Ревматоидный фактор в идиотипической регуляции
реклама
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Удмуртский государственный университет» На правах рукописи Столярова Елена Юрьевна РЕВМАТОИДНЫй ФАКТОР В ИДИОТИПИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ АУТОРЕАКТИВНОСТИ 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель – Бедулева Любовь Викторовна доктор биологических наук, доцент Ижевск - 2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ стр. Введение………………………………………………………………………….. 4 Глава 1. Обзор литературы…………………………………………………… 11 1.1. Механизмы регуляции аутореактивности, обеспечивающие естественную толерантность……………………………………………………. 1.1.1. Иммунная сеть как механизм формирования и поддержания естественной толерантности…………………................................................... 1.1.2. Анти-иммунноглобулиновые антитела 11 в 11 регуляции аутореактивности…………………………………………………………........... 17 1.1.3. Молекулярные и клеточные механизмы регуляции аутореактивности, обеспечивающие естественную толерантность……......................................... 1.2. 19 Ревматоидный фактор, специфичность и функции……………………… 23 1.2.1. Роль ревматоидных факторов в регуляции иммунного ответа, естественной толерантности и патогенезе аутоиммунных заболеваний………………………………………………………………………. 23 1.2.2. Структурные особенности ревматоидных факторов и антигенные детерминанты, узнаваемые ревматоидным фактором на Fc области IgG…… 27 1.2.3. Идиотип-антидиотипические взаимодействия между ревматоидными факторами и антителами различной специфичности…………………………. 1.2.4. Методы определения ревматоидных факторов и 33 антигены, распознаваемые ревматоидными факторами……….……………………........ 35 Глава 2. Организация, материалы и методы исследований…………….. 39 2.1. Организация исследований………………………………………………… 39 2.2. Материалы и методы исследований………………………………………. 40 Глава 3. Результаты и их обсуждение………………………………………… 54 3.1. Сравнительный анализ продукции популяций ревматоидного фактора у чувствительных и резистентных к индуцируемым аутоиммунным 3 заболеваниям крыс…..…………………………………………………………… 54 3.2 Специфичность ревматоидного фактора, определяемого методом агглютинации танизированных, нагруженных гомологичным IgG эритроцитов……………………………………………………………………… 67 3.3 Исследование идиотип-антиидиотипических взаимодействий между ревматоидным фактором и антителами к антигенам-индукторам аутоиммунных заболеваний………………....................................................... 78 Заключение……………………………………………………………………… 88 Выводы…………………………………………………………………………… 94 Список сокращений и условных обозначений…………………………….. 95 Список литературы…………………………………………………………….. 97 Приложение 1…………………………………………………………………… 111 4 Введение Актуальность темы исследования и степень ее разработанности В настоящее время одним из ключевых в фундаментальной и клинической иммунологии остается вопрос о механизмах иммунорегуляции, обеспечивающих состояние естественной толерантности, поскольку нарушения в этих механизмах ведут к развитию аутоиммунных заболеваний. Сегодня происходит кардинальная смена представлений о механизмах толерантности к аутоантигенам в направлении признания существования в условиях физиологической нормы непатогенной активности аутореактивных лимфоцитов и продукции аутоантител к внеклеточным, мембранным, внутриклеточным и внутриядерным аутоантигенам [33]. В связи с этим возникает вопрос, как осуществляется регуляции активности аутореактивных лимфоцитов, обеспечивающая не агрессивный характер аутоиммунных реакций. Обсуждается роль Т-регуляторных (CD4+CD25+ FoxP3) [15, 62, 94, 117] и В-регуляторных клеток (CD19+CD25high) [60] в контроле аутореактивности. Однако механизм регуляции аутореактивных клеток до конца не ясен. Об этом свидетельствует не только отсутствие эффективных лекарственных средств для лечения аутоиммунных заболеваний, но и не обозначенность биомишеней, воздействие на которые может подавлять аутоиммунные реакции. Наиболее обоснованное объяснение как формируется и поддерживается состояние естественной толерантности может быть найдено в рамках предложенной Jerne теории иммунной сети. Согласно теории Jerne лимфоциты и антитела специфически взаимодействуют между собой посредством взаимного узнавания идиотипов. Такие взаимодействия назвали идиотип- антиидиотипические (ИАИ). Jerne предполагал, что антиидиотипические антитела – ключевые факторы специфической супрессии иммунного ответа. Позже были получены многочисленные доказательства, что ИАИ взаимодействия являются механизмом саморегуляции в иммунной системе [93]. Показана важная роль ИАИ 5 взаимодействий в ограничении иммунного ответа на чужеродные антигены [127], поддержании иммунной памяти [75], селекции репертуара лимфоцитов, установлении преиммунного разнообразия, естественной иммунной активности, независимой от внешней антигенной нагрузки [34]. Сегодня наблюдается ренессанс в исследованиях ИАИ взаимодействий [13, 99] в частности, в связи с их способностью обеспечить специфичность, клональность регуляции и высоким потенциалом в регуляции естественной толерантности [34, 89]. В ряде работ показано, что аутореактивные лимфоциты являются компонентами иммунной сети и находятся под контролем антиидиотипических лимфоцитов [18, 33, 95]. Однако, как иммунная сеть осуществляет контроль аутореактивных лимфоцитов, до конца не ясно. Важным компонентом иммунной сети является ревматоидный фактор (РФ) и лимфоциты его продуцирующие [22, 43, 80]. Идиотип-антиидиотипические взаимодействия обнаружены между ревматоидным фактором и антителами различной специфичности: аутоантителами к тиреоглобулину [63], аутоантителами к коллагену II типа [82], антителами к антигенам семейства герпес вирусов [46, 74], антителами против пептидогликанов стрептококков и против Fc-связывающих белков групп A, C и G Streptococcus [58, 78]. Поэтому можно предполагать, что лимфоциты, продуцирующие ревматоидный фактор, участвуют в регуляции активности как аутореактивных лимфоцитов, так и лимфоцитов против антигенов-индукторов аутоиммунных заболеваний посредством идиотип-антиидиотипических взаимодействий с ними. Учитывая, что РФ гетерогенная по специфичности и свойствам группа антител [80, 85, 118], для определения РФ были выбраны два метода, один из которых позволяет определять аутореактивный РФ у здоровых людей и животных, другой выявляет РФ, ассоциированный по данным литературы с артритом [48, 122]. Цель исследования: исследовать роль ревматоидного фактора в идиотипической регуляции иммунного ответа против антигенов-индукторов экспериментально вызванных аутоиммунных заболеваний. 6 Задачи исследования: 1. Провести сравнительный анализ продукции популяций ревматоидного фактора у чувствительных и резистентных к индуцируемым аутоиммунным заболеваниям крыс. 2. Выяснить специфичность ревматоидного фактора, определяемого методом агглютинации танизированных, нагруженных гомологичным IgG эритроцитов, и сравнить ее со специфичностью ревматоидного фактора, определяемого методом иммуноферментного анализа с использованием в качестве антигена IgG кролика. 3. Исследовать ревматоидным идиотип-антиидиотипические фактором и антителами взаимодействия к между антигенам-индукторам экспериментально вызванных аутоиммунных заболеваний. Методология и методы исследования Исследование аутоиммунных проводилось заболеваний: на трех экспериментальных экспериментального моделях аутоиммунного энцефаломиелита крыс, вызванного иммунизацией ОБМ морской свинки в ПАФ, коллаген-индуцированного артрита крыс, вызванного иммунизацией БК в НАФ, атеросклероза крыс вызванного иммунизацией ЛПНП человека в НАФ. Для моделирования аутоиммунных заболеваний крыс Wistar иммунизировали однократно внутрикожно. После иммунизации еженедельно, в течение 10 недель в моделях КИА и ЭАЭ и 16 недель в модели атеросклероза, забирали кровь кардиальной пункцией. Плазму крови анализировали. В работе использованы биохимические, иммунохимические, гистологические, статистические методы исследования. Степень достоверности Результаты экспериментальных получены моделях на адекватных аутоиммунных заболеваниям заболеваний, с человека помощью стандартизованных методов, на выборках достаточного объема, воспроизведены в нескольких сериях экспериментов. Для оценки достоверности выявленных различий использованы адекватные статистические критерии. 7 Апробация результатов исследований Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на II Всероссийской научной конференции «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия», (Санкт-Петербург, 2012); 17-ой международной Пущинской школе-конференции «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2013); объединенном иммунологическом форуме (Нижний Новгород, 2013); 15-м международном конгрессе иммунологов (Милан, 2013); ХХII съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград, 2013); научнопрактической конференции посвященной 40-летию ФГУП «Гос. НИИ ОЧБ» ФМБА России (Санкт-Петербург, 2014). Личное участие автора Формулировка основной идеи, планирование научной работы, включая формулировку рабочей гипотезы, определение методологии диссертационного исследования, а также интерпретация и анализ полученных результатов, представление результатов в научных публикациях проводились диссертантом совместно с научным руководителем. Цель, задачи и дизайн исследования сформулированы и разработаны автором самостоятельно. Анализ, систематизация, обобщение литературы по изучаемой проблеме проведены диссертантом самостоятельно. Экспериментальные исследования проводились соискателем самостоятельно. Статистическая обработка данных, оформление рукописи диссертации, представление результатов в виде докладов на конференциях осуществлялись соискателем лично. Положения, выносимые на защиту 1. Ревматоидный фактор осуществляет негативную регуляцию активности лимфоцитов специфичных к антигенам-индукторам аутоиммунных заболеваний. 2. Ревматоидный антигенов-индукторов фактор регулирует аутоиммунных антиидиотипические взаимодействия с ними. активность лимфоцитов заболеваний через против идиотип- 8 Научная новизна исследования В нескольких экспериментальных моделях аутоиммунных заболеваний (коллаген-индуцированного артрита крыс, экспериментального энцефаломиелита крыс и атеросклероза крыс) выявлена связь между продукцией ревматоидного фактора в период инициации иммунного ответа против антигенов-индукторов экспериментально вызываемых аутоиммунных заболеваний и устойчивостью к их развитию. Обнаружена ассоциация высокого уровня РФ с завершением иммунного ответа и ремиссией экспериментально вызываемых аутоиммунных заболеваний. Таким образом, впервые показана физиологическая роль ревматоидного фактора, заключающаяся в негативной регуляции иммунного ответа против антигеновиндукторов экспериментально вызываемых аутоиммунных заболеваний и обеспечении устойчивости к их развитию. Выявлены две, разные по специфичности, популяции РФ, участвующие в регуляции иммунного ответа против антигенов-индукторов экспериментально вызываемых аутоиммунных заболеваний. Одна из них может быть определена методом агглютинации танизированных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов, другая - методом иммуноферментного анализа с использованием в качестве антигена IgG кролика и служит дополнительным фактором регуляции. Впервые выяснена специфичность определяемого методом агглютинации регуляторной популяции танизированных РФ, нагруженных гомологичным IgG эритроцитов. Данная популяция РФ несет 2 вида паратопов – индивидуальный и общий. Индивидуальные паратопы молекул РФ разнообразны по специфичности и служат для узнавания антигенсвязывающих участков иммуноглобулиновых рецепторов и антител, общий паратоп молекул РФ узнает повторяющиеся идиотопы на иммуноглобулиновых рецепторах разной специфичности. Узнаваемые общим паратопом антигенные детерминанты могут быть индуцированы в шарнирной области Fc фрагментов гомологичного IgG папаиновым протеолизом. 9 Теоретическая и практическая значимость исследования Представлена новая гипотеза о механизме негативной регуляции активности лимфоцитов против антигенов-индукторов экспериментально вызываемых аутоиммунных заболеваний с помощью ревматоидного фактора посредством идиотип-антиидиотипических взаимодействий. Полученные знания о роли РФ в регуляции аутореактивности открывают перспективы для разработки новых подходов в лечении аутоиммунных заболеваний, основанных на восстановлении механизмов регуляции аутореактивности. Выявленная ассоциация интенсивной продукции РФ в период инициации иммунного ответа и устойчивостью к развитию аутоиммунного заболевания в нескольких экспериментальных моделях позволяет обозначить лимфоциты, продуцирующие РФ как потенциальную биологическую мишень для разработки лекарственного средства против широкого спектра аутоиммунных заболеваний. Результаты исследования специфичности РФ дают основание для использования папаиновых Fc фрагментов гомологичного IgG, содержащих шарнирную область, в качестве действующего начала лекарственного средства для лечения аутоиммунных заболеваний. Найден новый предиктор (ранний маркер) манифестации экспериментально вызванных аутоиммунных заболеваний, которым является отсутствие продукции ревматоидного фактора в период их индукции. Внедрение результатов исследования в практику Результаты исследования внедрены в учебный процесс, в курсы «Иммунология», «Клиническая иммунология», «Экспериментальные модели иммопатологий», в темы магистерских диссертаций, дипломных, курсовых работ, в тематику НИОКР кафедры иммунологии и клеточной биологии УдГУ по разработке вакцины для лечения аутоиммунных заболеваний. Структура диссертационной работы Работа изложена на 111 страницах, содержит приложение и состоит из введения, обзора литературы, описания организации и методов исследования, 10 результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов. Список литературы включает 128 источников, среди которых 8 отечественных и 120 иностранных. Работа иллюстрирована 19 рисунками, 3 таблицами. 11 Глава 1. Обзор литературы 1.1 Механизмы регуляции аутореактивности, обеспечивающие естественную толерантность Присутствие на периферии аутореактивных лимфоцитов и аутоантител, проявляющих свою непатогенную активность в норме свидетельствует о том, что естественная толерантность обеспечивается не делецией аутореактивных клеток, а регуляторными механизмами, контролирующими их активность. Регуляция иммунного ответа на собственные антигены, многие детерминанты которых можно найти на чужеродных антигенах, представляет собой сложный процесс, так как он должен обеспечивать, во-первых, аутотолерантность, а, во-вторых, надежный иммунный ответ на чужеродные антигены [23]. Исследователи пытаются понять, как формируется и поддерживается естественная толерантность на системном уровне, а также выяснить клеточные и молекулярные механизмы регуляции аутореактивных лимфоцитов. 1.1.1 Иммунная сеть как механизм формирования и поддержания естественной толерантности Теория иммунной сети была предложена N. Jerne в 1974 г. Согласно теории Jerne все лимфоциты и антитела специфически взаимодействуют между собой посредством взаимного узнавания идиотипов, т.е. через идиотип- антиидиотпические (ИАИ) взаимодействия, и формируют тем самым иммунную сеть. N. Jerne рассматривал иммунную сеть как ключевой механизм иммуносупрессии - ограничения активности лимфоцитов [57]. Однако, Jerne при построении теории не поднимал вопрос об особых механизмах регуляции аутореактивных лимфоцитов. N. Jerne считал, что огромное разнообразие идиотипов антигенраспознающих молекул может нести информацию как о многообразии чужеродных антигенов (внутренние образы антигенов), так и аутоантигенов. Антиидиотипические антитела регулируют активность 12 идиотипнесущих лимфоцитов. Достаточно обоснованное предположение о том, как осуществляется регуляция аутореактивных лимфоцитов и формируется естественная толерантность, основанное на представлениях о иммунной сети, было высказано позже Carneiro, Coutinho и Leon [19, 32, 67]. Авторы предполагают, что репертуар иммунной сети формируется в период раннего онтогенеза на основе аутоантигенов, названных антигенамиоснователями сети. Сеть лимфоцитов в присутствии набора аутоантигенов развивается путем самоорганизации. В первую очередь поддерживаются аутореактивные лимфоциты, они становятся точками для дальнейшего роста иммунной сети на основе идиотип-антиидиотипических взаимодействий. Carneiro предполагает, что все В-лимфоциты, которые включаются в центральную иммунную систему, должны пройти стадию активации. Это предположение подтверждают факты, что значительная фракция В-лимфоцитов в иммунной системе новорожденных мышей, а также мышей выращенных в безмикробной Аутореактивные среде находится лимфоциты в активированном поступают под состоянии супрессорный [109]. контроль антиидиотипических лимфоцитов. Таким образом, иммунная система становится толерантна к антигенам, представленным в период формирования сети. B. Sulzer на основе гипотезы Coutinho предложил топологию центральной иммунной системы и ее математическую модель с целью показать то, каким образом ауто В-клетки находятся под идиотипическим контролем в иммунной сети. Модель B. Sulzer можно назвать АВСD-моделью. А, В, С, D клоны - клоны центральной иммунной системы. А - центральный клон. А-клон связан с каждым элементом системы – с А, В, С и D. Каждый В-клон связан с одним С-клоном идиотип-антиидиотипическими взаимодействиями. В-С клоны входят с систему как идиотипически связанная пара. D-клоны связаны только с А-клонами и не имеют связей с другими клонами. 13 Рисунок 1 – Топология центральной части идиотипической сети в АВСDмодели В. Sulzer Клоны В, С и А могут взаимодействовать с аутоантигенами. В идиотипической паре (В-С) аутореактивный лимфоцит находится под негативным контролем антиидиотипического лимфоцита и лимфоцита А-клона. При этом в состоянии толерантности концентрации всех аутореактивных антител низкие, а антиидиотипических антител высокие, что подтверждается экспериментальными данными. При взаимодействии А-клонов с аутоантигеном система не теряет состояния толерантности за счет сильных супрессивных взаимодействии внутри группы А-клонов. Согласно представлениям B. Sulzer состояние толерантности к аутоантигену достигается в процессе раннего онтогенеза в ходе формирования иммунной сети и зависит от времени появления аутореактивного клона, его антиидотипа и их концентраций. Для становления толерантности требуется хорошо упорядоченная последовательность появления клонов - антиидиотипические лимфоциты по отношению к аутореактивным клонам должны появляться раньше. Состояние аутоиммунности возникает в том случае, если этот процесс прошел с нарушениями [109]. Vera Calenbuhr и соавторы с целью понять механизм, который останавливает иммунный ответ в постоянном присутствии аутоантигена, изучали модели идиотипической сети, состоящие из одного, двух и трех клонов, не 14 связанных с аутоантигеном и связанных с аутоантигеном. Было показано, что, по крайней мере, в закрытой цепи из трех клонов система имеет возможность справиться с неограниченным ответом на такой антиген. В данной модели система в отсутствии аутоантигена находится в хаотическом режиме и все три клона динамически эквивалентны. Когда в такую систему вводится аутоантиген, в зависимости от его концентрации, она может находиться в нескольких динамических стабильных состояниях, при этом нет клонов, чья активность неограниченно возрастает и клонов, чья активность полностью супрессирована. Другими словами, чтобы избежать неограниченного иммунного ответа происходит дегенерация хаотического аттрактора в один из нескольких возможных стабильных периодических аттракторов, т.