Сазонова Елена Викторовна МЕХАНИЗМЫ РЕАЛИЗАЦИИ
advertisement
На права х р укописи Сазонова Елена Викторовна МЕХАНИЗМЫ РЕАЛИЗАЦИИ РЕГУЛЯТОРНОГО ВЛИЯНИЯ ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 НА АПОПТОЗ ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ 14.03.03 – патологическая физиология 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Кемерово – 2010 2 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», г. Томск Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Рязанцева Наталья Владимировна доктор медицинских наук Жукова Оксана Борисовна Официальные оппоненты: доктор медицинский наук, профессор Лисаченко Геннадий Васильевич доктор медицинских наук Литвинова Лариса Сергеевна Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Омская государственная медицинская академия Росздрава», г. Омск Защита состоится «__» _________ 2010 г. в __ часов на заседании диссертационного совета Д 208.035.02 при ГОУ ВПО «Кемеровская государственная медицинская академия Росздрава» (650029, г. Кемерово, ул. Ворошилова, 22а) С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ГОУ ВПО «Кемеровская государственная медицинская академия Росздрава» Автореферат разослан «___» ___________ 2009 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор Разумов А.С. 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. К ключевым системам, обеспечивающим стратегию адаптации макроорганизма к постоянно изменяющимся условиям внутренней и внешней среды, относится система иммунитета. Одним из фундаментальных механизмов регулирования иммунных реакций является апоптотическая гибель иммунокомпетентных клеток [Потапнев М.П., 2002], необходимая для установления баланса между их эффективным функционированием, с одной стороны, и своевременным и безопасным удалением – с другой. Регуляция выживания и гибели иммунокомпетентных клеток осуществляется через цитокиновую сеть, представляющую собой систему клеточных медиаторов и их рецепторов, к числу которых относят интерфероны, колониестимулирующие факторы, трансформирующие ростовые факторы, хемокины и интерлейкины [Симбирцев А.С., 2004; Prasad T.S. et al., 2009]. Одним из ведущих цитокинов, определяющих жизнедеятельность иммунокомпетентных клеток, является интерлейкин-2 (IL-2), в течение долгого времени известный как ростовой фактор для Т-, В-лимфоцитов, NK-клеток и фагоцитов, обеспечивающий их функциональную активацию [Сенников С.В. и соавт., 2004; Лебедев Л.Р. и соавт., 2007]. К настоящему времени установлено, что модулирующее влияние данного клеточного медиатора на танатогенную программу носит двойственный характер. Для объяснения выбора про- или aнтиапоптотического пути воздействия IL-2 была предложена теория обратной связи в контроле апоптоза Т-лимфоцитов, согласно которой указанный цитокин вызывает повышение чувствительности Т-лимфоцитов к апоптозу [Потапнев М.П., 2002]. Исход жизни клетки зависит от уровня антигенного и костимулирующего воздействия. В случае его отсутствия экспрессия IL-2 и его клеточного рецептора угнетается. В результате этого клетки подвергаются апоптозу, связанному с нехваткой цитокина. Данный механизм ограничивает иммунный ответ после устранения патогена. При избытке антигенного воздействия может наступить антигениндуцированный апоптоз Т-клеток, обусловленный связыванием антигена с рецептором и опосредованный воздействием на активированный Т-лимфоцит Fas-лиганда и фактора некроза опухоли [Walczak H. et al., 1997]. Изменение продукции IL-2 и связанное с этим нарушение реализации танатогенной программы является причиной многих патологических процессов. Так, избыточная экспрессия IL-2 и IL-2R обнаруживается у большинства опухолевых клеток, потерявших способность к апоптозу, что дает основания рас- 4 сматривать данный цитокин в качестве одного из факторов, способствующих малигнизации [Reichert Т.Е. et al., 1998; Eriksen K. et al., 2001]. Высокая интенсивность программированной гибели лимфоцитов, сопровождаемая угнетением продукции IL-2, выявлена при инфекционной патологии. Так, при гепатите С происходит изменение содержания цитозольного Ca2+, определяющего активность транскрипционного фактора NFAT и, соответственно, промотора гена IL-2 [Bergqvist A., Rice C.M., 2001; Jerome K.R., 2008]. При коровьей оспе отмечается блокирование TcR-индуцированной активации NFAT/AP 1 элемента промотора гена IL-2 [Alonso A.S. et al., 2003]. Для моделирования дисбаланса системы IL-2–IL-2R используются различные приемы, к числу которых относятся нокаутирование гена IL-2 и его рецептора, конструирование генов β- и γ-субъединиц IL-2R и др. [Fanzo J.C. et al., 2006]. Доступным методом, позволяющим изучать молекулярные механизмы проведения сигнала от данного рецепторного комплекса, является культивирование лимфоцитарных клеток в присутствии рекомбинантного IL-2. Следует признать, что в настоящее время молекулярные механизмы дизрегуляции системы IL-2–IL-2R изучены недостаточно, а имеющиеся в литературе данные в рамках обсуждаемой проблемы носят весьма неоднозначный характер. В связи с этим важным становится исследование молекулярных механизмов IL-2-опосредованных нарушений апоптоза лимфоцитов для поиска новых патогенетически обоснованных технологий управления гибелью клеток. Цель исследования: выявить роль и молекулярные механизмы участия интерлейкина-2 в регуляции апоптоза лимфоцитов крови. Задачи исследования: 1. Установить особенности реализации апоптоза лимфоцитов крови при действии рекомбинантной формы интерлейкина-2 человека in vitro в концентрациях от 0,1 до 1,0 нг/мл. 2. Оценить внутриклеточный уровень активных форм кислорода и состояние трансмембранного потенциала митохондрий при интерлейкин-2-зависимой гибели лимфоцитов крови. 