ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ «МОСКОВСКИЙ ОБЛАСТНОЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ
advertisement
ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ «МОСКОВСКИЙ ОБЛАСТНОЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ АКУШЕРСТВА И ГИНЕКОЛОГИИ» ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ ГОРОДА МОСКВЫ «РОДИЛЬНЫЙ ДОМ № 3 ДЕПАРТАМЕНТА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ ГОРОДА МОСКВЫ» На правах рукописи ЛИННИК Александр Павлович ОСОБЕННОСТИ КОМПЕНСАТОРНО-ПРИСПОСОБИТЕЛЬНЫХ ИММУННЫХ МЕХАНИЗМОВ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ КЛИНИЧЕСКИХ ВАРИАНТАХ НЕВЫНАШИВАНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ 14.01.01 - Акушерство и гинекология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор медицинских наук, профессор БУЯНОВА С.Н. Москва - 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Стр. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ………………………….......…………… 4 ВВЕДЕНИЕ …………………………………………………………….. 7 ГЛАВА 1 Современные представления об этиологии и патогенетических механизмах невынашивания беременности (Обзор литературы) ….…………………………………………...…… 13 1.1. Клинико-патогенетические варианты невынашивания беременности .……………………………...…………………….. 13 1.2. Общая характеристика иммунных механизмов невынашивания беременности ………………………………….. 19 1.3. Дисбаланс основных субпопуляций Т-хелперных лимфоцитов и особенности цитокинового статуса при невынашивании беременности …………………………………………………….. 26 ГЛАВА 2 Материалы и методы исследования ……………………. 39 2.1. Общая клиническая характеристика беременных женщин …... 39 2.2. Клинико-лабораторное и инструментальное обследование ….. 43 2.3. Статистическая обработка результатов исследования ……….. 49 ГЛАВА 3 Клинико-лабораторная и иммунологическая характеристика различных клинических вариантов невынашивания беременности …………………………………...…. 50 3.1. Клиническая характеристика, данные лабораторных и инструментальных методов обследования женщин с различными клиническими вариантами невынашивания беременности …...…………………………………….………….. 51 3.2. Иммунологическая характеристика женщин с различными клиническими вариантами невынашивания беременности …... 82 ГЛАВА 4 Обсуждение результатов исследования ………………… 119 3 ВЫВОДЫ ………………………………………………………………. 137 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ……………………………. 139 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ……………………………………………. 141 4 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АЛАТ аланинаминотрансфераза АСАТ аспартатаминотрансфераза АЧТВ активированное парциальное (частичное) тромбопластиновое время ДВС-синдром синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания ЖКТ желудочно-кишечный тракт ИЛ интерлейкин ИРИ иммунорегуляторный индекс ИФН интерферон ЛГ лютеинизирующий гормон НБ невынашивание беременности ОРВИ острая респираторная вирусная инфекция ПНБ привычное невынашивание беременности Т3 св. свободный трийодтиронин Т4 св. свободный тироксин ТВ тромбиновое время ТТГ тиреотропный гормон ТЭГ тромбоэластография ФНО фактор некроза опухоли ФСГ фолликулостимулирующий гормон ХГЧ хорионический гонадотропин человека A ширина кривой в последний доступный момент изменения (показатель тромбоэластогрммы) AP-1 activator protein 1 - активаторный белок 1 CCR Cysteine - Cysteine chemokine receptor - рецептор CC 5 хемокина CD Cluster of Differentiation, кластер дифференцировки – номенклатура дифференцировочных антигенов лейкоцитов человека CI коагуляционный индекс (показатель тромбоэластогрммы) CTLA cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen - антиген цитотоксических Т-лимфоцитов CXCR Cysteine - Amino Acid - Cysteine chemokine receptor рецептор CXC хемокина Foxp3 forkhead box P3 – транскрипционный фактор регуляторных Т-клеток G плотность сгустка (показатель тромбоэластогрммы) GATA распознающий консенсусную последовательность нуклеотидов G – гуанин, А – аденин, Т – тимин, А – аденин GPIIb/IIIa гликопротеин IIb/IIIa тромбоцитов HY минорные антигены гистосовместимости Y хромосомы Ig иммуноглобулин IRF4 interferon regulatory factor 4 - фактор регуляции активности интерферона 4 K время коагуляции (показатель тромбоэластогрммы) LAG-3 lymphocyte-activation gene-3 - фактор активации лимфоцитов 3 LY30 процент лизиса сгустка в течение 30мин (показатель тромбоэластогрммы) MA максимальная амплитуда (показатель тромбоэластогрммы) 6 NK natural killer – естественные киллеры NKRP1 рецептор NK клеток Р1 R время реакции (показатель тромбоэластогрммы) ROR retinoic acid-related orphan receptor - орфановый рецептор ретиноевой кислоты STAT signal transducer and activator of transcription - трансдуктор сигнала и активатор транскрипции T1/ST2 рецептор-подобная молекула, гомологичная рецептору 1го типа ИЛ 1 T-bet T-box expressed in T cells - экспрессированный в Тклетках транскрипционный фактор Т-box TGF-β transforming growth factor β - трансформирующий фактор роста β Th1 Т-хелперы 1-го типа Th17 Т-хелперы типа 17 Th2 Т-хелперы 2-го типа Treg регуляторные Т-лимфоциты 7 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы Невынашивание беременности (НБ) стоит в ряду актуальных проблем практического акушерства в силу большой социальной и медицинской значимости. По данным разных авторов, частота НБ колеблется от 10 до 25% от общего числа зарегистрированных беременностей, при этом неудачу терпит 10 - 15% всех первых беременностей. В России частота самопроизвольного прерывания беременности остается достаточно высокой и составляет от 15 до 23% от всех зарегистрированных беременностей [40, 64, 71]. Таким образом, практически теряется каждая пятая желанная беременность, что означает существенные демографические потери: каждый год в стране не рождается до 180 000 желанных детей [60, 64]. Полагают, что при этом не учитывается большое число очень ранних и субклинически протекающих выкидышей. 75% беременностей прерываются до имплантации или сразу после нее, и лишь 15 – 20% случаев потерь беременности проявляются клинически [3]. Спорадический выкидыш является, как правило, следствием действия факторов, напрямую не связанных с патологией репродуктивной функции женщины в последующем. Вместе с тем, в группе женщин, потерявших первую беременность, существует категория пациенток (от 1 до 5%), в организме которых присутствуют эндогенные факторы, препятствующие нормальному развитию эмбриона и плода, в последующем приводящие к повторным прерываниям беременности – симптомокомплексу привычного невынашивания беременности (ПНБ). На долю ПНБ приходится 5 – 25% от общего числа потерь беременности [50, 62]. Риск потери беременности после первого выкидыша составляет 13 – 17%, что соответствует частоте спорадического выкидыша в популяции, тогда как после двух 8 предшествовавших самопроизвольных прерываний вероятность потери третьей желанной беременности возрастает более чем в 2 раза и составляет 36 - 38%, а по некоторым данным, до 40 – 45% [12, 52, 62]. Среди основных причин НБ указывают генетические факторы, ведущие к закладке аномального эмбриона, а также анатомические, эндокринные, метаболические, инфекционные и иные факторы, создающие неблагоприятный фон для развития генетически полноценного плодного яйца, эмбриона и плода. Указывают, что после исключения указанных выше факторов, в основе 80% случаев ПНБ неясного генеза лежат нераспознанные иммунные нарушения [21, 40, 62, 63, 66, 132]. При лечении НБ специалисты ограничены в количестве попыток, и это накладывает величайшую ответственность на врача при проведении диагностики и выборе тактики лечения. С каждой неудачной попыткой беременности усугубляются патологические процессы, приводящие к НБ, что все более затрудняет решение этой проблемы [10, 18, 50]. Статистика НБ не имеет тенденции к снижению, несмотря на многочисленные и эффективные методы диагностики и лечения, разработанные в последние годы [1, 64]. Последнее обстоятельство указывает на некоторую условность сегодняшних представлений о причинах и механизмах репродуктивной патологии и диктует необходимость дальнейших исследований, направленных на уточнение патогенетических механизмов НБ, в том числе выяснения роли иммунных факторов. Цель исследования Оптимизация подходов к диагностике и профилактике НБ путем изучения популяционного и субпопуляционного состава, экспрессии маркеров активации и апоптоза лимфоцитов периферической крови, 9 особенностей цитокинового профиля при различных клинических вариантах НБ. Задачи исследования 1. Дать характеристику клинических, анатомических, генетических, эндокринологических, тромбофилических и инфекционных факторов риска у женщин с НБ. Оценить роль иммунных нарушений при различных клинических вариантах НБ. Выявить факторы риска НБ путем изучения иммунологических показателей у исследуемых пациенток. 2. Изучить особенности популяционного и субпопуляционного состава, а также экспрессию маркеров активации и апоптоза лимфоцитов периферической крови, при различных клинических вариантах НБ. Дать характеристику компенсаторно-приспособительных иммунных механизмов у женщин с репродуктивной патологией. 3. Оценить функциональный баланс субпопуляций Т-хелперных лимфоцитов Th1, Th2 и Th17 при различных вариантах НБ с помощью определения концентрации основных цитокинов в сыворотке крови. Дать характеристику цитокинового профиля Th17 субпопуляции Т-хелперных лимфоцитов при НБ, выявив иммунорегуляторные механизмы, способствующие и/или препятствующие вынашиванию беременности. 4. Изучить взаимосвязь показателей гормонального фона, состояния систем гемостаза и фибринолиза с иммунологическими параметрами у женщин с различными клиническими вариантами НБ. Сформулировать рекомендации по оценке результатов параклинического обследования беременных женщин с учетом особенностей иммунного статуса. 5. Рекомендовать методы оценки популяционного и субпопуляционного состава и активационного профиля лимфоцитов, функционального баланса Th1, Th2 и Th17 субпопуляций хелперных лимфоцитов для 10 выявления иммунологических факторов риска, прогнозирования исхода беременности и снижения частоты случаев самопроизвольного прерывания беременности. Научная новизна исследования Впервые проведено комплексное изучение количественных характеристик Т- и В-звеньев иммунитета, маркеров активации и апоптоза лимфоцитов, с учетом клинического варианта НБ. Впервые исследован функциональный баланс Th1, Th2 и Th17 субпопуляций лимфоцитов при различных клинических вариантах НБ. Дана развернутая характеристика цитокинового профиля Th17 субпопуляции Тхелперных лимфоцитов при НБ и выявлена антигестагенная роль Th17опосредованных иммунорегуляторных механизмов. Впервые исследована взаимосвязь количественного и функционального дисбаланса иммунной системы при различных вариантах НБ с другими факторами системного ответа организма, такими как показатели свертывания крови и фибринолиза, параметры эндокринного статуса. Практическая значимость работы Показана ведущая роль иммунных механизмов в патогенезе репродуктивных потерь у женщин, у которых исключены анатомические, генетические, эндокринные, тромбофилические и инфекционные причины НБ. Продемонстрировано значение перенесенных инфекционных заболеваний, в том числе детских инфекций и воспалительных заболеваний мочеполовой сферы, для нарушений репродуктивной функции, выражающихся в задержке полового развития и риске НБ во взрослом возрасте. 11 Предложены гормонального рекомендации статуса с по учетом интерпретации особенностей показателей иммунологической реактивности у женщин с различными вариантами НБ. Выявлены показатели иммунного статуса, отражающие функциональное состояние иммунокомпетентных клеток и баланс Th1, Th2 и Th17 субпопуляций лимфоцитов, совершенствования имеющие алгоритмов практическое диагностики и значение лечения, а для также профилактики неблагоприятных исходов беременности. Внедрение в практическое здравоохранение Результаты исследования внедрены в повседневную лечебную работу акушерско-гинекологического стационара ГБУЗ МО МОНИИАГ и ГБУЗ Родильный дом № 3 ДЗМ, что позволило снизить частоту случаев самопроизвольного прерывания беременности, а также усовершенствовать индивидуальный алгоритм обследования и лечения пациенток с НБ. Результаты исследования и основные практические рекомендации используются при обучении клинических ординаторов и практических врачей на ФУВ ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, врачей на рабочем месте. Основные положения диссертации, выносимые на защиту 1. Снижение иммунологической реактивности, лежащее в основе повышенной инфекционной заболеваемости, в том числе детскими инфекциями и урогенитальными инфекциями, приводит к нарушению становления репродуктивной функции, а в последующем является фактором риска НБ. 2. Эндокринные факторы, процессы гемостаза и фибринолиза, и иммунные механизмы участвуют в формировании интегральных компенсаторно- 12 приспособительных гормонального реакций статуса, при гемостаза и беременности. Показатели фибринолиза необходимо интерпретировать в контексте иммунных нарушений при НБ. 3. Иммунологическими признаками угрозы прерывания беременности являются активация Т-клеточного иммунитета, проявляющаяся ростом числа клеток с фенотипом CD3+CD25+ и CD4+CD25+, и увеличение доли активированных «не-хелперных» Т-клеток. Изменения цитокинового профиля периферической крови, указывающие на усиление функциональной активности Th17 субпопуляции лимфоцитов на фоне сдвига Th1/Th2 баланса в сторону преобладания Th1-опосредованных иммунных прерывания реакций, являются беременности. К предиктором самопроизвольного компенсаторно-приспособительным иммунным механизмам, направленным на сохранение беременности, относятся активационный апоптоз Т-лимфоцитов, для которого характерен рост числа CD3+CD95+ клеток при нормальном содержании активированных CD25+ Т-лимфоцитов, а также стимуляция В-звена иммунитета. Угнетение Th17- и усиление Th2-зависимых процессов иммунорегуляции способствует сохранению текущей беременности у женщин со скомпрометированной репродуктивной функцией. 4. Решение практической задачи по предотвращению неблагоприятных исходов беременности требует включения комплекса иммунологических показателей в алгоритм обследования беременных женщин с учетом патогенетического или компенсаторно-приспособительного характера сдвигов в иммунной системе. 13 ГЛАВА 1 СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ОБ ЭТИОЛОГИИ И ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМАХ НЕВЫНАШИВАНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 1.1. Клинико-патогенетические варианты невынашивания беременности Причины НБ многообразны, отражая неблагополучие в состоянии здоровья беременной, плода, окружающей среды и многих других факторов [5, 7, 38, 59, 80, 155, 184]. Выделяют социально-демографические и медицинские факторы, приводящие к репродуктивным потерям [58]. Среди социальных факторов, оказывающих существенное влияние на течение и исход беременности, указывают уклад семьи, объем домашней работы, характер отношений между супругами. В большой степени на течение беременности влияют вредные привычки матери, особенно курение, употребление алкоголя, наркотиков [51, 63, 84, 159]. Отклонения в психоэмоциональной сфере нередко сопровождаются нарушениями гормонального статуса [75]. Медицинские факторы НБ могут приводить к закладке аномального эмбриона либо создавать неблагоприятные условия для его развития. Среди основных причин самопроизвольного прерывания беременности выделяют генетические факторы (наследуемые от родителей или возникающие do novo), инфекции (в основном, хронические персистирующие инфекции, протекающие на врожденные или фоне иммунодефицитного приобретенные состояния анатомические пациентки), дефекты органов репродуктивной сферы, эндокринные факторы, иммунные нарушения [18, 26, 48, 62, 82]. 14 Основное место в структуре причин прерывания беременности на сроках до 5 – 6 недель занимают генетические нарушения [14, 30]. На протяжении последних 40 – 50 лет понятие генетических причин НБ ранних сроков включало в себя наличие хромосомных аномалий (количественных и/или структурных нарушений кариотипа) как у супругов с выкидышами в анамнезе, так и у абортусов [5, 102]. При спорадическом прерывании беременности в первом триместре около 50% абортусов имеют нарушения кариотипа. Большую часть из них – 95% - составляют изменения числа хромосом – моносомии (утрата одной хромосомы) и трисомии (наличие добавочной хромосомы), являющиеся результатом ошибок при мейозе, а также полиплоидии (увеличение на полный гаплоидный набор), возникающие при оплодотворении яйцеклетки 2 и более сперматозоидами. При спорадических выкидышах наиболее распространенной патологией являются трисомии – 60% всех мутаций (чаще всего по 16-й, а также 13, 18, 21, 22-й хромосомам), на втором месте по частоте стоит синдром Шерешевского-Тернера (45 Х0) – 20%, остальные 15 - 20% приходятся на долю полиплоидии (особенно триплоидии). Для ПНБ хромосомные аномалии не столь значимы [62, 64]. На современном этапе развития генетики широко применяются новые высокотехнологичные молекулярные методы диагностики, и понятие «генетика НБ» расширило свои границы. НБ может быть обусловлено не только хромосомными аномалиями, но также генными мутациями и наследственной предрасположенностью [5, 118]. Среди потерь беременности на сроках 7 – 10 недель важную роль играют факторы эндокринной природы. На их долю приходится от 8 до 20% всех случаев НБ [48, 62, 64]. Наиболее значимы гиперандрогения, недостаточность функции желтого тела, дисфункция щитовидной железы, сахарный диабет [1, 62, 119]. Самая частая известная причина ПНБ – 15 недостаточность функции желтого тела – заключается в недостаточном влиянии прогестерона на эндометрий. Может быть результатом действия целого ряда факторов: нарушения секреции фолликулостимулирующего (ФСГ) и лютеинизирующего (ЛГ) гормонов в первой фазе менструального цикла; раннего или, наоборот, слишком позднего пика выброса ЛГ; гипоэстрогении как следствия неполноценного фолликулогенеза [20, 78]. У больных с ПНБ недостаточность лютеиновой фазы наблюдается в 20 – 60% случаев, а ультразвуковые признаки поликистозных яичников – в 44 – 56% [62]. Большое значение в генезе НБ имеет соотношение содержания прогестерона и эстрогенов. Прогестерон вызывает децидуальные изменения в эндометрии и готовит его к имплантации оплодотворенной яйцеклетки, способствует развитию и росту миометрия и его васкуляризации, снижает возбудимость матки путем нейтрализации действия окситоцина, стимулирует рост и развитие молочных желез, снижает тканевые иммунологические реакции. Прогестерон имеет иммуносупрессивные свойства - подавляет эмбриотоксическое действие Т-хелперов [60, 65, 129, 179, 220]. Эстрогены во время беременности вызывают разрастание сосудов в эндометрии, усиливают поглощение кислорода тканями, энергетический обмен, активность ферментов и синтез нуклеиновых кислот, повышают чувствительность матки к окситоцину, влияют на биохимические процессы в матке [40, 83]. Известно, что 21–32% случаев НБ обусловлено гиперандрогенией яичникового или надпочечникового генеза [20]. У женщин с явлениями гирсутизма в 6 раз чаще наблюдаются ранние самопроизвольные выкидыши и в 10 раз чаще – неразвивающаяся беременность. Повышение уровня андрогенов приводит, с одной стороны, непосредственно к гибели зародыша, а с другой – к плацентарной недостаточности [104]. Гормоны щитовидной железы также играют определенную роль в развитии беременности, поэтому нарушение функции щитовидной железы 16 (как повышение, так и снижение) может существенно влиять на течение беременности. Частота досрочного прерывания беременности на фоне тиреоидной дисфункции колеблется от 25% до 50% [76, 148]. На сроках более 10 недель беременности большое значение имеют причины НБ, связанные с нарушениями гемокоагуляции: тромбофилии как наследственного, так и иммунного генеза [14, 64, 118]. Сюда относятся антифосфолипидный синдром, метилентетрагидрофолатредуктазы и мутация гена гипергомоцистеинемия, мутация Лейдена (гена, кодирующего V фактор свертывания), мутация гена протромбина G20210A, дефицит антитромбина III, дефицит протеинов С, S и др. [13, 48, 52, 62, 167]. Многочисленные исследования продемонстрировали взаимосвязь наследственной тромбофилии с НБ, гестозом, задержкой внутриутробного развития плода, преждевременной отслойкой нормально расположенной плаценты. Неполноценная или слабая инвазия цитотрофобласта ведет к запаздыванию начала маточно-плацентарного кровообращения и является морфологическим субстратом раннего самопроизвольного выкидыша. Генетические формы тромбофилии обусловливают 10–30% случаев ПНБ, что позволяет выделить их в самостоятельную группу причин НБ [35]. Абсолютное большинство генетических форм тромбофилии клинически проявляется именно во время беременности в виде тромбозов и акушерских осложнений, что физиологически связано с протекающей особенностями беременности системы [15, 17]. гемостаза при Наблюдается возрастание коагулянтного потенциала в связи с увеличением почти в 2 раза уровней всех факторов свертывания (кроме XI и XIII) на фоне снижения фибринолитической и антикоагулянтной активности. Увеличение уровня фибриногена начинается с 3-го месяца беременности, также возрастает активность фактора VIII. Отмечается небольшое уменьшение уровня XI 17 фактора и выраженное – XIII (фибринстабилизирующего); при этом снижается уровень антитромбина III и протеина S [178]. Активность фибринолиза снижается в конце беременности и в процессе родов, а в раннем послеродовом периоде возвращается к норме. Число тромбоцитов при неосложненном течении беременности остается практически неизменным. При сроках беременности более 15 – 16 недель на первый план выходят причины НБ инфекционной природы. Вопрос об этиологической роли бактериально-вирусного фактора остается открытым. Одни исследователи считают, что инфекция - одна из наиболее значимых причин как спорадического, так и ПНБ; другие считают, что инфекция играет ключевую патогенетическую роль для спорадического, но не ПНБ [8, 14, 27, 29, 48]. У большинства женщин с ПНБ на фоне хронического эндометрита отмечено присутствие в эндометрии 2–3 и более видов облигатноанаэробных микроорганизмов и вирусов, в 86,7% случаев наблюдается персистенция условно-патогенных микроорганизмов в эндометрии, что может служить причиной активации иммунопатологических процессов. Особое внимание уделяют вирусным инфекциям, персистенция которых в организме приводит к изменениям в иммунной системе, развитию хронического тромбофилического состояния, аутоиммунных заболеваний. Смешанная персистентная вирусная инфекция (вирус простого герпеса, вирус папилломы человека, Коксаки А, Коксаки В, энтеровирусы 68–71, цитомегаловирус, парвовирус) встречается у больных с ПНБ достоверно чаще, чем у женщин с нормальным акушерским анамнезом. Указывают на роль кампилобактерной инфекции в патогенезе ПНБ [28, 62, 74]. Бактериально-вирусная колонизация эндометрия является, как правило, следствием неспособности иммунной системы и неспецифических защитных сил организма (система комплемента, фагоцитоз) полностью элиминировать инфекционный агент [37, 41, 62]. 18 Среди вирусных инфекций при НБ наибольшее значение имеют герпесвирусные инфекции. Вирус простого герпеса является одним из наиболее распространенных возбудителей, играющих важную роль в патологии беременности. У пациенток с НБ персистирующая герпетическая инфекция встречается в 74% случаев [55]. По данным Басковой О. Ю. и соавт., структура инфекционного фактора у женщин при НБ представлена следующим образом: кандидоз диагностирован у 10,2% женщин, хламидиоз – у 5,6%, уреаплазмоз – у 23,7%, микоплазмоз – у 7,5%, бактериальный вагиноз – у 19,8%, трихомоноз – у 1,0%, сифилис –1,6%, папилломатоз – у 0,2% [4]. За счет локальной иммуносупрессии, характерной для беременных, часто развиваются кандидоз, вагиноз, кольпит. Инфицирование восходящим путем при истмико-цервикальной недостаточности ведет к преждевременному излитию околоплодных вод и стимуляции под влиянием инфекционного процесса сократительной деятельности матки [64]. Оказание эффективной медицинской помощи, основывающейся на учете этиологических и патогенетических факторов НБ, возможно только при условии тщательного необходимы исследования: обследования современные технологии, генетические, эндокринологические, супружеской пары. Для высокоинформативные иммунологические, микробиологические. этого методы гемостазиологические, Совершенствование наших представлений о физиологии репродукции и изучение тонких механизмов, обеспечивающих сохранение, либо, напротив, приводящих к потере беременности, является необходимым условием решения проблемы НБ. 19 Общая 1.2. характеристика иммунных механизмов невынашивания беременности Среди причин НБ иммунные механизмы занимают важное место. На долю иных причин, таких как цитогенетические аномалии, нарушения развития матки, эндокринная дисфункция, врожденные и приобретенные тромбофилии, приходится от 20 до 50% всех случаев ПНБ [68, 175]. До 80% остальных потерь беременности связаны с нарушениями аутоиммунного и аллоиммунного характера. При аутоиммунных процессах агрессия иммунной системы направлена против клеток собственного организма, проявляясь, в частности, в выработке антифосфолипидных, антитиреоидных, антинуклеарных аутоантител или антител к хорионическому гонадотропину человека (ХГЧ). При аллоиммунных нарушениях иммунный ответ направлен против антигенов эмбриона или плода [2, 39, 44]. Следует отметить, что иммунные неспособностью организма нарушения тесно элиминировать патоген при связаны с хронических бактериальных и вирусных инфекциях, а также с развитием тромботических осложнений беременности [6, 9, 25, 45, 57, 95]. Выработка аутоантител лежит в основе значительного числа случаев НБ. Наибольшее клиническое значение имеет антифосфолипидный синдром – симптомокомплекс, включающий наличие антифосфолипидных антител в сочетании с артериальными и венозными тромбозами, акушерскими потерями, тромбоцитопенией и неврологическими нарушениями [172, 177]. В основе антифосфолипидного фосфолипидным синдрома детерминантам, лежит выработка присутствующих на антител к мембранах большинства клеток – тромбоцитов, эндотелиальных клеток, моноцитов. Причиной тромбозов при антифосфолипидном синдроме является белокопосредованное взаимодействие антифосфолипидных антител с отрицательно заряженными или нейтральными фосфолипидами. В качестве 20 белков-кофакторов чаще всего выступают белки плазмы крови: β2гликопротеин I, который, связываясь с фосфолипидами, образует истинный антиген для антифосфолипидных антител, а также протромбин [47]. Диагностическое значение имеет выявление антител к β2-гликопротеину I, волчаночного антикоагулянта и антикардиолипиновых антител [34]. Частота антифосфолипидного синдрома в популяции достигает 5%, среди пациенток с ПНБ антифосфолипидный синдром составляет 27 – 42%, причем без проведения лечения гибель эмбриона/плода наблюдается у 85 – 90% женщин, имеющих аутоантитела к фосфолипидам [62]. Акушерскими проявлениями антифосфолипидного синдрома являются ПНБ, неудачи экстракорпорального оплодотворения, гестозы, включая преэклампсию и эклампсию, плацентарная недостаточность, внутриутробная задержка роста плода, преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты [47]. Нарушение плацентарного кровотока вследствие тромбоза сосудов плаценты приводит к нарушению роста и развития, а затем и к гибели плода. Другим патогенетическим механизмов акушерских потерь при антифосфолипидном синдроме является локальное воспаление плаценты, которое связывают с активацией системы комплемента [177]. К аутоиммунным факторам ПНБ относят антитела к ХГЧ. В сыворотке 26,7% женщин, страдающих ПНБ, выявляются антитела к ХГЧ, которые, обладая высокой аффинностью, блокируют его биологический эффект, а в некоторых случаях снижают общую концентрацию ХГЧ. Механизм действия антител, вероятно, состоит не только в предупреждении связывания ХГЧ с рецепторами желтого тела яичников, но и в прямом повреждающем влиянии на клетки эмбриональной трофэктодермы. У 95% женщин с высокими титрами антител к ХГЧ была зарегистрирована угроза прерывания беременности в I триместре [62]. 