017017 B1 017017 B1 (11) 017017

Евразийское
патентное
ведомство
(19)
(11)
017017
(13)
B1
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45)
Дата публикации и выдачи патента
2012.09.28
(21)
(51) Int. Cl. A61K 47/42 (2006.01)
A61P 35/00 (2006.01)
Номер заявки
201070216
(22)
Дата подачи заявки
2008.07.16
(54)
ОКИСЛЕННЫЙ АВИДИН С БОЛЬШИМ ВРЕМЕНЕМ УДЕРЖАНИЯ В
ОБРАБОТАННОЙ ИМ ТКАНИ
B1
(72)
Изобретатель:
(74)
Представитель:
(57)
В изобретении приведено описание химически модифицированных авидинов, имеющих большую
стабильность в обработанной ими ткани по сравнению с авидином дикого типа. Окисление
авидина проводят окислением с периодатом в присутствии низкоаффинного лиганда HABA,
который, занимая участки связывания биотина, предупреждает денатурацию белка в ходе стадии
окисления. В результате окисления периодатом при разрыве маннозного кольца образуются CHOгруппы, которые при инъекции в ткань вступают в реакцию с NH2-группами ткани, образуя
стабильные Шиффовы основания. Заякоренные авидины сохраняют способность связывать
биотинилированные агенты, имеющие терапевтическую активность, такие как радиоактивно
меченые биотины, стволовые клетки и соматические клетки, используемые для брахитерапии,
подобной радионуклидной терапии с интраоперативным авидинированием для (IART®), или для
брахитерапии дегенеративных или генетических болезней.
Де Сантис Рита, Нуццоло Карло
Антонио (IT)
Медведев В.Н. (RU)
B1
017017
(56) US-A1-2002137125
GREEN N.M.: "AVIDIN. 3. THE NATURE
OF THE BIOTIN-BINDING SITE". THE
BIOCHEMICAL JOURNAL, DEC. 1963, vol.
89, December 1963 (1963-12), pages 599-609,
XP009105730, ISSN: 0264-6021, cited in the
application, page 604, right-hand column, paragraph
2, page 606, left-hand column, paragraph 2, page 607,
right-hand column, paragraph 3, page 608, right-hand
column, paragraph 1
US-A1-2004191832
WO-A-2004093916
017017
(31) 07113733.5; 08157473.3
(32) 2007.08.02; 2008.06.03
(33) EP
(43) 2010.08.30
(86) PCT/EP2008/059260
(87) WO 2009/016031 2009.02.05
(71)(73) Заявитель и патентовладелец:
СИГМА-ТАУ ИНДУСТРИЕ
ФАРМАСЬЮТИКЕ РИУНИТЕ С.П.А.
(IT)
017017
Область техники
Настоящее изобретение относится к модифицированным авидинам, пригодным для связывания
биотинилированных соединений или клеток и удерживания их на участке тела, нуждающегося в терапии.
Предпосылки изобретения
В течение многих лет авидин-биотиновая система была известна в качестве превосходного инструмента для количественных и качественных исследований взаимодействий между низкомолекулярными
соединениями и биологическими рецепторами (Wilchek, M., et al., Immunol. Today, 1984, 6, 39).
Авидин представляет собой гликопротеин с молекулярным весом около 68 кД, присутствующий в
яичном белке и имеющий высокое сродство к витамину Н (биотину). Его константа диссоциации
(Kd~10-15 M) является наиболее низкой из известных в природе (Green N.M., et al., Biochem. J., 1970, 118,
67; Green, N.M., Adv. Protein Chem., 1975, 29, 85). Авидин состоит из четырех субъединиц с идентичной
аминокислотной последовательностью, каждая из которых может потенциально связывать одну молекулу биотина. Остатки сахара составляют примерно 10% от молекулярного веса авидина, причем на одну
субъединицу в среднем приходится от 4 до 5 остатков маннозы и 3 N-ацетилглюкозаминовых остатка
(Bruch R.С., et al., Biochemistry, 1982, 21, 5334).
В 1988 году было опубликовано исследование, посвященное изучению взаимодействия между радиоактивно мечеными производными биотина и авидином (Garlick R.K., et al., J. Biol. Chem., 1988, 263,
210).
В WO 04093916 на имя заявителя описана двухстадийная периоперативная терапия солидных опухолей в качестве нового вида брахитерапии. Первая стадия включала введение в оперируемую область
биотинилированного специфического антитела с последующей инъекцией нативного или модифицированного молекулами ПЭГ авидина для создания "искусственного рецептора". Затем во второй стадии
проводили системное введение подходящего противоракового агента, связанного с биотином. Вторую
стадию необходимо провести в интервале от 4 до 72 ч после хирургического удаления опухоли. Однако в
этом патенте не предлагалось прямое "авидинирование" посредством связывания авидина с данной тканью.
Клиническое применение этой двухстадийной брахитерапии с использованием авидина на первой
стадии и радиоактивно меченого биотина-DOTA (ST2210) на второй стадии оказалось эффективным для
частичного облучения хирургически оперируемой области у пациентов с раком молочной железы
(Paganelli G., et al., The Breast, 2007, 16, 17; Paganelli G., et al., Clin. Cane. Res., 2007, 13, 5646). Доза облучения, высвобождаемая в хирургически оперируемый сектор, у 11 пациентов в среднем составляла 20 Гр
при вводимой дозе 100 мКи. Это составляет около 1/3 предполагаемой дозы 60 Гр, получаемой такими
пациентами при стандартной дистанционной лучевой терапии (ДЛТ).
Недавно были опубликованы результаты применения конструкций стрептавидина с антителами
вместе с конъюгатами биотина и радионуклидов при лечении пациентов со злокачественными глиомами
и биспецифических антител с гаптен-радионуклидами в терапии опухолей, экспрессирующих карциноэмбриональный антиген (Goldenberg, D.M., et al., J. Clin. Oncol., 2006, 24, 823). Однако в довольно большом числе случаев вследствие слишком высокой дозы радиоактивности, проходящей через почки, возникала нефротоксичность.
Одной из главных проблем при лечении с использованием авидина является его быстрое выведение
из организма. В последнее время проводимые исследования сосредоточены на поиске "модифицированного авидина" с более продолжительным временем полужизни. В одном из таких подходов через свободные аминогруппы к белку присоединяют монометоксиполиэтиленгликоль, что дает увеличение времени полужизни модифицированного авидина в плазме, причем при использовании авидина, связанного
с ПЭГ-20000, 8% внутривенно введенной дозы все еще присутствует в опухоли через 5 ч, а через 72 ч 6% (Caliceti P., et al., J. Control. Release, 2002, 83, 97).
