Углеводная специфичность галектинов тандемного типа
реклама
На правах рукописи Вохмянина Ольга Александровна Углеводная специфичность галектинов тандемного типа 03.01.04 – Биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2012 Работа выполнена в лаборатории углеводов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Научный руководитель кандидат химических наук Рапопорт Евгения Марковна Официальные оппоненты: Румш Лев Давыдович доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Местечкина Наталия Михайловна кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаборатории Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Ведущая организация Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный университет тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова Защита состоится 6 декабря 2012 года в 13.00 на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 2. С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 1. Автореферат разослан 01 ноября 2012 года. Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук А.Ф. Орловский 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Введение Лектины – углеводсвязывающие белки неиммунного происхождения. Связываясь с гликоконъюгатами клетки, они принимают непосредственное участие в разнообразных процессах меж- и внутриклеточного узнавания. Галектины – β-галактозидсвязывающие белки, объединенные в одну группу по гомологии в аминокислотной последовательности углеводсвязывающего сайта. В зависимости от структурной организации, галектины млекопитающих разделяют на три группы: прототип, химерный и тандемный типы (рис. 1). Галектины «прототипа» содержат один углеводсвязывающий домен (УСД), единственный белок "химерного" типа галектин-3, состоит из одного УСД и одного регуляторного домена, содержащего повторяющиеся коллагеноподобные участки. Для галектинов тандемного типа характерно наличие в молекуле двух (N- и С-) УСД, гомологичных, но не идентичных по аминокислотной последовательности. Прототип Химерный тип Тандемный тип Рисунок 1. Структурная организация галектинов. УСД выделены черным цветом, линкер галектинов тандемного типа – белым цветом, регуляторный домен галектина-3 – серым цветом. К и N – коллагеновый и N-концевой участки регуляторного домена галектина-3. Актуальность проблемы Интерес к исследованию галектинов вызван тем, что они экспрессируются на различных видах клеток, в том числе опухолевых, и вовлечены в апоптоз, регуляцию клеточного цикла, адгезию клеток друг к другу и межклеточному матриксу, передачу межклеточных сигналов, некоторые галектины являются маркерами трансформации клетки и медиаторами воспаления. Несмотря на многообразие функций, информация об углеводной специфичности галектинов в составе клеток ограничена. С помощью различных бесклеточных тест-систем, которые отличаются друг от друга презентацией гликанов или лектина, было показано, что экспонированные на поверхности клетки галектины способны связываться с любыми комплементарными β-Gal-терминированными гликанами, содержащие остатки Fucα или Galα/GalNAcα. Однако, исследования, проведенные in vitro и in vivo, показали, что клеточные галектины избирательно связываются только с некоторыми гликанам, то есть применяемые для исследования специфичности белка искусственные модели не воспроизводят в полной 3 мере особенности взаимодействия галектина с клеточным окружением. В связи с этим представляет большой интерес изучение углеводной специфичности галектинов в составе клеток. Цель и задачи Цель данной работы – установить механизм, который обеспечивает избирательность галектинов в составе клеток. В связи с этим были поставлены следующие задачи: 1. Исследовать углеводную специфичность галектинов тандемного типа человека, как полноразмерных, так и однодоменных. 2. Провести сравнительный анализ углеводной специфичности куриного (CG8) и человеческого галектинов-8. 3. Исследовать, какой из углеводсвязывающих доменов, N- или С-, участвует в заякоривании на клетке, и с какими гликанами он связывается; объяснить, какой из доменов (или оба) вовлечены в связывание с внешними гликанами. 