с таковым в контроле, что свидетельствует о супрессирующем влиянии гиперосмотических растворов на продукцию ИЛ-6 при продолжительном воздействии. Продукцию всех вышеперечисленных цитокинов регулирует фактор транскрипции NF-κB. Причем провоспалительные и противовоспалительные цитокины активируются одним и тем же гетеродимером p50/RelA(p65), а «баланс» продукции цитокинов определяется множеством внешних и внутриклеточных факторов, от которых зависит судьба клетки. ФНО-α поддерживает активность NF-κB в кератиноцитах, тогда как ИЛ-10 выполняет роль ингибитора [Wullaert A., Bonnet M. C., 2011]. NF-κB также играет важную роль в процессе дифференцирования кератиноцитов эпидермиса. Его влияние на процессы пролиферации и дифференцирования кератиноцитов зависит от степени активации субъединицы p50. В норме, в базальных кератиноцитах активность этой субъединицы снижена и увеличивается по мере дифференцирования кератиноцитов. Вероятно, это необходимо для остановки клеточного цикла, поскольку ингибирование данной субъединицы приводит к гиперпролиферации эпидермиса, а увеличение экспрессии субъединицы p50 в базальных кератиноцитах приводит к гипоплазии эпидермиса [Seitz C.S. et al., 1998; Takao J. et al., 2003]. В ходе исследования установлено, что кератиноциты HaCaT в контрольной группе (обычные условиях культивирования, без ГР) характеризуются выраженной активностью p50 и p65 субъединиц NF-κB (Рисунок 26). Видимо, относительно высокий базальный уровень продукции ИЛ-6 (20 пг/мл, в условиях монослоя) в контрольных кератиноцитах поддерживается как раз в связи с конституционной активностью транскрипционного фактора NF-κB. Экспозиция кератиноцитов с ГР в течение 1 часа (имитация режима бальнеотерапии) не оказывала влияния на конститутивное количество транскрипционного фактора, находящегося в ядре. 95 Рисунок 26. Характер распределения субъединиц р50 и р65 транскрипционного фактора NF-κB в контрольных кератиноцитах. Увеличение х400. В то же время более длительное гиперосмотическое воздействие (24 ч) приводило к снижению ядерной локализации субъединиц p65 и p50, причем в случае с p50 происходило практически полное удаление субъединицы из ядра (Рисунки 2728), что, вероятно, служит причиной снижения продукции ИЛ-6 в тех же условиях (24 ч в условиях ГР). 96 Рисунок 27. Характер распределения субъединиц р50 и р65 транскрипционного фактора NF-κB в кератиноцитах через 24 часа после гиперосмотического воздействия. Увеличение х400. 97 Рисунок 28. Результат измерения уровня транслокации субъединиц р50 и р65 транскрипционного фактора NF-κB в ядрах кератиноцитов через 24 часа после гиперосмотического воздействия. Полученные данные об увеличении продукции ИЛ-6 и неизменном уровне ядерной локализации NF-κB при одинаковых условиях экспозиции с гиперосмотическим раствором на первый взгляд не согласуются между собой, учитывая, что ген ИЛ-6 контролируется промотором, активируемым данным транскрипционным фактором. В то же время это может быть связано с различиями в механизмах активации NF-κB у кератиноцитов HaCaT и нормальных кератиноцитов. Так, для кератиноцитов HaCaT показана большая чувствительность к ультрафиолетовому излучению, связанная с задержкой активации NF-κB [Lewis D.A. et al., 2006]. Также остается неясным отсутствие продукции ИЛ-1β, ФНО-α и ИЛ-10, в то время как уровень ИЛ-6 изменялся от различных режимов воздействия гиперосмотическими растворами. Хотя следует заметить, что использованная нами клеточная модель исключает воспалительный процесс, это может объяснять отсутствие продукции провоспалительных цитокинов ИЛ-1β, ФНО-α. Таким образом, удалось установить, что прямое воздействие гиперосмотического раствора препарата «Рапан» на кератиноциты не приводит к продукции провоспалительных цитокинов ИЛ-1β и ФНО-α и противовоспалительного цитокина ИЛ-10, но сопряжено с усилением продукции ИЛ-6 в ответ на непродолжительную 98 экспозицию с гиперосмотическими растворами и ингибированием продукции ИЛ-6 при продолжительном воздействии на клетки. Видимо, индуцибельный эффект гиперосмотического воздействия на продукцию ИЛ-6 реализуется по тому же самому механизму, что и в эндотелии сосудов в ответ на биомеханический стресс, когда NF-κB-зависимое усиление продукции ИЛ-6 связано с активацией малой ГТФазы Rac1, обеспечивающей реорганизацию актинового цитоскелета при гидростатическом сжатии клетки [Zampetaki A. et al., 2005]. Последующее падение уровня ИЛ-6 согласуется с тем, что после суточной экспозиции с гиперосмотическими растворами происходит ингибирование транскрипционного фактора NF-κB и, соответственно, подконтрольного ему гена ИЛ-6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В ходе проведенных исследований установлено, что воздействие гиперосмотическими растворами препарата «Рапан» на кератиноциты оказывает временный цитостатический эффект, вызывая арест клеточного цикла в фазе G0 и G1 и, как следствие, остановку пролиферации. При этом часть клеток, находящихся в фазе G1, в дальнейшем образует новый пролиферирующий пул, тогда как клетки, находящиеся в G0-фазе клеточного цикла, претерпевают процесс дифференцирования, сопровождающийся активацией макроаутофагии и экспрессией белков, характерных для дифференцированных кератиноцитов – филаггрина, лорикрина и цитокератина-10. Данные свойства выбранных растворов могут быть использованы для направленной регуляции процессов клеточной пролиферации и дифференцирования, в случае гиперпролиферативных проявлений в коже при воспалительных заболеваниях. Установлено, что гиперосмотическое воздействие на кератиноциты линии HaCaT приводит к генерации внутриклеточных АФК. Усиление продукции АФК развивается в первые минуты после начала гиперосмотического воздействия и носит временный характер. Скорее всего, продукция АФК связана с влиянием гиперосмотических растворов на функцию митохондрий, поскольку одновременно с повышением продукции АФК отмечали снижение трансмембранного митохондри- 99 ального потенциала. Полученные в ходе этого эксперимента данные впервые указывают на прямую связь между гиперосмотическим воздействием и окислительным стрессом в кератиноцитах. Кроме того, учитывая собственную роль АФК в регулировании дифференцировочных процессов кератиноцитов, нельзя исключать, что влияние гиперосмотического воздействия усиливает синергизм клеточных механизмов, отвечающих за дифференцирование клеток. Гиперосмотическое воздействие на кератиноциты и генерация АФК приводит к активации редокс-чувствительного транскрипционного фактора Nrf2, причем эта активация происходит одновременно с повышением продукции АФК. С одной стороны, это служит причиной элиминации АФК, а с другой, вероятно, приводит к запуску сигнальных каскадов, которые могут обеспечить как восстановление клеточного цикла, так и инициацию процесса дифференцирования клеток. Кроме того, после гиперосмотического воздействия изменятся характер взаимодействия цитоплазматического Nrf2 с актиновым цитоскелетом кератиноцитов, его реорганизация и «разобщение» с Nrf2, что может выступать в роли возможного дополнительного механизма активации транскрипционного фактора Nrf2. Исследование реорганизации цитоскелета кератиноцитов во время гиперосмотического воздействия свидетельствует об активации малой ГТФазы Rac1, обеспечивающей клеточный сигналинг от цитоплазматической мембраны к ядру и запуск механизмов адаптивного ответа клетки на гиперосмотическое воздействие. Активация малой ГТФазы Rac1 сопряжена с функционированием фактора транскрипции NF-κB, под контролем которого находятся различные провоспалительные и противовоспалительные цитокины. В ходе исследования продукции цитокинов ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-10, ФНО-α установлено, что прямое воздействие гиперосмотических растворов на кератиноциты не приводит к активации продукции ИЛ1β, ИЛ-10, ФНО-α, но сопряжено с изменение продукции ИЛ-6 при разных режимах воздействия гиперосмотическими растворами. Особенностью