3. Определить роль белков семейства Bcl-2, транскрипционных факторов NFkB, P53 и ингибитора циклинзависимых киназ Р21 в регуляции апоптоза, опосредованного интерлейкином-2. 4. Провести сравнительную оценку состояния молекулярных механизмов интерлейкин-2-опосредованного апоптоза лимфоцитов при добавлении рекомбинантной формы интерлейкина-2 человека in vitro и при патологическом про- 5 цессе, сопровождающемся нарушениями в системе интерлейкина-2 (у пациентов с клещевым энцефалитом). Научная новизна. Получены новые данные фундаментального характера о влиянии интерлейкина-2 на реализацию апоптоза лимфоцитов крови в зависимости от концентрации цитокина и условий культивирования. Впервые определены молекулярные мишени интерлейкин-2-опосредованной регуляции апоптотической гибели. Установлено, что рекомбинантный интерлейкин-2 в конечных концентрациях от 0,1 до 1,0 нг/мл дозозависимо оказывает проапоптотическое действие на лимфоциты крови и проявляет протективный эффект в отношении дексаметазониндуцированного апоптоза данных клеток. Показано, что в культуре лимфоцитов у здоровых доноров, инкубированных с 0,1 нг/мл рекомбинантного интерлейкина-2, повышено количество клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий на фоне накопления в них активных форм кислорода, снижения уровня антиапоптотических белковрегуляторов Bcl-2 и Bcl-XL, активации транскрипционных факторов NFkB и P53. Впервые выявлено, что индукция апоптоза иммунокомпетентных клеток крови при остром клещевом энцефалите, сопровождающемся повышенной продукцией и сниженной рецепцией лимфоцитами интерлейкина-2, обусловлена участием NFkB, P53 и митохондриальных факторов (увеличение числа клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий, повышение внутриклеточного уровня активных форм кислорода, дисбаланс белков семейства Bcl-2). Показана унификация молекулярных механизмов апоптоза иммунокомпетентных клеток как при дисбалансе системы интерлейкина-2 в условиях in vitro, так и при инфекционном процессе (клещевой энцефалит). Теоретическая и практическая значимость. Результаты проведенного исследования расширяют фундаментальные знания о характере изменения программированной гибели клеток под действием рекомбинантной формы интерлейкина-2 человека в зависимости от его концентрации и состояния клеточного микроокружения. Полученные фактические данные раскрывают молекулярные механизмы интерлейкин-2-опосредованной регуляции апоптотической гибели лимфоцитов, связанные с активацией митохондриального пути и обусловленные участием транскрипционных факторов (NFkB и P53) и белков семейства Bcl-2. Основные положения исследования могут служить основой для создания 6 молекулярных технологий управления функциями иммунокомпетентных клеток с использованием цитокинов. Положения, выносимые на защиту: 1. Рекомбинантный интерлейкин-2 человека оказывает дозозависимые эффекты на реализацию апоптоза иммунокомпетентных клеток: количество апоптотических клеток в культуре лимфоцитов изменяется однонаправленно с концентрацией цитокина в диапазоне 0,1-1,0 нг/мл и обратнопропорционально его дозе на фоне действия дексаметазона. 2. Дисбаланс системы интерлейкина-2 при культивировании лимфоцитов крови здоровых доноров с рекомбинантной формой данного цитокина и при клещевом энцефалите сопровождается модуляцией апоптотической гибели лимфоцитов крови, реализующейся при участии митохондриальных факторов, активных форм кислорода, NFkB, P53 и обусловленной смещением баланса Bcl-2белков в сторону проапоптотических. Апробация материалов диссертации. Результаты исследования были доложены и обсуждены на VIII и X Конгрессах молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2007, 2009), XIII и XV Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (СанктПетербург, 2007, 2009), IV Объединенном иммунофоруме (Санкт-Петербург, 2008), Х Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009), XIII Всероссийском форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009), VII Съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург, 2009), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009). Основные положения и выводы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедр патофизиологии (разделы «Патофизиология клетки», «Патофизиология иммунной системы», «Воспаление»), фундаментальных основ клинической медицины (разделы «Патофизиология клетки», «Типовые патологические процессы», «Роль апоптоза клетки в патологии»), кафедры морфологии и общей патологии (раздел «Инфекция и иммунитет») ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава. Работа выполнена в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» по темам «Работа по проведению проблемноориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем с участием научных организаций Японии» (ГК № 02.512.11.2285), «Проведение научных исследований коллективами на- 7 учно-образовательных центров в области фундаментальной медицины и физиологии» (ГК № 02.740.11.0311), а также при финансировании РФФИ «Разработка способов направленной коррекции дизрегуляции пролиферации и апоптоза нормальных и патологически измененных клеток с помощью регуляторных молекул» (№ 09.04.99025) и Совета по грантам при Президенте РФ по государственной поддержке научных исследований молодых российских ученыхдокторов наук по теме «Молекулярные механизмы цитокинопосредованной дизрегуляции апоптоза лимфоцитов при поляризации иммунного ответа по Th1- или Th2-пути» (МД-3842.2009.7) и ведущих научных школ РФ по теме «Роль генетически детерминированной реакции системы крови в патоморфозе инфекционных заболеваний» (НШ-2334.2008.7). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе 6 – в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста и состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 280 источников, из которых 226 – иностранных авторов. Работа иллюстрирована 4 таблицами и 24 рисунками. Личный вклад автора. Анализ литературных данных по теме диссертации, планирование исследования, выделение и культивировпние лимфоцитов крови, оценка продукции лимфоцитов крови и его рецепторов, апоптоза лимфоцитов крови, количества клеток со сниженным уровнем потенциала митохондриальной мембраны, содержания активных форм кислорода, факторов транскрипции и белков регуляторов апоптоза в лимфоцитах крови, статистический анализ результатов, написание диссертации выполнены лично автором. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования В основу работы положены результаты комплексного клиниколабораторного обследования 65 человек (30 мужчин и 35 женщин в возрасте от 18 до 50 лет), включая 45 пациентов с клещевым энцефалитом и 20 здоровых доноров. Критериями исключения из программы исследования являлись возраст моложе 18 и старше 50 лет; период обострения хронических воспалительных 8 заболеваний; аутоиммунные, наследственные и психические болезни, алкогольная и наркотическая зависимости. Пациенты находились на диспансерном учете или стационарном лечении в терапевтическом отделении МЛПУ МСЧ «Строитель» (главный врач − И.Н.Бартфельд, зав. отделением − О.В. Буров), инфекционном отделении госпитальных клиник ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (главный врач – Заслуженный врач РФ, канд. мед. наук В.М. Шевелёв, зав. отделением − канд. мед. наук Н.С. Бужак) и инфекционном отделении МЛПУ ГБ №3 (главный врач − М.А. Лукашов, зав. отделением − Г.В. Запаздаева). Материалом для исследования служила венозная кровь, взятая утром натощак из локтевой вены в количестве 10 мл и стабилизированная гепарином (25 Ед/мл). Исследование проводилось на базе Научно-образовательного центра молекулярной медицины ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (руководитель – канд. мед. наук О.Е. Чечина) и лаборатории клинической иммунологии ФГУЗ Клиническая больница № 81 ФМБА России (зав. лабораторией – канд. мед. наук Т.Т. Радзивил). В соответствии с поставленными целью и задачами исследования работа была разделена на два последовательных этапа. На первом этапе проводилась оценка эффекта rIL-2 на реализацию клеточной гибели в зависимости от его дозы. В работе было использовано инкубирование клеток здоровых доноров с различными концентрациями рекомбинантной формы IL-2 (rIL-2) человека. Для анализа антиапоптотического действия IL-2 лимфоциты крови инкубировали в полной среде, содержащей дексаметазон, выступавший в качестве индуктора апоптоза, и rIL-2. Второй этап исследования был посвящен изучению механизмов проапоптотического действия IL-2 на экспериментальной модели IL-2-опосредованного апоптоза лимфоцитарных клеток крови, полученных у здоровых доноров и у пациентов с клещевой нейроинфекцией. Распределение здоровых доноров и пациентов с клещевым энцефалитом в соответствии с использованными методами исследования представлено в таблице 1. Лимфоциты выделяли из крови путем центрифугирования на градиенте плотности Ficoll-Paque (ρ=1,077 г/см3) («Pharmacia», Швеция). Выделенные клетки инкубировали в течение 18 ч при температуре 37ºС в полной питательной среде, в среде с добавлением rIL-2 в диапазоне концентраций 0,015-1,000 нг/мл, а также в полной среде при одновременном внесении 10-4 моль/мл дексаметазона и rIL-2 в дозах 0,025-0,050 нг/мл. Продукцию лимфоцитами IL-2 Та б л и ц а 1 – Распределение обследованных лиц в соответствии с методами исследования лимфоцитов крови (n=65) Лимфоциты, инкубированные с 0,1 нг/мл rIL-2 16 – – 17 15 16 – – 17 15 20 20 20 20 20 Определение числа лимфоцитов со сниженным уровнем трансмембранного потенциала митохондрий методом проточной цитофлюориметрии 20 10 10 16 17 Оценка содержания в клетке АФК методом проточной цитофлюориметрии 20 10 10 22 17 Исследование содержания факторов транскрипции (Р53 и NFkB), Р21 и белков-регуляторов апоптоза (Bad, Bax, Bcl-2, Bcl-XL) методом иммуноблоттинга 12 12 12 12 12 Методы исследования Исследование содержания IL-2 в супернатантах культур лимфоцитов методом иммуноферментного анализа Оценка количества IL-2Rпрезентирующих лимфоцитарных клеток методом проточной цитофлюориметрии Определение количества апоптотически измененных лимфоцитов в аннексиновом тесте методом проточной цитофлюориметрии Лимфоциты пациентов с острым клещевым энцефалитом Лимфоциты пациентов с хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита 9 Лимфоциты здоровых доноров Лимфоциты, инкубированные с 0,1 нг/мл rIL-2 и 10-4 М дексаметазона 10 оценивали методом иммуноферментного анализа по инструкции, предлагаемой фирмой-производителем («Протеиновый контур», Санкт-Петербург). Содержание лимфоцитов, презентирующих на своей поверхности мембранную форму рецептора к IL-2, определяли методом