1. Диссертация Вершинская А.А.
advertisement
ФГБНУ «РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР им. Н.Н.БЛОХИНА» На правах рукописи ВЕРШИНСКАЯ АННА АРКАДЬЕВНА ЛЕЙКОЦИТАРНЫЕ ИНТЕГРИНЫ ПРИ СПОНТАННОМ ГЕПАТОКАНЦЕРОГЕНЕЗЕ ПОД ВЛИЯНИЕМ СУХОГО ЭКСТРАКТА ФИТОАДАПТОГЕНА 14.01.12 - онкология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: д.б.н., профессор Бочарова О.А. канд. фарм. наук Барышникова М.А. Москва - 2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Список сокращений ……………………………………………………......... 5 Введение ……………………………………………………………………… 6 Глава 1. Обзор литературы ………………………………………………… 13 1.1. Адгезионная концепция злокачественного роста …………………… 13 1.1.1. Молекулярные основы контактных взаимодействий ……………….. 14 1.1.2. Межклеточные контакты в процессе опухолевого роста …………… 18 1.1.3. Значение адгезии при злокачественном росте ……………………… 20 1.2. Цитокины и адгезия ……………………………………………………… 24 1.2.1. Участие цитокинов в контактных взаимодействиях между клетками……………………………………………………………….. 24 1.2.2. Роль цитокинов в опухолевом процессе ……………………………. 33 1.3. Фитоадаптогены в онкологии ………………………………………… 36 1.3.1. Фитоадаптогены — индукторы дифференцировки ……………….. 36 1.3.2. Воздействие фитоадаптогенов на разные системы организма ……. 37 1.3.3. Гормономодулирующие свойства фитоадаптогенов ……………..... 39 1.3.4. Фитоадаптогены - регуляторы межклеточных взаимодействий ……………………………………………………….. 45 Глава 2. Материалы и методы исследования …………………………... 51 2.1. Лабораторные животные ……………………………………………….. 51 2.2. Описание эксперимента на лабораторных животных ……………… 52 2.3. Материалы исследования ……………………………………………….. 53 2.4. Среды …………………………………………………………………….. 54 2.5. Реактивы ……………………………………………………………......... 54 2.6. Методы исследования …………………………………………………… 55 2.6.1. Анализ экспрессии лейкоцитарных интегринов методом непрямой иммунофлуоресценции ……………………………………. 55 2.6.2. Определение цитокинов в сыворотке крови экспериментальных животных иммуноферментным методом ……………………………. 56 2.6.3. Иммуногистохимический анализ CD8, CD11a, CD11b 3 антигенов на лимфоцитах, инфильтрирующих гепатокарциномы ……………………………………………………… 58 2.7. Определение концентрации тестостерона и кортикостерона в сыворотке крови экспериментальных животных …………………. 60 2.8. Статистический анализ результатов ………………………………… 60 Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение ………………………………………………. 61 3.1. Исследование экспрессии лейкоцитарных интегринов у мышей-самцов инбредной линии СВА при воздействии сухого экстракта фитоадаптогена в разных режимах применения .................................................................61 3.2. Оценка влияния сухого экстракта фитоадаптогена на сывороточный уровень интерлейкинов 6 и 10 у высокораковых мышей при спонтанном гепатоканцерогенезе ….…………………… 67 3.3. Определение воздействия сухого экстракта фитоадаптогена на частоту возникновения, количество и размеры гепатокарцином у высокораковых мышей ............................................ 74 3.4. Морфологическое исследование ткани печени высокораковых мышей в разных режимах применения сухого экстракта фитоадаптогена ……………………………………………… 82 3.5. Иммунофенотипирование опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов гепатокарцином у высокораковых мышей, получавших сухой экстракт фитоадаптогена ………………………… 89 3.6. Изучение воздействия сухой формы фитоадаптогена на продолжительность и качество жизни мышей с высокой частотой спонтанного опухолеобразования …………………………. 96 3.7. Воздействие сухого экстракта фитоадаптогена в разных режимах применения на концентрацию тестостерона и кортикостерона в сыворотке крови мышей высокораковой линии СВА ……………… 106 4 Заключение ………………………………………………………………… 112 Выводы …………………………………………………………………….. 122 Список литературы ………………………………………………………. 123 5 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АГ – антиген АТ - антитело ИЛ-6 - интерлейкин-6 ИЛ-10 - интерлейкин-10 ИФА – иммуноферментный анализ ИФН – интерферон ОИЛ — опухоль-инфильтрирующие лимфоциты СРБ - С-реактивный белок ТЭС - телячья эмбриональная сыворотка фм-40 – фитомикс-40 ФНО-α – фактор некроза опухоли альфа АР-1 - фактор транскрипции активатора протеина-1 ЭЦМ - экстрацеллюлярный матрикс ABC комплекс - Avidin and Byotinylated horseradish peroxidase macromolecular Complex bFGF – фактор роста фибробластов основной CBA - инбредная линия мышей, самцы которой генетически предрасположены к раку печени CD – кластер дифференцировки антигенов ICAM – межклеточные адгезионные молекулы LFA-1 - лимфоцитарный функциональный антиген -1 Mac -1 - макрофагальнай функциональный антиген-1 NK – натуральные киллеры NO – оксид азота NF-κB – ядерный фактор транскрипции - каппа В VLA- интегрины – интегины поздней активации VEGF – эндотелиальный фактор роста сосудов 6 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы Снижение дифференцировки, потерю контроля над пролиферативными процессами считают неотделимыми чертами опухолевых клеток. Эти признаки напрямую связаны с ослаблением взаимной адгезивности клеток в ткани-мишени, утратой их связи с окружающими тканями, с клетками иммунной системы и, в результате, с целым организмом. Вот почему нарушение адгезивных взаимодействий имеет первоочередное значение в патогенезе злокачественного роста, ускользании опухоли от иммунологического надзора, инвазии и метастазировании [Бочарова О.А., 2014; Lascombe I., Clairotte A. et al., 2006; Milrgineanu E, Cotrutz CE et al., 2008]. Нарушение адгезии обеспечивается дефицитом сначала тканеспецифических, а затем и гистонеспецифических (например, из семейства IСАМ сверхсемейства иммуноглобулинов) молекул адгезии. Недостаточность гистонеспецифических молекул адгезии мембраны опухолевых клеток, в свою очередь, индуцирует снижение экспрессии соответствующих контррецепторов из семейства лейкоцитарных интегринов (например, LFA-1, Mac-1), обеспечивающих прикрепление иммунных эффекторов (макрофагов, нейтрофилов, натуральных киллеров, цитотоксических лимфоцитов) к клеткам-мишеням [Бочарова О.А., Карпова Р.В. и др., 2012; Sumagin R., Prizant H. et al., 2010; Kadioglu A., De Filippo K.et al., 2011]. Это приводит к протектированию опухоли от иммунологического надзора. Очевидно, коррекция экспрессии лейкоцитарных интегринов может внести существенный вклад в реализацию противоопухолевого эффекта. Вместе с тем медиаторами взаимоотношений между иммунной системой организма и растущей опухолью являются цитокины. Многообразие биологических эффектов цитокинов, играющих существенную роль в пролиферации, дифференцировке, цитотоксичности иммунных клеток, межклеточных взаимодействиях, предполагает их участие в патологических 7 процессах, в том числе в росте и метастазировании злокачественных новообразований [Dunn G., Koebel K. et al., 2006; Kim D., Oh S., Kwon H. et al., 2009]. Таким образом, снижение активности иммунных эффекторов в отношении опухолевых клеток cвязано не только с ослаблением их адгезионных взаимодействий с клеточными мишенями, но и с обязательным цитокиновым сопровождением. Изучение возможности восстановления регуляции адгезионных механизмов с участием сигнальной реактивности цитокинов при опухолевом процессе неспецифическими препаратами с адгезиогенным действием является актуальным. Интерес в данном аспекте представляют фитоадаптогены, способные регулировать межклеточную адгезию, усиливая тем самым процессы дифференцировки тканей и иммунологическую реактивность организма [Бочарова О.А., 1999; 2009; Kim SW, Kwon H. et al., 2003; Guo L., Song L. et al., 2009]. Фитомикс-40 – комплексный фитоадаптоген, содержащий компоненты водно-спиртовых экстрактов сорока растений, в том числе адаптогенов. Состав ФМ-40 защищён патентом РФ стандартизован, сертифицирован экспериментальных и в [Бочарова О.А., 1998]. Препарат качестве клинических парафармацевтика. исследованиях В выявлены антиоксидантные, антимутагенные, иммуномодулирующие, в том числе адгезиогенные и интерфероногенные свойства, а также противоопухолевое действие фитомикса-40 [Бочарова О.А., Карпова Р.В. и др., 1999б; Бочарова О.А., Чекалина Т.Л. и др., 2003; Бочков Н.П., Бочарова О.А. и др., 2005; Бочаров Е.В., Кучеряну В.Г. и др., 2006; Бочарова О.А., Матвеев В.Б. и др., 2006; Бочарова О.А.,Барышников А.Ю., Давыдов М.И., 2008; ; Бочаров Е.В., Иванова-Смоленская И.А. и др., 2010; Бочаров Е.В., Карпова Р.В. и др., 2013; Карпова Р.В., Бочаров Е.В. и др., 2013; Куренная О.Н., Карпова Р.В. и др., 2013]. 8 В предыдущих исследованиях на модели спонтанного гепатоканцерогенеза у мышей высокораковой инбредной линии СВА было выявлено, что кратковременное в раннем онтогенезе (в течение первого месяца) и долговременное в зрелом онтогенезе (с 6-ти месяцев на фоне возникших гепатом до естественной гибели) воздействие комплексного фитоадаптогена в форме водно-спиртового экстракта приводит к усилению экспрессии лейкоцитарных интегринов на эффекторах иммунитета периферической крови, которое сопровождается признаками лимфоцитарной инфильтрации и деструкции опухолевых узлов, а также подавлением сывороточного уровня ИЛ-6 и ИЛ-10. Полученные результаты оказались существенными для снижения частоты спонтанного опухолеобразования на 30% (при обоих режимах введения препарата), увеличения средней продолжительности жизни при профилактическом и лечебном применении на 14,5% и 28,2% соответственно [Бочарова О.А., Барышников А.Ю. и др., 2013; Бочарова О.А., Барышников А.Ю. и др., 2014; Бочарова О.А., Бочаров Е.В. и др., 2014а)б)]. Однако проведенные исследования оставили невыявленным фенотип клеток, инфильтрирующих опухоль, а также вопрос о том, экспрессированы ли на этих клетках, в частности, молекулы лейкоцитарных интегринов при использовании комплексного фитоадаптогена. Также целесообразной является оценка роли гормонов, особенно стресс-гормона кортизола (кортикостерона у мышей) и мужского полового гормона тестостерона, при столь существенном увеличении продолжительности жизни высокораковых животных. Наряду с этим, применение, хранение и транспортировка препарата в жидкой форме вызывает определенные проблемы. С фармакологической точки зрения более современной и перспективной является сухая форма экстракта. Изучение влияния сухой формы, практически субстанции препарата фитоадаптогена, на модели спонтанного гепатоканцерогенеза у мышей позволит с более высокой степенью объективности оценить 9 результаты подавления опухолевого процесса и повышения продолжительности жизни животных. Таким образом, исследование эффективности сухого экстракта фитоадаптогена при воздействии на спонтанные гепатокарциномы высокораковых мышей является актуальным для сравнительного анализа данных, полученных с жидкой формой экстракта, а также повышения научно-практической значимости результатов реализации противоопухолевых реакций организма при воздействии комплексного фитоадаптогена. Цель исследования: изучение экспрессии молекул лейкоцитарных интегринов на клетках инфильтрирующих периферической опухоль, при крови воздействии и лейкоцитах, сухого экстракта комплексного фитоадаптогена у высокораковых мышей линии СВА, а также значимости её коррекции при спонтанном гепатоканцерогенезе. Задачи исследования: 1. Исследование экспрессии лейкоцитарных интегринов у мышейсамцов инбредной линии СВА с высокой частотой спонтанного опухолеобразования на клетках периферической крови при воздействии сухого экстракта фитоадаптогена в раннем и зрелом онтогенезе. 2. Оценка влияния сухого экстракта фитоадаптогена на сывороточный уровень ИЛ-6 и ИЛ-10 у высокораковых мышей. 3. Определение воздействия сухого экстракта на частоту возникновения, количество и размеры гепатокарцином у мышей-самцов линии СВА. 4. Морфологическое исследование ткани печени высокораковых мышей при разных режимах применения сухого экстракта фитоадаптогена. 5. Иммунофенотипирование опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов в ткани печени высокораковых фитоадаптогена в разных режимах. мышей, получавших сухой экстракт 10 6. Исследование воздействия сухого экстракта фитоадаптогена на концентрацию тестостерона и кортикостерона в сыворотке крови мышей высокораковой линии СВА. 7. Изучение воздействия сухой формы препарата на продолжительность и качество жизни мышей с высокой частотой спонтанного опухолеобразования. Научная новизна Впервые описано воздействие сухого экстракта фитоадаптогена на экспрессию лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1, сывороточный уровень цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-10 у мышей-самцов высокораковой линии СВА в онтогенезе. Впервые определено воздействие фитоадаптогена в форме сухого экстракта на содержание гормонов тестостерона и кортикостерона в сыворотке крови мышей высокораковой линии. Получены новые данные об инфильтрации спонтанных гепатокарцином высокораковых мышей цитотоксическими CD8+лимфоцитами, экспрессирующими CD11a и CD11b лейкоцитарные интегрины, при воздействии сухого экстракта фитоадаптогена. Впервые проведена оценка влияния комплексного фитоадаптогена в сухой форме на уровень спонтанного опухолеобразования, продолжительность и качество жизни животных. Научно-практическая значимость исследований Инфильтрация цитотоксическими CD8+лимфоцитами, экспрессирующими лейкоцитарные интегрины CD11a и CD11b, спонтанных гепатокарцином высокораковых мышей имеет существенное значение для подавления опухолевого процесса и увеличения продолжительности жизни животных. Коррекция сывороточного содержания стресс-гормона кортикостерона и тестостерона сухим экстрактом комплексного фитоадаптогена может учитываться при разработке профилактических мер, направленных на 11 повышение продолжительности жизни у членов "раковых" семей и людей с повышенным риском заболеваемости. Модель генетически обусловленного гепатоканцерогенеза мышей с учетом коррекции показателей лейкоцитарных интегринов и некоторых цитокинов периферической крови, сывороточного содержания гормонов кортикостерона и тестостерона, снижения уровня опухолеобразования, фенотипа опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов, а также увеличения выживаемости и улучшения соматического состояния экспериментальных животных может применяться для исследования препаратов- геропротекторов, перспективных для профилактики и комплексной терапии онкологических заболеваний. Выявление эффективности сухого экстракта фитоадаптогена на модели спонтанного гепатоканцерогенеза у мышей имеет практическое значение при его использовании в качестве субстанции для создания различных форм препарата, расширяя способы его применения. Эффект снижения частоты и размеров опухолей, выявленный при усилении экспрессии лейкоцитарных интегринов под воздействием как жидкого, так и сухого экстрактов фитоадаптогена в разных режимах введения на модели спонтанного гепатоканцерогенеза у мышей, имеет существенное значение для повышения объективной оценки результатов подавления опухолевого процесса и увеличения продолжительности жизни животных. Связь диссертационной работы с планом основных научных работ Исследования выполняли в рамках Программы фундаментальных научных исследований государственных академий наук 2013-2020 гг. теме: «Значимость коррекции иммунобиологических реакций сухим экстрактом комплексного фитоадаптогена для профилактики опухолей» (№ госрегистрации 114112440112; 2015-2019) Апробация работы состоялась 27 марта 2015 года в НИИ ЭДиТО ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» на совместной научной коференции с 12 участием лабораторий иммунофармакологии, экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, фармакологии и токсикологии, клеточного иммунитета, экспериментальной химиотерапии, медицинской биотехнологии. Основные положения диссертации доложены на XVII, XVIII, XIX международном конгрессе «Phytopharm» (Вена, 2013 г.; Санкт-Петербург, 2014 г.; Вена, 2015 г.); XXI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2014 г.); Всероссийской конференции с международным научно-практической участием "Отечественные противоопухолевые препараты" (Москва, 2014 г.; 2015 г.) Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ. 13 Глава 1 Обзор литературы 1.1. Адгезионная концепция злокачественного роста Онкологическая наука на нынешнем этапе обладает глубокими знаниями о различных нарушениях при опухолевом процессе (экспрессия онкогенов и цитокинов, факторы апоптоза, лекарственной резистентности, ангиогенеза, дефицит иммунной реактивности и др.). Однако обобщенной теории рака до сих пор не существует. Ни один из этих факторов нельзя считать специфическим, пусковым, ключевым, «выключением» которого можно предотвратить или остановить опухолевый процесс. Мы располагаем лишь неполными знаниями о том, каким образом опухолевая клетка координирует и связывает огромное число событий, умело используя «предательскую» помощь своего окружения в организме хозяина для его же уничтожения [Bogenrieder T., Herlyn M. , 2003; Patel L.,Parker B. Et al., 2013]. Нарушение дифференцировки клеток при потере контроля над пролиферативными процессами считают неотделимой чертой опухолевых клеток. При этом клетки опухоли утрачивают взаимодействие друг с другом, с эффекторами иммунитета и как результат со всем организмом [Lascombe I., Clairotte A. et al., 2006]. Канадский ученый Дейл Коман [Coman D.R., 1944] обнаружил, что клетки эпителиальных опухолей (рак губы, рак шейки матки) образуют практически на порядок менее прочные связи друг с другом, чем в гомологичных нормальных тканях. Отсюда следовало теоретическое предположение об отличии адгезивных свойств нормальных клеток и клеток опухоли и представление на этой основе механизма анаплазии, инвазии и метастазирования. На базе накопленных к настоящему времени исследований нарушение адгезивных взаимодействий предполагается в качестве ключевого механизма злокачественного роста [Бочарова О.А., 2002; Milrgineanu E, Cotrutz CE et al., 2008]. 14 Запуская каскад патологических реакций в самом начале злокачественного процесса, ослабление взаимной адгезивности клеток в ткани-мишени, приводит к более сложным поломкам адгезии. Потеря местного (тканевого) контроля пролиферации, анаплазия, инвазия, метастазирование и ускользание опухоли от иммунологического надзора считают основными свойствами опухоли, которые обеспечиваются нарушением именно адгезивных взаимодействий [Бочарова О.А., Карпова Р.В., 2006]. 1.1.1. Молекулярные основы контактных взаимодействий Механизмы распознавания и клеточная адгезия и являются основными условиями, необходимыми для развития многоклеточного организма. Адгезивнные молекулы в онтогенезе обеспечивают тканево- и органоспецифическую информацию, которая является гарантом целостности тела. Межклеточные взаимодействия регулируются молекулами адгезии, которые служат контактными молекулами при организации тканевых комплексов, объединяя цитоскелеты в единые гистосистемы. В основе морфогенетических движений в раннем эмбриогенезе лежит механизм клеточной адгезии, который является фундаментальным в органо- и гистогенезе. Молекулы клеточной адгезии разной специфичности появляются в результате избирательной экспрессии генов на разных стадиях развития. Они действуют как ограничители других первичных процессов развития, изменяя свойства клеточной поверхности, что и обеспечивает создание той формы, которую должен иметь данный организм [Edelman G., 1989; Weber G.F., Bjerke MA et al., 2011]. Moscona A. [1961] и Holtfreter O. [1955] положили начало исследованиям роли поверхностных молекул клетки и экстрацеллюлярного матрикса в адгезионных взаимодействиях. Впервые было показано, что клетки, дезинтегрированные из зародыша амфибии на ранней стадии развития, быстро реагрегировали в клеточные комплексы, состоящие из 15 однородных клеток. При дезинтеграции клеток из зачатков различных органов зародыша реагрегация происходила тканевоспецифически с последующим морфогенезом, чему предшествовал этап так называемого «сортинга». Наряду с этим, адгезионные взаимодействия являются необходимым звеном иммунных реакций. Относящиеся к числу важных эффекторных клеток иммунной системы разнообразные лимфоциты нуждаются в механизме адгезии для выполнения своих функций. Показано, что во многих типах клеток (эндотелиальных, эпителиальных, лимфоцитах, моноцитах/макрофагах) присутствуют молекулы межклеточной адгезии, являющиеся, с одной стороны, контактными молекулами интеграции клеток в тканевых системах и служащие также местом прикрепления для функционально гомологичных присутствующих на молекул лимфоцитах лейкоцитарных и интегринов, обеспечивающих адгезию иммунокомпетентных клеток и клеток-мишеней. Современная классификация молекул адгезии включает четыре группы этих молекул: суперсемейство иммуноглобулинов, интегрины, селектины и кадхерины. Сверхсемейство иммуноглобулинов объединяет такие молекулы межклеточной адгезии (Intercellular Adhesion Molecules), как ICAM-1, ICAM2, ICAM-3, VCAM, NCAM, MgCAM. К этому семейству также относятся и антигеннезависимые рецепторы CD2 (LFA-2) и LFA-3. Суперсемейство иммуноглобулинов имеет своей функцией связывание растворимых и поверхностных лигандов клеток. Молекулы иммуноглобулинов вместе с тем играют важную роль в процессах дифференцировки и активации клеток, во многом способствуют осуществлению межклеточных взаимодействий. Остановимся более подробно лишь на некоторых молекулах этой группы. 16 В норме ICAM-1 и близкая к ней ICAM-2 обнаруживаются на мышечных клетках, эндотелии, кератиноцитах и фибробластах [Diamond M.C., Staunton D.E.et al., 1990; de Fougerolles A.R., Stacker S.A. et al., 1991]. ICAM-1 выявлена на клетках легкого и печени, микроглии, в эпителии красной пульпы синусов селезенки, на дендритных клетках лимфоидных фолликул, на кортикальном и медуллярном эпителии миндалин и тимуса [Abbas A.K., Lichtman A.H. et al., 1994]. Указанные молекулы участвуют в том числе в поддержании клеточной (гомотипической) интеграции данных тканей. Контррецептором (лигандом) этих молекул являются LFA-1 (lymphocyte function-associated antigen-1) и Mас-1 (monocyte adhesion complex) - молекулы адгезии, которые относятся к семейству лейкоцитарных интегринов. Экспрессия ICAM-3, в отличие от ICAM-1 и ICAM-2, ограничена классом гемопоэтических клеток. Малые В- и Т-лимфоциты, все тимоциты экспрессируют ICAM-3. Последняя представляет собой Ig-подобную молекулу, гомологичную молекулам ICAM-1 и ICAM-2, и является третьим лигандом для LFA-1. Сверхсемейство интегринов – иная группа (помимо молекул адгезии сверхсемейства иммуноглобулинов) функционально аналогичных поверхностных белков, обеспечивающих кратковременные контакты между разными клетками (гетеротипическая адгезия), а также между клеткой и экстрацеллюлярным матриксом (ЭЦМ). Молекулы интегринов выявлены на поверхности различных клеток, в том числе и лейкоцитов, способствуют прикреплению клеток, их миграции, а также участвуют в передаче сигнала от матрикса или от клетки в клетку о делении и дифференцировке. Все белки, входящие в это крупное семейство, состоят из двух полипептидых цепей (альфа и бета), нековалентно связанных. Клеточную мембрану пронизывают обе цепи. Альфа цепь содержит 3 или 4 тандемных повтора, связывающих двухвалентные ионы Mg и Ca, которые важны для 17 реактивности. Альфа функциональный цепи при рецептор соединении [Vogel B.E., с бета Tarone G. цепью Et дают al., 1990]. Классифицированы интегрины в соответствии с бета цепями. В зависимости от типа β-субъединицы группа интегринов делится на 3 семейства: β-1 (VLA - very late activation antigens); β-2 (лейкоцитарные интегрины); β-3 (цитоадгезины). Они обеспечивают адгезию клеток к компонентам внеклеточного матрикса и другим клеткам [Hynes RO., 2009]. Лейкоцитарные интегрины играют ведущую роль в осуществлении важнейших функций лейкоцитов, прежде всего в миграции лейкоцитов из кровяносного русла в ткани. В зависимости от α-субъединицы различают следующие лейкоцитарные интегрины: LFA-1 (CD 11a/CD18), Mac-1(СD11b/CD18) и GP 150, 95 (CD11c/CD18). Более подробно остановимся на двух из них - LFA-1 и Mac-1. Молекула LFA-1 экспрессируется преимущественно на лимфоцитах (малых Т- и В-клетках) и почти на всех лейкоцитах, в меньшей степени на незрелых В-клетках, на кортикальных и медуллярных тимоцитах. Лигандами LFA-1 являются молекулы межклеточной адгезии ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3 [Хаитов Р.М. и др., 2011]. LFA-1 участвует в осуществлении киллинга клеток-мишеней опосредует NK-клетками взаимодействия и цитотоксическими лейкоцитов и лимфоцитами, эндотелия, агрегацию гранулоцитов и моноцитов [Roitt I., Brostoff J., 1996; Wong SY, Hynes RO., 2007]. Молекула Mac-1(СD11b/CD18) экспрессируется на моноцитах- макрофагах, лимфоцитах, нейтрофилах и NK-клетках. Лигандами Mac-1 являются ICAM-1, C3bi, фибриноген, фактор Х. Молекула CD11b/CD18 участвует во взаимодействии миелоидных клеток и эндотелия, связывает растворимые лиганды, обеспечивает адгезию нейтрофилов к эндотелию, проникновение их сквозь клетки высокого эндотелия кровеностных сосудов 18 в участки воспаления, гемопоэтическую агрегацию и хемотаксис лейкоцитов [Moretta A., Bottino C. et al, 2001, Wong SY, Hynes RO., 2007]. 1.1.2. Межклеточные контакты в процессе опухолевого роста Нарушение взаимной адгезивности клеток наследственно предрасположенной к новообразованию ткани может быть результатом потери или инактивации единственного аллеля (нулевой гомозиготности, или гемизиготности) гена гликопротеина - “контактина” (вероятно, из семейства кадхеринов), тканеспецифически регулирующего межклеточные взаимодействия, поддерживающего тканевую архитектуру, отвечающего за дифференцировку и клеточный гомеостаз нормальной ткани. В нормальном онтогенезе содержание “контактина” в соответствующей ткани является максимальным при становлении взрослой функции (высокой степени дифференцированности), убывая со временем при развитии процессов старения [Бочарова О. А., Модянова Е. А., 1982; Umerava K., Asakura S. Et al., 1994; Lascombe I., Clairotte A. Et al., 2006]. Нарушение адгезии обеспечивается дефицитом сначала тканевоспецифических, а затем и -неспецифических (например, из семейства IСАМ сверхсемейства иммуноглобулинов) факторов гомотипической (клетка-клетка одноименной ткани) адгезии [Kimura K., Endo Y. еt al., 2000; Kato Y., Hirano T. еt al., 2005; Margulis A., Zhang W. Et al., 2005; Lascombe I., Clairotte A. еt al., 2006; Milrgineanu E., Cotrutz C. et al., 2008]. Дефицит тканевоспецифических факторов адгезии ограничивает, возможно, один из центральных механизмов тканевой противоопухолевой защиты, нарушая регуляцию процессов деления и дифференцировки [Модянова Е. А., Бочарова О. А., Маленков А. Г., 1983; Thedieck C., Kuczyk M. Et al., 2005; Heidemann J., Maaser C. et al., 2006; Tsanou E., Peschos D. Et al., 2008]. Дефицит гистонеспецифических молекул гомотипической адгезии возникает намного позже. Он усугубляет ослабление контактных взаимодействий клеток опухоли [Лобанов С.Л., Клименков А.А. и др., 1990; 19 Umerava K., Asakura S., 1994; Shin H. C., Shiozawa T., 2004; Вlank C., Brown I. еt al., 2005; Mukoyama Y., Zhou S. еt al., 2005; Spizzo G., Went P., 2006]. Недостаточность гистонеспецифических молекул адгезии на мембране опухолевых клеток соответствующих индуцирует, лигандов из во-первых, семейства снижение экспрессии лейкоцитарных интегринов (например, LFA-1, Mac-1) на поверхности иммунных эффекторов [Enns A., Gassmann P. Et al., 2004; Maksan S. M., Araib P. et al., 2004], а во-вторых, усиление на мембранах опухолевых клеток экспрессии молекул адгезии к субстрату, например антигенов поздней активации VLA и цитоадгезинов из семейства интегринов [Yoneda T., 2002; Takatsuki H., Komatsu S. еt al., 2004; Heidemann J., Maaser C. еt al., 2006]. Первое приводит к недостаточности взаимодействий молекул из семейства ICAM с их лигандами, обеспечивающими прикрепление иммунных эффекторов к клеткам-мишеням, сводя к минимуму элиминацию клеток мишеней макрофагами, нейтрофилами, натуральными киллерами, цитотоксическими лимфоцитами, что вносит существенный вклад в экранирование опухоли от механизмов противоопухолевого надзора [Zhou J., Sargiannidou I., 2000; Shirai A., Furukawa M.et al., 2003; Kawaguchi T., 2005]. Второе способствует формированию собственной сосудистой сети опухоли (путем индукции экспрессии, например, молекул VСАМ-1), ее инвазии в окружающие ткани и гетеротипической адгезии, что индуцирует усиление пролиферации и еще большее подавление апоптоза, а также по линии обратной связи — дополнительное разобщение клеток опухоли [Genda T., Sakamoto M., 2000; Ivaska J., 2000; Zhou J., Sargiannidou I., 2000; Bouma-ter Steege J. C., Baeten C. Ir. еt al., 2004; Liu K., Caldwell S. A. еt al., 2005]. Так появляются метастазы, которые через новый виток адгезивных нарушений усугубляют ускользание опухоли от иммунологического надзора и контроля пролиферации, беспрепятственно "съедая" подлежащие и другие ткани, что, в конечном итоге, приводит к гибели организма. 20 Следовательно, нарушение адгезивных взаимодействий в ткани-мишени инициирует создание сначала местных, а потом и общих условий для развития новообразования. Иными словами, дефицит тканевоспецифического адгезивного фактора в самом начале процесса неоплазии, запуская каскад патологических реакций, приводит к более сложным нарушениям адгезии, которые в свою очередь являются критическими для "тоталитарного" поведения опухоли и "колонизации" ею других тканей и органов. Согласно данной гипотезе, нарушение адгезии играет роль ключевого механизма опухолевого процесса, поскольку обеспечивает основные свойства опухоли: потерю местного (тканевого) контроля пролиферации, анаплазию, инвазию, метастазирование и ускользание от иммунологического надзора [Бочарова О.А., Карпова Р.В., 2006]. 1.1.3. Значение адгезии при злокачественном росте В пользу данной гипотезы можно привести следующие доводы. Вопервых, сложно отыскать какой-либо иной фактор (функция апоптоза, рецепция факторов роста, экспрессия онкогенов и др.), нарушение которого объясняло бы все этапы развития опухоли. Во-вторых, опираясь на эту гипотезу, легко объяснить возникновение опухоли, как правило, в одном органе и разную агрессивность метастазирования (в связи с существованием индивидуального интегринового профиля) для опухолей разных локализаций [Gui G.P., Wells C.A., 1995; Ahmed N., Riley C. еt al., 2005]. В-третьих, экспрессию молекул VLA-интегринов некоторые авторы расценивают как наиболее существенный (по сравнению со всем комплексом используемых параметров — клинических, гистологических, биохимических и др.) маркер для прогноза опухолевого процесса [Takatsuki H., Komatsu S. еt al., 2004]. Вчетвертых, ослабление межклеточной адгезии в ткани является специфическим свойством именно опухолевого процесса (патологии с увеличением клеточной массы ткани). Патологии другого рода, с потерей клеточной массы органа (воспаления, деструктивные процессы), 21 характеризуются усилением межклеточной адгезии и соответственно повышением экспрессии, в частности, молекул IСАМ-1, IСАМ-2, LFA-1, LFA-3, Мас-1 в ответ на медиаторы воспаления (провоспалительные цитокины, гормоны, клеточный стресс, инфекции). Последнее влечет за собой увеличение хелперно-супрессорного (СD4+/СD8+) соотношения, активацию натуральных киллеров, макрофагов, нейтрофилов. Подавление повышенной экспрессии этих молекул с помощью моноклональных антител, а также глюкокортикоидов и кортикостероидов приводит к терапевтическому эффекту, снижая степень воспалительной реакции [Horvathova M., Ferencik M., 2000; Patella V, Incorvaia C., et al., 2011]. В редких случаях спонтанной регрессии злокачественной опухоли на мембранах ее клеток определена повышенная экспрессия, например, IСАМ-1 при множественной инфильтрации опухоли лейкоцитами, в том числе Т-лимфоцитами [Danese S., Semeraro S. еt al., 2005]. Справедливость данной концепции может быть также подтверждена эволюционной взаимосвязью молекул кадхеринов (тканевоспецифически опосредующих контактные взаимодействия клеток путем объединения их цитоскелетов в единые гистосистемы, что является фундаментом гисто- и органогенеза); СJM (cell junction molecules), участвующих в формировании сложных межклеточных контактов; IСАМ (гистонеспецифически участвующих в поддержании тканевой интеграции и служащих лигандами молекул лейкоцитарных интегринов); интегринов, обеспечивающих гетеротипическую адгезию к другим тканям; IgG; рецепторов факторов роста; белков главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I, которые необходимы для обеспечения реакций именно клеточного иммунитета. Иммуноглобулины и другие перечисленные выше молекулы кодируются генами вариабельных и константных участков, возникшими в ходе эволюции в результате дупликации исходного предшественника, который весьма похож на ген одной из молекул кадхеринов [Edelman G.M., 1986]. 