воздействия гиперосмотических растворов является также снижение ядерной локализации фактора транскрипции NF-κB при длительной экспозиции. Однако остается не ясным, отражает ли ядерная локализация NF-κB истинный уровень активности этого транскрипционного фактора, учитывая, что непродолжительное гиперосмотическое воздействие приводит к существенному увеличению продукции NF-κB зави- 100 симого цитокина ИЛ-6, но не влияет на продукцию других NF-κB-зависимых цитокинов, таких как ИЛ-1β и ФНО-α. Возможно, данное явления объясняется отсутствием воспалительного процесса в используемой клеточной модели. Следует заметить, что индуцибельный эффект гиперосмотического воздействия на продукцию ИЛ-6, видимо, может действовать синергично с механизмами, обеспечивающими выход клетки из ареста клеточного цикла и стимулирующими пролиферативную активность. В целом, полученные данные впервые комплексно описывают молекулярноклеточные процессы и их механизмы, реализующиеся в ответ на гиперосмотическое воздействие на кератиноциты in vitro. Полученные результаты не только проясняют известные клинические данные по лечению воспалительных процессов в коже гиперосмотическими растворами, но и предполагают механизмы их реализации через изменение пролиферативной активности, усиление дифференцировочных процессов и активацию редокс-чувствительных сигнальных систем клетки. Полученные данные, несомненно, полезны для разработки направленного и осознанного воздействия на эпидермис гиперосмотическими растворами, с возможностью модулировать внутриклеточные процессы при воспалительных заболеваниях кожи, таких как псориаз и атопический дерматит. ВЫВОДЫ: 1. Гиперосмотическое воздействие растворами препарата «Рапан» раз- личных концентраций оказывает обратимый дозозависимый цитостатический эффект на кератиноциты, сопровождающийся остановкой клеточного цикла в стадии G1/G0 и переходом части клеточной популяции в стадию G0, что свидетельствует о возможности направленной регуляции клеточной пролиферации выбранными растворами. 2. Гиперосмотическое воздействие растворами препарата «Рапан» со- пряжено с индукцией аутофагии и последующим дифференцированием кератиноцитов in vitro, не вызывая усиления апоптотической или некротической гибели. 3. Гиперосмотическое воздействие растворами препарата «Рапан» на ке- ратиноциты приводит к развитию окислительного стресса, усилению продукции 101 АФК и падению трансмембранного митохондриального потенциала, что служит доказательством прямой связи гиперосмотического и окислительного стресса. 4. Повышение продукции АФК при гиперосмотическом воздействии растворами препарата «Рапан» на кератиноциты приводит к активации редоксчувствительной сигнальной системы Nrf2/Keap1/ARE, участвующей в элиминации образованных АФК, что указывает на ее гомеостазирующую функцию в указанных экспериментальных условиях. 5. Гиперосмотическое воздействие растворами препарата «Рапан» при- водит к реорганизации актинового и тубулинового компонентов цитоскелета кератиноцитов, сопряженной с активацией малой ГТФазы Rac1, которая обеспечивает развитие адаптивного ответа клеток. 6. Гиперосмотические растворы препарата «Рапан» изменяют активность транскрипционного фактора NF-κB в кератиноцитах, что следует из характера распределения субъединиц р50 и р65 (снижение общего количества субъединиц в ядрах клеток). Это явление сопряжено с изменением продукции ИЛ-6, зависящим от продолжительности гиперосмотического воздействия, но не оказывает индуцибельного влияния на продукцию ИЛ-1β, ФНО-α и ИЛ-10. 102 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Быков В.Л. Частная гистология человека: краткий обзорный курс. 2-е изд. - Санкт-Петербург: СОТИС, 1999. – 301стр. 2. Гордеева А.В., Лабас Ю. А., Звягильская Р. А. Апоптоз одноклеточных ор- ганизмов: механизмы и эволюция // Биохимия. - 2004 г. - №10: Т. 69. - стр. 1301-1313. 3. Давыдова О.Б., Тупицина Ю.Ю., Анисимкина А.Н., Крикорова С.А. Лечеб- ное действие хлоридных натриевых ванн // Российский медицинский журнал. - 2002 г. № 7. - стр. 34-38. 4. Данлыбаева Г.А., Жылкибаев А.А., Рыков В.А., Тритек В.С. , Силаев Д.В., Гуляев А.Е. Цитотоксичность карбонилсодержащих соединений // Биотехнология. Теория и практика. - 2012 г. - Т. 3. - стр. 49-54. 5. Дацковский Я.С. Лечение псориаза высокоминерализованным бромйодным раствором // Российский журнал кожных и венерических болезней. - 2002 г. –Т. 2. - стр. 35-39. 6. Еронина Т.Б., Чеботарева Н.А., Курганов Б.И. Влияние осмолитов на акти- вацию и агрегацию мышечной гликогенфосфорилазы b под действием гуанидингидрохлорида. Ускорение агрегации белка в условиях краудинга // Биохимия. - 2005 г. -№ 9: Т. 70. стр. 1237-1244. 7. Зеленецкая В.С., Андреев С.В. О механизмах биологического и лечебного действия бальнеопроцедур // Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физической культуры. - 1992 г. – №1. - стр. 46-50. 8. Калинина Е.В., Чернов Н. Н., Саприн А.Н. Участие тио -, перокси- и глута- тион редоксинов в клеточных редокс-зависимых процессах // Успехи биологической химии. - 2008 г. - Т. 48. - стр. 319-358. 9. Кузнецов С.Л., Горячкина В.Л., Иванова М.Ю., Цомартова Д.А. Гистофи- зиология эпидермиса // Морфология. - 2012 г. - Т. 5. - стр. 76-85. 10. Лезвинская Е. М., Молочков В.А., Молочков А.В. Цитокины в генезе опухолей кожи // Иммуноонкология. – 2003г. -№ 3. –стр.92-100 11. Лузгина Н.Г., Потапова О.В., Гонцова А.А., Шкурупий В.А. Структурные особенности эпидермального барьера у лиц с синдромом недифференцированной дисплазии соединительной ткани // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009 г. - № 12. - стр. 690-692. 12. Лузгина Н.Г., Потапова О.В., Шкурупий В.А., Новиков А.И., Ермакова О.Б., Эффективность лечения атопического дерматита природными высокоминерализованными 103 водами в сочетании с УФО // Экспериментальная и клиническая дермато - косметология. 2006 г. - Т. 4. - стр. 59-62. 13. Новиков А.И., Шкурупий В.А., Лузгина Н.Г., Ермакова О.Б., Тырышкина Л.В. Эффективность восстановительного лечения больных атопическим дерматитом с разными вариантами бальнеологической реакции // Экспериментальная и клиническая дерматокосметология. - 2006 г. - Т. 5. - стр. 59-62. 14. Ткачев В.О., Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К. Механизмы работы сигнальной системы Nrf2/Keap1/ARE // Биохимия. - 2011 г. -№ 4: Т. 76. - стр. 502-519. 15. Баринов Э.Ф., Айзулятов Р.Ф., Баринова М.Э., Сулаева О.Н. Функциональ- ная морфология кожи: от основ гистологии // Клиническая дерматология и венерология. 2012 г.№ - 1.- стр 48-52. 16. Abdou A.G., Maraee A.H., Eltahmoudy M., El-Aziz R.A. Immunohistochemical expres-sion of GLUT-1 and Ki-67 in chronic plaque psoriasis // Am J Dermatopathol.. - 2013 . №7: V. 35. - P. 731-737. 17. Abramovits W., Perlmutter A. Steroids versus other immune modulators in the manage-ment of allergic dermatoses // Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. - 2006 . -№ 5: V. 6. P. 345-354. 18. Adam-Vizia V., Starkov A.A. Calcium and Mitochondrial Reactive Oxygen Spe- cies Generation: How to Read the Facts // Journal of Alzheimer's disease. - 2010 . - V. 20. - P. 413-426. 19. Adragna N.C., White R.E., Orlov S.N., Lauf P.K. K-Cl cotransport in vascular smooth muscle and erythrocytes: possible implication in vasodilation // Am J Physiol Cell Physiol. - 2000 . –V. 278 (2). - P. 381-390. 20. Andrei G., Duraffour S., Van den Oord J., Snoeck R. Epithelial raft cultures for investiga-tions of virus growth, pathogenesis and efficacy of antiviral agents // Res. Antiviral. 2010. - №3: V. 85. - P. 431-449. 21. Atzeni F., Ventura D., Batticciotto A., Boccassini L., Sarzi-Puttini P. Interleukin 6 block-ade: tocilizumab in psoriatic arthritis // J Rheumatol Suppl. - 2012. - 89. - P. 97-99. 22. Aymard E., Barruche V., Naves T., Bordes S. Autophagy in human keratinocytes: an early step of the differentiation? // Experimantal Dermatology. - 2011. - V. 20. - P. 263-268. 