е в состояние толерантности. Таким образом, данное исследование показывает спонтанное происхождение естественной толерантности. Конечно, реальная иммунная система имеет гораздо большее количество клонов, но может оказаться, что случай с замкнутой цепью, состоящей из трех клонов, представляет своего рода строительный блок иммунной сети, изучение которого позволит предсказать поведение всей системы [17]. В рамках теории иммунной сети предполагается, что формирование патологических аутоантител регулируется элементами идиотипической сети. В стационарном состоянии, или состоянии иммунологического гомеостаза, есть равновесие между Ат1 (идиотип) и Ат2 (антиидотип), при котором продукция Ат1 контролируется Ат2-реактивными лимфоцитами. Когда организм сталкивается с чужеродным антигеном или с аутоантигеном, в случае аутоиммунных заболеваний, равновесие смещается в сторону увеличения Ат1, которые реагируют на антиген. Это приводит к увеличению Ат2-продуцирующих клонов и увеличению производства Ат2, которые модулируют количество и функции Ат1-продуцирующих клеток, что приводит к снижению Ат1 [114]. Факт, позволяющий предположить, что идиотип–антиидиотипические взаимодействия в сети могут участвовать в подавлении формирования 15 аутоантител был получен P. I. Cochen и коллегами. Авторы исследовали мышей линии NZB, которые с возрастом спонтанно продуцируют антиэритроцитарные антитела, опосредующие серьезную Кумбс-положительную гемолитическую анемию. F1 гибриды NZB мышей и несколько нормальных линий способны развивать слабую гемолитическую анемию с более низкими уровнями антител по Кумбсу. Было обнаружено, что некоторые из этих гибридов спонтанно производят высокие титры антиидотипических антител по отношению к антиэритроцитарным антителам, которые специфически распознают антиэритроцитарные идиотипы, встречающиеся у NZB-мышей [27]. Авторы прелположили, что антиидиотипические антитела к антиэритроциатрнным антителам могут быть отвествтенны за низкий уровень антиэритроцитарных антител и вызываемую ими гемолитическую анемию. Calkins C.E. с коллегами показали, что продукцию аутоиммунных антител против эритроцитов мыши в популяции клеток селезенки молодых Кумбсотрицательной мышей NZB активно регулируют специфические CD8 +, CD4 – Т супрессорные клетки [18]. В рамках теории иммунной сети предполагается, что поддержание . естественной толерантности в ходе онтогенеза может осуществляться также за счет того, что антиидиотпические антитела (анти-Ид), находящиеся в сыворотке человека препятствуют связыванию аутоантигена со специфическими к нему антителами (Ид), связывая последние. Так, используя эту идею, Nabih I. Abdou и соавторы оценивали способность сывороток, полученных от пациентов с диагнозом системная красная волчанка (СКВ), конкурировать с ДНК за связывание с СКВ-сыворотками с известной ДНК-связывающей способностью. Конкурирующие сыворотки получали от СКВ-пациентов с признаками рецидива и в ремиссии и истощали их от анти-ДНК антител и ДНК аффинной хроматографией. Было обнаружено, что конкурирующие сыворотки от пациентов в ремиссии супрессировали связывание аутологичных анти-ДНК антител с ДНК. Конкурирующие сыворотки от СКВ-пациентов с признаками рецидива, так же как 16 человеческий сывороточный альбумин, не обладали супрессивной активность. Так же было показано, что супрессирующая активность анти-анти-ДНК антител на СКВ-сыворотки пациентов в ремиссии локализована в F(ab’)2 области IgG [9]. Lefvert с коллегами в сыворотке пациентов, больных миастенией, обнаружили антиидиотипические антитела против аутоантител к ацетилхолиновым рецепторам. В раннюю фазу миастении в сыворотке пациентов определялись высокие концентрации антиидиотипических антител, которые были ассоциированы с отсутствием IgG-антител против ацетилхолиновых рецепторов, позднее, в течение болезни, появлялись антирецепторные IgG-антитела, и падал уровень антиидиотипических антител. Доминирование антиидиотипов также было найдено в сыворотке здоровых детей, рожденных женщинами страдающими миастенией и у здоровых родственников пациентов с миастенией [66, 95, 38]. Rossi с коллегами наблюдали пациента с тяжелым кровотечением ассоциированным с наличием циркулирующих аутоантител против фактора свертывания крови VIII. Через нескольких недель неэффективного плазмофереза и вливания больших объемов фактора VIII, уровень фактора VIII в плазме всетаки увеличился до 300 % от нормального в течение нескольких недель, а затем снизился до нормальных значений и остался на таком уровне в течение 7 лет с неопределяемой активностью аутоантител против фактора VIII. У F(аb')2 фрагментов из фракции IgG, произведенной из плазмы, полученной через 6 недель, 6 месяцев и 4 года после восстановления нормального уровня фактора VIII была обнаружена нейтрализующая активность по отношению к F(аb')2 фрагментам, полученным из плазмы до восстановления [95]. Таким образом, в настоящее время иммунной сети отводится функция специфической внутренней регуляции, не только нормального иммунного ответа на чужеродный антиген, но и регуляции аутореактивных лимфоцитов [32]. 17 Антииммуноглобулиновые 1.1.2 антитела в регуляции аутореактивности Антиммунноглобулиновые антитела принадлежат к семейству антител называемых ревматоидным фактором [113]. Наиболее известным представителем этого семейства является IgM-анти-IgG антитела или классический РФ. Подавляющее большинство исследований, касающихся анти-IgG аутоантител сосредоточены на IgM-РФ, поскольку принято считать, что они вовлечены в патогенез ревматических заболеваний. Кроме IgM-РФ есть аутоантитела других изотипов. Гетерогенность антииммуноглобулинов касается не только изотипов, но также эпитопов связывания [113]. Кроме классического РФ к антииммуноглобулиновым антителам относят анти-F(ab’)2 антитела, специфичные к шарнирной области IgG, а также анти-Fab антитела. Информация об анти-F(ab’)2 антителах впервые была опубликована в 1963 году. Анти-F(ab’)2-иммунный ответ не специфичен к конкретному заболеванию и обнаруживается у пациентов с аутоиммунными, инфекционными и миеломными заболеваниями, а также у здоровых людей [80]. В то же время Terness и коллеги показали, что существует обратная корреляция между продукцией IgG-анти-F(аb')2 антител и антиэритроцитарных аутоантител у пациентов с аутоиммунной гемолитической анемией (болезнь холодовых агглютининов) [112]. Также было показано, что анти-F(ab′)2 антитела играют важную роль в реакции отторжении трансплантата почки. Süsal с коллегами обнаружили связь между активностью IgG-анти-F(аb')2 антител в предтрансплантационной сыворотке реципиентов и успехом в трансплантации почки в течение 1 года после операции. Реципиенты с немедленно функционирующим трансплантатом и креатинином <130 mumol/l в течение 1 года имели намного большую предтрансплантационную IgG-анти-F(аb')2 активность, чем пациенты с проблемой отторжения трансплантата [110]. В сыворотке крови 51 пациента с системной красной волчанкой Silvestris с коллегами исследовали анти-ДНК- и анти-F(аb')2 антитела с помощью твердофазного 18 иммуноферментного анализа. У пациентов с тяжелым, неконтролируемым течением болезни обнаруживались высокие уровни анти-ДНК и низкие уровни анти-F(аb')2-антител. У пациентов с вяло текущей системной красной волчанкой обычно обнаруживались высокие уровни анти-F(аb')2- и низкие уровни антиДНК-антител [102]. Клинические исследования наводят на мысль об участии anti-F(ab')2 антител в иммунорегуляции, что также было показано в экспериментах Terness и коллегами. К культуре В-клеток, полученных от животных иммунизированных столбнячным анатоксином, и продуцирующих анти-эритроцитарные антитела, были добавлены IgG anti-F(ab')2 антитела. Была обнаружена дозо-зависимая супрессия продукции антител (максимум при 1-3 нг IgG на 106 клеток). Этот эффект подавлялся F(ab')2γ-фрагментами. Данные исследования показывают, что в ходе иммунного ответа на столбнячный токсин генерируются медиаторы способные антитела, стимулировать следовательно, В-клетки иммунная продуцирующие система должна антиэритроцитарные иметь механизмы, защищающие от аутоагрессии при иммунном ответе на чужеродный антиген. Так как В-клетки несут на своей поверхности иммуноглобулины, то антииммуноглобулины, способные с ними связываться, могут выступать в качестве регуляторов активности В-клеток. Многие исследования показали, что гетерологичные антиммуноглобулиновые антитела подавляют ответ В-клеток. Авторы предполагают, что аутологичные IgG anti-F(ab')2 антитела, образующиеся при противостолбнячном иммунном ответе, а также при ответах на другие антигены препятствуют активации аутореактивных клеток. В частности, эти антитела могут супрессировать В-клетки, продуцирующие антиэритроцитарные антитела [111]. Terness с коллегами определили специфичность, исследуемых ими регуляторных анти-F(аb')2 антител. Они обнаружили, что анти-F(аb')2 антитела не взаимодействуют с Fab-фрагментами, но связываются с F(аb')2-фрагментами IgG. Этот факт указывает на то, что анти-F(аb')2 антитела не являются 19 антиидиотипическими и, что эпитоп связывания для них расположен в шарнирной области IgG. Они показали сайты связывания анти-F(аb')2 антител в шарнирной области IgG. ScFv анти-F(аb')2 антитела (химерный белок, представляющий собой комплекс из вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулинов, связанных коротким линкерным пептидом) связываются с шарнирной областью IgG1 и IgG4 и эпитопы связывания расположены в среднем участке шарнирной области. Взаимодействие с IgG2 или IgG3 обнаружено не было [123]. Таким образом, экспериментальные и клинические данные указывают на то, что IgG анти-F(аb')2 антитела, обнаруживаемые у всех лиц, являются эффективным средством для контроля над аутореактивностью. Увеличение титров анти-F(аb')2 антител предотвращает активацию аутореактивных В-клеток, активированных стимуляторами продуцируемыми в ходе иммунного ответа [111]. Таким образом, показано, что анти-F(аb')2 антитела участвуют в контроле аутореактивности. Молекулярные 1.1.3 и клеточные механизмы регуляции аутореактивности, обеспечивающие естественную толерантность Известно, что для активации как Т- так и В-лимфоцитов требуются костимулирующие сигналы. Т-хелперы с помощью цитокинов и CD40/CD40L взаимодействия обеспечивают В-лимфоцитам необходимый костимулирующий сигнал при активации. Для активации Т-лимфоцита также необходима костимуляция через CD28 на поверхности аутореактивного Т-лимфоцита и В7 на АПК. Отсутствие костимулирующих сигналов при активации антигеном приводит к анергии Т- и В-лимфоцитов. Известно, что анергичные В-лимфоциты достаточно быстро вступают в апоптоз и погибают. Таким образом, предотвращается синтез антител против собственных антигенов. Если в месте локализации распознавшие аутоантигенов антиген нет инфекции Т-лимфоциты или не деструкции получают тканей, то достаточного костимулирующего сигнала, так как контактируют с дендритными клетками, созревшими в отсутствии инфекции или воспаления. Такие дендритные клетки 20 представляют на своей поверхности аутоантиген в комплексе с белками МНС, но с низким уровнем экспрессии В7 и без секреции цитокинов, поддерживающих развитие активированных Т-лимфоцитов. В результате индуцируется абортивная активация аутореактивных Т-лимфоцитов, запускающая апоптоз или переход в состояние анергии. Помимо активирующих рецепторов, клетки экспрессируют на своей поверхности ингибирующие рецепторы. CTLA-4, подобно CD28, связывается с В7, но вместо активационного сигнала передает Т-лимфоциту ингибирующий сигнал, который подавляет его активацию. Экспрессия CTLA-4 индуцируется позже, чем экспрессия CD28. Это обеспечивает торможение и завершение иммунного ответа. Роль молекулы CTLA-4 была выяснена, когда были получены мыши, лишенные гена, кодирующего этот рецептор. У таких мышей развивалась массивная пролиферация Т-лимфоцитов и возникали, аутоиммунные заболевания, что доказывало важную роль этой молекулы в сохранении периферической толерантности. Экспрессия ингибиторного рецептора РD-1 (Programmed death-1 – Рецептор программируемой смерти – 1) индуцируется на поверхности Т-лимфоцитов при их дифференцировке в эффекторные клетки. Один из лигандов этого рецептора (PD-1L) экспрессируется на стромальных клетках во многих тканях. Контакт указанных рецепторов на активированных Т-лимфоцитах с соответствующими лигандами подавляет активацию этих клеток и индуцирует их апоптоз. Точная природа этого механизма пока недостаточно изучена, но в экспериментах с мышами с мутантной формой PD-1 было показано, что у этих животных повышается частота аутоиммунных заболеваний. Важную роль Fas-киллинга в механизмах периферической толерантности доказывает факт развития системных аутоиммунных заболеваний у мышей с природными мутациями в Fas-рецепторе или в Fas-лиганде. Активированные через ТCR аутореактивные Т-лимфоциты экспрессируют повышенные уровни Fas и FasL. И у В-, и у Т-лимфоцитов взаимодействие Fas-FasL индуцирует быстрый 21 апоптоз с последующей гибелью клеток, так как анергичные В- и Т-клетки со слабым сигналом от ВCR/ТCR весьма чувствительны к Fas-киллингу. У мышей, несущих инактивирующие мутации в генах Fas и FasL, не работает механизм Fasкиллинга, и у них в раннем возрасте развиваются аутоиммунные заболевания. Аналогичное заболевание встречается и у людей, это – аутоиммунный лимфопролиферативный синдром. У больных обнаружена мутация гена Fas. Подобно мышам с аналогичным генетическим дефектом, у них тяжелый аутоиммунный процесс поражает многие органы, наблюдается интенсивная пролиферация В-лимфоцитов в периферических лимфоидных органах (лимофаденопатия), идет интенсивный синтез аутоантител, включая антитела к антигенам ядер. Это заболевание получило название «аутоиммунный лимфопролиферативный синдром». Ключевую роль в поддержании периферической толерантности в последнее время отводили регуляторным CD4+Т-лимфоцитами. Предполагается, что клоны Т-лимфоцитов, прошедшие положительную селекцию, но несущие высокоаффинные рецепторы к антигенам собственного организма начинают экспрессировать на своей поверхности белок FoхP3 – регулятор транскрипции и дифференцируются в регуляторные Т-лимфоциты. Эти клетки имеют фенотип CD4+CD25+FoxP3+ и обладают супрессорной активностью по отношению к эффекторным Т-лимфоцитам той же специфичности (Тх1, CD8+ цитотоксическим лимфоцитам), а также по отношению к дендритным клеткам, которые осуществляют представление антигенов и активацию Т-клеток, распознающих этот антиген. Предполагается, что регуляторные Т-лимфоциты вступают в прямые контактные взаимодействия с эффекторными Т-лимфоцитами той же специфичности, выделяют гранзим В и вызывают апоптоз последних, либо выделяют супрессорные цитокины ИЛ-10, TGF-β, ИЛ-35 и др. Установлено, программирование что дефекты функциональных белка свойств FoxP3, контролирующего регуляторных Т-лимфоцитов, приводит к возникновению (как у человека, так и у мышей) тяжелого 22 аутоиммунного заболевания, характеризующегося воспалительным поражением многих органов. У человека FoxP3 кодируется генами, локализованными в Ххромосоме, и генетический дефект этого белка вызывает заболевание, которое называется «иммунодисрегуляция, полиэндокринопатия, энтеропатия, Х- связанный синдром» – IPEX. У мышей дефицит FoxP3 вызывает очень похожее тяжелое аутоиммунное заболевание, которое может быть излечено простым переносом нормального функционального FoxP3 гена в часть CD4 + Т-клеток. Это доказывает, что именно отсутствие регуляторных Т-лимфоцитов является причиной тяжелой потери толерантности [5]. В популяции CD4+CD25+ Т-клеток выделяют субпопуляцию, экспрессирующую CD27+. Было показано, что CD27+ регуляторные Т-клетки супрессируют не только наивные Т-клетки и Т-клетки памяти, но и Т-клетки участвующие в текущем Т-клеточном ответе. CD4+CD25+CD27+ T-клетки обнаруживаются как мощная регулирующая субпопуляция в пуповинной крови и в in vitro системе, описанной в [96]. Кроме того, в синовиальной жидкости пациентов с ювенильным идиопатическим артритом обнаружено, что совместная экспрессия CD25+ и CD27+ допускает дифференциацию активированных эффекторных Т-клеток в высоко супрессивные FoxP3+ регуляторные Т-клетки [26]. Исследования иммунной системы животных и людей показали, что существуют не только Т-регуляторные клетки, множество клеток ведет себя как иммуно-регуляторные клетки. Например, было установлено присутствие Bрегуляторных клеток у человека. Обнаружено, что способность аутологичных стимулированных CD4+ Т-клеток к пролиферации значительно снижалась (в зависимости от дозы) в совместных культурах В-регуляторными клетками, имеющими фенотип CD19+CD25high . В совместных культурах В-регуляторных и Т-регуляторных клеток было обнаружено увеличение экспрессии Foxp3 и CTLA-4 на T-регуляторных клетках. Регулирующая функция В-регуляторных клеток на T- 23 регуляторные клетки, в основном зависит от непосредственного контакта между В-регуляторными и T-регуляторными клетками, а также от TGF-β [60]. Таким образом, сегодня известно несколько клеточных и молекулярных факторов регуляции аутореактивности. Однако целостного представления о механизме регуляции, который мог бы согласовать роль отдельных факторов, и объяснить, как обеспечивается естественная толерантность, не существует. 1.2. Ревматоидный фактор, специфичность и функции 1.2.1. Роль ревматоидных факторов в регуляции иммунного ответа, естественной толерантности и патогенезе аутоиммунных заболеваний Традиционно ревматоидный фактор рассматривается как имеющий отношение к патогенезу ревматоидного артрита [50], но его присутствие обнаруживается при неартритных клинических заболеваниях, в особенности связанных с хроническим воспалением [47] и инфекциями [68], а также у здоровых индивидов [24]. Из исследований РФ при инфекционных заболеваниях может быть сделано некоторое количество важных выводов. В большинстве случаев РФ-ответ является транзиторным. У индивидов, у которых в ответ на инфекцию обнаруживается РФ, редко развиваются острые артриты, хотя это может случаться при таких вирусных инфекциях, как гепатит В, и таких бактериальных, которые вызванны Staphylococcus aureus и ассоциированны с эндокардитами. Однако в дальнейших исследованиях инфекционного эндокардита в группах с ревматическими проявлениями и без них доля РФ была примерно одинаковая (35%), что указывает на то, что РФ не очень хороший маркер артрита в этой группе индивидов. У HLA B27+ индивидов, которые являются РФ-негативными, бактерии индуцируют артрит. Присутствие РФ у индивидов с острой инфекцией может быть ассоциировано с транзиторной артралгией. РФ ответ в этом случае характеризуется как редко наносящий ущерб. Количество РФ позитивных индивидов при различных инфекционных заболеваниях зависит от того первичная или вторичная инфекция, от того, как 24 давно пациент инфицирован (т.е. хроническое или острое состояние). Так, в исследовании пациентов с сифилисом, РФ-позитивными были только 8 % первично инфецированных, 23 % вторично инфицированных и 37 % среди носителей инфекции в скрытом состоянии. 20 % пациентов, бессимптомных носителей гепатита В, были РФ-позитивными, когда в контроле РФ-позитивными были 2,7 % [80]. Наиболее подробно изучена роль РФ в патогенезе ревматоидном артрите (РА). При высоком титре РФ артрит у человека часто протекает тяжелее, быстрее прогрессирует и сопровождается внесуставными проявлениями. Однако предполагают, что РФ сам по себе не является причиной заболевания и его присутствие не обязательно для развития хронического синовита. Было показано, что у здоровых добровольцев после переливания им плазмы, полученной от РФположительных пациентов больных ревматоидным артритом, признаков артрита не обнаруживается в течение двух месяцев после переливания не смотря на сохраняющиеся высокие титры РФ в их крови [119]. Роль РФ, вероятно, заключается в поддержании воспаления в синовиальной ткани больных РА за счет формирования иммунных комплексов с иммуноглобулинами. В пользу этого предположения свидетельствует то, что в синовиальных тканях и суставной жидкости пораженных суставов постоянно обнаруживаются иммунные комплексы, в состав которых входит РФ. Считается, что эти комплексы вызывают острую воспалительную реакцию внутри сустава, которая приводит к разрушению протеогликана поверхностного слоя хряща и тем самым усиливает поражение хрящевой ткани [29, 72, 119]. Иммобилизованные в поверхностных слоях хряща комплексы способны фиксировать белки системы комплемента и активировать их по классическому пути [41]. В свою очередь, повреждение иммунными комплексами тканей сустава ведет к дальнейшему аутоантителообразованию. Доказательства того, что РФ может быть фактором поддержания аутоиммунной реакции к собственному коллагену, представлены в работе Ezaki I. 25 Введение человеческих моноклональных IgG РФ и РФ IgМ мышам, иммунизированным коллагеном II типа, привело к увеличению уровня антиколлагеновых антител и связанному с этим усилению клинических проявлений артрита. Кроме того, после введения РФ у некоторых мышей появились кожные язвы [40]. К образованию иммунных комплексов, обусловливающих эрозию хрящей при РА, может приводить также связывание между собой молекул РФ класса IgG, специфичных к Fсγ фрагментам. Способность молекул РФ образовывать агрегаты зависит от степени их гликозилирования. Процесс связывания облегчается в случае отсутствия в обеих М-связанных олигосахаридных цепях Fc фрагмента концевого остатка галактозы. Наличие агалакто-гликоформы IgG в составе иммунных воспалительных комплексов процессов, т. к. может способствовать развитию дефекты гликозилирования повышают иммуногенность Fc фрагментов антител и уменьшают их естественную элиминацию в организме. Хотя IgG РФ и IgM РФ считаются наиболее распространенными и патогенными иммуноглобулиновыми классами РФ, определяемыми у больных РА, IgE РФ также обнаруживается у некоторых пациентов, особенно у пациентов с внесуставными проявлениями. IgE РФ могут образовывать комплексы с агрегированным IgG синовиальной оболочки, которые способствуют дегрануляции тучных клеток через активацию Fc-рецепторов. IgA РФ также продуцируются у пациентов с диагнозом РА, в том числе у тех, которые серонегативны в стандартных клинических испытаниях, которые в первую очередь обнаруживают IgM РФ [41]. Обнаружение РФ не ограничивается патологическими состояниями, он присутствует и у здоровых индивидов. В-лимфоциты, продуцирующие РФ, присутствуют у здоровых людей, в пуле циркулирующих лимфоцитов 1-2% РФкоммитированных лимфоцитов [82]. Некоторые авторы приписывают ему определенную физиологическую роль [117, 85, 104, 123]. Считается, что РФ 26 участвует в развитии нормального иммунного ответа. Так IgM РФ и IgG РФ могут связываться с Fc фрагментами, входящих в иммунные комплексы иммуноглобулинов и способствовать их элиминации за счет связывания своими Fc фрагментами с Fc рецепторами на фагоците. В частности, это может способствовать очистке от комплексов, содержащих IgG2 и IgG4 подклассы, поскольку они не способны активировать комплемент [80, 105]. В-клетки, продуцирующие РФ, могут играть роль антигенперезентирующих клеток. Используя мембраносвязанный РФ, они могут захватывать иммунные комплексы, содержащие IgG, и затем презентировать важные антигенные эпитопы Т-клеткам как части иммунного ответа [105]. Хотя олигомерные IgM РФ слабо реагирует с мономерным IgG, молекулы РФ могут прочно связываться с IgG, опсонизировавшим клеточные стенки бактерий и другие антигены. По этой причине, IgM РФ может стабилизировать связывание низкоаффинных IgG антител, которые производятся во время раннего поликлонального иммунного ответа на инфекционные агенты. Это характерно как при связывании обычных инфекционных антигенов, так и при связывании идиотип-антиидиотипических комплексов [52, 64]. Антитела, которые ведут себя как РФ, найдены в печени и селезенке плода, что наводят на мысль о том, что аутореактивные (РФ+)-В-клетки играют роль в развитии предиммунного репертуара антител [105]. Существуют данные о том, что РФ может быть участником в идиотипической регуляции аутоиммунных реакций. Nordling с коллегами описывают антиидиотипические антитела у мышей к моноклональным аутоантителам к коллагену II типа с активностью ревматоидного фактора, то есть антитела, которые связываются как с Fab фрагментами антиколлагеновых антител, так и с Fc фрагментами молекулы IgG интактных мышей. Они указывают на сходство этих аниидиотипических антител с РФ, полученными от пациентов с РА и предполагают, что они участвуют в идиотипической регуляции аутоиммунных реакции на коллаген II типа [82]. 