22 Основные функции адаптивной иммунной системы, вероятно, возникли из более древней системы клеточной адгезии, функции которой заключались в регуляции движения клеток и пространственной организации тканей. Хотя лимфоциты не участвуют в формообразовании, их функции основываются на регулируемых контактных взаимодействиях между клетками. Эта регуляция в свою очередь зависит от специфических механизмов связывания, ведущих свое начало от древней системы клеточной адгезии [Edelman G.M., 1989]. Молекулы межклеточной адгезии, сыгравшие центральную роль в эволюционном переходе одноклеточных организмов к многоклеточным и в возникновении адаптивной иммунной системы позвоночных, имеют определяющее значение в поддержании высокой дифференцированности органов и тканей, а, следовательно, целостности и гомеостаза организма, т. е., вероятно, удерживают последний от обратного процесса — распада, к чему в конечном счете и стремится опухолевая патология. Концепция ключевой роли нарушения адгезии при опухолевом процессе имеет теоретическое и практическое значение. Во-первых, она не противоречит идее многофакторности и многоступенчатости процесса опухолеобразования; практически все известные и существенные для канцерогенеза звенья, механизмы и факторы можно выстроить в единую систему молекулярных сигналов, изначально зависимых от адгезивных нарушений и поэтапно приводящих к поломкам адгезии нового уровня, запускающих новый виток контактных патологий. Во-вторых, она снимает главные критические замечания в адрес теории иммунобиологического надзора Ф. Бернета, которая не объясняет несостоятельность иммунных реакций при опухолевых процессах. Например, у бестимусных мышей (nude) частота возникновения опухолей такая же, как и у обычных животных; в "забарьерных" органах (ЦНС, передняя камера глаза, семенники и др.) опухоли возникают не чаще, чем в других областях организма; во всех случаях иммунодефицита системы Т-лимфоцитов должны были бы возникать множественные поликлональные опухоли, однако 23 опухоли развиваются, как правило, в одной ткани, и они моноклональны; иногда малое число опухолевых клеток прививается у новых хозяев лучше, чем большее их число; при некоторых состояниях с продолжительной иммуносупрессией (лепра, саркоидоз, уремия) не наблюдается увеличения частоты развития опухолей и т. п. [Ломакин М. С. 1990]. Наконец, с позиций выдвигаемой гипотезы можно объяснить недостаточную эффективность клинической онкологии, которая использует, с одной стороны, методы "уничтожения" самой опухоли (хирургия, химиолучевая терапия), а с другой - иммуномодуляторы (интерфероны, интерлейкины) и вакцины (дендритные и др.) для усиления иммунологических механизмов в организме с опухолью. Даже при радикальном удалении опухолевого узла оставшаяся здоровая ткань продолжает быть дефектной по адгезионному фактору и является источником возникновения опухоли в будущем. В случае нерадикальной операции при микроинвазиях и микрометастазах опухолевые клетки, лишенные “посадочных площадок” для эффекторов иммунитета, интенсивно “цепляясь” за полноценные субстраты других органов и тканей, усиленно размножаются с прогрессирующим подавлением апоптоза и усугублением лекарственной устойчивости. Вполне понятно, почему химиопрепараты, цитокины и вакцины не в силах в полной мере преодолеть данную ситуацию. Несмотря на достижения в разработке способов лечения опухолевых заболеваний, его успехи, вероятно, лимитируются отсутствием эффективных средств, обладающих адгезиогенным действием. В этом направлении получены обнадеживающие результаты: экспериментальная реверсия клеток рака предстательной железы с помощью молекулы адгезии С-САМ [Lin S.H., Pu Y.S., 1999]. Кроме того, при использовании аденовирусного вектора, обеспечивающего трансдукцию ICAM-2 в клетки метастатического рака желудка, усиливалась адгезия и активность натуральных киллеров в отношении опухолевых клеток, результатом чего явилось подавление метастазирования [Tanaka H., Yashiro M., et al., 2004]. 24 Целесообразным представляется определение интегринового профиля для опухоли каждой локализации, что должно иметь значение для прогноза и диагностики (в том числе для выяснения источника метастазов при неизвестном первичном очаге опухоли). Поиск препаратов и воздействий, подавляющих адгезию к субстрату (например, с помощью антител или соответствуюших лигандов к определенным молекулам, путем нарушения экспрессии их рецепторов с использованием генных "нокаутов" или "антисмысловой" стратегии, а также с помощью неспецифических факторов), может иметь существенное значение для профилактики и лечения метастазов. Иными словами, различные молекулы на поверхности опухолевых клеток, обеспечивающие адгезию к экстрацеллюлярному матриксу, могут служить не только для понимания путей метастазирования, являясь факторами прогноза прогрессии опухолей, но также могут являться важными мишенями для воздействия лекарственных агентов [Oshita F., Kameda Y. Et al., 2004; Kato Y., Hirano T. Et al., 2005; Kawaguchi T., 2005; Park C.C., Zhang H. еt al., 2006]. Таким образом, выдвигаемая гипотеза создает перспективу для новых способов диагностики, профилактики и лечения опухолей. Следует отметить, что, согласно теоретическим основам обсуждаемой гипотезы, онкологическое заболевание можно расценивать как стремительное старение одного из органов. В связи с этим проблему рака можно отнести к загадкам развития и старения живого организма. Следовательно, ее решение требует бесконечных усилий. 1.2. Цитокины и адгезия 1.2.1. Участие цитокинов в контактных взаимодействиях между клетками Целесообразным при оценке значимости адгезионных взаимодействий весьма представляется учитывать цитокины. Последние являются тоже 25 факторами регуляции экспрессии различных клеточных рецепторов и лигандов, выполняющих в том числе контактные функции. Цитокины являются полипептидными медиаторами межклеточного взаимодействия, участвующих, в основной мере, в формировании и коррекции протекторных реакций организма при внедрении патогенов, при опухолевом процессе, нарушении целостности тканей, а также в регуляции некоторых нормальных физиологических функций. Цитокины осуществляют взаимосвязь между неспецифическими защитными реакциями и специфическим иммунитетом в рамках иммунной системы, действуя в обоих направлениях. Цитокины принимают участие в реакциях иммунитета, который наряду с нервной и эндокринной системами поддерживает гомеостаз. Все три системы при этом взаимосвязаны и взаимозависимы [Кетлинский С. А., Симбирцев А. С., 2008]. Исследование цитокинов началось в 40-е годы прошлого века. Тогда были описаны первые эффекты кахектина — сывороточного фактора, способного вызывать распад мышечных белков, что приводит к кахексии, или существенному снижению массы тела. В последствии этот медиатор был выделен и определен как фактор некроза опухоли (ФНО). Название медиатора происходило в результате изучения одного биологического эффекта. Так, в 50-е годы назвали интерферон (ИФН) из-за способности интерферировать, или повышать сопротивляемость при повторном инфицировании вирусом [Isaack A., 1957]. В 60–70-е годы был открыт Т-клеточный ростовой фактор [Morgan D., 1976], или IL-2, а также ряд факторов, стимулирующих рост и функциональную активность Т-, Влимфоцитов и других типов лейкоцитов. Тогда считали, что цитокины продуцируются клетками иммунной системы, являясь одновременно и ее регуляторами. Поэтому N. Cohen в 1974 году предложил использовать термин «цитокин» [Cohen S., 1974]. Сейчас имеются данные, что продуцентами цитокинов могут быть и эндотелиальные клетки, причем вырабатываемые ими цитокины также участвуют в регуляции 26 процессов гемопоэза, дифференцировки иммунокомпетентных клеток, хемотаксиса лейкоцитов, синтеза острофазных белков. В девяностые годы прошлого века выявлено субъединичное строение рецепторов цитокинов, и было сформировано понятие «цитокиновая сеть». В начале нашего века с помощью генетического анализа были открыты много новых цитокинов. Цитокинами считают интерфероны, хемокины, колониестимулирующие факторы (CSF), трансформирующие ростовые факторы, фактор некроза опухолей, интерлейкины с исторически сложившимися порядковыми номерами и некоторые другие эндогенные медиаторы. Цитокины могут быть разделены на провоспалительные, ростовые и дифференцировочные факторы лимфоцитов, а также отдельные регуляторные цитокины. Далее перечислены общие свойства цитокинов, благодаря которым они объединены в самостоятельную систему регуляции [Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., 2001; Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008]. Цитокины — гликозилированные полипептиды или белки (ММ от 5 до 50 кДа), состоящие из одной, двух, трех и более одинаковых или разных субъединиц. Цитокины являются антигеннеспецифичными, однако они влияют на функциональную активность клеток и принимают участие в реакциях врожденного и приобретенного иммунитета. Вместе с тем, они воздействуют на Т- и В-лимфоциты и стимулируют индуцированные антигенами процессы в иммунной системе. Для генов, ответственных за цитокины существует три варианта экспрессии: а) стадиоспецифическая экспрессия на определенных этапах эмбрионального развития, б) конститутивная экспрессия для регуляции физиологических функций в норме, в) индуцибельный тип экспрессии, характерный для большей части цитокинов. Цитокины вырабатываются на малый промежуток времени в ответ на стимуляцию. Один и тот же цитокин может синтезироваться в различных по гистогенезу типах клеток организма в разных органах. Цитокины с высокой аффинностью могут связываться между собой. 27 Некоторые из них используют общие субъединицы рецепторов. Рецепторы цитокинов могут существовать в растворимой форме, сохраняя способность связывать лиганды. Цитокины обладают плейотропностью биологического действия. Один и тот же цитокин может влиять на разные типы клеток, вызывая разнообразные эффекты. Разнообразие действия цитокинов обеспечивается экспрессией их рецепторов на разных по происхождению и функциях типов клеток и проведением сигнала с помощью различных внутриклеточных мессенджеров и транскрипционных факторов. Цитокинам присуща взаимозаменяемость биологического действия. Разные цитокины могут вызывать один и тот же биологический эффект либо обладать похожей активностью. Цитокины стимулируют или подавляют синтез самих себя, других цитокинов и их рецепторов. Активационный сигнал способствует синтезу клетками одновременно нескольких цитокинов, участвующих в формировании цитокиновой сети. Биологические эффекты зависят от содержания и концентрации в тканях других цитокинов синергичного, аддитивного или противоположного действия. Цитокины могут воздействовать на пролиферацию, дифференцировку и функциональную активность клеток-мишеней. Цитокины влияют на клетки аутокринно (на клетку, продуцирующую и секретирующую этот цитокин); паракринно (на клетки вблизи клетки-продуцента, например, в очаге воспаления или лимфоидном органе); эндокринно (дистантно, на клетки любых органов и тканей после попадания в циркуляцию). В последнем случае действие цитокинов напоминает действие гормонов. На современном этапе известно уже более 200 индивидуальных веществ, относящихся к семейству цитокинов. Основное внимание в данном обзоре уделено некоторым цитокинам, играющим важную роль как в развитии злокачественных новообразований, так и в активации иммунореактивности при опухолевой патологии. Интерлейкин-2 (ИЛ-2) является иммуномодулятором, который синтезируется активированными Т-лимфоцитами, вирусинфицированными 28 дендритными клетками [Сепиашвили Р.И., Балмасова И.П., 2005; Abbas A.K., Lichtman A.H., 1994]. Рецептор к ИЛ-2 (CD25, или ИЛ-2Rα) экспрессирован у Т-лимфоцитов, натуральных киллеров, моноцитов. Взаимодействие ИЛ-2 с ИЛ-2Rα самостоятельно не реализует сигнала трансдукции, но обладает костимулирующим эффектом по отношению к ИЛ-2Rβγ, способствуя их взаимодействию с ИЛ-2. В результате, происходит транскрипционная активация генов перфорина, ИФН-γ, ФНО-α, молекул адгезии, особенно LFA-1, в соответствующих клетках. В число эффектов ИЛ-2 таким образом входит стимуляция пролиферативной активности эффекторов иммунитета через митоген-активированную протеиназу, передающую сигнал в ядра клеток [Zhou J., Olsen S., 1997; Licato L.L., Grimm E.A., 1999; Strengell M., Maticainen S., 2003]. Интерлейкин-6 (ИЛ-6) - полифункциональный цитокин с молекулярной массой 20-30 кД. Продуцируется иммунокомпетентными клетками различных типов — Т-лимфоцитами (Th2), эозинофилами, макрофагами, эндотелиоцитами и эпителиоцитами, тучными клетками, фибробластами. Его основной мишенью служат В-лимфоциты. ИЛ-6 регулирует дифференцировку В-лимфоцитов и усиливает антителообразование, индуцирует цитотоксичность клеток, не зависимую от экспрессии антигенов MHC, в том числе их ответ на ИЛ-2 и ИФН-гамма. Наряду с выраженными провоспалительными действиями он модифицирует активность макрофагов в отношении опухолевых клеток. ИЛ-6 принимает участие в генерации LAK-клеток и препятствует апоптозу нейтрофилов, усиливая их цитотоксический потенциал в отношении опухолевых клеток. ИЛ-6 усиливает синтез С-реактивного белка (СРБ). Имея пентамерную структуру, СРБ (после связывания с фосфолипидами опухолевой клетки) активирует C1q субкомпонент системы комплемента, запуская процесс, аналогичный классическому пути активации комплемента. В результате происходит формирование мембраноатакующего комплекса и в некоторых случаях - лизис опухолевой клетки. Ингибирование роста опухоли ИЛ-6 29 может быть связано и с его способностью индуцировать секрецию антагониста рецептора ИЛ-1b. При этом следует упомянуть, что ИЛ-6 может способствовать регрессии опухоли только на ранних этапах роста и лишь слабоиммуногенных опухолей. В то же время ИЛ-6 не оказывает такого эффекта на развитие иммуногенных опухолей на поздних этапах их роста [Hurst S. Et al., 2001; Kaplanski G. et al., 2003]. Однако в большинстве случаев (при опухолях желудка, печени, поджелудочной железы, кишечника, почек, яичника, головы, шеи, гортани и др.) опухолевая прогрессия сопровождается повышением уровня ИЛ-1b, ИЛ6 и белков