23. Bachelor M., Binder R.L., Cambron R.T., Kaczvinsky J.R., Spruell R., Wehmeyer K.R., Reilman R., Adams R., Tiesman J.P., Wang Y., Bascom C.C., Isfort R.J., Dicolandrea T. Transcriptional profiling of epidermal barrier formation in vitro // J Dermatol Sci. - 2014 . - №3: V. 73. - P. 187 - 197. 104 24. Bak J.P., Kim Y.M., Son J., Kim C.J., Kim E.H. Application of concentrated deep sea water inhibits the development of atopic dermatitis-like skin lesions in NC/Nga mice // BMC Complement Altern Med. - 2012 . - V. 12. - P. 1-10. 25. Barrientos S., Stojadinovich O., Golinko M.S., Brem H. Growth factors and cyto- kines in wound healing // Wound repair and regeneration. - 2008 . - V. 16. - P. 585-601. 26. Basham J.C., Chabrerie A., Kempson S.A. Hypertonic activation of the renal beta- ine/GABA transporter is microtubule dependent // Kidney International. - 2001. - V. 59. - P. 2182-2191. 27. Becker W. Emerging role of DYRK family protein kinases as regulators of protein stabil-ity in cell cycle control // Cell Cycle. - 2012. -№18: V. 11. - P. 3389-3394. 28. Bell E., Sher S., Hull B., Merrill C., Rosen S., Chamson A., Asselineau D., Dubertret L., Coulomb B., Lapiere C., Nusgens B., Neveux Y. The reconstitution of living skin // J In-vest Dermatol. - 1983. – V.81. - P. 2-10. 29. Bell S.P., Dutta A. DNA replication in eukaryotic cells // Annual review of bio- chemistry. - 2002. - V. 71. - P. 333-374. 30. Bernard D., Gosselin K., Monte D. Involvement of Rel/Nuclear Factor-kB Tran- scription factors in Keratinocyte Senescence // Cancer Research. - 2004. - V. 64. - P. 472-481. 31. Bernardi P., Scorrano L., Colonna R., Petronilli V., Di Lisa F. Mitochondria and cell death. Mechanistic aspects and methodological issues // Eur J Biochem . - 1999. - №3: V. 264. - P. 687-701. 32. Bernerd F. Human skin reconstructed in vitro as a model to study the keratinocyte, the fi-broblast and their interactions: photodamage and repair processes // J Soc Biol. - 2005. №4: V. 199. - P. 313-320. 33. Bieber T. Novak N. Pathogenesis of atopic dermatitis: new developments // Cur- rent Al-lergy and Asthma Reports. - 2009 . – V. 9. - P. 291-294. 34. Bienert G.P. Schjoerring J.K., Jahn T.P. membrane transport of hydrogen perox- ide // Bi-ochemical et biophysica Acta. - 2006. - V. 1758. - P. 994-1003. 35. Blackwell T.S., Christman J.W. The role of Nuclear Factor-κB in Cytokine Gene regulation // American journal of respiratory cell and molecular biology. - 1997. - V. 17. - P. 1-9. 36. Boer J., Schothorst A.A., Boom B., Hermans J., Suurmond D. Influence of water and salt solutions on UVB irradiation of normal skin and psoriasis // Arch. Dermatol. Res.. 1982. - V. 273. - P. 247-259. 37. Bortner C.D., Cidlowski J.A. Absence of volume regulatory mechanisms contrib- utes to the rapid activation of apoptosis in thymocytes // The American Journal of Physiology. 1996. - V. 271. - P. 950-961. 105 38. Bortner C.D., Cidlowski J.A. A necessary role for cell shrinkage in apoptosis // Biochemical pharmacology. - 1998 . - V. 56. - P. 1549-1559. 39. Boukmap P., Petrussevska R.T., Breitkreutz D., Hornung J., Markham A., Fusenig N.E. Normal keratinization in a sponta-neously immortalized human keratinocyte cell line // Journal of cellular biology. - 1988. - №3: V. 106. - P. 761-771. 40. Brand M.D. The sites and topology of mitochondrial superoxide // Experimental geron-tology. - 2010. - V. 45. - P. 466-472. 41. Breitkreutz D., Schoop V.M., Mirancea N., Baur M., Stark H.J., Fusenig N.E. Ep- idermal differentiation and basement membrane formation by HaCaT cells in surface transplants // European Journal of Biology. - 1998. - V. 75. - P. 273-286. 42. Brem H., Young J., Tomic-Canic M., Isaacs C., Ehrlich H.P. Clinical efficacy and mech-anism of bilayered living human skin equivalent (HSE) in treatment of diabetic foot ulcers // Surg Technol Int. - 2003 . – V. 11. - P. 23-31. 43. Bulavin D.V., Higashimoto Y., Popoff I.J., Gaarde W.A., Basrur V., Potapova O., Appella E., Fornace A.J.Jr. Initiation of a G2/M checkpoint after ultraviolet radiation requires p38 kinase. // Nature. - 2001. - V. 411. - P. 102-107. 44. Bustelo X.R., Sauzeau V., Berenjeno I.M. GTP-binding proteins of the Rho/Rac family regulation, effectors and functions in vivo // Bioassays. - 2007. -№4: V. 29. - P. 356-370. 45. Byun J.Y., Choin H.Y., Myung K.B., Choi Y.W. Expression of IL-10, TGF-β1 and TNF-α in Cultured Keratinocytes (HaCaT Cells) after IPL Treatment or ALA-IPL Photodynamic Treatment // Annals of Dermatology. - 2009. - №1: V. 21. - P. 12-17. 46. Caamaño J., Hunter C.A. NF-kappaB family of transcription factors: central regu- lators of innate and adaptive immune functions // Clinical Microbilogy reviews. - 2002. - V. 15. P. 414-429. 47. Candi E., Schmidt R., Melino G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. // Nat Rev Mol Cell Biol. - 2005. – V. 6. - P. 328-340. 48. Cao S., Zhang X., Mosser D.M. NF-κB1 (p50) Homodimers Differentially Regu- late Pro- and Anti-inflammatory Cytokines in Macrophages // The journal of biological chemistry. - 2006. - №36: V. 281. - P. 26041-26050. 49. Carr W.J., Oberly-Deegan R.E. Antioxidant proteins and reactive oxygen species are de-creased in a murine epidermal side population with stem cell-like characteristics // Hystochemistry and Cell biology. - 2011. - V. 135. - P. 293-304. 50. Chakravarty D., Cai Q., Ferraris J.D., Michea L., Burg M.B., Kültz D. Three GADD45 isoforms contribute to hypertonic stress phenotype of murine renal inner medullary cells. // Am J Physiol Renal Physiol. - 2002. – V. 283. - P. 1020-1029. 106 51. Chamulitrat W., Stremmel W., Kawahara T., Rokutan K., Fujii H. A constitutive NADPH oxidase-like system containing gp91phox homologs in human keratinocytes // Journal of investigative dermatology. - 2004. - V. 122. - P. 1000-1009. 52. Chandel N., Maltepe E., Goldwasser E., Mathieu C., Simon M., Schumacker P. Mito-chondrial reactive oxygen species trigger hypoxia-induced transcription // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1998. - V. 95. - P. 11715–11720. 53. Chandra J., Samali A., Orrenius S. Triggering and modulation of apoptosis by ox- idative stress // Free radical biology and medicine. - 2000. - V. 29. - P. 323-333. 54. Chen X.L., Kunsch C. Induction of cytoprotective genes through Nrf2/antioxidant re-sponse element pathway: a new therapeutic approach for the treatment of inflammatory diseases // Curr Pharm Des. - 2004. - №10: V. 8. - P. 879 - 891. 55. Cho H.Y., Reddy S.P., Debiase A. Gene expression profiling of NRF2-mediated protec-tion against oxidative injury // Free radical biology and medicine. - 2005. - №3: V. 38. P. 325-343. 56. Clanton T.L. Hypoxia-induced reactive oxygen species formation in skeletal mus- cle. // J Appl Physiol. - 2007. - №6: V. 102. - P. 2379-2388. 57. Collins J.M., Berry D.E., Bagwell C.B. Different rates of DNA synthesis during the S phase of log phase HeLa S3, WI-38, and 2RA cells. - 1980 . -№8: V. 288. - P. 3585-3590. 58. Crompton M. The mitochondrial permeability transition pore and its role in cell death // Biochem J. - 1999. – V.341. - P. 233-249. 59. Cross A.R., Jones O.T. Enzymic mechanisms of superoxide production. - 1991 . - №3: V. 1057. - P. 281-298. 60. Dallaglio K., Petrachi T., Marconi A., Truzzi F., Lotti R., Saltari A., Morandi P., Puviani M., Maiorana A., Roop D. R., Pincelli С., Isolation and Characterization of Squamous Cell Carcinoma-Derived Stem-like Cells: Role in Tumor Formation // Int J Mol Sci.. - 2013 . №10: V. 14. - P. 19540–19555. 61. Dascalu A., Matithyou A., Oron Y., Korenstein R. A hyperosmotic stimuls ele- vates intra-cellular calcium and inhibits proliferation of a human keratinocyte cell line // Journal of Investigative Dermatology. - 2000. - V. 115. - P. 714-. 62. Denda M., Katagiri C., Hirao T., Maruyama N, Takahashi M. Some magnesium salts and a mixture of magnesium and calcium salts accelerate skin barrier recovery. // Arch. Dermatol. Res. - 1999. - №10: V. 291. - P. 560-563. 