27 Таким образом, среди ревматоидных факторов есть популяции, ассоциированные с аутоиммунными заболеваниями, и популяции, обладающие модулирующим действием на развитие иммунного ответа. Первые называют патологическим РФ, а вторые физиологическим РФ, обладающим регуляторными свойствами [20, 105, 118]. 1.2.2. Структурные особенности ревматоидного фактора и антигенные детерминанты, узнаваемые ревматоидным фактором на Fc области IgG В настоящее время показано, что ревматоидный фактор, определенный изначально как аутоантитела против IgG, является гетерогенной группой антител, включающей в себя антитела различной специфичности. Разнообразие РФ связано с неоднородностью его антиген-связывающих структур. Так, Youngblood с коллегами исследовали последовательности ДНК, кодирующие тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов из 11 клеточных линий, секретирующие моноклональные ревматоидные факторы и полученные из периферической крови иммуногенетического двух пациентов анализа этих с ревматоидным последовательностей артритом. Из видно, что неоднородность Fc связывающих структур РФ, ассоциированная с ревматоидным артритом, может возникнуть в результате большого разнообразия генов тяжелых и легких цепей, генных комбинаций и по крайней мере частично из-за соматических мутаций. Исследование изучаемых последовательностей генов легких цепей иммуноглобулинов из В-клеточных линий, продуцирующих РФ, продемонстрировало доминирование легких цепей, кодируемых семейством Vκ3 генов (~67% исследованных образцов). В состав РФ пациентов с РА входит большое разнообразие тяжелых цепей. В панели из 9 клеточных линий пациента R четыре используют VH1 генное семейство, три используют VH4 и два используют VH3. Соматические мутации, а также различные VH/VL комбинации способствуют гетерогенности РФ у пациентов с РА [126]. Fong подразделяет идиотипические маркеры РФ на «частные» и «общие». Частные идиотипы представляют собой маркеры для структурно уникальных 28 вариабельных регионов, в то время как перекрестно-реагирующие идиотипы (CRI) отражают общие структурные черты между антителами [43]. CRI обнаруживаются на антителах одинаковой специфичности, полученных от неродственных лиц. Присутствие CRI обозначает общие структуры вариабельных регионов на различных молекулах антител. Ревматоидный фактор несет несколько перекрестно-реагирующих идиотипов: CRI называемый Wa, CRI называемый Po и CRI называемый Bla. Было показано, что в формировании CRI участвует как легкая, так и тяжелая цепь. [69]. Первоначально перекрестно реагирующие идиотипы на РФ были определены серологически с использованием поликлональной антисыворотки к нативным IgM ревматоидным факторам. Было обнаружено, что РФ, несущие CRI, имеют структурно подобные легкие цепи, принадлежащие к Vκ3 субгруппе [43]. В поликлональной сыворотке Wa-позитивные молекулы обычно несут Vκ3b легкую цепь [21, 22] и VH1 тяжелую цепь. Однако показано, что из четырнадцати РФ, несущих Vκ3b легкую цепь два содержат тяжелые цепи VH2 субгруппы и два содержат тяжелые цепи VH3 субгруппы. Эти результаты демонстрируют, что Vκ ген может комбинироваться с несколькими VH генами из различных VH генных субгрупп, в результате формируя антитела с РФ активностью [100]. К Wa-группе относится большинство РФ у пациентов со смешанной криоглобулинэмией (~65 %). Po CRI представлены на 15% ревматоидных факторов, встречающихся у пациентов со смешанной криоглобулинэмией. Этот идиотипический маркер в основном находится на Vκ3a легких цепях [97] обычно ассоциированых с VH3 тяжелыми цепями. Bla CRI экспресируется на 15% процентах ревматоидных факторов, встречающихся у пациентов со смешанной криоглобулинэмией и детектируются на Vκ3a легких цепях, как и Po CRI, но Bla позитивные молекулы в основном ассоциированы с VH4 тяжелыми цепями. Так ревматоидные факторы, полученные от пациентов со смешанной криоглобулинэмией, как правило, несут 29 один из этих трех мажорных идиотипов [35, 101]. В отличие от пациентов со смешанной криоглобулинэмией, Wa и Po CRI являются только минорными популяциями ревматоидных факторов у пациентов с РА [121]. CRI, формируемые Vκ3a и Vκ3b легкими цепями, встречаются также на IgM РФ у здоровых индивидов. Так при исследовании РФ-положительных сывороток пациентов с РА и людей, не страдающих РА, было показано, что Vκ3b определяется в сыворотке 13% пациентов с РА и в сыворотке 19% людей не страдающих РА, Vκ3a определяется в сыворотке 26% пациентов, страдающих РА и в сыворотке 28% здоровых людей [65]. У здоровых лиц с относительно повышенными уровнями IgM РФ, ~30% экспрессируют VH1 генный сегмент в большинстве случаев ассоциированный с продуктами Vκ3 генов [69], а именно Vκ3а [91]. Причем VH1 у здоровых людей определяется гораздо чаще, чем у больных РА [98]. Таким образом, очевидно, что существует ограниченное структурное разнообразие вариабельных доменов (идиотипов) ревматоидных факторов. Структурное разнообразие вариабельных доменов ревматоидного фактора объясняет способность ревматоидного фактора взаимодействовать с разными антигенными детерминантами на молекуле IgG, расположенными в ее Fc области. В основном детерминанты для РФ, расположенные на Fc области IgG, подразделяют на изотипические, аллотипические, неоантигенные и видоспецифические антигенные детерминанты. Подкласс-специфические или изотипические детерминанты для РФ найдены на всех или некоторых из четырех подклассов IgG человека: эпитопы, экспрессируемые на всех IgG (или пан-IgG детерминанты); эпитопы, экспрессируемые на IgGl, IgG2 и IgG4 (или детерминанта Ga); эпитопы, экспрессируемые на некоторых, но не всех IgG в пределах каждого подкласса (но не аллотипические). Многочисленные исследования показали, что детерминанта Ga является основной специфичностью РФ. 30 Показано, что большинство РФ, в том числе РФ полученные от здоровых людей, всегда связываются с сайтом или сайтами Fc области интактного IgG, которые идентичны сайту связывания SPA (staphylococcal protein A) или достаточно близки к нему, чтобы быть ингибированными небольшим фрагментом SPA – фрагментом D. Исследования с помощью рН-титрования и химических модификаций установили вовлеченность остатков гистидина и тирозина на Fc области IgG в связывании РФ с детерминантой Ga. Эпитоп расположен между Cγ2-Cγ3 доменами IgG и состоит из трех полипептидных петель, две из них расположены в Cγ2 домене и одна в Cγ3 домене, которые находятся в непосредственной близости друг от друга в области между Cγ2 и Cγ3 доменами. Аминокислоты, участвующие в связывании вероятно, будут включать гистидин в положении 310, 433, 435 и тирозин в положении 436 [69, 77]. Corper c коллегами получили кристаллическую структуру Fab фрагментов IgM ревматоидного фактора в комплексе с Fc областью IgG4 человека. Подтвердили, что эпитоп Fc области IgG включает в себя регион между Cγ2 и Cγ3 доменами, и накладывается на сайты связывания бактериальных Fc-связывающих белков [28]. Кроме того, показано, что РФ, обнаруженный у взрослых пациентов с РА, обладает наибольшим сродством к СН3 области IgG3, а скрытый РФ при ювенильном ревматоидном артрите специфичен к IgG1 и IgG3 молекулам и также связывается с их CH3 доменами [76]. Natvig обнаружены антигенные детерминанты для ревматоидных факторов в CH2 домене Fc фрагмента - 3 антигенные детерминанты, и в CH3 – 1 детерминанта, с которыми могут взаимодействовать популяции РФ [79]. Таким образом, многочисленные данные о специфичности ревматоидного фактора указывают на то, что изотипические антигенные детерминанты для него расположены на СН2 домене, на СН3 домене и между CH2 и CH3 доменами. Основной изотипической детерминантой для РФ является Ga детерминанта. 31 Для РФ найдены аллотипические детерминанты типа Gm. Наиболее частые аллотипические детерминанты для РФ, полученного от РА-пациентов – G1m(а) и G3m(g). Интересной особенностью РФ с анти-Gm специфичностью является то, что они не присутствуют в сыворотке совместно с соответствующими им детерминантами (гетероклитическая специфичность). Исследование природы детерминант гетероклитичного ревматоидного фактора специфичного к Gm(а) и Gm(g) на аллогенных, но не аутологичных IgG показало, что тепловая агрегация (при 63 С° в течение 20 мин) или связывание антигена (например, комплексы столбнячный анатоксин-антитело к столбнячному анатоксину) индуцируют «функциональные» Gm(а+) и/или (g+) фенотипы в Gm(а-), (g-). Детерминанты Gm(а) могут возникнуть в результате тонких изменений в CH2-CH3 РФсвязывающей области [125]. В целом не ясно актуальны ли аллотипические детерминаты для IgG в сыворотке больных людей, но они обнаружены в норме у здоровых людей [69]. Большинство антигенных детерминант, узнаваемых ревматоидным фактором, скрыты и не представлены на мономерной нативной молекуле гомологичного IgG, но экспонируются при агрегации гомологичного IgG, образовании иммунных комплексов или на Fc фрагментах гомологичного IgG в ходе папаинового протеолиза [37, 80, 85] – неоантигенные детерминанты. Анализ работ, посвященных изучению специфичности популяции РФ, которую определяют методом агглютинации танизированных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов, показал, что данная популяция РФ, специфична к тепловым аггрегатам гомологичного IgG с Mr около 106 кДа. Аггрегаты с меньшей или большей молекулярной массой не несут детерминанты для антител, определяемых методом агглютинации танизированных нагруженных IgG эритроцитов [84]. Henney С.S. показано, что агрегаты, полученные прогреванием при 63 0С, преципитирующие РФ, несут свободные SH группы (0,5 групп/мол IgG Mr=160). Количество этих групп возрастает при прогревании IgG в интервале температур 32 45-63 0С. Сами по себе свободные SH группы не необходимы для взаимодействия с РФ, так как их алкилирование не препятствует взаимодействию агрегатов с РФ. Однако наличие свободных SH групп на агрегатах служит маркером наличия детерминант для РФ на тепловых агрегатах IgG. Henney С.S. предположил, что межцепочечные S-S связи в Fc области IgG разрываются при 63 0C и участвуют в формировании межмолекулярных мостиков, что ведет к агрегации молекул IgG. Важным условием появления детерминант является агрегация не менее 6 молекул IgG. Тепловые агрегаты IgG человека, несущие детерминанты для РФ, могут быть получены прогреванием раствора IgG при 63 0С в течение 20 минут и имеют выход 15 % [51]. Иммунные комплексы также могут нести детерминанты для РФ. Эти детерминанты появляются на Fc области IgG после связывания антитела с антигеном. Данные о том, являются ли детерминанты на агрегированном IgG и на IgG, связанном с антигеном, одними и теми же детерминантами или разными, противоречивы [85]. Так Ota и Brown показали, что на человеческом IgG, связанном с антигеном, присутствуют новые антигенные детерминанты, которые узнают антиглобулиновые антитела IgM-класса, тогда как на тепловых агрегатах таких детерминант не обнаружено [16, 85]. Некоторые гетерологичных антигенные детерминанты иммуноглобулинах – для РФ присутствуют видоспецифические на детерминанты, например, на мономерной нативной молекуле IgG кролика. Так Dissanayake показал, что популяция РФ человека, выделенная при нейтральном pH, связывающаяся с агрегированным IgG человека, также с высокой константной связывается с мономерным иммуноглобулином кролика. Предполагается, что на мономерной молекуле IgG кролика в готовом виде присутствуют детерминанты, которые на гомологичном IgG появляются только при агрегации. Такие детерминанты назвали 'rabbit-like' [37]. Эпитопы, распознаваемые на IgG кролика имеют наибольшее сходство с основной детерминантой для РФ на IgG человека – Ga. Однако, эти детерминанты не идентичны. Селективная химическая 33 модификация боковых цепей аминокислот продемонстрировала, что тирозиновые остатки присутствуют в сайте связывания для РФ-IgM специфичного к Gaдетерминанте на IgG человека, но не на IgG кролика [55]. Позднее было показано, что в сыворотках некоторых больных РА могут быть обнаружены РФ, реагирующие исключительно с IgG кролика, но не реагирующие с IgG человека, а также, что некоторые моноклональные РФ, полученные с помощью гибридомных технологий из синовиальной мембраны пациентов с РА, со специфичностью к Ga детерминанте, могут вступать в реакцию с IgG человека, но не реагируют с IgG кролика [69]. Таким образом, в многочисленных исследованиях, нацеленных на выяснение специфичности РФ, относительно Fc области IgG показано, что РФ разнообразен по специфичности. Детерминанты, узнаваемые ревматоидными факторами на Fc области IgG можно разделить на конститутивные детерминанты (изотипические, аллотипические, видоспецифические) и индуцируемые (неоантигенные). Антигенные детерминанты для РФ локализуются в CH2, в CH3 доменах тяжелой цепи IgG, а также между доменами. 1.2.3. Идиотип-антидиотипические взаимодействия между ревматоидными факторами и антителами различной специфичности Существуют данные о том, что РФ может участвовать в ИАИ взаимодействиях с антителами различной специфичности. Так ИАИ взаимодействия были обнаружены между антителами против тиреоглобулина и РФ. Kojima K. и его коллегами были сконструированы два моноклональных антиидиотипических антитела, которые связывались с F(аb')2 фрагментами IgG специфичного к тиреоглобулину, полученными от пациента с хроническим тиреоидитом и с нормальным человеческим IgG, но не связывались с F(аb')2 фрагментами IgG не специфичного к тиреоглобулину, полученными от пациента с хроническим тиреоидитом и с F(аb')2 фрагментами нормального человеческого IgG. Антиидиотипические свойства и способность связываться с Fc областью IgG 34 (подобно ревматоидному фактору) этих моноклональных антител были подтверждены с помощью конкурентного ингибирования [63]. Nordling с коллегами описывают антиидиотипические антитела у мышей к моноклональным аутоантителам к коллагену II типа с активностью ревматоидного фактора, то есть антитела, которые связываются как с Fab фрагментами антиколлагеновых антител, так и с Fc фрагментами молекулы IgG интактных мышей. Они указывают на сходство этих аниидиотипических антител с РФ, полученными от пациентов с РА и предполагают, что они участвуют в идиотипической регуляции аутоиммунных реакций на коллаген II типа [82]. Sindic C.J. и соавторы показали, что бычий ОБМ агглютинирует частицы латекса, нагруженные IgG и Fc фрагментами [101]. Следовательно, РФ, который также взаимодействует с Fc фрагментами IgG, может нести «внутренний образ» бычьего ОБМ. Тогда антитела к ОБМ будут являться антиидиотипическими по отношению к РФ. Кроме того, что РФ ассоциирован с различными аутоиммунными заболеваниями, он обнаруживается при вирусных, бактериальных и паразитических инфекциях [88] и может образовываться как антиидиотипические антитела к детерминантам на антителах к антигенам некоторых микроорганизмов – ВЭБ [74], gE гликопротеина ВПГ-1 [45], пептидогликанов-полисахаридов из клеточной стенки Streptococcus [58]. Также показано, что РФ несут внутренний образ ранних и поздних антигенов ЦМВ [74], Staphylococcal protein A [83], Fcсвязывающих белков групп A, C и G streptococci [78, 81] и являются антиидитипическими антителами к антителами против данных антигенов. Также обнаружены факты, указывающие на то, что развитие рассеянного склероза, ассоциируется с определенными инфекциями (инфекциями, вызванными герпесвирусами – ВПГ-1, ВГЧ-6, ВЭБ, вирусом ветряной оспы; ретровирусами; Chlamydia pneumoniae) [25, 87, 92, 104, 106]. Возможно РФ, обнаруживаемый при рассеянном склерозе, образуется как антиидиотипические антитела против антител к микроорганизмам, вызывающим данные инфекции. 35 Способность РФ взаимодействовать с различными F(ab’)2 фрагментами антител указывает на то, что РФ может вступать в ИАИ взаимодействия с антителами различной специфичности [80]. Таким образом, многие факты указывают на участие ревматоидного фактора в идиотип-антиидиотипических взаимодействиях с антителами различной специфичности. Через идиотип-антиидиотпические взаимодействия может быть продуцируют опосредована как ревматоидный индукция фактор, клонов так и лимфоцитов, регуляция которые активности антигенспецифических лимфоцитов ревматоидным фактором. 1.2.4. Методы определения ревматоидных факторов и антигены, распознаваемые ревматоидным фактором В настоящее время известно несколько тест-систем для определения РФ в сыворотке человека: агглютинационные тест-системы с использованием в качестве антигена эритроцитов барана в комплексе с кроличьими антиэритроцитарными иммуноглобулинами [90, 107], эритроцитов человека нагруженных с помощью танина иммуноглобулином человека [84], латексных частиц нагруженных иммуноглобулином человека [107]; иммуноферментные тест-системы, где в качестве антигена используют человеческий, кроличий иммуноглобулины и их Fc фрагменты [48, 124]. Первым тестом для обнаружения РФ в сыворотке больных РА людей был тест с использованием бараньих эритроцитов в комплексе с кроличьими антиэритроцитарными иммуноглобулинами, предложенный Waaler в 1940 году. Он обнаружил, что сыворотка от больных РА пациентов агглютинирует эритроциты барана антиэритроцитарными использовал сенсибилизированные иммуноглобулинами. сыворотку от кролика, специфическими Для кроличьим сенсибилизации иммунизированного Waaler бараньими эритроцитами. Rose дополнил этот тест. Он заметил, что в некоторых случаях анализируемая сыворотка лизирует эритроциты, используемые в тесте, и предложил прогревать сыворотку перед анализом, чтобы инактивировать 36 комплемент, лизирующий клетки. Также он стандартизовал количество антиэритроцитарных иммуноглобулинов, предложив использовать кроличью антиэритроцитарную сыворотку для сенсибилизации в субагглютинирующем титре. Такой тест, основанный на реакции пассивной гемагглютинации, для определения РФ, был назван тест Waaler-Rose. В дальнейшем данная тест-система развивалась в направлении использования вместо антиэритроцитарной кроличьей сыворотки для сенсибилизации эритроцитов фракции эуглобулинов (сывороточные глобулины, в основном γ глобулины, образующиеся при высаливании нейтральными солями), фракции Кона II [107]. РФ определяется в тестах не только с использованием эритроцитов в комплексе с антиэритроцитарными иммуноглобулинами, но и нагруженных IgG с помощью танина [124]. Причем, известен феномен агглютинации ненагруженных танизированных эритроцитов сывороткой здоровых животных и людей, а также сывороткой больных с заболеваниями различной этиологии [4]. Антитела, агглютинирующие танизированные эритроциты были названы панагглютининами. Природа и роль панагглютининов остается не известна. Singer и Plotz упростили данную агглютинационную систему, предложив использовать вместо суспензии эритроцитов полистироловые латексные частицы [14]. Латексные частицы стандартного размера смешивали с раствором лиофилизированного человеческого γ глобулина и затем нагруженные частицы латекса использовали для тестирования сывороток. Использование латексных частиц позволило избежать необходимости прогревания анализируемой сыворотки, что возможно оказывало влияние на результат теста. Вместо полистироловых латексных частиц могут быть использованы частицы бентонита [107]. Латексный тест и тест Waaler-Rose выявляют в основном IgM РФ, который более эффективен в реакции агглютинации, благодаря своей поливалентности. Кроме того, результат реакции агглютинации является достаточно субъективным, поскольку исследователь решает при каком именно разведении сыворотки 37 агглютинация еще присутствует, а при каком ее уже нет и это решение будет меняться от наблюдателя к наблюдателю. В этом отношении наиболее объективным методом для определения РФ является ИФА, причем ИФА позволяет определять РФ различных классов. В 1970-1980 гг. была доказана адекватность применения ИФА в определении IgM РФ. При использовании в качестве антигена фракции Кона II, результаты ИФА по определению IgM РФ в сыворотке крови больных РА пациентов хорошо коррелировали с результатами агглютинационного теста с использованием эритроцитов барана [59, 120]. Агглютинационные тесты обнаруживают РФ у 60 – 70 % пациентов с РА. С использованием ИФА для определения РФ в сыворотке больных РА пациентов процент сероположительных случаев значительно увеличивается. РФ с помощью ИФА обнаруживается в РФ-отрицательных по латексному тесту образцах [11]. Авторы, работающие над развитием иммуноферментных тест-систем для определения РФ, в частности при диагностике ревматоидного артрита, отмечают, что в настоящее время не существует надежных лабораторных тестов, позволяющих с достаточной уверенностью ставить диагноз. В первую очередь, это связано с тем, что в различных ИФА-диагностикумах используются различные антигены. Какие же антигены использовать в детекции РФ является до сих пор не решенной проблемой. Предполагается, что для диагностики РА более корректно в качестве антигена использовать кроличий IgG, нежели человеческий IgG [37, 61, 73, 108, 114]. Это предположение возникло в связи с тем, что тест Waaler-Rose, с использованием в качестве антигена кроличьего IgG, считается более специфичным к РА, чем латексный агглютинационный тест с человеческим IgG в качестве антигена [114]. Некоторые авторы предпочитают IgG кролика потому, что РФ IgM имеет высокое сродство к Ga подобным детерминантам, находящимся на Fc фрагменте IgG кролика. Сообщается, что специфичность анализа увеличивается при использовании в качестве антигена Fc фрагментов IgG [12]. Но чувствительность измерения IgA-РФ при использовании в качестве 38 антигена Fc фрагментов IgG кролика вместо IgG человека была значительно снижена. Tuomi исследовал методом иммуноферментного анализа взаимодействие РФ IgM и IgA классов в сыворотке пациентов больных РА и пациентов без клинических проявлений артрита, но имеющих положительный результат в тесте Waaler-Rose, с кроличьим IgG (rIgG) и Fc фрагментами IgG кролика и человека (rFc, hFc). Он обнаружил, что при использовании в качестве антигена rIgG, rFc, hFc для определения РФ IgM в сыворотке больных РА результаты ИФА хорошо коррелируют с Waaler-Rose тестом. Значительное количество не ревматоидной сыворотки, но дающей положительный результат в Waaler-Rose тесте и в ИФА с использованием в качестве антигена rIgG, не реагировала с rFc в ИФА. Но 22 % процента такой сыворотки реагировала в равной степени и с rFc, и с hFc. В некоторых сыворотках IgM РФ и IgA РФ по-разному реагировали с rFc и hFc: IgM реагировали только с человеческими, а IgA и с человеческими и с кроличьими Fcфрагментами [114]. Bas с коллегами в своем сравнительном анализе различных ИФА-тестов для определения IgM РФ и IgA РФ выявили значительные расхождения в результатах анализа коммерческими ИФА тест-системами различных производителей. Одной из главных причин такого различия результатов по мнению авторов является использование различных антигенов в этих тестах. В одних тестах используется hIgG, в других rIgG, а в третьих Fc-фрагменты hIgG и rIgG [12]. Подобное разнообразие методов, используемых для определения ревматоидного фактора в ревматоидных сыворотках и сыворотках здоровых людей, подтверждает то, что ревматоидный фактор – это гетерогенная группа антител, включающая в себя антитела различной специфичности. 