острой фазы [Krzystek-Korpacka M. et al., 2008; Kemik O. et al., 2011]. Кроме того, показано, что антитела к ИЛ-6 могут замедлять рост опухоли. Противоопухолевый эффект антител к ИЛ-6 сопровождается подавлением уровня СРБ, нормализацией тромбоцитопении и нейтропении, в частности, у пациентов миеломоноцитарным лейкозом. больных с высоким содержанием ИЛ-6 в Вместе с тем, у сыворотке крови противоопухолевый ответ на антитела к ИЛ-6 отсутствует [Jones S., 2005]. ИЛ-6 вместе с ИЛ-1b участвует в патогенезе анорексии, кахексии (способствуя распаду мышечных белков) и анемии онкологических больных. Блокирование гена Ил-6 или введение антител против Ил-6 приводит к подавлению снижению выраженности анорексии, кахексии и анемии [ Kovalovich K. Et al., 2001; Narimatsu M. еt al., 2001]. Кроме того, IL-6 стимулирует у таких больных синтез СРБ, что способствует прогрессированию атеросклероза [Eukaszewicz M. et al., 2007; Kim D. et al., 2009]. Интерлейкин-10 (ИЛ-10) – ключевой регулятор иммунного ответа. ИЛ-10 блокирует синтез ИФН-γ дендритными клетками. Ингибирует представление антигенов макрофагами и дендритными клетками. Подавляет продукцию провоспалительных цитокинов и реактивных интермедиатов кислорода и азота макрофагами-моноцитами. При действии на макрофагимоноциты ИЛ-10 и ИФН-γ являются антагонистами с противоположными 30 свойствами. Вместе с тем, ИЛ-10 служит физиологическим антагонистом ИЛ-12 [Sun F., et al., 2010]. ИЛ-10 ингибирует иммунную функцию и других типов клеток. Например, данный цитокин подавляет экспрессию молекулы адгезии ICAM-1 на эндотелиальных клетках, а также Т-зависимую активацию В-клеток [Moore K. еt al., 2001]. ИЛ-10 считают ингибитором клеточного иммунитета. Данный цитокин стимулирует активацию Th2- и подавляет развитие Th1-клеток снижая продукцию ИФН-γ Т- лимфоцитами. При этом подавляется уровень секреции ФНО и ИЛ-2 [Mocellin S., Panelli M.C., 2003; Peppa D., Micco L. et al., 2010]. В опытах на мышах, искусственно лишенных гена ИЛ-10 исследовали значение ИЛ-10 в механизмах иммунных реакций. У этих мышей констатировали нормальное развитие лимфоцитов и антителообразования. Однако у опытных животных наблюдали анемию, задержку роста, а главное, симптомы хронического энтероколита. В условиях свободного от патогенов содержания у животных развивалось воспаление в толстом кишечнике, что говорит в пользу на ключевой роли ИЛ-10 в контроле развития воспалительной реакции на кишечные антигены. При экспериментальном заражении опытных животных паразитами развивалась выраженная воспалительная реакция с повышением сывороточных уровней, ИФН-γ, ФНО-α и ИЛ-12, превышающих содержание этих цитокинов у контрольных мышей в 4-6 раз [Hacham M. et al., 2004]. Проведенные исследования указывают на защитную, иммунорегуляторную роль ИЛ-10, связанную с контролем гиперактивации реакций воспаления, например, в кишечнике. Интерлейкин-12 синтезируется в основном макрофагами и дендритными клетками (прнзентирующими антигены). Он также выделяется активированными В-лимфоцитами, нейтрофилами, моноцитами, а также кератиноцитами и эндотелиоцитами. Считаясь выраженным 31 провоспалительным цитокином, ИЛ-12 в то же время может способствовать синтезу других провоспалительных цитокинов, таких как, например, ИЛ-6 и ФНО-α. Одним из наиболее важных свойств ИЛ-12 является индукция дифференцировки незрелых Т-лимфоцитов (Th0) в Т-хелперы 1-го типа (Th1), что способствует синтезу последними ИФН-γ. ИЛ-12 взаимодействует со своими рецепторами на мембранах Th0-клеток и способствует активизации сигнального пути с участием факторов транскрипции T-bet и STAT4, которые считают ключевыми молекулами при дифференцировке Th1-клеток. Под воздействием ИЛ-12 увеличивается активность натуральных киллеров (их пролиферация, дифференцировка), цитотоксических Т- лимфоцитов, ускоряется созревание дендритных клеток и активизируется презентация ими дифференцировку антигенов. и Наряду цитотоксические с этим, свойства ИЛ-12 индуцирует антигенспецифических киллеров, усиливает иммунологическую память, способствует активации Влимфоцитов, является связующим звеном между врожденным приобретенным иммунитетом [Dummer W, Becker JC,1995; и Colombo M., Trinchieri G., 2002; Trinchieri G., 2003]. Выявлено, что линии экспериментальных животных, дефицитных по ИЛ-12, более чувствительны к химическим канцерогенам. После введения перевиваемых опухолевых клеток таким животным чаще развивается процесс метастазирования [Portielje J. еt al., 2003]. Следовательно, можно полагать, что ИЛ-12 участвует в усилении иммунореактивности при опухолевом процессе. Интерферон-гамма (ИФН-γ) впервые был обнаружен в среде культивирования активированных антигеном лейкоцитов. Этот фактор обладал антивирусной активностью. Однако чувствительностью к действию кислот он отличался от других интерферонов. В связи с этим, учитывая биохимические свойства фактора, в противовес кислотоустойчивым интерферонам I типа он получил название «кислотолабильный интерферон», или интерферон II типа, а затем ИФН-γ. Противовирусная активность 32 оказалась не основным свойством этой молекулы. ИФН-γ обладает выраженными свойствами иммунорегуляции, 200 генов. ИФН-γ синтезируют модулируя функции свыше макрофаги, естественные киллеры, иммунные Т-лимфоциты. В результате, ИФН-γ выполняет функции регулятора иммунных реакций, вследствие чего получил название «иммунный интерферон». [Ковальчук Л.В. и др., 2001; Хаитов Р.М. и др., 2005]. Интерфероны I типа синтезируются почти всеми клетками организма. В отличие от них ИФН-γ вырабатывается преимущественно активированными Т-лимфоцитами и NK-клетками. Среди Т-лимфоцитов синтез и секреция ИФН-γ осуществляются в основном CD4+ Тh0-клетками. ИФН-γ считается одним из существенных факторов, активирующих макрофаги. При этом у макрофагов повышается показатель завершенности фагоцитоза, а также усиливается продукция NO. В результате, увеличивается способность макрофагов элиминировать внутриклеточные патогены. Кроме того, ИФН-γ стимулирует макрофаги, индуцируя лизис опухолевых клеток. Наряду с этим, под влиянием ИФН-γ на макрофагах и дендритных клетках выявлено повышение экспрессии антигенов гистосовместимости II класса, что позволяет более эффективно представлять антигены Т-лимфоцитамхелперам. Таким образом запускается еще один механизм усиления клеточного звена иммунитета. ИФН-γ активирует синтез ИЛ-12 макрофагами, дендритными клетками и экспрессию лимфоцитами бета-цепи рецептора ИЛ-12, тем самым увеличивая стимуляцию Th0-клеток. ИФН-γ сдвигает баланс в сторону активации клеточного иммунитета, регулируя взаимодействие Т-хелперных клонов,. Фактор некроза опухолей (ФНО-α) занимает особое место среди цитокинов. Свое название он получил в связи со свойством индуцировать геморрагический некроз опухолей у экспериментальных животных [Old L., 1985]. Далее было выявлено, что ФНО – это целое семейство цитокинов, которые осуществляют свои функции через соответствующие клеточные 33 рецепторы. В состав этого семейства входит лимфотоксин, Fas-лиганд, мембранные молекулы СD-40 и CD-30, рецептор нейротрофина, ФНОсвязанный апоптоз-индуцирующий лиганд (TRAL) и др. [Caron J., 1999] Продуцентами мононуклеарные этих цитокинов фагоциты, считаются активированные эндотелиальные клетки, антигенстимулированные Т-клетки (CD4+ и CD8+), активированные NKклетки [Abbas A. Et al., 1994]. ФНО-α является одним из наиболее ярких провоспалительных цитокинов. Главными эффектами ФНО-α считают индукцию синтеза ИЛ-1, ИЛ-6 и самого ФНО, антителообразования В-клетками, колониеобразующих факторов эндотелиальными клетками и фибробластами, ко-стимуляцию Тклеточной активации и NK-клеток [Jewett A. Et al., 2000]. 1.2.2. Роль цитокинов в опухолевом процессе Исследования последних 40 лет показали, что цитокины являются медиаторами сложных взаимоотношений между прогрессирующей опухолью и иммунной системой организма. Выявлено, что цитокины участвуют в активации реакций иммунитета, нацеленных на элиминацию опухолевых клеток. Вместе с тем, цитокины, вырабатываемые клетками опухоли, могут способствовать прогрессии и метастазированию опухолевого процесса [Dunn G. еt al., 2006]. Размножение полноценной в опухоли, организме опухолевых способной к клеток и самообеспечению, образование индукции неоангиогенеза и инвазии в другие органы, зависит не только от самой изменившейся клетки, но и от состояния окружающих тканей. Показано, что хроническое воспаление в шейке матки, коже, слизистой желудка, толстом кишечнике, и в некоторых других органах служит предрасполагающим фактором для развития рака [Coussens L. 2001]. С точки зрения существования иммунологического надзора эти воспалительные процессы должны приводить к активации иммунологических реакций отторжения 34 возникающих опухолей. Однако, напротив, при этом происходит локальная продукция ряда цитокинов-медиаторов, обладающих пролиферативными, ангиогенными, хемотаксическими и другими свойствами. Члены семейств ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО считают основными среди провоспалительных цитокинов, продуцируемых в тканях при развитии хронических воспалительных процессов. Эти цитокины могут иметь значение в индукции роста опухолей в связи с тем, что способны активизировать практически все стороны развития воспалительной реакции. Для трансформированых клеток провоспалительные цитокины могут выступать в роли ростовых факторов. Напротив, опухоли в некоторых случаях не развиваются при их отсутствии или недостатке в организме. Выявлено, например, что дефицитные по гену ИЛ-6 мыши устойчивы к развитию индуцированных плазмоцитом [Lattanzio G., 1997], а по гену ФНО к развитию рака кожи [Moore R. tt al., 1999]. Рецепторы для ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО и ряда других цитокинов экспрессируются на многих типах опухолевых клеток. Транскрипционные факторы NFκB, STAT1, STAT3, чьи функции заключаются в экспрессии генов, запускающих пролиферацию, ингибирующих апоптоз и приводящих к синтезу ростовых факторов, являются сигнальными внутриклеточными молекулами для провоспалительных подавления опухолевого роста, цитокинов. вызванного Следовательно, для провоспалительными цитокинами, одним из возможных подходов является блокирование NFκB и отдельных STAT [Yoshimura A. 2006]. ФНО вместе с тем проявляет цитотоксический эффект, индуцируя образование свободных кислородных радикалов и апоптоз трансформированных клеток, что было выявлено на некоторых клеточных культурах в экспериментальных исследованиях. Наряду с этим, in vivo ФНО практически не демонстрирует элиминиции клеток опухоли из-за того, что фермент антиоксидантной защиты организма супероксиддисмутаза способен захватывать продуцируемые под действием ФНО кислородные радикалы. 35 Кроме того, ФНО может обладать ангиогенной активностью, в некоторых случаях стимулируя кровоснабжение опухоли, а также повышать уровень пролифераци опухолевых клеток, продукции ростовых факторов, стимулируя, по сути, злокачественный процесс [Balkwill F. 2002]. Выявлено также, что провоспалительные цитокины, например ИЛ-1, могут активировать метастазирование опухоли. В то же время рецептор ИL1RA блокирует этот эффект ИЛ-1 [Vidal-Vanaclocha F. еt al., 2000]. Вместе с тем показано, что в результате транскрипционной активации генов адгезионных молекул (особенно LFA-1), перфорина, ИФН-γ, ФНО-α в Т-лимфоцитах, моноцитах, натуральных киллерах, вызванной ИЛ-2, цитолитическая активность последних в отношении опухолевых клеток усиливается. Таким образом, можно полагать, что регуляторные сигналы адгезионных процессов (экспрессия взаимодействий и т.п.) молекул связаны адгезии, с установление механизмами контактных образования и функционирования цитокинов. Так, выявлено, что цитокины проявляют полный спектр биологической активности при межклеточном контакте в виде мембранной формы, ассоциируясь с мембранами синтезирующих их клеток. Вместе с тем рост содержания ИЛ-10 ингибирует реакции иммунитета, вызывая подавление экспрессии молекулы адгезии ICAM-1 эндотелиальными клетками [Moore K. еt al., 2001; Peppa D. еt al., 2010]. Более того, снижение экспрессии молекул адгезии и их лигандов (например, ICAM-1, -2, LFA-1, Mac-1) на клетках-мишенях и иммунных эффекторах участвует в подавлении воспалительной реакции под влиянием ИЛ-10. ИЛ12, в свою очередь, может усиливать иммунореактивность при подавлении экспрессии молекул адгезии к субстрату (VLA-интегринов), уменьшая вероятность метастазирования опухолевых клеток [Portielje J. еt al., 2003]. Накопление мононуклеаров в очаге воспаления и формирование их контактов с клетками мишенями для реализации противовоспалительного 36 эффекта (смерть патологических клеток по типу апоптоза, с помощью NO, Н2О2 и т.п.) обеспечивается усилением экспрессии молекул адгезии, связанным с подавлением продукции в том числе ИЛ-6, ИЛ-10 и активации – ИЛ-12, ИФН-γ, ФНО-α. Образование реактивных интермедиатов в том числе кислорода и азота мононуклеарами может происходить при ингибировании синтеза ИЛ-10. Fas-лиганд, входящий в состав семейства ФНО, провоцирует апоптоз клеток-мишеней. Однако, как правило, этого не происходит при опухолевом процессе. В тех же случаях, когда происходит регрессия опухоли при инфильтрации её лимфоцитами, наблюдают повышение экспрессии молекул адгезии. Действительно, при множественной миграции Т- лимфоцитов в опухоль, что наблюдают при редких случаях спонтанной регрессии злокачественной опухоли, на мембранах ее клеток определена повышенная экспрессия, в частности, молекул IСАМ-1 [Danese S., Semeraro S. еt al., 2005; Brady J. et al., 2010]. В результате, цитокины, по всей вероятности, участвуют в аранжировке адгезивных организмов взаимодействий было обусловлено, организма. в первую Развитие очередь, многоклеточных необходимостью образования контактных взаимодействий между клетками с помощью молекул адгезии, что эволюционно совпадало с формированием системы посредников – системы цитокиновой регуляции. Таким образом, исследование содержания некоторых цитокинов актуально для изучения механизмов реализации эффектов адгезивных взаимодействий при опухолевом процессе. 1.3. Фитоадаптогены в онкологии 1.3.1. Фитоадаптогены — индукторы дифференцировки Cтимулирующее и тонизирующее действие были первыми изученными эффектами фитоадаптогенов [Брехман И.И., 1968; Дардымов И.В., 1976]. В связи с этим фитоадаптогены в учебниках и справочниках, в основном, описываются как стимуляторы. Тем не менее, такое представление не совсем 37 верно. Точнее сказать, что фитоадаптогены можно отнести к регуляторам функций организма, которые, в одних случаях, стимулируют, в других ингибируют, словом, - приводят к норме реакции организма в экстремальных ситуациях, или в условиях соматического стресса. Выявлено, например, что под влиянием фитоадаптогенов происходит ускорение полового созревания молодых и пролонгация детородного периода времени у взрослых животных (как самок, так и самцов) [Яременко К.В., 1990]. Кроме того, было продемонстрировано, что фитоадаптогены увеличивают скорость дифференцировки клеток эмбриона морских ежей и амфибий, повышают степень дифференцировки, например, клеток меланомы В16 и гепатокарциномы у мышей, замедляя при этом рост опухоли [Ota T., Fujikawa-yamamoto K. et al., 1987; Zeng X.L., Tu Z.G., 2004]. Таким образом, препараты фитоадаптогенов можно считать индукторами дифференцировки (а не стимуляторами клеточного деления), которые поддерживают тканевые системы в высокодифференцированном состоянии гомеостаза, характерном для нормального онтогенеза в зрелом периоде. 