4. Исследовать локализацию галектинов тандемного типа в гликокаликсе. Научная новизна и практическая значимость работы Предложен метод исследования углеводной специфичности лектинов (не имеющих GPI якоря) в составе клетки. Исследована углеводная специфичность галектинов тандемного типа в составе клетки; выявлен паттерн их лигандов. Проведен сравнительный анализ углеводной специфичности одного и того же галектина, но выделенного из разных источников: на примере куриного и человеческого галектина-8 показано, что их углеводсвязывающие профили совпадают. Выявлены клеточные гликаны, с помощью которых N- и C-УСД галектинов тандемного типа заякориваются на клетке, показано, что несмотря на наличие двух функционально активных УСД, ключевая роль в связывании экзогенных гликанов принадлежит C-УСД. Выявлено, что одним из механизмов избирательности связывания может быть маскирование галектинов цис-лигандами1, то есть взаимодействие белка с цис-лигандами управляет связыванием «внешних» (транс)-лигандов. Несмотря на то, что работа имеет фундаментальную направленность, свойство галектинов тандемного типа высоко специфично связывать группоспецифические антигены крови АВН может быть использовано при создании новых лекарств, направленных на активацию иммунной системы при инфекционных и воспалительных процессах, а также онкотрансформации. Публикации и апробация работы По теме диссертации опубликовано 2 статьи в рецензируемых журналах. Основные материалы диссертации были представлены на следующих конференциях: Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009» (Москва, 2009), 1 Цис-гликаны – гликаны, экспрессирующиеся на тех же клетках, что и галектин; трансгликаны – гликаны других клеток 4 IV Российский симпозиум «Белки и пептиды», (Казань, 2009), Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова, (Москва, 2009), 13-я международная пущинская школа-конференция молодых ученых, (Пущино, 2009), XXII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии, (Москва, 2010), 11th European Training course on Carbohydrate (Вагенинген, Нидерланды, 2010), Annual Conference of the Society for Glycobiology (Сейнт Пит Бич, Флорида, США, 2010), Russian-Indian Symposium on Glycosciences (Москва, 2011), XXI International Symposium on Glycoconjugates (Вена, Австрия, 2011), Первая Всероссийская конференция «Фундаментальная гликобиология» (Казань, 2012). Структура и объем диссертации Диссертационная работа изложена на 137 страницах, содержит 48 рисунков, 7 таблиц, 4 приложения, имеет традиционную структуру и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов, заключения и списка цитируемой литературы, включающего 193 ссылки. 5 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Гликан-связывающую специфичность галектинов исследовали в составе клеток Raji (В-лимфоциты человека). Эта клеточная линия была выбрана, так как она не экспрессирует эндогенные галектины. Галектины нагружали на клетки, факт сорбции доказывали с помощью соответствующих антител. 1. Сравнительный анализ углеводной специфичности галектинов -4, -8 и -9 человека Связывание галектинов, нагруженных на клетки, с флуоресцеин-мечеными гликоконъюгатами Glyc-PAA-fluo (гликопробами) изучали методом проточной цитометриии. Гликопробы – олигосахариды системы крови АВН, а также сульфатированные и сиалилированные гликаны, терминированные LN или LeC (табл. 1). Таблица 1. Олигосахариды в составе Glyc-PAA-fluo, их аббревиатура. № Структура гликана (Glyc) Аббревиатура Дисахариды 1 Gal1-4GlcNAc LN 2 Galβ1-3GalNAc TF 3 Gal1-3GlcNAc LeC 4 Galβ1-3GalNAc Tββ 5 3-O-Su-Galβ1-4(6-O-Su)Glc 3',6OSu2Lac 6 3-O-Su-Gal1-4GlcNAc 3'OSuLN 7 6-O-Su-Gal1-4GlcNAc 6'OSuLN 8 4-O-Su-Gal1-4GlcNAc 4'OSuLN 9 Gal1-4(6-O-Su)GlcNAc 6OSuLN 10 3-O-Su-Gal1-3GalNAc 3'OSuTF 11 3-O-Su-Gal1-3GlcNAc 3'OSuLeC 12 GalNAc1-3GalNAcβ Fs-2 13 GalNAc1-4GlcNAc LacdiNAc 14 GalNAc1-4(6-O-Su)GlcNAc 6OSuLacdiNAc Трисахариды 15 Gal1-3Galβ1-4GlcNAc Galα3'LN 16 Fuc1-2Gal1-3GlcNAc H (тип 1) 17 Fuc1-2Gal1-4GlcNAc H (тип 2) 18 Fuc1-2Gal1-3GalNAc H (тип 3) 19 Fuc1-2Gal1-3GalNAc H (тип 4) 6 № Структура гликана (Glyc) Аббревиатура 20 Gal1-3(Fuc1-2)Gal Btri 21 GalNAc1-3(Fuc1-2)Gal Atri 22 Neu5Ac2-3Galβ1-4GlcNAc 3'SiaLN 23 Neu5Ac2-6Galβ1-4GlcNAc 6'SiaLN 24 Neu5Ac2-3Galβ1-3GalNAcα 3'SiaTF 25 Neu5Ac2-3Gal1-3GlcNAc 3'SiaLeС GlсNAc1-6 26 GalNAc Core 2 Gal1-3 