63. Denda M., Fuziwara S., Inoue K. Influx of calcium and chloride ions into epider- mal keratinocytes regulates exocytosis of epidermal lamellar bodies and skin permeability barrier homeostasis // J. Invest. Dermatol. - 2003. -№ 2: V. 121. - P. 362-367. 107 64. Deruy E., Gosselin K., Vercamer C., Martien S., Bouali F., Slomianny C., Bertout J., Bernard D., Pourtier A., Abbadie C. MnSOD Upregulation Induces Au-tophagic Programmed Cell Death in Senescent Keratinocytes // PLOS One. - 2010 . –V. 5. - P. 1-18. 65. Desai B.N., Myers B.R. and Schreiber S.L. FKBP12-rapamycin-associated protein asso-ciates with mitochondria and senses osmotic stress via mitochondrial dysfunction // PNAS. - 2002 . - №7: V. 99. - P. 4319-4324. 66. Di Ciano C., Nie Z., Szaszi K., Lewis A, Uruno T, Zhan X, Rotstein OD, Mak A, Kapus A. Osmotic stress-induced remodeling of the cortical cytoskeleton // American journal of physiology. - 2002. - V. 283. - P. 850-865. 67. Diker-Cohen T., Koren R., Liberman U.A., Ravid A. Vitamin D protects keratino- cytes from apoptosis induced by osmotic shock, oxidative stress and tumor necrosis factor // Annals of New York Academy of Science. - 2003 . - V. 1010. - P. 350-353. 68. Dmitrieva N., Michea L., Burg M. p53 tumor suppressor protein protects renal in- ner me-dullary cells from hypertonic stress by restricting DNA replication . - 2001 . - 3 : V. 281. - P. 522-530. 69. Dmitrieva N., Kultz D., Michea L., Ferraris J, Burg M. Protection of renal inner medullary epithelial cells from apoptosis by hypertonic stress-induced p53 activation // The Journal of bio-logical chemistry. - 2000. - V. 275. - P. 18243-18247. 70. Dmitrieva N.I., Bulavin D.V., Fornace A.J. Rapid activation of G2/M checkpoint after hypertonic stress in renal innermedullary epithelial (IME) cells is protective and requires p38 kinase // Proctors of the national academy of sciences of the United States of Ameri-ca. 2002. - 1: V. 99. - P. 184-189. 71. Dmitrieva N.I., Michea L.F., Rocha G.M., Burg M.B. Cell cycle delay and apop- tosis in response to osmotic stress. // Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. - 2001. №3: V. 130. - P. 411-420. 72. Echtay K.S. Mitochondrial uncoupling proteins--what is their physiological role? - 2007 . - 10: V. 43. - P. 1351-1371. 73. Ehrlich H.P. Understanding experimental biology of skin equivalent: from labora- tory to clinical use in patients with burns and chronic wounds // Am J Surg. - 2004 . - 187(5A). P. 29-33. 74. Faruqi T.R., Gomez D., Bustelo X.R., Bar-Sagi D., Reich N.C. Rac1 mediates STAT3 activation by autocrine IL-6 // Proc Natl Acad Sci U S A.. - 2001. – V.98(16). - P. 90149019. 108 75. Feingold K., Elias P. The important role of lipids in the epidermis and their role in the formation and maintenance of the cutaneous barrier // Biochim Biophys Acta.. - 2014 . - 3 : V. 1841. 76. Finkel T. Oxygen radicals and signaling // Curr Opin Cell Biol. - 1998. - V. 10. - P. 248 - 253. 77. Finkel T. Reactive oxygen species and signal transduction // IUBMB Life. - 2001. - №1: V. 52. - P. 3-6. 78. Fischer C. P. Interleukin-6 in acute exercise and training: what is the biological rele-vance? // Exerc Immunol Rev.- 2006. - V. 12. - P. 6-33. 79. Fisher D., Krasinska L., Coudreuse D., Novák B. Phosphorylation network dy- namics in the control of cell cycle transitions // J Cell Sci. - 2012 . - V. 125. - P. 4703-4711. 80. Fisher D.A. Adverse effects of topical corticosteroid use // West. J. Med. - 1995. - №2: V. 162. - P. 123-126. 81. Flock A., Flock B., Scarfone E. Laser scanning confocal microscopy of the hear- ing organ: fluorochrome-dependent cellular damage is seen after overexposure. // J Neurocytol.. - 1998. - №7: V.27. - P. 507 - 516. 82. Friis M.B., Friborg C.R., Schneider L. Cell shrinkage as a signal to apoptosis in NIH 3T3 fibroblasts // The Journal of Physiology. - 2005. - V. 567. - P. 427-443. 83. Fuchs E. Epidermal differentiation: the bare essentials // J Cell Biol. - 1990. – V.111. - P. 2807-2814. 84. Fukata M., Nakagawa M., Kaibuchi K. Roles of Rho-family GTPases in cell po- larisation and directional migration // Curr Opin Cell Biol. - 2003. - №5: V. 15. - P. 590- 597. 85. Galucci R.M., Simeonova P.P., Matheson J.M., Kommineni C. Impaired cutane- ous wound healing in interleukin-6–deficient and immunosuppressed mice // The Journal of cancer research. - 2000. - V. 14. - P. 2525-2531. 86. Galvez A., Morales M.P., Eltit J.M., Ocaranza P., Carrasco L., Campos X., Sapag- Hagar M., Díaz-Araya G., Lavandero S. A rapid and strong apoptotic process is triggered by hyperosmotic stress in cultured rat cardiac myocytes // Cell and Tissue Research. - 2001. - №2: V. 304. - P. 279-285. 87. Gandarillas A., Davies D., Blanchard J.M. Normal and c-Myc-promoted human keratino-cyte differentiation both occur via a novel cell cycle involving cellular growth and endoreplication. - 2000. -№ 29: V. 19. - P. 3278-3289. 88. Garach-Jehoshua O., Ravid A., Liberman U.A., Reichrath J. Upregulation of the calcium-dependent protease, calpain, during keratinocyte differentiation // British Journal of Dermatology. - 1998. - V. 139. - P. 950-957. 109 89. Garrington T.P., Johnson G.L. Organization and regulation of mitogen-activated protein kinase signaling pathways // Curr. Opin. Cell Biol. - 1999. –V. 11. - P. 211-218. 90. Genova M.L., Pich M.M., Bernacchia A., Bianchi C., Biondi A., Bovina C., Falasca A.I., Formiggini G., Castelli G.P., Lenaz G. The mitochondrial production of reactive oxygen species in relation to aging and pathology. - 2004 . - V. 1011. - P. 86-100. 91. Genova M.L., Ventura B., Giuliano G., Bovina C., Formiggini G., Parenti Castelli G., Lenaz G. The site of production of superoxide radical in mitochondrial Complex I is not a bound ubisemiquinone but presumably iron-sulfur cluster N2 // FEBS Lett. - 2001. -№ 3:V. 505. - P. 364-368. 92. Giono L.E., Manfredi J.J. The p53 tumor suppressor participates in multiple cell cycle checkpoints // Journal of cellular physilology. - 2006. -№1: V. 209. - P. 13-20. 93. Gloire G., Piette J. Redox regulation of nuclear post-translational modifications during NF-kappa activation // Antioxidants & redox signaling. - 2009 . - V. 11. - P. 2209-2222. 94. Gniadecki R., Hansen M., Wulf H.C. Two pathways for induction of apoptosis by ultra-violet radiation in cultured human keratinocytes // J Invest Dermatol. - 1997. -№2: V. 109. P. 163-169. 95. Goldman M.P., Merial-Kieny C., Nocera T., Mery S. Comparative benefit of two thermal spring waters after photodynamic therapy procedure. - 2007. -№1: V. 6. - P. 31-35. 96. Goldsby R., Kindt T.J., Osborn B., Kubi J. Immunology. - . Freeman, 2003. - 97. Gorczyca W. Cytometric analyses to distinguish death processes. // Endocr Relat 551. Cancer. – 1999. - №1: V. 6. - P. 17-19. 98. Gosselin K., Deruy E., Martien S., Vercamer C. Senescent Keratinocytes Die by Au-tophagic Programmed Cell Death // The American Journal of Pathology. - 2009. -№2: V. 174. – 99. Gozuacik D., Kimchi A. Autophagy as a cell death and tumor suppressor mecha- nism. // Oncogene. - 2004. –V. 23 (16). - P. 2891-2906. 100. Grandjean-Laquerriere A., Gangloff S.C, Le Naour R., Trentesaux C., Hornebeck W., Guenounou M. Differential modulation of stress-inflammation responses by plant polyphenols in cultured normal human keratinocytes and immortalized HaCaT cells // Cytokine. 2002. - №3:V. 18. - P. 168-177. 101. Greiner J., Diezel W. Inflammation-inhibiting effect of magnesium ions in contact eczema reactions // Hautarzt. - 1990. - №11: V. 41. - P. 602-605. 102. Grone A. Keratinocytes and Cytokines // Veterinary immunology and immuno- pathology. - 2002. - V. 88. - P. 1-12. 110 103. Gruner S., Zwirner A., Boonen H., Sönnichsen N. Effect of treatment with salt from the Dead Sea (Tomesa therapy) on epidermal Langerhans cells--a clinical study // Z. Hautkr.. - 1990. - №12: V. 65. - P. 1146-1152. 