проточной лазерной цитометрии с использованием стандартных моноклональных антител к IL-2Rα (CD25), меченных фикоэритрином (CD25-PE) («R&D Systems», США). Оценку реализации программированной гибели лимфоцитов проводили с использованием FITC-меченного аннексина V и пропидиум йодида (PI) («Beckman Coulter», США) [Van Engeland M., 1998] методом проточной лазерной цитометрии на цитометре Epics XL («Beckman Coulter», США). Количество клеток со сниженным уровнем потенциала митохондриальных мембран (∆ψ) регистрировали с помощью набора реагентов «MitoScreen» («BD Pharmigen», США), ключевым реагентом которого является флюорохром 5,5’,6,6’тетрахлоро-1,1’,3,3’-тетраэтилбензимидазолилкарбоцианин йодид (JC-1). Окрашенные JC-1-лимфоциты анализировали на проточном цитометре Epics XL («Beckman Coulter», США), определяя процентное содержание клеток в гейтах неапоптотических (FL-1 и FL-2) и апоптотических клеток (FL-1-свечение). Для оценки уровня активных форм кислорода в клетках применяли краситель с заблокированной флюоресценцией дихлорфлюоресцеин диацетат («Sigma», США). После 20-минутной инкубации с данным препаратом реакцию останавливали 200 мкл лизирующего раствора. Затем оценивали параметры зеленой флюоресценции в гейте лимфоцитарных клеток, выявленных на FL1-канале с помощью проточного цитометра Epics XL («Beckman Coulter», США) [Дамбаева С.В. и соавт., 2001]. Для исследования содержания белков-регуляторов апоптоза (Bcl-2, BclXL, Bax, Bad), а также транскрипционных факторов (NFkB, Р53, Р21) был использован иммуноблоттинг. Белки разделяли по молекулярной массе под действием электрического поля (10 В/см пути). Использовали белковые маркеры молекулярного веса (14,3 – 220,0 kDa, «Fermentas», EU). Для последующего исследования белки электрофоретически переносили на нитроцеллюлозную мембрану («Bio-Rad», США) в течение 80-90 мин при силе тока 50-60 мА. В работе были использованы антитела к Bcl-2, Bcl-XL, Bax, Bad, Р53, NFkB, Р21 («Biosource», США) в разведении 1:200. В качестве стандарта и внутреннего контроля использовали глицеро-3-фосфат-дегидрогеназу («Chemicon», США). 11 Оценку полученных данных проводили методами статистического описания и проверки статистических гипотез [Кремер Н.Ш., 2004]. Проверку нормальности распределения количественных показателей проводили с использованием критерия Колмогорова-Смирнова. Для каждой выборки вычисляли медиану (Me), первый и третий квартили (Q1 и Q3). Сравнение изученных показателей проводили с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни для двух независимых групп и непараметрического критерия Краскела-Уоллиса для нескольких независимых групп. Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05 [Кремер Н.Ш., 2004]. Результаты исследования и их обсуждение Культивирование лимфоцитов, полученных у здоровых доноров, в присутствии рекомбинантной формы IL-2 (rIL-2) показало, что данный цитокин начинал проявлять своё проапоптотическое действие в отношении лимфоцитарных клеток, когда его концентрация в среде культивирования составляла 0,100 нг/мл. При последующем увеличении дозы медиатора отмечалось повышение числа фосфатидилсеринэкспрессирующих лимфоцитов, пропорциональное дозе циткина (рис. 1). % 40 35 30 25 20 15 10 5 0 * * * * * 0,000 0,015 0,025 0,050 0,100 0,150 0,350 0,500 1,000 нг/мл * – р<0,05 по сравнению с аналогичными значениями в культуре клеток, инкубированных в безцитокиновой среде Р и с у н о к 1 – Изменение количества апоптотических лимфоцитов в зависимости от концентрации rIL-2 в культуральной среде Следует отметить, что в литературе на сегодняшний день не описан дозозависимый характер проапоптотического действия IL-2. В настоящем исследо- 12 вании было впервые обнаружено, что для реализации апоптозиндуцирующего эффекта rIL-2 на лимфоциты крови в условиях in vitro необходим определенный порог концентрации цитокина. Наличие подобного «барьера» действия IL2 может быть объяснено строением его рецептора и работой внутриклеточных сигнальных путей [Boytim M.L. et al., 2000; Lindemann M.J., 2003; Stauber D.J. et al., 2006]. На модели глюкокортикоидиндуцированного апоптоза лимфоцитов, вызванного добавлением 10-4 М дексаметазона, установлено протективное действие rIL-2 (рис. 2). Существует множество причин отмены апоптоза данным цитокином. Одна из них − способность данного цитокина запускать пролиферативный каскад по JAK/STAT−, PI3K− или MAPK−сигнальным путям, сходящимся на регуляции экспрессии гена bcl-2, результатом повышения которой является клеточное выживание и пролиферация [Fridman J.S., Lowe S.W., 2003]. % 60 50 40 * 30 * * 20 10 0 0,000 0,025 0,050 0,100 нг/мл * – р<0,05 – по сравнению с аналогичными значениями в культуре клеток, инкубированных с 0,1 ммоль/л дексаметазона Р и с у н о к 2 – Количество апоптотически измененных лимфоцитов в условиях культивирования в среде, содержащей дексаметазон и rIL-2 в различных концентрациях Дозозависимый характер этого явления может быть объяснен увеличением количества активированных IL-2R с повышением дозы цитокина и усилением интенсивности антиапоптотических сигнальных путей в клетке [Lindemann M.J. et al., 2003]. Установлено, что течение острого клещевого энцефалита характеризуется повышением уровня продукции IL-2, снижением содержания IL-2Rположительных клеток и усилением вовлечения лимфоцитов в процесс апопто- 13 за (рис. 3). Усиление секреции IL-2, на наш взгляд, является проявлением адекватной реакции иммунной системы, направленной на элиминацию возбудителя. Как известно, инициация противовирусного иммунитета путем включения специфического иммунного ответа осуществляется за счет взаимодействия Тлимфоцита с антигенпредставляющей клеткой [Хаитов Р.