39 Глава 2. Организация, материалы и методы исследований 2.1. Организация исследований Исследование аутоиммунных проводилось заболеваний: на трех экспериментальных экспериментального моделях аутоиммунного энцефаломиелита крыс (ЭАЭ), вызванного иммунизацией ОБМ морской свинки с ПАФ, коллаген-индуцированного артрита крыс (КИА), вызванного иммунизацией БК с НАФ, атеросклероза крыс, вызванного иммунизацией ЛПНП в составе НАФ. Разные модели аутоиммунных заболеваний в том числе не ревматоидных были использованы для проверки гипотезы, что ревматоидный фактор участвует в регуляции иммунного ответа независимо от специфичности последнего. В ответ на иммунизацию аутоиммунные заболевания возникали не у всех иммунизированных животных, некоторые крысы оказались устойчивыми к их развитию. У крыс в моделях ЭАЭ и КИА кинетику образования антител к иммуногену и популяций ревматоидного фактора исследовали в течение 10 недель, в модели атеросклероза – в течение 16 недель. Проводили сравнительный анализ уровня исследуемых антител у устойчивых к аутоиммунным заболеваниям крыс и больных крыс. Популяции РФ определяли двумя методами, традиционно используемыми для определения РФ в научных исследованиях: методом агглютинации танизированных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов [84] и методом ИФА, где в качестве антигена использовали IgG кролика [48, 124]. РФ, определяемый методом агглютинации называли РФтнIgGэ, методом ИФА – РФкрIgG. Идиотип-антиидиотипические взаимодействия между РФтнIgGэ и антителами к иммуногенам исследовали методом конкурентого ИФА. Для выяснения специфичности РФтнIgGэ мы использовали несколько методических подходов. Во-первых, сравнили специфичность РФтнIgGэ со специфичностью панагглютининов. Во-вторых, исследовали способность IgG и 40 его фрагментов ингибировать агглютинацию танизированных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов, вызванную РФтнIgGэ-содержащей сывороткой и вызывать продукцию РФтнIgGэ у интактных крыс. В-третьих, сравнили специфичности РФтнIgGэ и РФкрIgG. 2.2. Материалы и методы исследований Крысы ЭАЭ, КИА и атеросклероз моделировали на белых нелинейных крысах Wistar (самцы, самки в возрасте 8-10 недель). Крысы были получены из питомника лабораторных животных «Столбовая» (Россия) и содержались в стандартных лабораторных условиях на стандартном рационе. Эксперименты на животных были проведены в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях. Коллаген-индуцированный артрит у крыс, индукция, клинические проявления Коллаген-индуцированный артрит у крыс является адекватной экспериментальной моделью ревматоидного артрита человека [53]. КИА вызывают иммунизацией бычьим коллагеном II типа в неполном адъюванте Фрейнда. Клинические признаки артрита - увеличение объема, отек, покраснение одной или нескольких лап, ограничение подвижности животных - возникают через 14-28 день после иммунизации. Силу поражений лап оценивали по объему вытесняемой жидкости [36, 49]. Клинические проявления могут усиливаться в течение 2-3 недель, за которыми следует спонтанная ремиссия. Методика [86]: 1. Нативный бычий коллаген II типа (Elastin) растворяют в 0,1 М уксусной кислоте, эмульгируют на льду с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда (Sigma) до получения стойкой эмульсии. 41 2. Эмульсию БК/НАФ вводят крысам под легкой анестезией диэтиловым эфиром внутрикожно в заднюю часть спины в 2-3 точки в дозе 400 мкг БК. Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, индукция, клинические проявления Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит является адекватной экспериментальной моделью рассеянного склероза, тяжелого нейродегенеративного заболевания человека. Индукторами ЭАЭ могут выступать многие белки миелина, одновременно они являются мишенями аутоиммунной реакции при аутоиммунного ЭАЭ. Известно энцефаломиелита, несколько вызываемых экспериментальных иммунизацией моделей отдельными белками миелина или гомогенатом спинного мозга [72]. Мы для индукции ЭАЭ выбрали иммунизацию крыс основным белком миелина морской свинки в полном адъюванте Фрейнда. ЭАЭ возникает через 10-12 дней после иммунизации и проявляется потерей тонуса хвоста, слабостью задних конечностей, параличом задних конечностей. Большинство крыс восстанавливаются спонтанно в течение от 6 до 8 дней после первого паралича. Методика: 1. ОБМ морской свинки эмульгируют с равным объемом ПАФ до образования стойкой эмульсии. 2. Каждой крысе под легкой анестезией диэтиловым эфиром внутрикожно в заднюю часть спины в 2-3 точки вводят эмульсию ОБМ морской свинки (25 мкг)/полный адъювант Фрейнда (100 мкг M. butyricum). Экспериментальная модель атеросклероза, индукция, клинические проявления [7] Сегодня известно много экспериментальных моделей атеросклероза. Нами выбрана экспериментальная модель атеросклероза у крыс, в основе которой лежит развитие аутоиммунной реакции против нативных ЛПНП, вызванное иммунизацией человеческими нативными ЛПНП в неполном адъюванте Фрейнда. 42 Данная модель воспроизводит основные метаболические, патофизиологические признаки заболевания и тем самым является адекватной экспериментальной моделью атеросклероза человека. Наличие атеросклероза оценивали по наличию эпикардиального жира и атеросклеротическим изменениям структуры стенки аорты. Методика: 1. Нативные ЛПНП (Sigma) человека эмульгируют с равным объемом НАФ до образования стойкой эмульсии. 2. Суспензию нативные ЛПНП (Sigma)/неполный адъювант Фрейнда (Sigma) вводят крысам под легкой анестезией диэтиловым эфиром внутрикожно в заднюю часть спины в 2-3 точки по 200 мкг нЛПНП на крысу. Введение неполного адъюванта Фрейнда, полного адъюванта Фрейнда, забуференного физиологического раствора крысам Было сформировано три контрольные группы крыс. Крысам первой группы водили НАФ, крысам второй группы - ПАФ, крысам третьей группы – ЗФР pH 7,2. Методики: 1. НАФ предварительно эмульгированный с ЗФР вводят крысам под легкой анестезией диэтиловым эфиром внутрикожно в заднюю часть спины в 2-3 точки по 80±20 мкл на крысу. 2. ПАФ, предварительно эмульгированный с равным объемом ЗФР вводят крысам под легкой анестезией диэтиловым эфиром внутрикожно в заднюю часть спины в 2-3 точки по 20±10 мкл (100 мкг M. butyricum). 3. ЗФР вводят крысам под легкой анестезией диэтиловым эфиром подкожно в заднюю часть спины в 2-3 точки по 80±20 мкл на крысу. Иммунизация крыс иммуноглобулином G крысы и его фрагментами Иммунизацию крыс нативным IgG крыс и его Fc фрагментами, полученными путем папаинового протеолиза, проводили с целью определить их способность индуцировать продукцию РФтнIgGэ. 43 Методики: 1.1 Нативный IgG крыс (Equitech-Bio, Inc.) эмульгируют с равным объемом НАФ до образования стойкой эмульсии. 1.2 Эмульсию IgG крыс/НАФ вводят крысам под легкой анестезией диэтиловым эфиром внутрикожно в заднюю часть спины в 2-3 точки по 500 мкг IgG на крысу. 2.1 Fc-фрагменты IgG крысы эмульгируют с равным объемом НАФ до образования стойкой эмульсии. 2.2 Эмульсию Fc-фрагменты IgG крысы/НАФ вводят крысам под легкой анестезией диэтиловым эфиром внутрикожно в заднюю часть спины в 2-3 точки в дозе 500 мкг Fc-фрагментов IgG крысы. Забор крови у крыс Кровь забирают до иммунизации и еженедельно после иммунизации у каждого животного кардиальной пункцией в объеме 1 мл с антикоагулянтом (3,8 % раствор цитрата натрия) под анестезией диэтиловым эфиром. Плазму немедленно собирают и замораживают. Определение танизированных ревматоидного нагруженных фактора методом гомологичным агглютинации иммуноглобулином G эритроцитов (РФтнIgGэ) [39] Принцип метода. Метод основан на взаимодействии ревматоидного фактора с танизированными эритроцитами, нагруженными неспецифическим IgG крыс, что приводит к видимой агглютинации эритроцитов. Методика: 1. Эритроциты фиксируют глутаровым альдегидом. Для этого трижды отмытый 0,9 % раствором NaCl осадок эритроцитов человека группы 0 охлаждают до 0 оС на ледяной бане. 25 % глутаровый альдегид разводят до 1 % раствором следующего состава: 1 часть 0,15 М Na2HPO4 (рН 8,2), 9 частей 0,15 М NaCl и 5 частей дистиллированной воды, охлаждают на ледяной бане. Разводят 44 осадок эритроцитов 1 % глутаровым альдегидом до 1-2 % суспензии, инкубируют 30 минут при 0 о С при периодическом перемешивании. Фиксированные эритроциты отмывают 5 раз 0,9 % раствором NaCl при 1000 об/мин по 5 минут. 2. Отмытые фиксированные эритроциты (10 % суспензия в ЗФР рН 7,2) смешивают с равным объемом раствора танина (3 мг на 10 мл ЗФР рН 7,2). Инкубируют 10 мин при комнатной температуре, трижды отмывают ЗФР. Для сенсибилизации смешивают 4 мл ФСБ (рН 6,4), 1,5 мл раствора IgG крысы (Sigma) в 0,9 % растворе NaCl с концентрацией 0,5 мг/мл и 70 мкл плотного осадка танизированных эритроцитов. Инкубируют 20 мин при комнатной температуре, трижды отмывают 0,2 % раствором БСА в ЗФР. 3. Для постановки реакции исследуемую плазму титруют с шагом 2 в ЗФР и вносят по 50 мкл в лунки планшета. Добавляют равный объем 1,5 % суспензии эритроцитов, нагруженных IgG крысы. В контроле вместо исследуемой плазмы вносят ЗФР. Инкубируют при 37 оС. Реакцию агглютинации учитывают через 3 часа. Определение определяемой способности методом популяции агглютинации ревматоидного танизированных фактора, нагруженных гомологичным иммуноглобулином G эритроцитов, взаимодействовать с иммунными комплексами В качестве иммунного комплекса использовали комплекс эритроцитов человека (А (II) Rh+) и IgG антител специфичных к ним. 1. Крыс иммунизируют под легкой анестезией диэтиловым эфиром эритроцитами человека (А (II) Rh+) однократно внутрибрюшинно в дозе 5*108 клеток, суспендированных в физиологическом растворе. Через 35 дней проводят реиммунизацию, забирают кровь и определяют титр антител специфичных к эритроцитам человека (А (II) Rh+). Выбирают образцы плазмы крови с максимальным титром. Среди данных образцов выбирают те, в которых содержатся преимущественно IgG антитела. Для этого образцы плазмы смешивают в равных объемах с 0,2 М меркаптоэтанолом в трис-НСl-буфере с рН 45 8,6, инкубируют 1 час при 37 °С. Затем плазму титруют с шагом 2 и смешивают с равным объемом 0,5 % суспензии эритроцитов человека. Инкубирут 3 часа при 37 °С и учитывают результаты. Меркаптоэтанол вызывает диссоциацию IgMпентаморов, в результате чего они утрачивают агглютинирующую способность. Поэтому добавление данного реагента приводит к тому, что в реакции агглютинации участвует лишь IgG, что позволяет сравнивать титры IgM и IgG [1]. При учете результатов реакции агглютинации с меркаптоэтанолом имеет значение не столько абсолютный титр антител, сколько удельное содержание в сыворотке IgG-антител. Если обработка меркаптоэтанолом не снижает титр или снижает его только на одно или два разведения, то это говорит о значительном содержании в сыворотке крови IgG-антител. Для получения иммунных комплексов отбирали образцы плазмы крови иммунизированных животных, содержащие преимущественно IgG антитела. 2. Плазму крысы, содержащую IgG антитела специфичные к эритроцитам человека, нагревают при 56° С в течение 30 минут, после чего разводят физологическим раствором до субагглютинирующего титра и добавляют равный объем 1 % суспензии эритроцитов человека. Инкубируют 1 час при 37°С. 3. Эритроциты человека нагруженные специфическими IgG антителами (иммунные комплексы) трижды отмывают физиологическим раствором и готовят из них 1 % суспензию. 4. Для постановки реакции РФтнIgGэ-содержащую плазму титруют с шагом 2 и вносят по 50 мкл в лунки. Добавляют в каждую лунку в равном объеме суспензию эритроцитов, нагруженных антиэритроцитарными антителами крыс. В контроле вместо исследуемой плазмы вносят физиологический раствор. Инкубируют при 37 ˚С. Реакцию агглютинации учитывают через 3 часа. Определение ревматоидного фактора методом иммуноферментного анализа (РФкрIgG) Принцип метода. 46 Метод основан на регистрации комплекса антиген-антитело при помощи антител, маркированных определенными ферментами, с последующим образованием легко регистрируемых хромогенных продуктов энзиматического превращения дополнительных компонентов реакции. Антигеном в данном методе служит IgG кролика, несущий в нативном, мономерном состоянии антигенные детерминанты для РФкрIgG [12, 48]. Методика: 1. IgG кролика (ИМТЕК) в ЗФР рН 7,2 в концентрации 10 мкг/мл сорбируют в лунки планшета по 50 мкл в течение суток при 4°С. Планшет промывают ЗФР рН 7,2 с твином-20 (0,5 мл на 1л) 3 раза. 2. Для блокировки неспецифического связывания вторых антител добавляют 0,1-0,05 % раствор БСА в ЗФР с твином-20 по 150 мкл на лунку (предварительно раствор белка фильтруют), инкубируют 1 час при комнатной температуре. Промывают 3 раза ЗФР с твином-20. 3. В лунки вносят исследуемую плазму в разведении 1:100, 1:200 и далее с шагом 2 по 100 мкл на лунку. Плазму разводят ЗФР рН 7,2 с твином-20. Инкубируют 1 час при комнатной температуре, трижды отмывают ЗФР рН 7,2 с твином-20. 4. Добавляют антивидовые антитела (антитела кролика против иммуноглобулинов крысы (ИМТЕК)) разведенные в 8000 раз ЗФР рН 7,2 с твином-20 по 100мкл на лунку. Инкубируют 1 час при комнатной температуре, трижды отмывают ЗФР рН 7,2 с твином-20. 5. Добавляют субстратную смесь (на 5 мл цитратного буферного раствора (рН 5,0) требуется 3 мг ОФД, 15мкл 3 % перекиси водорода) по 100 мкл на лунку. Для приготовления цитратного буфера смешивают 5,5 мл раствора Na2HPO4*12H2O (0,2 моль/л) с 5 мл раствора лимонной кислоты (0,1 моль/л) и 10мл дистиллированной воды. Все компоненты субстратной смеси смешивают непосредственно перед добавлением в лунки. Инкубируют 10-15 минут в темноте. Для остановки реакции добавляют 0,2 М H2SO4 по 50 мкл на лунку. В контроль 47 вместо исследуемой плазмы вносят ЗФР. Фотометрируют при длине волны 492 нм. Определяют титр антител в плазме, как максимальное разведение плазмы, при котором ОП выше контрольной. Определение антител против нативных липопротеинов низкой плотности методом иммуноферментного анализа Принцип метода. Метод основан на регистрации комплекса антиген-антитело при помощи антител, маркированных определенными ферментами, с последующим образованием легко регистрируемых хромогенных продуктов энзиматического превращения дополнительных компонентов реакции. Методика [8]: 1. Твердой фазой служат полихлорвиниловые микротитровальные плоскодонные планшеты. В качестве связывающего агента используют ЛПНП в концентрации 10 мкг/мл (фирма «SIGMA»), иммобилизованные в течение суток при 4 0С в фосфатном буферном растворе с 0,15М NaCl (ЗФР рН 8,5). Планшет промывают ЗФР (рН 7,4) с твином-20 (0,5 мл на 1 л) 3 раза. 2. Исследуемую плазму титруют, используя ЗФР (рН 7,4) с твином-20. В лунки вносят по 100 мкл исследуемой плазмы в последовательном разведении. Инкубируют 3 часа при температуре 520С. Отмывают 3 раза ЗФР с твином-20. В качестве контроля добавляют ЗФР с твином-20. 3. Проявление комплекса связывающий агент - лиганд (ЛПНП-антитело) осуществляют конъюгатом поликлональных антител к IgG крысы с ферментной меткой – пероксидазой хрена («ИМТЕК»). Инкубируют 1 час при комнатной температуре. Отмывают 3 раза ЗФР с твином-20. 4. Для проявления ферментативной активности конъюгата добавляют свежеприготовленную субстратную смесь по 100 мкл на лунку (на 5 мл цитратного буферного раствора, (pH 5,0), 3 мг ОФД, 3% перекись 15 мкл) Инкубация 10-15 минут в темноте. Реакцию ингибируют 0,2 М раствором серной кислоты по 50 мкл на лунку. Измерение оптической плотности проводят при 48 λ=492 нм. Определяют титр антител в плазме, как максимальное разведение плазмы, при котором ОП выше контрольной. Определение антител против основного белка миелина, бычьего коллагена методом иммуноферментного анализа Принцип метода. Метод основан на регистрации комплекса антиген-антитело при помощи антител, маркированных определенными ферментами, с последующим образованием легко регистрируемых хромогенных продуктов энзиматического превращения дополнительных компонентов реакции. Методика 1. ОБМ сорбируют в концентрации 10 мкг/мл в ЗФР, БК сорбируют в концентрации 50 мкг/мл в ЗФР в лунки планшета по 50 мкл в течение суток при 4°С. Планшет промывают ЗФР с твином-20 (0,5 мл на 1л) 3 раза. 2. Для блокировки неспецифического связывания вторых антител добавляют 0,1-0,05% раствор БСА в ЗФР с твином-20 по 150мкл на лунку (предварительно раствор белка фильтруют), инкубируют 1 час при комнатной температуре. Промывают 3 раза ЗФР с твином-20. 2. В лунки вносят исследуемую плазму в разведении 1:100, 1:200 и далее с шагом 2 по 100мкл на лунку. Плазму разводят ЗФР с твином-20. В контроле вместо исследуемой плазмы вносят ЗФР с твином-20. Инкубируют 1 час при комнатной температуре, трижды отмывают ЗФР с твином-20. 3. Добавляют антивидовые антитела (антитела кролика против иммуноглобулинов крысы (ИМТЕК)) разведенные в 4000 раз в ЗФР рН 7,2 с твином-20 при определении антител к БК и в 8000 раз при определении антител к ОБМ по 100мкл на лунку. Инкубируют 1 час при комнатной температуре, трижды отмывают ЗФР рН 7,2 с твином-20. 4. Добавляют субстратную смесь (на 5 мл цитратного буферного раствора (рН 5,0) требуется 3мг ОФД, 15мкл 3% перекиси водорода) по 100мкл на лунку. Для приготовления цитратного буфера смешивают 5,5мл раствора 49 Na2HPO4*12H2O (0,2 моль/л) с 5мл раствора лимонной кислоты (0,1моль/л) и 10мл дистиллированной воды. Все компоненты субстратной смеси смешивают непосредственно перед добавлением в лунки. Инкубируют 10-15 мин в темноте. Для остановки реакции добавляют 0,2М H2SO4 по 50мкл на лунку. Фотометрируют при длине волны 492нм. Определяют титр антител в плазме, как максимальное разведение плазмы, при котором ОП выше контрольной. Определение определяемой специфичности методом популяции агглютинации ревматоидного танизированных фактора, нагруженных гомологичным иммуноглобулином G эритроцитов, методом торможения реакции пассивной гемагглютинации Принцип метода. Метод основан на ингибировании реакции агглютинации нагруженных антигеном эритроцитов в присутствие небольшого количества антигена в растворе, конкурирующего за связывание с агглютинирующими антителами [1]. Агглютинирующие антитела используют в дозе превышающей минимальную агглютинирующую дозу (МАД) в 2-3 раза. Методика: 1. Эритроциты, обработанные танином и нагруженные гомологичным IgG готовят как описано в главе 2 в пункте «Определение РФтнIgGэ методом агглютинации танизированных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов». 2. Проводят предварительную реакцию агглютинации для определения титра РФтнIgG в плазме. Реакцию проводят как описано в главе 2 в пункте «Определение РФтнIgGэ методом агглютинации танизированных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов» и определяют разведение сыворотки, содержащей 2 МАД. 3. В лунки планшета вносят 50 мкл РФтнIgGэ-содержащей плазмы в разведении, содержащем 2 МАД, 50 мкл тестируемого антигена в концентрации 2 мг/мл и 50 мкл 1,5 % суспензии эритроцитов, обработанных танином и нагруженных гомологичным IgG. 50 4. Инкубируют при 37 оС. Реакцию агглютинации учитывают через 3 часа. Определение идиотип-антиидиотипических взаимодействий между популяцией ревматоидного фактора, определяемой методом агглютинации танизированных нагруженных гомологичным иммуноглобулином G эритроцитов, и антителами к антигенам-индукторам аутоиммунных заболеваний методом конкурентного иммуноферментного анализа Наличие идиотип-антиидиотипических взаимодействий между РФтнIgGэ и антителами к антигенам-индукторам аутоиммунных заболеваний было определено по способности РФтнIgGэ-содержащей плазмы конкурировать с антигенам-индукторам аутоиммунных заболеваний за связывание с антигенспецифической плазмой. Антиген-специфическая плазма, используемая в этом эксперименте имела высокие титры антиген-специфических антител и не обнаруживаемые уровни РФтнIgGэ. Плазма была получена от иммунизированных крыс. Плазма, содержащая РФтнIgGэ была получена от крыс на 7 день после иммунизации БК, ОБМ и нЛПНП. Антиген-специфические антитела в этих образцах плазмы не были обнаружены. Методика: 1. ОБМ сорбируют в концентрации 10 мкг/мл, БК сорбируют в концентрации 50 мкг/мл, нативные ЛПНП сорбируют в концентрации 10 мкг/мл в ЗФР в лунки планшета по 50 мкл в течение суток при 4°С. Планшет промывают ЗФР с твином-20 (0,5 мл на 1л) 3 раза. 2. Для блокировки неспецифического связывания вторых антител добавляют 150 мкл БСА (0,1-0,05%) в ЗФР с твином-20 (предварительно раствор белка профильтровать) на лунку, инкубируют 1 ч при температуре 23-25°С. Промывают 3 раза ЗФР с твином-20. 