21 В последнее время активно исследуется патогенетическая роль антител к рецепторам ангиотензина II типа I при акушерской патологии [172]. Такие антитела были обнаружены в крови женщин с преэклампсией. Они обладали высоким сродством к рецепторам ангиотензина II, представленными в ткани плаценты, и, связываясь с ними, имитировали действие эндогенного лиганда. В экспериментах на животных было показано, что введение антител к рецепторам ангиотензина II, выделенных их крови женщин с преэклампсией, приводило к развитию гипертензии, протенинурии, эндотелиального воспаления почечных клубочков, нарушениям развития плаценты и репродуктивным потерям [224]. Важно отметить, что механизмы сохранения беременности также могут быть связаны с продукцией антител [43, 46, 172]. Существует гипотеза, согласно которой успешный исход беременности зависит от присутствия блокирующих антител, защищающих плод от атаки цитотоксических лимфоцитов матери. До 50 – 80% случаев ПНБ может быть связано с нарушением выработки блокирующих антител к отцовским антигенам в организме матери [2]. Обсуждается значение для сохранения беременности так называемых асимметричных антител, которые обладают способностью связывать антиген, однако, вследствие особенностей гликозилирования молекулы иммуноглобулина, не образуют нерастворимые комплексы антиген- антитело. Асимметричные антитела неспособны реализовывать эффекторные иммунные функции, такие как активация системы комплемента, опсонизация и фагоцитоз, антитело-зависимая клеточная цитотоксичность [161]. Асимметричные антитела в значительно более высокой концентрации обнаруживаются в сыворотке крови беременных, чем у женщин вне беременности [160]. При НБ концентрация асимметричных антител оказалась ниже, чем при физиологической беременности. Эти результаты позволили 22 предположить, что выработка асимметричных антител к антигенам тканевой совместимости отца при беременности является защитным механизмом, а неспособность иммунной системы матери продуцировать асимметричные антитела является одной из причин НБ [221]. В последние годы предметом пристального изучения стала роль цитотоксических патогенезе НБ Т-лимфоцитов, [139, 219]. экспрессирующих Внимание антиген исследователей к CD8, в указанной субпопуляции лимфоцитов связано с тем, что CD8+ клетки распознают антигены гистосовместимости класса I, представленные на поверхности практически всех ядросодержащих клеток и обеспечивающие распознавание «свой - чужой», в том числе отцовские антигены, экспрессированные на клетках полуаллогенного плода [200, 208]. С другой стороны, CD8+ Тлимфоциты играют центральную роль в реакциях противовирусного иммунитета, причем баланс механизмов «неотвечаемости» к антигенам плода и способности иммунного к ответа реализации является полноценного важнейшим противоинфекционного условием возникновения и сохранения беременности [108, 113]. На ранних сроках беременности, на долю Т-клеток приходится около 5 – 20% от общего числа лимфоцитов децидуальной оболочки, а к завершению беременности их доля возрастает до 40 – 80% [206]. При этом субпопуляционный состав децидуальных Т-лимфоцитов принципиально отличается от периферической крови. CD8+ клетки составляют основную часть Т-лимфоцитов децидуальной ткани во время беременности. Из них подавляющее большинство относятся к активированным эффекторным Тклеткам памяти. Цитотоксический потенциал этих клеток оказался слабее по сравнению с CD8+ эффекторными клетками и эффекторными клетками памяти периферической крови, что выражалось в сниженном содержании таких цитотоксических белков, как перфорин и гранзим В. Децидуальные 23 CD8+ лимфоциты экспрессируют молекулы FasL и, в небольших количествах, гранулизин, что может лежать в основе альтернативного механизма реализации их цитотоксичности [199, 207]. CD8+ лимфоциты децидуальной оболочки способны распознавать антигены гистосовместимости, относящиеся к группам HLA-C, HLA-E и HLA-G, которые представлены на клетках трофобласта. При этом только молекулы HLA-C обладают аллельным полиморфизмом, а значит, могут служить объектами распознавания по принципу «свой - чужой» [98, 128]. По меньшей мере у части беременных женщин в организме присутствуют CD8+ Т-клетки, специфичные в отношении унаследованных от отца антигенов гистосовместимости HLA-C, экспрессированных на клетках трофобласта. Несовпадение антигенов гистосовместимости матери и плода приводит к активации лимфоцитов, что может играть существенную роль в развитии такого осложнения беременности, как ПНБ [208]. Антигены полиморфных белков, не относящихся к системе главного комплекса гистосовместимости, также могут распознаваться цитотоксическими CD8+ лимфоцитами. Они получили название минорных антигенов гистосовместимости [117]. Показана способность нескольких белков, кодирующихся генами, расположенными на Y хромосоме (минорные антигены гистосовместимости Y хромосомы - HY), индуцировать специфический иммунный ответ, опосредованный CD8+ лимфоцитами, у женщин, беременных плодом мужского пола. Ряд HY и аутосомных минорных антигенов гистосовместимости представлены на клетках трофобласта [126]. Недавно было показано, что HY-специфические Тлимфоциты присутствуют в периферической крови, а также децидуальной ткани около 50% женщин, беременных плодом мужского пола, уже в первом триместре беременности. Большая часть этих клеток относится к субпопуляции CD8+ эффекторных клеток и эффекторных клеток памяти. Они 24 секретируют интерферон (ИФН) γ и обладают цитотоксической активностью в отношении клеток-мишеней цитотоксических реакций [152]. Нарушение распознавания ограничения минорных антигенов гистосовместимости может лежать в основе некоторых случаев НБ [150]. Вирусные инфекции являются частой причиной осложнений беременности, в том числе иммуноопосредованных. Одним из механизмов этого феномена может быть перекрестное распознавание вирусных антигенов и унаследованных от отца антигенов гистосовместимости цитотоксическими CD8+ лимфоцитами. В этом случае цитотоксические клетки, возникшие в организме в ответ на вирусную инфекцию, могут взаимодействовать с антигенами, представленными на клетках трофобласта. Перекрестная реактивность показана для антигенов вируса Эпштейна-Барра, цитомегаловируса, вирусов ветряной оспы и гриппа [89, 112]. Многочисленные клетки, противовоспалительной цитокины активностью и и молекулы, обладающие присутствующие в тканях трофобласта и плаценты, могут нарушать процесс элиминации вирусного патогена. На примере цитомегаловирусной инфекции было показано, что у женщин, у которых произошла трансплацентарная передача инфекции плоду, имела место более медленная пролиферативная реакция и снижение содержания в периферической крови цитотоксических клеток, продуцирующих интерлейкин (ИЛ) 2 и ИФН-γ [115, 149]. Вирусная инфекция может вызывать усиление миграции цитотоксических Т- лимфоцитов в децидуальную ткань и продукцию ими провоспалительных цитокинов, что, в свою очередь, приводит к нарушению механизмов толерантности в отношении антигенов плода и развитию иммунных осложнений беременности [208]. Важную роль в патогенезе НБ иммунной природы отводят цитотоксическим лимфоцитам, принадлежащим к популяции NK (natural 25 killer – естественные киллеры) клеток. NK-клетки выделены в особый класс лимфоцитов благодаря их уникальной способности быстро разрушать чужеродные либо свои измененные клетки в отсутствие молекул главного комплекса гистосовместимости, независимо от антител и комплемента, что подтверждает их название «естественные киллеры». Они обладают естественной цитолитической активностью. В дополнение к прямой цитотоксической функции, NK-клетки способны секретировать значительные количества хемокинов и цитокинов, что ставит эти клетки в ряд важных регуляторов как врожденного, так и адаптивного иммунитета [79, 114, 168, 203]. Характерной чертой NK-клеток является экспрессия на их поверхности молекул CD56 и CD16, с помощью которых в лабораторных условиях осуществляется идентификация NK-клеток [56, 130]. Децидуализация эндометрия, предшествующая имплантации эмбриона, сопровождается миграцией в эндометрий NK-клеток. На долю NK-клеток приходится до 70% от общего числа лимфоидных клеток эндометрия. NKклетки эндометрия существенно отличаются от NK-клеток периферической крови и по своему фенотипу и функции. Около 90% NK-клеток периферической крови экспрессируют на своей поверхности оба маркера, CD56 и CD16. Напротив, большая часть NK-клеток эндометрия имеют лишь маркер CD56, представленный с высокой плотностью, но не CD16. Лишь 10% NK-клеток эндометрия имеют на поверхности оба маркера [144, 169]. Nakashima и соавт. [2012] предложили разделить NK-клетки на четыре группы в соответствии с особенностями спектра секретируемых ими цитокинов: NK1 клетки, продуцирующие цитокины, характерные для Th1 субпопуляции лимфоцитов; NK2 клетки, вырабатывающие цитокины, характерные для Th2 субпопуляции лимфоцитов; NK3 клетки, секретирующие трансформирующий фактор роста β (TGF-β), и NKr1, продуцирующие ИЛ 10 [175]. Для нормальной беременности характерно 26 преобладание NK3 клеток в децидуальной ткани и NKr1 – в периферической крови. Эти клетки обладают сниженной цитотоксической активностью. Субпопуляционный состав и миграция NK-клеток в эндометрий находятся под контролем половых гормонов. Пролактин способствует дифференцировке предшественников в NK3 клетки, ХГЧ и прогестерон – в NKr1 лимфоциты. Прогестерон также играет важную роль в миграции NKклеток из периферической крови в эндометрий [85, 99]. Для ПНБ характерно увеличение числа и усиление цитотоксической активности NK-клеток периферической крови [49, 136]. Было отмечено снижение доли NK3 и NKr1 по сравнению с физиологически протекающей беременностью. Исследование механизмов цитотоксического воздействия NK-клеток при НБ показало, что в них повышено содержание гранулизина, но не гранзима В и перфорина. В эксперименте было показано, что гранулизин-содержащие NK-клетки способны вызывать гибель клеток трофобласта по апоптотическому механизму [146, 210]. Таким образом, различные механизмы субпопуляции гуморального иммунитета, цитотоксических лимфоцитов, а также реализующие процессы врожденного и адаптивного иммунного ответа, принимают участие в индукции и поддержании иммунологической толерантности в отношении полуаллогенного плода, а нарушение этих механизмов приводит к осложнениям беременности, прежде всего, в форме НБ. 1.3. Дисбаланс основных субпопуляций Т-хелперных лимфоцитов и особенности цитокинового статуса при невынашивании беременности Представления о существовании двух типов CD4+ лимфоцитов с реципрокными функциями - Т-хелперов 1-го типа (Th1) и Т-хелперов 2-го типа (Th2) – сформировались в середине 80-х годов прошлого века [143, 170]. 27 Вскоре были получены убедительные доказательства существования Th1 и Th2 Т-лимфоцитов у человека [111, 189], а затем сделаны первые шаги в направлении изучения Th1/Th2 дисбаланса при патологии человека [188, 214]. Th1 клетки играют важную роль в развитии реакций клеточного иммунитета, патогенов, направленных а также против участвуют в внутриклеточных реакциях инфекционных гиперчувствительности замедленного типа. Th2 клетки обеспечивают реализацию гуморального иммунитета, поддерживая пролиферацию и дифференцировку В- лимфоцитов, элиминацию внеклеточных патогенов, участвуют в развитии аллергических реакций немедленного типа и защищают организм от глистных инвазий [158]. Т-хелперы 1-го и 2-го типов отличаются набором секретируемых ими цитокинов. Так, Th1 продуцируют ИФН-γ, являющийся маркером этой субпопуляции Т-хелперных клеток, а также ИЛ 2, фактор некроза опухоли (ФНО) α. Напротив, Th2 вырабатывают ИЛ 4 (маркер Th2 субпопуляции), ИЛ 5, ИЛ 10 и ИЛ13. Th1 лимфоциты экспрессируют на своей поверхности рецепторы хемокинов CCR5 и CXCR3, маркеры CD26 и LAG-3. Th2 клеточные клоны характеризуются поверхностной экспрессией рецепторов хемокинов CCR3 и CCR4, а также маркеров CD62L, T1/ST2 и CD30. Уникальный транскрипционный фактор Th1 клеток – это T-bet; транскрипционные факторы STAT1 и STAT4 выявляются как в Th1, так и в клетках других популяций. Th2 лимфоциты используют уникальный транскрипционный фактор GATA3, а также STAT6 [33, 158]. Следует отметить, что достоверная верификация CD4+ Т-хелперных клонов возможна лишь посредством комплексного изучения спектра продуцируемых цитокинов, особенностей поверхностного фенотипа и факторов транскрипции, однако важнейшими 28 характеристиками Th1 и Th2 клеток по-прежнему считается их способность к продукции ИФН-γ и ИЛ 4, соответственно. В 1995 году была описана способность субпопуляции CD4+ Тлимфоцитов, экспрессирующих маркер CD25 (α-цепь рецептора ИЛ 2), подавлять иммунные реакции в моделях in vivo и in vitro [193]. Эти клетки получили название «регуляторных», или Treg. Помимо поверхностных маркеров CD4 и CD25, важнейшим признаком Treg клеток является экспрессия транскрипционного фактора Foxp3, тесно связанного с их иммунорегуляторной функцией. Феномен иммунологической толерантности предполагает способность организма поддерживать контролируемый баланс между «неотвечаемостью» к аутоантигенам и способностью к реализации полноценного иммунного ответа в отношении инфекционных и иных генетически чужеродных агентов, и ключевая роль в этом балансе отводится сегодня Treg лимфоцитам [209]. В середине 90-х годов был описан цитокин, первоначально получивший название антигена цитотоксических Т-лимфоцитов 8 (CTLA-8), а затем - ИЛ 17 [218]. Позднее ИЛ 17 был обозначен как ИЛ 17А, поскольку поиск гомологичных последовательностей генома позволил идентифицировать пять цитокинов, обладающих высокой степенью структурного сходства с ИЛ 17 – от ИЛ 17B до ИЛ 17F (ИЛ 17E также известен как ИЛ 25), и сформулировать концепцию «семейства ИЛ 17» [223]. Хотя ИЛ 17 был открыт более 15 лет тому назад, лишь недавно удалось охарактеризовать клетки, являющиеся основными продуцентами этого цитокина. В 2005 году исследования ИЛ 17А и ИЛ 17F позволили охарактеризовать уникальную субпопуляцию CD4+ Т-лимфоцитов, получившую название Т-хелперы типа 17, или Th17 [122, 145]. С тех пор Th17 – опосредованные механизмы иммунорегуляции находятся в центре внимания иммунологов. 29 ИЛ 17А также вырабатывается γδ Т-лимфоцитами, естественными киллерными клетками, нейтрофилами, эозинофилами, моноцитами, макрофагами, тучными клетками и гладкомышечными клетками стенки сосуда [32, 215]. Однако основными источниками ИЛ 17А являются активированные CD4+ Т-клетки. Th17 представляет собой особую субпопуляцию CD4+ Т-лимфоцитов, отличную от обсуждавшихся ранее Th1 и Th2, а также других, менее изученных типов хелперных клеток. Th17 лимфоциты и продуцируемые ими провоспалительные цитокины участвуют в реализации защитных механизмов против внеклеточных инфекционных патогенов. При этом, однако, они могут способствовать развитию избыточной воспалительной реакции и деструкции тканей [121, 137]. Th17 цитокины являются факторами патогенеза различных воспалительных и аутоиммунных заболеваний, в том числе ревматоидного артрита, системной красной волчанки, энецефаломиелита и рассеянного склероза, астмы, склерита, увеита, воспалительных заболеваний кишечника, диабета, реакции отторжения трансплантата и др. [137, 157, 158]. Привлечение нейтрофильных лейкоцитов в очаг воспаления и их активация является одним из ключевых механизмов реализации про-воспалительного потенциала Th17 клеток [181]. Помимо ИЛ 17А и ИЛ 17F, Th17 клетки секретируют также другие цитокины, в частности, ИЛ 6, ИЛ 21, ИЛ 22, ИЛ 26, ФНО-α, гранулоцитарномакрофагальный колониестимулирующий фактор, хемокины CXCL8 и CCL20 [90, 164, 215]. Ключевым транскрипционным фактором для Th17 лимфоцитов является RORγt; соответствующий ему ген RORC иногда упоминается в литературе как синоним транскрипционного фактора RORγt применительно к человеку [157]. Транскрипционные факторы RORα, STAT3, IRF4, RORc и AP-1 также необходимы для экспансии и функциональной 30 активности Th17 лимфоцитов, однако не являются уникальными для этой Тклеточной субпопуляции. CD161 – это гликопротеид человека, аналогичный мышиному рецептору NK клеток Р1 (NKRP1), представленному на естественных киллерных клетках грызунов. CD161 экспрессирован на большинстве человеческих NK клеток и некоторой части CD4+ и CD8+ лимфоцитов. Коэкспрессия маркеров CD4 и CD161 позволяет фенотипически охарактеризовать Th17 субпопуляцию лимфоцитов человека [106]. Особое место, которое цитокины семейства ИЛ 17 занимают в процессах иммунорегуляции млекопитающих, объясняется, вероятно, филогенетической древностью этого защитного механизма. Ген, обладающий высокой степенью гомологии с ИЛ 17D человека (идентичность 21%), обнаружен в геноме тихоокеанской устрицы Crassostrea Gigas. Бактериальное инфицирование Crassostrea Gigas вызывало быстрое и значительное усиление транскрипции гена в гемоцитах моллюска, что указывает на его потенциальную защитную функцию [186, 187]. В геноме асцидии Ciona Intestinalis выявлен цитоплазматическому ген, на региону 27% рецептора идентичный ИЛ 17 по структуре млекопитающих; биологическая роль этого белка, однако, пока не установлена [204]. CD4+ лимфоциты недоношенных новорожденных экспрессируют такие маркеры Th17 субпопуляции как ИЛ 23R, RORγt, STAT3 и CD161, причем уровень экспрессии находится в обратной зависимости от гестационного возраста ребенка. CD4+ лимфоциты контрольной группы взрослых людей имеют преимущественно Th1 фенотип. Это наблюдение показывает, что и в онтогенезе Th17 – зависимые защитные механизмы начинают работать раньше, чем Th1 – опосредованные реакции иммунитета [97]. Направление дифференцировки общего предшественника Т-хелперов – Th0 – определяется особенностями цитокинового микроокружения. В первых 31 экспериментах на мышах было показано, что TGF-β, являющийся фактором дифференцировки Treg лимфоцитов, также играет ключевую роль в формировании Th17 клеточных клонов. Решающее значение имеют костимулирующие факторы, в роли которых выступают провоспалительные цитокины ИЛ 6, а также ИЛ 1β и ФНО-α. В отсутствие провоспалительных факторов, TGF-β обеспечивает дифференцировку клеток-предшественников в Treg, напротив, сочетанное воздействие TGF-β и ИЛ6, а также других провоспалительных цитокинов, приводит к их дифференцировке в Th17 клетки. Происходит индукция секреции ИЛ 21, который, в свою очередь, стимулирует экспрессию рецепторов ИЛ 23 и делает Т-клетки восприимчивыми к ИЛ 23, обеспечивающему выживание и экспансию Th17 клонов. Дифференцировка Th17 клеток у человека также управляется ИЛ 6, ИЛ 21, ИЛ 23 и ИЛ 1β при важной синергичной роли TGF-β, в том числе благодаря способности этого цитокина угнетать формирование Th1 клеточных клонов [87, 101, 194]. Возможно, что у человека Th17 лимфоциты дифференцируются из малочисленной субпопуляции тимических предшественников, имеющих фенотип CD161+RORC+IL-1R1+IL-23R+CCR6+ и мигрирующих в периферические лимфоидные органы на ранних этапах онтогенеза [106, 194]. Не исключено, что, по аналогии с «индуцированными» и «естественными» Treg, существуют две субпопуляции Th17 клеток, имеющие периферическое или центральное происхождение [138]. Первоначально Th17 клетки рассматривали как важную часть механизма иммунного повреждения и воспаления при различных заболеваниях [171, 202]. Постепенно стали накапливаться сведения о возможной противовоспалительной активности Th17 лимфоцитов [217, 222]. Это обстоятельство диктует необходимость дифференцированного подхода к 32 изучению патогенетической роли отдельных цитокинов, вырабатываемых Th17 лимфоцитами, в частности, ИЛ 17А, ИЛ17F, ИЛ 21 и ИЛ 22. Цитокины и транскрипционные факторы, характерные для Th1 и Th2 субпопуляций хелперных CD4+ лимфоцитов, ингибируют развитие Th17. В частности, ИФН-γ, продуцируемый Th1 клетками, и ИЛ 4, вырабатываемый Th2 хелперными лимфоцитами, подавляют дифференцировку Th17 клеток и продукцию ИЛ 17. Дифференцировка Th17 лимфоцитов угнетается под влиянием транскрипционных факторов Th1 (STAT1, STAT4 и T-bet) и Th2 (STAT6 и GATA3) клеток. В свою очередь, факторы дифференцировки Th17 клеток подавляют формирование Th1 и Th2 клонов. У человека клетки Th17 субпопуляции могут образовывать промежуточные формы дифференцировки с Th1, Th2 и Treg лимфоцитами и даже имитировать их функцию [107, 125, 142, 225]. Таким образом, представления о Т-клеточной иммунорегуляции были существенно дополнены сведениями о новой, уникальной субпопуляции CD4+ клеток, обозначенной как Th17. Филогенетическая древность этого иммунорегуляторного механизма объясняет его особую роль как в борьбе с инфекционными патогенами, прежде всего, внеклеточными бактериями и грибами, особенно на ранних этапах онтогенеза, так и способность поддерживать иммунные реакции, обычно реализуемые клетками иных субпопуляций Т-лимфоцитов (переходные Th17/Th1, Th17/Th2, Th17/Treg и «не классические» формы CD4+ клеток). Важно подчеркнуть, что цитокины, продуцируемые Th17 клетками, не всегда участвуют в воспалительной реакции, а в ряде экспериментов была продемонстрирована их противовоспалительная активность. Последнее наблюдение указывает на важность комплексной оценки цитокинового профиля Th17 лимфоцитов при воспалении, аллергических и аутоиммунных заболеваниях. Следующим закономерным шагом должно стать детальное 33 изучение механизмов Th17 – опосредованной иммунорегуляции в медицинской практике. Дисбаланс иммунорегуляторных механизмов приводит к недостаточности репродуктивной функции, в том числе нарушениям имплантации, спорадическому или ПНБ, неразвивающейся беременности, преждевременным родам и преэклампсии [21, 66, 68, 147, 212]. В 1993 году была предложена гипотеза, согласно которой беременность представляет собой “Th2 феномен”, т.е. материнские Th1 лимфоциты, опосредующие аллоспецифические цитотоксические реакции, ингибируются во время беременности, что предотвращает отторжение плода. При этом количество Th2 клеток, формирующих гуморальный иммунный ответ, увеличивается, препятствуя тем самым развитию тотальной иммуносупрессии [213]. Th2 концепция беременности нашла многочисленные подтверждения как в лабораторных исследованиях, так и в акушерской практике. Культуральная жидкость клеток трофобласта подавляла секрецию ИЛ 2, ИФН-γ и ФНО-α лимфоцитами, выделенным из периферической крови, в то время как продукция ИЛ 4 и ИЛ 10 не отличалась от контрольных значений. При этом экспрессия транскрипционных факторов GATA3 и STAT6 значительно возрастала, а STAT4 – снижалась; экспрессия T-bet не менялась. Эти результаты указывают на способность растворимых факторов, продуцируемых клетками трофобласта, смешать Th1/Th2 баланс в сторону преобладания Th2 механизмов [153]. Стимулированные антигенами трофобласта мононуклеарные клетки периферической крови женщин с ПНБ обладали эмбриотоксической активностью в 65% наблюдений, при этом в контрольных группах женщин с полноценной детородной функцией и мужчин эмбриотоксические эффекты отсутствовали. В 20 образцах культуральной жидкости мононуклеарных 34 клеток, обладавших эмбриотоксическими свойствами и сдержавших ИФН-γ, были обнаружены ФНО-α (100% образцов), ФНО-β (85% образцов), а Th2 цитокины обнаруживались в небольшом числе наблюдений - ИЛ 10 в 10% образцов и ИЛ 4 в 5% образцов. Напротив, образцы культуральной жидкости мононуклеарных клеток периферической крови женщин с полноценной детородной функцией не содержали Th1 цитокинов, однако ИЛ 10 выявлялся в большинстве образцов, а ИЛ 4 – в 23% образцов культуральной жидкости [124]. Т-клеточные клоны, выделенные из децидуальной ткани женщин с ПНБ, продуцировали значительно меньшие количества ИЛ 4 по сравнению с децидуальными Т-клеточными клонами беременных, которым был выполнен медицинский аборт, или полученными из эндометрия небеременных женщин [182]. Концентрация ИЛ 10 в сыворотке крови была значительно выше у женщин с физиологической беременностью, чем в случаях ПНБ. Напротив, уровни ИФН-γ и ФНО-α оказались повышенным в группе с ПНБ [93, 134]. Усиление спонтанной и митоген-индуцированной продукции ФНО-α, ИФН-γ и ИЛ 2 было выявлено при преэклампсии по сравнению с нормально протекающей беременностью. При этом наблюдалась достоверная положительная корреляционная связь между концентрациями Th1 цитокинов и цифрами среднего артериального давления [192]. В работах отечественных исследователей было показано повышение уровней провоспалительных цитокинов ФНО-α, ИФН-γ, ИЛ 1β, ИЛ 12 в сыворотке крови и цервикальной слизи при внутриутробной инфекции и угрозе прерывания беременности [39, 42, 45, 77]. При этом данные о содержании Th2 цитокинов при НБ оказалась противоречивыми. В ряде работ было показано снижение ИЛ 4 и ИЛ 10 по сравнению с контрольной группой женщин с физиологически протекающей беременностью [39, 77]. В другом исследовании, напротив, был отмечено повышение содержания ИЛ 4 в сыворотке крови и цервикальной слизи при НБ по сравнению с 35 контрольной группой [45]. При фето-плацентарной недостаточности также было отмечено повышение концентраций провоспалительных цитокинов ИФН-α, ИФН-γ и ИЛ 8 и снижение уровней ИЛ 4 и ИЛ 10 по сравнению с физиологически протекающей беременностью, что указывает на сдвиг Th1/Th2 баланса при этой патологии [11]. Выявленные закономерности были подтверждены в более поздних исследованиях: цитотоксический ответ иммунной системы матери в отношении плода предотвращается посредством смещения Th1/Th2 баланса в направлении доминирования Th2 субпопуляции хелперных Т-лимфоцитов и подавления Th1 провоспалительных иммунных механизмов [153, 190]. Позднее было показано, что Treg клетки играют важную роль в сохранении аллогенной беременности и индукции толерантности иммунной системы матери в отношении плода [92]. У женщин число циркулирующих CD4+CD25+ Treg лимфоцитов возрастает в раннем периоде беременности, достигая максимального уровня во втором триместре и снижаясь после родов до уровня, отмечаемого у небеременных женщин детородного возраста [198, 201]. При этом количество CD4+CD25+ клеток в децидуальной оболочке было в три раза выше, чем в периферической крови. Прерывание беременности сопровождалось снижением числа CD4+CD25+ Treg лимфоцитов в децидуальной оболочке и периферической крови до уровня небеременных женщин. ПНБ характеризуется снижением числа и нарушением функции CD4+CD25+ Treg клеток. [92]. Нарушение имплантации также может быть связано с несостоятельностью механизмов иммунорегуляции, связанных с недостатком Treg лимфоцитов [133]. Наконец, был показано, что число CD4+CD25+ Treg в децидуальной ткани и в периферической крови снижается при развитии преэклампсии [197]. 36 Роль Th17 механизмов и баланса Treg/Th17 при беременности недавно стали предметом пристального изучения [94, 191, 212]. К сожалению, до настоящего времени опубликованы результаты небольшого количества исследований, и зачастую они оказываются противоречивыми. ИЛ 17 был выявлен в клетках трофобласта и плацентарных макрофагах при физиологической беременности, прерывании беременности и при хорионаденоме [183]. При этом культуральная жидкость клеток трофобласта подавляла секрецию ИЛ 17 in vitro лимфоцитами периферической крови [153]. Показано, что ИЛ 17 увеличивает выработку прогестерона, что может также способствовать успешному вынашиванию беременности. Данные о числе Th17 клеток при беременности носят противоречивый характер. Так, по данным Santner-Nanan и соавт. [196], доля Th17 клеток периферической крови у беременных женщин в третьем триместре беременности значительно ниже, чем у небеременных женщин. Напротив, Nakashima и соавт. [174] не выявили изменения числа Th17 клеток в периферической крови при беременности, однако их количество в децидуальной ткани было выше, чем в периферической крови. Эти данные согласуются с результатами Hee и соавт. [123], не обнаружившими изменения концентрации сывороточного ИЛ 17 при нормальной беременности. Авторы сообщают о снижении концентрации ИЛ 17 в сыворотке крови в случаях преждевременных родов. Напротив, MartinezGarcia и соавт. [163] сообщают о повышении сывороточной концентрации ИЛ 17 в течение всей беременности, при этом наибольший уровень цитокина был отмечен в третьем триместре. Содержание Th17 клеток в децидуальной ткани оказалось значительно выше, чем в периферической крови. Возможно, это связано с тем, что полость матки не является абсолютно стерильной, и Th17 опосредованные иммунные механизмы обеспечении защиты от инфекционных патогенов. могут участвовать в 37 Усиление провоспалительных Th17 – опосредованных иммунных механизмов и подавление Treg клеток отмечено при ПНБ. Так, показано увеличение числа Th17 клеток в периферической крови и децидуальной оболочке, и превышение концентрации ИЛ 17 в культуральной жидкости CD4+ Т-лимфоцитов in vitro у женщин с ПНБ неясного генеза. При этом число и супрессорная активность Treg клеток оказались сниженными. Концентрация ИЛ 17 и ИЛ 23, а также экспрессия транскрипционного фактора RORc также оказались повышенными у женщин с ПНБ по сравнению с нормально протекающей беременностью [147, 154, 211]. Количество Th17 клеток в децидуальной ткани повышалось при состоявшемся прерывании беременности, при этом угроза прерывания беременности, не завершившаяся выкидышем, не сопровождалась изменением числа Th17 клеток, что указывает на вероятное участие цитокина в поздних, но не инициальных механизмах прерывания беременности [173]. Вопрос о том, является ли повышение числа и функциональной активности Th17 клеток причиной или следствием прерывания беременности, требует дальнейшего изучения [191]. Хориоамнионит – одна из основных причин преждевременных родов. Концентрация ИЛ 17 в амниотической жидкости оказалась выше в случаях преждевременных родов по сравнению со своевременными родами. Количество Th17 клеток в хориоамниотической мембране было повышенным при преждевременных родах в случаях, сопровождавшихся хориоамнионитом. Содержание ИЛ 17 в амниотической жидкости при преждевременных родах в случаях с хориоамнионитом было выше, чем при преждевременных родах без признаков хориоамнионита, и коррелировало с выраженностью воспаления [131]. Отсутствие увеличения числа Treg клеток и снижения доли Th17 лимфоцитов в периферической крови, характерных для нормально 38 протекающей беременности, было отмечено при преэклампсии [196]. Более того, в работе Darmochwal-Kolarz и соавт. [109] было показано увеличение числа ИЛ 17А - продуцирующих Т-лимфоцитов в периферической крови женщин с преэклампсией по сравнению с физиологически протекающей беременностью в третьем триместре. Напротив, количество CD4+CD25+Foxp3+ Treg клеток оказалось достоверно ниже. Также была продемонстрирована функциональная неполноценность Treg лимфоцитов при преэклампсии. Таким образом, представленные в литературе сведения указывают на несомненную роль иммунных механизмов как в возникновении и сохранении беременности, так и при различных вариантах репродуктивной патологии. Лишь комплексное изучение врожденных и адаптивных механизмов иммунного ответа, регулирующих гестационные процессы на тканевом и клеточном уровнях, в контексте их взаимодействия с эндокринными факторами, системой гемостаза и нервной системой позволит приблизиться к решению практической задачи предупреждения и лечения НБ. 39 ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Работа выполнена на базе гинекологической клиники ГБУЗ МО Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии (руководитель – д.м.н., профессор С.Н. Буянова), акушерского отделения патологии беременности (заведующая отделением – И.В. Михайленко), гинекологического отделения (заведующая отделением – Г.Р. Мухамадиева) и консультативно – диагностического отделения с цитогенетической лабораторией (заведующая отделением – Н.Н. Сухова) ГБУЗ Родильный Дом №3 ДЗ г. Москвы (главный врач – к.м.н. О.Г. Иванова). Общеклинические, гематологические, биохимические, гормональные и коагулологические лабораторные исследования выполнялись в отделении клинической лабораторной диагностики ГБУЗ Родильный Дом №3 ДЗ г. Москвы (заведующая отделением – О.В. Черепнина). Иммунологические лабораторные исследования проводились в лаборатории клинической иммунологии ГБУЗ МО Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского (руководитель - д.м.н., профессор В.В. Яздовский). 2.1 Общая клиническая характеристика беременных женщин Под нашим наблюдением находились 153 женщины в I или II триместре беременности в возрасте от 21 до 41 года, обследовавшиеся и получавшие лечение в период с 2011 по 2013 год. В основные группы вошли 118 женщин с угрозой прерывания беременности и/или ПНБ в анамнезе. Контрольную группу составили 35 женщин с неотягощенным акушерским анамнезом и благоприятным течением настоящей беременности. 40 Таким образом, для целей настоящего исследования нами были выделены следующие группы пациенток: пациентки с прерыванием беременности – группа I: 1. 1.1 пациентки с начавшимся абортом и абортом в ходу – подгруппа IА; 1.2 беременные с угрожающим абортом – подгруппа IБ; 2. беременные женщины с ПНБ в анамнезе – группа II. 3. женщины с благоприятным течением настоящей беременности и неосложненным акушерским анамнезом – контрольная группа. Отбор женщин для участия в исследовании осуществлялся на основании следующих формальных критериев: Критерии включения 1. Женщины в возрасте от 18 до 44 лет. 2. Беременность, I или II триместр. 3. Клиническая картина прерывания беременности – группа I: 3.1 начавшийся аборт или аборт в ходу – подгруппа IА; ИЛИ 3.2 угрожающий аборт – подгруппа IБ. ИЛИ 4. Благоприятное течение настоящей беременности: 4.1 Неосложненный акушерский анамнез – контрольная группа; ИЛИ 4.2 ПНБ в анамнезе – группа II. Критерии исключения Акушерские и гинекологические факторы 1. Аномалии анатомического строения матки: по данным гинекологического осмотра и УЗИ внутренних половых органов. 