Тетра-, пента- и гексасахириды 27 Gal1-3GlcNAc1-3Gal1-4Glc LNT 28 Gal1-4GlcNAc1-3Gal1-4Glc LNnT 29 Gal1-4GlcNAc1-3Gal1-4GlcNAc LN3'LN 30 Gal1-4GlcNAc1-6Gal1-4GlcNAc LN6'LN 31 Gal1-4GlcNAc1-3Gal1-4GlcNAc1-3Gal1-4GlcNAc (LN)3 GlcNAcβ1-6 32 Galβ1-4GlcNAcβ (GlcNAc)23',6'LN GlcNAcβ1-3 GlcNAcβ1-6 33 Galβ1-4GlcNAcβ LN3'(GlcNAc6')LN Galβ1-4GlcNAcβ1-3 Gal1-4GlcNAc1-6 34 Gal1-4GlcNAc LN6'(GlcNAc3')LN GlcNAc1-3 Gal1-4GlcNAc1-3 35 Gal1-4GlcNAc (LN)23',6'LN Gal1-4GlcNAc1-6 36 Gal1-3GlcNAc1-3Gal1-4GlcNAc LeC3'LN 37 Gal1-3GlcNAc1-3Gal1-3GlcNAc Lec3'LeC 38 Gal1-3GlcNAc1-6Gal1-4GlcNAc Lec6'LN 7 № Структура гликана (Glyc) Аббревиатура GalNAc1-3 39 Gal1-3GlcNAc A (тип 1) Gal1-4GlcNAc A (тип 2) Gal1-3GlcNAc В (тип 1) Gal1-4GlcNAc В (тип 2) Gal1-3GalNAc В (тип 3) Gal1-3GalNAc В (тип 4) Fuc1-2 GalNAc1-3 40 Fuc1-2 Gal1-3 41 Fuc1-2 Gal1-3 42 Fuc1-2 Gal1-3 43 Fuc1-2 Gal1-3 44 Fuc1-2 Fuc1-3 45 GlcNAc Ley Fuc1-2Gal1-4 Galα1-3 46 Galβ1-4 Fucα1-2 GlcNAcβ1-3β BLey Fucα1-3 Cледует отметить, что из-за разной аффинности антител к галектинам не представляется возможным строго количественно оценить их нагрузку, а значит и последующее связывание с гликанами. Однако, можно сравнить профили связывания. Общим для исследованных галектинов человека является следующее: 8 1. Галектины -4, -8, -9 не связывались вовсе, или связывались слабо с LN, но проявили сродство к Tрис. 2, а, б, в). В целом, галектины тандемного типа предпочтительнее связывались с гликанами, в терминальном фрагменте которых имеется заместитель при С-3 (Gal1-3GalNAc, Gal1-3GlcNAc), а не С-4 (Gal1-4GlcNAc) остатка GlcNAc (или GalNAc). 2. Галектины связывались с линейными и разветвленными олиголактозаминами. 3. Все три галектина связывались с отрицательно заряженными гликанами, содержащими заместители при О-3 остатка галактозы и О-6 остатка глюкозы или GlcNAc, а именно c 3'OSuLN, 3'OSuLeC, 3'OSuTF и 6OSuLN. 4. Самыми аффинными лигандами галектинов -4, -8, -9 в клеточной системе оказались АВН-гликаны, то есть группоспецифические антигены крови системы АВН. а б в Рисунок 2. Изучение специфичности галектинов -4 (а), -8 (б) и -9 (в) в составе клеток. Галектины нагружали на клетки Raji и исследовали его связывание с гликопробами. Относительную флуоресценцию подсчитывали по формуле [(Fi/F0) × 100]-100, где Fi – интенсивность флуоресценции клеток, нагруженных галектином, после инкубации с GlycPAA-fluo, F0 – интенсивность флуоресценции клеток после инкубации c Glyc-РАА-fluo в отсутствие галектина. За отсутствие связывания принимали величину флуоресценции < 20. Несмотря на то, что галектины -4, -8 и -9 относятся к группе тандемных галектинов, гомология между ними составляет всего 40 – 60%, поэтому неудивительно, что паттерн их специфичности совпадает лишь частично: 1. Галектины -8 и -9 (рис. 2, б, в), но не галектин-4 (рис. 2, а), связывались с дисахаридом LeC. В тоже время, все галектины связывались с LeC-содержащими 9 дисахаридами. Следует отметить, что за исключением связывания с LNT, в целом, сродство к гликанам, содержащим LeC, было ниже, чем к олиголактозаминам (рис. 2, а, б, в). 2. В отличие от галектинов -4 и -8, галектин-9 связывался не только с 3'-, но и с 6'- замещенными олиголактозаминами (рис. 2, в). 3. Хотя все три галектина связывались с отрицательно заряженными гликанами, драматическое усиление по сравнению с нейтральными дисахаридами LN, LeС и TF наблюдалось только в отношении галектина-4 (рис. 2, а). 4. Из группоспецифических антигенов в клеточной системе галектины -4 и -8 предпочтительнее связывались с А-, (рис. 2, а, б), а галектин-9 – с В-гликанами (рис. 2, в). 2. Галектин-8 курицы Проведенный сравнительный анализ птичьего и человеческого галектинов позволил выявить некоторые особенности в специфичности CG8. Во-первых, углеводсвязывающие профили человеческого и куриного галектинов в составе клеток в целом совпадают (рис. 3), за исключением взаимодействия с дисахаридом LeC; это свидетельствует в пользу того, что птичий галектин-8 является ортологом человеческого. Во-вторых, несмотря на отсутствие экспрессии АВН-гликанов у птиц, CG8 проявлял наибольшее сродство именно к ним, что также характерно и для другого птичьего галектина, CG1A. Самыми аффинными лигандами были тетрасахариды А (тип 2) и В (тип 2), однако, уровень связывания с ними CG8 в составе клеток Raji был ниже, чем человеческого галектина (рис. 3). Рисунок 3. Сравнительная углеводная специфичность CG8 и НG8, определенная цитофлуориметрией. Галектины инкубировали с клетками Raji, далее исследовали связывание модифицированных клеток с гликопробами (см. «Материалы и методы»). Данные нормализованы относительно интенсивности флуоресценции клеток после инкубации с TF-пробой и приведены в относительных единицах. 