3. После этого в лунках планшета в течение 1 часа при комнатной температуре инкубировали смесь (100 мкл на лунку), содержащую антиген- 51 специфическую плазму и РФтнIgGэ-содержащую плазму, которая была предварительно проинкубирована в течение 1 часа при комнатной температуре. Образцы антиген-специфической плазмы используют в разведениях, включая рабочее. РФтнIgGэ-плазма всегда используется в разведении с учетом титра в 10 или 100 раз. Далее ИФА, где антигеном служат ОБМ и БК проводят как описано выше в главе 2 в пункте «Определение антител против ОБМ, БК методом ИФА», где антигеном служат чЛПНП - как описано в главе 2 в пункте «Определение антител против нативных ЛПНП методом ИФА» Для определения рабочего разведения антиген-специфической плазмы последние добавляют в серии разведений в лунки планшета с предварительно засорбированным в них антигеном. Для определения рабочего разведения ОБМ- и БК-специфической плазмы анализ проводят как описано выше в главе 2 в пункте «Определение антител против ОБМ, БК методом ИФА», для чЛПНП-специфической плазмы как описано в главе 2 в пункте «Определение антител против нативных ЛПНП методом ИФА». Получение Fc фрагментов иммуноглобулина G крысы папаиновым гидролизом с предварительной обработкой дитиотреитолом (ДТТ) 1. Выделение IgG из плазмы крови крысы. Кровь забирают у интактных крыс с гепарином и центрифугируют. Полученную плазму разводят дистиллированной водой в 3 раза и добавляют сульфат аммония до 40 % от насыщения. Далее сульфатный осадок промывают 40 % раствором сульфата аммония. Сульфатный осадок растворяют дистиллированной водой и проводят диализ против ЗФР с pH=7,5. Полученный раствор наносят на колонку с protein G-сефарозой, используя в качестве начального буфера ЗФР с pH=7,5. Элюцию проводят 0,1 М глицин-HCl буфером с pH=2,7. В полученную фракцию IgG добавляют 1М Tris-HCl буфер с pH=9.0, после чего проводят диализ против ЗФР с pH=7,5. 2. Обработка IgG ДТТ и папаином. 52 К IgG крысы с C=20 мг/мл добавляют 1 мг ДТТ на 1 мл белка (конечная концентрация 13 мМ), инкубируют 1 час при 37 0С. Далее добавляют 0,1 % папаина (w/w), инкубируют 5 минут при 37 0С. Образец наносят на колонку с Superdex 200, используя в качестве элюирующего буфера ЗФР с pH=7,5. Получают 2 пика, первый пик представляет собой смесь нерасщепленного IgG и presplit-IgG. Второй пик – Fab и Fc фрагменты IgG. 3. Выделение и очистка Fc фрагментов. Для разделения Fc и Fab фрагментов второй пик наносят на колонку с protein G-сефарозой, где происходит сорбция только Fab фрагментов. Полученную фракцию Fc фрагментов диализируют против 0,015 М K-Naфосфатного буфера с pH=7,5 и разделяют на колонке с ДЭАЭ-сефарозой, используя в качестве начального буфера 0,015 М K-Na-фосфатного буфера с pH=7,5. Для элюции использовали линейный градиент 0-30 % 0,015 М K-Naфосфатного буфера с pH=7,5 с 1 М NaCl (60 объемов). Эллюция градиентом ионной силы с ДЭАЭ-целлюлозы позволила получить 2 фракции Fc фрагментов IgG крысы. Чистоту фракций Fc фрагментов оценивали электрофореза в ДСН-ПААГ-электрофорезе в с помощью диссоциирующих и в диссоциирующих и восстанавливающих условиях по числу и локализации окрашеных фракций. Загрязняющих Fab фрагментов или IgG не наблюдалось. Чистота Fc фрагментов IgG крысы составила 95%. Макроскопическое исследование сердца и аорты. Микроскопическое исследование аорты 1.Крыса подвергается анестезии диэтиловым эфиров. После вскрытия грудной полости крысе проводят интракардиальную перфузию последовательно: 30 мл физиологическим раствором, 30 мл фиксатором иммунофикс. 2. Аорту и сердце извлекают и очищают от окружающих тканей. Сердце и часть аорты окрашивают на липиды суданом III: образцы помещают в 70 % спирт на 15 мин, с последующим погружением в красящий раствор (Herxheimerstainingsolution - 0,5 % раствор Судана III в 35% спирт – 50% 53 ацетоновой смеси) на 20 минут при комнатной температуре. Далее аорту и сердце помещают в 85% спирт на 20 мин, затем образцы промывают под проточной водой в течение часа. Судан III окрашивает жир в красно-коричневый цвет. 3. Другая часть аорты подвергается гистологическому исследованию, для этого сосуды обезвоживают в возрастающей батарее спиртов и заливают в парафин. С помощью роторного микротома REICHERT готовят срезы, толщиной 3-5 мкм. Срезы монтируют на предметные стекла, предварительно обработанные желатином и хромовыми квасцами. Затем проводят отмывание от парафина с помощью ксилола, денатурации в 70%, 90%, 100% этаноле и окрашивают гематоксилином-эозином. Статистический анализ Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica 5.0 для Windows. Результаты выражали как среднее±SE, или SD – выборочное стандартное отклонение [2]. Для оценки достоверности различий был использован критерий Манна-Уитни или t-тест [2]. 54 Глава 3. Результаты и их обсуждение 3.1. Сравнительный анализ продукции популяций ревматоидного фактора у чувствительных и резистентных к индуцируемым аутоиммунным заболеваниям крыс Для выяснения роли ревматоидного фактора (РФ) в регуляции иммунного ответа против антигенов-индукторов экспериментально вызываемых аутоиммунных заболеваний был проведен сравнительный анализ уровня РФ у крыс в ответ на иммунизацию антигенами-индукторами аутоиммунных заболеваний. Были выбраны хорошо известные, адекватные соответствующему аутоиммунному заболеванию человека, экспериментальные модели: модель экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита крыс, вызванного иммунизацией ОБМ морской свинки/ПАФ, модель коллаген-индуцированного артрита крыс, вызванного иммунизацией БК/НАФ. Также была использована недавно разработанная модель атеросклероза крыс, вызванного иммунизацией человеческим ЛПНП/НАФ. РФ определяли двумя разными методами, которые традиционно используют для определения РФ в научных исследованиях: методом агглютинации танизированных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов (РФтнIgGэ) и методом ИФА, где в качестве антигена использовали IgG кролика (РФкрIgG). Тест агглютинации танизированных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов для определения РФ был выбран, потому что этот тест позволяет обнаружить популяцию РФ, специфичную к гомологичному IgG в то время как ИФА-тест является непригодным для выявления антител к гомологичному IgG и в качестве антигена в ИФА при определении уровня РФ часто используют IgG кролика или другой гетерологичный IgG [48]. В свою очередь IgG кролика выбирают в качестве антигена для выявления РФ в связи с тем, что он несет на Fc фрагменте антигенные детерминанты, которые появляются на IgG человека при аггрегации [37]. Эпитопы, распознаваемые на IgG кролика имеют наибольшее 55 сходство с основной детерминантой для РФ на IgG человека – Ga. Однако, эти детерминанты не идентичны [55]. Иммунизация антигенами-индукторами экспериментальных аутоиммунных заболеваний не всегда приводит к развитию соответствующего заболевания. Часть животных оказывается устойчива к заболеванию. В ответ на иммунизацию БК/НАФ артрит возник у 14 из 38 крыс. Устойчивыми к артриту считали крыс, у которых не было никаких изменений конечностей в течение 10 недель наблюдения после иммунизации БК (рисунок 2 А). У артритных крыс поражения варьировали от опухолей отдельных суставов до полного поражения одной или нескольких конечностей (рисунок 2 Б). Иммунизация ОБМ морской свинки/ПАФ вызвала ЭAЭ у 7 из 20 иммунизированных крыс. Устойчивыми к ЭАЭ считали крыс, у которых не было выявлено ни потери тонуса хвоста, ни паралича конечностей. У заболевших ЭАЭ крыс первым признаком была потеря тонуса хвоста, за которой следовал паралич задних конечностей. У всех заболевших крыс симптомы исчезали спонтанно через 18 – 20 дней после иммунизации. Атеросклероз возник у 10 из 17 крыс в ответ на иммунизацию чЛПНП/НАФ (рисунок 2 Г, Е, З). О развитии атеросклероза у крыс, иммунизированных чЛПНП, судили по таким признакам, как дислипопртеинемия, значительное увеличение объема эпикардиального жира, изменение стенки дуги аорты, проявляющееся в увеличении объема периваскулярного жира, скоплении лейкоцитов между медиа и адвентицией, дезинтеграции медиа, повреждении интимы к 16 неделе после иммунизации (рисунок 2 Г, Е, З). Устойчивыми к атеросклерозу считали крыс, у которых не было выявлено эпикардиального жира и изменений в стенке аорты, дислипопротеинемии к 16 неделе после иммунизации (рисунок 2 В, Д, Ж). Кинетика иммунного ответа против антигенов-индукторов аутоиммунных заболеваний и кинетика ревматоидного фактора (РФтнIgGэ, РФкрIgG) у крыс, оказавшихся устойчивыми к развитию аутоиммунных заболеваний, показана на рисунках 3 А, 4 А и 5 А, у крыс, у которых развилось соответствующее аутоиммунное заболевание, показана на рисунках 3 Б, 4 Б и 5 Б. 56 Рисунок 2 – Признаки артрита и атеросклероза у крыс: А – устойчивые к артриту крысы, Б – артритные крысы, В, Д, Ж – устойчивые к атеросклерозу крысы, Г, Е, З – признаки атеросклероза у крыс. В, Г – окрашенные суданом сердца устойчивых к атеросклерозу крыс (В) и крыс, с признаками атеросклероза (Г). Красным цветом окрашена эпикардиальная жировая ткань. Д, Е – стенка дуги аорты крыс, окрашенная гематоксилином-эозином. У устойчивых к атеросклерозу крыс интима аорты представлена единственным эндотелиальным слоем, плотно прилегающим к внутренней эластической мембране; медиа аорты состоит из нескольких слоев мышечных клеток и экстрацеллюлярного коллагенового матрикса, разделенного эластиновыми пластинками (Д). Участок полной деградации интимы, вспучивание и обнажение медиа у крыс, с признаками атеросклероза (Е) Ж, З: криостатные срезы стенки дуги аорты крыс, окрашенные 57 суданом III и гематоксилином. Отложение липидов в стенке дуги аорты у крыс, спризнаками атеросклероза (З). Длина линии = 200 мкм Рисунок 3 – Кинетика антител к БК и кинетика РФтнIgGэ и РФкрIgG в ходе иммунного ответа против БК у устойчивых (А) и чувствительных (Б) к КИА крыс. Каждая точка представлена средним от 24 крыс ± SE для здоровых животных и от 14 крыс ± SE для больных животных 58 Рисунок 4 – Кинетика антител к ОБМ морской свинки и кинетика РФтнIgGэ и РФкрIgG в ходе иммунного ответа против ОБМ морской свинки у устойчивых (А) и чувствительных (Б) к ЭАЭ крыс. Каждая точка представлена средним от 13 крыс ± SE для здоровых животных и от 7 крыс ± SE для больных животных 59 Рисунок 5 – Кинетика антител к чЛПНП и кинетика РФтнIgGэ и РФкрIgG в ходе иммунного ответа против чЛПНП у устойчивых (А) и чувствительных (Б) к атеросклерозу крыс. Каждая точка представлена средним от 7 крыс ± SE для здоровых животных и от 10 крыс ± SE для больных животных 60 На рисунках 3 А, 4 А и 5 А видно, что у устойчивых к аутоиммунным заболеваниям крыс, иммунному ответу против антигена-индуктора независимо от его специфичности предшествует повышение уровня РФтнIgGэ. Первый максимум РФтнIgGэ в крови наблюдаются уже на 7 день после иммунизации, тогда как антитела к иммуногену достигают максимума только на 28-35 день после иммунизации. У животных, у которых развился КИА, ЭАЭ или атеросклероз не выявлено повышения уровня РФтнIgGэ в период индукции иммунного ответа (т.е. в течение 7 дней после иммунизации) (рисунок 3 А, 4 А и 5 А соответственно). Сравнительный анализ уровня РФтнIgGэ на 7 день после иммунизации у устойчивых и больных крыс в трех моделях показан на рисунке 6. Уровень РФтнIgGэ на 7 день у устойчивых крыс достоверно выше, чем у которых развилось заболевание. Зависимость между высоким уровнем РФтнIgGэ на 7 день после иммунизации и устойчивостью к развитию клинической картины заболевания выявлена в нескольких экспериментальных моделях аутоиммунных заболеваний (моделях КИА, ЭАЭ, атеросклероза). Данный факт позволяет рассматривать РФ, определяемый в тесте агглютинации танизированных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов, как универсальный фактор устойчивости к развитию аутоиммунных заболеваний. В фазу завершения иммунного ответа у крыс устойчивых к КИА (рисунок 3 A) и ЭАЭ (рисунок 4 А), а также клинической ремиссии и падения уровня антител против антигенов-индукторов у крыс больных КИА (рисунок 3 Б) и ЭАЭ (рисунок 4 Б) наблюдается достижение максимального уровня РФтнIgGэ в крови. У артритных крыс уровень РФтнIgGэ в фазу ремиссии повышается незначительно, что ассоциировано с незавершенностью продукции антител к БК (рисунок 3 Б) и неполной редукцией симптомов к 9-10 неделе после иммунизации. У чувствительных к развитию атеросклероза крыс повышение уровня РФтнIgGэ за 16 недель наблюдения не выявлено, при этом не происходит и ограничения 61 продукции антител к чЛПНП, наоборот, наблюдается их прогрессивный рост и развитие ранних признаков атеросклероза (рисунок 5 Б). Рисунок 6 – Сравнительный анализ уровней РФтнIgGэ у устойчивых и чувствительных к аутоиммунным заболеваниям крыс. * - различия статистически значимы, р<0,05, критерий Манна-Уитни в моделях ЭАЭ и атеросклероза, t-тест в модели КИА. А, В, Д – устойчивые к экспериментально вызываемому аутоиммунному заболеванию, Б, Г, Е – чувствительные к экспериментально вызываемому аутоиммунному заболеванию На рисунках 3, 4 и 5 видно, что интенсивная продукция РФтнIgGэ, наблюдаемая у устойчивых к аутоиммунным заболеваниям крыс, сопровождается менее сильной, чем у больных крыс продукцией антител против антигенов индукторов аутоиммунных заболеваний. В период прогрессивного роста РФтнIgGэ уровень антител к антигенам индукторам снижается либо остается на низком уровне. РФкрIgG, как правило, мало изменяется в ходе иммунного ответа против антигенов-индукторов аутоиммунных заболеваний у устойчивых животных во всех исследуемых моделях. Однако индивидуальный анализ показал, что у некоторых крыс, оказавшихся устойчивыми к развитию заболевания в период индукции иммунного ответа, наблюдается продукция РФкрIgG. Так в модели 62 артрита и атеросклероза у некоторых устойчивых крыс вместо РФтнIgGэ продуцируется РФкрIgG (рисунок 7, рисунок 8); в модели ЭАЭ – продукция РФкрIgG следует за продукцией РФтнIgGэ (рисунок 9). У животных, которые заболели ЭАЭ и атеросклерозом продукция РФкрIgG, как и РФтнIgGэ не значительна (рисунок 4 Б, рисунок 5 Б). У животных, заболевших артритом снижение титра антител против БК сопровождается увеличением уровня РФкрIgG (рисунок 3 Б). У большинства интактных крыс до иммунизации обнаруживается низкий уровень РФтнIgGэ и РФкрIgG (0 день), что свидетельствует о том, что изменение уровней РФ может происходить спонтанно и не связано с иммунизацией. Также РФ может изменяться под влиянием ПАФ и НАФ, которые используются при иммунизации. Чтобы проверить это предположение исследовали кинетику РФтнIgGэ и РФкрIgG у интактных крыс и крыс, которым ввели ПАФ и НАФ. На рисунках 10 и 11 видно, что ни ПАФ, ни НАФ не увеличивают РФтнIgGэ и РФ крIgG соответсвенно в плазме крыс. Таким образом, устойчивость к развитию аутоиммунного заболевания в моделях КИА, ЭАЭ, атеросклероза крыс ассоциирована с интенсивной продукцией РФтнIgGэ в период инициации иммунного ответа, тогда как отсутствие продукции РФтнIgGэ в ранний период иммунного ответа связано с чувствительностью крыс к развитию аутоиммунных заболеваний, индуцируемых чужеродными антигенами-индукторами аутоиммунных заболеваний. У некоторых не чувствительных к КИА и атеросклерозу животных, устойчивость к развитию соответствующего аутоиммунного заболевания связана с продукцией РФкрIgG вместо РФтнIgGэ, у некоторых не чувствительных к ЭАЭ крыс - с последовательной продукцией обеих популяций РФ. Ремиссия экспериментально вызванных аутоиммунных заболеваний и завершение иммунного ответа против антигена также связаны с повышением уровня РФтнIgGэ. 63 Рисунок 7 – Кинетика антител к БК и кинетика РФтнIgGэ и РФкрIgG в ходе иммунного ответа против БК у устойчивых к КИА крыс. Каждая точка представлена средним от 4 крыс ± SЕ Рисунок 8 – Кинетика антител к чЛПНП и кинетика РФтнIgGэ и РФкрIgG в ходе иммунного ответа против чЛПНП у устойчивых к атеросклерозу крыс. Каждая точка представлена средним от 5 крыс ± SE 64 Рисунок 9 – Индивидуальная кинетика РФтнIgGэ и РФкрIgG в ходе иммунного ответа против бОБМ у устойчивых к ЭАЭ крыс 65 Рисунок 10 – Кинетика РФтнIgGэ у интактных крыс, крыс иммунизированных ПАФ и НАФ. Каждая точка представлена средним значением ± SE Рисунок 11 – Кинетика РФкрIgG у интактных крыс, крыс иммунизированных ПАФ и НАФ. Каждая точка представлена средним значением ± SE 66 На первый взгляд полученные в работе факты и следующие из них выводы не согласуются с широко распространенным представлением о том, что повышение РФ предшествует ревматоидному артриту [48, 122] и что высокий титр РФ является фактором риска прогресса артралгии и развития внесуставных проявлений у пациентов с ревматоидным артритом. Высокие титры IgM-РФ также присутствуют у лиц с первичным синдромом Шегрена, смешанной криоглобулинемией, а также с различными хроническими инфекциями [42, 68, 80, 105]. Однако существуют доказательства того, что есть два класса ревматоидных факторов – физиологический и патологический. В то время как патологический РФ ассоциирован с заболеванием, физиологический РФ считается нормальным компонентом иммунного ответа [118]. Изучаемые нами популяции РФ выявляются у интактных животных и повышение их уровня в ответ на инициирующий антигенный стимул, предшествующее продукции антител к иммуногену, ассоциировано с устойчивостью животных к развитию аутоиммунных заболеваний в исследуемых экспериментальных моделях. Эти факты дают основания считать РФ, определяемый методом агглютинации танизированных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов, а также РФ сецифичный к IgG кролика отличными от патологического РФ, ассоциированного с артритом, и отнести их к классу физиологических, регуляторных РФ. Исследования, посвященные вовлеченности РФ в нормальный иммунный ответ против разных чужеродных антигенов, было проведено ранее Coulie и Van Snick [31]. Авторы также показали, что РФ вовлечен в нормальный иммунный ответ против чужеродных антигенов, достигает пика и падает раньше, чем антитела против чужеродного антигена. Однако авторы не нашли РФсекретирующие клетки у мышей при первичном иммунном ответе, обнаружив их при вторичном. Исследуемый ими РФ, имел высокое сродство к иммунным комплексам [31]. Исследуемый нами РФтнIgGэ не взаимодействует с иммунными комплексами (раздел 3.3, страница 82). Поэтому причиной того, что авторы в 67 отличие от нас не нашли РФ при первичном иммунном ответе, связано с исследованием другой по специфичности популяции РФ. Выявленные факты указывают на регуляторную роль исследованных популяций ревматоидного фактора как РФтнIgGэ, так и РФкрIgG в продукции антител к антигенам индукторам аутоиммунных заболеваний независимо от специфичности антигенов. Популяция РФ, определяемая методом агглютинации танизированных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов, является ведущей в регуляции. Низкий уровень РФтнIgGэ в период индукции иммунного ответа (7 день после иммунизации) может рассматриваться как предиктор последующей манифестации экспериментально вызванных аутоиммунных заболеваний. 3.2. Специфичность ревматоидного фактора, определяемого методом агглютинации танизированных, нагруженных гомологичным IgG эритроцитов Для выяснения специфичности РФтнIgGэ использовали несколько подходов: - сравнение специфичности РФтнIgGэ и панагглютининов; - исследование способности мономерного нативного IgG крысы и его фрагментов ингибировать агглютинацию танизированных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов, вызванную РФтнIgGэ-содержащей плазмой и вызывать продукцию РФтнIgGэ у интактных крыс; - сравнение специфичности РФтнIgGэ и РФкрIgG. 3.2.1. Сравнение специфичности РФтнIgGэ и панагглютининов Тест-система, используемая нами для определения РФтнIgGэ, была разработана в свое время как тест-система для определения ревматоидного фактора [128]. Предполагается, что антигеном в данной тест-системе служит модифицированный танином IgG сорбированный на эритроцитах [84]. Однако описанный в литературе феномен панагглютининов – антител, вызывающих агглютинацию эритроцитов, обработанных танином, и присутствующих в крови 68 здоровых и больных артритом людей [3, 54], вызвал сомнения в том, что антитела, определяемые в использованной нами тест-системе, являются ревматоидным фактором, то есть антителами против Fc фрагментов IgG. Поэтому был проведен сравнительный анализ интенсивности реакции агглютинации танизированных эритроцитов (ЭТ) и танизированных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов (ЭТIgG) РФтнIgGэ-содержащей плазмой, полученной от интактных крыс и крыс иммунизированных БК (таблица 1). Все исследованные образцы РФтнIgGэ-содержащей плазмы не взаимодействовали с нативными эритроцитами человека, неспецифически незначительно взаимодействовали с эритроцитами фиксированными глутаровым альдегидом (таблица 1). Таблица 1 – Способность плазмы, содержащей РФтнIgGэ, связывать танизированные эритроциты и танизированные эритроциты, нагруженные IgG Исследованные плазма и сыворотки РФтнIgGэ содержащая плазма интактных крыс (титр±SD), (n = 40) РФтнIgGэ содержащая плазма крыс, иммунизирова нных БК, полученная на 7 день после иммунизации БК (титр±SD), (n=25) Эритроциты на стадиях последовательной обработки при приготовлении тест-системы Нативные Эритроциты Эритроциты Эритроциты эритроциты фиксированные фиксированные фиксированные ГА ГА, танизиро- ГА, танизированванные (ЭТ) ные, нагруженные IgG крыс (ЭТIgG) 0 0 36,0±16,2 40,0±32,6 140,0±210,2 147,4 ±253,7 568,6±971,5 1525,9 ±2978,3* (P = 0,04) 69 Сыворотка кролика против 0 16 256 16192 IgG крысы (титр) Антисыворотка против IgG человека (НИИ ЭМ предприятие 128 128 256 16192 по производству бакпреп-в им. Гамалеи), (титр) Плазма интактных крыс вызывала агглютинацию танизированных и танизированных нагруженных IgG эритроцитов в равной степени (таблица 1). Титр антител в плазме иммунизированных БК животных, полученной на максимуме РФтнIgGэ, в реакции агглютинации с ЭТIgG, достоверно выше, чем при использовании в качестве антигена танизированных эритроцитов. Однако сравнительный анализ кинетики антител в ходе иммунного ответа против БК, выявляемых в агглютинационном тесте, где антигеном служили танизированные эритроциты и ЭТIgG, показал, что уровень антител, определяемых в тесте с танизированными эритроцитами изменяется синхронно с изменением уровня антител, определяемых в тесте с танизированными, нагруженными IgG эритроцитами (рисунок 12). Максимумы образования антител против танизированных эритроцитов и танизированных нагруженных IgG эритроцитов совпадают во времени. Аналогичные результаты были получены при сравнении кинетики образования антител против танизированных эритроцитов и танизированных нагруженных IgG эритроцитов в ходе иммунного ответа против бОБМ и чЛПНП (рисунок 12). 