1.3.2. Воздействие фитоадаптогенов на разные системы организма Фитоадаптогены позитивно воздействуют на нервную систему, способствуя сохранению функций нервных клеток и процессов высшей нервной деятельности [Rausch W., Liu S., 2006; Nah S.Y. et al., 2007; Chen Z., Lu T., 2010]. Фитоадаптогены хорошо влияют на работу сердца [Li J., Ichikawa T. еt al., 2010]. Уровень артериального давления в большинстве случаев также нормализуется под влиянием фитоадаптогенов при условии использования корректных дозировок. На первых этапах изучения исследователи придерживались мнения, что фитоадаптогены являются исключительно гипертензивными препаратами, в связи с тем, что якобы способствуют сужению сосудов. Позже было выявлено, что фитоадаптогены 38 тормозят проникновение кальция внутрь клеток гладкой мускулатуры, ослабляя сужение кровеносных сосудов и нормализуя таким образом артериальное давления [Guan Y.Y., Zhou J.G. et al., 2006; Nakaya Y., Mawatari K. еt al., 2007]. Фитоадаптогены успешно применяют на вредных производствах, поскольку они повышают резистентность организма к неблагоприятным условиям окружающей среды [Levenson D., 2001; Lee TK, O’Brien KF, 2010]. Таким образом, интерес, который проявляют онкологи к этим препаратам с учетом перечисленных свойств, представляется вовсе не удивительным. Под руководством ученых Дальнего Востока и Сибири в экспериментах на животных установлены противоопухолевые свойства родиолы розовой, женьшеня, элеутерококка и других фитоадаптогенов. Использование адаптогенов приводило к тому, что опухоли возникали позже по срокам, при этом скорости их роста и частота возникновения снижались [Бочарова О.А., Матвеев Б.П., 1995; Hasegawa H., Suzuki R., 2002]. Установлено замедление возникновения метастазов. Показано снижение токсичности и повышение эффекта химиолучевой терапии [Гольдберг Е.Д., Разина Т.Г. и др., 2008; Kucinskaite A., Briedis V., 2004; Qi F., Li A., 2010]. Изучение отдельных фитоадаптогенов в клинической онкологии при опухолях разных локализаций повторили результаты экспериментальных исследований. Установлено, что фитоадаптогены обладают комплексным характером действия на организм. Фитоадаптогены имеют иммуномодулирующее влияние на организм [Jin Y, Kotakadi VS, 2008]. Они являются выраженными антиоксидантами [Сhae S., Kang K. еt al., 2010; Li BH, Wang CZ, 2010]. С этими свойствами можно связать антимутагенную активность фитоадаптогенов, что является актуальным, в первую очередь, для первичной профилактики рака. Нейропротекторная активность является важным свойством фитоадаптогенов [Bao H., Zhang J., 2005]. Показано, что увеличение содержания катехоламинов (в частности дофамина, который подавляется при 39 старении) повышает продолжительность жизни и снижает частоту опухолеобразования. Фитоадаптогены, например элеутерококк и женьшень, предотвращают гибель дофаминергических нейронов [Rausch W., Liu S. et al., 2006; Chen ZY, Lu TT, 2010]. В результате картину значимости фитоадаптогенов для профилактической онкологии дополняет их нейропротекторная активность. 1.3.3. Гормономодулирующие свойства фитоадаптогенов Считают, что благодаря гормономодулирующим свойствами фитоадаптогены являются геропротекторами, что в том числе обусловливает перспективу их применения в онкологии. Эндокринная система - одна из важнейших регуляторных систем организма. Неоспоримо ее участие в организации сложных форм поведения, в процессах адаптации к повреждающим воздействиям, в регуляции репродуктивного и энергетического гомеостазов, иммунной реактивности, высшей нервной деятельности. Очевидно, что нарушения эндокринной регуляции, обусловленные в том числе возрастными изменениями, лежат в основе повреждения различных функций организма. Существенное "омоложение" заболеваний, обычно ассоциируемых со старением, в современном мире, характеризующемся расширением диапазона стрессорных воздействий на организм человека, указывает на важное значение эндокринных нарушений и в патогенезе преждевременного старения. Именно стресс является составной частью этиопатогенеза различных заболеваний, включая гипертензию, язвенные патологии пищеварительного тракта, диабет, иммуносупрессию, злокачественные новообразования [Griffin GD, Charron D. et al., 2014]. Вместе с тем и основные методы лечения онкологических больных (оперативное вмешательство, химио- и лучевая терапия) представляют собой стрессорные воздействия. 40 Как экстремальная реакция стресс характеризуется напряжением защитных систем организма [Kioukia-Fougia N., Antoniou K. et al., 2002]. У онкологических больных он нередко переходит в патологическую реакцию и имеет для организма чаще всего отрицательные последствия. Экспериментальные и клинические исследования свидетельствуют об усилении в частности процесса метастазирования после значительных стрессорных воздействий [Яременко К.В., Пашинский В.Г.. 2003]. Гиперкортицизм, глюкокортикоидов, обусловленный представляет собой усилением продукции обязательный компонент стрессорной реакции организма и является фактором, способствующим в том числе развитию новообразований и их распространению. Так, в исследованиях, проведенных на крысах с метастазирующими опухолями, доказана корреляционная зависимость между степенью гиперкортицизма, развивающегося после операционного вмешательства, и степенью последующей стимуляции процесса метастазирования [Яременко К.В., Пашинский В.Г., 2003]. Глюкокортикоиды усиливают процессы катаболизма в тканях, особенно в лимфоидных органах. При этом понижается функциональная активность ретикуло-эндотелиальной системы, повышается свертываемость крови. Все это способствует приживлению и развитию метастазов. Вместе с тем глюкокортикоиды оказывают гипергликемический эффект, способствуя образованию глюкозы из белков и жиров, и повышая тем самым содержание глюкозы в крови, гликогена в печени и мышцах. Все это создает благоприятные условия для питания опухолей. Повышенное выраженные содержание нарушения катаболическим гормоном, кортизола гомеостаза. в крови Кортизол разрушающим ткани. отражает весьма считают главным Ответной реакцией организма на стресс становится выброс кортизола из надпочечников, что заставляет усиленно работать сердечнососудистую систему и легкие, подавляя иммунную систему. При этом известно, что кортизол индуцирует гибель лимфоцитов по типу апоптоза. Вместе с тем повышенный уровень 41 кортизола способствует замедлению процессов пищеварения и снижению репродуктивной функции. Параллельно с этим высокий уровень гормона кортизола негативно сказывается на работе мозга. В первую очередь, он начинает разрушать нейроны, находящиеся в гиппокампе, приводя к торможению когнитивных функций. Также повышенный уровень гормона кортизола подавляет выработку так называемых гормонов радости серотонина и дофамина. Последнее приводит к депрессивному состоянию, может подтолкнуть человека к суициду. Основным анаболическим гормоном является тестостерон. Он крайне благоприятен не только для мужчин, но и для женщин. Анаболические гормоны – тестостерон, эстроген у женщин, прогестерон, гормон роста, мелатонин и ДЭА (дегидроэпиандростерон) – способствуют росту тканей и поддержанию молодости, поэтому их относят к гормонам юности. Однако их уровень начинает падать после репродуктивного возраста. И напротив, кортизол, инсулин и эстроген (у мужчин) относят к гормонам старения, уровень которых в крови с возрастом повышается. Иными словами, с возрастом баланс между гормонами сдвигается от анаболиков к катаболикам. Стероидные гормоны (включая кортизол) синтезируются из холестерола. Холестерол превращается в прегненолон, который затем может перейти либо в прогестерон, либо в ДЭА, «мать гормонов» тестостерона и эстрогена. Когда организм подвергается стрессу, хроническому или избыточному, производится больше кортизола за счет ДЭА, тестостерона и эстрогена. Нормальный процесс старения связан сo сдвигом к большему выделению кортизола и одновременным снижением образования других гормонов. Очевидно, воздействия, регулирующие гормональный баланс, прежде всего развитие стрессорной реакции (уровень кортизола), играют важную роль в сохранении гомеостаза организма. Существенным свойством в частности адаптогенов считают их антистрессорное действие. Этим можно объяснить их геропротекторное 42 влияние на организм, что издавна использовалось народами Востока, поскольку считают, что процесс старения характеризуется показателями хронического стресса пищеварительной, (гиперкортицизм, репродуктивной, иммунодепрессия, когнитивной функции, снижение а также подавление уроня эндогенных антидепрессантов) [Meydani M., 2002]. Так, введение препаратов фитоадаптогенов предварительно или на фоне стресса значительно уменьшает величину и длительность стадии тревоги общего адаптационного синдрома, подавляет катаболический синдром и усиливает восстановительные процессы на стадии резистентности [Яременко К.В., 1990]. На моделях как острого, так и хронического стресса выявлено, что адаптогены практически снимают его патологические проявления, а именно препятствуют гипертрофии надпочечников, инволюции тимуса и селезенки, а также развитию язв в желудочно-кишечном тракте [Bhattacharya S.K., Muruganandam A.V., 2003]. Вместе с тем адаптогены оказывают нормализующее влияние на биохимические параметры, а именно снижают уровень глюкозы и холестерина в крови. Иными словами, при стрессе адаптогены оптимизируют функции связанных между собой защитных систем (нейроэндокринной и иммунной), а также процессов обмена веществ. При этом возрастает устойчивость организма к фактору, вызвавшему стресс, и к дополнительным повреждениям. Коррекция адаптогенами содержания в крови стресс-гормона кортизола (кортикостерона у грызунов) может служить показателем антистрессорной активности данных препаратов [Attele A., Zhou Y. et al., 2002]. Показано, что в результате регулирования стрессорной реакции экстракт элеутерококка предотвращал взрыв метастазирования, нередко развивающийся после операции [Гольдберг Е.Д. и др., 2008]. Препараты родиолы розовой повышали уровень серотонина в мозге, снижая или исключая депрессивную симптоматику [Саратиков А.С., Краснов Е.А., 43 2004], ослабляли глюкокортикоидный остеопороз [Колодняк О.Л. и др., 2002]. Уровень гормона кортизола у пациентов с лейкоплакией слизистой оболочки полости рта (как предраковой патологии) до лечения превышал физиологическую норму, что отражает выраженные нарушения гомеостаза. Применение комплексного фитоадаптогена фитомикса-40 в жидкой форме способствовало нормализации уровня стрессового гормона. При этом наряду с улучшением иммунологических показателей отмечена положительная динамика клинической картины. Полное выздоровление наблюдалось в 17% случаев, у большинства больных (56%) наблюдалось клиническое улучшение (уменьшение размеров и плотности очага гиперкератоза, активация регенераторных процессов, полная эпителизация эрозивных поверхностей) [Бочарова О.А., Пожарицкая М.М. и др., 2004б), 2004в)]. У мужчин пожилого возраста (средний возраст 70 ± 1 год) с доброкачественной гиперплазией предстательной железы применение комплексного фитоадаптогена в виде монотерапии вызывало нормализацию гормональных показателей: снижение уровней кортизола, эстрадиола, лютеинизирующего гормонов, повышение тестостерона. Это коррелировало со снижением частоты мочеиспускания, повышением качества жизни, уменьшением размеров гиперплазированного узла и самой предстательной железы [Бочарова О.А., Матвеев В.Б. и др., 2006; Бочарова О.А., Карпова Р.В. и др., 2004]. У больных распространенным раком желудка на фоне стандартного лечения (операция, полихимиотерапия) с применением комплексного фитоадаптогена удалось добиться снижения концентрации кортизола до физиологической нормы в сыворотке крови. У пациентов, не принимавших препарат, концентрация гормона стресса на фоне лечения не снизилась, более того, отмечено ее нарастание. При этом продолжительность жизни у леченых пациентов повысилась в среднем в 2,5 раза [Чулкова С.В., Бочарова О.А. и др., 2006; Бочарова О.А., Давыдов М.И. и др., 2009]. 44 У пациентов с болезнью Паркинсона (как патологии старения) на фоне стандартной антипаркинсонической терапии уровень кортизола в крови превышал физиологическую норму, что отражает нарушение гомеостаза как в процессе старения, так и в связи с токсичностью левадопосодержащих препаратов антипаркинсонической терапии. Это коррелировало с выраженной иммунодепрессии в отношении Т- и В- лимфоцитов у пациентов с БП. Комплексный фитоадаптоген при включении в схему лечения приводил иммунодепрессивное к нормализации действие уровня кортизола, глюкокортикоидов и снижал приводил к нормализации иммунологических показателей. При этом существенно улучшалась двигательная активность и в целом качество жизни пациентов с БП [Бочаров Е.В., Иванова-Смоленская И.А. и др., 2010]. В эксперименте на модели спонтанного гепатоканцерогенеза профилактическое и лечебное воздействие комплексного фитоадаптогена в форме жидкого экстракта приводило к существенному повышению продолжительности жизни мышей (на 14,5 и 28 % соответственно), что сопровождалось увеличением экспрессии лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1, снижением сывороточного уровня интерлейкинов -6 и -10, уменьшением частоты возникновения гепатом, лучшим соматическим состоянием животных [Бочарова О.А., Бочаров Е.В. и др., 2014а)б)]. Поскольку развитие опухоли можно расценивать как хронический стресс, очевидно, что замедление опухолевого процесса и повышение выживаемости мышей может быть результатом гормономодулирующего и, в частности, стресспротекторного действия препарата. Поэтому перспективным представляется оценить профилактическое и лечебное воздействие препарата в форме сухого экстракта на уровни кортизола и тестостерона в сыворотке крови животных в динамике спонтанного опухолевого процесса, а также оценить корреляцию этих показателей с выживаемостью высокораковых мышей. 45 1.3.4. Фитоадаптогены - регуляторы межклеточных взаимодействий в онкологии Подавление роста опухолей с помощью фитоадаптогенов можно объяснить их свойством влиять на контактные взаимодействия между клетками, регулируя тем самым процессы дифференцировки тканей и иммунологическую реактивность организма. При действии на опухоль фитоадаптогены таким образом индуцируют редифференцировку (обратную трансформацию), что может приводить к деканцерогенезу. Воздействуя в таком направлении на клетки опухоли, фитоадаптогены могут тормозить опухолевый рост, уменьшая темпы их пролиферации [Бочарова О.А., Фигурин К.