10 К настоящему времени отсутствуют данные о наличии видовой специфичности у галектинов. Хотя было показано, что связывание галектинов -4 и -9 мыши с гликанами, проявившими сродство к их человеческим гомологам, на порядок ниже, но различие в аффиности объяснялось заменами в активном центре углеводсвязывающего сайта [Nagae et al., 2008]. Гомология между N-УСД галектина-8 и CG8 составляет 74% [Kaltner et al., 2009], поэтому можно предположить, что другие аминокислоты, входящие в УСД, вносят свой вклад в связывание. 3. Роль междоменного линкера во взаимодействии галектинов с гликанами Чтобы выявить влияние линкера (участка белка, соединяющего два УСД) на углеводсвязывающие свойства, было изучено связывание с гликопробами галектина-4wl2 и галектина-8L. Следует отметить, что оба галектина сорбировались на клетки в той же степени, что и нативные галектины. Связывание галектина-4wl с гликопробами было на уровне галектина-4 (рис. 4). В частности, с нейтральными олиголактозаминами и с 3'ОSuTF в одинаковой степени связывались обе формы, в то время как сродство к АВН-гликанам было в полтора-два раза ниже. Рисунок 4. Изучение специфичности галектина-4wl в составе клеток. Галектин-4wl нагружали на клетки Raji и исследовали его связывание с гликопробами. Относительную флуоресценцию подсчитывали по формуле [(Fi/F0)×100]-100, где Fi – интенсивность флуоресценции клеток, нагруженных галектином, после инкубации с Glyc-PAA-fluo, F0 – интенсивность флуоресценции клеток после инкубации c Glyc-РАА-fluo в отсутствие галектина.За отсутствие связывания принимали величину флуоресценции <20. 2 Линкер галектина-4wl состоит из 26, а не 41 а.о; линкер галектина-8L длиннее на 41 а.о, чем у нативного белка 11 Галектин-8L, наоборот, связывалcя слабо, или не связывался вовсе с гликопробами, в том числе, с теми, к которым проявил высокую аффинность галектин-8. Т.к. домены безлинкерного галектина-4wl расположены близко друг к другу, то после заякоривания на гликане первого домена, второму из пространственных соображений сложно вступить в цис-взаимодействие, в то время как его доступность для экзогенных гликанов сохраняется. Напротив, у галектина с длинным линкером возможность второго домена связаться с цис-гликаном сохраняется, что затрудняет взаимодействие с трансгликанами. Принимая во внимание, что галектины являются медиаторами межклеточной адгезии, экспрессия удлиненных форм, неспособных связывать гликаны, может быть необходима для ингибирования («выключения») межклеточной адгезии. Суммируя, следует подчеркнуть, что, данные, полученные с помощью клеточной и бесклеточных (гликочипный анализ, поляризация флуоресценции, фронтальная аффинная хроматография – литературные данные) систем совпадают, однако, выявляется и ряд отличий: 1. Галектины -4, -8 и -9 не связываются с LeC и с гликанами, содержащими этот дисахарид. В клеточной системе, как уже упоминалось выше, галектины -8 и -9 связывались с ними. Более того, связывание с LeC было даже выше, чем с 3'-O-сульфатированным аналогом. 2. Также, как и в искусственных системах минимальным фрагментом для связывания галектинами A- и B-гликанов являются тетрасахариды, трисахарид H также узнается. Галектины преимущественно связываются с АВН гликанами 1 и 2 типов, трисахариды А и В во всех случаях без исключений были неактивны. 3. Сродство к АВН-олигосахаридам галектинов, нагруженных на клетки, значительно выше, чем к другим гликанам. В бесклеточных системах эта разница была не столь драматической. Чтобы объяснить это, необходимо знать специфичность каждого из УСД, и уже основываясь на этом знании, предполагать, какой домен заякоривается на клетке, а какой - участвует во взаимодействии с транс-гликанами. Для ответа на эти вопросы были проведены следующие эксперименты: 1) исследован углеводсвязывающий профиль однодоменных галектинов в твердофазной системе; 2) исследовано связывание галектинов (полноразмерных и однодоменных) с клетками, обработанными гликозидазами; 3) измерено количество высвободившегося белка в супернатанте после инкубации с аффинной для С-УСД гликопробой. 