70 Рисунок 12 – Кинетика антител, определяемых в тест-системе с танизированными эритроцитами (ЭТ) и РФтнIgGэ, определяемого в тест-системе с танизированными нагруженными гомологичным IgG эритроцитами (ЭТIgG). Каждая точка представлена средним от 4 крыс ± SЕ. А – при иммунизации БК, Б – при иммунизации бОБМ, В – при иммунизации чЛПНП Из этих данных следует, что популяция РФ с регуляторными свойствами, определяемая методом агглютинации танизированных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов, и панагглютинины – одни и те же антитела, и танизированные эритроциты ненагруженные IgG могут нести антигенные детерминанты, с которыми взаимодействует РФтнIgGэ. 71 Исследование 3.2.2. способности мономерного нативного иммуноглобулина G крысы и его фрагментов вызывать торможение реакции агглютинации танизированных нагруженных гомологичным иммуноглобулином G эритроцитов и продукцию популяции ревматоидного фактора, определяемого методом агглютинации танизированных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов Fc фрагменты IgG крысы получали папаиновым протеолизом IgG крысы с последующим хроматографическим разделением на ДЭАЭ-целлюлозе, как описано в главе 2. Эллюция градиентом ионной силы с ДЭАЭ-целлюлозы позволила получить 2 фракции Fc фрагментов IgG крысы (рисунок 13). Чистоту Fc фрагментов оценивали с помощью электрофореза в ПААГ в диссоциирующих и в диссоциирующих и восстанавливающих условиях по числу и локализации окрашенных фракций (рисунок 13). Рисунок 13 – Электрофореграмма Fc фрагментов фракции I и II, полученных папаиновым протеолизом IgG крысы с последующим хроматографическим разделением на ДЭАЭ-целлюлозе, и Fab фрагментов. Слева – Fc и Fab фрагменты в диссоциирующих и восстанавливающих условиях. Справа – Fc и Fab фрагменты в диссоциирующих условиях. В качетсве контроля используется IgG крысы в диссоциирующих и восстанавливающих условиях. 72 На рисунке 13 видно, что загрязняющих Fab фрагментов или IgG как в I, так и во II фракции Fc фрагментов не наблюдается. Также на рисунке 13 видно, что фракции Fc фрагментов в диссоциирующих и восстанавливающих условиях обладают одинаковой подвижностью, а в диссоциирующих условиях разной. Так в диссоциирующих условиях подвижность Fc фрагментов фракции I чуть больше подвижности тяжелых цепей IgG, а подвижность Fc фрагментов фракции II соответствует подвижности легких цепей. Этот факт наводит на мысль о том, что Fc фрагменты фракции I имеют шарнирную область. Нативный мономерный IgG крысы и его Fc фрагменты, выделенные на DEAE-целлюлозе, добавляли в качестве конкурента в тест-систему, состоящую из нагруженных IgG крысы эритроцитов и РФтнIgGэ-содержащей плазмы, которую получали от крыс иммунизированных антигенами-индукторами аутоиммунных заболеваний в модели КИА, ЭАЭ и атеросклероза. Исследовали способность вызывать торможение реакции агглютинации. Результаты реакции агглютинации танизированных нагруженных IgG эритроцитов представлены в таблице 2. Обнаружено, что только фракция I Fc фрагментов IgG крыс вызывает торможение данной реакции (таблица 2). Для определения способности мономерного IgG крысы и его Fc фрагментов индуцировать продукцию РФтнIgGэ in vivo крыс иммунизировали гомологичным нативным мономерным IgG крысы и его Fc фрагментами I и II фракции. Обнаружено, что только фракция I Fc фрагментов IgG крыс индуцирует продукцию антител, вызывающих агглютинацию танизированных, нагруженных гомологичным IgG эритроцитов, тогда как нативный мономерный IgG крысы и Fc фрагменты фракции II не способны вызывать их продукцию у крыс (рисунок 14). 73 Таблица 2 – Исследование способности различных антигенов ингибировать реакцию агглютинации танизированных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов, вызванную РФтнIgGэ-содержащей плазмой Источник РФтнIgGэсодержащей плазмы Рабочее разведение РФтнIgGэсодержащей плазмы (2-3 МАД) Антигены Fc Fc IgG крысы ЗФР фрагменты фрагменты (0,4 мг/мл) (контроль) IgG IgG крысы, крысы, фракция I фракция II (0,1 мг/мл) (0,1 мг/мл) БКII иммунизиро ванные крысы 256 - + + + чЛПНП иммунизиро ванные крысы 256 - + + + бОБМ иммунизиро ванные крысы 512 - + + + Примечание: + агглютинация, - отсутствие агглютинации Таким образом, Fc фрагменты фракции I конкурируют с ЭТIgG за связывание с РФтнIgGэ и вызывают его продукцию in vivo, мономерный IgG крыс и фракция II Fc фрагментов IgG крыс не обладают такими свойствами. Так как продукция РФтнIgGэ индуцируется Fc фрагментами, полученными папаиновым протеолизом, и не индуцируется нативным мономерным IgG, можно предполагать, что ревматоидный фактор, определяемый в тест-системе, где антигеном служат танизированные нагруженные гомологичным IgG эритроциты, специфичен к неоантигенным детерминантам, индуцируемым in vitro папаиновым протеолизом на Fc фрагменте гомологичного IgG. Факты, что только Fc 74 фрагменты фракции I, содержащие шарнирную область, но не фрагменты фракции II, не имеющие шарнира, способны вызвать продукцию РФтнIgGэ in vivo и конкурировать за связывание с РФтнIgGэ in vitro, указывают на то, что неоантигенные детерминанты для РФтнIgGэ формируются в шарнирной области гомологичного IgG. Рисунок 14 – Кинетика РФтнIgGэ в ответ на введение различных антигенов. Каждая точка представлена средним значением±SE Таким образом, РФтнIgGэ, определяемый в тест-системе, где антигеном служат танизированные нагруженные гомологичным IgG эритроциты, специфичен к Fc фрагментам гомологичного IgG, содержащим шарнирную область. 3.2.3. Сравнение специфичности РФ, определяемого в тесте агглютинации танизированных нагруженных гомологичным IgG и РФ, определяемого методом ИФА с использованием в качестве антигена IgG кролика В качестве антигена для определения РФ в научных и клинических исследованиях широко используют IgG кролика. Использование IgG кролика 75 облегчает стандартизацию тест-систем для определения РФ, так как мономерный нативный IgG кролика несет детерминанты, которые на IgG человека появляются только после тепловой агрегации [37] или связывания с антигеном [6]. Кроме того, принято считать, что специфичность теста, использующего IgG кролика для определения РФ при диагностике ревматоидного артрита человека, существенно выше, чем специфичность теста агглютинации латекса, нагруженного IgG человека [114]. Чтобы выяснить, являются РФкрIgG специфичный к IgG кролика и РФтнIgGэ специфичный к танизированным нагруженным гомологичным IgG эритроцитам (ЭТIgG) одними и теми же антителами или разными, исследовали кинетику РФ в ходе иммунного ответа, вызванного иммунизацией крыс ОБМ, а также способность IgG кролика вызывать торможение реакции агглютинации танизированных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов, вызванную РФтнIgGэ-содержащей плазмой, и продукцию РФтнIgGэ. Обнаружено, что иммунизация ОБМ у некоторых устойчивых к ЭАЭ крыс вызывает повышение уровня обоих исследуемых РФ. Однако временные максимумы образования РФ против IgG кролика и РФ против ЭТIgG не совпадают. Так, у двух крыс максимум РФ против ЭТIgG наблюдается на 7-й день после иммунизации ОБМ, тогда как РФ против IgG кролика – на 14 день (рисунок 9 А, Б), у одной крысы максимум РФ против ЭТIgG наблюдается на 21 день, а РФ против IgG кролика – на 28 день (рисунок 9 В), более того, во всех случаях кинетика исследуемых ревматоидных факторов носит реципрокный характер. Было обнаружено, что IgG кролика не вызывает торможение реакции агглютинации танизированных нагруженных IgG эритроцитов, вызванной РФтнIgGэ-содержащей плазмой, полученной от крыс иммунизированных антигенами-индукторами аутоиммунных заболеваний в модели КИА, ЭАЭ и атеросклероза (таблица 3). 76 Таблица 3 – Исследование способности IgG кролика ингибировать реакцию агглютинации танизированных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов, вызванную РФтнIgGэ-содержащей плазмой Источник РФтнIgGэсодержащей плазмы Рабочее разведение РФтнIgGэсодержащей плазмы (2-3 МАД) Антигены IgG кролика (0,4 мг/мл) ФСБ (контроль) БК иммунизированные крысы 256 + + чЛПНП иммунизированные крысы 256 + + бОБМ иммунизированные крысы 512 + + Было показано, что IgG кролика in vivo не индуцирует продукцию РФтнIgGэ в течение 14 дней после иммунизации (рисунок 15). Данные факты служат основанием утверждать, что РФкрIgG, определяемый с помощью иммуноферментного анализа, где в качестве антигена используется IgG кролика и РФтнIgGэ, определяемый методом агглютинации танизированных нагруженных гомологичным IgG – разные по специфичности популяции ревматоидного фактора. 77 Рисунок 15 – Кинетика РФтнIgGэ в ответ на введение Fc фрагментов IgG крысы, фракции I и IgG кролика. Каждая точка представлена средним значением ± SE Таким образом, взятые вместе выше изложенные факты свидетельствуют о том, что IgG кролика не несет детерминанты для РФ, определяемого в тесте агглютинации танизированных нагруженных IgG эритроцитов. Антитела против танизированных эритроцитов, то есть панагглютинины, и ревматоидный фактор, определяемый в тесте с танизированными нагруженными гомологичным IgG эритроцитами, являются сходными по специфичности антителами. Ревматоидный фактор, определяемый методом агглютинации танизированных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов, специфичен к неоантигенным детерминантам, формирующимся в шарнирной области Fc фрагментов гомологичного IgG в ходе папаинового протеолиза, и отличается по специфичности от ревматоидного фактора против IgG кролика. 78 3.3. Исследование идиотип-антиидиотипических взаимодействий между ревматоидным фактором и антителами к антигенам-индукторам аутоиммунных заболеваний Чтобы выяснить является ли ревматоидный фактор антиидиотипическими антителами по отношению к антителам против антигенов-индукторов аутоиммунных заболеваний, был проведен конкурентный ИФА (рисунок 16, рисунок 17). К паре сорбированный антиген/ плазма, содержащая антитела против антигена, добавляли РФтнIgGэ-содержащую плазму, полученную от крыс иммунизированных данным антигеном (рисунок 16, рисунок 17 А, В, Д). В качестве контроля добавляли плазму, исходно несодержавшую РФтнIgGэ и плазму истощенную от РФтнIgGэ. Ингибирование реакции связывания антиген/антитело наблюдали в присутствии РФтнIgGэ-содержащей плазмы, и не выявили в присутствии плазмы свободной от РФтнIgGэ. Данный факт показывает, что наблюдаемое ингибирование вызвано РФтнIgGэ (рисунок 16, рисунок 17). На рисунке 17 (слева) показаны результаты конкурентного ИФА при различных разведениях плазмы. Видно, что в присутствии РФтнIgGэ-содержащей плазмы снижение оптической плотности реакции связывания антител с антигеном наблюдается только в зоне, где отношение концентраций антигена, связанного с антителами, и суммарного антигена близко к 0,5, и не происходит ни в области избытка, ни в области недостатка антител по отношению к антигену. При отношении концентраций связанного с антителами антигена и суммарного антигена близком к 0,5 создаются условия для конкуренции за связывание с антителами [4]. Поэтому снижение оптической плотности на рисунке 17 А, В, Д свидетельствует о конкуренции между РФтнIgGэ-содержащей плазмой и антигеном, в ответ на иммунизацию которым она была получена. Конкурентное ингибирование реакции связывания антиген/антитело в присутствии РФтнIgGэсодержащей плазмой, полученной при иммунизации этим антигеном, указывает на наличие существование внутреннего образа антигена идиотип-антиидиотипических на РФтнIgGэ отношений и доказывает между анти-БК 79 антителами и РФтнIgGэ, полученным от крыс иммунизированных БК, между анти-чЛПНП антителами и РФтнIgGэ от ЛПНП иммунизированных крыс, и между анти-мсОБМ антителами и РФтнIgGэ от мсОБМ иммунизированных крыс. Рисунок 16 – Схема эксперимента по ингибированию специфического связывания (А) БК с анти-БК антителами, (Б) чЛПНП с анти-чЛПНП антителами, (В) мсОБМ с анти-мсОБМ антителами в присутствии РФтнIgGэ-содержащей плазмы, полученной от крыс, иммунизирвоанных мсОБМ морской свинки, БК и чЛПНП 80 Рисунок 17 – Ингибирование специфического связывания антигенаиндукотра аутоиммунных заболеваний и специфиечских к ним антител в 81 присутствии РФтнIgGэ-содержащей плазмы, полученной от крыс, иммунизирвоанных ОБМ морской свинки, БК и чЛПНП. Каждая точка представлена средним±SE. * - значения статистически значимы по отношению к контролю, р<0,05. А. Кривые титрования анти-БК плазмы, содержащей антитела к БК, в присутствии РФтнIgGэ-содержащей плазмы и не содержащей РФтнIgGэ плазмы, полученных от БК-иммунизированных крыс. В. Кривые титрования антиБК плазмы в присутствии РФтнIgGэ-содержащей плазмы и не содержащей РФтнIgGэ плазмы, полученной от крыс, иммунизированных чЛПНП, мсОБМ. С. Кривые титрования анти-чЛПНП плазмы в присутствии РФтнIgGэ-содержащей плазмы и не содержащей РФтнIgGэ сыворотки, полученных от чЛПНПиммунизированных крыс. D. Кривые титрования анти-чЛПНП плазмы в присутствии РФтнIgGэ-содержащей плазмы и не содержащей РФтнIgGэ плазмы, полученной от крыс, иммунизированных БК. E. Кривые титрования анти-мсОБМ плазмы в присутствии РФтнIgGэ-содержащей плазмы и не содержащей РФтнIgGэ сыворотки, полученных от ОБМ-иммунизированных крыс. F. Кривые титрования анти-мсОБМ плазмы в присутствии РФтнIgGэ-содержащей плазмы и не содержащей РФтнIgGэ плазмы, полученной от крыс, иммунизированных БК, чЛПНП Способность РФтнIgGэ вступать в идиотип-антиидиотипические взаимодействия с антителами разной специфичности позволяет предполагать, что РФтнIgGэ – гетерогенная по специфичности популяция антител, и РФтнIgGэ, полученный в ответ на иммунизацию одним антигеном, отличается от специфичности от РФтнIgGэ, полученного при иммунизации другим антигеном. Образцы РФтнIgGэ-содержащей плазмы, вызывающие конкуренцию, были также добавлены к разным парам антиген-антитело. Выявлено, что РФтнIgGэсодержащая плазма ингибирует связывание любой из исследованных пар антигенантитело независимо от их специфичности. Например, РФтнIgGэ-содержащая плазма полученная от крыс, иммунизированных БК ингибирует связывание античЛПНП антител с чЛПНП (рисунок 17 Г) и связывание анти-мсОБМ антител с 82 мсОБМ (рисунок 17 Е). РФтнIgGэ-содержащая плазма, полученная от крыс иммунизированных мсОБМ, ингибирует связывание анти-БК антител с БК (рисунок 17 Б). РФтнIgGэ-содержащая плазма, полученная от крыс иммунизированных чЛПНП, ингибирует связывание анти-БК антител с БК (рисунок 17 Б) и связывание анти-мсОБМ антител с мсОБМ (рисунок 17 Е). Однако характер ингибирования иной. Кривые титрования исследуемой плазмы в присутствии РФтнIgGэ-содержащей плазмы параллельно смещены вниз, т.е. ингибирование происходит при любом соотношении антиген-антитело. Такое ингибирование является неконкурентным, неспецифическим. Неспецифичное ингибирование реакции связывания антиген/антитело РФтнIgGэ-содержащей плазмы может происходить по двум причинам. Либо РФтнIgGэ связывается с Fc областью антител в составе иммунных комплексов, образующихся при анализе, либо ревматоидные факторы помимо индивидуальных специфичностей несут общий паратоп (структурно подобный паратоп), с помощью которого узнают общий идиотоп на антителах разной специфичности. Однако если бы РФтнIgGэ был способен связываться с Fc областью антител в составе иммунных комплексов, то мы не могли бы наблюдать конкурентное ингибирование реакции связывания антиген-антитело в присутствии РФ-содержащей плазмы (рисунок 17, левый столбец). Мы проверили способность плазмы, содержащей РФтнIgGэ, агглютинировать комплексы антиген-антитело - эритроциты человека/IgG антитела против эритроцитов. Плазма, содержащая РФтнIgGэ, полученная при иммунизации БК, бОБМ не вызывает агглютинацию исследуемых комплексов антиген-антитело. Поэтому неспецифическое ингибирование реакции связывания антиген/антитело, вызываемое РФтнIgGэ-содержащей плазмой, можно объяснить скорее наличием общих детерминант на антителах разной специфичности, и наличием на РФтнIgGэ разной специфичности детерминанты (рисунок 18). общего паратопа, узнающего такие 83 Рисунок 18 – Гипотетическая схема идиотип-антиидиотипических взаимодействий между ревматоидным фактором и лимфоцитами против антигенов-индукторов экспериментально вызываемых аутоиммунных заболеваний. Молекулы РФтнIgGэ имеют два типа паратопов – индивидуальный и общий. Индивидуальный паратоп уникален для каждой молекулы РФтнIgGэ, представляет собой внутренний образ антигена и служит для специфического распознавания идиотипа антиген-распознающего рецептора лимфоцита. Общий паратоп имеет сходство у всех молекул РФтнIgGэ различной специфичности. Детерминантами для общего паратопа могут служить повторяющиеся идиотопы на антиген-связывающих рецепторах различной специфичности. Детерминанты для общего паратопа РФтнIgGэ также располагаются в шарнирной области Fcфрагментов При постановке конкурентного ИФА было замечено, что не все исследуемые образцы РФтнIgGэ-содержащей плазмы подавляют реакцию 84 связывания антитела с антигеном. Развивая гипотезу о наличии общего паратопа на РФтнIgGэ, можно предположить, что общий паратоп в неоднородной популяции крыс Wistar может иметь некоторое разнообразие. Чтобы проверить это предположение был проведен сравнительный анализ ингибирующей активности РФтнIgGэ-содержащей плазмы, полученной от неродственных крыс иммунизировных чЛПНП, в отношении реакции связывания сыворотки против мсОБМ с мсОБМ. Каждый из 11 образцов РФтнIgGэ-содержащей плазмы, полученный от крыс иммунизированных чЛПНП, добавляли к паре мсОБМ/антимсОБМ плазма (рисунок 19). Для анализа использовали две анти-мсОБМ плазмы, полученные от двух разных животных (животные № 21 и № 29). Обнаружено, что 6 из 11 образцов РФтнIgGэ-содержащей плазмы ингибируют анти-мсОБМ активность анти-мсОБМ плазмы, полученной от крысы № 21 (рисунок 19А). Активность второй анти-мсОБМ плазмы, полученной от крысы № 29, ингибировалась 1 из 11 образцов РФтнIgGэ-содержащей плазмы (рисунок 19Б). Эта плазма не ингибировала активность первой анти-мсОБМ плазмы (№ 21). 4 из 11 образцов РФтнIgGэ-содержащей плазмы не ингибировали активность ни первой, ни второй анти-мсОБМ плазмы (рисунок 19). Такая ситуация, когда одна и таже РФтнIgGэ-содержащая плазма (№ 4) ингибирует активность одной анти-мсОБМ плазмы (№ 29) и не ингибирует активность другой анти-мсОБМ плазмы (№ 21), возможна в том случае, если повторяющиеся идиотопы анти-мсОБМ антител полученных от разных крыс, структурно отличаются и в одном случае способны взаимодействовать с общим паратопом РФтнIgGэ, а вдругом нет. Ситуация, когда некоторые образцы РФтнIgGэ-содержащей плазмы, полученные от разных животных, иммунизированых чЛПНП, ингибируют активность анти-мсОБМ плазмы, а другие не ингибируют активность той же антимсОБМ плазмы, возможна в том случае, когда общие паратопы молекул РФтнIgGэ структурно отличаются друг от друга. То есть в популяции 85 беспородных крыс линии Wistar существует умеренное разнообразие повторяющихся идиотопов специфических антител и общих паратопов РФтнIgGэ. Рисунок 19 – Ингибирование специфического связывания анти-мсОБМ антител с мсОБМ в присутствии РФтнIgGэ-содержащей плазмы, полученной от 86 крыс, иммунизирвоанных чЛПНП. Каждая точка представлена средним±SD. * значения статистически значимы по отношению к контролю, р<0,05. А. Кривые титрования анти-мсОБМ плазмы (№ 21) в присутствии РФтнIgGэ-содержащей плазмы и не содержащей РФтнIgGэ плазмы, полученных от чЛПНП-иммунизированных крыс. Б. Кривые титрования анти-мсОБМ плазмы (№ 29) в присутствии РФтнIgGэ-содержащей плазмы и не содержащей РФтнIgGэ плазмы, полученных от чЛПНП-иммунизированных крыс Таким образом, способность РФтнIgGэ-содержащей плазмы конкурировать с антигеном, при иммунизации которым она получена и неспецифически подавлять связывание разных пар антиген-антитело возможно, указывает на то, что РФтнIgGэ – антиидиотипические антитела, несущие индивидуальный паратоп и общий паратоп (рисунок 18). Индивидуальный паратоп РФтнIgGэ специфичен к антиген-связывающему региону антител против антигенов-индукторов экспериментально вызванных аутоиммунных заболеваний (рисунок 18). Общий паратоп узнает идиотопы сходные на антителах различной специфичности, расположенные вне антигенсвязывающего участка (рисунок 18). В популяции беспородных крыс линии Wistar существует умеренное разнообразие общих паратопов РФтнIgGэ. Исследование идиотипических маркеров РФ человека Fong и др. также показали, что идиотипические маркеры для ревматоидного фактора человека можно классифицировать на "частные" или "общие". «Частные» идиотипические маркеры представляют структурно уникальные вариабельные регионы, в то время как «общие» идиотипические маркеры отражают общие структурные особенности между РФ [44]. Идея общего паратопа на РФ представлена в соответствующих исследованиях, в которых показано, что среди ревматоидных факторов, полученных от неродственных индивидуумов, присутствует структурное сходство, в частности в κ легких цепях, так как РФ используют общие Ig гены вариабельной области [44]. 