М., 1997; Guo L, Song L. еt al., 2009]. Повышение на опухолевых клетках экспрессии адгезивных лигандов для эффекторов иммунитета, обусловленное фитоадаптогенами, ослабляет "ускользание" опухоли от иммунологического надзора. Наряду с этим, фитоадаптогены, могут опосредовать антиметастатические и антиангиогенные эффекты, подавляя экспрессию ростовых факторов сосудов, в частности vascular endothelial growth factor (VEGF) и basic fibroblast growth factor (bFGF). Кроме того, выявлено, что фитоадаптогены усиливают цитотоксическое действие химиотерапии на опухоль. При этом они блокируют белок множественной лекарственной устойчивости (который обычно “выносит” из опухолевой клетки попадающие туда цитостатики), задерживая химиопрепараты в клетках опухоли [Kim SW, Kwon H, 2003; Kitagawa S, Takahashi T., 2007; Ni W, Zhang X, Wang B, 2010]. Вместе с тем, фитоадаптогены провоцируют самоуничтожение (физиологическую гибель) клеток опухоли, активизируя “спящие” на них рецепторы апоптоза [Yan Z, Yang R, 2011]. Большое внимание в литературе, посвященной проблемам онкологии, уделяется регуляторным механизмам, ответственным за c-jun, c-fos (и др.) онкогенную трансактивацию эукариотического фактора транскрипции NFkappaB, а также - активатора протеина-1 (АР-1). Можно полагать, что противоопухолевая активность фитоадаптогенов, в частности экстракта 46 женьшеня, его полисахаридов, гинзенозидов (Rb1, Rc, Re, Rg1, Rg3 и IH901), их метаболитов (которые образуются в результате жизнедеятельности бактерий кишечника) обусловлена подавлением активности NF-kappaB и АР1, а также экспрессии циклооксигеназы-2 [Oh G.S., Pae H.O. et al., 2005; Peralta E., Murphy L. еt al., 2009; Wang N, Wan JB. еt al., 2011]. Вместе с тем, продемонстрировано, что активные вещества, например, из индийского женьшеня, ингибируя активность NF-kappaB и NF-kappaB-регулируемую экспрессию соответствующих генов, индуцирует апоптоз и снижает инвазию при метастазировании клеток опухоли [Ichikawa H., Takada Y. et al., 2006; Park SC, Yoo HS. еt al., 2009]. Во многих исследованиях выявлены антиоксидантные, антимутагенные, противовоспалительные свойства женьшеня, а также отдельных его компонентов (полисахаридов и гинзенозидов). В частности, показана способность снижать экспрессию мРНК циклооксигеназы 1 и 2, ИЛ1-бета, ИЛ4, ИФН-гамма, ФНО-альфа путем фосфорилирования I kappaB альфа-киназы, с последующей деградацией I kappaB-альфа и ингибировании таким образом NF-kappаB транскрипционного фактора [Bae E.A., Han M.J. et al., 2006; Ahn J.Y., Choi K., Kim M. et al., 2007; Lee D.C., Lau A.S..et al., 2011]. Представленный материал свидетельствует о том, что характерной чертой фитоадаптогенов является широкий спектр биологического действия. Это связано с тем, что их активные компоненты обладают структурной и функциональной связью со стероидными гормонам, которым присуща высокая биологическая активность. На фармакологическую активность гинзенозидов оказывает влияние число и место связывания сахаров (глюкоза, мальтоза, фруктоза, сахароза) и ОН групп, обеспечивая каждому веществу определенное свойство: Rg1 усиление гуморального и клеточно-опосредованного иммунитета; Rh2; Rb1, Rb2, Rc - антипролиферативная активность в отношении опухолевых клеток; Rh1,Rh2, Rh3, Rg3 - индукция дифференцировки и коррекция гомо- и гетеротипических адгезионных взаимодействий; Rg3; Rd1-K - 47 антиметастатическая активность; преодоление множественной лекарственной устойчивости; Rh - усиление корректорной активности ДНКполимеразы (антимутагенность); RcM1- индукция апоптоза в опухолевых клетках; Rb1; Rg1; Rg3 - подавление ангиогенеза опухоли; Rb1, Rb2, Re, Rg1 - повышение активности антиоксидантных ферментов (СОД, каталазы, глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы); Rb1 - предотвращение апоптической гибели нейронов (стимуляция экспрессии антиапоптического фактора Bcl-x(L) in vitro and in vivo) [Attele A. et al., 1999; Lian-Wen Qi, Chong-Zhi W., 2011]. Профилактические свойства фитоадаптогенов в отношении возникновения опухолей, метастазирования, рецидивирования, развития цитостатической болезни показали их перспективность для лечения и профилактики злокачественных новообразований. Однако для отдельных фитоадаптогенов характерно возникающее со временем привыкание. С этим связана необходимость замены одного препарата на другой с аналогичным типом действия. При этом проводится комплексный анализ по определению индивидуальной чувствительности больного к отдельным фитоадаптогенам. Данная ситуация препятствует широкому применению индивидуальных фитоадаптогенов в практической онкологии. Вместе с тем до сих пор существует проблема подбора эффективных доз препаратов фитоадаптогенов в клинике из-за недостаточности критериев их стандартизации. В связи с этим стандартизованные комплексные фитоадаптогены представляют несомненный интерес с точки зрения перспективности сочетанных воздействий, влияющих на разные звенья защитных систем организма. Известны зарубежные разработки фитокомплекса на основе пяти китайских растений (Panax ginseng, Schisandra chinensis, Fructus crataegi, Ziziphus jujube and Glycine Max), обработанных пивными дрожжами Sacharomyces cerevisiae. Его противоопухолевая активность была 48 продемонстрирована на голых мышах (nude) с опухолями желудка. При этом препарат активировал моноциты, повышая уровень внутриклеточного кальция, снижая уровень ИЛ-6, способствуя выделению ФНО-альфа, ИФНгамма и индуцируя активность NF-kappaB транскрипционного фактора [Chan A.S., Yip E.C. et противовоспалительная al., 2005]. Высокая эффективность противоопухолевая другого и фитоадаптогенного комплекса (SQCR) обусловлена подавлением экспрессии мРНК и активации NF-kappaB [Zhang H.M., Chen S.W. et al., 2006]. Вместе с тем в предшествующих исследованиях лаборатории иммунофармакологии РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН был разработан комплексный фитоадаптогенный препарат фитомикс-40 (ФМ-40). В его состав входят компоненты экстрактов 40 целебных растений, включая женьшень, родиолу розовую, элеутерококк, лимонник, заманиху, калган, бессмертник, сосновые и березовые почки, толокнянку, эвкалипт, можжевельник, чагу, валериану, спорыш, пустырник, шиповник, калину, рябину, боярышник, чернику, клюкву, черную смородину и др. Все ингредиенты фитопрепарата включены в Госфармакопею XI. Состав защищен патентом Российской Федерации [Бочарова О.А., 1998]. Препарат сертифицирован в качестве парафармацевтика. Стандартизован с помощью биологических и химических методов. При изучении химического состава Фитомикса-40 с использованием современных физико-химических методов выявлено содержание широкого спектра биологически активных соединений, в том числе панаксазидов, аралозидов, элеутерозидов, салидрозида, флавоноидов (в том числе рутина), схизандрина, арбутина, гидрохинона, глицирризиновой кислоты, урсуловой кислоты, олеаноловой (аскорбиновой кислоты, кислоты, бетулина, никотинамида, полифенолов, α-токоферола, витаминов пиридоксина, ретинола) [Шейченко В.И., Бочарова О.А. и др., 2006; 2007; 2008; 2012; 2013]. 49 ФМ-40 обладает более высокой адаптогенной активностью (Аadapt = 51,6%) по сравнению с отдельными фитоадаптогенами. Адаптогенная активность данного препарата определена с помощью разработанного ранее способа количественного биологического контроля фитоадаптогенов с использованием культуры сахаромицетов [Бочарова О.А., Куренная О.Н. и др., 1993; Бочарова О.А., Лыженкова М.А. и др., 2003]. ФМ-40 не вызывает индивидуальную иммунологическую (устойчивость) толерантность по сравнению с отдельными адаптогенами, а также проявляет, как следует из предыдущих экспериментальных и клинических исследований, противоопухолевую активность [Бочарова О.А., Давыдов М.И. и др., 2009]. Вместе с тем у ФМ-40 выявлены иммуномодулирующие свойства, в том числе регуляция адгезивных взаимодействий и коррекция продукции такого цитокина, как ИФН-γ, при опухолевом процессе [Бочарова О.А., Матвеев В.Б. и др., 2006; Бочарова О.А., Барышников А.Ю., Давыдов М.И., 2008; Бочарова О.А., Давыдов М.И. и др. 2009]. Ранее было установлено, что формирование устойчивости к наследственному опухолеобразованию в эпителиальных тканях связано с повышением интеграции клеток ткани-мишени на заключительном этапе ее дифференцировки в раннем постнатальном онтогенезе. В эпителиальных тканях, предрасположенных к опухолям, усиления взаимной адгезивности клеток не происходит [Маленков А.Г., Бочарова О.А., 1987]. Значимость этого явления для уровня частоты спонтанных опухолей была показана на высокораковых линиях мышей как с помощью эндогенных тканеспецифических адгезионных факторов – контактинов (коррегирующих взаимную адгезивноть клеток ткани между собой), так и – неспецифических агентов, в качестве которых был использован фитоадаптоген Rhodiolae rosea, обладающий адгезиогенными свойствами [Бочарова О. А., Модянова Е. А., 1982; Модянова Е.A., Бочарова О.А., 1983; Маленков А.Г., Бочарова О.А., 1987; Бочарова О.А., Серебрякова Р.В., 1994]. При введении мышам 50 указанных препаратов, захватывая "критический" период развития органа (на этапе завершения дифференцировки соответствующей нормальной ткани), частота спонтанных опухолей существенно снижалась. При этом взаимная адгезивность клеток ткани долговременно повышалась. Аналогичные изменения были выявлены и для функциональной активности Т-лимфоцитов. Вместе с тем применение препарата родиолы розовой (Rhodiolae rosea) позже, на этапе созревания тимуса (с 2-х до 3-х месяцев) или в начальный период образования спонтанных гепатокарцином у мышейсамцов линии СВА (с 7-ми до 8-ми мес) не оказывало долговременного повышения обозначенных показателей. При этом частота наследственного опухолеобразования не изменялась в сравнении с контрольными мышами, а размеры гепатокарцином у высокораковых мышей в возрасте 12-13 мес сократились, т.е. скорость их роста замедлялась. Таким образом, введение неспецифического адгезиогенного препарата (индивидуального активностью фитоадаптогена Аadapt=50,4%), Rhodiolae захватывая с адаптогенной период завершения rosea дифференцировки ткани печени привело к долговременному повышению тканевой интеграции, существенно снизило функциональной частоту активности наследственных Т-лимфоцитов гепатом. и Проведение дополнительных курсов профилактики препаратом Rhodiolae rosea в возрасте 2-3 и 7-8 меcяцев не изменило результатов первой серии экспериментов. Использование препарата только в период, совпадающий с окончанием увеличения абсолютной массы тимуса, т.е. с завершением формирования главного органа клеточного иммунитета (2-3 мес), а также в период образования первых опухолей (7-8 мес), не приводит к долговременному увеличению взаимной адгезивности клеток ткани печени и активности клеточного иммунитета. Вместе с тем не изменился и высокий уровень частоты наследственных опухолей печени, соответствующий интактным самцам линии СВА. Однако средний диаметр опухолей в данном случае 51 оказался существенно меньшим, чем в контроле. Последнее, по-видимому, свидетельствует о некоторой задержке опухолевого роста даже при кратковременном повышении изучаемых характеристик [Бочарова О.А., Серебрякова Р.В., 1994]. В связи с вышеизложенным представляется актуальным изучение изменений экспрессии лейкоцитарных интегринов и некоторых цитокинов, а также гормонов кортикостерона и тестостерона при опухолевом процессе на примере высокораковой линии экспериментальных животных, а также определение значимости коррекции выявленных нарушений с помощью комплексного фитоадаптогена в форме сухого экстракта для снижения интенсивности опухолеобразования и увеличения продолжительности жизни. Глава 2. Материалы и методы исследования 2.1. Лабораторные животные Работу проводили на мышах-самцах высокораковой инбредной линии СВА (сублиния СВА/Lac Y). Исходно мыши получены из ФГБУ «Научный центр биомедицинских технологий» РАМН, отдела разведения лабораторных животных ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина». Эта линия является классической моделью генетической предрасположенности к опухолям печени с высоким риском их возникновения. Дистальная хромосома 1 в клетках этих мышей несет один и более генов, обеспечивающих предрасположенность к спонтанному и химически индуцированному гепатоканцерогенезу [Bilger A. et al., 2004]. Первые спонтанные гепатомы у мышей-самцов линии СВА возникают, начиная с 6-месячного возраста, и встречаются в 7 раз чаще, чем у самок [Медведев Н.Н. 1964; Sharp J. et al., 1976]. В позднем онтогенезе, в возрасте 18-22 месяца, в 100% случаев у самцов выявляют гепатокарциномы [Фактор В.М. и др., 1984; Sharp J. et al., 1976]. 52 2.2. Описание эксперимента на лабораторных животных Сухой экстракт комплексного фитоадаптогена фм-40 применяли в двух режимах введения: 1-й – в течение 1-го месяца постнатального развития животных, захватывая «критический» период завершения дифференцировки, соответствующий нормальной ткани печени, примерно за пять месяцев до возникновения гепатом; 2-й – с шестимесячного возраста (курсами) на фоне возникающих гепатом до естественной гибели животного. Курс применения препарата составил 3 недели, интервал между курсами – 1 неделю. Доза сухого экстракта была приведена в соответствие с эффективной дозой водноспиртового экстракта фм-40, которая была выбрана на основании предыдущих исследований. [Бочарова О.А. и др., 2003; Бочарова О.А. и др., 2006]. Животных содержали в стандартных условиях вивария в соответствии с международными этическими нормами. Мыши контрольной группы (группа 1, n=110) получали в качестве питья только воду. Водой наполняли стандартные поилки. Животные пили воду самостоятельно. Мыши группы 2 (профилактическая группа, n=95) получали 0,3% водный раствор сухого экстракта, который принимали самки, начиная с рождения детенышей до их отъема в возрасте 1 месяц постнатального развития. Мыши группы 3 (лечебная группа, n=95) получали аналогичный раствор сухого экстракта в питьевой воде, начиная с возраста 6 мес. (курсами) до естественной гибели животного. Всего в работе было использовано 300 мышей. Часть животных (по 13-17 мышей из каждой группы) забивали в соответствии с этическими нормами при использовании эфирного наркоза в возрасте 4, 8, 22 месяцев. Печень контрольных и опытных животных, помимо макроскопического исследования, подвергали гистологической обработке по стандартной методике и окрашиванию гематоксилином - эозином, а также специально определения обрабатывали CD8, для CD11a, проведения CD11b иммуногистохимического антигенов на лимфоцитах, 53 инфильтрирующих гепатокарциномы. Макроскопической ревизии подвергали и другие органы животных. Однако опухолей при этом не наблюдали. На лимфоцитах периферической крови животных исследовали уровни экспрессии лейкоцитарных интегринов СD11a, CD11b. В сыворотке крови животных определяли содержание цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-10, а также гормонов тестостерона и кортикостерона. Оставшиеся животные находились под наблюдением вплоть до естественной гибели. Объём опухолей (мм3) вычисляли по стандартной формуле: А х В х С х 0,52; где А, В, С – максимальные размеры опухоли по длине, ширине и высоте. Среднюю продолжительность жизни и медиану выживаемости определяли по методу Каплан-Мейера. В позднем онтогенезе оценивали вес, наличие алопеций и седой шерсти у животных как показатели их соматического состояния. 2.3. Материалы исследования При выполнении опытов на экспериментальных животных материалом исследования служили образцы сыворотки периферической крови, цельная кровь, печень и другие органы. Сыворотку крови получали центрифугированием цельной крови при 1500 об/мин в теч 10 мин. Образцы сыворотки крови хранили при температуре -80°С до выполнения исследований. В качестве препарата в работе использовали порошок, полученный при высушивании комплексного фитоадаптогена фитомикса-40 (фм-40) с использованием распылительной сушки по определённой технологии. Фм40 разработан на основе компонентов 40 растительных экстрактов, в том числе женьшеня, родиолы розовой, элеутерококка, лимонника, заманихи, можжевельника, сосновых и березовых почек, калгана, бессмертника, эвкалипта, пустырника, ягод боярышника, шиповника, черной смородины и др. [Бочарова О.А., Лыженкова М.А. и др., 2003]. 54 2.4. Среды 1. Среда для разведения моноклональных антител (МКА): фосфатный буферный раствор Дюльбеко А (PBS), содержащий 2% инактивированной телячьей эмбриональной сыворотки и 0,2 % азида натрия. 2. Физиологический раствор (0,85% NaCl). 3. Среда 199 на растворе Хенкса для культур тканей (ПанЭко, Россия). 4. Среда RPM1-1640, содержащая 2 мМ L-глутамина, 50 мкМ 2меркаптоэтанола (Serva, США), 160 мкг/мл гентамицина, 10 млМ HEPES буфера, 10% инактивированной телячьей эмбриональной сыворотки. 5. среда DPX (Fluca A.G., Buchs, Switzeerland) 2.5. Реактивы 1. Гепарин: 20 ед/мл среды 199. 