Фармакокинетическое исследование влияния размера молекулы ПЭГ показало, что при увеличении
веса молекулы ПЭГ сокращается время полужизни, в то время как степень аффинности взаимодействия
биотина и авидина имеет обратную тенденцию (Salmaso S., et al., Biochim. Phys. Acta, 2005, 1726, 57).
Другое исследование фармакокинетических свойств модифицированного молекулами ПЭГ-авидина
и его способности связывать биотин показало, что соотношение семь молекул ПЭГ на молекулу авидина
является наилучшим, позволяющим увеличить время полужизни в плазме и снизить иммуногенность
авидина. Однако не было приведено никаких данных в отношении накопления биотинилированного лекарственного соединения в опухолях в животной модели (Chinol M., et al., Br. J. Cancer, 1998, 78, 2, 189).
Проводили исследования термочувствительных полимеров в качестве альтернативы ПЭГ-авидину.
Поли(сополимер N-изопропилакриламида и акриламида)авидин обладает большим временем удержания
в кровотоке по сравнению с авидином и меньше накапливается в печени (Salmaso S., et al., Int. J. Pharm.,
2007, 340, 20). Однако в этом случае также не было приведено никаких данных относительно накопления
биотинилированного лекарственного соединения в опухолях в животной модели.
К сожалению, на сегодняшний момент не существует эффективного и селективного способа специфической локализации терапевтических агентов.
-1-
017017
Поэтому все еще необходимо улучшение противораковой терапии, и на это направлена основная
часть исследований, проводимых фармацевтическими компаниями.
Связывание авидина с биотином зависит от белковой части молекулы гликопротеина. В действительности, дегликозилированный авидин сохраняет способность связывать биотин (Hiller Y., et al.,
Biochem. J., 1987, 248, 167; Rosebrough S.F., et al., J. Nucl. Med., 1996, 37, 8, 1380).
Увеличение накопления и стабильности терапевтического агента в области, которой необходимо
воздействие, можно получить посредством авидинирования ткани модифицированным авидином,
имеющим более высокую стабильность в ткани по сравнению с авидином дикого типа.
Такая стратегия позволяла бы избежать необходимости системного введения авидина и, следовательно, предупреждала бы любые побочные эффекты, связанные с такой терапией. Дополнительно, повышенное авидинирование целевой ткани давало бы в результате менее токсичный способ лечения
вследствие меньшего содержания противоракового агента в нецелевых органах и меньшей дозы противоракового агента для получения такого же эффекта, как при использовании авидина дикого типа.
В настоящем изобретении было найдено, что с помощью окисления гликозилированной части авидина можно получить стабильное авидинирование окружающей опухоль ткани, что обеспечивает лучшее
накопление биотинилированного противоракового агента в такой области.
Описание изобретения
Настоящее изобретение включает химически окисленный авидин, способный взаимодействовать с
тканями in vivo через обратимую ковалентную химическую связь, что задерживает его диффузию. Такой
окисленный авидин вводят на этапе хирургического вмешательства (или с помощью инъекции) в отдельные орган или ткань, которым необходима терапия.
Недавно было раскрыто окисление авидина с помощью 10 мМ периодата натрия (US 20020137125).
В нем авторы присоединяли окисленный авидин к фосфопентаманнозогидразину для получения иминного производного с высокой степенью фосфорилирования, которое затем можно вводить пациенту для
модификации лизосомного фермента, что усиливает эффективность ферментзамещающей терапии при
лизосомных болезнях. Следует отметить, что образование иминов не происходит in vivo. Также следует
отметить, что в этой заявке не была приведена активность такого модифицированного авидина.
В частности, настоящее изобретение относится к окисленному авидину, полученному окислением
молекул сахара в гликопротеине, стабильность которого в тканях превышает стабильность авидина дикого типа (авидина-ДТ), в результате чего минимизируются побочные эффекты, возникающие при использовании ранее опубликованных модифицированных авидинов.
Связывание с тканью окисленного авидина является высокогомогенным и не зависит, как, например, в IART (радионуклидной терапии с интраоперативным авидинированием) от способности положительно заряженного авидина локализоваться в опухолевых или воспаленных тканях. Поэтому действие
окисленного авидина не ограничено специфическим взаимодействием с опухолевыми клетками, что позволяет авидинирование тканей, окружающих удаляемые хирургическим путем опухоли, которые, как
известно, содержат дополнительные опухолевые клетки, мечение которых авидином дикого типа затруднено.
Первый вариант осуществления настоящего изобретения относится к химически модифицированному авидину дикого типа, получаемому путем окислительного раскрытия пиранозного кольца сахара, в
результате которого образуются альдегидные группы, взаимодействующие с аминогруппами, присутствующими в целевой ткани.
При кислом рН (ниже 6,0) альдегидные группы (CHO) являются, по существу, инертными в отношении белковых NH2-групп, поскольку они присутствуют в протонированной форме (NH3+). Однако при
pH7 CHO-группы вступают в реакцию с белковыми NH2-группами, образуя Шиффовы основания. На
схеме 1 приведен пример химического окисления репрезентативного остатка маннозы авидина дикого
типа и последующая реакция новообразованных CHO-групп с аминогруппами (R-NH2, где R представляет собой белок ткани).
Схема 1
Данное окисление сахара осуществляется с помощью хорошо известного способа, основанного на
реакции нативного авидина с периодатом натрия (Zaborsky, O.R., et al., Biochem. Bioph. Res. Comm.,
1974, 61, 1, 210; Green, N.M., Biochem. J., 1963, 89, 599).
-2-
017017
Однако известно, что окисление авидина приводит к повреждению некоторых аминокислотных остатков белка, а именно к окислению триптофана, входящего в участок связывания биотина, что приводит
к низкой аффинности к биотину и/или производным биотина (US 20040191832; Green, N.M., Biochem. J.,
1963, 89, 599).
В данном изобретении было найдено, что связывание авидина с низкоаффинным лигандом
4-гидроксиазобензол-2'-карбоновой кислотой (НАВА) перед стадией окисления придает первому конформацию, предупреждающую окисление остатков триптофана, что было показано с помощью УФ спектрального анализа таких производных. Понижение характерных точек перегиба при 282 и 291 нм в
УФ-спектре четко связано со степенью окисления триптофановых остатков; в то время как увеличение
поглощения в области 250-260 нм характерно для образования замещенного оксиндола.