4. Изучение углеводной специфичности N- и С-однодоменных галектинов в твердофазной системе Т.к. однодоменные галектины одновалентны, то исследовать их связывание с гликопробами в составе клеток не представлялось возможным. В твердофазной системе было показано, что N-однодоменные галектины проявили сродство к олиголактозаминам, в то время как с АВН-гликанами связывался С-УСД. Как N-, так и С-УСД проявляли сродство к отрицательно заряженным гликанам, хотя аффинность N-УСД к ним была выше (рис. 5). 12 а б в Рисунок 5. Специфичность однодоменных галектинов -4N и -4C (а), -8N (б) и -9N (в) в твердофазной системе. Значение ингибирования рассчитывали по формуле 1/I100, где I – максимальная (а) концентрация Glyc-PAA (мкM), при которой еще наблюдается ингибирование или концентрация (б-в) гликопробы, при которой наблюдается 40%-ное ингибирование. 5. Выявление гликанов, с которыми предположительно связываются галектины тандемного типа на клетках Для идентификации гликанов, с которыми связываются галектины, исследовали их связывание с клетками после дегликозилирования. Клетки сначала инкубировали с ферментами, а уже затем на них нагружали галектины. Факт сорбции галектинов подтверждали с помощью соответствующих антител. Десиалилирование клеток приводило к уменьшению связывания как полноразмерного галектина-8, так и его однодоменной формы-8N (рис. 6, б). Напротив, связывание с клетками полноразмерных галектинов -4 и -9, а также их однодоменных форм увеличивалось (рис. 6, а, в). После обработки клеток -галактозидазой связывание всех галектинов уменьшалось (рис. 6, б, в), если сравнивать с только десиалилированными. 13 а б в Рисунок 6. Взаимодействие галектинов -4 (а), -8 (б) и -9 (в) с клетками после ферментативной обработки. Клетки Raji, обработанные ферментами, инкубировали с галектинами, как описано в «Материалах и методах». Флуоресценцию рассчитывали по формуле [Fi/F0)×100]-100, где Fi – интенсивность флуоресценции после инкубации клеток, нагруженных галектином, с антителами, F0 – интенсивность флуоресценции клеток после инкубации с ФИТЦ-мечеными анти-кроличьими антителами. С помощью лектинов и анти-углеводных антител было показано, что большая часть гликанов клеток Raji терминирована олиголактозаминами, частично сиалилироваными; в то же время на этих клетках вообще не экспрессируются АВН-гликаны. Как уже было сказано выше, аффинность С-УСД к олиголактозаминам, в том числе к 3'-сиалилированным ниже, чем N-УСД (см. п. 3), поэтому наиболее вероятно, что при заякоривании на клетке ключевая роль принадлежит N-УСД, а не С-УСД. Тогда можно предположить, что в связывание с экзогенными гликанами вовлечен С-УСД. 14 Чтобы проверить это, был проведен модельный эксперимент с однодоменными формами галектина-4, когда заякоренный на клетке белок инкубировали с высокоаффинной для С-домена гликопробой, после чего измеряли количество высвободившегося белка в супернатанте. Рисунок 7. Идентификация галектина-4 в супернатанте клеток, дот-анализ. Такое высвобождение наблюдалось только в случае С-домена, но не в случаях Nдомена и целого двухдоменного галектина-4 (рис. 7), то есть в связывание с экзогенными гликанами вовлечен С-УСД. Его высокой аффинностью к АВН-гликанам обуславливается предпочтительность связывания клеточных галектинов тандемного типа с группоспецифическими антигенами АВН, несмотря на то, что паттерн связывания (как видно из приведенного исследования) значительно шире. Гликокаликс клетки имеет сложную организацию, его состав постоянно обновляется. У животных клеток его толщина варьирует от 30 – 500 нм, а у эндотелиальных клеток может достигать 4,5 мкм [Curry and Adamson, 2011; Martins and Bairos, 2002], что значительно больше размера белка. Это означает, что почти все гликолиганды в той или иной степени скрыты и недоступны для связывания с белками. Чтобы понять механизм межклеточных взаимодействий с участием галектинов была исследована: 1) их локализация; 2) вовлеченность цис-гликанов в маскировку белка. 