2. Азид натрия: 10% раствор на PBS. 3. Мышиные моноклональные антитела к CD8 антигену, лейкоцитарным интегринам LFA-1 (CD11a) и Мac-1 (CD11b) фирмы BD Biosciences (USA). 4. Лизирующий буфер (НПЦ "Медбиоспектр"). 5. Формалин: 10% раствор. 6. Реактивы для гистологического исследования – этанол, ксилол. 7. Красители: гематоксилин (приготовленный по методу Бемера) и 2% эозин. 8. Парафин. 9. Цитратный буфер 0,01-молярный (рН 6). 10. Раствор перекиси водорода 0,3% в 0,01-молярном фосфатном буфере (рН 7,4). 11. Детергент 0,3% - Triton X100. 12. Нормальная ослиная сыворотка 2%. 55 13. Поликлональные ослиные антитела против иммуноглобулина мыши, конъюгированные с биотином (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. США). 14. Раствор 3,3′-диаминобензидин тетрагидрохлорида 0.05% (ДАБ - Sigma Chemical Co., St Louiis, Mo., U.S.A.) 15. Авидин-биотин-пероксидазный ABC комплекс (аббревиатура от английского Avidin and Byotinylated horseradish peroxidase macromolecular Complex; ABC standard kit Vector Laboratories, Burlingame, CA, США) 2.6. Методы исследования 2.6.1. Анализ экспрессии лейкоцитарных интегринов методом непрямой иммунофлуоресценции В возрасте 4, 8 и 22 месяцев на лимфоцитах периферической крови животных исследовали уровень экспрессии лейкоцитарных интегринов СD11a и CD11b с использованием наборов фирмы BD Biosciences (США). Кровь забирали в стерильную центрифужную пробирку, содержащую 20 ед/мл гепарина. Реакцию выполняли в пластиковых пробирках (фирмы «Falcon»). К 100 мкл гепаринизированной цельной крови добавляли 20 мкл соответствующих моноклональных антител и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего клетки отмывали центрифугированием в PBS в течение 7 минут при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость удаляли, осадок ресуспендировали. Затем к клеткам добавляли по 20 мкл меченой флуоресцеинизотиоционатом антисыворотки барана против иммуноглобулинов мыши и инкубировали 30 мин при 4оС. Для удаления эритроцитов к клеткам добавляли 2 мл лизирующего раствора и тщательно перемешивали на вортексе. Инкубировали при комнатной температуре в защищенном от света месте в течение 10 мин. Центрифугировали 7 мин при 1500 об/мин. После проведения процедуры лизиса эритроцитов клетки отмывали дважды в PBS, 56 после чего ресуспендировали в PBS, содержащем 1% формалина и 0,1% азида натрия. Реакцию учитывали на проточном цитофлуориметре FACScanto IIc (Becton Dickinson, США) в гейте лимфоцитов. 2.6.2. Определение цитокинов в сыворотке крови экспериментальных животных иммуноферментным методом Уровень цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-10 в сыворотке крови экспериментальных животных в возрасте 4, 8 и 22 месяца определяли методом твёрдофазного иммуноферментного анализа с использованием наборов фирмы «Diaclone» (Франция). Количественное определение интерлейкинов проводили с помощью иммуноферментного метода (ИФА), основанного на реакции антиген (АГ)антитело (АТ), с высокой специфичностью и высокой чувствительностью, усиленной за счет биотина, конъюгированного с АТ, и обладающего высоким к нему сродством стрептавидина, конъюгированного с ферментом пероксидазой (пероксидаза КФ 1.11. 1.7.) [Clark R., 1981; Иммунологические методы, 1987]. В работе был использован неконкурентный ИФА-метод двойных АТ — «сэндвич вариант». Для этого варианта использованы два моноклональных АТ с различной эпитопной специфичностью к АГ. Одно из них иммобилизовано на твердой фазе (внутренняя поверхность реакционных лунок микропланшета), второе конъюгировано с биотином. На первой стадии анализа АГ из калибровочных, контрольных и исследуемых проб связывается с АТ, находящимися на внутренней поверхности лунок. На второй стадии комплекс АГ–АТ взаимодействует со вторыми АТ, конъюгированными с биотином. Количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству АГ в исследуемом образце. Далее в лунки вносится конъюгат стрептавидин-пероксидаза (КФ 1.11.1.7), а на последней стадии — субстратная смесь. Во время инкубации с субстратной смесью (перекись водорода с тетраметилбензидином происходит окрашивание раствора в 57 синий цвет (разной степени интенсивности) в лунках. Остановка реакции — добавление кислоты, изменение окраски в желтый цвет. Степень окраски прямо пропорциональна количеству связавшегося определяемого АГ с АТ. После измерения экстинкции раствора в лунках на основании калибровочной кривой рассчитывается концентрация исследуемого вещества (АГ) в определяемых образцах. Калибровочные, контрольные и исследуемые пробы анализируются в двух повторностях. Определение уровня интерлейкина-6 в сыворотке крови экспериментальных животных. Образцы и стандарты в объеме 100 мкл помещали в лунки 96-луночного микропланшета с предварительно иммобилизованными на дне моноклональными антителами к ИЛ-6. В среду (во все лунки) добавляли 50 мкл биотинилированного раствора с антителами к ИЛ-6, стрипы инкубировали при температуре 37°С в течение 2-х часов при постоянном встряхивании. По окончании инкубации содержимое лунок удаляли и промывали 3-4 раза буферным раствором. Затем вносили 100 мкл раствора конъюгата стрептавидин-пероксидаза и инкубировали 30 мин при 37°С, постоянно встряхивая. Отмывали 3-4 раза буферным раствором. В планшет добавляли 100 мкл субстратного раствора перекиси водорода с тетраметилбензидином Реакционную смесь и в инкубировали лунке при 12-15 развитии минут на окраски шейкере. останавливали добавлением 50 мкл стоп-реагента Н2SО4. Величину абсорбции измеряли при длине волны 450 нм на спектрофотометре «Униплан» (Россия). Определение уровня интерлейкина-10 в сыворотке крови экспериментальных животных Образцы и стандарты в объеме 100 мкл помещали в лунки 96-луночного микропланшета с предварительно иммобилизованными на дне моноклональными антителами к ИЛ-10. В среду во все лунки добавляли 50 мкл биотинилированного раствора с антителами к ИЛ-10, стрипы инкубировали при температуре 37°С в течении 3-х часов при постоянном встряхивании. По окончании инкубации содержимое лунок удаляли и промывали 3-4 раза промывочным буфером. Вносили 100 мкл 58 раствора конъюгата стрептавидин-пероксидаза и инкубировали 30 мин при 37°С, постоянно встряхивая. Отмывали 3-4 раза буферным раствором. В планшет добавляли субстратный раствор 100 мкл перекиси водорода с тетраметилбензидином Реакционную смесь и в инкубировали лунке при 25-30 развитии минут окраски на шейкере. останавливали добавлением 50 мкл стоп-реагента Н2SО4. Величину абсорбции измеряли при длине волны 450 нм на спектрофотометре «Униплан» (Россия). 2.6.3. Иммуногистохимический анализ CD8, CD11a, CD11b антигенов на лимфоцитах, инфильтрирующих гепатокарциномы Анализ CD8, CD11a, CD11b антигенов проводили на парафиновых срезах гепатокарцином мышей СВА в возрасте 22 мес, получавших сухой экстракт фитоадаптогена в профилактическом и лечебном режимах введения. Печень обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин. Гистологические срезы фиксировали на стеклах с адгезивным полилизиновым покрытием (Thermo Scientific, Barrington, IL, USA). Часть срезов окрашивали гематоксилин-эозином стандартным методом. Препараты изучали под микроскопом фирмы Leica DM LB2 при x50, х200, х400 кратном увеличении с последующим фотографированием. На других срезах проводили непрямое иммуногистохимическое окрашивание CD8, CD11a, CD11b антигенов на лимфоцитах, инфильтрирующих гепатокарциномы с использованием авидин-биотинпероксидазного комплекса (ABC). Окраске предшествовали стадии демаскировки антигена и деактивации эндогенной пероксидазы. Для этого депарафинированные в ксилоле и проведенные по спиртам до воды срезы погружали в раствор 0,01-молярного цитратного буфера (рН 6) и кипятили в течение 20 минут в микроволновой печи с последующим охлаждением до комнатной температуры в течение 20 минут. Затем срезы погружали в 0,3% раствор перекиси водорода в 0,01-М фосфатном буфере (рН 7,4) на 30 минут и троекратно промывали фосфатным 59 буфером. Пространство между срезами высушивали фильтровальной бумагой, срезы окружали гидрофобной полоской с помощью Super pap pen. На первой стадии иммуногистохимического окрашивания срезы обрабатывали первичными мышиными моноклональными антителами к исследуемым антигенам (CD8, CD11a, CD11b) в разведении 1:30 - 1:50 0,01-М фосфатным буфером (рН 7,4) с добавлением 0,3% детергента — Triton X100 и 2% нормальной ослиной сыворотки для блокировки неспецифического связывания антител. Реакцию с первичными антителами проводили в течение 12 часов (ночь) при 4оС во влажной камере. Затем препараты промывали 3 раза 0,01-М фосфатным буфером (рН 7,4). На второй поликлональных стадии ослиных срезы покрывали антител против раствором вторичных иммуноглобулина мыши, конъюгированных с биотином, в 0,01-М фосфатном буфере с добавлением 0,3% детергента — Triton X100 и выдерживали 1 час при комнатной температуре. Затем препараты промывали 3 раза 0,01-М фосфатным буфером (рН 7,4). Далее срезы троекратно промывали 0,01-М фосфатным буфером (рН 7,4) и покрывали 0,5% раствором авидин-биотин-пероксидазного комплекса, который присоединяется к биотину вторичных антител, на 1 час в том же растворителе. После троекратной промывки в фосфатном буфере проводили реакцию выявления активности пероксидазы АВС комплекса: срезы в течение 10 минут обрабатывали 0.05% раствором 3,3′-диаминобензидин тетрагидрохлорида (ДАБ - Sigma Chemical Co., St Louiis, Mo., U.S.A.) с добавлением перекиси водорода (6 мкл 30% раствора H2O2 в 20 мл раствора ДАБ). После промывки в фосфатном буфере срезы проводили по спиртам до ксилола и покрывали средой DPX (Fluca A.G., Buchs, Switzeerland). Некоторые срезы перед проводкой по спиртам подкрашивали гематоксилинэозином. Препараты изучали под микроскопом Olympus IX81 (Olympus Life Science Europa, Hamburg Germany) с управляемым компьютером, 60 моторизованным препаратоводителем и цифровой фотокамерой Olympus DP72 при x50, х200, х400 кратном увеличении с последующим фотографированием. 2.7. Определение концентрации тестостерона и кортикостерона в сыворотке крови экспериментальных животных Концентрацию тестостерона в сыворотке крови мышей определяли с помощью набора «Direct ELISA Kit. The EiAsyTM Way Testosterone» производства компании DBC («Diagnostic Biochem Canada Inc») в соответствии с инструкцией производителя. В этом тесте сыворотку исследовали без разведения. Концентрацию кортикостерона в сыворотке крови мышей определяли с помощью стандартного набора для прямого иммуноферментного анализа «Corticosterone EIA» производства компании IDS (США) в соответствии с инструкциями производителя. Перед определением сыворотку крови разводили в 5 раз с помощью буфера для образцов, входящего в состав набора. Все измерения проводили на автоматическом универсальном ридере микропланшетов с использованием 2-параметрической модели для построения калибровочных кривых и расчета концентрации в исследуемых пробах. Каждая точка представляет собой среднее трех параллельных измерений. Концентрацию исследованных гормонов выражали в нанограммах (нг) на 1 мл сыворотки. 2.8. Статистический анализ результатов Статистический анализ результатов проводили с использованием алгоритмов компьютерной программы “STATISTICA” 6.0 с помощью однофакторного дисперсионного анализа ONE–WAY ANOVA. 61 Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Исследование экспрессии лейкоцитарных интегринов у мышей-самцов инбредной линии СВА при воздействии сухого экстракта фитоадаптогена в разных режимах применения. В таблице 1 представлены результаты воздействия сухого экстракта фм-40 при разных схемах применения на экспрессию лейкоцитарного интегрина LFA-1 (CD11a/CD18) лимфоцитами крови у мышей высокораковой линии СВА в онтогенезе. Из таблицы видно, что в возрасте 4 и 8 месяцев у мышей всех групп уровень экспрессии CD11a антигена статистически не различался (p ≥ 0,5). У мышей 1 группы (контрольной) к 22 месячному возрасту выявлено статистически достоверное снижение этого показателя с 45,93,4% (в возрасте 8 месяцев) до 36,5±1,9%, (р8-22=0,03). У мышей 2 группы, которые в течение первого месяца постнатального развития получали с питьевой водой сухой экстракт фм-40, к 22 месяцам изменение экспрессии CD11a антигена по сравнению с ранним периодом онтогенеза происходит статистически не значимо (52,3±3,0% и 44,62,1% соответственно, р4-22=0,05). По сравнению с 8 месячным возрастом этот показатель статистически не различался (р8-22=0,2). Вместе с тем значение этого показателя оказалось выше в сравнении с аналогичным периодом онтогенеза (22 месяца) у контрольных мышей (р1-2 = 0,01). У мышей 3 группы, получавших сухой экстракт фм-40, начиная с шестимесячного возраста постнатального онтогенеза (периода возникновения первых гепатокарцином), к 22 месяцам данный показатель также практически не снижался по сравнению с 4 месячным возрастом (50,23,1%; 43,4±2,6%; р4-22 = 0,1). В позднем онтогенезе показатель статистически значимо повышен в сравнении с контролем (р1-3=0,04). 62 Результаты разных режимов воздействия сухого экстракта фм-40 на экспрессию лейкоцитарного интегрина Mac-1 (CD11b/CD18) клетками крови мышей самцов высокогепатомной линии СВА в онтогенезе представлены в таблице 2. Из таблицы 2 следует, что у мышей контрольной группы количество лимфоцитов крови, экспрессирующих лейкоцитарный интегрин CD11b, в возрасте 8 месяцев (12,1±1,7%) достоверно не отличалось от такового 4 месячных животных (13,4±1,7%; р4-8 = 0,6). В возрасте 22 месяцев этот показатель статистически достоверно снизился до 6,81,1% (р8-22=0,02; р422=0,004). У опытных мышей 2 группы уровень экспрессии CD11b антигена в возрасте 4 и 8 месяцев не различался (17,21,5% и 15,61,4%; р4-8 = 0,5), но имел тенденцию к повышению по сравнению с контрольными животными в аналогичные периоды онтогенеза (р1-2=0,1). К 22 месячному возрасту уровень экспрессии снизился до 12,11,1% (Р8-22=0,06; Р4-22=0,01). Вместе с тем в позднем онтогенезе в данной группе уровень экспрессии CD11b антигена достоверно превышал значение у мышей контрольной группы в этом возрасте (р1-2=0,003). В 3 группе мышей в возрасте 4 месяцев значение исследуемого показателя сравнимо с таковым в контрольной и 2 опытной группах (р1-3 = 0,5; р2-3 = 0,4). В позднем онтогенезе относительно восьмимесячных животных в своей группе уровень экспрессии CD11b антигена снизился статистически достоверно с 17,91,4%; до 13,21,4%, р8-22=0,03. В то же время в возрасте 8 и 22 месяцев уровень экспрессии CD11b антигена был выше значений у мышей контрольной группы и составил 17,91,4% 3=0,02) (р1- и 13,21,4% (р1-3=0,002) соответственно. Таким образом, полученные на данном этапе результаты показали, что при разных режимах применения сухого экстракта фм-40 у мышей высокораковой линии СВА, число лимфоцитов, экспрессирующих молекулы 63 LFA-1 (СD11a/CD18) и Mac-1 (СD11b/CD18), повышено по сравнению с контрольными животными. Долговременное применение сухого экстракта фм-40, курсами, с шестимесячного возраста мышей до их естественной гибели, сравнимо по степени воздействия на изучаемые показатели с первым вариантом введения фитоадаптогена. Вместе с тем, эффективность воздействия сухого экстракта фм-40 на уровень экспрессии лейкоцитарных интегринов сравнима с таковой для жидкой формы фитоадаптогена, выявленной в предыдущем исследовании [Бочарова О.А., Карпова Р.