Сравнение спектров поглощения окисленного авидина (оксавидина) и НАВА-насыщенного окисленного авидина (ОКСавидинаНАВА) со спектром авидина дикого типа (авидина-ДТ) указывает на то, что
использование НАВА для защиты сайта связывания биотина в процессе окисления значительно снижает
содержание поврежденного триптофана (фиг. 1).
Предпочтительным вариантом осуществления этого изобретения является окисленный авидин с
УФ-спектром, в котором поглощение при 282 и 291 нм не представляет прогиба, характерного для окисления остатков триптофана, относительно прогиба, наблюдаемого для авидина-ДТ.
Другим предпочтительным вариантом осуществления этого изобретения является окисленный авидин с УФ-спектром, в котором не увеличивается поглощение при 250-260 нм относительно увеличения,
наблюдаемого для авидина-ДТ.
Еще одним предпочтительным вариантом этого изобретения является способ окисления авидина
и/или производных авидина в присутствии НАВА-лиганда, который предупреждает окисление триптофановых остатков.
ОКСавидинНАВА имеет структурные и термодинамические свойства, очень сходные со свойствами
авидина-ДТ, что хорошо коррелирует с защитным эффектом НАВА. Термостабильность и конформационные изменения определяли с помощью спектроскопии кругового дихроизма до и после окисления, в
присутствии и в отсутствие 4 экв. биотина. Кривые плавления записывали по падению дихроического
сигнала при 225 нм в диапазоне температур 25-95C. Точку перегиба и наклон (p) сигмоидальных кривых
вычисляли с помощью аппроксимирующей модели Больцмана программного обеспечения Origin 7.0, и
они представляли собой точку перехода через денатурированное состояние.
Для каждого конкретного соединения термическая стабильность соответствует температуре, которая совпадает с точкой перегиба соответствующей кривой, полученной для диапазона температур 2595C.
Данные (табл. 1) указывают на то, что окисление снижает термическую стабильность, определяемую по снижению температуры плавления (Tm) и по наклону (p) сигмоидальной кривой ОКСавидина по
сравнению с авидином-ДТ (74,3 относительно 79,0C и 8,9 относительно 14,7 соответственно).
Неожиданно, но дестабилизирующий эффект был практически незаметен при проведении окисления с НАВА-защищенным авидином, что подтверждалось значениями Tm и p для ОКСавидинаНАВА и
авидина: 78,1 относительно 79,0C и 11,2 относительно 14,7 соответственно.
Таблица 1
* Наклон сигмоидальной кривой.
Хотя при нагревании без биотина термическая денатурация является необратимой, как для ОКСавидинаНАВА, так и для оксиавидина, только ОКСавидинНАВА способен восстанавливать свою вторичную
структуру аналогично авидину-ДТ при нагревании/охлаждении в присутствии биотина (данные не показаны). Эти данные подтверждают, что насыщение НАВА представляет собой весьма эффективный способ сохранения конформации авидина при химическом окислении и объясняет впоследствии сохраняемую способность связывать биотин.
Дополнительным предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является
окисленный авидин, имеющий термическую стабильность выше или равную 78C.
Более предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является окисленный
авидин, имеющий термическую стабильность выше или равную 78C с наклоном сигмоидальной кривой
выше 10.
-3-
017017
Предыдущие данные также подтверждаются способностью окисленного авидина (ОКСавидинаНАВА)
связывать биотинилированный аддукт ST2210 аналогично авидину-ДТ, как показано в табл. 2.
Таблица 2
N - число независимых экспериментов;
SD - стандартное отклонение;
HT - не тестировалось;
@Экспериментальное значение 97,40,5, полученное с биотином-DOTA (ST2210) по
сравнению с биотином в НАВА-анализе, принимали за 100% в качестве референсного
значения для модифицированных авидинов;
*p<0,05 относительно 10 мМ;
#p<0,01 относительно 10 мМ (односторонний Anova с последующим тестом СтьюдентаНьюмана-Кейлса);
**p<0,001 относительно той же концентрации периодата без НАВА (двусторонний Anova
с последующим тестом Бонферони).
Окисленный авидин, полученный по оптимизированному способу (ОКСавидинНАВА), обладает
улучшенными свойствами по сравнению с окисленным авидином, полученным без защиты с помощью
НАВА, в отношении связывания с ST2210, в то же время обладая высокой стабильностью в ткани (в
мышцах конечностей мышей после внутримышечной инъекции). В действительности, при окислении
авидина 10 мМ NaIO4 его способность связывать ST2210 становится выше при добавлении НАВА перед
окислением (86,3% по сравнению с только 50,9% для соответствующего окисленного авидина в отсутствие НАВА). Аналогичный результат возникает при окислении более высокой концентрацией (20 мМ)
периодата натрия (81,4 относительно 49,1%).
Дополнительным предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является
окисленный авидин, связывание которого с ST2210 составляет 75% или выше относительно 97,4%, полученного для авидина-ДТ.
Более того, стабильность окисленного авидина в тканях задних конечностей мыши (вне зависимости от присутствия НАВА при окислении) была значительно выше, чем для авидина-ДТ. Это хорошо
коррелирует с присутствием CHO-групп в гликозилированных боковых цепях авидина.
В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения после окисления 10 и
20 мМ NaIO4 образуется от примерно 8 до 15 CHO-групп на молекулу авидина (определенных способом
с использованием реагента Purpald).
-4-
017017
В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения "НАВАзащищенные" окисленные авидиновые производные (ОКСавидинНАВА) сохраняют высокую способность
к связыванию ST2210 и обладают стабильностью в тканях через 24 ч и через 1 неделю после инъекции,
что коррелирует с числом CHO-групп.
Физико-химические исследования с помощью изотермической титрационной калориметрии
(ИТК) такого взаимодействия авидина с биотином выявили, что ST2210 связывает авидин-ДТ и ОКСавидинНАВА аналогичным образом, что демонстрируют константы ассоциации (KA) и изменение энтальпии
(Н) (3,45 относительно 2,50106 М-1 и -1,48 относительно -1,71104 ккалмоль-1 соответственно). В отличие от этого взаимодействие ST2210 и ОКСавидина характеризуется более низким значением KA
(6,45105 М-1) и более высоким значением H (-0,79104 ккалмоль-1).
В соответствии с данными по связыванию ST2210 с окисленными авидинами (в пределах ошибки
эксперимента) определенная стехиометрия взаимодействия составляет 3,0, 1,7 и 1,2 молекулы ST2210 на
молекулы авидина-ДТ, ОКСавидинаНАВА и ОКСавидина соответственно.