41 2. Хромосомные, генетические эмбриона/плода: по и структурные результатам аномалии медико-генетической консультации, данным семейного и индивидуального анамнеза, объективного осмотра и УЗИ плода. 3. Воспалительные заболевания мочеполовых органов, в том числе инфекции, передаваемые половым путём: по данным анамнеза, жалоб, общего и гинекологического осмотра, клинического анализа крови, клинического анализа мочи, исследования отделяемого мочеполовых органов и специальных лабораторных тестов. 4. Неразвивающаяся беременность: по данным УЗИ при отсутствии сердцебиения плода. Соматические факторы 5. Нарушения гемостаза и фибринолиза, в том числе наследственные и иммунные объективного тромбофилии: осмотра, по данным клинического анамнеза, жалоб, анализа крови, коагулограммы, ТЭГ, определения антифосфолипидных антител. 6. Эндокринная патология, в том числе заболевания щитовидной железы и сахарный диабет: по данным анамнеза, жалоб, объективного осмотра, исследования гормонального профиля, биохимического анализа крови, клинического анализа мочи. Лечение 7. Медикаментозное лечение (за исключением спазмолитических и седативных препаратов), назначение препаратов прогестерона. Общие 8. Тяжелые соматические, в том числе аутоиммунные и онкологические заболевания. 9. Тяжёлые инфекционные заболевания, в том числе ВИЧ инфекция. 42 Психические расстройства и злоупотребление (зависимость) 10. психотропными и наркотическими веществами. До наступления беременности у всех женщин имел место нормальный регулярный двухфазный менструальный цикл с нормальными значениями половых гормонов и нормальные показатели спермограммы супруга. Теоретический гестационный срок вычисляли у пациенток с регулярным менструальным циклом или известной датой овуляции (зачатия). Фактический гестационный срок определяли путем измерения среднего внутреннего диаметра плодного яйца и копчико-теменного размера эмбриона/плода с использованием нормативов зависимости данных показателей от срока гестации [16]. Оценивали сердечную деятельность эмбриона/плода, регистрировали двигательную активность, производили оценку размеров и структуры хориона, визуализацию желточного мешка. Для оценки роста и развития эмбриона/плода кроме общепринятого измерения копчико-теменного размера измеряли бипариетальный размер головки, окружность головки, окружность живота, длину бедра. Эмбрио/фетометрические параметры, соответствующие гестационному сроку свидетельствовали о физиологически протекающей беременности. Угрожающий аборт диагностировали на основании типичной клинической картины, включавшей ощущение тяжести, тянущие или схваткообразные боли внизу живота и в пояснично-крестцовой области, наличие мажущих темных выделений из половых путей. Величина матки соответствовала сроку беременности, наружный зев шейки матки закрыт, тонус матки повышен. Для уточнения диагноза использовали ультразвуковое обследование и данные лабораторных исследований. В подгруппу пациенток с начавшимся абортом и абортом в ходу вошли женщины со схваткообразными болями внизу живота и в области крестца, 43 кровянистыми выделениями или выраженным кровотечением из половых путей. При ультразвуковом исследовании определялось отслоение плодного яйца, его перемещение в канал шейки матки или выход из полости матки. Величина матки соответствовала или была меньше срока гестации. Отмечалось раскрытие канала шейки матки или подтекание околоплодных вод. ПНБ диагностировали на основании двух и более подряд самопроизвольных прерываний беременности в анамнезе, предшествовавших наступлению настоящей беременности. 2.2 Клинико-лабораторное и инструментальное обследование Все пациентки прошли полное клинико-лабораторное обследование, включавшее: сбор данных анамнеза (общий и специальный анамнез, возраст, характер работы, условия жизни и питания, наследственность, перенесенные заболевания в детском возрасте и в период полового созревания, выявление наследственных, генитальных и экстрагенитальных, аутоиммунных заболеваний, возраст менархе, характер менструальной и генеративной функции, перенесенные гинекологические заболевания, количество беременностей, течение и исходы предыдущих беременностей, течение предшествующих родов); объективный осмотр (тип телосложения, индекс массы тела, характер оволосения); специальное гинекологическое исследование (особенности развития наружных половых органов, состояния слизистых влагалища, шейки матки, определение положения, размеров, консистенции, болезненности матки и придатков, соответствие размеров матки 44 гестационному сроку по данным последней нормальной менструации, характер выделений); клинический и биохимический анализ крови, клинический анализ мочи; ультразвуковое исследование матки и эмбриона/плода (состояние миометрия, наличие плодного яйца и экстраэмбриональных структур, визуализация эмбриона, выяснение жизнеспособности эмбриона (наличие сердцебиения на ранних сроках), соответствие развития эмбриона/плода гестационному сроку, определение характера имплантации/плацентации, наличие патологических образований в шейке матки, матке ретрохориальной и придатках, гематомы, диагностика ультразвуковая наличия фетометрия, допплерометрия); анализ мазка из уретры, цервикального канала, влагалища на флору и степень чистоты; исследование гормонального профиля: ХГЧ, ЛГ, ФСГ, α-фетопротеин и прогестерон, тиреотропный гормон (ТТГ), свободный тироксин (Т4 св.), свободный трийодтиронин (Т3 св.); исследование системы гемостаза (коагулограмма, тромбоэластография - ТЭГ); иммунологическое фенотипа обследование лимфоцитов содержания (исследование периферической цитокинов в поверхностного крови, сыворотке определение крови, выявление мультичастотным конвексным антифосфолипидных антител); Ультразвуковое исследование эмбриона и плода Абдоминальное УЗИ проводилось преобразователем с частотами 2,5-5 Мгц на ультразвуковом сканнере 45 Acuson/Siemens 128 XP/10 Art, а также мультичастотным конвексным преобразователем с частотами 2,8-5 Мгц на ультразвуковом сканнере Sonoline Siemens G20. Эндовагинальное УЗИ проводилось мультичастотным эндовагинальным конвексным преобразователем с частотами 4-9 МГц на ультразвуковом сканнере Acuson/Siemens 128 XP/10 Art, мультичастотным конвексным преобразователем с частотами 5-9 МГц на ультразвуковом сканнере Sonoline Siemens G20, с пустым мочевым пузырем, в случаях головного предлежания, при подозрении на аномалии головки плода и лица, или при тазовом предлежании, при подозрении на аномалии спинного мозга. Исследование гормонального профиля Концентрации гормонов и α-фетопротеина определяли с помощью иммунохимического анализатора Access 2 (Beckman Coulter, Inc., США). В системе используется метод гетерогенного иммуноферментного анализа. Антитела, иммобилизованные на парамагнитных частицах, связываются с определяемым веществом в клиническом образце и специфическими реагентами. Образующиеся иммунные комплексы, связанные с парамагнитными частицами, отделяются от несвязанных с помощью магнитного поля. Хемилюминесцентный субстрат реагирует с ферментной меткой, присутствующей в связанных комплексах, в результате происходит эмиссия света. Интенсивность светового потока измеряется люменометром. Полученная величина преобразуется системой в концентрацию определяемого вещества в образце. Исследование системы гемостаза Параметры коагуляционного гемостаза оценивали с помощью анализатора показателей гемостаза АПГ4-02П ЭМКО. Оценивали следующие показатели: активированное парциальное (частичное) тромбопластиновое 46 время (АЧТВ), протромбиновое время, протромбин по Квику, тромбиновое время (ТВ), содержание фибриногена по общепринятым методикам. ТЭГ исследование проводили с использованием прибора TEG® 5000 (Haemoscope Corporation, США). Анализатор ТЭГ записывает кинетические изменения, такие как образование сгустка, ретракция и лизис в образцах цельной крови, плазмы или плазмы обогащенной тромбоцитами. После компьютерной обработки процессы тромбообразования и фибринолиза представлены в виде кривой, схема которой изображена на рисунке 1. Основные показатели, описывающие кривую, это R - время реакции. Время с момента, когда образец был помещен в анализатор, до момента образования первых нитей фибрина. Представляет собой характеристику энзиматической (плазменной) части коагуляционного каскада. K - время коагуляции. Время с момента начала образования сгустка до достижения фиксированного уровня прочности сгустка (амплитуды = 20 мм). K отражает кинетику увеличения прочности сгустка. α - угол расхождения. Угол, построенный по касательной к тромбоэластограмме из точки начала образования сгустка. Отображает скорость роста фибриновой сети и её структурообразование (увеличение прочности сгустка). Характеризует уровень фибриногена в плазме. МА - максимальная амплитуда. Характеризует максимум динамических свойств соединения фибрина и тромбоцитов посредством GPIIb/IIIa и отображает максимальную прочность сгустка. На 80% МА обусловлена количеством и свойствами (способностью к агрегации) тромбоцитов, на 20% - количеством образовавшегося фибрина. A – амплитуда тромбоэластограммы в последний момент времени в течение настоящего измерения. Если тромбоэластограмма уже закончена, то 47 А - это последняя измеренная амплитуда (в момент окончания написания тромбоэластограммы). G – расчетный показатель, характеризующий плотность сгустка. CI – коагуляционный индекс. Является производным параметром от R, K, MA и угла расхождения (α), и характеризует коагуляционный потенциал крови пациента в целом. Нормальные значения для коагуляционного индекса лежат в диапазоне между -3.0 и +3.0. Положительные значения вне этого диапазона (CI > +3.0) указывают, что образец находится в гиперкоагуляции, тогда как отрицательные значения вне этого диапазона (CI < -3.0) указывают, что образец в гипокоагуляции. LY30 - изменение площади под кривой тромбоэластограммы в течение следующих за достижением MA 30 минут, по отношению к площади под кривой тромбоэластограммы без признаков лизиса (прямоугольник с высотой МА), выраженное в процентах. Представляет собой характеристику процесса растворения сгустка – лизиса. Рисунок 1. Схема ТЭГ кривой. Процессы образования сгустка и фибринолиза. 48 Иммунологические методы Исследование популяционного и субпопуляционного состава и активационных маркеров лимфоцитов периферической крови проводили методом 4-цветной лазерной проточной цитометрии c использованием прибора FACSCalibur (Becton Dickinson, США) и моноклональных антител (Becton Dickinson, США). Определяли экспрессию CD3+, CD3/CD4+, CD3/CD8+, CD3–CD16+56+, CD3+CD16+CD56+, CD19+, CD3+HLA-DR+, CD3– HLA-DR+, CD3+CD25+, CD4+CD25+, CD3+CD95+ антигенов. Определение концентрации цитокинов ИФН-γ, ИЛ 4, ИЛ 17А, ИЛ 17F, ИЛ 21 и ИЛ 22 в сыворотке крови проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием наборов реагентов фирмы eBioscience, США. В основе метода лежит взаимодействие цитокина, содержащегося в сыворотке крови, с моноклональным антителом к цитокину, иммобилизованным на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок). На первой стадии анализа цитокин, содержащийся в калибровочных и исследуемых пробах, связывается внутренней поверхности с антителами, иммобилизованными на лунок. На второй стадии анализа иммобилизованный цитокин взаимодействует с теми же антителами, конъюгированными с пероксидазой. Количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству цитокина в исследуемом образце. Во время инкубации с субстратной смесью происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся меченых антител. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочной кривой рассчитывается концентрация цитокина в определяемых образцах. Аналитические характеристики наборов реагентов для определения цитокинов: ИФН-γ - Диапазон измерения: 0.06-10.0 пг/мл. Чувствительность: 0.06 пг/мл. 49 ИЛ 4 - Диапазон измерения: 2.0-500.0 пг/мл. Чувствительность: 2.0 пг/мл. ИЛ 17А - Диапазон измерения: 0.5-100.0 пг/мл. Чувствительность: 0.5 пг/мл. ИЛ 17F - Диапазон измерения: 15.5-2000.0 пг/мл. Чувствительность: 15.5 пг/мл. ИЛ 21 - Диапазон измерения: 20-5000 пг/мл. Чувствительность: 20 пг/мл. ИЛ 22 - Диапазон измерения: 5-2000 пг/мл. Чувствительность: 5 пг/мл. Антифосфолипидные антитела определяли методом иммуноферментного анализа для выявления антител к кардиолипину классов IgG и IgM в комплексе с рекомбинантным бета2-гликопротеином I человека. 2.3 Статистическая обработка результатов исследования Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы PASW Statistics 18. Рассчитывали параметры описательной статистики: средняя величина, ее стандартная ошибка, минимум, максимум, медиана. Для определения статистической обоснованности различия исследуемых групп применяли непараметрический U-критерий Манна – Уитни. Критерий согласия Пирсона (Хи-квадрат) служил для анализа различия частот в двух независимых группах. Для оценки характера, силы и достоверности связи отдельных показателей использовали коэффициент линейной корреляции Пирсона. В таблицах представлены средняя величина (M) и ее стандартная ошибка (m) для каждого показателя. На рисунках отражены средние величины изучаемых показателей. 50 ГЛАВА 3 КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНАЯ И ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЗЛИЧНЫХ КЛИНИЧЕСКИХ ВАРИАНТОВ НЕВЫНАШИВАНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ Беременность представляет «иммунологического собой сосуществования» уникальный генетически и феномен антигенно неидентичных организмов матери и плода [68, 191, 212]. Возникновение и вынашивание беременности возможно благодаря уникальному сочетанию защитно-приспособительных нервной системами, механизмов, системой реализуемых гемостаза. эндокринной, Однако механизмы иммунологической толерантности играют центральную роль [68, 175]. Угрожающий аборт, начавшийся аборт и аборт в ходу являются этапами патологического процесса, приводящего к утрате беременности. Несмотря на большое количество исследований, посвященных изучению причин и механизмов разработке самопроизвольного новых подходов к прерывания лечению, беременности, проблема а также сохраняет свою актуальность [1, 64]. Беременность у женщин с ПНБ в анамнезе представляет собой модель для изучения адаптивных и патогенетических механизмов, при этом особую ценность представляет клиническими, сопоставление получаемых результатов иммунологическими, гемостазиологическими данными, полученными с гормональными, в группе с самопроизвольным прерыванием беременности. Не вызывает сомнения важная роль иммунных механизмов в патогенезе НБ. В многочисленных публикациях обсуждаются количественный и функциональный дисбаланс важнейших популяций и субпопуляций иммунокомпетентных клеток, в том числе Т-хелперов 1-го и 2-го типов, 51 эффекторных цитотоксических клеток, процессы активации и апоптоза, миграции лимфоцитов, особенности цитокинового профиля крови и других биологических жидкостей [39, 45, 66, 68, 77, 151, 212]. Тем не менее, иммунные механизмы НБ нельзя рассматривать вне контекста общего клинического состояния, эндокринных, гемостазиологических и иных нарушений в организме беременной женщины, которые могут вызывать или способствовать сдвигам в иммунной системе, либо выступать в роли эффекторных механизмов иммунопатологического процесса [45, 57, 95]. В данной главе представлены результаты комплексного клиниколабораторного и инструментального обследования женщин с различными вариантами НБ, а также проанализирована их взаимосвязь с показателями иммунного статуса. 3.1 Клиническая характеристика, инструментальных различными методов клиническими данные лабораторных обследования вариантами женщин и с невынашивания беременности В основную группу вошли 67 женщин с прерыванием беременности (группа I), в том числе 29 с начавшимся абортом и абортом в ходу (продгруппа IА) и 38 с угрожающим абортом (подгруппа IБ), и 51 женщина с ПНБ в анамнезе и благоприятным течением настоящей беременности (группа II). Контрольную группу составили 35 женщин с неотягощенным акушерским анамнезом и благоприятным течением настоящей беременности. Общий и акушерско-гинекологический анамнез. Клинические данные. Основные демографические показатели и акушерский статус женщин, принявших участие в исследовании, представлены в таблице 1. 52 Таблица 1. Основные демографические показатели и акушерский статус женщин с НБ Показатель Группа I Группа II Контрольная группа IА IБ Возраст, лет 29,1±0,5 * 32,5±1,0 *** 36,3±0,6 *** 26,9±0,7 Возраст менархе, лет 13,5±0,3 * 13,3±0,2 * 12,6±0,2 * 11,8±0,3 Число беременностей 2,69±0,25 *** 2,36±0,16 *** 6,00±0,26 *** 1,43±0,10 Число родов 1,54±0,10 1,45±0,12 1,30±0,09 1,29±0,07 Примечание: * - p<0,05; *** - p<0,001, достоверность различия показателя по сравнению с контрольной группой. Таблица 2. Возрастная структура групп женщин с НБ Возраст, лет Группа I Группа II Контрольная группа IА IБ 21 - 25 2 (7%) *** 5 (13%) *** 0 (0%) *** 17 (49%) § 26 - 30 22 (78%) *** 17 (44%) * 5 (10%) 8 (23%) 31 - 35 3 (8%) 5 (13%) 15 (29%) 10 (28%) 36 - 40 2 (7%) 9 (24%) ** 31 (61%) *** 0 (0%) 41 и старше 0 (0%) 2 (6%) 0 (0%) 0 (0%) Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001, достоверность различия показателя по сравнению с контрольной группой. § - p<0,05, достоверность различия показателя по сравнению с подгруппой IБ. 53 Пациентки в подгруппах IА и IБ оказались несколько старше женщин контрольной группы, что могло явиться одним из факторов риска прерывания беременности. Средняя разница в возрасте составила около 2 лет для подгруппы IА и более 5 лет для подгруппы IБ. Пациентки в группе II оказались в среднем на 10 лет старше, чем женщины контрольной группы. Разница в возрасте была закономерно связана с неблагоприятными исходами нескольких предшествовавших беременностей при ПНБ. Однако все женщины основных и контрольной групп находились в активном репродуктивном возрасте. Возрастная структура основных и контрольной групп представлена в таблице 2. Данные о профессии и трудовой деятельности беременных женщин представлены в таблице 3. Каких-либо значимых различий между подгруппами IА и IБ и контрольной группой нам выявить не удалось. Обращает на себя внимание большая вовлеченность пациенток из II группы в формальную трудовую деятельность: доля домохозяек среди них была в 2,5 раза ниже, чем в контрольной группе. Напротив, число служащих учреждений было больше в два раза. Наблюдалась тенденция к увеличению доли женщин, работа которых была связана с физическим трудом, не достигающая, однако, статистически значимого уровня. Следует отметить, что никто из обследованных женщин не был связан с вредными производствами и тяжелым физическим трудом. Для более полной характеристики групп женщин с НБ и контрольной группы мы проанализировали данные анамнеза о перенесенных ими общих соматических, инфекционные и гинекологических заболеваниях. Из таблицы 4 видно, что спектр перенесенных заболеваний существенных различий между группами не имел, однако частота детской инфекционной и общей инфекционной заболеваемости была значительно выше у пациенток с НБ, особенно в подгруппе IА. 54 Таблица 3. Профессия и трудовая деятельность Профессия Группа I IА 2 (7%) 2 (7%) 2 (7%) 4 (14%) IБ 2 (5%) 4 (11%) 3 (8%) 2 (5%) Группа II Контрольная группа Преподаватель в школе 6 (12%) 3 (9%) Преподаватель в ВУЗе 5 (10%) 3 (9%) Научный работник 3 (6%) 2 (5%) Врач 2 (4%) * 7 (20%) Работа, связанная с 2 (7%) 3 (8%) 10 (20%) 3 (9%) физическим трудом Домашняя хозяйка 12 (41%) 10 (26%) 6 (12%) * 11 (31%) Служащая учреждения 5 (17%) 14 (37%) 19 (36%) * 6 (17%) Примечание: * - p<0,05, достоверность различия показателя по сравнению с контрольной группой. 55 Таблица 4. Перенесенные заболевания Структура заболеваемости Группа I IА IБ Группа II Контрольная группа Инфекционные заболевания Детские инфекции (ветряная 27 (93%) *** §§ 23 (61%) ** 26 (51%) * 9 (26%) оспа, корь, паротит, краснуха) Хронический тонзиллит 23 (79%) *** § 20 (52%) ** 39 (76%) *** 7 (20%) Ангина 18 (62%) *** 27 (70%) *** 37 (72%) *** 7 (20%) §§§ Частые ОРВИ 29 (100%) *** 21 (56%) * 19 (37%) 9 (26%) Соматические заболевания Сердечно-сосудистые 14 (48%) ** 10 (26%) 8 (16%) 4 (11%) заболевания Заболевания органов 13 (45%) *** 13 (35%) ** 16 (31%) ** 2 (6%) мочевыделения Заболевания органов дыхания 6 (21%) 10 (26%) * 1 (2%) 2 (6%) §§§ Заболевания ЖКТ 22 (76%) *** 8 (22%) 9 (18%) 3 (9%) Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001, достоверность различия показателя по сравнению с контрольной группой. § - p<0,05; §§ - p<0,01; §§§ - p<0,001, достоверность различия показателя по сравнению с подгруппой IБ. 56 Из анамнеза было выяснено, что в основных группах в детстве часто отмечались такие заболевания, как корь, паротит, коклюш, ветряная оспа, скарлатина. В контрольной группе их было значительно меньше. Также в анамнезе у женщин с НБ часто отмечались ангина и частые ОРВИ. Столь высокая инфекционная заболеваемость свидетельствует о вероятных нарушениях в системах, контролирующих инфекционные процессы в организме у женщин, отнесенных к группам НБ, что является значимым фактором риска НБ [73]. Заболевания органов мочевыделения, представленные в основном хроническим пиелонефритом в стадии ремиссии, также в определённой степени были связаны с персистированием в организме инфекционного патогена. В I группе пациенток значительно чаще встречались хронические соматические заболевания. Заболевания сердечно-сосудистой системы были представлены преимущественно вегето-сосудистой дистонией по смешанному типу. Патология органов дыхания – хроническими бронхитами, пневмонией; желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) - хроническим гастритом. Напротив, мы не выявили увеличения частоты сердечно-сосудистых заболеваний и болезней органов дыхания у женщин II группы. Отягощенность соматического и инфекционного анамнеза у пациенток с НБ могла оказать влияние на становление менструальной функции. Только 84% обследованных женщин в I группе начали менструировать своевременно, в возрасте от 11 до 14 лет. В 11 случаях, или 16%, отмечено позднее наступление менархе. Средний возраст менархе составил 13,4±0,2 лет в группе I и 11,8±0,3 лет - в контрольной группе (p<0,05). Менархе у женщин II группы также наступало в более позднем возрасте, чем в контрольной группе. У 9 женщин (18%) отмечено позднее наступление менархе (как и в группе пациенток с прерыванием беременности). Средний возраст менархе составил 12,6±0,2 лет в группе II (p<0,05 по сравнению с 57 контрольной группой). Можно предположить, что высокая инфекционная заболеваемость (в том числе детскими инфекциями) является общим фактором риска, обусловившим более позднее половое созревание женщин в группах I и II. К моменту наступления беременности у подавляющего большинства обследованных женщин менструальный цикл был регулярным. Данные представлены в таблице 5. В среднем продолжительность цикла была 28,8±0,3 дней в группе I, 28,2±0,4 дней в группе II и 27,4±0,6 дней - в контрольной группе (p>0,05). Болезненные менструации отмечали 25 (37%) пациенток группы I, 16 (31%) пациенток группы II и 12 (34%) пациенток контрольной группы. Таблица 5. Продолжительность менструального цикла Группа I Менструальный Контрольная Группа II цикл группа IА IБ 21-24 дня 4 (14%) 5 (13%) 5 (10%) 3 (9%) 25-27 дней 5 (17%) * 5 (13%) ** 11 (21%) 14 (40%) 28 - 30 дней 19 (65%) 25 (66%) 35 (69%) 18 (51%) 31-33 дня 1 (4%) 3 (8%) 5 (10%) 0 (0%) Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,01, достоверность различия показателя по сравнению с контрольной группой. В таблице 6 представлен анализ патологии репродуктивной системы исследуемых групп женщин. Хронический эндометрит значительно чаще встречался в группе I (у 38 женщин, 57%), чем в контроле (у 3 женщин, 9%). Эрозия шейки матки у 22 женщин, 33%, в контроле - у 9 женщин, 26%. 58 Таблица 6. Перенесенные гинекологические заболевания Патология Группа I IА IБ Группа II Контрольная группа Воспалительные заболевания Хронический эндометрит 16 (55%) *** 22 (58%) *** 44 (86%) *** 3 (9%) Хронический 15 (52%) ** 20 (53%) ** 40 (78%) *** 7 (20%) сальпингоофорит Цервициты 26 (90%) *** §§§ 2 (5%) 13 (25%) * 2 (6%) Кольпиты 15 (52%) *** 11 (29%) * 31 (61%) *** 3 (9%) Инфекции, передаваемые 9 (31%) 11 (29%) 18 (35%) 6 (17%) половым путем Гиперпластические, дистрофические и опухолевые заболевания Эрозия шейки матки 12 (41%) 10 (26%) 15 (29%) 9 (26%) Эндометриоз 5 (17%) ** 4 (10%) * 9 (18%) ** 0 (0%) Миома матки 1 (3%) 1 (3%) 4 (8%) 3 (9%) Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001, достоверность различия показателя по сравнению с контрольной группой. §§§ - p<0,001, достоверность различия показателя по сравнению с подгруппой IБ. 59 В группе II хронический эндометрит был диагностирован у 44 женщин, 86%. Хронический сальпингоофорит - у 40 женщин, 78%, (7 женщин, 20% в контроле). Эндометриоз – у 9 женщин, 18% (в контрольной группе не диагностирован). Цервициты – 13 женщин, 25% (2 женщины, 6% в контроле). Кольпиты – 31 женщина, 61% (3 женщины, 9% в контрольной группе). В результате проведенного анализа выявлено частое сочетание воспалительных заболеваний внутренних половых органов с заболеваниями шейки матки и влагалища при НБ. У женщин группы I хронический сальпингоофорит в сочетании с эрозией шейки матки обнаружен у 17 женщин, 25%; с кольпитом — у 17 женщины, 25%; с цервицитом - у 23 женщин, 34%. Хронический эндометрит в сочетании с эрозией шейки матки обнаружен у 10 женщин, отнесенных к группе I, 15%; с цервицитом - у 21 женщины, 31%; с кольпитом - у 25 женщин, 37%. В группе II хронический сальпингоофорит в сочетании с кольпитом обнаружен у 15 женщин, 29%; с цервицитом - у 9 женщин, 18%. Хронический эндометрит в сочетании с цервицитом обнаружен у 7 женщин, 14%; с кольпитом - у 16 женщин, 31%. У женщин контрольной группы такие сочетания встречалось гораздо реже: хронический сальпингоофорит в сочетании с эрозией шейки матки был обнаружен только у 3 женщин, 9%; хронический эндометрит в сочетании с эрозией шейки матки - у 2 женщин, 6%. Приведенные выше сведения свидетельствуют о вероятном снижении барьерной функции гениталий нижнего отдела и восходящем характере инфицирования у женщин основных групп. Мы проанализировали время наступления первой беременности от момента начала половой жизни у женщин всех групп. Данные представлены в таблице 7. 60 Таблица 7. Время наступления беременности от момента начала половой жизни Группа I Время Контрольная Группа II наступления группа IА IБ 1-й год 3 (10%) *** 2 (5%) *** 6 (12%) *** 28 (80%) 2-й год 12 (42%) 10 (26%) 25 (49%) ** 7 (20%) 3-й год и 14 (48%) *** 26 (69%) *** 20 (39%) *** 0 (0%) позже Примечание: ** - p<0,01; *** - p<0,001, достоверность различия показателя по сравнению с контрольной группой. В группе I наступление беременности на первом году половой жизни произошло только у 5 пациенток, 7%; величина показателя более чем в 10 раз ниже, чем в контрольной группе. На втором году беременность наступила у 22 пациенток, 33%. В группе II наступление беременности на первом году половой жизни произошло только у 6 пациенток, 12%. На втором году беременность наступила у 25 пациенток, 49%. Все женщины контрольной группы забеременели в течение первых двух лет с момента начала половой жизни. Напротив, 40 пациенток в группе I, 60%, и 20 пациенток в группе II, 39%, смогли забеременеть только на третьем году от начала половой жизни или позднее. Более позднее наступление беременности может быть связано с более высокой инфекционной, соматической и гинекологической заболеваемостью женщин в основных группах, приводящей к нарушению их репродуктивной функции [73]. Большее среднее число беременностей в группах с НБ по сравнению с контрольной группой (таблица 1) побудило нас провести анализ исходов предшествовавших беременностей. Как видно из таблицы 8, пациентки основных групп имели отягощенный акушерский анамнез. 61 Таблица 8. Структура исходов предшествовавших беременностей у женщин с НБ Показатель Группа I IА 78 (100%) 35 (44,9%) *** 10 (12,8%) ** 9 (11,5%) IБ 90 (100%) 43 (47,8%) *** 14 (15,5%) ** 9 (10,0%) Группа II Контрольная группа Число беременностей 307 (100%) 50 (100%) Своевременные роды 44 (14,3%) *** 46 (92,0%) Преждевременные роды 20 (6,5%) 0 (0%) Искусственный аборт 21 (6,8%) 2 (4,0%) Самопроизвольный 15 (19,3%) *** 12 (13,3%) *** 179 (58,4%) *** 0 (0%) выкидыш Неразвивающаяся 9 (11,5%) 7 (7,8%) 32 (10,4%) 2 (4,0%) беременность Внематочная 0 (0%) § 5 (5,6%) 11 (3,6%) 0 (0%) беременность Примечание: ** - p<0,01; *** - p<0,001, достоверность различия показателя по сравнению с контрольной группой. § - p<0,05, достоверность различия показателя по сравнению с подгруппой IБ. 62 Обращает на себя внимание превышение числа искусственных абортов над показателем контрольной группы. В среднем, на каждую женщину с благоприятно протекающей настоящей беременностью приходилось 0,07±0,04 медицинских аборта, в то время как в подгруппе IБ – 0,25±0,06 (p<0,05), в подгруппе IА – 0,31±0,07 (p<0,01), а в группе II – 0,40±0,09 (p<0,01). Вероятно, искусственные аборты в анамнезе явились одним из факторов риска НБ, которые в совокупности привели к росту среднего числа неблагоприятных исходов беременности (выкидыш, неразвивающаяся беременность, внематочная беременность) с 0,08±0,04 на каждую женщину в контрольной группе до 0,62±0,10 в подгруппе IБ (p<0,001), 0,85±0,18 в подгруппе IА (p<0,001) и 4,40±0,24 в группе II у (p<0,001); только 64 беременности (20,8%) завершились родами, своевременными или преждевременными, в последней группе. Клинический и биохимический анализ крови Клинический анализ крови является одним из наиболее распространенных и высокоинформативных методов скрининговой оценки состояния организма. Мы проанализировали показатели красной и белой крови у пациенток с НБ и в контрольной группе женщин с благоприятно протекающей беременностью. Данные о количестве тромбоцитов представлены в разделе, посвященном гемостазу. Показатели красной крови представлены в таблице 9. Нам не удалось выявить значимых различий между группами обследованных женщин. 63 Таблица 9. Показатели красной крови у пациенток с НБ Группа I Показатель IА IБ Группа II Контрольная группа Гемоглобин, 120,92±2,16 119,64±1,38 117,40±1,90 117,57±1,08 г/л Эритроциты, 3,91±0,08 3,75±0,04 3,81±0,06 3,79±0,04 клеток х 1012/л Гематокрит, % 36,98±0,76 36,25±0,39 36,90±0,40 36,29±0,33 Примечание: статистически значимые различия между обследованными группами отсутствовали. На рисунке 2 представлены средние показатели лейкоцитарной формулы в группах с НБ и у женщин контрольной группы. При анализе показателей белой крови мы обнаружили, что подгруппа IБ характеризовалась преобладанием клеток миелоидного ряда. 