М., 2001]. Сочетание сигналов, поступающих на Т-хелпер через комплекс ТСR-CD3 и CD28, приводит к активации клетки, т.е. выходу ее из фазы покоя G0 в фазу клеточного цикла G1. Основной результат этого состоит в индукции экспрессии генов ростовых факторов, в частности IL-2, что подготавливает клетку к пролиферации, лежащую в основе любых форм проявления активности лимфоцитов [Хаитов Р.М., 2001; Кашкин К.П., 2004]. % от нормы 250 Здоровые доноры * 200 150 Больные острым клещевым энцефалитом * 100 50 * * * Пациенты с хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита 0 Содержание Количество Количество Содержание IL-2, Количество IL-2R+ Количество + лимфоцитов IL-2, пг/мл IL-2R лимфоцитов, пг/мл лимфоцитов, % % лимфоцитов в в апоптозе, % апоптозе, % * – р<0,05 по сравнению с аналогичными значениями у здоровых доноров Р и с у н о к 3 – Продукция IL-2 лимфоцитами, содержание IL-2Rпрезентирующих клеток и количество лимфоцитов в апоптозе у пациентов с клещевым энцефалитом При взаимодействии IL-2 с IL-2R сигнал передается на внутриклеточный протеинкиназный комплекс, каскадная активация которого проявляется в апоптогенном или митогенном влиянии цитокина на клетку. В ходе настоящего исследования было установлено, что у лиц с хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита отмечено снижение доли IL-2R-презентирующих и увеличение количества апоптотически измененных лимфоцитов на фоне неизменной цитокинпродуцирующей способности (рис. 3). Этот факт, возможно, объясняется недостаточной реактивностью макроорганизма, которая, в свою очередь, обусловливает неэффективность иммунной защиты в ответ на действие 14 инфекта [Хаитов Р.М., 2001], становясь одним из механизмов, ведущих к хронизации инфекционного процесса [Рязанцева Н.В. и соавт., 2006]. Таким образом, результаты настоящей работы позволили выявить факт модификации программированной гибели лимфоцитов в условиях экспериментальной модели интерлейкин-2-зависимого апоптоза и у пациентов с клещевой нейроинфекцией, сопровождающейся изменением состояния системы интерлейкина-2 и его рецептора. Это явилось основанием для проведения этапа исследования, направленного на выявление молекулярных мишеней апоптотического каскада, запускаемого при участии IL-2. Известно, что функциональное состояние клетки зависит от уровня содержания в ней активных форм кислорода (АФК) [Buzek J. et al., 2002; Pastori G.M. et al., 2002], которые используются как посредники при передаче сигнала от мембранных рецепторов на внутриклеточные системы протеинкиназ [Pastori G.M. et al., 2002]. Эксперимент, проведенный с рекомбинантным IL-2 в условиях in vitro, продемонстрировал повышение уровня АФК в клетке и их участие в реализации проапоптотического эффекта цитокина (рис. 4а). усл.ед. % 1,0 14 0,8 12 10 0,6 8 0,4 Медиана 25%-75% Min-Max 0,2 0,0 -0,2 1 2 а 3 4 6 4 2 0 1 2 3 4 б 1 − интактные лимфоциты здоровых доноров; 2 − лимфоциты здоровых доноров, инкубированные с 0,100 нг/мл rIL-2; 3 − лимфоциты, полученные у больных острым клещевым энцефалитом; 4 − лимфоциты, полученные у пациентов с хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита; ΔΨ − трансмембранный потенциал митохондрий Р и с у н о к 4 – Содержание активных форм кислорода в лимфоцитах крови (а), численность лимфоцитов со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий (б) При оценке внутриклеточной продукции АФК лимфоцитами крови у пациентов с клещевой нейроинфекцией выявлено, что величина данного парамет- 15 ра возрастает, при этом более выраженные изменения исследуемого показателя отмечаются у пациентов с острым клещевым энцефалитом (рис. 4а). Рассматривая механизмы АФК-опосредованного апоптоза клетки, особое внимание следует уделить митохондриям, которые, образуя сложную систему взаимовлияний, являются как мишенями, так и продуцентами кислородных радикалов [Зенков Н.К. и соавт., 2001; Бра М., 2005; Черняк Б.В., 2005; Меньшикова Е.Б. и соавт., 2006]. В проведенном нами исследовании было зафиксировано повышение количества лимфоцитов со сниженным значением ΔΨ в лимфоцитарных клетках, полученных у здоровых доноров и подвергнутых воздействию rIL-2 в концентрации 0,1 нг/мл, и у пациентов с клещевой нейроинфекцией (рис. 4б), что дало возможность предположить заинтересованность митохондриального пути апоптоза в реализации проапоптотического действия IL-2. Контроль над выходом из межмембранного пространства митохондрий в цитозоль регуляторов апоптоза обеспечивают белки семейства Bcl-2, динамическое равновесие которых определяет выбор клетки между жизнью и смертью [Fridman J.S., Lowe S.W.,2003]. Исследование, выполненное методом иммуноблоттинга, показало, что при действии 0,1 нг/мл rIL-2 происходило значительное снижение внутрилимфоцитарного содержания белков Bcl-2 и Bcl-XL по сравнению с величиной данных показателей в интактных клетках. Аналогичные изменения были зарегистрированы у пациентов с клещевой нейроинфекцие (рис. 5а, б). Анализ содержания белка Bax в лимфоцитах, культивированных с rIL-2 в дозе 0,1 нг/мл, показал, что уровень данного проапоптотического белка был вдвое ниже величины аналогичного показателя в интактных клетках. Можно заметить, что у больных острым клещевым энцефалитом и у антигеноносителей данного возбудителя уровень Bax в лимфоцитах практически не изменялся (рис. 5в). Точный механизм, благодаря которому данные белки регулируют проницаемость мембраны митохондрий, до сих пор неясен. Имеются литературные данные о том, что Bcl-XL способен связываться с уже вышедшим цитохромом с, предотвращая дальнейшую активацию каспаз [Cheng E.H. et al., 2001]. Помимо этого установлено, что Bcl-2 и Bcl-XL могут гетеродимеризоваться с проапоптотическим протеином Вах, тем самым ингибируя его каналформирующую способность [Brenner C. et al., 2000]. В то же время Bax в ответ на смертельный сигнал изменяет свою конформацию и встраивается в мембрану митохондрии с образованием пор. 16 усл.