Таблица 3
Окисленный авидин по настоящему изобретению, по существу, сохраняет способность авидина дикого типа связывать биотин, в то же время приобретая способность к обратимому взаимодействию с белками тканей, тем самым представляя собой идеальный кандидат для применения в брахитерапии как,
например, в IART.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения окисленный авидин вводят
на интраоперационной стадии, в результате чего генерируется "искусственный рецептор" для вводимого
впоследствии противоракового агента.
Более предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является предоставление химически окисленного авидина для использования в качестве первого агента брахитерапии, имеющего высокую стабильность в обработанных им тканях, в комбинации с вторым агентом, имеющим
сродство к указанному первому окисленному авидину.
Еще более предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является предоставление химически окисленного авидина для использования в качестве первого агента брахитерапии,
имеющего высокую стабильность в обработанных им тканях, в комбинации со вторым противораковым
агентом, имеющим сродство к указанному первому окисленному авидину.
Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая указанный химически модифицированный авидин в качестве первого ингредиента и
биотинилированный терапевтический агент в качестве второго активного ингредиента.
В одном предпочтительном воплощении изобретения вторым активным ингредиентом вышеупомянутой фармацевтической композиции является биотинилированный противораковый агент.
Противораковым агентом называют агент, способный бороться с опухолями. Неполный список
противораковых агентов состоит из химиотерапевтических лекарственных соединений, радиоактивно
меченых соединений, эффекторных клеток, токсинов, цитокинов и противораковых клеток.
В другом предпочтительном воплощении изобретения терапия представляет собой радиотерапию.
Другой предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения включает в себя получение набора, пригодного для брахитерапии молочной железы, мышц, печени, поджелудочной железы,
мочевого пузыря, легких, предстательной железы, яичников, глаз и других органов.
В одной предпочтительной реализации набора два ингредиента находятся в двух отдельных контейнерах.
В одном более предпочтительном варианте осуществления изобретения контейнер химического
модифицированного авидина будет содержать достаточное количество продукта, который находится в
совместимом кислом растворе или лиофилизирован вместе с подходящими наполнителями, образуя
прессованный осадок.
-5-
017017
В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения вышеупомянутый контейнер
будет представлять собой специальный шприц, подходящий для последовательного многократного введения точных объемов содержимого в резекционные границы или остатки пораженной ткани, которые
вследствие инфильтрации в жизненно важные органы нельзя удалить хирургическим путем.
Также может быть удобным, если контейнер подходит для введения химически модифицированного авидина в виде спрея.
Предпочтительно, чтобы различные контейнеры, уже содержащие дозы отдельных ингредиентов,
изготавливались в виде единой упаковки с инструкцией по способам введения.
Еще более предпочтительно, чтобы различные контейнеры представляли собой шприцы.
В другом особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения набор для применения
в брахитерапии, например в IART, подходит для последовательного, ограниченного локальной областью, введения первого ингредиента и последующего системного или местного введения второго ингредиента.
Второй ингредиент композиции этого изобретения можно вводить любыми путями, включающими,
но не ограниченными, пероральное, внутривенное, внутримышечное, интраартериальное, интрамедуллярное, интратекальное, интравентрикулярное, трансдермальное или чрескожное введение, подкожное,
внутрибрюшинное, интраназальное, энтеральное, местное, сублингвальное, интравагинальное, ректальное введение или местное нанесение на пораженную ткань.
В клинической практике существуют случаи, когда брахитерапию проводят, вводя радиоизотоп напрямую в массу опухоли (а именно, в неоперируемые опухоли мозга, как описано в Julow J., et al., Prog.
Neurol. Surg., 2007, 20, 303) или в пораженные опухолью органы (а именно, в предстательную железу,
как описано в Saito S., et al., Int. J. Clin. Oncol., 2007, 12, 395). В таком случае идеальным устройством для
брахитерапии будет устройство, обеспечивающее гомогенное распределение и стабильность в области
участка, подвергаемого воздействию.
На основе экспериментальных данных было найдено, что авидинирование ткани происходит в различных тканях, таких как мышцы, молочная железа (показано в примерах), а также в ткани мозга.
В еще одном особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения будут получать
комплекс окисленного авидина и биотинилированного терапевтического агента смешиванием двух ингредиентов и далее вводить пациенту.
Композиция по настоящему изобретению состоит из лекарственного соединения, пригодного для
терапии операбельных или неоперабельных (или удаляемых не полностью) солидных опухолей, таких
как, например, но не исключительно, раковые заболевания молочных желез, поджелудочной железы,
легких, плевры, брюшной полости, лица и шеи, мочевого пузыря, мозга, предстательной железы, яичников, глаз и других органов, как описано в патентной заявке WO 2004/093916, поданной на имя заявителя.
По предпочтительному варианту осуществления изобретения окисленный авидин, полученный с
помощью способа по изобретению, можно описать, как химически модифицированный авидин, в котором по меньшей мере один из остатков маннозы замещен на остаток со следующей формулой:
Дополнительной целью настоящего изобретения являются фармацевтические композиции, описанные ранее, в комбинации с наполнителями и/или фармакологически приемлемыми разбавителями.
Дополнительным вариантом осуществления изобретения является способ получения фармацевтических композиций, отличающийся смешиванием химически модифицированного авидина с подходящими наполнителями, стабилизаторами и/или фармакологически приемлемыми разбавителями.
Наполнитель представляет собой инертное вещество, добавляемое к лекарственному соединению
для увеличения массы.
Для введения терапевтического агента фармацевтическая композиция может также содержать фармацевтически приемлемый носитель. Такие носители включают антитела и другие полипептиды, гены и
другие терапевтические агенты, такие как липосомы, при условии, что носитель можно вводить без чрезмерной токсичности.
Подходящими носителями могут быть большие, медленно метаболизируемые макромолекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, аминокислотные сополимеры и неактивные вирусные частицы.
Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых носителей можно найти в Remington's
Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N. J. 1991).
Фармацевтически приемлемые носители в терапевтических композициях могут дополнительно содержать жидкости, такие как вода, солевой раствор, глицерин и этиловый спирт.
-6-
017017
Дополнительно в таких композициях могут присутствовать вспомогательные вещества, такие как
увлажняющие или эмульгирующие агенты, pH-буферные вещества и т.п. Такие носители позволяют составить фармацевтическую композицию в виде лиофилизированных прессованных осадков, таблеток,
пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и т.п. для приема внутрь пациентами.
Субъектом лечения могут быть животные, в частности субъектом лечения может быть человек.
Схема лечения может включать однократное или многократное введение.