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Подгруппа IА Подгруппа IБ палочкоядерные нейтрофилы эозинофилы лимфоциты Группа II Контрольная группа сегментоядерные нейтрофилы базофилы моноциты Рисунок 2. Лейкоцитарная формула пациенток с НБ. 64 Таблица 10 приводит средние абсолютные значения содержания различных популяций лейкоцитов в периферической крови. Видно, что как относительное, так и абсолютное содержание палочкоядерных, сегментоядерных нейтрофилов и эозинофилов в подгруппе IБ выше, чем в контрольной группе. В частности, процент палочкоядерных нейтрофилов составил 3,82±0,39 (2,86±0,25 в контроле, p<0,05), сегментоядерных нейтрофилов – 66,36±1,03 (59,43±1,03 в контроле, p<0,001), эозинофилов – 2,09±0,63 (0,79±0,12 в контроле, p<0,05). Напротив, относительное и абсолютное содержание в крови лимфоцитов в подгруппе IБ оказалось ниже, чем при физиологической беременности; процент лимфоцитов составил 19,73±1,08 по сравнению с 27,50±0,94 в контроле (p<0,001). Это наблюдение важно для обсуждения особенностей цитокинового профиля при угрожающем аборте, поскольку косвенно указывает на стимуляцию миелоидного ростка кроветворения. Важным нам представляется изменение картины крови при прогрессировании патологического процесса прерывания беременности до начавшегося аборта и аборта в ходу. Мы отметили прирост общего числа лейкоцитов в периферической крови. При этом, несмотря на некоторое снижение относительного содержания нейтрофилов (процент палочкоядерных нейтрофилов составил 2,92±0,33 по сравнению с 3,82±0,39 в подгруппе IА, p<0,05; сегментоядерных нейтрофилов – 62,46±1,32 по сравнению с 66,36±1,03, p<0,05), абсолютное содержание нейтрофильных лейкоцитов в периферической крови практически не изменилось. Напротив, мы наблюдали существенное увеличение относительного (24,92±1,16 процентов по сравнению с 19,73±1,08, p<0,05) и абсолютного числа лимфоцитов. Таким образом, рост числа лейкоцитов при спонтанном аборте происходил за счет лимфоцитарной популяции, что указывает на вероятную патогенетическую роль лимфоидных клеток. 65 Таблица 10. Абсолютное содержание лейкоцитарных клеток различных популяций в периферической крови пациенток с НБ Показатель Группа I IА IБ Группа II Контрольная группа Лейкоциты, общ 9,64±0,47 * 8,87±0,50 8,64±0,34 8,16±0,26 (клеток х 109/л) Палочкоядерные нейтрофилы 0,28±0,03 0,38±0,06 * 0,35±0,03 ** 0,25±0,03 9 (клеток х 10 /л) Сегментоядерные нейтрофилы 5,99±0,28 ** 5,86±0,33 * 5,65±0,29 ** 4,85±0,19 9 (клеток х 10 /л) Эозинофилы 0,11±0,02 * 0,23±0,09 * 0,09±0,01 0,06±0,01 (клеток х 109/л) Базофилы 0,01±0,01 0,01±0,01 0,00±0,00 0,01±0,01 (клеток х 109/л) Лимфоциты 2,42±0,18 §§ 1,72±0,13 ** 1,93±0,08 * 2,24±0,10 9 (клеток х 10 /л) Моноциты 0,91±0,08 0,76±0,04 0,70±0,04 0,71±0,03 (клеток х 109/л) Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,01, достоверность различия показателя по сравнению с контрольной группой. §§ - p<0,01, достоверность различия показателя по сравнению с подгруппой IБ. При анализе показателей белой крови в группе II (рисунок 2) мы обнаружили преобладание клеток миелоидного ряда. В частности, процент палочкоядерных нейтрофилов составил 4,10±0,32 (2,86±0,25 в контроле, p<0,01), сегментоядерных нейтрофилов – 64,60±1,29 (59,43±1,03 в контроле, p<0,01). Доля лимфоцитов оказалась меньше, чем в контрольной группе. Процент лимфоцитов составил 23,00±1,04 по сравнению с 27,50±0,94 в контроле (p<0,01). 66 Таблица 11. Показатели биохимического анализа крови у женщин с НБ Показатель Группа I IА 70,23±0,74 * 45,74±0,91 3,98±0,15 *** 63,59±1,49 IБ 68,24±0,81 43,64±0,72 2,95±0,09 62,09±2,21 Группа II Контрольная группа Общий белок, г/л 67,58±0,81 68,74±0,68 Альбумин, г/л 42,61±1,10 ** 43,94±0,74 Мочевина, ммоль/л 3,35±0,14 * 2,96±0,09 Креатинин, мкмоль/л 63,35±1,60 * 56,15±2,82 Мочевая кислота, 264,78±21,62 218,47±12,91 234,50±5,41 241,86±9,41 мкмоль/л Билирубин общий, 13,69±0,71 * 11,56±1,11 9,38±0,66 10,83±0,59 мкмоль/л Калий, ммоль/л 4,17±0,07 3,99±0,13 4,11±0,07 4,23±0,06 Натрий, ммоль/л 140,05±0,77 ** 138,50±0,51 140,46±0,60 *** 136,37±0,76 Кальций, ммоль/л 2,16±0,07 2,21±0,04 1,97±0,09 2,21±0,06 Магний, ммоль/л 0,97±0,02 0,93±0,03 0,93±0,02 0,95±0,02 Железо, мкмоль/л 20,80±1,18 23,05±1,11 23,12±0,90 21,05±0,96 Хлор, ммоль/л 111,79±1,76 *** 106,26±0,80 109,64±0,98 *** 105,23±0,62 АЛАТ, Ед/л 31,46±1,95 26,93±1,52 40,41±4,80 31,24±3,85 АСАТ, Ед/л 34,88±1,22 32,78±1,47 37,92±2,73 37,38±2,86 Глюкоза, ммоль/л 5,60±0,26 *** 4,39±0,17 4,45±0,13 4,37±0,09 Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001, достоверность различия показателя по сравнению с контрольной группой. 67 Абсолютное число палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов в группе II было выше, чем в контрольной группе (таблица 10). Количество эозинофилов в основной и контрольной группах, однако, не различалось. Напротив, абсолютное содержание в крови лимфоцитов в группе II оказалось ниже, чем при физиологической беременности. Таким образом, группа II характеризовалась приростом числа нейтрофильных лейкоцитов и некоторым снижением количества лимфоцитов – клеток, отвечающих за иммунологическую реактивность. Показатели биохимического анализа крови женщин с НБ представлены в таблице 11. Нам не удалось выявить какие-либо значимые отклонения в подгруппе IБ. Изменения показателей биохимического анализа крови пациенток подгруппы IА носили неспецифический характер и определялись тяжестью их общего состояния: рост концентраций общего белка, мочевины, общего билирубина, натрия, хлора и глюкозы. В группе II обращали на себя внимание показатели, характеризующие почечную функцию и электролитный обмен. Оставаясь в пределах нормальных значений, они, тем не менее, заставляли вспомнить о высокой частоте заболеваний органов мочевыделения в этой группе (таблица 4). Клинический анализ мочи и исследование отделяемого мочеполовых органов Для оценки роли воспалительного фактора в механизмах прерывания беременности мы оценили показатели клинического анализа мочи и вагинального мазка у всех обследованных женщин. 68 Таблица 12. Клинический анализ мочи и вагинальный мазок у женщин с невынашиванием беременности Показатель Группа I IА IБ Группа II Контрольная группа Моча Плотность, г/л 1 018,00±1,50 1 018,25±1,25 1 021,60±1,16 1 018,85±1,61 Белок, г/л 0,05±0,01 ** 0,11±0,04 ** 0,09±0,04 0,01±0,00 Глюкоза, ммоль/л 0,00±0,00 0,00±0,00 0,00±0,00 0,00±0,00 Лейкоциты, 3,54±0,37 8,50±2,36 7,60±2,08 3,08±0,37 кл. в поле зрения Эритроциты, 1,00±0,24 *** 2,19±1,06 0,40±0,15 0,08±0,04 кл. в поле зрения Вагинальный мазок Лейкоциты, 10,69±1,07 12,00±1,56 9,00±1,03 16,46±2,48 кл. в поле зрения Эритроциты 1,15±0,22 *** §§§ 0,13±0,07 0,40±0,22 * 0,00±0,00 кл. в поле зрения Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001, достоверность различия показателя по сравнению с контрольной группой. §§§ - p<0,001, достоверность различия показателя по сравнению с подгруппой IБ. 69 Цвет мочи был желтый или соломенно-желтый у всех женщин контрольной группы. Мутная моча наблюдалась у двух (5%) женщин подгруппы IБ и четырех (14%) женщин подгруппы IА. Эпителиальные клетки в значительном количестве присутствовали в осадке мочи у 19 женщин контрольной группы (54%), 9 женщин подгруппы IБ (24%), 9 пациенток подгруппы IА (31%) и 5 пациенток группы II (10%). Остальные показатели состава мочи и микроскопии осадка мочи и вагинального мазка представлены в таблице 12. Содержание белка в моче женщин группы I было повышенным, а в подгруппе IБ также наблюдалось некоторое увеличение числа лейкоцитов (статистически недостоверное). Эритроциты в моче и вагинальном мазке женщин подгруппы IА, вероятно, указывают на начинающееся вагинальное кровотечение. Все показатели группы II не отличались от контрольной группы, за исключением среднего числа эритроцитов в поле зрения в вагинальном мазке. Следует, однако, отметить тенденцию к увеличению содержания белка и числа лейкоцитов и эритроцитов в осадке мочи (статистически недостоверно). Показатели группы II оказались сходными с таковыми у пациенток группы IБ. Так, содержание белка в мочке составило 0,09±0,04 г/л в группе II и 0,11±0,04 г/л в подгруппе IБ (p>0,05), число лейкоцитов в осадке мочи - 7,60±2,08 и 8,50±2,36 в поле зрения, соответственно (p>0,05), число эритроцитов в осадке мочи - 0,40±0,15 и 2,19±1,06 в поле зрения, соответственно (p>0,05). Это наблюдение позволяет заключить, что минимальные признаки воспаления мочевыводящих путей в равной степени характерны как для угрозы прерывания беременности, так и для беременных женщин с ПНБ в анамнезе. Данные о составе микрофлоры влагалища пациенток с НБ и женщин контрольной группы представлены в таблице 13. Палочковидные бактерии 70 (палочки Додерлейна) прерыванием обнаруживались беременности, у хотя процент большинства выявления женщин с палочковидной микрофлоры у пациенток группы I был несколько ниже. Обращает на себя внимание аномальный состав микрофлоры влагалища у женщин группы II, что может быть одной из причин хронических воспалительных заболеваний мочеполовой сферы, выявляемых с высокой частотой в этой группе (таблица 4 и 6). Таблица 13. Состав микрофлоры влагалища у женщин с НБ Группа I Состав Контрольная Группа II микрофлоры группа IА IБ Палочко16 (55%) * 28 (74%) 20 (39%) *** 28 (80%) видная Смешанная 11 (38%) ** § 5 (13%) 16 (31%) * 3 (8%) Кокковая 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 2 (6%) Грибы 2 (7%) 5 (13%) 15 (30%) ** 2 (6%) Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001, достоверность различия показателя по сравнению с контрольной группой. § - p<0,05, достоверность различия показателя по сравнению с подгруппой IБ. Таким образом, полученные нами данные хотя и позволяют рассматривать инфекционный агент в качестве одного из факторов риска НБ, однако незначительная выраженность изменений лабораторных показателей не позволяет сделать вывод о прямой причинно-следственной связи между инфекцией и прерыванием беременности у пациенток обследованных групп. С другой стороны, бактериально-вирусная колонизация эндометрия является, как правило, следствием неспособности иммунной системы и неспецифических защитных механизмов (NK-клетки, фагоцитоз, система комплемента) сопровождается элиминировать инфекционный агент, активацией иммунокомпетентных что, клеток предпосылки для развития аллоиммунных нарушений [46, 62]. и однако, создает 71 Таблица 14. Показатели коагулограммы у женщин с НБ Показатель Группа I IА IБ Группа II Контрольная группа Тромбоциты, 235,38±12,81 236,09±7,92 237,00±7,72 243,14±7,46 клеток х 109/л Фибриноген, г/л 3,79±0,06 * 3,98±0,07 4,05±0,09 3,97±0,06 Протромбиновое время, 12,58±0,14 12,51±0,10 12,24±0,10 12,36±0,09 секунды Протромбиновое время 78,58±3,20 * 81,94±3,28 87,69±6,61 88,46±3,88 по Квику, % АЧТВ, секунды 29,65±0,42 30,05±0,52 28,49±0,40 29,53±0,34 Тромбиновое время, 9,75±0,21 9,85±0,21 11,17±0,53 ** 9,66±0,15 секунды Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,01, достоверность различия показателя по сравнению с контрольной группой. 72 Гемостаз и фибринолиз Мы использовали рутинные коагулологические тесты и метод ТЭГ для оценки системы гемостаза и фибринолиза у женщин с НБ. Как видно из таблицы 14, в подгруппе IБ отсутствовали какие-либо значимые изменения коагулограммы. В подгруппе IА мы выявили незначительные признаки гипокоагуляции, выражавшиеся в снижении показателя протромбинового времени по Квику. Содержание фибриногена в этой группе оказалось несколько ниже, чем в контрольной. У женщин II группы было отмечено удлинение тромбинового времени, указывающее на некоторое снижение коагуляционного потенциала крови. Остальные показатели не отличались от контрольной группы (таблица 14). На рисунке 3 представлены показатели коагулограммы женщин с НБ в I и II триместре беременности. Обращала на себя внимание тенденция к росту концентрации фибриногена во II триместре беременности, достигавшая статистически значимого уровня в подгруппе IА. Также была отмечена тенденция к увеличению показателя протромбинового времени по Квику во II триместре беременности во всех группах, не достигавшая, однако, статистически значимого уровня. Другие различия показателей коагулограммы у женщин в I и II триместре беременности отсутствовали. ТЭГ оказалась более информативным методом оценки процессов гемостаза и фибринолиза. характеризовалась ростом Как видно показателей, из таблицы отражающих 15, группа IБ агрегационную способность тромбоцитов – МА, G и A. Также мы отметили снижение показателя LY30, что свидетельствует об угнетении фибринолиза. Для подгруппы IА было характерно увеличение показателя R, который характеризует ферментативную часть системы коагуляционного гемостаза, и уменьшение угла расхождения α, описывающего фибриногеновый компонент коагуляционного гемостаза. 73 Тромбоциты 4 150 12 3 10 3 2 II триместр 35 100 секунды 80 40 20 0 АЧТВ II триместр Подгруппа IА 14 30 12 25 10 20 15 Тромбиновое время 8 6 10 4 5 2 0 0 I триместр I триместр II триместр I триместр II триместр Протромбиновое время по Квику 60 6 0 0 I триместр 8 2 1 0 Протромбиновое время 4 1 50 % 4 2 100 14 ** §§§ секунды 200 г/л клеток х 109/л 250 120 Фибриноген 5 секунды 300 I триместр II триместр Группа II I триместр II триместр Контрольная группа Подгруппа IБ Рисунок 3. Показатели коагулограммы у женщин с НБ и в контрольной групе в I и II триместре беременности. Примечание: ** - p<0,01, достоверность различия показателя по сравнению с контрольной группой. §§§ - p<0,001, достоверность различия показателя по сравнению с II триместром. Величина CI, интегрального показателя, который отражает состояние системы гемостаза в целом, оказалась сниженной по сравнению с подгруппой IБ. Таким образом, для подгруппы IА было характерно снижение 74 коагуляционного потенциала крови за счет фибриногенового компонента гемостаза, что согласуется с результатами рутинных коагулологических тестов. Таблица 15. Показатели ТЭГ у женщин с НБ Показатель Группа I IА 10,52±0,53 ** 2,46±2,15 IБ 9,84±0,68 2,15±0,16 Контрольная группа 10,38±0,44 ** 8,77±0,31 2,16±0,12 2,06±0,08 Группа II R, мин K, мин α - угол расхождения, 58,22±1,71 * 61,76±1,46 56,28±2,32 * 63,01±0,96 град. MA, мм 61,47±0,82 63,25±1,19 * 63,19±0,73 60,83±0,86 2 G, дин/см 8,20±0,29 9,08±0,40 * 8,77±0,27 8,04±0,28 A, мм 43,82±3,10 47,54±2,97 * 45,75±3,20 38,36±2,97 § CI 1,16±0,20 1,57±0,30 1,72±0,18 1,51±0,15 LY30, % 14,46±3,04 7,06±2,22 * 17,37±3,63 14,97±2,54 Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,01, достоверность различия показателя по сравнению с контрольной группой. § - p<0,05, достоверность различия показателя по сравнению с подгруппой IБ. Показатели ТЭГ у женщин группы II также указывали на угнетение коагуляционного гемостаза: мы наблюдали увеличение показателя R (ферментативная часть системы коагуляционного гемостаза) и уменьшение угла расхождения гемостаза). Таким α (фибриногеновый образом, были компонент выявлены коагуляционного однонаправленные гипокоагуляционные изменения рутинных тестов на свертываемость крови и показателей ТЭГ в этой группе. Анализ показателей ТЭГ у пациенток в I и II триместре беременности подтвердил описанные выше закономерности, однако не выявил существенных особенностей у женщин с различным сроком гестации (рисунок 4). 75 3 * 8 2 4 1 2 1 0 0 II триместр I триместр G 60 * мм 6 * 40 20 20 0 0 I триместр * 40 II триместр Подгруппа IА I триместр CI 2 II триместр LY30 20 15 10 * ** * 5 1 0 I триместр II триместр 1 10 0 * 2 20 2 MA 60 40 30 4 * 3 50 8 60 II триместр A 80 α - угол расхождения % 10 дин/см2 2 6 I триместр 80 K мм 3 *** ** мин мин 10 R * градусы 12 0 I триместр II триместр Подгруппа IБ 0 I триместр II триместр Группа II I триместр II триместр Контрольная группа Рисунок 4. Показатели ТЭГ у женщин с НБ и в контрольной группе в I и II триместре беременности. Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001, достоверность различия показателя по сравнению с контрольной группой. 76 Характеристика гормонального профиля На следующем этапе мы проанализировали особенности гормонального фона у женщин с НБ, результаты тестов представлены в таблице 16. Концентрации ТТГ и Т3 св. в подгруппе IБ оказались несколько ниже, чем в контрольной группе женщин с физиологической беременностью, однако все показатели оставались в пределах референсных значений. Концентрации Т4 св. в подгруппе IБ и в контрольной группе не различались. Обращало на себя внимание существенное повышение концентраций прогестерона и α-фетопротеина в подгруппе IБ. Прогестерон является мощным фактором, способствующим возникновению и сохранению беременности. Он способствует переходу слизистой оболочки матки из фазы пролиферации в секреторную фазу, а после оплодотворения создает необходимые условия для имплантации и развития оплодотворенной яйцеклетки. Прогестерон также оказывает расслабляющее действие на гладкую мускулатуру матки. Получены убедительные результаты, указывающие на то, что защитный эффект прогестерона на ранних сроках беременности может быть связан с его иммуномодулирующей активностью, в том числе с нормализацией цитокинового баланса при беременности [54]. Показана иммуномодулирующая активность α-фетопротеина, в том числе его способность усиливать активационный апоптоз лимфоидных клеток, ограничивая тем самым процессы иммунного повреждения и воспаления [31, 69, 70]. Усиление гестагенных влияний у женщин подгруппы IБ является, вероятно, адаптационно-приспособительной реакцией эндокринной системы, направленной на сохранение беременности. Мы выявили дальнейшее снижение концентрации Т3 св. в сыворотке крови женщин подгруппы IА, хотя содержание ТТГ увеличивалось по сравнению с группой пациенток с угрожающим абортом. При этом оба показателя оставались в пределах нормальных значений. 77 Таблица 16. Гормональный профиль женщин с НБ Гормон Группа I IА IБ Группа II Контрольная группа ТТГ, 4,06±0,57 §§ 1,77±0,15 * 2,42±0,38 2,41±0,17 мкМЕ/мл Т4 св., 8,68±0,53 8,91±0,19 9,83±0,29 ** 8,61±0,30 пмоль/л Т3 св., 3,55±0,28 *** § 4,82±0,21 ** 4,30±0,22 *** 5,81±0,26 пмоль/л ХГЧ, 65 978±10 358 36 006±3 426 32 891±3 807 36 190±3 112 мМЕ/мл Прогестерон, 140,21±20,01 ** 100,54±6,76 *** 163,67±17,77 *** 69,83±7,87 нмоль/л α-фетопротеин, 48,18±12,28 *** §§§ 73,69±5,33 * 83,42±8,53 * 65,95±7,02 МЕ/мл Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001, достоверность различия показателя по сравнению с контрольной группой. § - p<0,05; §§ - p<0,01; §§§ - p<0,001, достоверность различия показателя по сравнению с подгруппой IБ. 78 Подавление секреции ЛГ и ФСГ было более выраженным в подгруппе IА по сравнению с контрольной группой. Наблюдалась выраженная тенденция к повышению концентрации ХГЧ, однако различие не было статистически достоверным из-за значительного разброса индивидуальных показателей. Заслуживает внимания обнаруженное нами дальнейшее повышение концентрации прогестерона в подгруппе IА. Как видно из рисунка 5, распределение пациенток с учетом срока беременности подтвердило выявленную закономерность. Концентрация α-фетопротеина у женщин подгруппы IА была несколько ниже, чем в контрольной группе и подгруппе IБ. Однако, с учетом срока гестации, оказалось, что содержание α-фетопротеина превышало верхнюю границу референсных значений для I и II триместра беременности и было почти в два раза больше, чем в группе с благоприятным течением беременности (результаты представлены на рисунке 5). У женщин группы II были отмечены колебания концентраций Т3 св. и Т4 св. в пределах референсных значений (таблица 16). Концентрации ТТГ в группе II и в контрольной группе не различались. Важно отметить, что в группе II, так же как в группе I, имело место существенное увеличение концентраций прогестерона и α-фетопротеина в сыворотке крови. Концентрация прогестерона оказалась выше, чем подгруппе IБ (163,67±17,77 нмоль/л и 100,54±6,76 нмоль/л соответственно, p<0,05). Концентрации ТТГ и Т3 св. существенно не различались у женщин в I и II триместре беременности, как в основных, так и в контрольной группе (рисунок 5). Напротив, мы обнаружили некоторое снижение концентраций Т4 св. во II триместре беременности, достигавшее статистически значимого уровня в контрольной группе и в подгруппе IБ. 79 ТТГ 5 Т4 св. 12 5 §§§ 10 7 § ** 6 ** 3 3 2 8 пмоль/л 4 пмоль/л мкМЕ/мл 4 6 * 4 * 2 2 0 II триместр Прогестерон 3 ** *** I триместр II триместр I триместр II триместр 140 ** α-фетопротеин 80 000 * 70 000 120 ** * 150 * * МЕ/мл 100 200 * * 80 60 §§ §§§ 40 §§ § 20 0 §§§ §§§ II триместр Подгруппа IА ХГЧ §§ *** §§ 50 000 40 000 30 000 20 000 * * §§§ §§§ 10 000 0 0 I триместр 60 000 мМЕ/мл 250 нмоль/л 4 0 0 I триместр 50 * ** 1 1 100 ** 5 2 1 300 Т3 св. 8 I триместр II триместр Группа II I триместр II триместр Контрольная группа Подгруппа IБ Рисунок 5. Характеристика гормонального фона женщин у женщин с НБ и в контрольной группе в I и II триместре беременности. Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001, достоверность различия показателя по сравнению с контрольной группой. § - p<0,05; §§ - p<0,01; §§§ - p<0,001, достоверность различия показателя по сравнению с II триместром. Концентрации прогестерона и α-фетопротеина были значительно выше у женщин во II триместре беременности как в основных, так и в контрольной 80 группе. При этом описанные выше особенности гормонального фона при НБ не зависели от срока гестации (рисунок 5). Концентрация ХГЧ оказалась ниже во II триместре беременности в контрольной группе женщин с благоприятно протекающей беременностью и неосложненным акушерским анамнезом и в группе II. Концентрация ХГЧ у женщин подгруппы IА была выше, чем в контрольной группе, во II триместре беременности. Многие авторы указывают, что снижение концентрации прогестерона является значимым фактором риска самопроизвольного прерывания беременности [53, 60, 61, 65, 81, 86]. Hussain и соавт. [129] рассматривали в качестве пороговой концентрацию прогестерона 40 нмоль/л. В исследовании Abdelazim и соавт. [86] были использованы пороговые концентрации 10 нг/мл (31,45 нмоль/л) и 20 нг/мл (62,82 нмоль/л). Мы проанализировали основные и контрольную группы пациенток с целью определения числа наблюдений с концентрацией прогестерона в сыворотке крови ниже пороговой, установленной как 31,45 нмоль/л (10 нг/мл), 40 нмоль/л и 62,82 нмоль/л (20 нг/мл). Результаты представлены на рисунке 6. Выявленное нами повышение средней концентрации прогестерона в сыворотке крови пациенток подгруппы IБ подтверждалось снижением доли женщин, у которых концентрация прогестерона была ниже пороговой, причем для пороговых значений в 40 нмоль/л и 62,82 нмоль/л (20 нг/мл) различие оказалось статистически достоверным. В подгруппе IА сохранялась та же тенденция; для порогового значения в 40 нмоль/л различие было статистически достоверным. Важно отметить, что подгруппы IА и IБ не различались между собой по доле женщин с концентрацией прогестерона в крови ниже 31,45 нмоль/л (10 нг/мл) и 40 нмоль/л. Напротив, использование в качестве порогового 81 значения 62,82 нмоль/л (20 нг/мл) позволило продемонстрировать статистически значимый рост доли женщин с концентрацией прогестерона в крови ниже пороговой величины в подгруппе IА по сравнению с подгруппой IБ. 60% 50% 48,6% § 41,4% 40% 34,3% 30% ** 18,4% 20% 10% 14,3% 6,9% ** 7,9% *** * 10,5% 9,8% 6,9% ** *** 0,0% 0,0% 0% < 31,45 нмоль/л (10 нг/мл) Подгруппа IА < 40,00 нмоль/л Подгруппа IБ Группа II < 62,82 нмоль/л (20 нг/мл) Контрольная группа Рисунок 6. Доля женщин с концентрацией прогестерона в сыворотке крови ниже порогового уровня 31,45 нмоль/л (10 нг/мл), 40 нмоль/л и 62,82 нмоль/л (20 нг/мл) в группах с НБ. Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,01, достоверность различия показателя по сравнению с контрольной группой. § - p<0,05, достоверность различия показателя по сравнению с подгруппой IБ. Таким образом, полученные нами данные согласуются с результатами других исследователей, показавших патогенетическое значение снижения концентрации прогестерона ниже критического значения для самопроизвольного прерывания беременности [53, 61, 65, 81, 86]. В нашей работе наиболее информативным оказалось использование в качестве порогового уровень прогестерона 62,82 нмоль/л (20 нг/мл). С другой стороны, мы наблюдали увеличение средней концентрации прогестерона 82 крови в подгруппах IА и IБ, имевшее, вероятно, адаптационный характер. При этом доля женщин с концентрацией прогестерона ниже пороговой в контрольной группе с благоприятно протекающей беременностью была значительной, составив почти половину пациенток для уровня 62,82 нмоль/л (20 нг/мл). Очевидно, что для женщин, принявших участие в нашем исследовании, у которых были исключены основные неиммунологические факторы риска прерывания беременности, рост уровня эндогенного прогестерона не обеспечивал, тем не менее, сохранение беременности. В группе II отсутствовали наблюдения с концентрацией прогестерона ниже пороговых значений 31,45 нмоль/л (10 нг/мл), 40 нмоль/л, а число наблюдений с уровнем гормона ниже 62,82 нмоль/л (20 нг/мл) было почти в пять раз меньше, чем в контрольной группе женщин с благоприятно протекающей беременностью и неосложненным акушерским анамнезом (рисунок 6). Таким образом, усиление гестагенных влияний было отмечено в группе II, и является, вероятно, как и при прерывании беременности, адаптационно-приспособительной реакцией эндокринной системы. 3.2 Иммунологическая характеристика женщин с различными клиническими вариантами невынашивания беременности Убедительно продемонстрирована роль клеточных и гуморальных иммунных механизмов в патогенезе различных клинических вариантов НБ [2, 21, 39, 153, 190]. Дальнейший прогресс в изучении роли иммунных факторов при нарушениях репродуктивный функции возможен при комплексной оценке количественных и функциональных характеристик иммунной системы, включая Т- и В-звенья, а также факторов неспецифической резистентности организма беременной женщины в норме и при патологии. 83 Антифосфолипидные антитела Для исключения гуморальных аутоиммунных механизмов прерывания беременности мы определяли антифосфолипидные антитела IgM и IgG у всех женщин. Беременные с диагностическим титром антифосфолипидных антител не принимали участия и исследовании. Средние концентрации антифосфолипидных антител IgM и IgG представлены в таблице 17. Таблица 17. Концентрация антифосфолипидных антител в крови пациенток с НБ Показатель Группа I IА Группа II IБ Контрольная группа Антифосфолип. 2,72±0,25 3,03±0,41 3,13±0,40 3,42±0,38 антитела IgG Антифосфолип. 2,25±0,21 2,53±0,32 2,33±0,31 3,28±0,49 антитела IgM Примечание: статистически значимые различия между обследованными группами отсутствовали. Ни в одном из наблюдений антифосфолипидные антитела не выявлялись в диагностическом титре. Таким образом, мы исключили антифосфолипидный синдром как причину НБ у пациенток, принявших участие в исследовании. Популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови Исследование поверхностного фенотипа иммунокомпетентных клеток является надежным и высокоинформативным методом количественной оценки основных популяций и субпопуляций лимфоцитов, а также особенностей их функционального состояния – активации, дифференцировки и готовности к реализации программы апоптотической гибели. 84 Таблица 18. Характеристика популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови пациенток с НБ Маркер Группа I Группа II Контрольная группа IА IБ CD3+, % 76,22±1,57 75,75±1,53 67,33±1,59 *** 77,91±1,45 9 §§§ клеток х 10 /л 2,13±0,16 1,23±0,12 ** 1,41±0,07 ** 1,73±0,10 + + CD3 CD4 , % 44,78±1,03 48,88±1,70 41,17±1,20 * 47,45±2,14 9 §§§ клеток х 10 /л 1,26±0,10 0,77±0,06 * 0,86±0,03 * 1,05±0,08 + + CD3 CD8 , % 29,78±0,95 26,00±1,46 * 26,33±0,97 29,55±1,42 9 §§§ клеток х 10 /л 0,81±0,05 * 0,44±0,06 *** 0,56±0,04 0,65±0,05 § ИРИ 1,51±0,04 2,06±0,16 1,60±0,08 1,83±0,16 – + + § CD3 CD16 CD56 , % 13,44±1,09 ** 10,13±1,27 15,50±1,32 ** 9,09±0,86 9 §§§ клеток х 10 /л 0,39±0,05 *** 0,16±0,02 0,34±0,03 ** 0,21±0,03 + + + CD3 CD16 CD56 , % 6,11±0,57 5,38±0,45 6,50±1,29 5,73±0,74 9 § клеток х 10 /л 0,12±0,02 0,06±0,01 0,11±0,03 0,11±0,02 + CD19 , % 8,89±0,62 10,63±0,71 * 10,67±0,85 * 8,27±0,64 9 §§ клеток х 10 /л 0,24±0,02 * 0,18±0,03 0,23±0,02 * 0,19±0,02 Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001, достоверность различия показателя по сравнению с контрольной группой. § - p<0,05; §§ - p<0,01; §§§ - p<0,001, достоверность различия показателя по сравнению с подгруппой IБ. 85 Мы изучили особенности популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови у женщин с НБ (таблица 18). Группа пациенток подгруппы IБ характеризовалась снижением абсолютного числа CD3+ лимфоцитов в периферической крови, включая субпопуляции хелперных и цитотоксических Т-клеток. Количество CD3+CD4+ лимфоцитов оказалось на 27%, а CD3+CD8+ - на 32% меньше, чем у женщин с благоприятным течением беременности и неосложненным акушерским анамнезом. Напротив, процентное содержание CD19+ В-клеток было несколько выше, однако их абсолютное число не отличалось от показателя контрольной группы. С учетом снижения общего числа лимфоцитов, обнаруженного у женщин подгруппы IБ, можно говорить о том, что особенностью иммунного статуса при угрожающем аборте является снижение количественных показателей Т-клеточного иммунитета при неизменном числе клеток, отвечающих за гуморальные иммунные реакции. Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови женщин подгруппы IА существенно отличался от показателей, выявленных в подгруппе IБ. Обращало на себя внимание увеличение абсолютного числа Тлимфоцитов на 23% по сравнению с группой женщин с благоприятно протекающей беременностью и на 73% по сравнению подгруппой IБ При этом число Т-хелперных соответственно, цитотоксической а CD3+CD4+ количество активностью, увеличилось CD3+CD8+ превысило на клеток, показатель 20% и 63%, обладающих группы с физиологической беременностью на 25% и подгруппы IБ – на 84%. Значение ИРИ (соотношение CD4:CD8 клеток) в подгруппе IА оказалось достоверно меньше по сравнению с подгруппой IБ, что также свидетельствовало о количественном преобладании Т-клеток с цитотоксической функцией. Одновременно мы выявили существенное увеличение числа клеток с фенотипом CD3–CD16+CD56+, относящихся к популяции естественных 86 киллеров, в подгруппе IА. В частности, абсолютное содержание NK-клеток в периферической крови превысило показатель группы с физиологической беременностью на 86% и показатель подгруппы IБ – на 144%. Убедительно показана патогенетическая роль NK-клеток, коэкспрессирующих маркеры CD16 и CD56, при различных клинических вариантах НБ [144, 169, 175]. Таким образом, можно говорить, что развитие патологического процесса от угрозы прерывания беременности к состоявшемуся аборту характеризуется численным приростом лимфоцитов с цитотоксической/киллерной функцией в периферической крови. Абсолютное CD19+ содержание В-лимфоцитов также оказалось несколько выше в подгруппе IА. Можно предположить, что при угрожающем аборте иммунная система находится в состоянии неустойчивого равновесия, предполагающего взаимодействие как патологических, так и адаптационно-приспособительных механизмов. Несостоятельность или срыв последних приводит к состоявшемуся аборту. Изучение показателей функционального состояния иммунной системы позволит продвинуться в изучении патогенеза прерывания беременности. У женщин II группы мы обнаружили снижение относительного и абсолютного числа преимущественно за CD3+ счет лимфоцитов хелперных абсолютного содержания статистически недостоверным). в периферической Т-клеток цитотоксических Абсолютное (снижение доли Т-лимфоцитов количество крови, и было CD3+CD4+ лимфоцитов оказалось на 18%, а CD3+CD8+ - на 13% меньше, чем у женщин с благоприятным течением беременности и неосложненным акушерским анамнезом. Напротив, относительное и абсолютное содержание в крови CD19+ В-клеток было выше, чем в контрольной группе. 