87 Факты о существовании повторяющихся идиотипов на аутоантителах разной специфичности (аутоантитела к эритроцитам, аутоантитела к ацетилхолиновому рецептору), а также на антителах против чужеродных антигенов были собраны Male [70]. В своем обзоре он обсуждает их участие в идиотипической регуляции аутореактивности. Мы предполагаем, что неоантигенные группы, появляющиеся на папаиновых Fc фрагментах IgG похожи на повторяющиеся идиотипы на Fab участках антител и РФ узнает эти детерминанты с помощью общего паратопа (рисунок 18). Не смотря на то, что анти-Fc и анти-Fab антитела, как правило, рассматриваются как отдельные популяции анти-IgG антител, было доказано, что у здоровых людей и у людей, страдающих аутоиммунными заболеваниями, есть популяции анти-IgG-антител с двойной специфичностью – как с анти-Fab, так и с анти-Fc специфичностью [56]. Способность РФ, определяемого в тесте агглютинации танизированных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов, связываться как с Fab фрагментами антител разной специфичности, так и с детерминантами на папаиновых Fc фрагментах, позволяют назвать РФ аутоантителами с двойной специфичностью. Таким образом ревматоидный фактор, определяемый методом агглютинации танизированных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов, конкурирует с антигеном, при иммунизации которым он получен, и неспецифически подавляет связывание разных пар антиген-антитело. Данный факт указывает на то, что исследуемый ревматоидный фактор – антиидиотипические антитела, несущие индивидуальный паратоп, служащий для узнавания антигенсвязывающего участка антител, и общий паратоп, который может быть специфичен к повторяющимся идиотопам на антителах разной специфичности. 88 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Аутоиммунные заболевания – патологические процессы, основанные на самоподдерживающемся иммунном ответе против собственных антигенов организма, возникающем в результате нарушения механизмов естественной толерантности. Аутоиммунные заболевания широко распространены, представлены спектром нозологических форм и на сегодняшний день относятся к числу неизлечимых, поскольку механизмы формирования и поддержания естественной толерантности остаются до конца не известны. Достаточно длительное время в вопросе о механизмах аутотолерантности классическая иммунология придерживалась представлений о том, что Тлимфоциты специфичные к собственным антигенам подвергаются делеции в тимусе, а аутореактивные В-лимфоциты, оставшись без помощи Т-лимфоцитов, переходят в состояние анергии. В настоящее время факт, что аутореактивные Т- и В-лимфоциты присутствуют в здоровом организме, имеют доступ к соответствующим антигенам и проявляют активность в рамках физиологической нормы, становится общепризнанным. Не смотря на отсутствие полного знания о механизмах естественной толерантности, ясно, что причиной агрессивного характера аутоиммунных реакций является нарушения механизмов регуляции экспансии аутореактивных лимфоцитов. Первые представления о механизмах негативной регуляции аутореактивных лимфоцитов появились в работах Эрлиха и Бернета и развивались в двух направлениях. Одно из них было сосредоточено на поиске специальной популяции клеток, обеспечивающей негативный контроль аутореактивности. Представления о таких клетках прошли путь от «вето» клеток к Т-супрессорам и Т-регуляторным клеткам. Несмотря на выдающиеся достижения в этом направлении, сегодня мы имеем больше вопросов, чем ответов. Полученные знания не привели к разработке лекарственных средств для лечения аутоиммунных заболеваний, действие которых направлено на Т-регуляторные клетки. 89 Другой подход был основан на идее осуществовании сети лимфоцитов (иммунной сети), основанной на идиотип-антиидиотипических взаимодействиях, которая сама, как система, обеспечивает негативный контроль лимфоцитов [57]. Для узнавания лимфоцита, как объекта регуляции, в иммунной сети используется уникальный для каждого лимфоцита идиотип антиген-распознающего рецептора, поэтому иммунная сеть обеспечивает избирательность (специфичность) регуляции. Способность иммунной сети обеспечить специфичность регуляции иммунного ответа притягивает внимание ученых к ней, как механизму регуляции. Теория Ерне получила бурное развитие в 80-90-е годы двадцатого века, когда были получены экспериментальные доказательства существования иммунной сети, ее роли в регуляции аутореактивных лимфоцитов, раскрыты некоторые закономерности ее функционирования. Однако иммунная сеть – сложный для изучения объект, механизмы организации и функционирования иммунной сети остались до конца не выяснены. Сегодня наблюдается ренесанс в исследованиях иммунной сети [13, 99]. Важный принцип идиотипической регуляции состоит в том, что активность идиотипических лимфоцитов регулируется продуктами активности связанных с ними антиидиотипических лимфоцитов по принципу обратной связи. Среди продуктов активности антиидиотипических лимфоцитов потенциальными факторами регуляции, которые могут изменить активность идиотипических лимфоцитов, являются индуцибельные мембраносвязанные молекулы, цитокины и антитела. Цитокины действуют локально, для реализации их эффекта требуется тесный контакт между лимфоцитами. Реализация эффектов через мембраносвязанные молекулы также требует межклеточного взаимодействия. Кроме того, цитокины действуют неспецифично. Регуляция посредством антиидиотипических расположенных антител лимфоцитов. решает проблему Поэтому контроля регуляторная отдаленно активность антиидиотипических лимфоцитов в отношении идиотипических лимфоцитов по 90 принципу обратной связи в большей степени должна реализоваться антиидиотипическими антителами. Анализ литературы показал, что важным компонентом иммунной сети являются лимфоциты, продуцирующие ревматоидный фактор. Ревматоидный фактор вступает в идиотип-антиидиотипические взаимодействия с аутореактивными лимфоцитами различной специфичности [63, 82], а также с лимфоцитами и антителами к белкам условно-патогенных бактерий и вирусов [46, 58, 74, 78]. Есть данные, что ревматоидный фактор, по крайней мере, некоторые его популяции, получившие название физиологический ревматоидный фактор, участвуют в иммунорегуляции [20, 82, 105]. На основании этих данных мы предположили, что лимфоциты, продуцирующие ревматоидный фактор, участвуют в регуляции активности как аутореактивных лимфоцитов, так и лимфоцитов против антигенов-индукторов аутоиммунных заболеваний посредством идиотип-антиидиотипических взаимодействий с ними. Чтобы проверить гипотезу, был проведен сравнительный анализ продукции популяций ревматоидного фактора у чувствительных и резистентных к индуцируемым аутоиммунным заболеваниям крыс. Были выбраны три экспериментальные модели аутоиммунных заболеваний: экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит крыс, вызванный иммунизацией основным белком миелина морской свинки в полном адъюванте Фрейнда, коллагениндуцированный артрит крыс, вызванный иммунизацией бычьим коллагеном в неполном адъюванте Фрейнда, атеросклероз крыс, вызванный иммунизацией липопротеинами низкой плотности человека в неполном адъюванте Фрейнда. Для моделирования аутоиммунных соответствующим заболеваний антигеном-индуктором крыс Wistar однократно иммунизировали внутрикожно. иммунизации еженедельно, в течение 10 недель в моделях индуцированного крыс артрита и экспериментального После коллаген- аутоиммунного энцефаломиелита крыс и 16 недель в модели атеросклероза в плазме крови 91 определяли титр антител против антигенов-индукторов экспериментально вызываемых аутоиммунных заболеваний с помощью иммуноферментного анализа, титр популяции ревматоидного фактора с помощью метода агглютинации танизированных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов (РФтнIgGэ) и титр популяции ревматоидного фактора с помощью метода иммуноферментного анализа, где в качестве антигена использовали IgG кролика (РФкрIgG). В ходе исследования обнаружили, что устойчивость к развитию аутоиммунного заболевания в моделях коллаген-индуцированного артрита крыс, экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, атеросклероза крыс ассоциирована с интенсивной продукцией РФтнIgGэ, опережающей продукцию антител к антигену-индуктору аутоиммунного заболевания, тогда как отсутствие продукции РФтнIgGэ в ранний период иммунного ответа связано с чувствительностью крыс к развитию аутоиммунных заболеваний, индуцируемых чужеродными некоторых антигенами-индукторами не атеросклерозу чувствительных животных, к аутоиммунных заболеваний. коллаген-индуцируемому устойчивость к развитию артриту У и соответствующего аутоиммунного заболевания связана с продукцией РФкрIgG вместо РФтнIgGэ, у некоторых не чувствительных к экспериментальному аутоиммунному энцефаломиелиту крыс - с последовательной продукцией обеих популяций ревматоидного фактора. Ремиссия экспериментально вызванных аутоиммунных заболеваний и завершение иммунного ответа против антигенов-индукторов аутоиммунных заболеваний также связаны с повышением уровня РФтнIgGэ. Полученные факты позволяют рассматривать исследованные популяции ревматоидного фактора как универсальный фактор регуляции продукции антител к антигенам индукторам аутоиммунных заболеваний, предотвращающий развитие аутоиммунных заболеваний. Популяция ревматоидного фактора, определяемая методом агглютинации танизированных эритроцитов, ведущей является в нагруженных гомологичным IgG регуляции. Отсутствие продукции 92 исследованных популяций ревматоидного фактора - РФтнIgGэ и РФкрIgG в период индукции иммунного ответа (7 день после иммунизации антигенамииндукторами аутоиммунных заболеваний) может рассматриваться как предиктор последующей манифестации экспериментально вызванных аутоиммунных заболеваний. Анализ иммунного ответа, осуществляемого с участием ревматоидного фактора, показал, что на фоне продукции ревматоидного фактора все же развивается полноценный нормальный иммунный ответ. Данный факт свидетельствует о том, что ревматоидный фактор не полностью угнетает регулируемые им лимфоциты, ревматоидный фактор работает по принципу сдерживания агрессивной экспансии лимфоцитов, активированных антигеном. Чтобы выяснить является ли ревматоидный фактор, выявляемый методом агглютинации танизированных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов, антиидиотипическими антителами по отношению к антителам против антигеновиндукторов экспериментально вызываемых аутоиммунных заболеваний, была исследована способность сывороток, содержащих ревматоидный фактор, конкурировать с данными антигенами за связывание с антителами к ним. С помощью метода конкурентного иммуноферментного анализа было обнаружено, что ревматоидный фактор, определяемый методом агглютинации танизированных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов, конкурирует с антигеном, при иммунизации которым он получен, и неспецифически подавляет связывание разных пар антиген-антитело. Данный факт указывает на то, что исследуемый ревматоидный фактор – антиидиотипические антитела, несущие индивидуальный паратоп, служащий для узнавания антигенсвязывающего участка антител, и общий паратоп, который может быть специфичен к повторяющимся идиотопам на антителах разной специфичности. Таким образом, ревматоидный фактор, определяемый в тесте агглютинации танизированных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов, осуществляет негативную регуляцию активности 93 лимфоцитов, специфичных к антигенам-индукторам аутоиммунных заболеваний посредством идиотип-антиидиотипических взаимодействий с ними. Выявленная ассоциация между интенсивной продукцией ревматоидного фактора в период инициации иммунного ответа и устойчивостью к развитию аутоиммунного заболевания в нескольких экспериментальных моделях позволяет обозначить лимфоциты, продуцирующие РФ как потенциальную биологическую мишень для разработки новых лекарственных средств лечения широкого спектра аутоиммунных заболеваний. В ходе настоящего исследования сделан важный шаг в данном направлении - выяснена специфичность общего паратопа ревматоидного фактора, выявляемого методом агглютинации танизированных нагруженных IgG эритроцитов (РФтнIgGэ). Анализ способности мономерного нативного IgG крысы и его фрагментов вызывать продукцию РФтнIgGэ у интактных крыс и ингибировать агглютинацию танизированных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов, вызванную РФтнIgGэ-содержащей плазмой, показал, что общий паратоп популяции молекул РФтнIgGэ специфичен к неоантигенным детерминантам, формирующимся в шарнирной области Fc фрагментов гомологичного IgG в ходе папаинового протеолиза. Таким образом, полученные результаты дают основание рассматривать папаиновые Fc фрагменты гомологичного IgG, содержащие шарнирную область, в качестве действующего начала лекарственного средства для лечения широкого спектра аутоиммунных заболеваний. Новые знания аутореактивности, о ревматоидном служат основой факторе для как пересмотра, факторе ставших регуляции догмой, представлений о ревматоидном факторе как артритогенном факторе. Как минимум некоторые популяции в группе антител, называемых ревматоидным фактором, являются фактором нормальной регуляции иммунного ответа, а их высокий уровень, наблюдаемый при артрите, – следствие нарушения в системе регуляции аутореактивности. 94 ВЫВОДЫ 1. Устойчивость к развитию коллаген-индуцированного артрита, экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита и атеросклероза крыс ассоциирована с интенсивной продукцией ревматоидного фактора в период индукция иммунного ответа, тогда как отсутствие его продукции в этот период ведет к манифестации аутоиммунных заболеваний. Ремиссия экспериментально вызванных аутоиммунных заболеваний и завершение иммунного ответа у устойчивых к аутоиммунным заболеваниям животных также связаны с повышением уровня ревматоидного фактора. 2. Ревматоидный фактор, определяемый методом агглютинации танизированных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов, специфичен к неоантигенным детерминантам, формирующимся в шарнирной области Fc фрагментов гомологичного IgG в ходе папаинового протеолиза, и отличается по специфичности от ревматоидного фактора против IgG кролика. 3. Ревматоидный фактор, определяемый методом агглютинации танизированных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов, конкурирует с антигеном, при иммунизации которым он получен, и неспецифически подавляет связывание разных пар антиген-антитело. Данный факт указывает на то, что исследуемый ревматоидный фактор – антиидиотипические антитела, несущие индивидуальный паратоп, служащий для узнавания антигенсвязывающего участка антител, и общий паратоп, который может быть специфичен к повторяющимся идиотопам на антителах разной специфичности. 95 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ АИЗ – аутоиммунные заболевания АИР – аутоиммунные реакции АПК – антигенпрезентирующие клетки БК – нативный бычий назальный коллаген II типа БСА – бычий сывороточный альбумин ВПГ-1 – вирус простого герпеса первого типа ВГЧ-6 – герпесвирус человека шестого типа ВЭБ – вирус Эпштейна-Барр ГА – глутаровый альдегид ЗФР – забуференный физиологический раствор ИАИ – идиотип-антиидиотипические взаимодействия ИФА – иммуноферментный анализ КИА - коллагениндуцированный артрит КК – крысиный коллаген МАД – минимальная агглютинирующая доза МАТ - моноклональные антитела НАФ – неполный адъвант Фрейнда чЛПНП – человеческие нативные липопротеины низкой плотности ОБМ – основный белок миелина ОП – оптическая плотность 96 ОФД – о-фенилендиамин ПАФ – полный адъювант Фрейнда РА - ревматоидный артрит РАЭ – реакция агглютинации эритроцитов РС – рассеянный склероз РТГА – реакция торможения гемагглютинации РФ – ревматоидный фактор РФтнIgGэ – популяция ревматоидного фактора, определяемая методом агглютинации танизированных нагруженных гомологичным IgG эритроцитов РФкрIgG – популяция ревматоидного фактора, определяемая методом ИФА, с использованием в качестве антигена IgG кролика ЦИК – циркулирующие иммунные комплексы ЧСА – человеческий сывороточный альбумин ЭАЭ – экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит ЭБ – эритроциты барана IgG – иммуноглобулин G CRI – перекрестно-реагирующие идиотипы SPA –белок A стафилококка 97 Литература 1. Антитела. Методы / Под ред. Д. Кэтти. – М.: Мир, 1991. – Книга 1. – 259 с. 2. Гланц С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. – M., Практика, 1999. – 459 с. 3. Голод И.С. О факторе, агглютинирующем танизированные эритроциты / И.С. Голод // Лабораторное дело. – 1969. – № 11. – С. 676 – 677. 4. Иммунология / Под ред. У. Пола. – М.: Мир, 1989. – Т. 3. – 360 с. 5. Кожанова С.В. Современные представления о механизмах центральной и периферической толерантности / С.В. Кожанова, Б.Б. Бижигитова, Г.Т. Балпанова // Вестник КАЗНМУ. – 2011. – № 3. – С. 104 – 108. 6. Кульберг А.Я. Антииммуноглобулины / А.Я. Кульберг. – М.: Медицина, 1978. – 182 с. 7. Меньшиков вызванного И.В. Экспериментальная иммунизацией нативными модель атеросклероза липопротеинами человека у крыс, / И.В. Меньшиков, К.В. Фомина, Л.В. Бедулева и др. // Вестник Удмуртского университета. – 2012. – № 1. – С. 80 – 86. 8. Хлюстов В.Н. Количественное определение аутоантител к липопротеинам низкой плотности / В.Н. Хлюстов // Клиническая лабораторная диагностика. – 1999. – № 4. – С. 17 – 20. 9. Abdou, N.I. Network theory in autoimmunity. In vitro suppression of serum antidna antibody binding to dna by anti-idiotypic antibody in systemic lupus erythematosus / N.I. Abdou, H. Wall, H.B. Lindsley et al. // J. Clin. Invest. – 1981. – Vol. 67, № 5. – P. 1297–1304. 10. Avrameas, S. Natural autoantibodies: from 'horror autotoxicus' to 'gnothi eauton' / S. Avrameas // Immunology Today. – 1991. – Vol. 12, № 5. – P. 154 – 159. 11. Banchuin, N. Re-Evalution of ELISA and latex agglutination test for rheumatoid factor detection in the diagnosis of rheumatoid arthritis / N. Banchuin, K. Janyapoon, S. Sarntivijai et al. // Asian Pacific Journal of Allergy and Immunology. – 1992. – Vol. 10, № 1. – P. 47 – 54. 98 12. Bas, S. Comparative study of different enzyme immunoassays for measurement of IgM and IgA rheumatoid factors / S. Bas, T.V. Perneger, E. Kunzle et al. // Annals of the Rheumatic Diseases. – 2002. – Vol. 61, № 6. – P. 505 – 510. 13. Behn, U. Idiotypic networks: toward a renaissance? / U. Behn // Immunological Reviews. – 2007. - Vol. 216. – P. 142–152. 14. Bernhard, G.C. The reaction of rheumatoid factor and complement with γ-globulin coated latex / G.C. Bernhard, W. Cheng, D.W. Talmage // Journal of Immunology. – 1962. – Vol. 88, № 6. – P. 750 – 762. 15. Bettelli, E. Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells / E. Bettelli , Y .Carrier, W. Gao et al. // Nature. – 2006. – Vol. 441. – P. 235 – 238. 16. Brown, E.J. Neoantigens appear in human IgG upon antigen binding: detection by antibodies that react specifically with antigen-bound IgG / E.J. Brown, J. Bekisz // Journal of Immunology. – 1984. – Vol. 132, № 3. – P. 1346-1352. 17. Calenbuhr, V. Natural Tolerance in a Simple Immune Network / V. Calenbuhr, H. Bersini, J. Stewart et al. // J. Theor. Biol. – 1995. – Vol. 177, № 3. – P. 199 – 213. 18. Calkins, C.E. Evidence for regulation of the autoimmune anti-erythrocyte response by idiotype-specific suppressor T cells in NZB mice / C.E. Calkins, S.A. Cochran, R.D Miller // Int. Immunol. – 1990. – Vol. 2, № 2. – P. 127–133. 19. Carneiro, J. A model of the immune network with B-T cell co-operation. II--The simulation of ontogenesis / J. Carneiro, A. Coutinho, J. Stewart // J. Theor. Biol. – 1996. – Vol. 182, № 4. – P. 531-547. 20. Carson, D. A. Physiology and pathology of rheumatoid factors / D.A. Carson, J-L. Pasquali // Springer Semin Immunopathol. – 1981. – Vol. 4, № 2. – P. 161 – 179. 21. Carson, D.A. A common idiotope on human rheumatoid factors identified by a hybridoma antibody / D.A. Carson , S. Fong // Mol. Immunol. – 1983. – Vol. 20, № 10. – P. 1080 – 1087. 22. Carson, D.A. Rheumatoid factor and immune networks / D.A. Carson, P.P. Chen, R.I. Fox et al. //Annu. Rev. Immunol. – 1987. – Vol. 5. – P. 109 – 126. 99 23. Chatenoud, L. Suppressor T cells – they're back and critical for regulation of autoimmunity / L. Chatenoud, B. Salomon, J.A. Bluestone // Immunol. Rev. – 2001. – Vol. 182. – P. 149 – 163. 24. Chen, P.P. Characterization of human rheumatoid factor with seven antiidiotypes induced by synthetic hypervariable region peptides / P.P. Chen, F. Goni, R.A. Houghten et al. // Exp. Med. – 1985. – Vol. 162, № 2. – P. 487 – 500. 25. Christensen, T. Association of human endogenous retroviruses with multiple sclerosis and possible interactions with herpes viruses / T. Christensen // Rev. Med. Virol. – 2005. – Vol. 15, № 3. – P. 179 – 211. 26. Coenen, J.J.A. Rapamycin, and not cyclosporin A, preserves the highly suppressive D27+ subset of human CD4+CD25+ regulatory T cells / J.J.A. Coenen, H.J.P.M. Koenen, E. Van Rijssen et al. // Blood. – 2006. – Vol. 107, № 3. – P. 1018 – 1023. 27. Cohen, P. L. Anti-idiotypic antibodies to the coombs antibody in nzb fx mice / P.L. Cohen, R.A. Eisenberg // J. Exp. Med. – 1982. – Vol. 156, № 1. – P. 173-180. 28. Corper, A.L. Structure of human IgM rheumatoid factor Fab bound to its autoantigen IgG Fc reveals a novel topology of antibody-antigen interaction / A.L. Corper, M.K. Sohi, V.R. Bonagura et al. // Nat. Struct. Biol. – 1997. – Vol. 4, № 5. – P. 374-381. 29. Corrigall, V.M. Autoantigens and immune pathways in rheumatoid arthritis / V.M. Corrigall, G.S. Panayi // Crit. Rev. Immunol. – 2002. – Vol. 22, № 4. – P. 281-293. 