Доза будет определяться опытным специалистом в данной области, так чтобы ввести в целевую
ткань количество, которое проявляет эффективное терапевтическое действие.
Общий диапазон дозировок может составлять от 10 до 100 мл раствора окисленного авидина с концентрацией 3-5 мг/мл. Объем дозировки будет зависеть от объема целевой ткани, подвергаемой воздействию, т.е. 30 мл для типичного воздействия на область груди, окружающую участок квандрантектомии
(Paganelli G., et al., The Breast, 2007, 16, 17), или до 100 мл для воздействия на брюшную полость.
Биохимическая характеристика окисленного авидина включает оценку CHO-групп колориметрическим методом Purpald, известным опытному специалисту в данной области (Avigad G., Anal. Biochem.,
1983, 134, 2, 499), с использованием пропионового альдегида в качестве стандарта.
Описание чертежей
Фиг. 1. Представлены УФ-спектры трех различных форм авидина.
Фиг. 2. Кривые А, В и С относятся к профилям элюции авидина-ДТ, ОКСавидинаНАВА и ОКСавидина соответственно для гель-фильтрации (колонка Biosep-SEC-S3000 (Phenomenex, 3007,8 мм, объем:
14,3 мл) при использовании изократических условий в 100 мМ ацетатном буфере, pH 5,5 и 0,15 мМ NaCl
при скорости потока 1 мл/мин и комнатной температуре. Два последних вещества были получены из
авидина-ДТ окислением с использованием NaIO4 (20 мМ). Соотношение 280/260 относится к чистоте
авидина в отношении окисления триптофановых остатков и образования оксиндола.
Фиг. 3. Показано биораспределение в организме мыши окисленного авидина после введения с помощью внутримышечной инъекции. В частности, данные на фиг. 3a указывают на то, что через 1 ч после
инъекции количество окисленного авидина в получившей инъекцию конечности превышает более чем в
два раза количество нативного авидина. Разница возрастает со временем: через 24 и 48 ч нативный авидин практически невозможно детектировать, в то время как количество окисленного авидина соответственно составляет примерно 22 и 15% от введенной с помощью инъекции дозы на 100 мг ткани. Более
высокая концентрация окисленного авидина по сравнению с авидином дикого типа в обработанной конечности ассоциирована с более низким содержанием окисленного авидина и более высоким содержанием авидина дикого типа в нецелевых органах, в частности, в течение первого часа, как показано на
фиг. 3b-3d для крови, почек и печени соответственно. На фиг. 3e показано распределение окисленного
авидина и авидина дикого типа в противоположных конечностях.
Фиг. 4. Показана стабильность меченых 125I авидина-ДТ и ОКСавидинаНАВА в обработанных и противоположных конечностях в течение 14 недель. Этот график указывает на то, что относительно уровня,
получаемого через 1 ч после введения, время полужизни ОКСавидинаНАВА составляет около 2 недель в
отличие от 2 ч для авидина-ДТ.
Фиг. 5. Показана стабильность авидина-ДТ, ПЭГ-авидина и ОКСавидинаНАВА через 24 ч после
инъекции 45 мкг (15 мкл) меченых 125I авидина-ДТ, ПЭГ-авидина и ОКСавидина (в 100 мМ ацетатном
буфере, pH 5,5) в одну заднюю конечность мышей Balb/c. Радиоактивность в обработанной конечности
измеряли с помощью гамма-счетчика (Camberra Packard, Schwadorf Austria).
Фиг. 6. Показаны срезы мышечной ткани мышей Balb/c, получивших инъекции авидина-ДТ (вкладка а) или ОКСавидинаНАВА (вкладка b), окрашенные антителами к авидину для иммунофлуоресценции
(мышиная асцитная жидкость, несущая антитела к авидину, (А5680 batch 064K4826, Sigma Aldrich)), и
далее окрашенные вторичными антителами к мышиным иммуноглобулинам, конъюгированными с
флуоресцентной меткой Alexa Fluor 488 (batch 99E2.2, Molecular Probes). На панели а наблюдается слабое
точечное окрашивание авидина, в то время как в срезах мышц, в которые был введен ОКСавидинНАВА,
наблюдается его сильное гомогенное распределение. В обоих случаях авидин локализуется в интерстициальном пространстве.
Фиг. 7. Показана стабильность во времени 111In-ST2210, введенного внутривенно в заднюю конечность мышей Balb/c, которым за 48 ч до этого ввели авидин-ДТ или ОКСавидинНАВА (вкладка a). Вкладки
b, c и d относятся к захвату 111In-ST2210 в печени, почках и селезенке соответственно после внутривенной инъекции 111In-ST2210. На вкладке е показан захват 111In-ST2210 через 48 ч после авидинирования
ткани. В другом варианте (повторное введение 111In-ST2210) животные получали сначала дозу "холодного" ST2210, а 24 ч спустя - вторую дозу 111In-ST2210.
Фиг. 8. Показано удерживание в ткани комплексов авидина-ДТ или ОКСавидинаНАВА с ST2210 через одну неделю после инъекции в одну заднюю конечность.
Фиг. 9. Показано удерживание в ткани мозга ОКСавидинаНАВА через 24 ч после инъекции с левой
стороны черепа.
-7-
017017
Нижеследующие примеры дополнительно иллюстрируют изобретение, не ограничивая его.
Примеры
Пример 1. Синтез и биохимическая характеристика окисленных авидинов.
Способ окисления включает следующие последовательные стадии:
a) инкубация авидина дикого типа (предварительно смешанного с молярным избытком НАВА) с
окислителем, таким как 10-20 мМ периодат натрия, в 50-100 мМ ацетатном буфере при pH ниже 6,0 в
течение 1-5 ч при 4C или при комнатной температуре;
б) остановка реакции и очистка продукта путем удаления окислителя и НАВА с помощью хроматографии, ультрафильтрации, диализа или других способов очистки, известных опытному специалисту в
данной области; и
в) лиофилизация или введение в состав с кислым pH.
Далее проводили анализ молекулярного веса окисленного авидина с помощью гель-фильтрации на
колонке biosep-SEC-S3000 (Phenomenex, 3007,8 мм, объем: 14,3 мл) с использованием изократических
условий в 100 мМ ацетатного буфера, pH 5,5 и 0,15 мМ NaCl при скорости потока 1 мл/мин и при комнатной температуре.
Как показано на фиг. 2, элюция окисленного авидина происходит с небольшой задержкой по сравнению с нативным авидином.
Пример 2. Биораспределение окисленного авидина при введении в мышь.