104. Hamanaka R.B., Glasauer A., Hoover P., Yang S. Mitochondrial Reactive Oxygen Species Promote Epidermal Differentiation and Hair Follicle Development // Science Signaling. - 2013. - 6: V. 261. 105. Harari M., Shani J., Seidl V., Hristakieva E. Climatotherapy of atopic dermatitis at the Dead Sea: demographic evaluation and cost-effectiveness // Int. J. Dermatol. - 2000. - №1: V. 39. - P. 59-69. 106. Haussinger D. The role of cellular hydration in the regulation of cell function. // Biochemical Journal. - 1996. - V. 313. - P. 697-710. 107. Hayden M.S., Ghosh S. NF-κB in immunobiology // Cell Research. - 2011. - V. 21. - P. 223-244. 108. Hayden M.S., Ghosh S. Shared principles in NF-κB Signaling // Cell. - 2008. - V. 132. - P. 344-362. 109. Hayden M.S., Ghosh S.S. NF-κB, the first quarter-century: remarkable progress and outstanding questions // Genes and Development. - 2012. - V. 26. - P. 203-234. 110. Henseleit U., Rosenbach T., Kolde G. Induction of apoptosis in human HaCaT keratinocytes // Arch Dermatol Res. - 1996. - №11: V. 288. - P. 676-683. 111. Henson J.H. Relationships between the actin cytoskeleton and cell volume regula- tion // Microscopy research and technique. - 1999. - V. 47. - P. 155-162. 112. Hirata H., Takahashi A., Kobayashi S. Caspases are activated in a branched prote- ase cascade and control distinct downstream processes in Fas-induced apoptosis // The Journal of Experimental medicine. - 1998. - №4: V. 187. - P. 587-600. 113. Hodak E., Gottlieb A.B., Segal T., Politi Y., Maron L., Sulkes J., David M. Cli- matotherapy at the Dead Sea is a remittive therapy for psoriasis: combined effects on ep-idermal and immunologic activation // J. Am. Acad. Dermatol. - 2003. - №3: V. 49. - P. 451-457. 114. Huang J., Klionsky D.J. Autophagy and human disease // Cell Cycle. - 2007. - V. 15. - P. 1837-1849. 115. Huet O., Dupic .L, Harrois A., Duranteau J. Oxidative stress and endothelial dys- function during sepsis. . - 2011. - V. 16. - P. 1986-1995. 116. Ikeda M., Hirose Y., Miyoshi K. et al. Nuclear Factor κB (NF-κB) activation by hydrogen peroxide in human epidermal keratinocytes and the restorative effect of inter-luekin-10 // Journal of Dermatological Science. - 2002. - V. 28. - P. 159-170. 111 117. Irarrazabal C.E., Liu J.C., Burg M.B., Ferraris J.D. DNA damage-inducible ki- nase, con-tributes to activation by high NaCl of the transcription factor TonEBP/OREBP // Proctors of the National Academy of Science of the United States. - 2004. -№23: V. 101. - P. 88098814. 118. Jain A.K., Bloom D.A., Jaiswal A.K. Nuclear Import and Export Signals in Con- trol of Nrf2 // The journal of biological chemistry. - 2005. -№ 32: V. 280. - P. 29158-29168. 119. Jensen J.M., Proksch E. The skin's barrier // G. Ital Dermatol Venereol. - 2009. – V.144(6). - P. 689-700. 120. Jeong W.S., Kim I.W., Hu R., Kong A.N. Modulatory properties of various natu- ral chemopreventive agents on the activation of NF-kappaB signaling pathway // Pharmaceutical Research. - 2004. - №4: V. 21. - P. 661-670. 121. Jin Z., El-Deiry W.S. Overview of cell death signaling pathways. // Cancer biolo- gy and therapy. - 2005 . -№ 2: V. 4. - P. 139-163. 122. Jordan M.A., Wilson L. Microtubules and actin filaments: dynamic targets for cancer chemotherapy // Current Opinion in cell biology. - 1998. - V. 10. - P. 123-130. 123. Joshi D.C., Bakowska J.C. Determination of mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species in live rat cortical neurons. // J Vis Exp. - 2011. - V. 51. 124. Jost M., Huggett T.M., Kari C., Rodeck U. Matrix-independent survival of human keratinocytes through an EGF receptor/MAPK-kinase-dependent pathway // Mol Biol Cell. 2001. –V.12. - P. 1519–1527. 125. Junankar P.R., Kirk K. Organic osmolyte channels: a comparative view // Cell Physiology and biochemistry. - 2000. - V. 10. - P. 355-360. 126. Kabe Y., Ando K., Yoshida M., Handa H. Redox regulation of NF-kappaB activa- tion: distinct redox regulation between the cytoplasm and the nucleus // Antioxi-dants&redox signaling. - 2005. - V. 7. - P. 395-403. 127. Kaibuchi K., Takai Y., Nishizuka Y. Protein kinase C and calcium ion in mitogenic response of macrophage-depleted human peripheral lymphocytes // The Journal of biological chemistry. - 1985. -№3: V. 260. - P. 1366-1369. 128. Kang M., Kobayashi A., Wakabayashi N., Kim S. Scaffolding of Keap1 to the ac- tin cytoskeleton controls the function of Nrf2 as key regulator of cytoprotective phase 2 genes // PNAS. - 2004. -№7: V. 101. - P. 2046-2051. 129. Kang M.I., Kobayashi A., Wakabayashi N., Kim S.G., Yamamoto M. Scaffolding of Keap1 to the actin cytoskeleton controls the function of Nrf2 as key regulator of cytoprotective phase 2 genes // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2004. - V. 101(7). - P. 2046-2051. 112 130. Karin M. The beginning of the end: IkappaB kinase (IKK) and NF-kappaB activa- tion. // J Biol Chem. - 1999 . -№39: V. 274. - P. 27339-27342. 131. Kaspar J.W., Niture S.K., Jaiswal A.K. Nrf2:INrf2 (Keap1) signaling in oxidative stress // Free raadical biology and medicine. - 2009. - V. 47. - P. 1304-1309. 132. Kato M., Ishizaki A., Hellman U., Wernstedt C., Kyogoku M., Miyazono K., Heldin C.H., Funa K. A human keratinocyte cell line produces two autocrine growth inhibitors, transforming growth factor-beta and insulin-like growth factor binding protein-6 in a calciumadn cell dependent manner // Journal of Biological Chemistry. - 1995. - V. 270. - P. 1237312379. 133. Keller U., Huber M., Werner S. Nrf Transcription Factors in Keratinocytes Are Essential for Skin Tumor Prevention but Not for Wound Healing // Molecular Cell Biol-ogy. 2006. - V. 26. - P. 3773-3784. 134. Khan H., Cino E.A., Brickenden A. Fuzzy complex formation between the intrin- sically disordered Prothymosin alpha and Kelch Domain of Keap1 Involved in the Oxida-tive Stress Response // Journal of molecular biology. - 2013. - V. 425. - P. 1011-1027. 135. Kepp O., Galluzzi L, Lipinski M, Yuan J, Kroemer G. Cell death assays for drug discovery // Nat. Rev. Drug Discov. 2011. № 3:V. 10.-P. 221–37. 136. Kil I.S., Kim S.Y., Park J.W. Glutathionolation regulates IkappaB // Biochemical and biophysical research community. - 2008. - V. 373. - P. 169-173. 137. Kirsner R.S. The use of Apligraf in acute wounds. // J Dermatol. - 1998 . – V.25 (12). - P. 805-811. 138. Klionsky D.J. Autophagy. - 2004. - P. 1-303. 139. Kobayashi A., Kang M., Watai Y. et al. Oxidatve and electrophile stresses acti- vate Nrf2 through inhibition of ubiquitination activity of keap1 // Molecular and cellular biology. - 2006. -№1: V. 26. - P. 221-229. 140. Kondo Y., Kanzawa T., Sawaya R., Kondo S. The role of autophagy in cancer de- velopment and response to therapy // Nature reviews. Cancer. - 2005. - V. 9. - P. 726-734. 141. Lang F., Bush G.L. et al. The diversity of volume regulatory mechanisms // Cell Physiology and biochemistry. - 1998. - V. 8. - P. 1-45. 142. Lang F., Stehle T., Heussinger D. Water, K+, H+, lactate and glucose fluxes dur- ing cell volume regulation in perfused rat liver // Phlugers Archiv. - 1989. - V. 413. - P. 209-216. 143. Lanneau D., Wettstein G., Bonniaud P., Garrido C. Heat shock proteins: cell pro- tection through protein triage. // Scientific World Journal. - 2010. - V. 10. - P. 1543-1552. 113 144. Lee H.P., Choi Y.J., Cho K.A., Woo S.Y., Yun S.T., Lee J.T., Kim H.J., Lee K.H., Kim J.W. Effect of Spa Spring Water on Cytokine Expression in Human Keratino-cyte HaCaT Cells and on Differentiation of CD4(+) T Cells. - 2012. - №3: V. 24. - P. 324-336. 145. Levi-Schaffer F., Shani J., Politi Y., Rubinchik E., Brenner S. Inhibition of prolif- eration of psoriatic and healthy fibroblasts in cell culture by selected Dead-sea salts. // Pharmacology. - 1996. -№5: V. 52. - P. 321-328. 