87 CD3+ 70 § §§§ §§§ 40 50 % % 60 40 30 25 30 §§§ ** § § §§ 20 15 10 0 5 0 0 I триместр II триместр 8 * § * §§ §§ * 10 5 0 % *** § CD3+CD16+CD56+ 14 6 12 5 10 4 II триместр Подгруппа IА CD19+ 16 7 * * * 8 3 6 2 4 1 2 0 0 I триместр I триместр II триместр I триместр II триместр CD3–CD16+CD56+ 20 % 30 * 10 10 15 * 20 20 25 35 50 ** ** § CD3+CD8+ 40 % 80 CD3+CD4+ 60 % 90 I триместр II триместр Группа II I триместр II триместр Контрольная группа Подгруппа IБ Рисунок 7. Процентное содержание популяций и субпопуляций лимфоцитов в периферической крови женщин с НБ и в контрольной группе в I и II триместре беременности. Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001, достоверность различия показателя по сравнению с контрольной группой. § - p<0,05; §§ - p<0,01; §§§ - p<0,001, достоверность различия показателя по сравнению с II триместром. 88 CD3+ 2,5 * * * 0,8 * * * ** * * 0,8 * 0,6 1,0 0,4 0,5 клеток х 109/л * 1,5 II триместр * 0,4 0,0 I триместр II триместр 0,14 CD3+CD16+CD56+ 0,30 0,12 0,25 CD19+ *** ** 0,3 § 0,1 клеток х 109/л клеток х 109/л § клеток х 109/л ** 0,4 0,10 0,08 0,06 0,04 II триместр Подгруппа IА ** * 0,20 0,15 0,10 0,00 0,00 I триместр * 0,05 0,02 0,0 * 0,3 I триместр II триместр CD3–CD16+CD56+ ** 0,5 0,1 0,0 I триместр 0,6 0,2 0,2 0,0 0,2 * 0,7 1,0 0,5 CD3+CD8+ 0,9 1,2 клеток х 109/л клеток х 109/л 2,0 CD3+CD4+ 1,4 I триместр II триместр I триместр II триместр Группа II Контрольная группа Подгруппа IБ Рисунок 8. Абсолютное содержание популяций и субпопуляций лимфоцитов в периферической крови женщин с НБ и в контрольной группе в I и II триместре беременности. Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001, достоверность различия показателя по сравнению с контрольной группой. § - p<0,05, достоверность различия показателя по сравнению с II триместром. Обращал на себя внимание значительный рост числа естественных киллерных клеток с фенотипом CD3–CD16+CD56+; их абсолютное 89 содержание в крови увеличилось на 62%. Сходные показатели мы наблюдали в подгруппе IА. С учетом снижения общего числа лимфоцитов, обнаруженного в группе II, можно говорить о том, что особенностью иммунного статуса у этих пациенток является снижение количественных показателей Т-клеточного иммунитета при росте доли клеток, отвечающих за гуморальные иммунные реакции. Указанные изменения носят, вероятно, адаптационный характер. Увеличение доли NK-клеток в периферической крови требует дальнейшего изучения. Нельзя исключить, что они являются предшественниками децидуальных CD3–CD16–CD56+ NK-клеток, которые утрачивают в результате миграции из крови в эндометрий свой цитотоксический потенциал [144, 169, 175]. Мы проанализировали зависимость процентного и абсолютного содержания лимфоцитов различных популяций и субпопуляций в крови женщин с НБ от гестационного срока. Как видно из рисунков 7 и 8, изменения соответствующих показателей в I и во II триместре беременности были однонаправленными, это позволило нам заключить, что описанные выше закономерности имеют универсальный характер и отражают сущность патологического процесса при НБ. Необходимо отметить, что иммунограмма женщин в I триместре беременности характеризовалась преобладанием доли NK клеток (фенотип CD3–CD16+CD56+) по сравнению с показателями II триместра. Так, у женщин контрольной группы содержание NK клеток в периферической крови составило в I триместре беременности 10,50%, а во II триместре – 7,44% (p<0,01); в подгруппе IБ величина показателей составила 12,00% и 9,14%, соответственно (p<0,05); в подгруппе IА – 15,00% и 10,75%, соответственно (p<0,01), и в группе II – 19,50% и 13,50%, соответственно (p<0,05). Напротив, во II триместре был выявлен прирост относительного числа Т-лимфоцитов, 90 преимущественно за счет цитотоксической субпопуляции. Доля CD3+ клеток у женщин с благоприятно протекающей беременностью и неосложнённым акушерским анамнезом составила в I триместре 74,50%, а во II триместре – 78,67% (p<0,05), при этом процент цитотоксических CD3+CD8+ лимфоцитов был равен 26,00% и 30,33%, соответственно (p<0,05). В подгруппе IБ Тклетки составили 72,33% в I триместре и 77,96% - во II триместре (различие статистически недостоверно), а цитотоксические Т-лимфоциты – 23,00% и 26,71%, соответственно (p<0,01). В подгруппе IА доля CD3+ клеток в I триместре беременности составила 70,60%, а во II триместре – 83,25% (p<0,001), а процентное содержание CD3+CD8+ лимфоцитов – 26,80% и 33,50%, соответственно (p<0,001). Наконец, у женщин II группы показатель CD3+ клеток был равен 62,50% в I триместре и 69,75% - во II триместре беременности (p<0,05), а доля CD3+CD8+ лимфоцитов – 21,50% и 28,75%, соответственно (p<0,001). Мы не обнаружили статистически значимых отличий абсолютного содержания Т-лимфоцитов и их субпопуляций в I и II триместре беременности, однако абсолютное число NK клеток также оказалось выше в I триместре беременности, причем в контрольной группе и в подгруппе IБ различие было статистически достоверным (для контрольной группы: 0,34 х 109 клеток/л в I триместре и 0,16 х 109 клеток/л во втором триместре беременности, p<0,05; для подгруппы IБ: 0,19 х 109 клеток/л в I триместре и 0,14 х 109 клеток/л во втором триместре беременности, p<0,05). Таким образом, с увеличением гестационного срока происходит сдвиг количественного баланса лимфоцитов с цитотоксической функцией: число CD3–CD16+CD56+ NK клеток снижается, а цитотоксических Т-лимфоцитов, напротив, растет. содержание CD3+CD8+ 91 Маркеры активации и апоптоза лимфоцитов Среди показателей, позволяющих оценить особенности функционального состояния иммунокомпетентных клеток, большое значение имеет исследование поверхностной экспрессии активационных маркеров CD25 (признак ранней активации), HLA-DR (поздняя активация) и CD95 (отражает готовность клетки к восприятию апоптотического сигнала и реализации программы апоптоза). В таблице 19 представлены результаты по количеству активированных лимфоцитов различных субпопуляций в крови женщин с НБ. В подгруппе IБ мы выявили умеренный прирост доли, но не абсолютного содержания активированных Т-лимфоцитов (фенотип CD3+CD25+). Другие признаки активации иммунокомпетентных клеток у этих пациенток отсутствовали. Напротив, подгруппа IА характеризовалась значительным увеличением как относительного, так и абсолютного числа Т-клеток, обладающих признаками ранней активации. Рост абсолютного содержания CD3+CD25+ лимфоцитов составил 220% по отношению к контрольной группе с благоприятным течением беременности и 146% по сравнению с подгруппой IБ. Число активированных хелперных Т-клеток (фенотип CD4+CD25+) также увеличилось на 70% и 42%, соответственно. Обращает на себя внимание растущее различие между процентом активированных Т-лимфоцитов (все субпопуляции) и активированных Тхелперов в подгруппе IА. Так, при физиологической беременности на долю CD4+ клеток приходилось 98% от общего числа Т-лимфоцитов, экспрессирующих маркер CD25, в подгруппе IБ этот показатель составил 95%. 92 Таблица 19. Экспрессия активационных маркеров лимфоцитами периферической крови пациенток с НБ Маркер Группа I Группа II Контрольная группа IА IБ CD3+CD25+, % 10,67±1,06 *** § 7,50±1,18 * 5,20±1,22 4,75±0,55 9 §§§ клеток х 10 /л 0,32±0,05 *** 0,13±0,02 0,11±0,03 0,10±0,02 + + CD4 CD25 , % 7,40±1,05 * 7,13±1,11 4,80±0,39 4,64±0,48 9 клеток х 10 /л 0,17±0,03 * 0,12±0,02 0,10±0,01 0,10±0,01 + + § CD3 HLA-DR , % 2,56±0,21 * 4,63±0,67 5,50±0,54 4,91±0,65 9 клеток х 10 /л 0,07±0,01 0,07±0,01 0,11±0,01 0,10±0,01 – + §§ CD3 HLA-DR , % 10,56±0,56 13,63±0,96 16,00±1,12 ** 12,09±0,85 9 §§ клеток х 10 /л 0,29±0,03 0,22±0,03 0,35±0,04 * 0,26±0,02 + + CD3 CD95 , % 11,04±1,08 15,01±3,11 22,03±6,98 * 11,26±1,29 9 клеток х 10 /л 0,25±0,03 0,25±0,05 0,49±0,16 * 0,25±0,04 Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001, достоверность различия показателя по сравнению с контрольной группой. § - p<0,05; §§ - p<0,01; §§§ - p<0,001, достоверность различия показателя по сравнению с подгруппой IБ. 93 Напротив, в подгруппе IА только 69% активированных Т-лимфоцитов принадлежали к субпопуляции CD4+. Это обстоятельство, вероятно, указывает на активацию при самопроизвольном прерывании беременности цитотоксических CD8+ клеток, на долю которых приходится до трети от общего числа активированных Т-лимфоцитов. Последнее наблюдение проливает свет на патогенетическое значение увеличения числа цитотоксических лимфоцитов крови при состоявшемся аборте. Значимые изменения показателей поздней активации и апоптоза Тлимфоцитов в подгруппах IА и IБ отсутствовали. Поверхностный фенотип лимфоцитов периферической крови в группе II характеризовался отсутствием признаков активации Т-лимфоцитов на фоне значительного, практически в два раза, роста числа клеток, экспрессирующих апоптотический маркер CD95 (таблица 19). Такие изменения отражают реализацию механизмов ограничения иммунных реакций, которые могут лежать в основе предотвращения неблагоприятного исхода беременности у женщин со скомпрометированной репродуктивной функцией. Рост числа активированных «не-Т-клеток» с фенотипом CD3–HLA-DR+ согласуется с увеличением доли CD19+ В-лимфоцитов у женщин II группы и свидетельствует, вероятно, об активации Th2 – опосредованных иммунных реакций, что также может быть одним из механизмов адаптации, способствующих вынашиванию беременности. В поддержку этой гипотезы говорит положительная корреляционная связь между относительным (r=0,53; p<0,001) и абсолютным (r=0,78; p<0,001) числом CD3–HLA-DR+ и CD19+ лимфоцитов. Процентное и абсолютное содержание активированных лимфоцитов в периферической крови в группах пациенток с НБ и в контрольной группе не зависело от гестационного срока. 94 А 6 6 0,25 0,20 0,15 0,10 0,15 Подгруппа IА 0,40 0,35 0,08 0,10 0,06 0,00 II триместр CD3+HLA-DR+ 0,10 0,05 I триместр 0,14 Подгруппа IБ 0 * 0,20 0,15 0,02 0,05 Группа II CD3+CD95+ 0,50 * * 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 I триместр II триместр 0,60 * 0,25 0,10 I триместр II триместр CD3–HLA-DR+ 0,30 0,04 0,00 I триместр II триместр 15 I триместр II триместр 0,12 * 0,05 0,00 0 I триместр II триместр * *** ** клеток х 109/л клеток х 109/л 0,30 CD4+CD25+ 0,20 * * 5 клеток х 109/л CD3+CD25+ 0,35 0 I триместр II триместр CD3+CD95+ 10 5 клеток х 109/л Б II триместр 10 2 0 I триместр 20 * 2 0 25 * 15 4 4 5 CD3–HLA-DR+ * * клеток х 109/л * % ** * % 10 * 8 20 CD3+HLA-DR+ % *** 8 CD4+CD25+ % 10 CD3+CD25+ % 15 0,00 I триместр II триместр I триместр II триместр Контрольная группа Рисунок 9. Процентное (А) и абсолютное (Б) число активированных лимфоцитов в периферической крови женщин с НБ и в контрольной группе в I и II триместре беременности. Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001, достоверность различия показателя по сравнению с контрольной группой. 95 Как видно из рисунка 9, изменения числа клеток, экспрессирующих маркеры CD25, HLA-DR и CD95, в I и во II триместре беременности были однонаправленными, статистически значимые различия между изучаемыми показателями отсутствовали. Представляют исследовавшего интерес взаимосвязь результаты между корреляционного сывороточными анализа, концентрациями прогестерона, α-фетопротеина и ХГЧ и экспрессией лимфоцитами маркеров активации и апоптоза (таблица 20, 21 и 22). При физиологическом течении беременности мы выявили слабую отрицательную связь между концентрацией прогестерона и процентом CD3+CD25+ и CD4+CD25+ клеток, обладающих признаками ранней активации (таблица 20). Можно предположить, что в этих условиях прогестерон, действуя как иммуносупрессивный фактор, предотвращает избыточную активацию иммунокомпетентных клеток. Полученные нами результаты согласуются с данными литературы о способности прогестерона ингибировать иммунный ответ [53, 61, 65, 72]. Напротив, у женщин I группы мы наблюдали положительную связь между изучаемыми параметрами, причем сила корреляции менялась от слабой в подгруппе IБ до высокой и очень высокой в подгруппе IА. При этом изменение концентрации прогестерона не было связано с числом клеток, экспрессирующих поздний активационный маркер HLA-DR и маркер готовности к апоптозу CD95. Таким образом, увеличение концентрации прогестерона при прерывании беременности, вероятно, способствовало активации лимфоцитов, что можно рассматривать скорее как фактор патогенеза, применительно к иммунным механизмам НБ. 96 Таблица 20. Сила и значимость корреляции между концентрацией прогестерона в сыворотке крови и количеством Т-лимфоцитов, экспрессирующих маркеры активации и апоптоза, у пациенток с НБ Маркер Группа I IА IБ + + CD3 CD25 , % 0,797 *** 0,509 * 9 клеток х 10 /л 0,373 0,457 * + + CD4 CD25 , % 0,992 *** 0,464 * 9 клеток х 10 /л 0,357 0,985 *** + + CD3 HLA-DR , % 0,191 –0,383 9 клеток х 10 /л 0,130 –0,325 + + CD3 CD95 , % –0,232 0,138 9 клеток х 10 /л –0,019 0,167 Примечание: корреляция значима на уровне * - p<0,05; *** - p<0,001. Группа II Контрольная группа 0,232 0,241 –0,506 * –0,631 * –0,892 *** –0,953 *** –0,587 * –0,554 * –0,344 * –0,250 –0,353 * –0,239 0,278 0,335 0,257 0,223 97 Эволюционно такой механизм мог сформироваться для предотвращения случаев прерывания беременности инфекционной природы, которые до сих пор остаются одной из наиболее распространенных форм спорадического НБ [14, 48]. Активация иммунитета в этом случае обеспечивала элиминацию инфекционного патогена, а другие прогестагенные свойства гормона обеспечивали сохранение беременности. Повышение концентрации прогестерона, выявленной беременных женщин II группы, сопровождалось снижением экспрессии раннего и позднего активационных маркеров и CD95. Иными словами, иммунотропное действие прогестерона было связано с ограничением процессов активации и активационного апоптоза лимфоцитов, являясь фактически адаптационным механизмом. Концентрация α-фетопротеина демонстрировала положительную связь с числом Т-лимфоцитов, несущих признаки поздней активации и готовности к апоптозу у женщин с физиологически протекающей беременностью (контрольная группа) и в подгруппе IБ (таблица 21), что можно рассматривать как механизм ограничения избыточных иммунных реакций. Напротив, в подгруппе IА содержание α-фетопротеина коррелировало с числом активированных Т-хелперных клеток (фенотип CD4+CD25+). Это наблюдение согласуется с данными Казимирского А.Н. и соавт. [31], которые показали, что α-фетопротеин и его пептидные фрагменты способны оказывать разнонаправленное действие на лимфоидные клетки, как модулируя экспрессию ранних активационных маркеров, так и стимулируя процессы программированной клеточной гибели. 98 Таблица 21. Сила и значимость корреляции между концентрацией α-фетопротеина в сыворотке крови и количеством Т-лимфоцитов, экспрессирующих маркеры активации и апоптоза, у пациенток с НБ Маркер Группа I Группа II IА IБ CD3+CD25+, % 0,309 –0,098 –0,592 ** 9 клеток х 10 /л 0,065 –0,183 –0,550 * + + CD4 CD25 , % –0,083 –0,345 0,779 ** 9 клеток х 10 /л –0,176 0,058 0,840 *** + + CD3 HLA-DR , % 0,377 0,436 0,423 * 9 клеток х 10 /л 0,107 0,309 0,371 + + CD3 CD95 , % 0,388 –0,367 0,608 ** 9 клеток х 10 /л 0,548 –0,311 0,453 * Примечание: корреляция значима на уровне * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001. Контрольная группа –0,211 –0,177 –0,212 –0,169 0,270 0,434 * 0,404 * 0,293 99 В группе II корреляционный анализ выявил отрицательную связь между уровнями α-фетопротеина и числом Т-лимфоцитов, экпрессирующих ранний активационный маркер CD25. Таким образом, иммунорегуляторную нам функцию не удалось прогестерона подтвердить и защитную α-фетопротеина при прерывании беременности. Напротив, в группе II прогестерон и αфетопротеин способствовали ограничению Т-клеточной иммунной биологических эффектов, реактивности. ХГЧ обладает уникальным спектром регулируя, среди прочего, практически все процессы, связанные с возникновением и вынашиванием беременности: продукцию прогестерона желтым телом, васкуляризацию эндометрия, имплантацию бластоцисты, дифференцировку цитотрофобласта, формирование иммунологической толерантности в отношении полуаллогенного плода, рост беременной матки и подавление ее сократимости, стимуляцию роста органов плода, рост и развитие пуповины [23, 24, 105, 135]. Мы исследовали связь между концентрацией ХГЧ в сыворотке крови и числом лимфоцитов, экпрессирующих активационные маркеры и маркер готовности к апоптозу CD95. Как видно из таблицы 22, в группе II присутствовала сильная отрицательная корреляция между обсуждаемыми показателями. Напротив, к контрольной группе и в подгруппе IА отсутствовала связь между концентрациями ХГЧ и числом активированных лимфоцитов, а в подгруппе IБ выявлялась отрицательная корреляция между концентрацией ХГЧ и числом CD3+CD95+ клеток. Таким образом, ХГЧ может обладать иммуносупрессивной избыточные иммунные реакции при НБ. активностью и ограничивать 100 Таблица 22. Сила и значимость корреляции между концентрацией ХГЧ в сыворотке крови и количеством Т-лимфоцитов, экспрессирующих маркеры активации и апоптоза, у пациенток с НБ Маркер Группа I Группа II IА IБ CD3+CD25+, % –0,316 0,097 –0,815 ** 9 клеток х 10 /л –0,372 0,030 –0,787 ** + + CD4 CD25 , % 0,026 0,035 –0,851 *** 9 клеток х 10 /л 0,220 0,003 –0,801 *** + + CD3 HLA-DR , % 0,288 –0,279 –0,733 ** 9 клеток х 10 /л 0,029 –0,176 –0,720 ** + + CD3 CD95 , % 0,110 –0,547 ** –0,849 *** 9 клеток х 10 /л 0,305 –0,428 * –0,803** Примечание: корреляция значима на уровне * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001. Контрольная группа 0,223 0,278 0,114 0,221 –0,402 0,056 –0,131 0,063 101 Возможно, ХГЧ является одним из эндогенных иммуномодуляторов, участвующих в индукции механизмов иммунологической толерантности к полуаллогенному плоду у женщин со скомпрометированной репродуктивной функцией. В пользу этого предположения говорят функциональный антагонизм ХГЧ и ИЛ 2, а также антипролиферативная активность ХГЧ в эксперименте [22, 36]. Cегодня ХГЧ рассматривают в качестве диагностического маркера и даже вероятного лечебного агента у женщин с ПНБ [19, 166]. На следующем этапе, для оценки влияния прогестерона на функциональное состояние клеток иммунной системы, мы проанализировали число лимфоцитов периферической крови, экспрессирующих активационные маркеры, у беременных женщин основных и контрольной группы с низкой (< 62,82 нмоль/л) и высокой (>62,82 нмоль/л) концентрацией прогестерона в сыворотке крови. Ранее мы установили, что пороговая величина 62,82 нмоль/л (20 нг/мл) позволяет продемонстрировать статистически значимое преобладание женщин с низкой сывороточной концентраций прогестерона в подгруппе IА по сравнению с подгруппой IБ (рисунок 6). Как видно из рисунка 10, у женщин с благоприятно протекающей настоящей беременностью (контрольная группа и группа II) высокое содержание прогестерона в крови закономерно сопровождалось снижением числа лимфоцитов, экспрессирующих маркеры активации, что согласуется с представлениями о прогестероне как об эндогенном иммуносупрессорном агенте [65, 72, 129, 179, 220]. Так, относительное содержание CD3+CD25+ лимфоцитов у женщин контрольной группы составило 5,26±0,75% в подгруппе с низкой концентрацией прогестерона и 3,00±0,52% в подгруппе с высокой концентрацией прогестерона (p<0,05). 102 CD3+CD25+ > 62,82 нмоль/л §§§ * §§ 0,30 § §§ * ** §§ 0,00 ≤ 62,82 нмоль/л > 62,82 нмоль/л начавшийся аборт и аборт в ходу клеток х 109/л *** 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 % 15 4 2 * > 62,82 нмоль/л ** *** §§§ § * §§§ * § > 62,82 нмоль/л угрожающий аборт ** 0,50 0,05 20 > 62,82 нмоль/л > 62,82 нмоль/л ПНБ в анамнезе ≤ 62,82 нмоль/л CD3–HLA-DR+ * 0,30 0,20 0,10 0,00 ≤ 62,82 нмоль/л 30 0 0,40 0,10 ** §§ 10 ≤ 62,82 нмоль/л § 0,00 ≤ 62,82 нмоль/л 10 > 62,82 нмоль/л CD3+HLA-DR+ 0,15 40 * 0 ≤ 62,82 нмоль/л CD4+CD25+ CD3+CD95+ 5 0 ≤ 62,82 нмоль/л CD3+CD25+ 0,10 6 0 0,20 CD3–HLA-DR+ клеток х 109/л §§ 0,40 клеток х 109/л §§§ 5 0 Б 20 клеток х 109/л § ≤ 62,82 нмоль/л CD3+HLA-DR+ 8 клеток х 109/л 5 § *** ** 10 ** §§ CD4+CD25+ §§ % % 10 15 *** % 15 % А ≤ 62,82 нмоль/л > 62,82 нмоль/л 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 ** §§ > 62,82 нмоль/л CD3+CD95+ ≤ 62,82 нмоль/л > 62,82 нмоль/л физиологическая беременность Рисунок 10. Процентное (А) и абсолютное (Б) число активированных лимфоцитов в периферической крови женщин с НБ и в контрольной группе c концентрацией прогестерона в сывортке крови ниже и выше порогового значения 62,82 нмоль/л (20 нг/мл). Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001, достоверность различия показателя по сравнению с контрольной группой. § - p<0,05; §§ - p<0,01; §§§ - p<0,001, достоверность различия показателя по сравнению с группой пациенток с концентрацией прогестерона выше порогового уровня. 103 Абсолютное число клеток с фенотипом CD3+CD25+ оказалось 0,12±0,02 х 109/л в подгруппе с низкой концентрацией прогестерона и 0,06±0,01 х 109/л в подгруппе с высокой концентрацией прогестерона (p<0,01). Аналогичным образом, мы выявили отчетливую тенденцию к снижению процентного содержания CD4+CD25+ лимфоцитов у женщин с высокой сывороточной концентрацией прогестерона (5,29±0,68% и 3,50±0,40%, p>0,05), а абсолютное содержание клеток было достоверно ниже (0,12±0,02 х 109/л и 0,07 х 109/л, p<0,05), чем у женщин с низкой концентрацией прогестерона. У женщин группы II мы также обнаружили более низкое содержание CD3+CD25+ лимфоцитов в подгруппе с высокой концентрацией прогестерона в сыворотке крови. Процент активированных Т-клеток составил 6,90±2,01% и 3,75±1,80%, соответственно, p<0,05. Абсолютное содержание CD3+CD25+ лимфоцитов также достоверно различалось (0,15±0,05 х 109/л и 0,09±0,04 х 109/л, p<0,05). Отчетливой была разница в количестве CD4+CD25+ клеток. Процентное содержание активированных Т-хелперов составило 6,50±0,22% у женщин с низкой концентрацией прогестерона и 3,67±1,17% у женщин с высокой концентрацией прогестерона в крови (p<0,001). Абсолютное число CD4+CD25+ лимфоцитов у женщин с низкой концентрацией прогестерона составило 0,13±0,01 х 109/л, а в подгруппе с высокой концентрацией прогестерона – 0,07±0,03 х 109/л (p<0,001). Число Т-лимфоцитов, экспрессирующих поздний активационный маркер HLA-DR в группе II также зависело от сывороточной концентрации прогестерона. Процентное содержание CD3+HLA-DR+ клеток составило 6,50±0,22% в подгруппе с низкой концентрацией прогестерона и 4,50±0,62% в подгруппе с высокой концентрацией прогестерона (p<0,01). Абсолютное содержание клеток также различалось: 0,15±0,01 х 109/л и 0,09±0,01 х 109/л, соответственно (p<0,05). 104 Следует отметить, что рост числа CD3+CD95+ клеток в крови женщин группы II происходил за счет подгруппы с низким уровнем сывороточного прогестерона. Относительное содержание клеток в этой подгруппе составило 33,50±10,28% (13,50±1,67% в контрольной группе, p<0,01, и 10,55±0,25в группе женщин с высоким содержанием прогестерона в крови, p<0,01). Абсолютное число CD3+CD95+ лимфоцитов составило 0,64±0,26 х 109/л (0,27±0,05 х 109/л в контрольной группе, p<0,01, и 0,25±0,02 х 109/л в группе женщин с высокой концентрацией прогестерона, p<0,01). Принципиально иными были особенности экспрессии активационных маркеров лимфоцитов в зависимости от концентрации прогестерона в сыворотке крови женщин I группы. В подгруппе IБ мы наблюдали нормальное или пониженное число лимфоцитов с фенотипом CD3+CD25+ и CD4+CD25+ у женщин с низкой концентрацией прогестерона. Процентное содержание активированных Т-клеток составило 2,50±0,22% (p>0,05 по сравнению с контрольной группой) и 2,50±0,22% (p<0,05 по сравнению с контрольной группой), соответственно. Абсолютное содержание CD3+CD25+ и CD4+CD25+ клеток составило 0,04±0,01 х 109/л для обоих маркеров (p<0,01 и p<0,05, соответственно, по сравнению с показателями контрольной группы). Напротив, у женщин с высокой концентрацией прогестерона в сыворотке крови мы выявили рост числа активированных Т-лимфоцитов по сравнению с показателями контрольной группы и подгруппы женщин с низкой концентрацией прогестерона в крови. Процентное содержание CD3+CD25+ лимфоцитов составило 9,17±1,37% (p<0,01 по сравнению с контрольной группой и по сравнению с женщинами с низкой сывороточной концентрацией прогестерона). Абсолютное содержание клеток также было значительно выше – 0,16±0,03 х 109/л (p<0,05 по сравнению с контрольной группой и p<0,01 по сравнению с женщинами с низкой концентрацией 105 прогестерона). Относительное CD4+CD25+ содержание лимфоцитов составило 8,67±1,29% (p<0,01 по сравнению с контрольной группой), а их абсолютное число – 0,15±0,03 х 109/л (p<0,05 по сравнению с контрольной группой и по сравнению с группой женщин с низкой концентрацией прогестерона). Сходную картину мы наблюдали в подгруппе IА. В подгруппе женщин с низкой сывороточной концентрацией прогестерона количество активированных Т-лимфоцитов не отличалось от показателей контрольной группы. Процентное содержание CD3+CD25+ клеток составило 7,50±1,39% (p>0,05 по сравнению с показателем контрольной группы), а их абсолютное число – 0,27±0,09 х 109/л (p>0,05 по сравнению с контрольной группой). Доля CD4+CD25+ оказалась 3,50±1,12% (p>0,05 по сравнению с показателем контрольной группы), абсолютное содержание клеток - 0,06±0,02 х 109/л (p>0,05 по сравнению с контрольной группой). Напротив, концентрацией в подгруппе прогестерона пациенток число с высокой активированных сывороточной Т-клеток было повышено. Процент CD3+CD25+ лимфоцитов составил 13,20±1,23% (p<0,001 по сравнению с контрольной группой и p<0,01 по сравнению с женщинами с низкой концентрацией прогестерона в крови). Абсолютное содержание CD3+CD25+ клеток было равно 0,37±0,04 х 109/л (p<0,001 по сравнению с контрольной группой). Процентное содержание клеток с фенотипом CD4+CD25+ составило 10,00±0,76% (p<0,001 по сравнению с контрольной группой и p<0,001 по сравнению с женщинами с низкой концентрацией прогестерона). Абсолютное число CD4+CD25+ лимфоцитов было равно 0,24±0,04 х 109/л (p<0,001 по сравнению с контрольной группой и p<0,001 по сравнению с женщинами с низкой концентрацией прогестерона). Полученные результаты позволяют предположить, что пациентки с прерыванием беременности представляют собой гетерогенную группу. У 106 части больных имеет место снижение содержания прогестерона в крови, приводящее к репродуктивной катастрофе, при этом непосредственным механизмом аборта могут быть факторы как иммунной, так и неиммунной природы [53, 61, 65]. Напротив, у других пациенток прерывание беременности обусловлено преимущественно иммунными механизмами, а процессы иммуноактивации «ускользают» из-под иммуносупрессорного влияния прогестерона. В результате, несмотря на компенсаторное усиление выработки прогестерона, формируется пул активированных Т-клеток, что приводит к прерыванию беременности. Причины невосприимчивости активированных Т-лимфоцитов к иммуномодулирующему действию прогестерона могут быть связаны с нарушениями рецепции и соотношения отдельных подтипов рецепторов прогестерона, особенностями метаболизма гормона и индуцируемых им иммуносупрессорных факторов, действием эндогенных блокирующих факторов и иными механизмами, требующими дальнейшего изучения [67, 100, 127]. Характеристика цитокинового профиля Мы исследовали концентрации ИЛ 4 и ИФН-γ в сыворотке крови женщин с НБ. Как видно из таблицы 23, для подгруппы IБ было характерно почти трехкратное повышение уровня ИФН-γ. Мы также выявили тенденцию к снижению концентрации ИЛ 4 (почти в два раза), не являвшуюся, однако, статистически значимой из-за значительного разброса индивидуальных показателей. Полученные данные свидетельствуют об усилении функции Th1 клеток и о смещении баланса Th1/Th2 в сторону преобладания Th1-опосредованных иммунорегуляторных механизмов при угрожающем аборте. Необходимо, однако, отметить, что усиление выработки ИФН-γ не обязательно является фактором патогенеза НБ. Накапливаются данные о способности этого 107 цитокина подавлять воспалительную реакцию [162, 180, 185]. Нельзя исключить, что избыточная продукция ИФН-γ, обнаруженная в подгруппе IБ, является одним из компенсаторных механизмов, препятствующих самопроизвольному прерыванию беременности. Рост числа гранулоцитарных клеток в крови пациенток подгруппы IБ также может быть связан с усилением дифференцировки миелоидных клеток под действием Th1 цитокинов в условиях антигенной стимуляции, что согласуется с данными, опубликованными Kim и соавт. [140] и MacNamara и соавт. [156]. Косвенно это подтверждается наличием положительной корреляционной связи между концентрацией ИФН-γ и содержанием нейтрофильных гранулоцитов (r=0,56; p<0,01) и эозинофилов (r=0,66; p<0,001) в крови женщин подгруппы IБ. Таблица 23. Концентрация ИФН-γ и ИЛ 4 в сыворотке крови пациенток с НБ Группа I Контрольная группа IА IБ §§ ИФН-γ, пг/мл 0,49±0,10 1,18±0,18 ** 0,40±0,10 0,45±0,07 ИЛ 4, пг/мл 12,37±1,74 13,97±2,59 40,81±6,26 * 26,00±6,27 Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,01, достоверность различия показателя по сравнению с контрольной группой. §§ - p<0,01, достоверность различия показателя по сравнению с подгруппой IБ. Цитокин Группа II Концентрация ИФН-γ в сыворотке крови пациенток подгруппы IА не отличалась от показателя группы с физиологическим течением беременности и была достоверно ниже, чем у женщин подгруппы IБ. Тенденция к снижению уровня ИЛ 4 а подгруппе IА сохранялась, но также была статистически недостоверной. Результаты тестов представлены в таблице 23. В сыворотке крови женщин II группы было выявлено значительное повышение уровня ИЛ 4 по сравнению с показателем в группе женщин с благоприятно протекающей беременностью и неосложненным акушерским 108 анамнезом. Концентрации ИФН-γ в крови женщин обеих групп практически не различались (таблица 23). Полученные данные свидетельствуют об усилении функции Th2 клеток и о смещении баланса Th1/Th2 в сторону преобладания Th2-опосредованных иммунорегуляторных механизмов у женщин, отнесенных к группе II. ИФН-γ 1,40 ИЛ 4 45 ** * 40 1,20 * * 35 1,00 0,80 пг/мл пг/мл 30 0,60 25 20 15 0,40 10 0,20 5 0,00 0 I триместр Подгруппа IА II триместр Подгруппа IБ I триместр Группа II II триместр Контрольная группа Рисунок 11. Концентрация ИФН-γ и ИЛ 4 в сыворотке крови женщин с НБ и в контрольной группе в I и II триместре беременности. Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,01, достоверность различия показателя по сравнению с контрольной группой. Мы проанализировали зависимость концентрации ИФН-γ и ИЛ 4 в сыворотке крови женщин НБ и в контрольной группе от гестационного срока. Как видно из рисунка 11, величина соответствующих показателей в I и 109 во II триместре беременности была сходной, статистически значимые различия между ними отсутствовали. Выявленные нами особенности экспрессии активационных маркеров лимфоцитов у женщин с низкой (< 62,82 нмоль/л) и высокой (>62,82 нмоль/л) концентрацией прогестерона в сыворотке крови побудили нас исследовать зависимость концентраций ИФН-γ и ИЛ 4 у женщин с НБ от уровня прогестерона. Как видно из рисунка 12, у женщин с благоприятно протекающей настоящей беременностью (контрольная группа и группа II) концентрация ИФН-γ была невысокой в обеих подгруппах, при этом отмечалась тенденция к снижению уровня цитокина в подгруппе женщин с высокой концентрацией прогестерона, что согласуется с представлениями о способности гормона угнетать, в том числе, Th1 – опосредованные иммунные реакции [65, 127]. У женщин II группы концентрация ИФН-γ в подгруппе с высоким уровнем прогестерона была достоверно меньше, чем у женщин с у женщин с низким уровнем прогестерона: 0,20±0,09 пг/мл и 0,53±0,13 пг/мл, соответственно (p<0,05). Повышение концентрации ИФН-γ в сыворотке крови пациенток подгруппы IБ было более выражено в подгруппе с низкой концентрацией прогестерона. Концентрация цитокина составила 1,90±0,49 пг/мл по сравнению с 0,97±0,17 пг/мл в подгруппе с высокой концентрацией прогестерона (p<0,05). Уровни ИФН-γ в крови пациенток подгруппы IА не различались между подгруппами (0,40±0,10 пг/мл у женщин с низким уровнем прогестерона и 0,55±0,18 пг/мл у женщин с высоким уровнем прогестерона, p>0,05). Изменения уровней ИЛ 4 у женщин с низкой и высокой концентрацией сывороточного прогестерона были однонаправленными, статистически значимые различия между подгруппами отсутствовали. 110 ИФН-γ 2,00 ИЛ 4 60 *** § 50 40 пг/мл пг/мл 1,50 * * 1,00 * 30 20 0,50 10 § 0,00 0 ≤ 62,82 нмоль/л Подгруппа IА > 62,82 нмоль/л Подгруппа IБ ≤ 62,82 нмоль/л Группа II > 62,82 нмоль/л Контрольная группа Рисунок 12. Концентрация ИФН-γ и ИЛ 4 в сыворотке крови женщин с НБ и в контрольной группе c концентрацией прогестерона в крови ниже и выше порогового значения 62,82 нмоль/л (20 нг/мл). Примечание: * - p<0,05; *** - p<0,001, достоверность различия показателя по сравнению с контрольной группой. § - p<0,05, достоверность различия показателя по сравнению с группой пациенток с концентрацией прогестерона выше порогового уровня. Полученные результаты указывают, на наш взгляд, на патогенетическую роль Th1 субпопуляции лимфоцитов и ИФН-γ на ранних этапах прерывания беременности, а также, вероятно, на неадекватное подавление Th1 – опосредованного иммунного ответа под влиянием прогестерона у пациенток с угрожающим абортом. Работы последних пяти лет убедительно показали, что обсуждение патогенетической или компенсаторно-приспособительной роли субпопуляций Т-хелперных клеток в рамках классической Th1/Th2 прадигмы 111 не позволяет в полной мере оценить вклад иммунных механизмов в возникновение и развитие заболевания [91, 158, 185]. Сегодня Th17 клетки принято считать обязательным компонентом Т-хелперной регуляции, и, несомненно, наши представления об иммунных механизмах патогенеза будут развиваться и усложняться с течением времени. В полной мере это относится к проблеме иммунопатогенеза репродуктивных нарушений [94, 191, 212]. В пилотной серии тестов мы не обнаружили статистически значимых различий в концентрации ИЛ 17А, являющегося основным цитокином Th17 лимфоцитов, у женщин с НБ и в контрольной группе. Этот результат побудил нас расширить спектр исследуемых цитокинов. Для комплексной характеристики функциональной активности Th17 лимфоцитов в нашей работе мы избрали определение концентраций ИЛ 17А, ИЛ 17F, ИЛ 21 и ИЛ 22 в сыворотке крови. Таблица 24. Концентрация цитокинов, секретируемых Th17 лимфоцитами, в сыворотке крови пациенток с НБ Цитокин Группа I IА IБ Группа II Контрольная группа ИЛ 17А, 7,06±0,94 7,79±0,93 4,52±0,58 ** 8,49±0,69 пг/мл ИЛ 17F, 25,46±2,26 * §§ 38,93±2,76 29,20±3,84 31,80±1,80 пг/мл ИЛ 21, 135,23±17,53 * §§ 81,11±4,76 * 84,62±5,48 98,99±6,30 пг/мл ИЛ 22, 41,96±8,33 § 25,12±2,04 18,86±2,02 * 29,05±2,56 пг/мл Примечание: * - p<0,05, достоверность различия показателя по сравнению с контрольной группой. § - p<0,05; §§ - p<0,01, достоверность различия показателя по сравнению с подгруппой IБ. Концентрации цитокинов, характеризующих субпопуляцию Th17 клеток, представлены в таблице 24. В подгруппе IБ отсутствовали значимые 112 изменения концентрации ИЛ 17А, ИЛ 17F и ИЛ 22, а концентрация ИЛ 21 оказалась ниже, чем в контрольной группе женщин с благоприятно протекающей беременностью. Напротив, в подгруппе IА наблюдалось заметное повышение концентрации ИЛ 21 (36% по сравнению с контрольной группой и 67% по сравнению с пациентками с угрожающим абортом) и ИЛ 22 (45% по сравнению с контрольной группой и 68% по сравнению с пациентками с угрожающим абортом) в сыворотке крови. При этом концентрация ИЛ 17F оказалась ниже, чем в обеих группах сравнения. Во II группе пациенток мы выявили снижение сывороточных уровней ИЛ 17А и ИЛ 22 по сравнению с контрольной группой, что свидетельствует, на наш взгляд, о подавлении функциональной активности Th17 лимфоцитов. Мы проанализировали концентрации ИЛ 17А, ИЛ 17F, ИЛ 21 и ИЛ 22 у женщин с НБ и в контрольной группе в I и во II триместре беременности. Как видно из рисунка 13, выявленные нами особенности цитокинового профиля имели однонаправленный характер. Статистически значимые различия между показателями I и II триместра беременности отсутствовали. Исследование уровней цитокинов, характеризующих Th17 субпопуляцию лимфоцитов, в подгруппах с низкой (< 62,82 нмоль/л) или высокой (>62,82 нмоль/л) концентрацией прогестерона сыворотки крови не выявило значимых различий у женщин с благоприятно протекающей беременностью и неосложнённым акушерским анамнезом (рисунок 14). У женщин группы II на фоне значительного повышения средней концентрации прогестерона (данные представлены в таблице 16) мы отметили снижение уровней ИЛ 17А (в обеих подгруппах) и ИЛ 22 (в подгруппе с низкой концентрацией прогестерона, величина показателя 14,03±1,87 пг/мл по сравнению с 26,1±1,65 пг/мл в подгруппе с высокой концентрацией 113 прогестерона, p<0,001). Данное наблюдение указывает, на наш взгляд, на способность прогестерона подавлять секрецию ряда Th17 цитокинов. ИЛ 17А 10 ИЛ 17F 45 ** 40 8 35 30 ** ** 4 пг/мл пг/мл 6 25 * 20 15 10 2 5 0 0 I триместр 180 160 II триместр I триместр 60 ИЛ 21 ** 50 140 100 * * 80 ИЛ 22 * 40 * 60 пг/мл пг/мл 120 II триместр 30 * 20 * 40 10 20 0 0 I триместр Подгруппа IА Рисунок 13. II триместр Подгруппа IБ Концентрация I триместр II триместр Группа II Контрольная группа цитокинов, секретируемых Th17 лимфоцитами, в сыворотке крови женщин с НБ и в контрольной группе в I и II триместре беременности. Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,01, достоверность различия показателя по сравнению с контрольной группой. 114 ИЛ 17А ИЛ 17F 40 10 35 30 6 * §§§ * * пг/мл пг/мл 8 4 25 20 ** §§§ 15 10 2 5 0 0 ≤ 62,82 нмоль/л 200 180 ≤ 62,82 нмоль/л > 62,82 нмоль/л 60 ИЛ 21 ИЛ 22 * * 50 160 140 40 * 120 100 80 * * пг/мл пг/мл > 62,82 нмоль/л 30 20 60 40 * §§§ 10 20 0 0 ≤ 62,82 нмоль/л Подгруппа IА > 62,82 нмоль/л Подгруппа IБ ≤ 62,82 нмоль/л Группа II > 62,82 нмоль/л Контрольная группа Рисунок 14. Концентрация цитокинов, секретируемых Th17 лимфоцитами, в сыворотке крови женщин с НБ и в контрольной группе c концентрацией прогестерона в крови ниже и выше порогового значения 62,82 нмоль/л (20 нг/мл). Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,01, достоверность различия показателя по сравнению с контрольной группой. §§§ - p<0,001, достоверность различия показателя по сравнению с группой пациенток с концентрацией прогестерона выше порогового уровня. 115 У пациенток подгруппы IБ имело место снижение концентрации ИЛ 21, отмечаемое в обеих подгруппах; концентрации ИЛ 17А, ИЛ 17F и ИЛ 22 существенно не менялись. Представляет значительный интерес характер изменения концентраций Th17 цитокинов у пациенток подгруппы IА. Если в подгруппе с высокой концентрацией сывороточного прогестерона достоверно менялся лишь уровень ИЛ 21 (возрастая до 124,25±9,95 пг/мл по сравнению с 103,65±8,73 пг/мл в контрольной группе, p<0,05), то у женщин с низкой концентрацией прогестерона мы наблюдали разнонаправленные сдвиги содержания ИЛ 17А и ИЛ 17F, с одной стороны, и ИЛ 21 и ИЛ 22, с другой. В частности, уровень ИЛ 17А (4,33±0,63 пг/мл) был достоверно ниже, чем в контрольной группе (6,84±0,83 пг/мл, p<0,05) и у женщин с высокой концентрацией прогестерона (9,1±1,31 пг/мл, p<0,001). Концентрация ИЛ 17F (15,53±2,44 пг/мл) также оказалась ниже, чем в контрольной группе (28,28±2,59 пг/мл, p<0,01) и в подгруппе пациенток с высоким уровнем прогестерона (32,90±1,09 пг/мл, p<0,001). Напротив, уровень ИЛ 21 оказался заметно повышенным в подгруппе с низкой концентрацией прогестерона, составив 176,43±35,21 пг/мл, по сравнению с 93,40±9,19 пг/мл в контрольной группе (p<0,05). Концентрация ИЛ 22 также возрастала до 55,70±18,54 пг/мл (29,40±4,58 пг/мл в контрольной группе, p<0,05). Мы предположили, что у части пациенток с прерыванием беременности концентрации ИЛ 21 и ИЛ 22 регулируются посредством прогестероннезависимых механизмов. При этом даже невысокие уровни прогестерона обеспечивают подавление секреции ИЛ 17А и ИЛ 17F, в то время как продукция ИЛ 21 и ИЛ 22 остается повышенной. Это может объясняться гетерогенностью Th17 субпопуляции лимфоцитов, пластичностью Th17 клеток, существованием переходных форм Т-хелперов, а также вкладом 116 других клеточных популяций [138, 142, 195, 217, 222]. Таким образом, Th17 – опосредованные иммунные процессы, связанные, прежде всего, с избыточной продукцией ИЛ 21 и ИЛ 22, могут являться одним из эффекторных механизмов прерывания беременности. Обобщив результаты, полученные при исследовании цитокинового профиля пациенток на различных этапах самопроизвольного прерывания беременности, можно утверждать, что угрожающий аборт характеризуется преобладанием Th1 эффектов и тенденцией к снижению Th2 - опосредованных иммунорегуляторных влияний. Для начавшегося аборта и аборта в ходу характерно усиление Th17 – опосредованных иммунных механизмов при сохраняющейся тенденции к ослаблению Th2 влияний. Обсуждая особенности цитокинового профиля при прерывании беременности следует отметить, что Th1 и Th17 – опосредованные иммунорегуляторные влияния имеют антагонистический характер: цитокины (в частности, ИФН-γ) и транскрипционные факторы (T-bet, STAT1, STAT4) Th1 лимфоцитов подавляют дифференцировку Th17 клеток и продукцию ими ИЛ 17А. Напротив, факторы дифференцировки Th17 лимфоцитов подавляют экспансию и функциональную активность Th1 клеточных клонов [96, 141, 165, 185]. В этой связи можно предположить, что возрастание функциональной активности Th17 клеток при начавшемся аборте и аборте в ходу, обнаруженное в нашем исследовании по увеличению концентраций Th17 цитокинов в крови, приводит к истощению адаптационных механизмов, существующих при угрожающем аборте (возможно, в том числе опосредованных Th1 клетками), и к самопроизвольному прерыванию беременности. Наши наблюдения согласуются с данными Nakashima и соавт. [173], показавшими увеличение числа Th17 клеток в децидуальной оболочке при необратимом аборте, сопровождающемся кровотечением и выраженным 117 абдоминальным болевым синдромом. Авторы рассматривают активацию Th17 – опосредованных иммунных реакций как эффекторный механизм самопроизвольного прерывания беременности [175]. В группе II мы выявили снижение сывороточных уровней ИЛ 17А и ИЛ 22 по сравнению с контрольной группой, что свидетельствует, на наш взгляд, о подавлении функциональной активности Th17 лимфоцитов. Учитывая увеличение концентрации ИЛ 4, отражающего функциональное состояние Th2 клеточной популяции, можно заключить, что ПНБ в анамнезе характеризуется доминированием прогестагенных влияний, направленных на сохранение настоящей беременности. Происходит смещение баланса Th1/Th2 в сторону преобладания Th2 – зависимых иммунорегуляторных влияний, при этом функциональная активность Th17 клеток угнетается. Th1 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Th17 Th2 Подгруппа IА Подгруппа IБ Группа II Контрольная группа Рисунок 15. Характеристика цитокинового профиля сыворотки крови женщин с различными клиническими вариантами НБ. 118 Выявленные закономерности схематически представлены на рисунке 15 (концентрации цитокинов при физиологической беременности приняты за 1, для субпопуляции Th17 представлена средняя арифметическая величина концентраций ИЛ 17А, ИЛ 17F, ИЛ 21 и ИЛ 22, отнесенных к показателям контрольной группы). Таким образом, поиск средств фармакологического воздействия на Th17 субпопуляцию лимфоцитов представляется перспективным направлением в профилактике и лечении прерывания беременности. Терапевтические мероприятия у женщин со скомпрометированной репродуктивной функцией должны быть направлены на усиление Th2 и подавление Th17 – опосредованных иммунных процессов. 119 ГЛАВА 4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ Проблеме НБ посвящено большое количество исследований, и число публикаций по этой теме непрерывно растет. Обсуждаются социальнодемографические и медицинские причины и механизмы репродуктивных потерь, совершенствуются методы диагностики и лечения репродуктивной дисфункции, однако в последние годы мы не наблюдаем улучшения статистических показателей [1, 64]. Это диктует необходимость комплексного подхода к изучению медицинского аспекта НБ, с учетом вклада генетических, анатомических, эндокринных, гемостазиологических, инфекционных и иммунных факторов. Состояние беременности уникально с точки зрения иммунологии, поскольку представляет собой сосуществование и активное взаимодействие генетически и антигенно неидентичных организмов матери и плода. Особенности иммунологической реактивности беременной женщины определяются предыдущими и текущими контактами с инфекционными патогенами, гормональный фон оказывает влияние на характер и выраженность иммунных реакций, а гемокоагуляционный каскад может быть инициирован, в том числе, иммунными факторами [45, 57, 95]. С другой стороны, связанный с отторжением полуаллогенного плода процесс самопроизвольного прерывания беременности предполагает, помимо активации иммунных механизмов, развитие локальной воспалительной реакции, сопровождающейся изменениями гуморального микроокружения, микроциркуляции, процессов гемостаза и фибринолиза [62, 65]. Системность и взаимосвязь патогенетических механизмов, и большое количество нерешенных вопросов профилактики, диагностики и лечения нарушений 120 репродуктивной функции требуют продолжения исследований в данном направлении. Под нашим наблюдением находились 153 женщины в I или II триместре беременности, в том числе 118 с прерыванием беременности и/или ПНБ в анамнезе и 35 с физиологически протекающей настоящей беременностью и неотягощенным акушерским анамнезом. Всем женщинам было проведено комплексное клинико-лабораторное и инструментальное обследование с целью выявления Иммунологическое факторов риска обследование и изучения включало механизмов количественную НБ. оценку важнейших популяций иммунокомпетентных клеток периферической крови и изучение особенностей их функционального состояния на основании экспрессии активационных и апоптотических маркеров лимфоцитов и сывороточных концентраций основных цитокинов, характеризующих баланс субпопуляций Т-хелперных клеток Th1, Th2 и Th17. Тщательный сбор анамнеза, физикальный осмотр, при необходимости проведение медико-генетической консультации позволили исключить генетические причины НБ у всех женщин, принявших участие в исследовании. Гинекологический осмотр и ультразвуковое исследование внутренних половых органов не выявили особенностей анатомического строения матки. Наконец, ультразвуковое исследование позволило исключить грубые аномалии развития плода. Исследование процессов гемостаза и фибринолиза с использованием как рутинных коагуляционных тестов, так и метода ТЭГ, а также скрининг всех женщин на антифосфолипидные антитела позволили исключить тромбофилическое состояние как причину НБ. Данные анамнеза и клинического осмотра, уровни ТТГ и тиреоидных гормонов в крови, глюкозы в крови и моче указывали на отсутствие связи между НБ и заболеваниями щитовидной железы и сахарным диабетом. 121 Определение концентраций гонадотропных и половых гормонов, включая прогестерон, также позволили исключить их из перечня факторов риска прерывания беременности. Инфекционный фактор, вероятно, оказал влияние на становление репродуктивной функции, о чем свидетельствовала высокая частота детских инфекций, ОРВИ, ангин и хронического тонзиллита, а также хронических воспалительных заболеваний мочеполовой сферы у женщин с прерыванием беременности и ПНБ, для которых было характерно также более позднее половое созревание [73]. С другой стороны, незначительная выраженность воспалительного процесса по данным клинического анализа мочи и исследования отделяемого мочеполовых органов не позволяет рассматривать микробную инфекцию как причину прерывания настоящей беременности. Таким образом, для целей настоящей работы мы отобрали женщин, у которых были исключены основные факторы риска, на долю которых приходится большая часть спорадических выкидышей и от 40% до 60% случаев ПНБ [132]. Среди «других» случаев ПНБ до 80% связаны с нераспознанными иммунными нарушениями [40, 62, 65, 66]. В группу прерывания беременности вошли женщины с угрожающим абортом и с начавшимся абортом и абортом в ходу. Мы предположили, что угрожающий аборт характеризуется состоянием неустойчивого равновесия патогенетических и компенсаторно-приспособительных реакций, в то время как при начавшемся аборте и аборте в ходу происходит срыв адаптационных механизмов, что приводит к прерыванию беременности. Таким образом, сравнительное изучение клинических данных, результатов лабораторных и инструментальных методов обследования при угрожающем и при состоявшемся аборте, и сопоставление их с показателями в контрольной группе женщин с благоприятно протекающей настоящей беременностью и 122 неосложнённым акушерским анамнезом позволит идентифицировать иммунные и иные механизмы, направленные на сохранение беременности. Во вторую группу вошли женщины с ПНБ в анамнезе и неосложненной настоящей беременностью. Мы также предположили, что изучение клинических и параклинических показателей в этой группе может дать ценные сведения о характере компенсаторно-приспособительных реакций, обеспечивающих благоприятное течение беременности у женщин со скомпрометированной репродуктивной функцией. Картина периферической крови при угрожающем аборте и при ПНБ в анамнезе характеризовалась приростом относительного и абсолютного числа гранулоцитов. Число лимфоцитарных клеток, напротив, снижалось (абсолютное содержание лимфоцитов составило 77% при угрожающем аборте и 86% при ПНБ в анамнезе, по отношению к показателю контрольной группы). Напротив, при начавшемся аборте и аборте в ходу росло общее число лейкоцитов и абсолютное содержание лимфоцитов в периферической крови (на 8% по сравнению с контрольной группой и 41% по сравнению с угрожающим абортом). Мы выявили сходные количественные изменения Т-звена иммунитета при угрожающем аборте и в группе с ПНБ в анамнезе: наблюдалось снижение общего числа Т-лимфоцитов за счет как хелперной, так и цитотоксической субпопуляций по сравнению с показателями контрольной группы. В частности, абсолютное содержание CD3+ Т-лимфоцитов снижалось на 29% при угрожающем аборте и на 18% при ПНБ в анамнезе, число хелперных CD3+CD4+ Т-клеток – на 27% и 18%, соответственно, число цитотоксических CD3+CD8+ Т-лимфоцитов – на 32% и 14%, соответственно. Напротив, при начавшемся аборте и аборте в ходу общее чисто Т-клеток возрастало на 23% по сравнению с контрольной группой и на 73% по сравнению с угрожающим абортом, содержание CD3+CD4+ клеток 123 увеличивалось на 20% и 64%, соответственно, а CD3+CD8+ клеток – на 25% и 84%, соответственно. При этом величина иммунорегуляторного индекса (ИРИ - соотношение CD4:CD8 клеток) снижалась до 1,51 (при 1,83 в контрольной группе и 2,06 при угрожающем аборте), что указывало на количественное преобладание клеток с цитотоксической функцией. Относительное содержание в крови CD19+ В-лимфоцитов, напротив, росло при угрожающем аборте, а при ПНБ в анамнезе увеличивалось как относительное, так и абсолютное число В-клеток (на 21% по сравнению с контрольной группой). При начавшемся аборте и аборте в ходу доля Влимфоцитов не менялась, хотя их абсолютное содержание в крови увеличивалось. Изменение числа CD3–CD16+CD56+ NK-клеток носило разнонаправленный характер. При угрожающем аборте их число практически не менялось, а при ПНБ в анамнезе росло (абсолютный показатель увеличивался на 62% по сравнению с контрольной группой). При начавшемся аборте и аборте в ходу относительное и абсолютное количество NK-клеток в крови также увеличивалось. Их абсолютное число росло на 86% по сравнению с контрольной группой и на 144% по сравнению с показателем в группе угрожающего аборта. Сравнительный анализ данных, полученных в разных группах беременных женщин позволяет заключить, что рост абсолютного числа лейкоцитов в периферической крови, увеличение содержания лимфоцитов, в том числе за счет Т-лимфоцитов, преобладающий рост количества цитотоксических Т-лимфоцитов и снижение величины ИРИ характеризуют развитие иммунопатологических процессов при прерывании беременности. Напротив, снижение общего содержания лимфоцитов, количества Тлимфоцитов за счет как хелперной, так и цитотоксической субпопуляций, а 124 также рост доли В-лимфоцитов отражают компенсаторно- приспособительные изменения в иммунной системе. Несмотря на выраженность изменений, интерпретация количества CD3– CD16+CD56+ клеток крови при прерывании беременности представляется затруднительной. Вероятно, это связано с функциональной гетерогенностью NK-клеток. Так, Nakashima и соавт. [175] выделяют четыре субпопуляции NK-клеток: NK1 клетки, продуцирующие цитокины, характерные для Th1 субпопуляции лимфоцитов; NK2 клетки, вырабатывающие цитокины, характерные для Th2 субпопуляции лимфоцитов; NK3 клетки, секретирующие TGF-β, и NKr1, продуцирующие ИЛ 10. Американское общество репродуктивной медицины не рекомендует использовать подсчет числа CD16+ NK-клеток в периферической крови в качестве диагностического показателя при ПНБ [184]. Для изучения особенностей функционального состояния лимфоцитов периферической крови мы оценили экспрессию раннего (CD25) и позднего (HLA-DR) активационных маркеров, а также антигена CD95, отражающего готовность лимфоидных клеток к восприятию апоптогенного сигнала и реализации программы апоптотической гибели. Число CD25+ Т-лимфоцитов у женщин с ПНБ в анамнезе не отличалось от показателей контрольной группы с физиологически протекающей настоящей беременностью и неосложненным акушерским анамнезом. В группе с угрожающим абортом наблюдалась тенденция к росту числа CD25+ клеток, которая, однако, была статистически значимой только в отношении относительного содержания CD3+CD25+ лимфоцитов. Напротив, в группе женщин с начавшимся абортом и абортом в ходу мы выявили значительный рост числа лимфоцитов с признаками ранней активации. Абсолютное число CD3+CD25+ лимфоцитов увеличилось на 220% по сравнению с контрольной группой и на 146% по сравнению с группой угрожающего аборта. Абсолютное число клеток с 125 фенотипом CD4+CD25+ выросло на 70% и 42%, соответственно. Обращало на себя внимание то обстоятельство, что если при физиологически протекающей беременности, ПНБ в анамнезе и угрожающем аборте практически все активированные Т-лимфоциты (98%, 92% и 95%, соответственно) принадлежали к CD4+ субпопуляции, то при начавшемся аборте и аборте в ходу около 30% активированных Т-лимфоцитов не относились к CD4+ клеткам. Мы предположили, что при состоявшемся аборте имел место рост числа активированных цитотоксических Тлимфоцитов, что согласуется с ростом содержания в периферической крови клеток с фенотипом CD3+CD8+. Мы не выявили изменения числа Т-клеток с признаками поздней активации (экспрессирующих маркер HLA-DR) при ПНБ в анамнезе и угрожающем аборте, а в группе с начавшимся абортом и абортом в ходу их абсолютное количество также было неизменным при снижении процентного содержания. Представляет интерес увеличение числа клеток с фенотипом CD3–HLADR+ в группе женщин с ПНБ в анамнезе. Эти клетки принято описывать как активированные «не Т-лимфоциты», имея в виду В- и NK-популяции лимфоцитов. Применительно к обсуждаемой группе беременных женщин и учитывая выявленный у них рост числа CD19+ клеток и сильную положительную корреляционную связь между числом CD3–HLA-DR+ и CD19+ лимфоцитов, можно предположить, что речь идет об активации Взвена иммунитета. Последнее предположение согласуется с концепцией, рассматривающей беременность как «Th2 - состояния» в рамках Th1/Th2 иммунорегуляторной парадигмы [153, 190, 213]. Следует также упомянуть большое количество «блокирующих публикаций, антител», а беременности [2, 160, 172, 221]. также посвященных «асимметричных защитной антител» роли при 126 Представляется важным наблюдение о почти двукратном росте числа Тлимфоцитов, несущих маркер CD95, при ПНБ в анамнезе. На наш взгляд, этот феномен иллюстрирует еще один компенсаторно-приспособительный механизм, защищающий плод от иммунологической атаки лимфоцитами матери. Отсутствие признаков активации иммунокомпетентных клеток в этой группе является, таким образом, не проявлением «слепоты» иммунной системы матери в отношении антигенов плода, а результатом реализации механизма активационного апоптоза иммунокомпетентных клеток и развития состояния иммунологической толерантности при беременности. Представляется целесообразным обсуждение особенностей активационного профиля лимфоцитов в контексте эндокринной регуляции, поскольку многие гормоны и факторы беременности обладают выраженным иммунотропным действием [22, 31, 36, 63, 70, 105, 129]. Наиболее выпряженные различия между группами обследованных женщин касались сывороточной концентрации прогестерона, обладающего иммуносупрессивной активностью [179, 220]. Во многих публикациях сообщается о снижении уровня прогестерона при НБ [53, 61, 63, 86]. Следует, однако, отметить, что большинство исследований были направлены на оценку риска прерывания беременности при низком уровне прогестерона в крови. Было показано, что наиболее уязвимыми являются ранние сроки беременности [86, 129]. В работе Hussain и соавт. [129] обсуждается пороговый уровень прогестерона 40 нмоль/л, ниже которого резко взрастал риск самопроизвольного прерывания беременности. Abdelazim и соавт. [86] предлагают ориентироваться на критические уровни 10 нг/мл (79,3% чувствительности для диагноза нежизнеспособной беременности и 93,3% специфичности для диагноза жизнеспособной беременности) и 20 нг/мл (95,1% чувствительности для диагноза нежизнеспособной беременности и 98,9% специфичности для диагноза жизнеспособной беременности). al-Sebai 127 и соавт. [88] установили пороговую концентрацию прогестерона, ниже которой происходило прерывание беременности как 45 нмоль/л (87,6% чувствительности и 87,5% специфичности) при гестационном сроке до 18 недель. Однако определение прогестерона в концентрациях, превышающих указанные критические уровни, не исключало самопроизвольного прерывания беременности. Противоречивые данные получены в отношении терапевтической активности прогестерона и его аналогов при прерывании беременности. Сообщают об эффективности препаратов прогестерона у пациенток с ПНБ [110, 176]. Напротив, при спорадическом прерывании беременности препараты прогестерона оказались неэффективными [53, 116, 120]. Cнижение уровня прогестерона в крови может быть не причиной, а эффекторным механизмом прерывания беременности [53]. Этим может объясняться отсутствие снижения сывороточных концентраций прогестерона при прерывании беременности в нашем исследовании, в котором приняли участие только женщины, у которых отсутствовали генетические, анатомические, эндокринные, тромбофилические и иные факторы риска НБ. Мы оценили связь между сывороточной концентрацией прогестерона и числом лимфоцитов периферической крови, экспрессирующих активационные маркеры и маркер апоптоза CD95, во всех группах. У женщин с благоприятно протекающей беременностью и неосложненным акушерским анамнезом (контрольная группа) наблюдалась достоверная отрицательная корреляция между уровнем прогестерона и процентом CD3+CD25+ и CD4+CD25+ клеток. У женщин с ПНБ в анамнезе также выявлялась отрицательная корреляционная связь между содержанием прогестерона и числом CD4+CD25+, CD3+HLA-DR+ и CD3+CD95+ клеток. Напротив, в группах с прерыванием беременности отмечалась положительная корреляция между концентрацией прогестерона и числом Т- 128 лимфоцитов с фенотипом CD3+CD25+ и CD4+CD25+, иными словами, рост сывороточного уровня прогестерона сопровождался увеличением числа активированных Т-клеток. Мы выявили существенные различия в количестве лимфоцитов, экспрессирующих активационные маркеры, в крови женщин с низкой (< 62,82 нмоль/л) и высокой (>62,82 нмоль/л) сывороточной концентрацией прогестерона. При благоприятном течении настоящей беременности (ПНБ в анамнезе и контрольная группа) повышение концентрации прогестерона закономерно сопровождалось снижением числа клеток с фенотипом CD3+CD25+ и CD4+CD25+, что согласуется с представлениями об иммуносупрессорной роли гормона при беременности [65, 129, 179, 220]. Напротив, у женщин с прерыванием беременности высокая концентрация прогестерона сочеталась с увеличением числа активированных Т- лимфоцитов в периферической крови. Последнее наблюдение позволяет предположить существование иммунокомпетентных клеток из-под механизма «ускользания» иммуносупрессорного влияния прогестерона у части пациенток с прерыванием беременности, что может являться одним из факторов патогенеза самопроизвольного аборта. Показана способность α-фетопротеина угнетать иммунные реакции и подавлять экспрессию активационных маркеров лимфоцитов [31, 70]. В нашем исследовании было отмечено увеличение содержания белка в сыворотке крови при ПНБ в анамнезе и угрожающем аборте (26% и 12%, соответственно, по сравнению с показателем контрольной группы). Для того чтобы сделать предположение о физиологической роли этих изменений, мы, по аналогии с прогестероном, оценили корреляционную связь между концентрациями α-фетопротеина и числом лимфоцитов периферической крови, несущих маркеры активации и апоптоза. Оказалось, что при угрожающем аборте и у женщин контрольной группы имела место 129 положительная корреляционная связь между уровнем α-фетопротеина и числом лимфоцитов, обладающих признаками поздней активации и готовности к апоптозу (фенотип CD3+HLA-DR+ и CD3+CD95+). В группе с ПНБ в анамнезе мы наблюдали отрицательную корреляцию между концентрацией α-фетопротеина и числом CD3+CD25+. Напротив, при начавшемся