30. Coulie, P. Rheumatoid factors and secondary immune responses in the mouse. II. Incidence, kinetics and induction mechanisms / P. Coulie, J. Van Snick // Eur. J. Immunol. – 1983. – Vol. 13, № 11. – P. 895–899. 31. Coulie, P. Rheumatoid factor (RF) production during anamnestic immune responses in the mouse. III. Activation of RF precursor cells is induced by their interaction with immune complexes and carrierspecific helper T cells / P. Coulie, J. Van Snick // J. Exp. Med. – 1985. – Vol. 161, № 1. – P. 88–97. 100 32. Coutinho, A. Selection of lymphocyte repertoires: the limits of clonal versus network organization / A. Coutinho, A. Bandeira, P. Pereira // Cold. Sring. Harb. Symb Quan. Boil. – 1989. – Vol. 54. – P. 159 – 170. 33. Coutinho, A. Natural autoantibodies / A. Coutinho, M.D. Kazatchkine, S. Avrameas // Current Opinion in Immunology. – 1995. – Vol. 7, № 6. – P. 812 – 818. 34. Coutinho, A. Will the idiotypic network helps to solve natural tolerance? / A. Coutinho // Trends. Immunol. – 2003. – Vol. 24, № 2. – P. 53 – 54. 35. Crowley, J.J. Incidence of three cross-reactive idiotypes on human rheumatoid factor paraproteins / J.J. Crowley, R.D. Goldfien, R.E. Schrohenloher et al. // J. Immunol. – 1988. – Vol. 140, № 10. – P. 3411 – 3418. 36. Cuzzocrea, S. Cloricromene, a coumarine derivative, protects against collageninduced arthritis in Lewis rats / S. Cuzzocrea, E. Mazzon, C. Bevilaqua et al. // British Journal of Pharmacology – 2000. – Vol. 131, № 7. – P. 1399 – 1407. 37. Dissanayake, S. The binding constants of IgM rheumatoid factors and their univalent fragments for native and aggregated human IgG / S. Dissanayake, F.C. Hay, I.M. Roitt // Immunoligy. – 1977. – Vol. 32, № 3. – P. 309 – 318. 38. Dwyer, D.S. Naturally occurring anti-idiotypic antibodies in myasthenia gravis patients / D.S. Dwyer, R.J. Bradley, C.K. Urquhart et al. // Nature. – 1983. – Vol. 301. – P. 611 – 614. 39. Edelman, G. M. Interaction of the rheumatoid factor with antigen-antibody complexes and aggregated gamma globulin / G.M. Edelman, H.G. Kunkel, E.C. Franklin // J. Exp. Med. – 1958. – Vol. 108, № 1. – P. 105–120. 40. Ezaki, I. Human monoclonal rheumatoid factors augment arthritis in mice by the activation of T cells / I. Ezaki, M. Okada, Y. Yoshikawa et al. // Clin. Exp. Immunol. – 1996. – Vol. 104, № 3. – P. 474 – 482. 41. Firestein, G. S. Etiology and Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis / G.S. Firestein, R.C. Budd, S.E Gabriel et al. // Kelley's Textbook of Rheumatology. – Elsevier Inc., 2013. – P. 1036 – 1086. 101 42. Fong, S. Rheumatoid factors in autoimmune disease: their origin, development and function. / S. Fong, P.P. Chen, R.I. Fox et al. // Pathol. Immunopathol. Res. – 1986. – Vol. 5, № 3-5. – P. 305-316. 43. Fong, S. Idiotypes and the structural diversity of human rheumatoid factors / S. Fong, P.P. Chen, J.J. Crowley et al. // Springer Semin. Immunopathol. – 1988. – Vol. 10, № 2-3 – P. 189–201. 44. Fong, S. Idiotypic characteristics of rheumatoid factors / S. Fong, P.P. Chen, J.J. Crowley et al. // J. Clin. Invest. – 1988. – Vol. 75. – P. 58 – 65. 45. Friedman, H. M. Immune evasion by herpes simplex virus type 1, strategies for virus survival / H.M. Friedman // Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. – 2003. – Vol. 114. – P. 103-112. 46. Grabar, P. Autoantibodies and the physiological role of immunoglobulins / P. Grabar // Immunology Today. – 1983. – Vol. 4. – P. 337 – 340. 47. Haberman, A.M. Rheumatoid Factors in Health and Disease: Structure, Function, Induction and Regulation / A.M. Haberman, J. William, C. Euler et al. // Curr. Dir. Autoimmun. Basel, Karger. – 2003. – Vol 6. – P. 169–195. 48. Halldórsdóttir, H. D. A prospective study on the incidence of rheumatoid arthritis among people with persistent increase of rheumatoid factor / H.D. Halldórsdóttir, T. Jónsson, J. Thorsteinsson et al. // Ann. Rheum. Dis. – 2000. – Vol. 59, № 2. – P. 149 – 151. 49. Hamada, T. Suppression of adjuvant arthritis of rats by a novel matrix metalloproteinase-inhibitor / T. Hamada, N. Arima, M. Shindo et al. // British Journal of Pharmacology – 2000 – Vol. 131, № 8. – P. 1513 – 1520. 50. Hay, F.C. Anti-globulins and circulating complexes in early rheumatoid arthritis / F.C. Hay, A. Young, M.G. Jones et al. // Clin. exp. Immunol. – 1983. – Vol. 54, № 3. – P. 723 – 730. 51. Henney, C. S. The Reactivity of Rheumatoid Factor with Human Gamma G Globulin / C.S. Henney, D.R. Stanworth // Immunology. – 1965. – Vol. 9, № 2. – P. 139 – 150. 102 52. Hoffman, G.W. The T cell receptor and AIDS pathogenesis / G.W. Hoffman // Scand. J. Immunol. – 1995. – Vol. 41, № 4. – P. 331 – 337. 53. Holmdahl, R. Collagen induced arthritis: an experimental model for rheumatoid arthritis with involvement of both DTH and immune complex mediated mechanisms / R. Holmdahl, J. Mo, C. Nordling et al. // Clin. Exp. Rheumatol. – 1989. – Vol. 7. – P. 51 – 55. 54. Hubinon, P.O. Production of an agglutinating auto-antibody (panagglutinin) active upon tanned erythrocytes in the rabbit / P.O. Hubinon, P. Ghysdael, O. Thys // Nature. – 1959. – Vol. 184. – P. 1250 – 1251. 55. Hunneyball, I. M. The effects of chemical modification on the antigenicity of human and rabbit immunoglobulin G / I.M. Hunneyball, D.R. Stanworth // Immunology. – 1976. – Vol. 30, № 6. – P. 881 – 894. 56. Hunt Gerardo, S. Human IgG anti-F(ab’)2 antibodies possess rheumatoid factor activity / S. Hunt Gerardo, J.E. Persselin, R.H. Stevens // Clin. Exp. Immunol. – 1990. – Vol. 81, № 2. – P. 293 – 300. 57. Jerne, N.K. Towards a network theory of the immune system / N.K. Jerne // Ann. Immunol. – 1974. – Vol. 125. – P. 373 – 389. 58. Johnson, P.M. Idiotypic interactions between rheumatoid factor and other antibodies / P.M. Johnson, H.B. Smalley // Scand. J. Rheumatol. Suppl. – 1998. – Vol. 75. – P. 93 – 96. 59. Karsh, J. Quantitative determination of rheumatoid factor by an enzyme labeled immunoassay / J. Karsh, S.P. Halbert, E. Klima et al. // J. Immunol. Methotds. – 1980. – Vol. 32, № 2. – P. 115 – 126. 60. Kessel, A. Human CD19+CD25high B regulatory cells suppress proliferation of CD4+ T cells and enhance Foxp3 and CTLA-4 expression in T-regulatory cells / A. Kessel, T. Haj, R. Per et al. // Autoimmunity Reviews. – 2012. – Vol. 11, № 9. – P. 670 – 677. 61. Kleveland, G. Quantitation of rheumatoid factors (RS) of IgM, IgA and IgG isotypes by a simple and sensitive ELISA. Discrimination between false and true IgG- 103 RF / G. Kleveland, T. Egeland, T. Lea // Scand. J. Rheumatol. Suppl. – 1988. – Vol. 75. – P. 15-24. 62. Kohm, A.P. Cutting edge: CD4+CD25+ regulatory T cells suppress antigen-specific autoreactive immune responses and central nervous system inflammation during active experimental autoimmune encephalomyelitis / A.P. Kohm, P.A. Carpentier, H.A. Anger et al. // J. Immunol. – 2002. – Vol. 169, № 9. – P. 4712 – 4716. 63. Kojima, K. Crossreaction of monoclonal antiidiotypic antibodies specific for human antithyroglobulin antibody with the Fc portion of human IgG / K. Kojima , T. Yamada, S. Ohgaki et al. // J. Rheumatol. – 1988. – Vol. 15, № 4. – P. 587 – 592. 64. Koritschoner, R.S. Induktion von Paralyse und Rückenmarksentzündung durch Immunisierung von Kaninchen mit menschlichem Rückenmarksgewebe / R.S. Koritschoner, F. Schweinburg // Z. Immunitätsf Exp. Therapie. – 1925. – Vol. 42. – P. 17 – 83. 65. Kouri, T. Occurrence of two germline-related rheumatoid factor idiotypes in rheumatoid arthritis and in non-rheumatoid seropositive individuals / T.Kouri, J. Crowley, K. Ahot et al. // Clin. exp. Immunol. – 1990. – Vol. 82, № 2. – P. 250 – 256. 66. Lefvert, A.K. Anti-idiotypic аntibodies, acetylcholine receptor antibodies and disturbed neuromuscular function in healthy relatives to patients with myasthenia gravis / A.K. Lefvert, R. Pirskanen, E. Svanborg // J. of Neuroimmunology. – 1985. – Vol. 9. – P. 41 – 53. 67. Leon, K. Natural and induced tolerance in an immune network model / K. Leon, J. Carneiro, R. Perez // J. Teor. Biol. – 1998. – Vol.193. – P. 519 – 534. 68. Levinson, A.I. Staphylococcus aureus Cowan I. Potent stimulus of immunoglobulin M rheumatoid factor production / A.I. Levinson, L. Tar, C. Carafa et al. // J. Clin. Invest. – 1986. – Vol. 78, № 3. – P. 612 – 617. 69. Mageed, R.A. Molecular and cellular aspects of human rheumatoid factor production and idiotypes / R.A. Mageed, S.P. Moyes, K.M. Thompson et al. // Idiotypes in Medicine: Autoimmunity, Infection and Cancer. – Elsevier S., 1997. – Р. 135 – 155. 104 70. Male, D.K. Idiotypes and autoimmunity / D.K. Male // Clin. Exp. Immunol. – 1986. – Vol. 65, № 1. – P. 1–9. 71. Mannie, M. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in the Rat / M. Mannie, R.H. Swanborg, J.A. Stepaniak // Curr. Protoc. Immunol. – 2009. – doi: 10.1002/0471142735.im1502s85. 72. Mannik, M. Rheumatoid factors in the pathogenesis of rheumatoid arthritis / M. Mannik // J. Rheumatol. Suppl. – 1992. – Vol. 32. – P. 46 – 49. 73. March, R.E. The specificity of human autoantibodies to IgG: the development of methodology for measuring the specificity of antiglobulin isotypes in rheumatoid and normal sera // R.E. March, V.R. Winrow, E.J. Holborow // Rheumatol. Int. – 1986. – Vol. 6, № 6. – P. 155 – 160. 74. McCormick, J.N. Do polyclonal rheumatoid factors carry an 'internal image' of cytomegalovirus, Epstein-Barr virus and nuclear antigens? / J.N. McCormick, D. Wojtacha, Е. Edmond et al. // Scandinavian Journal of Rheumatology. – 1988. – Vol. 75. – P. 109 – 116. 75. Mitra-Kaushik, S. Idiotype and antigen-specific T cell responses in mice on immunization with antigen, antibody, and anti-idiotypic antibody / S. Mitra-Kaushik, M.S. Shaila, A.K. Karande // Cell Immunol. – 2001. – Vol. 209, № 2. – P. 109 – 119. 76. Moore ,T.L. Rheumatoid Factors / T.L. Moore, R.W. Dorner // Clin. Biochern. – 1993. – Vol. 26, № 2. – P. 75 – 84. 77. Nardella, F.A. IgG rheumatoid factors and staphylococcal protein A bind to a common molecular site on IgG / F.A. Nardella, D.C. Teller, C.V. Barber et al. // J. Exp. Med. – 1985. – Vol. 162, № 6. – P. 18111 – 824. 78. Nardella, F.A. Fc epitopes for human rheumatoid factors and the relationships of rheumatoid factors to the Fc binding proteins of microorganisms / F.A. Nardella, I.R. Oppliger, G.C. Stone et al. // Scand. J. Rheumatol. Suppl. – 1988. – Vol. 75. – P. 190 – 198. 105 79. Natvig, J.B. IgG antigens of the Сγ2 and Сγ3 homology regions interacting with rheumatoid factors / J.B. Natvig, P.I. Gaarder, M.W. Turner // Clin. exp. Immunol. – 1972. – Vol. 12, № 2. – P. 177 – 184. 80. Newkirk, M.M. Rheumatoid factors: host resistance or autoimmunity / M.M. Newkirk // Clinical immunology. – 2002. Vol. 104, № 1. – P. 1 – 13. 81. Nitsche-Schmitz, D.P. Group G Streptococcal IgG Binding Molecules FOG and Protein G Have Different Impacts on Opsonization by C1q / D.P. Nitsche-Schmitz, M. Johansson, I. Sastalla et al. // The Journal of Biological Chemistry. – 2007. – Vol. 282, № 24. – P. 17530 – 17536. 82. Nordling, C. A monoclonal antiidiotypic antibody with rheumatoid factor activity defines a cross-reactive idiotope on murine anticollagen antibodies / C. Nordling, R. Holmdahl, L. Klareskog // The Journal of Immunology. – 1991. – Vol. 146, № 12. – P. 4258 – 4263. 83. Oppliger, R. Human rheumatoid factors bear the internal image of the Fc binding region of staphylococcal protein A / R. Oppliger, F.A. Nardella, G.C. Stone // J. Exp. Med. – 1987. – Vol. 166, № 3. – P. 702 – 710 84. Oreskes, I. Reactivity of sized thermal aggregates of immunoglobulin G with IgM rheumatoid factor / I. Oreskes, D. Mandel // Immunology. – 1984. – Vol. 51, № 1. – P. 115 – 121. 85. Ota, T. Present status and problems with rheumatoid factor as a laboratory test / T. Ota // Rinsho Byori. – 2003. – Vol. 51, № 7. – P. 649 – 655. 86. Paul-Clark, M. Potent antiarthritic properties of a glucocorticoid derivative, NCX1015, in an experimental model of arthritis / M. Paul-Clark, L. Mancini, P. Del Soldato et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. – 2002. – Vol. 99, № 3. – P. 1677–1682. 87. Pawate, S. The role of infections in the pathogenesis and course of multiple sclerosis / S. Pawate, S. Sriram // Ann. Indian. Acad. Neurol. – 2010. – Vol. 13, № 2. – P. 80 – 86. 88. Posnett, D. N. When Do Microbes Stimulate Rheumatoid Factor? / D.N. Posnett, J. Edinger // J. Exp. Med. – 1997. – Vol. 185, № 10. – P. 1721–1723. 106 89. Prohászka, Z. Chaperones as part of immune networks / Z. Prohászka //Adv. Exp. Med. Biol. – 2007. – Vol. 594. – P. 159 – 166. 90. Puente, A. The incidence of rheumatoid arthritis is predicted by rheumatoid factor titer in a longitudinal population study / A. Puente, W.C. Knowler, D.J. Pettitt et al. // Arthritis and Rheumatism. – 1988. – Vol. 31, № 10. – P. 1239 – 1244. 91. Radoux, V. A conserved human germline Vκ gene directly encodes rheumatoid factor light chains / V. Radoux, P.P. Chen, J.A. Sorge et al. // J. Exp. Med. – 1986. – Vol. 164. – P. 2119 – 2124. 92. Rasmussen, H.B. Possible association between multiple sclerosis and the human T cell leukemia virus (HTLV)-related endogenous element, HRES-1 / H.B. Rasmussen, A. Heltberg, K. Christensen et al. // Mult. Scler. – 1996. – Vol. 2, № 3. – P. 133 – 136. 93. Rodkey, L.S. Autoregulation of Immune Responses via Idiotype Network Interactionst / L. S. Rodkey // Microbiological reviews. – 1980. – Vol. 44, № 4. – P. 631 – 659. 94. Roncarolo, M.G. Type 1 T regulatory cells / M.G. Roncarolo, R. Bacchetta, C. Bordignon et al. // Immunological Reviews. – 2001. – Vol. 182. – P. 68 – 79. 95. Rossi, F. Anti-idiotypes against Autoantibodies in Normal Immunoglobulins: Evidence for Network Regulation of Human Autoimmune Responses / F. Rossi, G. Dietrich, M. D. Kazatchkine // Immunological Reviews. – 1989. – Vol. 110. – P. 135 – 149. 96. Ruprecht, C.R. Coexpression of CD25 and CD27 identifies FoxP3 regulatory T cells in inflamed synovial / C.R. Ruprecht, M. Gattorno, F. Ferlito et al. // J. Exp. Med. – 2005. – Vol. 201, № 11. – P. 1793 – 1803. 97. Schrohenloher, R. E. Monoclonal antibody 6B6.6 defines a cross-reactive kappa light chain idiotope on human monoclonal and polyclonal rheumatoid factors / R.E. Schrohenloher, M.A. Accavitti, A.S. Bhown et al. // Arthritis Rheum. – 1990. – Vol. 33, № 2. – P. 187 – 198. 98. Shokri, F. Qualitative and quantitatve expression of VHI associated cross reactive idiotopes within IgAM rheumatoid factor from patients with early synovitis / F. Shokri, 107 R.A. Mageed, E. Tunn et al. // Annals of the Rheumatic Diseases. – 1990. – Vol. 49. – P. 150 – 154. 99. Shulz, R. Self-tolerance in a minimal model of the idiotypic network / R. Schulz, B. Werne, U. Behn // Frontiers inImmunology. – 2014. – doi: 10.3389/fimmu.2014.00086 100. Silverman, G.J. Idiotypic and subgroup analysis of human monoclonal rheumatoid factors. Implications for structural and genetic basis of autoantibodies in humans / G.J. Silverman, R.D. Goldfien, P. Chen et al. // J. Clin. Invest. – 1988. – Vol. 82, № 2. – P. 469 – 475. 101. Silverman, G.J. Structural characterization of the second major cross-reactive idiotype group of human rheumatoid factors. Association with the VH4 gene family / G.J. Silverman, R.E. Schrohenloher, M.A. Accavitt et al. // Arthritis Rheum. – 1990. – Vol. 33, № 9. – P. 1347 – 1360. 102. Silvestris F. Studies of anti-f(ab’)* antibodies and possible immunologic control mechanisms in systemic lupus erythematosus / F. Silvestris, A. D. Bankhurst, R. P. Searles, R. C. Jr. Williams // Arthritis and Rheumatism. – 1984. – Vol. 27. – P. 1387 – 1396. 103. Sindic, C.J. The binding of myelin basic protein to the Fc region of aggregated IgG and to immune complexes / C.J. Sindic, C.L. Cambiaso, P.L. Masson et al. // Clin. Exp. Immunol. – 1980. – Vol. 41, № 1. – P. 1 – 7. 104. Soldan, S.S. Association of human herpes virus 6 (HHV-6) with multiple sclerosis: increased IgM response to HHV-6 early antigen and detection of serum HHV6 DNA / S.S. Soldan, R. Berti, N. Salem et al. // Nat. Med. – 1997. – Vol. 3, № 12. – P. 1394 – 1397. 105. Soltys, A.J. Rheumatoid factors: where are we now? / A.J. Soltys, J.S. Axford // Annals of the Rheumatic Diseases. – 1997. – Vol. 56. – P. 285 – 286. 106. Sriram, S. Multiple sclerosis associated with Chlamydia pneumoniae infection of the CNS / S. Sriram, W. Mitchell, C. Stratton // Neurology. – 1998. – Vol. 50, № 2. – P. 571 – 572. 108 107. Stollar, D. Serologic phenomena in rheumatoid arthritis: a review / D. Stollar // Can. Med. Assoc. J. – 1960. – Vol. 83, № 18. – P. 950 – 954. 108. Stone, R. Clinical value of ELISA assays for IgM and IgG rheumatoid factors / R. Stone, J.S. Coppock, P.T. Dawes et al. // J. Clin. Pathol. – 1987. – Vol. 40, № 1. – P. 107 – 111. 109. Sulzer, B. Central immune system, the self and autoimmunity / B. Sulzer, J.L. Van Hemmen, U. Behncentral // Bulletin Of Mathematical Biology. – 1994. – Vol. 56, № 6. – P. 1009 – 1040. 110. Süsal, C. The association of kidney graft outcome with pretransplant serum IgGanti-F(ab')2 gamma activity / C. Süsal, J. Groth, H.H. Oberg et al. // Transplantation. – 1992. – Vol. 54, № 4. – P. 632 – 635. 111. Terness, P. Suppression of anti-erythrocyte autoantibody-producing B cells by a physiological IgG-anti-F(ab')2 antibody and escape from suppression by tumour transformation; a model relevant for the pathogenesis of autoimmune haemolytic anaemia / P. Terness, U. Marxt, G. Sandilandst et al. // Clin. Exp. Immunol. – 1993. – Vol. 93, № 2. – P. 253 – 258. 112. Terness, P. Inverse Correlation Between igg-Antihinge Region and Antierythrocyte Autoantibody in Chronic Benign and Malignant Cold Agglutination / P. Terness, M. Kirschfink, D. Navolan et al. // Journal of Clinical Immunology. – 1997. – Vol. 17, № 3. – P. 220 – 227. 113. Terness, P. Natural Anti-Immunoglobulin Autoantibodies: Irrelevant By-Products or Immunoregulatory Molecules? / P. Terness G. Opelz // Int. Arch. Allergy Immunol. – 1998. – Vol. 115, № 4. – P. 270 – 277. 114. Tuomi, T. Which antigen to use in the detection of rheumatoid factors? Comparison of patients with rheumatoid arthritis and subjects with “false positive” rheumatoid factor reactions / T. Tuomi // Clin. Exp. Immunol. – 1989. – Vol. 77, № 3. – P. 349 – 355. 115. Uner, A. Idiotypes / A. Uner, J. Gavalchin // Encyclopedia of Life Sciences. – 2006. – doi: 10.1002/9780470015902.a0000912 109 116. Utsumi, S. Stepwise Cleavage of Rabbit Immunoglobulin G by Papain and Isolation of Four Types of Biologically active Fc Fragments / S. Utsumi // Biochem. J. – 1969. – Vol. 112, № 3. – P. 343 – 355. 117. Van Amelsfort, J. M. R. CD4+CD25+ Regulatory T Cells in Rheumatoid Arthritis / J.M.R. Van Amelsfort, K.M.G. Jacobs, J.W.J. Bijlsma et al. // Arthritis & Rheumatism. – 2004. – Vol. 50, № 9. – P. 2775 – 2785. 118. Van Esch, V.W.J. Differential requirements for induction of total immunoglobulin and physiological rheumatoid factor production by human peripheral blood B cells / V.W.J. Esch, C.C. Reparon-Schuijt, E.W. Levarht et al. // Clin. Exp. Immunol. – 2001. – Vol. 123, № 3. – P. 496 – 504. 119. Vaughan, J.H. Pathogenetic concepts and origins of Rheumatoid factor in rheumatoid arthritis / J.H. Vaughan // Arthritis and Rheumatism. – 1993. – Vol. 36, № 1. – P. 1 – 6. 120. Vejtorp, M. Enzyme-linked immunosorbent assay for determination of IgM rheumatoid factor / M. Vejtorp, M. Hoier-Madsen, P. Halberg // Scand. J. Rheumatol. – 1979. – Vol. 8, № 2. – P. 65 – 70. 121. Victor, K. D. Rheumatoid Factors Isolated from Patients with Autoimmune Disorders Are Derived from Germline Genes Distinct from Those Encoding the Wa, Po, and Bla Cross-Reactive Idiotypes / K.D. Victor, I. Randen, K. Thompson et al. // J. Clin. Invest. – 1991. – Vol. 87, № 5. – P. 1603 – 1613. 122. Vittecoq, O. Rheumatoid factor is the strongest predictor of radiological progression of rheumatoid arthritis in a three-year prospective study in communityrecruited patients / O. Vittecoq, S. Pouplin, K. Krzanowska et al. // Rheumatology. – 2003. – Vol. 42. – P. 939 – 946. 123. Welschof, M. The antigen binding domain of non-idiotypic human antiF(ab')2 autoantibodies: study of their interaction with IgG hinge region epitopes / U. Reineke, C. Kleist, S. Kipriyanov et al. // Hum Immunol. – 1999. – Vol. 60, № 4. – P. 282 – 290. 110 124. Westwood, O.M.R. Rheumatoid factors: what’s new? / O.M.R. Westwood, P.N. Nelson, F.C. Hay // Rheumatology. – 2006. – Vol. 45, № 4. – P. 379 – 385. 125. Williams, R.C.Jr. Heteroclitic polyclonal and monoclonal anti-Gm(a) and antiGm(g) human rheumatoid factors react with epitopes induced in Gm(a-), Gm(g-) IgG by interaction with antigen or by nonspecific aggregation. A possible mechanism for the in vivo generation of rheumatoid factors / R.C.Jr. Williams, C.C. Malone, P. Casali // J. Immunol. – 1992. – Vol. 149, № 5. – P.1817 – 1824. 126. Youngblood, K. Rheumatoid Factors from the Peripheral Blood of Two Patients with Rheumatoid Arthritis Are Genetically Heterogeneous and Somatically Mutated / K. Youngblood, L. Fruchter, G. Ding et al. // J. Clin. Invest. – 1994. – Vol. 93, № 2. – P. 852 – 861. 127. Zanetti, M. Functions and structures in regulatory network for self-reactivity / M. Zanetti, M. Sollazzo, R. Billetta // Immunol Ser. – 1991. – Vol 55. – P 221 – 238. 128. Zutshi, D.W. FII haemagglutination test for serum antigammaglobulin factors in arthritides sero-positive and sero-negative by other tests / D.W. Zutshi, C.A. Reading, W.V. Epstein et al. // Ann Rheum. Dis. – 1969. – Vol. 28, № 3. – P. 289 – 299. 111 Приложение 1 Рисунок 1 – Кинетика антител к БК, антител к КК и кинетика РФтнIgGэ в ходе иммунного ответа против БК у устойчивых (А) и чувствительных (Б) к КИА крыс. Каждая точка представлена средним от 13 крыс ± SE для здоровых животных и от 8 крыс ± SE для больных животных.