6. Локализация галектинов -4, -8 и -9 в гликокаликсе клетки Флуоресцентной микроскопией была исследована локализация галектинов в клеточной мембране. Как видно на гистограммах распределения флуоресценции, все три галектина аккумулируются в пэтчах разных размеров (рис. 8). 15 70 60 60 60 50 50 50 40 40 40 30 20 Флуоресценция 70 Флуоресценция Флуоресценция 70 30 20 30 20 10 10 10 0 0 0 0 2 4 6 8 Расстояние (мкм) 10 12 0 2 4 6 8 10 12 Расстояние (мкм) 14 16 0 2 4 6 8 10 Расстояние (мкм) 12 Рисунок 8. Локализация галектинов -4 (а), -8 (б) и -9 (в) в гликокаликсе клеток Raji. Галектины нагружали на клетки, после чего инкубировали с соответствующими антителами, мечеными фикоэритрином (красный цвет). Изображения получали с помощью конфокального микроскопа Nikon Eclipse TE 2000-E (Япония), объектив ×100. Масштаб = 10 мкм. На гистограммах (внизу) приведено распределение флуоресценции областей, выделенных белыми прямоугольниками (вверху), по оси ординат – относительная интенсивность флуоресценции в условных единицах, по оси абсцисс - длина выделенного участка в мкм. Методом конфокальной микроскопии с двойным окрашиванием исследовали расположение галектиновых пэтчей в гликокаликсе. Для этого галектины детектировали соответствующими антителами, а гликокаликс окрашивали растительным лектином DSA (Datura stramonium), узнающим -галактозиды. Толщину гликокаликса и расположение в нем галектинов измеряли с помощью «внутренней линейки», встроенной в программное обеспечение EZC1 к конфокальному микроскопу Nikon (Япония) (рис. 9) и стандартных флуоресцентных частиц диаметром 500 мкм, для каждой клетки проводили более двенадцати измерений; в каждом опыте было проанализировано не менее десяти клеток. Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Exсel 2003. Как видно из рис. 9, в целом, галектины -4, -8 и -9 распределяются по всей толщине гликокаликса, однако, для каждого из них характерен собственный паттерн распределения. Так, галектины -8 и -9 обнаруживается в четко очерченных патчах, в то время как галектин-4 – в диффузных. 16 а б в г д Рисунок 9. Расположение галектинов -4, -8 и -9 в гликокаликсе. Галектины нагружали на клетки Raji, после чего инкубировали с соответствующими антителами (красный цвет, б), для окрашивания гликокаликса клетки инкубировали с биотинилированным лектином DSA и затем с Str-ФИТЦ (зеленый цвет, а); конфокальная микроскопия, увеличение×1000. Типичная локализация галектинов показана стрелками (в). Справа приведены схемы расположения галектинов в гликокаликсе (г). Толщина гликокаликса в соответствующем месте показана белым цветом и цифрой. На гистограммах (д) приведено распределение флуоресценции областей, выделенных прямоугольниками; по оси ординат - относительная интенсивность флуоресценции в условных единицах, по оси абсцисс - длина выделенного участка в мкм. Далее была исследована клеточная локализация однодоменных галектинов. Галектины -4N, -8N и -9N распределялись по всей толщине гликокаликса (рис. 10), в то же время С-однодоменный галектин-4 располагался как в глубине гликокаликса, так и на его переферии (рис. 11). Рисунок 10. Расположение галектинов -4N, -8N и -9N в гликокаликсе. Галектины нагружали на клетки Raji, после чего инкубировали с соответствующими антителами (красный цвет), для окрашивания гликокаликса клетки инкубировали с биотинилированным лектином DSA и затем с Str-ФИТЦ (зеленый цвет); конфокальная микроскопия, увеличение × 1000. Справа приведены схемы расположения N-однодоменных галектинов в гликокаликсе. Локализация галектинов показана стрелками. Толщина гликокаликса, выделенная в соответствующем месте белым цветом, обозначена цифрой. 