146. Lewis D.A., Hengeltraub S.F., Gao F.C., Leivant MA, Spandau DF. Aberrant NF-kappaB Activity in HaCaT Cells Alters their Response to UVB Signaling // Journal of Investigative Derma-tology. - 2006. - V. 126. - P. 1885-1892. 147. Li N, Karin M. Is NF-kappaB the sensor of oxidative stress? // FASEB J. - 1999. - №10: V. 13. - P. 1137-1143. 148. Lim C.P., Phan T.T., Lim I.J., Cao X. Cytokine profiling and stat3 phosphorilation in epithelial-mesenchimal interactions between keloid keratinocytes and fibroblasts // J In-vest Dermatol. - 2009. - V. 129. - P. 815-861. 149. Lim S., Kaldis P. Cdks, cyclins and CKIs: roles beyond cell cycle regulation. // Development. - 2013. -№15: V. 140. - P. 3079-3093. 150. Lin H.Y., Kao C.H., Lin K.M. Notch signaling regulates late-stage epidermal dif- ferentiation and maintains postnatal hair cycle homeostasis // Plos One. - 2011. - 6. - P. 158. 151. Lin Z.Q., Kondo T., Ishida Y., Takayasu T., Essential involvement of IL-6 in the skin wound-healing process as evidenced by delayed wound healing in IL-6-deficient mice // Journal of leukocyte biology. - 2003. -№6: V. 73. - P. 713-721. 152. Lustgarten M.S., Bhattacharya A., Muller F.L. Complex I generated, mitochondri- al matrix-directed superoxide is released from the mitochondria through voltage depend-ent anion channels // Biochemical and biophisical research communications. - 2012. -№3: V. 422. - P. 515-521. 153. Lyons A.B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution // J Immunol Methods. - 2000. -№(1-2): V. 243. - P. 147154. 154. Maas-Szabowski N., Shimotoyodome A., Fusenig N.E. Keratinocyte growth regu- lation in fibroblast cocultures via a double paracrine mechanism // Journal of cell science. - 1999. - Vol. 112. – P. 1843-1853. 155. Maeno E., Ishizaki Y., Kanaseki T., Hazama A, Okada Y. Normotonic cell shrinkage because of disordered volume regulation is an early prerequisite to apoptosis // PNAS. - 2000. - V. 97. - P. 9487-9492. 114 156. Maeno E., Takahashi N., Okada Y Dysfunction of regulatory volume increase is a key component of apoptosis // FEBS letters. - 2006. - V. 580. - P. 6513-6517. 157. Mailloux R.J., Harper M. Uncoupling proteins and the control of mitochondrial reactive oxygen species production // Free radical biology and medicine. - 2011. - №6: V. 51. P. 1106-1115. 158. Mammone T., Ingrassia M., Goyarts E. Osmotic stress induces terminal differen- tiation in cultured // In vitro cell and developmental biology. Animal. - 2007. - V. 44. - P. 135139. 159. Mammucari C., Rizzuto R. Signaling pathways in mitochondrial dysfunction and aging. // Mech. Ageing Dev. 2010. -V. 131. -P. 536–43. 160. Manohar A., Shome S.G., Lamar J., Stirling L, Iyer V, Pumiglia K, et al. Alpha 3 beta 1 integrin promotes keratinocyte cell survival through activation of a MEK/ERK signaling pathway // J Cell Sci. - 2004 . - 117. - P. 4043–4054. 161. Marconi A., Vaschieri C., Zanoli S., Giannetti A., Pincelli C. Nerve growth factor protects human // J Invest Dermatol. - 1999. - V. 113. - P. 920–927. 162. Matsuhime H., Ewen M.E., Strom D.K., Kato J.Y., Hanks S.K., Roussel M.F., Sherr C.J. Identification and properties of an atypical catalytic subunit (p34PSK-J3/cdk4) for mammalian D type G1 cyclins // Cell. - 1992. -№2: V. 71. - P. 323-334. 163. Matsuyama S., Reed J.C. Mitochondria-dependent apoptosis and cellular pH regu- lation // Cell Death Differ. - 2000. -№12: V. 7. - P. 1155-1165. 164. Matz H., Orion E., Wolf R. Balneotherapy in dermatology // Dermatol Ther. - 2003. –№2: V. 16. - P. 132-140. 165. Maunsbach A.B., Marples D., Chin E., Ning G., Bondy C., Agre P., Nielsen S. Aquaporin-1 water channel expression in human kidney. // J Am Soc Nephrol. - 1997. - №8 (1). - P. 1-14. 166. May M.J. Ghosh S. Signal transduction through NF-kappa B // Immunology to- day. - 1998. - №2: V. 19. - P. 80-88. 167. Micallef L., Belaubre F., Pinon A., Jayat-Vignoles C., Delage C., Charveron M., Simon A. Effects of extracellular calcium on the growth-differentiation switch in immor-talized keratinocyte HaCaT cells compared with normal human keratinocytes. // Exp Dermatol.- 2009. №2: V. 18. - P. 143-151. 168. Micallef L. Effects of extracellular calcium on the growth differentiation switch in immortalized keratinocyte HaCaT cells compared with normal human keratinocytes // Experimental dermatology. - 2008. - №2: V. 18. - P.143-151. 115 169. Michea L., Combs C., Andrews P., Dmitrieva N., Burg M.B. Mitochondrial dys- function is an early event in high-NaCl-induced apoptosis of mIMCD3 cells // American Journal of Physiol-ogy. Renal Physiology. - 2002. -№6: V. 282. - P. 981-990. 170. Michea L. ,Ferguson D.R., Peters E.M., Andrews P.M., Kirby M.R., Burg M.B.. Cell cycle delay and apoptosis are induced by high salt and urea in renal medullary cells // Am J Physiol Renal Physiol - 2000. -№2: V. 278. - P. 209-218. 171. Mignotte B., Vayssiere J.L. Mitochondria and apoptosis // Eur J Biochem.. - 1998. -№1: V. 252. - P. 1-15. 172. Mildner M., Eckhart L., Lengauer B., Tschachler E. Hepatocyte growth fac- tor/scatter factor inhibits UVB induced apoptosis of human keratinocytes but not of keratinocytederived cell lines via the phosphatidylinositol 3-kinase/AKT pathway // J Biol Chem. - 2002. V. 277. - P. 14146–14152. 173. Militello R. Colombo M.I. Small GTPases as regulators of cell division // Commun Integr Biol. - 2013. - №5: V. 6. e25460 174. Mills J.W., Scwiebert E.M., Stanton B.A. Evidence for the role of actin filaments in regulating cell swelling // Journal of experimental zoology. - 1994. - V. 268. - P. 111-120. 175. Mills J.W., Scwiebert E.M., Stanton B.A. Evidence for the role of actin filaments in regulating cell swelling // Journal of experimental zoology. - 1994. – V. 246. - P. 111-120. 176. Mitchinson T.J., Cramer L.P. Actin-based cell motility and cell locomotion // Cell. - 1996. - V. 84. - P. 371-379. 177. Mitra R.S., Wrone-Smith T., Simonian P., Foreman K.E., Nunez G., Nickoloff B.J. Apoptosis in keratinocytes is not dependent on induction of differentiation. // Lab Invest. 1997. -№1: V. 76. - P. 99-107. 178. Morgan M.J., Liu Z. Crosstalk of reactive oxygen species and NF-kB signaling // Cell Research. - 2011. - V. 21. - P. 103-115. 179. Morito N., Yoh K., Itoh K. Nrf2 regulates the sensitivity of death receptor signals by affecting intracellular glutathione levels // Oncogene. - 2003. - V. 22. - P. 9275-9281. 180. Mosser D.D., Caron A.W., Bourget L., Denis-Larose C., Massie B. Role of the human heat shock protein hsp70 in protection against stress-induced apoptosis // Mol Cell Biol. 1997. –V.17(9). - P. 5317-5327. 181. Mossman T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays // Journal of immunological methods. - 1983. – V.65. - P. 55-63. 116 182. Motohashi H., Katsuoka F., Engel J.D., Yamamoto M. Small Maf proteins serve as transcriptional cofactors for keratinocyte differentiation in the Keap1-Nrf2 regulatory pathway. // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2004. - №17: V. 101. - P. 6379 - 6384. 183. Murphy M.P. How mitochondria produce reactive oxygen species // Biochemical Journal. - 2009. - V. 417. - P. 1-13. 184. Nauseef W.M. Assembly of the phagocyte NADPH oxidase. // Histochem Cell Biol. - 2004. -№ 4: V. 122. - P. 277 - 291. 185. Neidhart S., Antonsson B., Gillieron C., Vilbois F., Grenningloh G., Arkinstall S. c-Jun N-terminal kinase-3 (JNK3)/stress-activated protein kinase-beta (SAPKbeta) binds and phosphorylates the neuronal microtubule regulator SCG10 // FEBS letters. - 2001. - №2: V. 508. - P. 259-264. 186. Nickoloff B.J., Qin J.Z., Chaturvedi V., Bacon P., Panella J., Denning M.F. Life and death signaling pathways // J Investig Dermatol Symp Proc. - 2002. - V. 7. - P. 27-35. 187. Nishi T., Shimizu N., Hiramoto M., Sato I., Yamaguchi Y., Hasegawa M., Aizawa S., Tanaka H., Kataoka K., Watanabe H., Handa H. Spatial redox regulation of critical cyctein residues of NF-kappa B in vivo // The journal of biological chemistry. - 2002. - V. 277. P. 44548-44556. 