ед. 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 усл.ед. Медиана 25%-75% Min-Max 1 2 3 4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 1 2 а 4 3 4 б усл.ед. 1,4 1,3 1,2 1,1 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 3 усл.ед. Медиана 25%-75% Min-Max 1 2 в 3 4 1,4 1,3 1,2 1,1 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 1 2 г Р и с у н о к 5 – Уровень белков Bcl-2 (а), Bcl-XL (б), Bax (в), Bad (г) в лимфоцитах, полученных у здоровых доноров (1 – интактная культура клеток, 2 – клетки после воздействия 0,1 нг/мл rIL-2) и у пациентов с клещевым энцефалитом (3 – больные острым клещевым энцефалитом, 4 – лица с хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита) Важно подчеркнуть, что в присутствии rIL-2 было зарегистрировано двукратное увеличение количества другого апоптотического индуктора – Bad, в то время как значения данного показателя у пациентов с клещевым энцефалитом сохранялись на неизменном уровне (рис. 5г). Таким образом, результаты настоящего исследования позволяют заключить, что сдвиг равновесия между содержанием про- и антиапоптотических Bcl2-белков в сторону проапоптотических лежит в основе апоптозиндуцирующего действия rIL-2. 17 Регуляция активности белков семейства Bcl-2 осуществляется транскрипционными факторами NFkB и Р53, которые управляют экспрессией генов этих белков [Fridman J.S., Lowe S.W., 2003]. В проведенном нами исследовании было установлено, что культивирование интактных лимфоцитарных клеток здоровых лиц с rIL-2 в проапоптотической дозе, равной 0,1 нг/мл, а также лимфоцитов пациентов с клещевым энцефалитом в безцитокиновой питательной среде сопровождается статистически значимым повышением содержания свободной субъединицы RelA NFkB (рис. 6). усл.ед. 1,4 1,2 1,0 NFkB (Mr=65 kDa) 0,8 0,6 GAFDG Медиана 25%-75% Min-Max 0,4 0,2 1 2 3 4 Р и с у н о к 6 – Уровень NFkB в лимфоцитах, полученных у здоровых доноров (1 – интактная культура клеток, 2 – клетки после воздействия 0,1 нг/мл rIL-2) и у пациентов с клещевым энцефалитом (3 – больные острым клещевым энцефалитом, 4 – лица с хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита) Большинство авторов рассматривает данный транскрипционный фактор в качестве внутриклеточного вторичного мессенджера, опосредующего передачу пролиферативного сигнала от IL-2 с плазматической мембраны к ядру клетки [Yamamoto Y., Gaynor R.B., 2001; Beyaert R., 2004; Gilmore T.D., 2006; Perkins N.D., 2007]. Однако в ряде экспериментальных работ была показана возможность NFkB-опосредованной активации Р53, ведущей к транскрипции генов проапоптотических белков [Kucharczak J. et al., 2003; Prasad T.S. et al., 2009]. В ходе проведенного исследования установлено снижение содержания нефосфорилированной формы белка Р53 в лимфоцитарных клетках здоровых лиц, инкубированных с проапоптотической дозой цитокина, а также в лимфоцитах крови, полученных у пациентов с клещевой нейроинфекцией (рис. 7). Это можно объяснить, по-видимому, переходом данного белка в активное, а именно 18 усл.ед. 1,8 1,6 1,4 1,2 Р53 (Mr=53kDa) 1,0 0,8 Медиана 25%-75% Min-Max 0,6 GAFDG 0,4 1 2 3 Р и с у н о к 7 – Уровень Р53 в лимфоцитах, полученных у здоровых доноров (1 – интактная культура клеток, 2 – клетки после воздействия 0,1 нг/мл rIL-2) и у больных острым клещевым энцефалитом (3) фосфорилированное состояние, поскольку транскрипционный фактор Р53 функционирует только в такой модификации [Burlacu A., 2006]. В качестве одного из возможных механизмов этого процесса можно рассматривать способность IL-2 активировать MAP-киназу JNK и белок NFkB, задействованные в фосфорилировании N-терминального домена Р53 [Kucharczak J. et al., 2003]. Одной из молекулярных мишеней белка Р53 выступает универсальный ингибитор циклинзависимых киназ Р21 (Waf1, Cip1, Sdi1), способный приводить к остановке клеточного цикла и запуску программы апоптоза в ответ на различные стрессовые стимулы [Rodriguez R., Meuth M., 2006]. С использованием метода иммуноблоттинга было показано, что культивирование лимфоцитов крови, полученных у здоровых доноров, с рекомбинантным IL-2 приводит к увеличению внутриклеточного содержания Р21 [0,48(0,48-0,72) усл.ед., р=0,032] по сравнению с соответствующим параметром в интактных клетках [0,35(0,35-0,40) усл.ед.]