Проводили оценку стабильности окисленного авидина (ОКСавидина) в обработанной им ткани, его
биораспределение в других органах (не обработанных), а также его способность к захвату 111In-ST2210 в
мышиной модели для имитации IART в сравнении с авидином дикого типа (авидином-ДТ).
Животную модель IART получали, проводя хирургический разрез на одной задней конечности
мыши, вводя радиоактивно меченый авидин в границы разреза и прилегающие ткани и измеряя радиоактивность в этой конечности в различных временных точках после введения авидина. В параллельной
группе мышей радиоактивный авидин вводили в конечность без хирургического вмешательства.
Количество радиоактивности через 1 и 24 ч после введения было аналогичным у животных с хирургическим вмешательством или без него. Поэтому дальнейшие исследования проводили, используя введение авидина без хирургического вмешательства. Авидин-ДТ метили 125I (Perkin Elmer, Italy) с использованием реагента Iodo-Gen (Pierce, Rockford, IL). Меченый авидин отделяли от свободного йода с помощью хроматографии на колонке PD-10 (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) и проводили его
окисление, как было описано ранее в примере 1 без какой-либо защиты с помощью НАВА.
ST2210, описанное в патентной заявке WO 02/066075 (стр. 18, 1-[2-[6-[5-[(3aS,4S,6aR)-гексагидро-2оксо-1H-триено[3,4-d]имидазол-4-ил]-1-пентиламино]-1-гексиламино]-2-оксоэтил]-1,4,7,10тетраазациклододекан-4,7,10-триуксусной кислоты пентагидрохлорид), метили 111In (Perkin Elmer, Italy) в
соответствии с описанным ранее способом (Urbano N., et al., Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 2007, 34, 68).
Мышей Balb/c nu/nu (Harlan Udine, Italy) разделяли на 8 групп по 5 мышей. Меченые 125I авидин-ДТ
или ОКСавидин вводили внутримышечно каждой мыши в одну заднюю конечность (400 мкг/мышь в 40
мкл), и через 1, 24 и 48 ч мышам вводили внутривенно 16 мкг 111In-ST2210.
Мышей забивали через 1, 24 и 48 ч после введения 111In-ST2210, образцы конечностей (обработанных и противоположных), почек, печени и крови собирали и определяли в них уровень радиоактивности
с помощью гамма-счетчика (Camberra Packard, Schwadorf, Austria).
Как показано на фиг. 3a, количество окисленного авидина в обработанной конечности более чем в
два раза превышает количество авидина через 1 ч после инъекции. Разница увеличивалась с течением
времени: через 24 и 48 ч нативный авидин становился практически недетектируемым, в то время как количество окисленного авидина соответственно составляло примерно 22 и 15% от введенной с помощью
инъекции дозы на 100 мг ткани. Как следствие этого, более высокая концентрация окисленного авидина
по сравнению с авидином дикого типа в получившей воздействие конечности ассоциирована с более
низким содержанием окисленного авидина и более высоким содержанием авидина дикого типа в нецелевых органах, в частности, в течение первого часа, как показано на фиг. 3b-3d для крови, почек и печени
соответственно. На фиг. 3e показано распределение окисленного авидина и авидина дикого типа в противоположной конечности.
Поскольку IART, как, например, описанная в патентной заявке WO 2004/093916, предусматривает
местное введение авидина-ДТ (интраоперативная инъекция) с последующим внутривенным введением
противоракового агента через 4-72 ч, очевидно, что использование химически модифицированного авидина (такого как в примере настоящего изобретения) предоставляет большое преимущество.
Пример 3. Продолжительная стабильность в ткани авидина дикого типа и окисленного авидина.
Мышам Balb/c nu/nu (Charles River, Lecco Italy) в одну заднюю конечность вводили с помощью
инъекции 45 мкг (в 15 мкл 100 мМ ацетатного буфера, pH 5,5) меченых 125I, или авидина-ДТ, или
ОКСавидина; через указанные отрезки времени животных забивали и измеряли радиоактивность в обработанной конечности (а также в других нецелевых органах) с помощью гамма-счетчика (Camberra
Packard, Schwadorf Austria).
-8-
017017
Стабильность авидина-ДТ и ОКСавидинаНАВА наблюдали на протяжении 14 недель. Было найдено,
что время полужизни ОКСавидина по отношению к содержанию через 1 ч после инъекции составляет
примерно 2 недели в отличие от 2 ч для авидина-ДТ (фиг. 4).
Пример 4. Биораспределение окисленного авидина в ткани молочной железы.
Оценивали стабильность ОКСавидинаНАВА в ткани молочной железы по сравнению с авидином-ДТ.
50 мкг (в 15 мкл) меченых 125I авидина-ДТ или ОКСавидинаНАВА (полученных стандартным способом,
описанным в примере 1) вводили кроликам (Francucci Enzo, Rieti, Italy) в область груди, прилегающей к
соску (по 3 области на каждый образец авидина). Животных забивали через 24 ч после инъекции, в области инъекции собирали образцы ткани примерно по 200 мг и измеряли их радиоактивность с помощью
гамма-счетчика, как было описано ранее. Данные представлены в виде среднего (+/-SD) 3 измерений.
Данные в табл. 4 показывают, что через 24 ч в ткани молочной железы было обнаружено 8,5 и
65,8% от введенной дозы авидина-ДТ и ОКСавидинаНАВА соответственно. Эти данные подтверждают
более высокую стабильность ОКСавидинаНАВА по сравнению с авидином-ДТ в ткани молочной железы
кролика, ранее наблюдаемую в мышечной ткани мышей.
Таблица 4
Стабильность авидина-ДТ и ОКСавидинанНАВА
в ткани молочной железы кролика через 24 ч
Пример 5. Стабильность в ткани авидина дикого типа, авидина, модифицированного ПЭГ, и окисленного авидина.
Ранее для увеличения времени полужизни авидина в кровотоке другими исследовательскими группами были описаны химически модифицированные авидины (Caliceti P., et al., J. Control. Release, 2002,
83, 97; Salmaso S., et al., Int. J. Pharm., 2007, 340, 20). Стабильность в ткани авидина-ДТ, ПЭГ-авидина
(полученного по методике, описанной в статье Caliceti) или ОКСавидинаНАВА (окисленного авидина по
настоящему изобретению) оценивали с использованием мышей С57В1/6 (Charles River, Lecco Italy). Животным вводили в одну заднюю конечность 45 мкг меченых 125I авидина-ДТ, ПЭГ-авидина и ОКСавидинаНАВА (в 15 мкл 100 мМ ацетатного буфера, pH 5,5). Через 24 ч после инъекции животных забивали и
радиоактивность в обработанной конечности измеряли с помощью гамма-счетчика (Camberra Packard,
Schwadorf Austria).