аборте и аборте в ходу концентрация α-фетопротеина положительно коррелировала с числом активированных CD4+CD25+ лимфоцитов. Мы обсуждали ключевую роль ХГЧ в возникновении и сохранении беременности, в том числе благодаря его иммунотропным свойствам [22, 23, 24, 36, 105, 135, 166]. В нашем исследовании не была выявлена связь между уровнем ХГЧ в крови и числом лимфоцитов, экспрессирующих активационные маркеры и маркер апоптоза, в контрольной группе с физиологическим течением беременности и неосложненным акушерским анамнезом. Напротив, у женщин с ПНБ в анамнезе наблюдалась выраженная отрицательная корреляция между концентрацией ХГЧ и числом клеток с фенотипом CD3+CD25+, CD4+CD25+, CD3+HLA-DR+ и CD3+CD95+. Обобщая вышеизложенное, можно заключить, что увеличение числа Тлимфоцитов, имеющих признаки ранней активации (фенотип CD3+CD25+, CD4+CD25+) является фактором патогенеза прерывания беременности. Рост доли активированных цитотоксических CD8+ Т-лимфоцитов, вероятно, также способствует отторжению полуаллогенного плода. Напротив, увеличение доли активированных «не Т-клеток» CD3–HLA-DR+, а также Т-лимфоцитов, экспрессирующих маркер апоптоза (фенотип CD3+CD95+) отражает реализацию реакций ограничения иммунной агрессии, являясь, фактически, компенсаторно-приспособительным механизмом. Результатов корреляционного анализа и сопоставления показателей иммунограммы у женщин с различными концентрациями прогестерона в 130 крови недостаточно для того, чтобы утверждать наличие причинноследственной связи между изменениями концентраций прогестерона, αфетопротеина и ХГЧ и активацией или супрессией иммунокомпетентных клеток при прерывании беременности. Мы можем, однако, предположить, что ответ лимфоцитов женщин с прерыванием беременности на стимуляцию прогестероном, α-фетопротеином и ХГЧ отличается от реакции, характерной для женщин с благоприятным течением беременности. Таким образом, прогестерон и α-фетопротеин нельзя рассматривать в качестве агентов, препятствующих прерыванию беременности с точки зрения их влияния на иммунные механизмы аборта. Напротив, ХГЧ может выступать в роли иммуносупрессивного агента у женщин со скомпрометированной репродуктивной функцией. Это может быть связано с особенностями рецепции и метаболизма прогестагенных факторов, или индукцией выработки эндогенных иммуномодуляторов при НБ, и требует дальнейшего изучения. Развитие воспалительной реакции, связанной с активацией эффекторных иммунных механизмов микроциркуляции, а в и ряде сопровождающейся случаев и системными изменениями нарушениями гемокоагуляции и фибринолиза, указывает на целесообразность изучения гемостазиологических сдвигов при прерывании беременности. Снижение коагуляционного потенциала крови при ПНБ в анамнезе (выявляемое по удлинению тромбинового времени, увеличению показателя R и уменьшению угла расхождения α ТЭГ) может иметь компенсаторно-приспособительный характер, способствуя поддержанию микроциркуляции в системе маточноплацентарного кровотока реактивности. Активация в условиях измененной тромбоцитарного иммунологической гемостаза и угнетение фибринолиза при угрожающем аборте, выявляемые по росту показателей MA, G, А и снижению показателя LY30 ТЭГ также, вероятно, направлены на 131 предотвращение и остановку маточного кровотечения. Напротив, гипокоагуляция, выявляемая по снижению протромбинового времени по Квику и изменению показателей ТЭГ, характеризующих коагуляционный компонент гемостаза (R, угол расхождения α и CI), при начавшемся аборте и аборте в ходу может быть предвестником такого грозного осложнения, как коагулопатия потребления (ДВС-синдром). Следует отметить, что в нашей работе ТЭГ показала себя как более чувствительный и, в конечном итоге, более информативный фибринолиза в метод акушерской диагностики практике, по нарушений сравнению гемостаза с и рутинными коагуляционными тестами. Несмотря на известные ограничения, определение концентраций цитокинов в периферической крови является надежным методом оценки функционального баланса клеток иммунной системы [103]. Для характеристики процессов иммунорегуляции при НБ мы исследовали концентрации цитокинов, характеризующих важнейшие субпопуляции Тхелперных клеток: Th1, Th2 и Th17. Маркером Th1 субпопуляции лимфоцитов является ИФН-γ, цитокиновый паттерн Th2 клеток принято оценивать по выработке ИЛ 4 [33, 111, 182]. Th17 представляет собой особую субпопуляцию CD4+ Т-лимфоцитов, отличную от Th1 и Th2, а также других, менее изученных типов хелперных клеток. Помимо ИЛ 17А и ИЛ 17F, Th17 клетки секретируют другие цитокины, в частности, ИЛ 21 и ИЛ 22 [90, 164, 215]. Цитокиновый профиль сыворотки крови пациенток с угрожающим абортом характеризовался заметным ростом концентрации ИФН-γ, на 162% по сравнению с группой женщин с благоприятным течением настоящей беременности и неосложненным акушерским анамнезом (контрольная группа). Напортив, уровень ИЛ 4 демонстрировал тенденцию к снижению, составив 54% от показателя контрольной группы. Указанное различие было, 132 однако, статистически недостоверным из-за значительного разброса индивидуальных показателей. Концентрации цитокинов, характеризующих функцию Th17 клеток, ИЛ 17А, ИЛ 17F и ИЛ 22, не отличались от показателей контрольной группы, а уровень ИЛ 21 был достоверно ниже, чем при физиологической беременности. Таким образом, Th1/Th2 баланс при угрожающем аборте характеризовался смещением в сторону преобладания Th1 – влияний. При этом мы не выявили усиления активности Th17 клеток. Полученные результаты хорошо согласуются с данными литературы. В частности, было показано повышение уровней провоспалительных цитокинов ФНО-α, ИФН-γ, ИЛ 12 в сыворотке крови и цервикальной слизи при угрозе прерывания беременности [39, 45, 77]. В ряде работ также было продемонстрировано снижение концентраций ИЛ 4 и ИЛ 10 по сравнению с контрольной группой женщин с физиологически протекающей беременностью [39, 77]. В другом исследовании, напротив, был отмечено повышение содержания ИЛ 4 в сыворотке крови и цервикальной слизи при НБ по сравнению с контрольной группой [45]. Количество Th17 клеток в децидуальной ткани повышалось при состоявшемся прерывании беременности, при этом угроза прерывания беременности, не завершившаяся выкидышем, не сопровождалась изменением числа Th17 клеток [173]. Увеличение числа Th1 клеток и увеличение выработки ИФН-γ при угрозе прерывания беременности принято рассматривать в качестве патогенетического механизма отторжения плода [146, 191]. Следует, однако, принять во внимание данные о противовоспалительной активности ИФН-γ, продемонстрированной в нескольких экспериментальных моделях [162, 180, 185]. ИФН-γ способствовал дифференцировке Treg лимфоцитов благодаря стимуляции экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости II класса, индуцибельной NO-синтазы, индоламин-2,3-диоксигеназы и гемоксигеназы [205, 216]. Нельзя исключить, что усиленная выработка ИФН-γ, 133 обнаруженная в группе пациенток с угрожающим абортом, является одним из компенсаторных механизмов, препятствующих самопроизвольному прерыванию беременности. Наиболее существенным сдвигом в цитокиновом статусе женщин с начавшимся абортом и абортом в ходу было увеличение концентраций ряда Th17 цитокинов. Уровень ИЛ 21 возрастал на 36% по сравнению с показателем контрольной группы и на 67% по сравнению с угрожающим абортом. Концентрация ИЛ 22 также повышалась на 45% по сравнению с группой с физиологической беременностью и на 68% по сравнению с угрожающим абортом. Уровень ИЛ 17А, однако, не менялся, а ИЛ 17F был даже снижен. Неоднонаправленность изменений концентраций Th17 цитокинов, вероятно, связана с функциональной гетерогенностью этой субпопуляции Т-клеток, наличием переходных форм Т-хелперов, а также вкладом других клеточных популяций [91, 142, 215, 217, 222]. Концентрация ИЛ 4 при начавшемся аборте и аборте в ходу демонстрировала тенденцию к снижению по сравнению с контрольной группой (на 46%, разница статистически недостоверна) и не отличалась от показателя в группе угрожающего аборта. Уровень ИФН-γ не отличался от концентрации цитокина в контрольной группе и был ниже, чем при угрожающем аборте. Последнее наблюдение может быть объяснено функциональным антагонизмом Th1 и Th17 субпопуляций лимфоцитов. Цитокины и транскрипционные факторы Th1 лимфоцитов подавляют дифференцировку Th17 клеток и продукцию ими ИЛ 17А. Напротив, факторы дифференцировки Th17 лимфоцитов угнетают экспансию и функциональную активность Th1 клеточных клонов [96, 141, 165, 185]. Анализ зависимости концентраций цитокинов от уровня прогестерона сыворотки крови показал, что содержание провоспалительных Th1 (ИФН-γ) и Th17 (ИЛ 21 и ИЛ 22) цитокинов было заметно выше при снижении уровня 134 прогестерона у женщин с прерыванием беременности, что, вероятно, указывает на несостоятельность механизмов угнетения Th1 и Th17 – опосредованных иммунных реакций под влиянием прогестерона при этом патологическом состоянии. В группе женщин с ПНБ в анамнезе и благоприятным течением настоящей беременности мы отметили увеличение концентрации ИЛ 4 на 58% по сравнению с контрольной группой, свидетельствовавшее об усилении Th2 эффектов. Концентрация ИФН-γ не отличалась от контрольного показателя, таким образом, имел место сдвиг Th1/Th2 баланса в сторону усиления Th2 – опосредованных иммунорегуляторных механизмов. Важно отметить, что концентрации всех изученных Th17 цитокинов имели тенденцию к снижению (ИЛ 17F – на 9%, ИЛ 21 – на 15%, ИЛ 22 – на 35%), а уровень ИЛ 17А был достоверно снижен на 47% по сравнению с контрольной группой. Обобщая изложенные выше сведения, можно заключить, что усиление Th2 – опосредованных иммунорегуляторных эффектов и подавление функции Th17 клеток - это факторы, способствующие сохранению беременности. Напротив, повышение концентраций Th1 и Th17 цитокинов характерно для НБ, причем рост функциональной активности Th17 клеток, вероятно, является эффекторным механизмом самопроизвольного аборта. Реализация цели и задач, поставленных в диссертационной работе, позволила нам выявить следующие закономерности, характеризующие патогенетические и компенсаторно-приспособительные сдвиги в иммунной системе, а также связанные с ними особенности гормонального фона и гемостаза, при НБ. 135 Патогенетические механизмы прерывания беременности включают в себя: Рост абсолютного числа лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови; Увеличение числа Т-лимфоцитов с преобладающим ростом цитотоксической субпопуляции; снижение иммунорегуляторного индекса; Рост числа Т-лимфоцитов, экспрессирующих маркер ранней активации CD25; Диссоциацию (фенотип между CD3+CD25+) количеством и числом активированных активированных Т-клеток Т-хелперов (фенотип CD4+CD25+); формирование субпопуляции активированных цитотоксических Т-лимфоцитов; Угнетение коагуляционного гемостаза при начавшемся аборте и аборте в ходу; Усиление Th1 – и Th17 – зависимых иммунных реакций на фоне угнетения Th2 субпопуляции Т-хелперных клеток. Увеличение содержания NK-клеток в периферической крови нельзя однозначно интерпретировать как адаптационный или патогенетический механизм при НБ. Компенсаторно-приспособительные механизмы, направленные на сохранение беременности, характеризуются: Снижением относительного и абсолютного числа лимфоцитов в периферической крови; Уменьшением относительного и абсолютного содержания Т- лимфоцитов, включая как хелперную, так и цитотоксическую субпопуляции; Ростом числа В-лимфоцитов в периферической крови; 136 Увеличением числа активированных «не Т-лимфоцитов» с фенотипом CD3–HLA-DR+; Ростом числа лимфоидных клеток, экспрессирующих CD95, маркер готовности к восприятию апоптогенного сигнала и реализации программы апоптотической гибели; Угнетением коагуляционного гемостаза при благоприятном течении беременности; активацией тромбоцитарно-сосудистого гемостаза и угнетением фибринолиза при угрожающем аборте; Усилением Th2 - и подавлением Th17 – зависимых иммунных реакций. Иммунотропное действие прогестерона, α-фетопротеина и ХГЧ не может быть однозначно интерпретировано как адаптационный или патогенетический механизм при НБ. Изложенные выше сведения представляют интерес с точки зрения совершенствования диагностического алгоритма у женщин с различными клиническими вариантами НБ. Кроме того, развитие представлений о патогенетических механизмах потерь беременности является необходимым условием разработки новых репродуктивных нарушений. подходов к профилактике и лечению 137 ВЫВОДЫ 1. Выраженные иммунологические сдвиги, выявляемые у женщин с НБ после исключения генетических, анатомических, эндокринных, тромбофилических и инфекционных этиологических факторов, указывают на ведущую роль иммунных нарушений в механизмах НБ «неясного генеза». 2. Высокая инфекционная заболеваемость в анамнезе, в том числе детскими инфекциями и воспалительными заболеваниями мочеполовой системы, является фактором риска задержки полового созревания и НБ во взрослом возрасте. 3. Для прерывания беременности характерна активация Т-клеточного иммунитета, проявляющаяся CD3+CD25+ и CD4+CD25+. ростом числа Диссоциация клеток между с фенотипом количеством активированных Т-лимфоцитов и активированных Т-хелперов указывает на активацию цитотоксической субпопуляции Т-клеток при начавшемся аборте и аборте в ходу. Компенсаторно-приспособительные иммунные механизмы, направленные на сохранение беременности у женщин со скомпрометированной репродуктивной функцией, включают активационный апоптоз Т-лимфоцитов, выявляемый по увеличению числа CD3+CD95+ клеток при нормальном содержании активированных CD25+ Т-лимфоцитов, а также стимуляцию В-звена иммунитета. 4. Усиление функциональной активности Th17 субпопуляции лимфоцитов на фоне сдвига Th1/Th2 баланса в сторону преобладания Th1опосредованных иммунных реакций является механизмом прерывания беременности. Напротив, угнетение Th17- и усиление Th2-зависимых процессов иммунорегуляции способствует беременности у женщин с ПНБ в анамнезе. сохранению текущей 138 5. Показатели гормонального фона при НБ следует интерпретировать с учетом особенностей иммунного статуса. Рост числа активированных CD3+CD25+ и CD4+CD25+ лимфоцитов на фоне повышенной концентрации прогестерона в крови, а также увеличение содержания провоспалительных Th1 (ИФН-γ) и Th17 (ИЛ 21 и ИЛ 22) цитокинов при низкой концентрации прогестерона являются факторам риска прерывания беременности. 139 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Алгоритм обследования женщин с НБ должен включать в себя оценку иммунологических параметров, в частности: популяционного и субпопуляционного состав лимфоцитов периферической крови (относительные и абсолютные показатели); числа клеток, экспрессирующих маркеры активации и апоптоза: CD3+CD25+, CD4+CD25+, CD3+HLA-DR+, CD3–HLA-DR+ и CD3+CD95+; цитокинового профиля, характеризующего Th1, Th2 и Th17 субпопуляции лимфоцитов. 2. Количественная оценка популяции CD3–CD16+CD56+ в периферической крови не позволяет сделать заключение о функциональной роли NKклеток при беременности; интерпретация соответствующего показателя иммунограммы требует осторожности. 3. Для адекватной характеристики функционального состояния Th17 субпопуляции лимфоцитов необходимо определение спектра цитокинов, включающего ИЛ 17А, ИЛ17F, ИЛ 21 и ИЛ 22. 4. Для оценки целесообразно гемостаза фибринолиза использовать высокоинформативным инструментом. и и метод в акушерской ТЭГ, чувствительным практике являющийся диагностическим 140 Рекомендуемые референсные значения иммунологических показателей при физиологической беременности Показатель Референсные значения Популяции и субпопуляции лимфоцитов CD3+, % клеток х 109/л CD3+CD4+, % клеток х 109/л CD3+CD8+, % клеток х 109/л CD3–CD16+CD56+, % клеток х 109/л CD3+CD16+CD56+, % клеток х 109/л CD19+, % клеток х 109/л Маркеры активации и апоптоза CD3+CD25+, % клеток х 109/л CD4+CD25+, % клеток х 109/л CD3+HLA-DR+, % клеток х 109/л CD3–HLA-DR+, % клеток х 109/л CD3+CD95+, % клеток х 109/л Цитокины ИФН-γ, пг/мл ИЛ 4, пг/мл ИЛ 17А, пг/мл ИЛ 17F, пг/мл ИЛ 21, пг/мл ИЛ 22, пг/мл 62,7 – 94,2 0,62 – 2,84 23,5 – 71,4 0,19 – 1,91 13,7 – 45,4 0,10 – 1,21 < 18,7 < 0,53 < 14,0 < 0,34 1,1 – 15,4 < 0,43 < 10,5 < 0,27 < 10,0 < 0,27 < 12,2 < 0,24 2,6 – 21,6 0,06 – 0,46 < 25,68 < 0,66 < 1,2 < 80,3 0,8 – 16,2 11,6 – 51,9 28,6 – 169,4 0,4 – 57,7 141 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Айрапетов Д.Ю., Ордиянц И.М. Эндокринные изменения у женщин с привычным невынашиванием беременности и гомологией антигенов HLA. Врач 2012; 8: 71-73. 2. Айрапетов Д.Ю., Ордиянц И.М., Побединская О.С. Аллоиммунный механизм привычного невынашивания беременности. Проблемы репродукции 2010; 1: 86-88. 3. Антух Е.И., Смирнова И.В. Метод иммунизации лимфоцитами мужа в лечении привычного невынашивания. Охрана материнства и детства 2011; 1: 66-68. 4. Баскова О. Ю., Судаков Ю. Е., Обоскалова Т. А. Структура инфекционного фактора при невынашивании беременности. Вестник Новосибирского государственного университета. Серия: Биология, клиническая медицина 2007; 3: 115. 5. Беспалова О.Н. Генетика невынашивания беременности. Журнал акушерства и женских болезней 2007; 1: 81-95. 6. Буянова С.Н., Мгелиашвили М.В. Профилактика и лечение бактериального вагиноза после антибиотикотерапии в оперативной гинекологии. Российский вестник акушера-гинеколога 2009; 5(9): 82-84. 7. Буянова С.Н., Мгелиашвили М.В., Петракова С.А. Возможности реконструктивной хирургии матки в коррекции репродуктивной функции у пациенток с миомой матки. Российский вестник акушерагинеколога 2011; 5(11): 89-93. 8. Буянова С.Н., Щукина Н.А., Горшилин А.В. Репродуктивный прогноз у больных с гнойными воспалительными заболеваниями органов малого таза: проблемы и решения. Российский вестник акушера-гинеколога 2009; 2(9): 65-68. 142 9. Буянова С.Н., Щукина Н.А., Савельев С.В., Сафарова С.С., Карева Е.Н., Лукашенко С.Ю. Клиническое значение рецепторов половых стероидов в оценке исхода хронического гнойного воспаления внутренних половых органов. Российский вестник акушера-гинеколога 2007; 3(7): 16-20. 10. Буянова С.Н., Юдина Н.В., Гукасян С.А. Реабилитация репродуктивной функции у женщин с миомой матки, страдающих бесплодием и невынашиванием беременности. Российский вестник акушера- гинеколога 2012; 5(12): 67-71. 11. Газиева И.А., Чистякова Г.Н., Данькова И.В., Селиванов О.Л. Иммунные механизмы регуляции формирования фетоплацентарного комплекса. Перинатология 2008; 52(12): 80-85. 12. Гинзбург Б.Г. Медико-демографические аспекты репродуктивных потерь. Проблемы репродукции 2010; 6: 39-43. 13. Глебов Н.В. Значение антифосфолипидного синдрома в профилактике невынашивания беременности. Бюллетень медицинских Интернетконференций 2011; 1: 9-10. 14. Глуховец И.Б., Миров А.И., Сидоренко В.В. Клинико-морфологические сопоставления при невынашивании беременности на ранних сроках. Российский медико-биологический вестник им. академика И.П. Павлова 2008; 3: 8-12. 15. Горовой Н.С. Гемостазиологические нарушения у пациенток при несвоевременном завершении беременности. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований 2012; 1: 23. 16. Демидов В. Н., Стыгар А. М. Клиническое значение эхо-графии в ранние сроки беременности. Акушерство и гинекология 1985; 10: 63–67. 17. Доброхотова Ю.Э., Ли А.Д., Джобава Э.М. Некоторые аспекты антикоагулянтной терапии тромбофилических состояний у беременных 143 с тромботическими осложнениями и невынашиванием беременности. Лечебное дело 2006; 2: 59-68. 18. Доброхотова Ю.Э., Озерова Р.И., Мандрыкина Ж.А., Рора Л.С. Некоторые аспекты этиологии и патогенеза эмбриональных потерь в I триместре гестации. Российский вестник акушера-гинеколога 2008; 5: 15-18. 19. Екимова Е.В., Гончарова Е.А., Алексеева М.Л., Колодько В.Г., Фанченко Н.Д. Хорионической гонадотропин и его свободная β-субъединица при беременности. Проблемы репродукции 2007; 1: 96-98. 20. Енькова Е.В., Грибанова В.А., Воронина Е.В. Современные представления о проблеме невынашивания беременности. Научномедицинский вестник Центрального Черноземья 2009; 38: 116-120. 21. Есина Е.В., Логина Н.Ю., Аляутдина О.С. Роль иммунных взаимодействий в развитии бесплодия: обзор литературы. Русский медицинский журнал 2013; 1 (21): 44-48. 22. Заморина С.А., Горбунова О.Л., Ширшев С.В. Хорионический гонадотропин как регулятор фенотипического созревания интактных и интерлейкин-2-активированных NK- и NKT-клеток. Вестник Пермского университета 2010; 1: 77-80. 23. Заморина С.А., Ширшев С.В. Влияние хорионического гонадотропина на секрецию моноцитами эластазы и катепсина G. Роль Toll-подобных протеинов. Вестник Пермского университета 2008; 9: 77-80. 24. Заморина С.А., Ширшев С.В. Хорионический гонадотропин – фактор индукции иммунной толерантности при беременности. Иммунология 2013; 2: 105-107. 25. Зароченцева Н.В. Особенности местного иммунитета шейки матки и беременность. Российский вестник акушера-гинеколога 2007; 1: 19-23. 144 26. Зароченцева Н.В., Аршакян А.К., Меньшикова Н.С. Воспалительные заболевания органов малого таза у женщин (обзор литературы). Гинекология 2013; 4: 65-69. 27. Зароченцева Н.В., Аршакян А.К., Меньшикова Н.С., Титченко Ю.П. Хронический эндометрит: этиология, клиника, диагностика, лечение. Российский вестник акушера-гинеколога 2013; 5: 21-27. 28. Зароченцева Н.В., Малиновская В.В., Серова О.Ф., Метелёва Е.А., Кешьян Л.В., Торшина З.В. Папилломавирусная инфекция у беременных. Российский вестник акушера-гинеколога 2011; 6: 75-78. 29. Зароченцева Н.В., Серова О.Ф., Торшина З.В., Меньшикова Н.С., Кешьян Л.В., Малиновская В.В. Особенности местного иммунитета у беременных с папилломавирусной инфекцией. Российский вестник акушера-гинеколога 2012; 4: 8-12. 30. Зотова Н. В., Казьмина Н. В., Маркова Е. В., Полстяная Г. Н., Махалова Н. А., Новосельцева А. В. Диагностика генетических факторов невынашивания беременности. государственного университета. Вестник Серия: Новосибирского Биология, клиническая медицина 2007; 3: 12-15. 31. Казимирский А.Н., Салмаси Ж.М., Купцова Н.В., Тагирова А.К., Молдогазиева Н.Т., Терентьев А.А. Элиминация лимфоцитов, активированных воспалительным процессом, под влиянием альфафетопротеина человека и олигопептида АФП14-20. Международный журнал экспериментального образования 2010; 7: 28-29. 32. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины. СПб: ООО «Издательство Фолиант» 2008: 552. 33. Киселева Е.П. Новые представления о противоинфекционном иммунитете. Инфекция и иммунитет 2011; 1(1): 9–14. 145 34. Кондратьева Л. В., Решетняк Т. М. Антифосфолипидный синдром: диагностика и профилактика тромбозов. Доктор.Ру 2010;3: 52-56. 35. Корнюшина Е. А., Зайнулина М. С. Нарушения системы гемостаза, методы их коррекции и исходы беременности у больных с невынашиванием и тромбофилией. Журнал акушерства и женских болезней 2008; 4: 89-95. 36. Косых А.А., Горшков А.С., Полушин А.В. Регуляция пролиферации клеток с помощью хорионического гонадотропина человека. Успехи современного естествознания 2008; 10: 74-76. 37. Краснопольский В.И., Буянова С.Н., Щукина Н.А. Гнойно-септические осложнения в акушерстве и гинекологии: патогенез, диагностики и лечебная тактика. Российский вестник акушера-гинеколога 2007; 5(7): 76-81. 38. Краснопольский В.И., Сергеев П.В., Гаспарян Н.Д., Карева Е.Н., Логутова Л.С., Буянова С.Н., Титченко Л.И., Горбунова Т.Н., Бабунашвили Е.Л. Беременность и прогестеронзависимая миома матки. Российский вестник акушера-гинеколога 2003; 3: 55-57 39. Левкович М.А. Современные представления о роли цитокинов в генезе физиологического и патологического течения беременности. Российский вестник акушера-гинеколога 2008; 3: 37-40. 40. Лупояд В.С., Бородай И.С., Аралов О.Н., Щербина И.Н. Привычное невынашивание беременности: современный взгляд на старую проблему. Международный медицинский журнал 2011; 4: 54-60. 41. Макаров О.В., Алешкин В.А., Хашукоева А.З., Савченко Т.Н., Протопопова Л.О., Афанасьев С.С., Воропаева Е.А., Ибрагимова М.И. Микробиологические аспекты и факторы противомикробной защиты в генезе невынашивания беременности. Вестник Российского государственного медицинского университета 2009; 4: 11-16. 146 42. Макаров О.В., Бахарева И.В., Идрисова Л.С. Анализ цитокинов в околоплодных водах при внутриутробной инфекции. Фундаментальные исследования 2004; 1: 67. 43. Макаров О.В., Богатырев Ю.А., Осипова Н.А. Значение аутоантител в патогенезе преэклампсии. Акушерство и гинекология 2012; 4: 16-21. 44. Макаров О.В., Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Бахарева И.В., Романовская В.В., Ганковская О.А. Прогностическое значение компонентов врожденного иммунитета у беременных с высоким риском реализации внутриутробной инфекции. Вестник Российского государственного медицинского университета 2009; 4: 27-33. 45. Макаров О.В., Озолиня Л.А., Сумеди Т.Н. Изменение показателей иммунитета у пациенток с невынашиванием беременности инфекционного генеза в I триместре. Российский вестник акушерагинеколога 2008; 6: 28-32. 46. Макаров О.В., Осипова Н.А., Полетаев А.Б. Клиническое значение аутоантител в диагностике гестоза. Медицина. XXI век 2009; 14: 28-32. 47. Макацария А.Д., Бицадзе В.О., Хизроева Д.Х., Макацария Н.А., Яшенина Е.В. Патогенетическое значение антифосфолипидных антител. Практическая медицина 2012; 5(60): 9-21. 48. Маринкин И.О., Илизарова Н.А., Кулешов В.М., Непомнящих Г.И. Клинико-патоморфологические аспекты привычного невынашивания беременности. Сибирское медицинское обозрение 2010; 4: 57-61. 49. Михайлова В.А., Сельков С.А., Соколов Д.И. Фенотипические и функциональные характеристики NK-клеток при беременности. Акушерство и гинекология. 2011; 5: 4-9. 50. Михалевич С.И., Гришкевич А.Н., Марковская Т.В., Гракович Л.Г. Привычное невынашивание беременности: социальная медицинские решения. Медицинские новости - 2012; 2: 12-18. проблема, 147 51. Могеладзе Н.О., Щуров В.А. Влияние изменения качества жизни населения на показатели невынашивания беременности и развития плода. Современные наукоемкие технологии 2009; 9: 110-112. 52. Можейко Л.Ф., Терешко Е.В., Дворник Е.В. Роль прегравидарной подготовки в улучшении исходов беременности и родов у женщин с разными уровнями и типами циркулирующих антифосфолипидных антител. Репродуктивное здоровье в Беларуси 2009; 6: 23-26. 53. Нагорная В.Ф. Эндогенный прогестерон и прогестины в обеспечении физиологической беременности, в профилактике и лечении ее осложнений. Репродуктивная эндокринология 2013; 5(13): 30-44. 54. Назаренко Т.А., Дуринян Э.Р., Ревишвили Н.А., Мишиева Н.Г. Современные подходы к применению прогестинов у женщин репродуктивого возраста. Вестник репродкутивного здоровья 2010; 3-4: 6-8. 55. Новиков А.И., Рудакова Е.Б., Тирская Ю.И. Влияние герпесвирусной инфекции у женщин с привычным невынашиванием беременности на показатели эндотелиально-тромбоцитарного звена гемостаза. Уральский медицинский журнал 2008; 2: 64-67. 56. Пинегин Б.В., Дамбаева С.В. NK-клетки: свойства и функции. Иммунология 2007; 2(28): 105-113. 57. Плахова К.И., Рахматулина М.Р., Фриго Н.В., Галимов А.Р., Волков И.А., Васильева Е.Л. Иммунные и генетические факторы нарушения репродуктивной функции, ассоциированные с урогенитальной хламидийной инфекцией у человека. Вестн дерматол венерол 2010; 6: 39–45. 58. Подзолкова Н.М., Скворцова М.Ю., Шевелева Т.В. Невынашивание беременности. М.: «Гэотар-Медиа» 2012; 128. 148 59. Потапова С.В., Коновалов гинекологической патологии О.Е. на Влияние соматической невынашивание и беременности. Российский медико-биологический вестник им. академика И.П. Павлова 2007; 3:98-103. 60. Радзинский В.Е., Запертова Е.Ю. Прогестеронобусловленные изменения провоспалительных цитокинов при привычном невынашивании беременности. Журнал акушерства и женских болезней 2004; 4: 59-61. 61. Сафронов И.Д., Кулешов В.М., Горбенко О.М., Шваюк А.П., Трунов А.Н. Влияние прогестагенов и токоферола на содержание цитокинов в крови при невынашивании беременности ранних сроков. Бюллетень Сибирского отделения Российской академии медицинских наук 2010; 5(30): 76-80. 62. Серов В.Н., Сидельникова В.М., Жаров Е.В. Привычное невынашивание беременности: современные представления о патогенезе, диагностике и лечении. Журнал Российского общества акушеров-гинекологов 2008; 3: 28-41. 63. Сидельникова В. М. Невынашивание беременности — современный взгляд. Доктор.Ру 2009; 6(50): 42-46. 64. Сидельникова В.М. Невынашивание беременности – современный взгляд на проблему. Российский вестник акушера-гинеколога 2007; 2: 62-64. 65. Сидельникова В.М. Применение дидрогестерона у пациенток с неполноценной лютеиновой фазой до и во время беременности. Гинекология 2009; 1(11): 68-71. 66. Сидельникова В.М., Сухих Г.Т. Невынашивание беременности. Руководство для практикующих врачей. М.: ООО «Медицинское информационное агентство» 2010; 536. 149 67. Смирнов А.Н. Молекулярная биология прогестерона. Российский химический журнал 2005; 1: 64-74. 68. Тапильская Н.И. Роль иммунной системы в патогенезе невынашивания беременности. Предпосылки для фармакологической коррекции. Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии 2002; 2: 19-26. 69. Терентьев А.А., Молдогазиева Н.Т., Казимирский А.Н., Татаринов Ю.С. Новые подходы в изучении структуры и функции альфа-фетопротеина. Успехи современного естествознания 2006; 3: 61-62. 70. Терентьев А.А., Порядин Г.В., Салмаси Ж.М., Александрова И.А., Тагирова А.К., Молдогазиева Н.Т., Казимирский А.Н. Пептид альфафетопротеина человека (АФП14-20) вызывает апоптоз CD95+ лимфоцитов. Успехи современного естествознания 2006; 3: 62-63. 71. Тетелютина Ф.К., Бушмелева Н.Н., Уракова Н.А., Давтян К.А., Михайлова Л.М., Бадриева Ю.Н. Современные подходы к лекарственной терапии при невынашивании беременности. Медицинский альманах 2010; 4(13): 88-92. 72. Токмаков А.А., Фуками Я. Внегеномные механизмы действия прогестерона. Цитология 2009; 5(51): 403-416. 73. Филонова Л.В. Некоторые аспекты патогенеза нарушений становления репродуктивной функции девочек-подростков (обзор литературы). Уральский медицинский журнал 2009; 3: 5-12. 74. Фоминых Е.А., Хасанов А.А. Оценка значимости кампилобактерной инфекции и способы ее диагностики у женщин с привычным невынашиванием беременности. Общественное здоровье и здравоохранение 2007; 3: 33-36. 75. Ходаревская Т.Н., Губарева Л.И. Психонейроэндокринный статус женщин с риском невынашивания беременности. Психофармакология и биологическая наркология 2008; 1–2; 2: 2382. 150 76. Чайка В.К., Демина Т.Н., Алипова Н.Ф. Роль аутоиммунного тиреоидита в генезе невынашивания беременности. Неонатология, хирургия и перинатальная медицина 2011; 2: 91-94. 77. Чистякова Г.Н., Газиева И.А., Ремизова И.И., Черданцева Г.А. Оценка продукции цитокинов при беременности, осложненной угрозой прерывания в первом триместре. Фундаментальные исследования 2005; 5: 96-98. 78. Чистякова Д.С. Гормональная недостаточность яичников и привычное невынашивание беременности. Журнал акушерства и женских болезней 2008; 2: 100-104. 79. Чурина Е.Г., Уразова О.И., Новицкий В.В., Наследникова И.О., Воронкова О.