. Повышение уровня Р21 наряду с Р53, вероятно, свидетельствует о блоке клеточного цикла в поздней G1- и Sфазе, что увеличивает чувствительность лимфоцитарных клеток к индукции апоптоза [Gartel A.L., Radhakrishnan S.K., 2005. Таким образом, оценка молекулярных механизмов IL-2-опосредованного апоптоза показала наличие сложной многокомпонентной реакции клетки в ответ на изменение условий ее жизнедеятельности (рис.8). Было выявлено, что индуцированное данным цитокином усиление наработки активных форм кисло- 19 Взаимодействие IL-2 с IL-2R Активация PI3/Akt пути Возрастание уровня внутриклеточных АФК Активация фосфорилирования JNK Активация фактора транскрипции NFkB ↑ синтеза Bcl-2 ↑ синтеза MnSOD ↑ дисмутации супероксида Активация фосфорилирования P38 МАРК Активация фактора транскрипции Р53 Активация IAPs Ингибирование каспаз -3, -6, -7,-8,-9 Активация проапоптотических белков семейства Bcl-2 Открытие пор пермеабилизационного перехода митохондриальных мембран Снижение трансмембранного потенциала митохондрий Выход в цитозоль апоптозиндуцирующих факторов Экспрессия фосфатидилсерина на цитоплазматической мембране и повышение её проницаемости Ингибирование апоптоза лимфоцитов крови Опухолевая прогрессия (лейкозы) ↑ − повышение, ↓ − снижение, Апоптоз лимфоцитов крови Инфекционные заболевания (клещевой энцефалит, вирусный гепатит В и С, туберкулез), аутоиммунные заболевания − ингибирование, → усиление Рисунок 8 – Молекулярные механизмы про- и антиапоптотического эффекта интерлейкина-2 [по данным J. Kucharczak et al., 2003; A. Matsuzawa et al., 2005; R. Rodriguez, M. Meuth, 2006 и результатам собственных исследований (выделено цветом)] 20 рода сопровождается активацией транскрипционных факторов, приводящей к изменению профиля экспрессии соответствующих генов. При этом, как показали полученные данные, судьба клетки решается на уровне белков семейства Bcl-2. Последние могут изменять свою активность в результате взаимодействия друг с другом, вышестоящими компонентами сигнальных систем, а также окислительной модификации. Важно подчеркнуть, что молекулярные механизмы реализации апоптотической программы лимфоцитов крови в использованной нами модели in vitro во многом схожи с таковыми при клещевой нейроинфекции. При этом АФК, вероятно, принадлежит роль вторичных мессенджеров, опосредующих активацию факторов транскрипции. Под действием последних происходит индукция синтеза белков, участвующих, в частности, в усилении митохондриальной проницаемости. Следует заметить, что устранение апоптозиндуцирующего действия IL-2, наблюдаемое при культивировании лимфоцитов в цитокинсодержащей среде в присутствии индуктора клеточной гибели дексаметазона, подтверждает гипотезу о том, что эффект данного медиатора определяется физиологическим состоянием клеток. Известно, что в организме на лимфоциты, помимо IL-2, действует множество различных сигнальных молекул, состав которых и интенсивность действия зависит от степени зрелости клеток, их фенотипа и стадии иммунного ответа. При разных физиологических и патологических процессах и состояниях в клетке активируются различные сигнальные пути, и меняется состав белков-регуляторов, благодаря чему IL-2 способен оказывать противоположные эффекты на апоптоз лимфоцитов (рис. 8). Точные внутриклеточные механизмы двойственности эффектов IL-2 требуют дальнейшего изучения. Это, в свою очередь, позволит понять процессы, лежащие в основе гомеостаза иммунной системы, что даст возможность для разработки новых методов лечения и диагностики заболеваний, связанных с дизрегуляцией апоптоза иммукомпетентных клеток. ВЫВОДЫ 1. При культивировании лимфоцитов, полученных у здоровых доноров, с рекомбинантным интерлейкином-2 в дозах 0,1-1,0 нг/мл увеличивается содержание апоптотически измененных клеток пропорционально концентрации цитокина. На фоне глюкокортикоидиндуцированного апоптоза (дексаметазон в дозе 10-4 М) рекомбинантный интерлейкин-2 оказывает антиапоптотический эффект на лимфоциты крови, который также носит дозозависимый характер. 2. Механизмы проапоптотического действия на лимфоциты рекомбинантного интерлейкина-2 в дозе 0,1 нг/мл обусловлены снижением трансмем- 21 бранного потенциала митохондрий на фоне внутриклеточного накопления активных форм кислорода, дисбалансом белков семейства Bcl-2 с про- и антиапоптотической функцией (уменьшение уровня Bcl-2, Bcl-XL и Bax, повышение – Bad) и увеличением содержания ингибитора циклинзависимых киназ Р21. 3. Дисбаланс системы интерлейкина-2 при клещевом энцефалите (снижение числа лимфоцитов, презентирующих рецепторы к интерлейкину-2 на фоне повышенной или нормальной продукции цитокина у больных острым клещевым энцефалитом и у пациентов с хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита, соответственно) сопровождается индукцией апоптотической гибели лимфоцитов, повышением количества клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий и высоким внутриклеточным уровнем активных форм кислорода. 4. У пациентов с клещевым энцефалитом апоптоз лимфоцитарных клеток крови опосредован смещением баланса белков семейства Bcl-2 в сторону проапоптотических: снижение содержания Bcl-2 и Bcl-XL на фоне отсутствия изменений уровня Bax и Bad. 5. При нарушении в системе интерлейкина-2 и его рецептора как в условиях in vitro, так и инфекционного процесса (клещевой энцефалит) молекулярные механизмы модуляции апоптотической гибели лимфоцитов являются однотипными и связаны с активацией митохондриального пути апоптоза, а также транскрипционных факторов NFkВ и Р53. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Роль p53 и NFkВ в реализации IL-2-опосредованного апоптоза лимфоцитов / Е.В. Сазонова, О.Е. Чечина, А.К. Биктасова и др. // Медицинская иммунология. – 2009. – № 4-5. – С. 380. 2. Система TNFα-TNF–RI и апоптоз лимфоцитов крови при хронической антигенемии вируса клещевого энцефалита / А.К. Биктасова, О.Б. Жукова, О.Е. Чечина, Е.