Конъюгирование с ПЭГ не влияло на стабильность в ткани авидина-ДТ, в то время как увеличение
стабильности в ткани было подтверждено для ОКСавидинаНАВА (фиг. 5).
Пример 6. Локализация в ткани авидина-ДТ или ОКСавидинаНАВА.
Проводили сравнение локализации в ткани ОКСавидинаНАВА и авидина-ДТ на замороженных срезах
авидинированных тканей после внутримышечной инъекции в одну заднюю конечность голых мышей
Balb/c (Harlan, Udine Italy). Через 24 после инъекции вырезали мышцы и приготавливали замороженные
срезы для каждого образца. Каждый срез окрашивали гематоксилином/эозином для определения клеточной морфологии или инкубировали с мышиными антителами к авидину (А5680, Sigma Aldrich, Italy) с
последующей инкубацией с конъюгированными с флуоресцентным красителем Alexa fluor 488 антителами к мышиным иммуноглобулинам (Invitrogen, Milan Italy). В конце слайды закрывали покровными
стеклами и наблюдали под микроскопом. Как показано на фиг. 6, в срезах мышц, в которые вводили авидин-ДТ (вкладка а), наблюдается слабое точечное окрашивание авидина, в то время как в срезах мышц, в
которые был введен ОКСавидинНАВА (вкладка b), наблюдается его сильное гомогенное распределение. В
обоих случаях авидин локализуется в интерстициальном пространстве. Окрашивание гематоксилином/эозином не выявило никаких гистологических аномалий в мышцах через 24 ч после инъекции ни для
авидина-ДТ, ни для ОКСавидинаНАВА (данные не показаны).
Пример 7. Однократный и многократный захват 111In-ST2210.
Определяли способность ОКСавидинаНАВА захватывать 111In-ST2210 в сравнении с авидином-ДТ в
мышиной модели, имитирующей IART.
Мышам Balb/c nu/nu (Harlan Udine, Italy) в одну заднюю конечность вводили внутримышечно
45 мкг авидина-ДТ или ОКСавидина (в 15 мкл 100 мМ ацетатного буфера, pH 5,5). Через 48 ч после инъекции животным внутривенно вводили 5 мг 111In-ST2210.
Через указанные промежутки времени забивали группы по 5 животных и измеряли радиоактивность в обработанной конечности, а также в других нецелевых органах с помощью гамма-счетчика (Camberra Packard, Schwadorf Austria).
-9-
017017
Как показано на фиг. 7а, специфический захват 111In-ST2210 через 2 ч после внутривенного введение был значительно выше для обработанной ОКСавидиномНАВА ткани, чем для ткани, обработанной
авидином-ДТ. Эта разница в уровне радиоактивности впоследствии сохраняется до 24 ч после внутривенного введения 111In-ST2210, тем самым подтверждая продолжительное авидинирование ткани с использованием ОКСавидинаНАВА. Распределение 111In-ST2210 в нецелевых органах для авидина-ДТ и
ОКСавидинаНАВА было аналогичным (фиг. 7b-d).
Одной группе животных вводили первую внутривенную дозу 5 мкг "холодного" ST2210 за 24 ч перед второй дозой 5 мкг 111In-ST2210. Первую дозу вводили через 24 ч после авидинирования. Животных
забивали через 2 ч после внутривенного введения радиоактивно меченого ST2210 и измеряли радиоактивность в обработанной конечности с помощью гамма-счетчика, как описано выше.
Как показано на фиг. 7e, вторая доза 111In-ST2210 захватывалась обработанной ОКСавидиномНАВА
конечностью на уровне, сравнимом с уровнем при введении однократной дозы. Этот результат позволяет
предположить, что используемая в данном исследовании однократная доза ST2210 не насыщает авидинированную ткань и возможно дробление данной предполагаемой дозы.
Пример 8. Захват 111In/90Y-ST2210 и терапевтическая эффективность у трансгенных мышей NeuT.
Трансгенные мыши Balb/c, несущие активированный крысиный онкоген HER-2/neu (мыши
Balb-NeuT (Di Carlo E., et al., Lab. Invest., 1999, 79, 10, 1261), были любезно предоставлены профессором
Гвидо Форни из Туринского университета, Италия. Группам животных (по 4 на группу) вводили с помощью внутрисосковой инъекции в четвертую пару (IV) молочных желез по 25 мкл (3,3 мг/мл) либо носителя, либо авидина-ДТ, либо ОКСавидинаНАВА, когда возраст животных достигал 12 недель, что соответствовало периоду, когда у животных развивалась карцинома in situ во всех 10 молочных железах. Через 48 ч животным внутривенно вводили дозу 4,4 мкг радиоактивно меченого ST2210. Эта доза соответствовала 800 мкКи 90Y для терапевтических целей с пиком 40 мкКи 111In-ST2210 для дозиметрических
целей. Двух животных на группу забивали через 3 ч после введения и вырезали как и третью (III), так и
четвертую пару молочных желез; и измеряли в них радиоактивность с помощью гамма-счетчика, как
описано выше. Также собирали другие органы, взвешивали и измеряли радиоактивность. Данные выражали в % от вводимой дозы на 1 г ткани. Эффект этой направленной брахитерапии на опухолевые поражения оценивали путем анализа тотальных препаратов молочной железы, как было описано ранее (De
Giovanni С., et al., Cancer Research, 2004, 64, 4001).
Данные, приведенные в табл. 5, указывают на то, что у мышей NeuT специфический захват радиоактивно меченого ST2210 был явно выражен в обработанных ОКСавидиномНАВА четвертых молочных
железах, но не был выражен в обработанных авидином-ДТ или носителем четвертых молочных железах.
Результаты измерений для третьих молочных желез во всех группах животных были отрицательными
(фоновый уровень крови), указывая на то, что авидинирование ограничивается обработанной молочной
железой. Данные в целом согласуются с разницей в стабильности в ткани, ранее описанной для авидинаДТ и ОКСавидинаНАВА. Фоновый уровень радиоактивности в крови и нецелевых органах, включая почки,
печень и селезенку, был ниже 0,2% от введенной дозы на 1 г ткани в любом случае, что указывает на отсутствие необходимости проведения стадии вытеснения с биотинилированным альбумином, необходимой для текущей версии IART. Действие данной брахитерапии на основе ОКСавидинаНАВА в результате
приводило к существенному уменьшению раковых поражений в обработанных ОКСавидиномНАВА молочных железах, по сравнению с обработанными носителем или авидином-ДТ молочными железами
(данные не приведены).