17 Рисунок 11. Расположение галектина-4С в гликокаликсе. Галектин нагружали на клетки Raji, после чего инкубировали с антителами (красный цвет), его локализация показана стрелкой Для окрашивания гликокаликса клетки инкубировали с биотинилированным лектином DSA и затем с Str-ФИТЦ (зеленый цвет); конфокальная микроскопия, увеличение × 1000. Справа приведена схема расположения галектина-4С в гликокаликсе. Локализация галектинов показана стрелками. Толщина гликокаликса, выделенная в соответствующем месте белым цветом, обозначена цифрой. Из приведенных экспериментов следует, что всегда галектины -4, -8 и -9 не распределены равномерно на поверхности мембраны, а аккумулируются в пэтчах. Пэтчинг не является результатом индукции гликокластеров самих галектинов. В пользу этого свидетельствует тот факт, что однодоменные (и поэтому одновалентные) галектины также аккумулировались в пэтчах. В гликокаликсе галектины, по всей вероятности маскированы гликанами тех же клеток, что может быть одной из причин избирательности галектинов. Чтобы проверить эту гипотезу, клетки, нагруженные галектинами, инкубировали с ферментами, последовательно отщепляющими остатки Neu5Ac и Gal. После чего сравнивали связывание с гликопробами галектинов в составе нативных клеток и обработанных гликозидазами. 7. Гликан-связывающая активность клеток, нагруженных галектинами -4, -8 и 9, после обработки ферментами После дегликозилирования галектины -4, -8 связывались с гликопробой LN, чего не наблюдалось в случае клеток, не обработанных ферментами. Галектин-9 связывался c LN слабо, после ферментативной обработки его связывание с гликопробой также усиливалось. Эти данные указывают на то, что УСД галектинов в составе клеток может быть маскирован цис-гликанами. 18 Рисунок 12. Влияние гликозидаз на гликан-связывающую активность галектинов, нагруженных на клетки Raji. Галектины нагружали на клетки, после чего их обрабатывали последовательно нейраминидазой и -галактозидазой, как указано в «Материалах и методах». Далее исследовали связывание клеток с LN-PAA-fluo, значение флуоресценции расчитывали по формуле [(Fi/F0)×100]-100%, где Fi – интенсивность флуоресценции клеток после инкубации с Glyc-PAA-fluo; F0 – интенсивность флуоресценции клеток после инкубации c Glyc-PAA-fluo без обработки клеток ферментами. Суммируя результаты этих экспериментов (п. 4 – 7), можно предположить, как осуществляется связывание галектинов тандемного типа с экзогенными гликанами: 1) галектины удерживаются на клетке N- и C-УСД, но аффинность последнего к гликанам ниже; 2) если аффинность внешнего гликана выше, чем цис-гликана, то он вытесняет его и происходит связывание С-УСД с транс-гликанами. 19 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Использованная в данной работе клеточная система позволила выявить углеводсвязывающий профиль галектинов -4, -8 и -9. Несмотря на наличие двух углеводсвязывающих доменов, ключевая роль во взаимодействии с экзогенными (транс-гликанами) принадлежит С-УСД. Самыми аффинными лигандами для него являются АВН-гликаны, чем обусловлена предпочтительность связывания клеточных галектинов тандемного типа с группоспецифическим антигенам крови. Естественно возникает вопрос, каков биологический смысл высокого сродства галектинов тандемного типа к ним. В норме АВНгликаны экспрессируются на мембранных гликопротеинах или гликолипидах эритроцитов, эпителиальных и эндотелиальных клеток, а также на секретируемых муцинах. Галектины экспрессируются на поверхности клетки при воспалительных процессах и онкотрансформации, поэтому связываться с АВН-гликанами в организме здоровых индивидуумов не могут. С другой стороны, некоторые патогенные бактерии и вирусы связывают А-и В-гликаны слизистой ротовой полости и желудочно-кишечного тракта человека. Можно предположить, что галектины ингибируют заражение, маскируя собственные А-и В-гликаны, или они узнают эти гликаны, когда они входят в состав клеточной стенки микроорганизмов. Кроме того, связывание галектинов -8 и -9 с АВНгликанами эндотелиальных клеток может способствовать их миграции в прилежащую ткань. Таким образом, при регенерации поврежденных тканей галектины могут быть позитивными регуляторами ангиогенеза. Однако, при онкотрансформации стимуляция галектинами -4, -8 и -9 ангиогенеза способствует метастазированию опухолевых клеток. В этом случае создание синтетических ингибиторов связывания галектинов с АВН-гликанами может быть одним из эффективных средств в противоопухолевой терапии. 