В. Сазонова и др. // Медицинская иммунология. – 2009. – № 4-5. – С. 334. 3. Молекулярные механизмы дизрегуляции апоптоза лимфоцитов при дисбалансе Th1- и Th2-цитокинов / Н.В. Рязанцева, О.Е. Чечина, В.В. Новицкий, Е.В. Сазонова и др. // Российский иммунологический журнал. – 2008. – Т. 2(11), № 2-3. – С. 259. 4. Молекулярные механизмы цитокиновой регуляции апоптоза лимфоцитов / О.Е. Чечина, А.К. Биктасова, Е.В. Сазонова и др. // Аллергология и иммунология. – 2009 – Т. 10, № 2. – С. 176. 22 5. Роль цитокинов в редоксзависимой регуляции апоптоза / О.Е. Чечина, А.К. Биктасова., Е.В. Сазонова и др. // Бюллетень сибирской медицины. – 2009. – №2. – С. 67-71. 6. Роль NFkB, p53 и р21 в регуляции ФНО-a-опосредованного апоптоза лимфоцитов / Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, О.Б. Жукова, А.К. Биктасова, О.Е. Чечина, Е.В. Сазонова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины – 2010. – № 1. – С. 56-59. 7. Состояние TNFα-опосредованного пути регуляции апоптоза лимфоцитов периферической крови при длительной антигенемии вируса клещевого энцефалита / А.К. Биктасова, О.Б. Жукова, О.Е.Чечина, Е.В. Сазонова // Материалы VII Конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке». – Томск, 2007. – С. 168. 8. TNF-опосредованная регуляция программированной гибели лимфоцитов при антигенемии вируса клещевого энцефалита / А.К. Биктасова, О.Б. Жукова, О.Е. Чечина, Е.В. Сазонова и др. // Материалы Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии». – СПб, 2007. – С. 13-14. 9. Клинико-иммунологическая характеристика клещевого энцефалита / И.Н. Удинцева, О.Е. Чечина, Н.Г. Жукова, Л.В. Лукашова, Н.В. Рязанцева, А.М. Попонина, Л.А. Малышева, Н.Н. Бартфельт, З.С. Кемерова, А.К. Биктасова, Е.В. Сазонова // Межрегиональная научно-практическая конференция с международным участием «Актуальные проблемы клещевых нейроинфекций». – Медицина в Кузбассе. – 2008. – № 5. – С. 152-156. 10. P53 и NFkB – сигнальные трансдукторы IL-2-опосредованного апоптоза лимфоцитов / Е.В. Сазонова, О.Е. Чечина, А.К. Биктасова, О.Б. Жукова // Материалы X Конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке». – Томск, 2009. – С. 101-102. 11. Дисбаланс белков семейства Bcl-2 в модуляции апоптоза лимфоцитов / А.Н. Марошкина, О.Е. Чечина, О.Б. Жукова, Н.В. Рязанцева, Т.С. Прохоренко, А.К. Биктасова, М.В. Белкина, Е.В. Сазонова и др. // Материалы Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация»: сб. статей молодых ученых. – Пущино, 2009. – С. 457-461. 12. Дозозависимые эффекты IL-2 на программированную гибель лимфоцитарных клеток / Е.В. Сазонова, О.Е. Чечина, А.К. Биктасова, О.Б. Жукова // Материалы Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии». – СПб, 2009. – С. 96-97. 13. Нарушение TNFα-опосредованного апоптоза лимфоцитов как механизм формирования хронической персистенции вируса клещевого энцефалита / 23 А.К. Биктасова, О.Е. Чечина, Е.В. Сазонова, О.Б. Жукова // Материалы Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии». – СПб, 2009. – С. 18-19. 14. Изменение содержания транскрипционных факторов при TNFαопосредованном апоптозе лимфоцитов крови / А.К. Биктасова, О.Б. Жукова, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, О.Е. Чечина, Е.В. Сазонова // Материалы Х Международного конгресса «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии». – Казань, 2009.– С. 278. 15. Роль белков семейства Bcl-2 в регуляции IL-2-опосредованного апоптоза лимфоцитов крови / Е.В. Сазонова, А.К. Биктасова, О.Б. Жукова и др. // Материалы Х Международного конгресса «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии». – Казань, 2009. – С. 308. 16. Участие транскрипционных факторов и белков семейства Bcl-2 в TNFαопосредованном апоптозе лимфоцитов / А.К. Биктасова, О.Б. Жукова, О.Е. Чечина, Е.В. Сазонова // Материалы X Конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке». – Томск, 2009. – С. 71-72. 17. Молекулярные мишени проапоптотического действия ИЛ-2, ИЛ-4 и ФНОα при поляризации иммунного ответа по Th1- и Th-2-пути / Н.В. Рязанцева, О.Е. Чечина, В.В. Новицкий, Е.В. Сазонова и др. // Материалы Четвертой Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» – Новосибирск, 2009. – С. 225-226. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АФК FITC Th ∆ψ NFkB Bad Bax Bcl-2 Bcl-XL GAFDG IL IL-2R MnSOD rIL-2 – активные формы кислорода – флюоресцеинизотиоцианат – Т-хелпер-лимфоцит – митохондриальный трансмембранный потенциал – nuclear factor kB, ядерный фактор kB – Bсl-2 agonist of cell death, Bcl-2-агонист клеточной смерти – Bcl-2-associated X protein, Bcl-2-ассоциированный белок Х – В-cell lymphoma/leukemia protein 2, белок 2 В-клеточной лимфомы/лейкемии – Bcl-2 related protein, long isoform, Bcl-2-связанный белок, длинная изоформа – глицеральдегидфосфатдегидрогеназа – interleukin, интерлейкин – interleukin-2 receptor, рецептор к интерлейкину-2 – магниевая супероксиддисмутаза – recombinant interleukin-2, рекомбинантный интерлейкин-2 24 Автор выражает благодарность заведующей лабораторией клинической иммунологии ФГУЗ Клиническая больница № 81 ФМБА России канд. мед. наук Т.Т. Радзивил, зав. кафедрой инфекционных болезней и эпидемиологии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава профессору, д-ру мед. наук А.В. Лепехину, профессору кафедры неврологии и нейрохирургии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава д-ру мед. наук Н.Г. Жуковой за ценные теоретические и методические советы.