Таблица 5
Пример 9. Одностадийная брахитерапия.
Проводили насыщение in vitro 125I-ОКСавидинаНАВА, используя ST2210, очищали от несвязавшегося
ST2210 с помощью ультрафильтрации и вводили внутримышечно в одну заднюю конечность мышей
Balb/c. Такой же протокол использовали для авидина-ДТ.
Проводили сравнение авидина-ДТ или ОКСавидинаНАВА, насыщенных ST2210, в данной конечности со свободным авидином-ДТ или ОКСавидиномНАВА через 1 неделю.
Результаты на фиг. 8 указывают на то, что в то время как ОКСавидинНАВА (в комплексе с ST2210
или нет) все еще присутствует через неделю после инъекции (17% от вводимой дозы на 100 мг),
авидин-ДТ практически исчезает (<0,5% от вводимой дозы на 100 мг), таким образом доказывая, что
ОКСавидинНАВА, предварительно насыщенный биотинилированным агентом, ведет себя так же, как свободный ОКСавидинНАВА, и его можно использовать для одностадийной брахитерапии.
- 10 -
017017
Пример 10. Стабильность ОКСавидинаНАВА в мозге в сравнении с авидином-ДТ.
В мозг мышей Balb/c под общей анестезией вводили с помощью инъекции меченые 125I авидин-ДТ
или ОКСавидинНАВА (доза 16 мкг в 5 мкл). Инъекции в мозг проводили гамильтоновским шприцем с левой стороны черепа на глубину 4-5 мм. Результаты на фиг. 9 указывают на то, что как в мышечной ткани,
так и в ткани молочной железы содержание ОКСавидинаНАВА в мозге через 24 ч после инъекции составляет примерно 12,656,59% от вводимой дозы на 100 мг ткани. Количество авидина-ДТ (как и в других
ранее исследованных тканях) составляет меньше 2,081,03% от вводимой дозы на 100 мг ткани. Эти результаты указывают на то, что ОКСавидинНАВА можно использовать для брахитерапии опухолей мозга
или для введения в мозг биотинилированных лекарственных средств.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Окисленный авидин, в котором по меньшей мере один остаток маннозы на молекулу авидина замещен остатком следующей формулы:
где указанный окисленный авидин содержит примерно от 8 до 15 альдегидных групп и имеет термическую стабильность, равную или выше 78C.
2. Комплекс, состоящий из окисленного авидина по п.1 и биотинилированного терапевтического
агента.
3. Комплекс по п.2, в котором биотинилированным терапевтическим агентом является противораковый агент.
4. Применение комплекса по п.2 или 3 в качестве лекарственного средства для лечения рака, дегенеративных или генетических болезней.
5. Применение окисленного авидина по п.1, в котором окисленный авидин вводят на первой стадии
лечения с последующим введением биотинилированного терапевтического агента.
6. Применение по п.4 или 5 в брахитерапии для лечения пациентов, страдающих от раковых заболеваний.
7. Применение по п.6, в котором раковое заболевание представляет собой рак молочных желез,
поджелудочной железы, легких, плевры, брюшной полости, лица и шеи, мочевого пузыря, мозга, предстательной железы, яичников или глаз.
8. Применение по п.6, в котором противораковый агент выбран из группы, состоящей из радиоизотопов, химиотерапевтических агентов, цитокинов, токсинов и противораковых клеток.
9. Применение по п.4 или 5, в котором терапевтический агент представлен биотинилированными
стволовыми клетками или соматическими клетками для лечения рака, дегенеративных или генетических
болезней.
10. Применение окисленных авидинов, где указанные окисленные авидины необязательно являются
частью комплекса по п.2 или 5 для использования в регенерации тканей, пригодной для лечения аутоиммунных/дегенеративных/генетических болезней, включающих диабет, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, болезнь Альцгеймера, травму спинного мозга, мышечную дистрофию Дюшенна, инфаркт
миокарда и удар.
11. Применение по п.8, в котором указанный радиоизотоп выбран из группы, состоящей из Fe-52,
Mn-52m, Co-55, Cu-64, Ga-67, Ga-68, Tc-99m, In-111, I-123, I-125, I-131, P-32, Sc-47, Cu-67, Y-90, Pd-109,
Ag-111, I-131, Pm-149, Re-186, Re-188, At-211, Pb-212, Bi-212 и Lu-177.
12. Фармацевтическая композиция, содержащая окисленный авидин или комплекс по любому из
пп.1-3 вместе с фармацевтически приемлемым наполнителем для применения в регенерации тканей для
лечения аутоиммунных/дегенеративных/генетических болезней, включающих диабет, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, болезнь Альцгеймера, травму спинного мозга, мышечную дистрофию Дюшенна, инфаркт миокарда и удар.
13. Набор, включающий фармацевтическую композицию по п.12, содержащую окисленный авидин
по любому из пп.1-3 в контейнере и биотинилированный терапевтический агент во втором контейнере.
14. Набор по п.13 для двухстадийной адъювантной интра- и периоперативной, ограниченной локальной областью, и/или системной терапии, в котором два контейнера имеют форму шприцев.
- 11 -
017017
15. Способ окисления авидина, в котором окисление включает следующие стадии:
а) инкубация авидина дикого типа, предварительно смешанного с молярным избытком 4гидроксиазобензол-2'-карбоновой кислоты (НАВА) с 10-20 мМ периодата натрия в 50-100 мМ ацетатном
буфере при pH ниже 6,0 в течение 1-5 ч при 4C или при комнатной температуре;
б) остановка реакции и очистка продукта путем удаления окислителя и НАВА с помощью хроматографии, ультрафильтрации, диализа или других способов очистки, известных специалисту в данной области; и
в) лиофилизация или введение в состав с кислым pH.
16. Способ лечения пациента, страдающего от ракового заболевания, отличающийся тем, что ткань
или орган, подвергаемые лечению, сначала авидинируют окисленным авидином по п.1 и после вводят
биотинилированный противораковый агент или напрямую вводят комплекс по п.2.
Фиг. 1
Фиг. 2
- 12 -
017017
Фиг. 3a
Фиг. 3b
Фиг. 3c
- 13 -
017017
Фиг. 3d
Фиг. 3e
- 14 -
017017
Фиг. 4
Фиг. 5
- 15 -
017017
Фиг. 6
Фиг. 7
- 16 -
017017
Фиг. 8
Фиг. 9
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
- 17 -