20 ВЫВОДЫ 1. Предложен метод исследования углеводсвязывающей специфичности галектинов, который заключается в изучении взаимодействия клеток, нагруженных галектинами, с экзогенными гликоконъюгатами. С помощью этого метода установлено, что галектины -4, 8 и -9 проявляют наибольшее сродство к группоспецифическим антигенам крови системы АВН. 2. Показано сходство куриного и человеческого галектинов-8 по их углеводной специфичности. 3. Установлено, что N-домен тандемных галектинов связывается с олиголактозаминами и отрицательно заряженными гликанами, а С-домен – с АВНгликанами. 4. Показано, что галектины тандемного типа заякориваются на клетке предпочтительно с помощью N-домена, в то время как С-домен отвечает за взаимодействие с внешними лигандами. 5. Найдено, что общим свойством галектинов является неравномерное (в виде кластеров) аккумулирование в гликокаликсе клетки; в то же время характер распределения каждого галектина индивидуален. 6. Показано, что цис-взаимодействие регулирует функциональную активность галектинов: с одной стороны, цис-лиганды маскируют галектины, предотвращая их взаимодействие с лигандами соседних клеток, с другой стороны, они же предотвращают взаимодействие с высокоаффинными. низкоаффинными лигандами, 21 разрешая взаимодействие с СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи 1. Вохмянина О.А., Рапопорт Е.М., Рыжов И.М., Корчагина Е.Ю., Пазынина Г.В., Северов В.В., Кальтнер Г., Андре С., Габиус Г.-И., Бовин Н.В. Углеводная специфичность куриного и человеческого галектинов в составе клеток. Биохимия. 2011, 76 (10), 1185-92. 2. Vokhmyanina O.A., Rapoport E.M., Andre S., Severov V.V., Ryzhov I.M., Pazynina G.V., Korchagina E.Ju., Gabius H.J., Bovin N.V. Comparative study of the glycan specificities of cell-bound human tandem repeat-type galectins -4, -8 and -9. Glycobiology. 2012, 22 (9), 12071217. Тезисы докладов 1. Вохмянина О.А. Специфичность галектина-8 человека. Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009», Москва, 13-18 апреля 2009, стр. 42. 2. Вохмянина О.А., Рапопорт Е.М., Пазынина Г.В., Северов В.В., Бовин Н.В. Специфичность галектина-8 человека. IV Российский симпозиум «Белки и пептиды», Казань, 23-27 июня 2009, стр. 68. 3. Вохмянина О.А., Рапопорт Е.М., Пазынина Г.В., Северов В.В., Бовин Н.В. Углеводсвязывающий паттерн клеточных галектинов человека тандемного типа. Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова, Москва, 28 сентября – 1 октября 2009, Том 2, стр. 41. 4. Вохмянина О.А., Рапопорт Е.М., Пазынина Г.В., Северов В.В., Бовин Н.В. Сравнительный анализ углеводных специфичностей галектина-8 человека и курицы. 13-я международная пущинская школа-конференция молодых ученых, Пущино, 28 сентября – 2 октября 2009, стр. 65. 5. Вохмянина О.А., Рапопорт Е.М., Пазынина Г.В., Северов В.В., Бовин Н.В. Углеводсвязывающий паттерн птичьего галектина-8: сравнительный анализ с галектином-8 человека, XXII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физикохимической биологии и биотехнологии, Москва, 8-11 февраля 2010, стр. 18. 6. Vokhmyanina O.A., Rapoport E.M., Pazynina G.V., Severov V.V., Bovin N.V. Carbohydrate-binding pattern of human tandem-repeat-type cellulat galectins, 11th European Training course on Carbohydrate, Wageningen, The Netherlands, 17-20 May, 2010, p. 96. 7. Vokhmyanina Olga, Rapoport Eugenia, Ryzhov Ivan, Korchagina Elena, Severov Vyacheslav, Pazynina Galina, Gabius Hans-J., Bovin Nikolai. Specificity of cell bound human galectins-4, -8 and -9, Annual Conference of the Society for Glycobiology, St Pete Beach, FL, USA, 17-21 November 2010, p. 1474. 8. Eugenia Rapoport, Olga Vokhmyanina, Ivan Ryzhov, Elena Korchagina, Galina Pazynina, Nicolai Bovin. Galectins: study of their cellular cis- and trans-ligands, Russian-Indian Symposium on Glycosciences, Moscow, 13-16 June, 2011, p. 23. 9. E. Rapoport, O. Vokhmyanina, E. Korchagina, I. Ryzhov, I. Mikhalev, N. Bovin. Neoglycolipids as a tool for study of cellular ligands of galectins, XXI International Symposium on Glycoconjugates, Vienna, Austria, August 21-26, 2011, p. 272. 10. Рапопорт Е.М., Вохмянина О.А., Матвеева В.К., Пазынина Г.В., Корчагина Е.Ю., Рыжов И.М., Бовин Н.В. Галектины: углеводная специфичность и механизм регуляции функциональной активности, Первая Всероссийская конференция «Фундаментальная гликобиология», Казань, 20-24 июня 2012, с. 53. 22