188. Niture S.K., Jaiswal A.K. Prothymosin-alpha mediates nuclear import of the INrf2/Cul3*Rbx1 Complex to degrade nuclear Nrf2 // The journal of biological chemis-try. 2009. -№20: V. 284. - P. 13856-13868. 189. Nogales E. Structural insight into microtubule function // Annual reviw of bio- chemistry. - 2000. - V. 69. - P. 277-302. 190. Ohta T., Iijima K., Miyamoto M. Loss of Keap1 function activates Nrf2 and pro- vides advantages for lung cancer cell growth // Cancer Reserch. - 2008. - V. 68. - P. 1303-1309. 191. Okada Y., Maeno E., Shimizu T., Dezaki K., Wang J., Morishima S. Receptor- mediated control of regulatory volume decrease (RVD) and apoptotic volume decrease (AVD) // The journal of physi-ology. - 2001. - V. 532. - P. 3-16. 192. Oleinick N.L., Morris R.L., Belichenko I. The role of apoptosis in response to photodynamic therapy: what, where, why, and how // Photochemical and photobiological sciences. - 2002. -№1: V. 1. - P. 1-21. 193. O'Neill W.C. Physiological significance of volume-regulatory transporters // The Amercian journal of physiology. - 1999. - V. 276. - P. 995-1011. 194. Page S.M., Brownlee G.G. Differentiation-specific enhancer activity in transduced keratinocytes: a model for epidermal gene therapy // Gene Ther.. - 1998 . - 3 : V. 5. - P. 394 402. 117 195. Pastor M.M., Proft M. and Pascual-Ahuir A. Mitochondrial Function Is an Induci- ble Determinant of Osmotic Stress Adaptation in Yeast // Journal of biological chemistry. - 2009. - V. 284. - P. 30307-30317. 196. Piao M.S., Choi J., Lee D., Yun S.J. Differentiation-dependent expression of NADP(H):quinone oxidoreductase-1 via NF-E2 related factor-2 activation in human epi-dermal keratinocytes // Journal of dermatological science. - 2011. - V. 62. - P. 147-153. 197. Piao M.S., Park J., Choi J., Lee D., Lee D.H., Yun S.J., Lee J.B., Lee S.C. Nrf2- dependent and Nrf2-independent induction of phase 2 detoxifying and antioxidant enzymes during keratinocyte differentiation // Archives of dermatological researches. - 2012. - V. 304. - P. 387-395. 198. Pines J. Protein kinases and cell cycle control // Seminars in Cell Biology. - 1994 . -№ 6: V. 5. - P. 399-408. 199. Polakowska R.R., Haake A.R. Apoptosis: the skin from a new perspective // Cell Death Differ. - 1994. -№ 1: V. 1. - P. 19-31. 200. Polakowska R.R., Haake A.R. Apoptosis: the skin from a new perspective. // Cell Death Differ.. – 1994. -№ 1: V. 1. - P. 19-31. 201. Pollak N., Dolle C., Ziegler M. The power to reduce: pyridine nucleotides - small molecules with a multitude of functions // Biochemical Journal. - 2007. - V. 402. - P. 205-218. 202. Polland T.D., Blanchoin L., Mullins R.D. Molecular mechanism contolling actin filament dynamics in nonmuscle cell // Annual reviews of biophisics and biomolecular structures. - 2000. - V. 29. - P. 545-576. 203. Pollard T.D., Mooseker M.S. Direct measurement of actin polymerization rate constants by electron microscopy of actin filaments nucleated by isolated microvillus cores. // The journal of cell biology. - 1981. - P. 654-659. 204. Predersen S.F., Hoffman E.K., Mills J.W. The cytoskeleton and cell volume regu- lation // comparative biochemistry and physiology. - 2001. - V. 130. - P. 385-399. 205. Presland R.B., Dale B.A. Epithelial structural proteins of the skin and oral cavity: function in health and disease // Crit Rev Oral Biol Med. - 2000. - №4: V. 11. - P. 383-408. 206. Proksch E., Nissen H.P., Bremgartner M., Urquhart C. Bathing in a magnesium- rich Dead Sea salt solution improves skin barrier function, enhances skin hydration, and reduces inflammation in atopic dry skin // Int. J. Dermatol. - 2005. -№2: V. 44. - P. 151-157. 207. Raftopoulou M., Hall A. Cell migration: Rho GTPases lead the way // Develop- mental biology. - 2004. - V. 265. - P. 23-32. 208. Raj D., Brash D.E., Grossman D. Keratinocyte apoptosis in epidermal develop- ment and disease // J Invest Dermatol. - 2006. -№2: V. 126. - P. 243-257. 118 209. Rhee S.G., Bae Y.S., Lee S.R., Kwon J. Hydrogen peroxide: a key messenger that modulates protein phosphorylation through cysteine oxidation // Sci STKE. - 2000. –V. 53. 210. Rheinwald J.G., Green H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells // Cell. - 1975a . - V. 6. P. 331-343. 211. Rheinwald J.G., Green H. Formation of a keratinizing epithelium in culture by a cloned cell line derived from a teratoma // Cell. - 1975b . –V. 6(3). - P. 317-330. 212. Rodriguez O.C., Schaefer A.W., Mandato C.A., Forscher P., Bement W.M., Wa- terman-Storer C.M. Conserved microtubule-actin interactions in cell movement and morphogenesis // Nat Cell Biol. - 2003. –V.5 (7). - P. 599-609. 213. Rosette C., Karin M. Ultraviolet light and osmotic stress: activation of the JNK cascade through multiple growth factor and cytokine receptors // Science. - 1996. - V. 274. - P. 1194-1197. 214. Ryle C.M., Breitkreutz D., Stark H.J., Leigh I.M., Steinert P.M., Roop D., Fusenig N.E. Density-dependent modulation of syn-thesis of keratins 1 and 10 in the human keratinocyte line HaCaT and in ras-transfected tumorigenic clones // Differentiation. - 1989. - V. 40. - P. 4254. 215. Sayers T.J. Targeting the extrinsic apoptosis signaling pathway for cancer therapy // Cancer Immunol. Immunother. 2011. -V. 60. –P. 1173–80. 216. Schäfer M., Farwanah H., Werner S. Nrf2 links epidermal barrier function with antioxidant defense // EMBO Molecular Medicine. - 2012. - V. 4. - P. 364-379. 217. Scholzen T., Gerdes J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown // Journal of Cellular physiology. - 2000. - V. 182. - P. 311-322. 218. Schoop V.M., Mirancea N., Fusenig N.E. Epidermal organization end differentia- tion of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts // Journal of investigative dermatology. - 1999. - V. 112. - P. 343-353. 219. Segre J.A. Epidermal barrier formation and recovery in skin disorders // J Clin In- vest. - 2006. - 116 (5). - P. 1150-1158. 220. Seitz C.S., Lin Q., Deng H., Khavati P.A. Alterations in NF-κB function in trans- genic epithelial tissue demonstrate a growth inhibitory role for NF-κB // PNAS. - 1998. - V. 95. P. 2307-2312. 221. Sena L.A., Chandel N.S. Physiological Roles of Mitochondrial Reactive Oxygen Species // Molecular cell. - 2012. - V. 48. - P. 158-167. 222. Shackelford R.E., Kaufmann W.K., Paules R.S. Cell cycle control, checkpoint mechanisms, and genotoxic stress // Environ Health Perspect. - 1999. -№1: V. 107. - P. 5-24. 119 223. Shani J., Sharon R., Koren R., Even-Paz Z. Effect of Dead-Sea brine and its main salts on cell growth in culture. // Pharmacology. - 1987. -№6: V. 35. - P. 339-347. 224. Sheikh-Hamad D., García-Pérez A., Ferraris J.D., Peters E.M., Burg M.B. Induc- tion of gene expression by heat shock versus osmotic stress // Am J Physiol. - 1994. - V. 267. - P. 26-34. 225. Shekih M.S., Huang Y. Death receptor activation complexes: it takes two to acti- vate TNF receptor 1 // Cell Cycle. - 2003. -№2: V. 6. - P. 550-552. 226. Shelton P., Jaiswal A. The transcription factor NF-E2-releted Factor 2 (Nrf2): a protooncogene? // The FASEB journal. - 2013. - V. 27. - P. 414-423. 227. Shimada N., Rios I., Moran H., Sayers B., Hubbard K. p38 MAP kinase- dependent regulation of the expression level and subcellular distribution of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 and its involvement in cellular senescence in normal human fibroblasts // RNA Biol. - 2009. –V. 6 (3). - P. 293-304. 228. Shimizu S., Kanaseki T., Mizushima N. et al. Role of Bcl-2 family proteins in a non-apoptotic programmed cell death dependent on autophagy genes // Nature Cell Bi-ology. 2004. –V.6. - P. 1221-1228. 229. Shintani T., Klionsky D.J. Autophagy in health and disease: a double-edged sword // Science. - 2004. - V. 306. - P. 990-995. 