В. Роль γδТ- и NK-клеток в иммунном ответе. Бюллетень сибирской медицины 2010; 5: 138-143. 80. Шалина Р.И., Канзапетов М.Р. Антиоксиданты и их роль в акушерской практике. Гинекология 2013; 5: 84-87. 81. Шалина Р.И., Коновалова О.В., Нормантович Т.О., Лебедев Е.В. Прогнозирование гестоза в первом триместре беременности: миф или реальность? Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии 2010; 4: 82-87. 82. Шалина Р.И., Курцер М.А., Аминтаева Н.Г., Панина О.Б., Лукашина М.В. Ведение беременности и родов у пациенток с миомой матки и рубцом на матке после миомэктомии. Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии 2004; 2: 20-25. 83. Шалина Р.И., Плеханова Е.Р. Комплексная терапия беременных с угрозой преждевременных родов. Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии 2007; 1: 33-40. 151 84. Шалина Р.И., Шаряпова О.Ш., Выхристюк Ю.В., Херсонская Е.Б., Негматова М.Х. Тяжелый гестоз. Ближайшие результаты развития детей. Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии 2007; 4: 43-48. 85. Ширшев С.В., Некрасова И.В., Орлова Е.Г. Регуляция фенотипического созревания NK и NKT клеток гормонами репродукции. Вестник Пермского университета. Серия: Биология. 2008; 9: 100-103. 86. Abdelazim I.A., Elezz A.A., Elsherbiny M. Relation between single serum progesterone assay and viability of the first trimester pregnancy. Springerplus 2012; 1(1): 80. 87. Acosta-Rodriguez E.V., Napolitani G., Lanzavecchia A., Sallusto F. Interleukins 1beta and 6 but not transforming growth factor-beta are essential for the differentiation of interleukin 17-producing human T helper cells. Nat Immunol 2007; 8(9): 942-949. 88. al-Sebai M.A., Kingsland C.R., Diver M., Hipkin L., McFadyen I.R. The role of a single progesterone measurement in the diagnosis of early pregnancy failure and the prognosis of fetal viability. Br J Obstet Gynaecol 1995; 102(5): 364-369. 89. Amir A.L., D'Orsogna L.J., Roelen D.L., van Loenen M.M., Hagedoorn R.S., de Boer R., van der Hoorn M.A., Kester M.G., Doxiadis I.I., Falkenburg J.H., Claas F.H., Heemskerk M.H. Allo-HLA reactivity of virus-specific memory T cells is common. Blood 2010; 115(15): 3146-3157. 90. Annunziato F., Cosmi L., Romagnani S. Human and murine Th17. Curr Opin HIV AIDS 2010; 5(2): 114-119. 91. Annunziato F., Cosmi L., Santarlasci V., Maggi L., Liotta F., Mazzinghi B., Parente E., Filì L., Ferri S., Frosali F., Giudici F., Romagnani P., Parronchi P., Tonelli F., Maggi E., Romagnani S. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. J Exp Med 2007; 204(8): 1849-1861. 152 92. Arruvito L., Sanz M., Banham A.H., Fainboim L. Expansion of CD4+CD25+and FOXP3+ regulatory T cells during the follicular phase of the menstrual cycle: implications for human reproduction. J Immunol 2007; 178(4): 2572-2578. 93. Arslan E., Colakoğlu M., Celik C., Gezginç K., Acar A., Capar M., Aköz M., Akyürek C. Serum TNF-alpha, IL-6, lupus anticoagulant and anticardiolipin antibody in women with and without a past history of recurrent miscarriage. Arch Gynecol Obstet 2004; 270(4): 227-229. 94. Bansal A.S. Joining the immunological dots in recurrent miscarriage. Am J Reprod Immunol 2010; 64(5): 307-315. 95. Beaman K.D., Ntrivalas E., Mallers T.M., Jaiswal M.K., Kwak-Kim J., Gilman-Sachs A. Immune etiology of recurrent pregnancy loss and its diagnosis. Am J Reprod Immunol 2012; 67(4): 319-325. 96. Berghmans N., Nuyts A., Uyttenhove C., Van Snick J., Opdenakker G., Heremans H. Interferon-γ orchestrates the number and function of Th17 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Interferon Cytokine Res 2011; 31(7): 575-587. 97. Black A., Bhaumik S., Kirkman R.L., Weaver C.T., Randolph D.A. Developmental regulation of Th17-cell capacity in human neonates. Eur J Immunol 2012; 42(2): 311-319. 98. Blaschitz A., Hutter H., Dohr G. HLA Class I protein expression in the human placenta. Early Pregnancy 2001; 5(1): 67-69. 99. Carlino C., Stabile H., Morrone S., Bulla R., Soriani A., Agostinis C., Bossi F., Mocci C., Sarazani F., Tedesco F., Santoni A., Gismondi A. Recruitment of circulating NK cells through decidual tissues: a possible mechanism controlling NK cell accumulation in the uterus during early pregnancy. Blood 2008; 111(6): 3108-3115. 153 100. Chandra N., Thurman A.R., Anderson S., Cunningham T.D., Yousefieh N., Mauck C., Doncel G.F. Depot medroxyprogesterone acetate increases immune cell numbers and activation markers in human vaginal mucosal tissues. AIDS Res Hum Retroviruses 2013; 29(3): 592-601. 101. Chen Z., Tato C.M., Muul L., Laurence A., O'Shea J.J. Distinct regulation of interleukin-17 in human T helper lymphocytes. Arthritis Rheum 2007; 56(9): 2936-2946. 102. Clementini E., Palka C., Iezzi I., Stuppia L., Guanciali-Franchi P., Tiboni G.M. Prevalence of chromosomal abnormalities in 2078 infertile couples referred for assisted reproductive techniques. Hum Reprod 2005; 20(2): 437442. 103. Clendenen T.V., Arslan A.A., Lokshin A.E., Idahl A., Hallmans G., Koenig K.L., Marrangoni A.M., Nolen B.M., Ohlson N., Zeleniuch-Jacquotte A., Lundin E. Temporal reliability of cytokines and growth factors in EDTA plasma. BMC Res Notes 2010; 3: 302. 104. Cocksedge K.A., Li T.C., Saravelos S.H., Metwally M. A reappraisal of the role of polycystic ovary syndrome in recurrent miscarriage. Reprod Biomed Online 2008; 17(1): 151-60. 105. Cole L.A. hCG, the wonder of today’s science. Reprod Biol Endocrinol 2012; 10: 24. 106. Cosmi L., De Palma R., Santarlasci V., Maggi L., Capone M., Frosali F., Rodolico G., Querci V., Abbate G., Angeli R., Berrino L., Fambrini M., Caproni M., Tonelli F., Lazzeri E., Parronchi P., Liotta F., Maggi E., Romagnani S., Annunziato F. Human interleukin 17-producing cells originate from a CD161+CD4+ T cell precursor. J Exp Med 2008; 205(8): 1903-1916. 107. Cosmi L., Maggi L., Santarlasci V., Capone M., Cardilicchia E., Frosali F., Querci V., Angeli R., Matucci A., Fambrini M., Liotta F., Parronchi P., Maggi E., Romagnani S., Annunziato F. Identification of a novel subset of human 154 circulating memory CD4(+) T cells that produce both IL-17A and IL-4. J Allergy Clin Immunol 2010; 125(1): 222-230. 108. Cox M.A., Kahan S.M., Zajac A.J. Anti-viral CD8 T cells and the cytokines that they love. Virology 2013; 435(1): 157-169. 109. Darmochwal-Kolarz D., Kludka-Sternik M., Tabarkiewicz J., Kolarz B., Rolinski J., Leszczynska-Gorzelak B., Oleszczuk J. The predominance of Th17 lymphocytes and decreased number and function of Treg cells in preeclampsia. J Reprod Immunol 2012; 93(2): 75-81. 110. Daya S. Efficacy of progesterone support for pregnancy in women with recurrent miscarriage. A meta-analysis of controlled trials. Br J Obstet Gynaecol 1989; 96(3): 275-280. 111. Del Prete G.F., De Carli M., Ricci M., Romagnani S. Helper activity for immunoglobulin synthesis of T helper type 1 (Th1) and Th2 human T cell clones: the help of Th1 clones is limited by their cytolytic capacity. J Exp Med 1991; 174(4): 809-813. 112. D'Orsogna L.J., Roelen D.L., Doxiadis I.I., Claas F.H. TCR cross-reactivity and allorecognition: new insights into the immunogenetics of allorecognition. Immunogenetics 2012; 64(2): 77-85. 113. Ebert S., Podlech J., Gillert-Marien D., Gergely K.M., Büttner J.K., Fink A., Freitag K., Thomas D., Reddehase M.J., Holtappels R. Parameters determining the efficacy of adoptive CD8 T-cell therapy of cytomegalovirus infection. Med Microbiol Immunol 2012; 201(4): 527-539. 114. Finton K.A., Strong R.K. Structural insights into activation of antiviral NK cell responses. Immunol Rev 2012; 250(1): 239-257. 115. Fornara C., Lilleri D., Revello M.G., Furione M., Zavattoni M., Lenta E., Gerna G. Kinetics of effector functions and phenotype of virus-specific and γδ T lymphocytes in primary human cytomegalovirus infection during pregnancy. J Clin Immunol 2011; 31(6): 1054-1064. 155 116. Goldstein P., Berrier J., Rosen S., Sacks H.S., Chalmers T.C. A meta-analysis of randomized control trials of progestational agents in pregnancy. Br J Obstet Gynaecol 1989; 96(3): 265-274. 117. Goulmy E. Human minor histocompatibility antigens. Curr Opin Immunol 1996; 8(1): 75-81. 118. Guerra-Shinohara E.M., Bertinato J.F., Tosin Bueno C., Cordeiro da Silva K., Burlacchini de Carvalho M.H., Pulcineli Vieira Francisco R., Zugaib M., Cerda A., Morelli V.M. Polymorphisms in antithrombin and in tissue factor pathway inhibitor genes are associated with recurrent pregnancy loss. Thromb Haemost 2012; 108(4): 693-700. 119. Gutaj P., Zawiejska A., Wender-Ożegowska E., Brązert J. Maternal factors predictive of first-trimester pregnancy loss in women with pregestational diabetes. Pol Arch Med Wewn 2013; 123(1-2): 21-28. 120. Haas D.M., Ramsey P.S. Progestogen for preventing miscarriage. Cochrane Database Syst Rev 2008; (2): CD003511. 121. Hanna S., Etzioni A. New host defense mechanisms against Candida species clarify the basis of clinical phenotypes. J Allergy Clin Immunol 2011; 127(6): 1433-1437. 122. Harrington L.E., Hatton R.D., Mangan P.R., Turner H., Murphy T.L., Murphy K.M., Weaver C.T. Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages. Nat Immunol 2005; 6(11): 1123-1132. 123. Hee L., Kirkegaard I., Vogel I., Thorsen P., Skogstrand K., Hougaard D.M., Uldbjerg N., Sandager P. Low serum interleukin-17 is associated with preterm delivery. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica 2011; 90: 92–96. 156 124. Hill J.A., Polgar K., Anderson D.J. T-helper 1-type immunity to trophoblast in women with recurrent spontaneous abortion. JAMA 1995; 273(24): 19331936. 125. Hirota K., Duarte J.H., Veldhoen M., Hornsby E., Li Y., Cua D.J., Ahlfors H., Wilhelm C., Tolaini M., Menzel U., Garefalaki A., Potocnik A.J., Stockinger B. Fate mapping of IL-17-producing T cells in inflammatory responses. Nat Immunol 2011; 12(3): 255-263. 126. Holland O.J., Linscheid C., Hodes H.C., Nauser T.L., Gilliam M., Stone P., Chamley L.W., Petroff M.G. Minor histocompatibility antigens are expressed in syncytiotrophoblast and trophoblast debris: implications for maternal alloreactivity to the fetus. Am J Pathol 2012; 180(1): 256-266. 127. Hughes G.C., Clark E.A., Wong A.H. The intracellular progesterone receptor regulates CD4+ T cells and T cell-dependent antibody responses. J Leukoc Biol 2013; 93(3): 369-375. 128. Hunt J.S., Petroff M.G., McIntire R.H., Ober C. HLA-G and immune tolerance in pregnancy. FASEB J 2005; 19(7): 681-693. 129. Hussain M., El-Hakim S., Cahill D.J. Progesterone supplementation in women with otherwise unexplained recurrent miscarriages. J Hum Reprod Sci 2012; 5(3): 248-251. 130. Inngjerdingen M., Kveberg L., Naper C., Vaage J.T. Natural killer cell subsets in man and rodents. Tissue Antigens 2011; 78(2): 81-88. 131. Ito M., Nakashima A., Hidaka T., Okabe M., Bac N.D., Ina S., Yoneda S., Shiozaki A., Sumi S., Tsuneyama K., Nikaido T., Saito S. A role for IL-17 in induction of an inflammation at the fetomaternal interface in preterm labour. Journal of Reproductive Immunology 2010; 84: 75–85. 132. Jaslow C.R., Carney J.L., Kutteh W.H. Diagnostic factors identified in 1020 women with two versus three or more recurrent pregnancy losses. Fertil Steril 2010; 93(4): 1234-1243. 157 133. Jasper M.J., Tremellen K.P., Robertson S.A. Primary unexplained infertility is associated with reduced expression of the T-regulatory cell transcription factor Foxp3 in endometrial tissue. Mol Hum Reprod 2006; 12(5): 301-308. 134. Jenkins C., Roberts J., Wilson R., MacLean M.A., Shilito J., Walker J.J. Evidence of a T(H) 1 type response associated with recurrent miscarriage. Fertil Steril 2000; 73(6): 1206-1208. 135. Kane N., Kelly R., Saunders P.T., Critchley H.O. Proliferation of uterine natural killer cells is induced by human chorionic gonadotropin and mediated via the mannose receptor. Endocrinology 2009; 150(6): 2882-2888. 136. Karami N., Boroujerdnia M.G., Nikbakht R., Khodadadi A. Enhancement of peripheral blood CD56(dim) cell and NK cell cytotoxicity in women with recurrent spontaneous abortion or in vitro fertilization failure. J Reprod Immunol 2012; 95(1-2): 87-92. 137. Khader S.A., Gopal R. IL-17 in protective immunity to intracellular pathogens. Virulence 2010; 1(5): 423-427. 138. Kim J.S., Smith-Garvin J.E., Koretzky G.A., Jordan M.S. The requirements for natural Th17 cell development are distinct from those of conventional Th17cells. J Exp Med 2011; 208(11): 2201-2207. 139. Kim K.H., Choi B.K., Kim J.D., Kim Y.H., Lee S.K., Suh J.H., Lee S.C., Kang S.W., Kwon B.S. 4-1BB signaling breaks the tolerance of maternal CD8+ T cells that are reactive with alloantigens. PLoS One 2012; 7(9): e45481. 140. Kim M.R., Hong S.W., Choi E.B., Lee W.H., Kim Y.S., Jeon S.G., Jang M.H., Gho Y.S., Kim Y.K. Staphylococcus aureus-derived extracellular vesicles induce neutrophilic pulmonary inflammation via both Th1 and Th17 cell responses. Allergy 2012; 67(10): 1271-1281. 158 141. Kryczek I., Wei S., Gong W., Shu X., Szeliga W., Vatan L., Chen L., Wang G., Zou W. Cutting edge: IFN-gamma enables APC to promote memory Th17 and abate Th1 cell development. J Immunol 2008; 181(9): 5842-5846. 142. Kryczek I., Wu K., Zhao E., Wei S., Vatan L., Szeliga W., Huang E., Greenson J., Chang A., Roliński J., Radwan P., Fang J., Wang G., Zou W. IL17+ regulatory T cells in the microenvironments of chronic inflammation and cancer. J Immunol 2011; 186(7): 4388-4395. 143. Kurt-Jones E.A., Hamberg S., Ohara J., Paul W.E., Abbas A.K. Heterogeneity of helper/inducer T lymphocytes. I. Lymphokine production and lymphokine responsiveness. J Exp Med 1987; 166(6): 1774-1787. 144. Laird S.M., Mariee N., Wei L., Li T.C. Measurements of CD56+ cells in peripheral blood and endometrium by flow cytometry and immunohistochemical staining in situ. Hum Reprod 2011; 26(6): 1331-1337. 145. Langrish C.L., Chen Y., Blumenschein W.M., Mattson J., Basham B., Sedgwick J.D., McClanahan T., Kastelein R.A., Cua D.J. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J Exp Med 2005; 201(2): 233-240. 146. Lee J., Choi B.C., Cho C., Hill J.A., Baek K.H., Kim J.W. Trophoblast apoptosis is increased in women with evidence of TH1 immunity. Fertil Steril 2005; 83(4): 1047-1049. 147. Lee S.K., Kim J.Y., Hur S.E., Kim C.J., Na B.J., Lee M., Gilman-Sachs A., Kwak-Kim J. An imbalance in interleukin-17-producing T and Foxp3+ regulatory T cells in women with idiopathic recurrent pregnancy loss. Hum Reprod 2011; 26(11): 2964-2971. 148. Lepoutre T., Debiève F., Gruson D., Daumerie C. Reduction of miscarriages through universal screening and treatment of thyroid autoimmune diseases. Gynecol Obstet Invest 2012; 74(4): 265-273. 159 149. Lilleri D., Fornara C., Furione M., Zavattoni M., Revello M.G., Gerna G. Development of human cytomegalovirus-specific T cell immunity during primary infection of pregnant women and its correlation with virus transmission to the fetus. J Infect Dis 2007; 195(7): 1062-1070. 150. Linscheid C., Petroff M.G. Minor histocompatibility antigens and the maternal immune response to the fetus during pregnancy. Am J Reprod Immunol 2013; 69(4): 304-314. 151. Lissauer D., Goodyear O., Khanum R., Moss P.A., Kilby M.D. Profile of maternal CD4 T-cell effector function during normal pregnancy and in women with a history of recurrent miscarriage. Clin Sci (Lond) 2014; 126(5): 347-354. 152. Lissauer D., Piper K., Goodyear O., Kilby M.D., Moss P.A. Fetal-specific CD8+ cytotoxic T cell responses develop during normal human pregnancy and exhibit broad functional capacity. J Immunol 2012; 189(2): 1072-1080. 153. Liu F., Guo J., Tian T., Wang H., Dong F., Huang H., Dong M. Placental trophoblasts shifted Th1/Th2 balance toward Th2 and inhibited Th17 immunity at fetomaternal interface. APMIS 2011; 119(9): 597-604. 154. Liu Y.S., Wu L., Tong X.H., Wu L.M., He G.P., Zhou G.X., Luo L.H., Luan H.B. Study on the relationship between Th17 cells and unexplained recurrent spontaneous abortion. Am J Reprod Immunol 2011; 65(5): 503-511. 155. Lu W.P., Lu M.S., Li Z.H., Zhang C.X. Effects of multimicronutrient supplementation during pregnancy on postnatal growth of children under 5 years of age: a meta-analysis of randomized controlled trials. PLoS One 2014; 9(2): e88496. 156. MacNamara K.C., Oduro K., Martin O., Jones D.D., McLaughlin M., Choi K., Borjesson D.L., Winslow G.M. Infection-induced myelopoiesis during intracellular bacterial infection is critically dependent upon IFN-γ signaling. J Immunol 2011; 186(2): 1032-1043. 160 157. Maddur M.S., Miossec P., Kaveri S.V., Bayry J. Th17 cells: biology, pathogenesis of autoimmune and inflammatory diseases, and therapeutic strategies. Am J Pathol 2012; 181(1): 8-18. 158. Mai J., Wang H., Yang X.-F. T Helper 17 Cells Interplay with CD4+CD25highFoxp3+ Tregs in Regulation of Inflammations and Autoimmune Diseases. Front Biosci 2010; 15: 986–1006. 159. Makelarski J.A., Romitti P.A., Sun L., Burns T.L., Druschel C.M., Suarez L., Olshan A.F., Siega-Riz A.M., Olney R.S.; National Birth Defects Prevention Study. Periconceptional maternal alcohol consumption and neural tube defects. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol 2013; 97(3): 152-160. 160. Malan Borel I., Gentile T., Angelucci J., Pividori J., Guala M.C., Binaghi R.A., Margni R.A. IgG asymmetric molecules with antipaternal activity isolated from sera and placenta of pregnant human. J Reprod Immunol 1991; 20(2): 129-140. 161. Margni R.A., Paz C.B., Cordal M.E. Immunochemical behavior of sheep nonprecipitating antibodies isolated by immunoadsorption. Immunochemistry 1976; 13(3): 209-214. 162. Marsland B.J., Harris N.L., Camberis M., Kopf M., Hook S.M., Le Gros G. Bystander suppression of allergic airway inflammation by lung resident memory CD8+ T cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2004; 101(16): 6116-6121. 163. Martínez-García E.A., Chávez-Robles B., Sánchez-Hernández P.E., NúñezAtahualpa L., Martín-Máquez B.T., Muñoz-Gómez A., González-López L., Gámez-Nava J.I., Salazar-Páramo M., Dávalos-Rodríguez I., Petri M.H., Zúñiga-Tamayo D., Vargas-Ramírez R., Vázquez-Del Mercado M. IL-17 increased in the third trimester in healthy women with term labor. Am J Reprod Immunol 2011; 65(2): 99-103. 161 164. Marwaha A.K., Leung N.J., McMurchy A.N., Levings M.K. TH17 Cells in Autoimmunity and Immunodeficiency: Protective or Pathogenic? Front Immunol 2012; 3: 129. 165. Matsuyama M., Ishii Y., Yageta Y., Ohtsuka S., Ano S., Matsuno Y., Morishima Y., Yoh K., Takahashi S., Ogawa K., Hogaboam C.M., Hizawa N. Role of Th1/Th17 Balance Regulated by T-bet in a Mouse Model of Mycobacterium avium Complex Disease. J Immunol 2014; 192(4): 17071717. 166. Matthiesen L., Kalkunte S., Sharma S. Multiple pregnancy failures: an immunological paradigm. Am J Reprod Immunol 2012; 67(4): 334-340. 167. Mierla D., Szmal C., Neagos D., Cretu R., Stoian V., Jardan D. Association of Prothrombin (A20210G) and Factor V Leiden (A506G) with Recurrent Pregnancy Loss. Maedica (Buchar) 2012; 7(3): 222-226. 168. Miletić A., Krmpotić A., Jonjić S. The evolutionary arms race between NK cells and viruses: Who gets the short end of the stick? Eur J Immunol 2013; 43(4): 867-877. 169. Moffett-King A. Natural killer cells and pregnancy. Nat Rev Immunol 2002; 2(9): 656-663. 170. Mosmann T.R., Cherwinski H., Bond M.W., Giedlin M.A., Coffman R.L. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J Immunol 1986; 136(7): 23482357. 171. Murphy C.A., Langrish C.L., Chen Y., Blumenschein W., McClanahan T., Kastelein R.A., Sedgwick J.D., Cua D.J. Divergent pro- and antiinflammatory roles for IL-23 and IL-12 in joint autoimmune inflammation. J Exp Med 2003; 198(12): 1951-1957. 172. Muzzio D., Zenclussen A.C., Jensen F. The role of B cells in pregnancy: the good and the bad. Am J Reprod Immunol 2013; 69(4): 408-412. 162 173. Nakashima A., Ito M., Shima T., Bac N.D., Hidaka T., Saito S. Accumulation of IL-17-positive cells in decidua of inevitable abortion cases. Am J Reprod Immunol 2010; 64(1): 4-11. 174. Nakashima A., Ito M., Yoneda S., Shiozaki A., Hidaka T., Saito S. Circulating and decidual Th17 cell levels in healthy pregnancy. Am J Reprod Immunol 2010; 63(2): 104-109. 175. Nakashima A., Shima T., Inada K., Ito M, Saito S. The balance of the immune system between T cells and NK cells in miscarriage. Am J Reprod Immunol 2012; 67(4): 304-310. 176. Oates-Whitehead R.M., Haas D.M., Carrier J.A. Progestogen for preventing miscarriage. Cochrane Database Syst Rev 2003; (4): CD003511. 177. Oku K., Amengual O., Atsumi T. Pathophysiology of thrombosis and pregnancy morbidity in the antiphospholipid syndrome. Eur J Clin Invest 2012; 42(10): 1126-1135. 178. Opat S., Butler J., Malan E., Duncan E., Tran H.A. Factor XIII Assays. Methods Mol Biol 2013; 992: 171-180. 179. Ozlü T., Güngör A.C., Dönmez M.E., Duran B. Use of progestogens in pregnant and infertile patients. Arch Gynecol Obstet 2012; 286(2): 495-503. 180. Pastor S., Minguela A., Mi W., Ward E.S. Autoantigen immunization at different sites reveals a role for anti-inflammatory effects of IFN-gamma in regulating susceptibility to experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol 2009; 182(9): 5268-5275. 181. Pelletier M., Maggi L., Micheletti A., Lazzeri E., Tamassia N., Costantini C., Cosmi L., Lunardi C., Annunziato F., Romagnani S., Cassatella M.A. Evidence for a cross-talk between human neutrophils and Th17 cells. Blood 2010; 115(2): 335-343. 163 182. Piccinni M.P., Romagnani S. Regulation of fetal allograft survival by a hormone-controlled Th1- and Th2-type cytokines. Immunol Res 1996; 15(2): 141-150. 183. Pongcharoen S., Somran J., Sritippayawan S., Niumsup P., Chanchan P., Butkhamchot P., Tatiwat P., Kunngurn S., Searle R.F. Interleukin-17 expression in the human placenta. Placenta 2007; 28(1): 59-63. 184. Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine. Evaluation and treatment of recurrent pregnancy loss: a committee opinion. Fertil Steril 2012; 98(5): 1103-1111. 185. Rangachari M., Mauermann N., Marty R.R., Dirnhofer S., Kurrer M.O., Komnenovic V., Penninger J.M., Eriksson U. T-bet negatively regulates autoimmune myocarditis by suppressing local production of interleukin 17. J Exp Med 2006; 203(8): 2009-2019. 186. Roberts S., Goetz G., White S., Goetz F. Analysis of genes isolated from plated hemocytes of the Pacific oyster, Crassostreas gigas. Mar Biotechnol (NY) 2009; 11(1): 24-44. 187. Roberts S., Gueguen Y., de Lorgeril J., Goetz F. Rapid accumulation of an interleukin 17 homolog transcript in Crassostrea gigas hemocytes following bacterial exposure. Dev Comp Immunol 2008; 32(9): 1099-1104. 188. Robinson D.S., Hamid Q., Ying S., Tsicopoulos A., Barkans J., Bentley A.M., Corrigan C., Durham S.R., Kay A.B. Predominant TH2-like bronchoalveolar T-lymphocyte population in atopic asthma. N Engl J Med 1992; 326(5): 298304. 189. Rotteveel F.T., Kokkelink I., van Lier R.A., Kuenen B., Meager A., Miedema F., Lucas C.J. Clonal analysis of functionally distinct human CD4+ T cell subsets. J Exp Med 1988; 168(5): 1659-1673. 190. Saini V., Arora S., Yadav A., Bhattacharjee J. Cytokines in recurrent pregnancy loss. Clin Chim Acta 2011; 412(9-10): 702-708. 164 191. Saito S., Nakashima A., Shima T., Ito M. Th1/Th2/Th17 and Regulatory TCell Paradigm in Pregnancy. American Journal of Reproductive Immunology 2010; 63: 601–610. 192. Saito S., Umekage H., Sakamoto Y. Increased T-helper-1-type immunity and decreased T-helper-2-type immunity in patients with preeclampsia. Am J Reprod Immunol 1999; 41(5): 297-306. 193. Sakaguchi S., Sakaguchi N., Asano M., Itoh M., Toda M. Immunologic SelfTolerance Maintained by Activated T Cells Expressing IL-2 Receptor αChains (CD25). Breakdown of a Single Mechanism of Self-Tolerance Causes Various Autoimmune Diseases. J Immunol 1995; 155: 1151–1164. 194. Santarlasci V., Maggi L., Capone M., Frosali F., Querci V., De Palma R., Liotta F., Cosmi L., Maggi E., Romagnani S., Annunziato F. TGF-beta indirectly favors the development of human Th17 cells by inhibiting Th1 cells. Eur J Immunol 2009; 39(1): 207-215. 195. Santarlasci V., Maggi L., Capone M., Querci V., Beltrame L., Cavalieri D., D'Aiuto E., Cimaz R., Nebbioso A., Liotta F., De Palma R., Maggi E., Cosmi L., Romagnani S., Annunziato F. Rarity of human T helper 17 cells is due to retinoic acid orphan receptor-dependent mechanisms that limit their expansion. Immunity 2012; 36(2): 201-214. 196. Santner-Nanan B., Peek M.J., Khanam R., Richarts L., Zhu E., Fazekas de St Groth B., Nanan R. Systemic Increase in the Ratio between Foxp3+and IL17-Producing CD4+ T Cells in Healthy Pregnancy but Not in Preeclampsia. The Journal of Immunology 2009; 183: 7023–7030. 197. Sasaki Y., Darmochwal-Kolarz D., Suzuki D., Sakai M., Ito M., Shima T., Shiozaki A., Rolinski J., Saito S. Proportion of peripheral blood and decidual CD4(+) CD25(bright) regulatory T cells in pre-eclampsia. Clin Exp Immunol 2007; 149(1): 139-145. 165 198. Sasaki Y., Sakai M., Miyazaki S., Higuma S., Shiozaki A., Saito S. Decidual and peripheral blood CD4+CD25+ regulatory T cells in early pregnancy subjects and spontaneous abortion cases. Mol Hum Reprod 2004; 10(5): 347353. 199. Scaife P.J., Bulmer J.N., Robson S.C., Innes B.A., Searle R.F. Effector activity of decidual CD8+ T lymphocytes in early human pregnancy. Biol Reprod 2006; 75(4): 562-567. 200. Scherjon S., Lashley L., van der Hoorn M.L., Claas F. Fetus specific T cell modulation during fertilization, implantation and pregnancy. Placenta 2011; 32 Suppl 4: 291-297. 201. Somerset D.A., Zheng Y., Kilby M.D., Sansom D.M., Drayson M.T. Normal human pregnancy is associated with an elevation in the immune suppressive CD25+ CD4+ regulatory T-cell subset. Immunology 2004; 112(1): 38-43. 202. Sonderegger I., Röhn T.A., Kurrer M.O., Iezzi G., Zou Y., Kastelein R.A., Bachmann M.F., Kopf M. Neutralization of IL-17 by active vaccination inhibits IL-23-dependent autoimmune myocarditis. Eur J Immunol 2006; 36: 2849–2856. 203. Sun H., Sun C., Tian Z., Xiao W. NK cells in immunotolerant organs. Cell Mol Immunol 2013; 10(3): 202-212. 204. Terajima D., Yamada S., Uchino R., Ikawa S., Ikeda M., Shida K., Arai Y., Wang H.G., Satoh N., Satake M. Identification and sequence of seventy-nine new transcripts expressed in hemocytes of Cionaintestinalis, three of which may be involved in characteristic cell-cell communication. DNA Res 2003; 10(5): 203-212. 205. Thelemann C., Eren R.O., Coutaz M., Brasseit J., Bouzourene H., Rosa M., Duval A., Lavanchy C., Mack V., Mueller C., Reith W., Acha-Orbea H. Interferon-γ Induces Expression of MHC Class II on Intestinal Epithelial Cells and Protects Mice from Colitis. PLoS One 2014; 9(1): e86844. 166 206. Tilburgs T., Claas F.H., Scherjon S.A. Elsevier Trophoblast Research Award Lecture: Unique properties of decidual T cells and their role in immune regulation during human pregnancy. Placenta 2010; 31 Suppl: 82-86. 207. Tilburgs T., Schonkeren D., Eikmans M., Nagtzaam N.M., Datema G., Swings G.M., Prins F., van Lith J.M., van der Mast B.J., Roelen D.L., Scherjon S.A., Claas F.H. Human decidual tissue contains differentiated CD8+ effector-memory T cells with unique properties. J Immunol 2010; 185(7): 4470-4477. 208. Tilburgs T., Strominger J.L. CD8+ effector T cells at the fetal-maternal interface, balancing fetal tolerance and antiviral immunity. Am J Reprod Immunol 2013; 69(4): 395-407. 209. Toda A., Piccirillo C.A. Development and function of naturally occurring CD4+CD25+regulatory T cells. J Leukoc Biol 2006; 80: 458–470. 210. Veljkovic Vujaklija D., Dominovic M., Gulic T., Mahmutefendic H., Haller H., Saito S., Rukavina D. Granulysin expression and the interplay of granulysin and perforin at the maternal-fetal interface. J Reprod Immunol 2013; 97(2): 186-196. 211. Wang W.J., Hao C.F., Yi-Lin, Yin G.J., Bao S.H., Qiu L.H., Lin Q.D. Increased prevalence of T helper 17 (Th17) cells in peripheral blood and decidua in unexplained recurrent spontaneous abortion patients. J Reprod Immunol 2010; 84(2): 164-170. 212. Warning J.C., McCracken S.A., Morris J.M. A balancing act: mechanisms by which the fetus avoids rejection by the maternal immune system. Reproduction 2011; 141: 715–724. 213. Wegmann T.G., Lin H., Guilbert L., Mosmann T.R. Bidirectional cytokine interactions in the maternal-fetal relationship: is successful pregnancy a TH2 phenomenon? Immunol Today 1993; 14(7): 353-356. 167 214. Wierenga E.A., Snoek M., Jansen H.M., Bos J.D., van Lier R.A., Kapsenberg M.L. Human atopen-specific types 1 and 2 T helper cell clones. J Immunol 1991; 147(9): 2942-2949. 215. Wilson N.J., Boniface K., Chan J.R., McKenzie B.S., Blumenschein W.M., Mattson J.D., Basham B., Smith K., Chen T., Morel F., Lecron J.C., Kastelein R.A., Cua D.J., McClanahan T.K., Bowman E.P., de Waal Malefyt R. Development, cytokine profile and function of human interleukin 17producing helper T cells. Nat Immunol 2007; 8(9): 950-957. 216. Wood K.J., Sawitzki B. Interferon gamma: a crucial role in the function of induced regulatory T cells in vivo. Trends Immunol 2006; 27(4): 183-187. 217. Yang X.O., Chang S.H., Park H., Nurieva R., Shah B., Acero L., Wang Y.H., Schluns K.S., Broaddus R.R., Zhu Z., Dong C. Regulation of inflammatory responses by IL-17F. J Exp Med 2008; 205(5): 1063-1075. 218. Yao Z., Painter S.L., Fanslow W.C., Ulrich D., Macduff B.M., Spriggs M.K., Armitage R.J. Human IL-17: a novel cytokine derived from T cells. J Immunol 1995; 155(12): 5483-5486. 219. Yoo J.H., Kwak-Kim J., Han A.R., Ahn H., Cha S.H., Koong M.K., Kang I.S., Yang K.M. Peripheral blood NK cell cytotoxicities are negatively correlated with CD8(+) T cells in fertile women but not in women with a history of recurrent pregnancy loss. Am J Reprod Immunol 2012; 68(1): 3846. 220. Young S.L., Lessey B.A. Progesterone function in human endometrium: clinical perspectives. Semin Reprod Med 2010; 28(1): 5-16. 221. Zenclussen A.C., Gentile T., Kortebani G., Mazzolli A., Margni R. Asymmetric antibodies and pregnancy. Am J Reprod Immunol 2001; 45(5): 289-294. 168 222. Zenewicz L.A., Yancopoulos G.D., Valenzuela D.M., Murphy A.J., Stevens S., Flavell R.A. Innate and adaptive interleukin-22 protects mice from inflammatory bowel disease. Immunity 2008; 29(6): 947-957. 223. Zhang X., Angkasekwinai P., Dong C., Tang H. Structure and function of interleukin-17 family cytokines. Protein Cell 2011; 2(1): 26-40. 224. Zhou C.C., Zhang Y., Irani R.A., Zhang H., Mi T., Popek E.J., Hicks M.J., Ramin S.M., Kellems R.E., Xia Y. Angiotensin receptor agonistic autoantibodies induce pre-eclampsia in pregnant mice. Nat Med 2008; 14(8): 855-862. 225. Zhou L., Lopes J.E., Chong M.M., Ivanov I.I., Min R., Victora G.D., Shen Y., Du J., Rubtsov Y.P., Rudensky A.Y., Ziegler S.F., Littman D.R. TGF-betainduced Foxp3 inhibits T(H)17 cell differentiation by antagonizing RORgammat function. Nature 2008; 453(7192): 236-240.