230. Simpson C.L., Patel D.M., Green K.J. Deconstructing the skin: cytoarchitectural determinants of epidermal morphogenesis // Nature Reviews Molecular Cell Biology. - 2011. – V. 12. - P. 565-580. 231. Sivamani R.K., Garcia M.S., Isseroff R.R. Wound re-epithelialization: modulating kerationcyte migration in wound healing // Frontiers in biosciences. - 2007. –V.12. - P. 28492868. 232. Stępkowski T.M., Kruszewski M.K. Molecular cross-talk between the NRF2/KEAP1 signaling pathway, autophagy and apoptosis // Free radical biology and medicine. - 2011. - V. 50. - P. 1186-1195. 233. Sullivan K.D., Gallant-Behm C.L., Henry R.E., Fraikin J.L., Espinosa J.M. The p53 circuit board // Biochim Biophys Acta. - 2012. -№2: V. 1825. - P. 229-244. 234. Sun S.C. Non-canonical NF-κB signaling pathway // Cell Research. - 2011. - V. 21. - P. 71-85. 235. Susin S.A., Lorenzo H.K., Zamzami N. et al. Molecular characterization of mito- chondrial apoptosis-inducing factor // Nature. - 1999. - V. 397. - P. 441-446. 120 236. Takada Y., Mukhopadhyay A., Kundu G. C. et al. Hydrogen Peroxide Activates NF-κB through Tyrosine Phosphorylation of IκBα and Serine Phosphorylation of p65 // The journal of biological chemistry. - 2003. - V. 278. - P. 24233-24241. 237. Takao J., Yudate T., Das A., Shikano S., Bonkobara M., Ariizumi K., Cruz P.D. Experssion of NF-κB in epidermis and the rela-tionship between NF-κB activation and inhibition of keratinocyte growth // British jour-nal of dermatology. - 2003. - V. 148. - P. 680-688. 238. Tamura R.E., de Vasconcellos J.F., Sarkar D., Libermann T.A., Fisher P.B., Zerbini L.F. GADD45 proteins: central players in tumorigenesis // Curr Mol Med.. - 2012. -№5: V. 12. - P. 634-651. 239. Tang A., Gilcherest B.A. Regulation of keratinocyte growth factor gene expres- sion in human skin fibroblasts // Journal of dermatological Science. - 1996. - 11. - P. 41-50. 240. Tanida I., Ueno T., Kominami E. LC3 conjugation system in mammalian autoph- agy. // Int J Biochem Cell Biol. - 2004. -№12: V. 36. - P. 2503-2518. 241. Tian F.F., ZHang F.F., Lai X.D. et al. Nrf2-mediated protection against UVA ra- diation in human skin keratinocytes // Bioscience trends. - 2011. - V. 5. - P. 23-29. 242. Tonks N.K. Redox redux: revisiting PTPs and the control of cell // Cell. - 2005. - V. 121. - P. 667-670. 243. Trent J.F., Kirsner R.S. Tissue engineered skin: Apligraf, a bi-layered living skin equivalent // Int J Clin Pract. - 1998. –V.52 (6). - P. 408-413. 244. Tschachler E. Psoriasis: the epidermal component // Clinical Dermatology. - 2007. - V. 25. - P. 589-595. 245. Twentyman P.R., Luscombe M. A study of some variables in a tetrazolium dye (MTT) based assay for cell growth and chemosensitivity // Br J Cancer. - 1987. -№3: V. 56. - P. 279-285. 246. Uhlmann F., Bouchoux C., López-Avilés S. A quantitative model for cyclin- dependent kinase control of the cell cycle: revisited // Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2011. - V. 366. - P. 3572-3583. 247. Uruno A., Motohashi H. The Keap1-Nrf2 system as an in vivo sensor for electro- philes // Nitric Oxide. - 2011. - V. 25. - P. 153-160. 248. Vasiliev J.M., Gelfand I.M. Interactions of normal and neoplastic fibroblasts with the substratum // Ciba Found Symp. - 1973. –V.14. - P. 311-331. 249. Vermeulen K., Berneman Z.N., Van Bockstaele D.R. Cell cycle and apoptosis // Cell Prolif. - 2003. -№3: V. 36. - P. 165-175. 250. Vousden K.H., Vande Woude G. F. The ins and outs of p53 // Nature Cell Biolo- gy. - 2000. -№ 2: V. 10. - P. 178-180. 121 251. Wakabayashi N., Shin S., Slocum S.L., Agoston E.S. Regulation of Notch1 sig- naling by Nrf2: implications for tissue regeneration // Science signaling. – 2010a. –V.3. - P. 52. 252. Wakabayashi N., Itoh K., Wakabayashi J., Motohashi H, Noda S, Takahashi S, Imakado S., Kotsuji T., Otsuka F., Roop D. R., Harada T, Engel JD, Yamamoto M. Keap1-null mutation leads to postnatal lethality due to constitutive Nrf2 activation // Nature genetics. – 2003. - V. 35. - P. 238-245. 253. Wakabayashi N., Slocum S.L., Skoko J.J. When Nrf2 talks, who's listening // AN- tioxidants and redox signaling. – 2010b. - V. 13. - P. 1649-1663. 254. Waldegger S., Lang F. Cell volume and gene expression // The Journal of mem- brane biology. - 1998. - V. 162. - P. 95-100. 255. Wang K., Zhang T., Dong Q., Nice E.C., Huang C., Wei Y. Redox homeostasis: the linchpin in stem cell self-renewal and differentiation // Cell Death Dis. - 2013. - V. 4. - P. 110. 256. Wang L., Dai W., Lu L. Hyperosmotic stress-induced corneal epithelial cell death through activation of Polo-like kinase 3 and c-Jun // Invest Ophthalmol Vis Sci. - 2011. - 6: V. 52. - P. 3200 - 3206. 257. Wang P., Huang S., Wang F., Ren Y., Hehir M., Wang X., Cai J. Cyclic AMP- response element regulated cell cycle arrests in cancer cells // PLoS One. - 2013. -№6: V. 8. - P. 1-7. 258. Warskulat U., Reinen A., Grether-Beck S., Krutmann J., Haussinger D. The os- molyte strategy of normal human kertinocytes in maintaining cell homeostasis // Journal of investigative dermatology. - 2004. -№ 3: V. 123. - P. 516-521. 259. Watt F.M., Jones P.H. Expression and function of the keratinocyte integrins // Dev Suppl. - 1993. - P. 185-192. 260. Wehner F., Olsen H., Tinel H., Kinne-Saffran E., Kinne R.K. Cell volume regula- tion: osmolytes, osmolyte transport, and signal transduction // Reviews of physiology, biochemistry and pharma-cology. - 2003. - V. 148. - P. 1-80. 261. Winterbourn C.C., Hampton M.B. Thiol chemistry and specificity in redox signal- ing // Free radical biology and medicine. - 2008. - V. 45. - P. 549-561. 262. Wittmann T., Waterman-Storer C.M. Cell motility: can Rho GTPases and micro- tubules point the way? // J Cell Sci. - 2004. -№ 21: V. 144. - P. 3795-3803. 263. Wu K.L., Khan S., Lakhe-Reddy S., Wang L., Jarad G., Miller R.T., Konieczkowski M., Brown A.M., Sedor J.R., Schelling J.R. Renal tubular epithelial cell apoptosis is associated with caspase cleavage of the NHE1 Na/H exchanger // American Journal of physiology. Renal physiology. - 2003. - V. 284. - P. 829-839. 122 264. Wu X., Quondamatteo F., Brakebusch C. Cdc42 expression in keratinocytes is re- quired for the maintenance of the basement membrane in skin. // Matrix Biol. - 2006. - 8: V. 25. - P. 466-474. 265. Wullaert A., Bonnet M.C. NF-κB in the regulation of epithelial homeostasis and inflammation // Cell Research. - 2011. - V. 21. - P. 146-158. 266. Xia Z., Dickens M., Raingeaud J., Davis R.J., Greenberg M.E. Opposing effects of ERK and JNK-p38 MAP kinases on apoptosis // Science. - 1995. -№270: V. 5240. - P. 13261331. 267. Yan F.P., Chen Y.J., Huang X.H. Expression of beclin1 and LC3 after rat's skin contusion // Fa Yi Xue Za Zhi. - 2007. - №1: V. 23. - P. 11-13. 268. Yang H.B., Song W., Chen L.Y., Li Q.F., Shi S.L., Kong H.Y., Chen P. Differen- tial expression and regulation of prohibitin during curcumin-induced apoptosis of immor-talized human epidermal HaCaT cells // Int J Mol Med. - 2014 . - 3: V. 33. - P. 507-514. 269. Young A., Narita M., Ferreira M., Kirschner K., Sadaie M,. Darot J.F., Tavaré S., Arakawa S., Shimizu S., Watt F.M., Narita M. Autophagy mediates the mitotic senes-cence transition // Genes and development. - 2009. - V. 23. - P. 798-803. 270. Yurchenco P. D. Basement membranes: cell scaffoldings and signaling platforms. // Cold Spring Harb Perspect Biol. - 2011. -№2: V. 3. - P. 1-27. 271. Zampetaki A., Zhang Z, Hu Y., Xu Q. Biomechanical stress induces IL-6 expres- sion in smooth muscle cells via Ras/Rac1-p38 MAPK-NF-κB signaling pathways // Am J Physiol Heart Circ Physiol. - 2005. - V. 288(6). - P. 2946-54. 272. Zuliani T., Denis V., Noblesse E., Schnebert S., Andre P., Dumas M., Ratinaud M.H. Hydrogen peroxide-induced cell death in normal human keratinocytes is differentiation dependent // Free radical biology and medicine. - 2005. - V. 38. - P. 307-316.