В. и др., 2012; 2013]. Учитывая, что контррецепторами молекулы LFA-1 являются молекулы межклеточной адгезии ICAM-1, ICAM-2 (которые могут находиться на опухолевых клетках), можно полагать, что увеличение количества лимфоцитов, экспрессирующих лейкоцитарный интегрин CD11a, под воздействием фитоадаптогена способствует более высокой иммунореактивности таких животных в осуществлении киллинга клетокмишеней эффекторами иммунитета (NK-клетками, цитотоксическими лимфоцитами) [Maksan S. M. et al., 2004]. Вместе с тем, молекула Mac-1 экспрессируется на нейтрофилах, лимфоцитах и NK-клетках, являясь лигандом в том числе ICAM-1. Поэтому аналогичные рассуждения уместны и в отношении повышенного уровня экспрессии CD11b антигена у мышей опытных групп по сравнению с контрольными животными под воздействием обоих режимов введения сухого экстракта фм-40. В данном случае также возможна активация способности иммунных эффекторов инфильтрировать опухоль, контактировать с клетками-мишенями, что помогает гибели последних [Sasada T, Suekane S., 2011]. На основании предшествующих и настоящих исследований можно полагать, что у мышей при спонтанном гепатоканцерогенезе сниженная активность Т-лимфоцитов обусловлена в том числе недостатком экспрессии 64 молекул лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1 на эффекторах иммунитета. Фитоадаптогены, обладающие адгезиогенным действием, способны нормализовать обозначенные показатели [Бочарова О.А., 2009]. Таким образом, при введении сухой формы препарата в в течение первого месяца постнатального онтогенеза высокогепатомным мышам, включая завершающий период дифференцировки нормальной ткани печени (5-15 день постнатального развития) можно обеспечить длительный по времени эффект повышения экспрессии на клетках крови молекул лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1. Применение сухой формы фитоадаптогена, начиная с периода возникновения опухолей и естественной гибели животных, может приводить к до аналогичным результатам. Очевидно, курсовое введение адгезиогенного препарата в сухой форме в течение длительного времени способствует поддержанию экспрессии молекул, обеспечивающих контактные взаимодействия между эффекторами иммунитета и клетками-мишенями. 65 Таблица 1 Уровень экспрессии CD11a антигена лимфоцитами крови у мышей линии СВА при воздействии сухого экстракта фитоадаптогена в раннем и зрелом онтогенезе CD 11a (%) Группы 4 мес. 8 мес. 22 мес. р р4-8=0,5 1. Контроль 49,43,6 45,93,4 36,51,9 р8-22=0,03 Р4-22=0,005 2. Прием фм-40 в течение 1-го мес. р4-8=0,4 52,33,0 49,02,9 44,62,1 р4-22=0,05 3. Прием фм-40, р4-8=0,5 начиная с 6-го 50,23,1 47,93,3 43,42,6 мес. р р8-22=0,2 р8-22=0,3 р4-22=0,1 р1-2=0,5 р1-2=0,5 р1-2=0,01 р1-3=0,8 р1-3=0,7 р1-3=0,04 р2-3=0,8 Р2-3=0,6 Р2-3=0,8 66 Таблица 2 Уровень экспрессии CD11b антигена лимфоцитами крови у мышей линии СВА при при воздействии сухого экстракта фитоадаптогена в раннем и зрелом онтогенезе Группы CD 11b (%) 4 мес. 8 мес. 22 мес. р р4-8=0,6 1. Контроль 13,41,7 12,11,7 6,81,1 р8-22=0,02 р4-22=0,004 2. Прием фм-40 р4-8=0,5 в течение 1-го 17,21,5 15,61,4 12,11,1 р8-22=0,06 мес. р4-22=0,01 3. Прием фм-40, р4-8=0,2 начиная с 6-го 15,01,5 17,91,4 13,21,4 мес. р8-22=0,03 р4-22=0,4 р р1-2=0,1 р1-2=0,1 р1-2 =0,003 р1-3=0,5 р1-3=0,02 р1-3=0,002 р2-3=0,4 р2-3=0,3 Р2-3=0,5 67 3.2. Оценка влияния сухого экстракта фитоадаптогена на сывороточный уровень интерлейкинов -6 и -10 у высокораковых мышей при спонтанном гепатоканцерогенезе Результаты определения уровня ИЛ-6 в сыворотке крови у мышей самцов высокогепатомной линии СВА контрольной (1) группы, а также опытных групп, получавших сухой экстракт фм-40 в раннем (2 группа) и зрелом (3 группа) онтогенезе, представлены в таблице 3. Из таблицы видно, что у контрольных животных в возрасте 4 и 8 месяцев концентрация ИЛ-6 в сыворотке крови статистически не различалась (84,2±5,2 и 89,7±4,1 пг/мл соответственно; р 4-8=0,41). К 22 месячному возрасту значение данного показатель статистически достоверно возросло до 140,2±7,2 пг/мл (р4-22, р8-22 = 0,0005). У опытных мышей группы 2 уровень ИЛ-6 в сыворотке крови в возрасте 4 и 8 месяцев также статистически не различался (82,0±4,4 пг/мл и 85,1±5,8 пг/мл соответственно, р4-8=0,75). Различий не выявлено и по сравнению с контрольной группой в эти же периоды онтогенеза (р1-2 ≥ 0,33). К 22 месячному возрасту у мышей 2 группы значение изучаемого показателя статистически значимо возросло до 117,0±7,2 пг/мл (р4-22=0,001; р8-22=0,004), отставая статистически достоверно от значения у контрольных мышей (р12=0,03). У опытных мышей группы 3 динамика изменения концентрации ИЛ-6 в сыворотке крови сравнима с таковой во 2 группе. В возрасте 4 и 8 месяцев этот показатель статистически не отличался от контрольной группы (85,3±5,1 пг/мл, р1-3=0,2 и 87,3±5,6 пг/мл, р1-3=0,69). В 22 месяца концентрация ИЛ-6 в сыворотке крови возросла по сравнению с более ранними периодами онтогенеза в своей группе (113,1±6,4 пг/мл, р 4-22=0,04; р8-22=0,03). В то же время по сравнению со значением в контрольной группе в этот период наблюдалось снижение данного показателя (р1-3=0,01). 68 Таким образом, в первых двух временных точках (4 и 8 месяцев) концентрация ИЛ-6 в сыворотке крови мышей СВА всех трех групп не изменялась. В позднем онтогенезе уровень ИЛ-6 во всех группах статистически достоверно повышен по сравнению с ранним онтогенезом. В то же время у мышей опытных групп 2 и 3 сывороточная концентрация ИЛ-6 в позднем онтогенезе (в возрасте 22 месяца) статистически достоверно подавлена в сравнении с аналогичным возрастным периодом у контрольных животных. Таким образом, введение сухого экстракта фм-40 в раннем онтогенезе мышам линии СВА, а также длительное применение препарата, минуя «критический» период формирования ткани печени, способствует менее выраженному повышению содержания сывороточного ИЛ-6 в течение жизни животного по сравнению с контрольной группой. Можно полагать, это приводит к подавлению образования противоопухолевых антител (блокирующих антигены опухолевых клеток), повышая вероятность разрушения опухолевых клеток эффекторами иммунитета при спонтанном гепатоканцерогенезе. Вместе с тем нельзя забывать, что уменьшение содержания ИЛ-6 может препятствовать расщеплению мышечных белков, замедляя развитие патогенеза анорексии и кахексии животных [Eukaszewicz M. et al., 2007; Kim D. et al., 2009]. В таблице 4 представлены результаты определения сывороточного уровня ИЛ-10 у мышей высокогепатомной линии СВА в онтогенезе под воздействием сухого экстракта фм-40 при разных схемах применения. Как следует из таблицы, у мышей контрольной группы к 8 месячному возрасту наблюдалась тенденция к увеличению уровня ИЛ-10 в сыворотке крови (30,3±3,0 и 37,0±3,9 пг/мл; р4-8=0,19), а к 22 месячному возрасту – статистически достоверное повышение этого показателя до 65,0±4,1 пг/мл (р4-8-22=0,0002). У опытных мышей группы 2 при кратковременном применении сухого экстракта фм-40 содержание ИЛ-10 в сыворотке крови в возрасте 4 и 8 69 месяцев статистически не различалось (25,3±2,4 пг/мл и 29,4±3,4 пг/мл соответственно, р4-8=0,33). В позднем онтогенезе (в возрасте 22 месяца) этот показатель достоверно увеличился по своей группе до 50,3±4,7 пг/мл, (р 822=0,001), Таким но не достиг уровня значения у контрольных мышей (р1-2=0,03). образом, применение сухого экстракта фм-40 в группе 2 способствовало снижению уровня образования ИЛ-10, концентрации которого в сыворотке крови опытных мышей этой группы на протяжении всего онтогенеза всё более отстают от таковых в сравнении с контрольными животными. У опытных мышей группы 3 при долговременном применении препарата динамика изменения уровня ИЛ-10 в сыворотке крови аналогична таковой для группы 2. В возрасте 4 и 8 месяцев значения этого показателя статистически не различались (23,7±3,1 пг/мл и 26,3±2,7 пг/мл соответственно, р4-8=0,54). В возрасте 22 месяцев показатель достоверно увеличился по своей группе до 48,4±4,0 пг/мл, р 8-22=0,0002. Вместе с тем, выявлено, что содержание ИЛ-10 у мышей данной группы, начиная с 8 месячного возраста, статистически достоверно отстаёт от уровня у контрольных мышей (р1-3=0,032 в 8 мес., р1-3=0,009 в 22 мес.). Таким образом, применение сухого экстракта комплексного фитоадаптогена на фоне возникающих спонтанных опухолей, т.е. в лечебном режиме, также может способствовать снижению уровня образования ИЛ-10. Следовательно, как кратковременное применение препарата фм-40 в раннем онтогенезе, так и продолжительное его использование при возникновении опухолей у мышей-самцов линии СВА, способствует отставанию концентрации ИЛ-10 в сыворотке крови от значений у контрольных животных в позднем онтогенезе. Учитывая корреляцию взаимодействия ИЛ-10 и ИЛ-6, а именно то, что снижение образования ИЛ-10 подавляет синтез ИЛ-6, восстанавливает экспрессию молекул адгезии ICAM-1 на клетках-мишенях, можно ожидать в данном случае усиления экспрессии лейкоцитарных интегринов, повышения 70 активности эффекторов иммунитета и синтеза ими реактивных интермедиатов кислорода и азота. Вместе с тем, можно предполагать в данном случае и регуляцию образования ИФН-γ, ИЛ-2, ИЛ-12 и ФНО в том числе Т-лимфоцитами, макрофагами, моноцитами, дендритными клетками, нейтрофилами, что также существенно для реализации противоопухолевых реакций [Brady J. et al., 2010]. Таким образом, у мышей линии СВА, генетически предрасположенных к спонтанному гепатоканцерогенезу, в динамике постнатального онтогенеза (от 4 до 22 месяцев) выявлено повышение сывороточного уровня ИЛ-6 и ИЛ10, а также уменьшение экспрессии лейкоцитрных интегринов LFA-1 и Mac1 клетками крови животных. Применение комплексного фитоадаптогена в сухой форме в разных режимах выявило долговременное снижение образования сывороточного содержания ИЛ-6 и ИЛ-10, которое сопровождается увеличением экспрессии лейкоцитрных интегринов LFA-1 и Mac-1 клетками крови опытных мышей. Следует отметить, что эффект подавления содержания ИЛ-6 и ИЛ-10 при воздействии сухого экстракта комплексного фитоадаптогена долговременно, в зрелом онтогенезе, вне периода завершения дифференцировки нормальной ткани печени, аналогичен таковому при кратковременном введении препарата в раннем периоде онтогенеза. При обсуждении полученных результатов следует отметить, что в данном случае, вероятно, снижается ингибирование экспрессии молекул адгезии ICAM-1 на клетках-мишенях, подавляется усиленное образование противоопухолевых антител (блокирующих антигены опухолевых клеток и, следовательно, рецепторы эффекторов иммунитета). В результате, нарушается ускользание опухолевых клеток от иммунологического надзора [Danese S., Semeraro S. еt al., 2005]. Вместе с тем может происходить «высвобождение» экспрессии лейкоцитарных интегринов (в том числе LFA-1 и Mac-1), миграция, накопление лимфоцитов в патологическом очаге и обеспечение контакта 71 эффекторов иммунитета с клетками-мишенями. При этом, во-первых, в клетки опухоли активно проникают факторы разрушения, в том числе протеиназы, лимфотоксины и реактивные интермедиаты кислорода, азота, водорода (ОН, О2, Н2О2, NO). Во-вторых, может происходить несекреторный лизис опухолевых клеток при активации них FasAPO1, или CD95-антигена (члена семейства ФНО) – рецептора апоптоза, запускающего механизм «самоубийтва» клетки. В этом процессе участвуют каспазы (цистеин/аспартат протеиназы), которые расщепляют клеточные белки, что, в конечном итоге, приводит к фрагментации ДНК и гибели клетки. Все эти процессы могут иметь значение при восстановлении иммунореактивности в отношении опухолевых клеток при новообразованиях [ Kovalovich K. Et al., 2001; Narimatsu M. еt al., 2001]. Таким образом, результаты работы показали, что комплексный фитоадаптоген в сухой форме может принимать участие в регуляции содержания ИЛ-6 и -10 при спонтанном гепатоканцерогенезе высокораковой линии СВА. 72 Таблица 3 Изменение уровня интерлейкина 6 в сыворотке крови у мышей высокораковой линии СВА при воздействии сухого экстракта фитоадаптогена в раннем и зрелом онтогенезе Группы 1.Контроль ИЛ-6 (пг/мл) 4 мес. 84,2±5,2 2. Прием фм40 в течение 1- 82,0±4,4 го мес 8 мес. 89,7±4,1 85,1±5,8 22 мес. 140,2±7,2 р4-8=0,4 р4-22=0,0005 Р8-22=0,0005 117,0±7,2 р4-8= 0,8 р4-22=0,001 р8-22=0,004 р4-8= 0,8 р4-22= 0,04 р8-22= 0,03 3. Прием фм40, начиная с 85,3±5,1 6-го мес 87,3±5,6 113,1±6,4 р1-2= 0,3 р1-3= 0,2 р2-3= 0,8 р1-2= 0,5 р1-3=0,7 р2-3=0,7 р1-2=0,03 р1-3=0,01 р2-3= 0,7 р р 73 Таблица 4 Изменение уровня интерлейкина 10 в сыворотке крови у мышей высокораковой линии СВА при при воздействии сухого экстракта фитоадаптогена в раннем и зрелом онтогенезе ИЛ-10 (пг/мл) Возраст 4 мес. 8 мес. 22 мес. р Р4-8=0,19 1.Контроль 30,3±3,0 37,0±3,9 65,0±4,1 р4-22=0,0002 р8-22=0,0002 2. Прием фм-40 Р4-8=0,33 в течение 1-го 25,3±2,4 29,4±3,4 50,3±4,7 р4-22=0,0002 месс р8-22=0,001 3. Прием фм-40, Р4-8=0,54 начиная с 6-го 23,7±3,1 26,3±2,7 48,4±4,0 месс р4-22=0,0002 р8-22=0,0002 р р1-2=0,20 р1-2=0,15 р1-2=0,03 р1-3=0,34 р1-3=0,032 р1-3=0,009 р2-3=0,71 Р2-3=0,74 р2-3=0,82 74 3.3. Определение воздействия сухого экстракта фитоадаптогена на частоту возникновения, количество и размеры гепатокарцином у высокораковых мышей В таблице 5 представлены результаты определения разных режимов воздействия сухого экстракта фм-40 на частоту возникновения, количество и размеры гепатокарцином в возрасте 8 месяцев у мышей-самцов СВА, предрасположенных к развитию данных опухолей. Из таблицы следует, что в контрольной группе опухоли были выявлены у трех из 20 животных, т.е. частота возникновения опухолей составила 15,0%, число опухолей на мышь - 0,20 ± 0,10. Средний объём одной опухоли определен как 22,6 ± 11,9 мм3, величина опухолевой массы в среднем у одного животного - 4,5 ± 3,1 мм3. У животных 2 группы, получавших сухой экстракт фм-40 в течение 1го мес жизни, макро- и микроскопически опухоли в этом возрасте определены не были. В третьей группе опухоль, объемом 11,5 мм3, была выявлена у одного животного, т.е. частота опухолеобразования составила 5%, число опухолей на мышь в группе - 0,05 ± 0,05. Объем опухолевой массы на мышь определен как 0,77 ± 0,77 мм3. В таблице 6 представлены результаты разных режимов воздействия сухого экстракта гепатокарцином в фм-40 на возрасте частоту 22 возникновения месяцев у и размеры мышей-самцов СВА, предрасположенных к развитию данных опухолей. Из таблицы видно, что в контрольной группе опухоли выявлены у всех животных, т.е. частота возникновения опухолей составила 100%. Число опухолей на мышь составило 2,8 ± 0,5, а средний объём одной опухоли 393,6±102,3 мм3. При этом величина опухолевой массы в среднем у одного животного была равна 1120,2±350,5 мм3. 75 У животных 2 группы опухоли возникли реже - в 66,7% случаев. При этом количество гепатом на мышь (1,5 ± 0,4) и общий объём опухолевой массы у одного животного (378,9 ± 126,8 мм3) оказались достоверно ниже, чем в контроле (р1-2 = 0,03; p 1-2 = 0,04 соответственно). Однако средний объём одной опухоли в данном случае (258,4±71,3 мм3) не имел статистически значимых отличий от значений у контрольных мышей (р1-2 = 0,35). В третьей группе животных, которым сухой экстракт фм-40 вводили с шестимесячного возраста постнатального онтогенеза, частота опухолеобразования сравнима со второй группой (72,7%). Число опухолей на мышь (1,4 ± 0,4) снижено достоверно по сравнению с контрольными животными (р1-3 = 0,03). Вместе с тем средний объем одной гепатомы оказался уменьшенным (66,3±17,5 мм3) также значимо (р1-3 = 0,048) по сравнению с контрольной группой, как и общий объём опухолевой массы на мышь (90,4 ± 32,6 м3), который снизился статистически достоверно (р1-3 = 0,01). Таким образом, применение сухого экстракта фм-40 в раннем постнатальном онтогенезе, захватывая период завершения дифференцировки нормальной ткани печени, привело к снижению числа животных с опухолями и, соответственно, частоты возникновения наследственных гепатом на 33,3%, уменьшению числа опухолей и объема опухолевой массы на одного животного. Длительное применение сухого экстракта фм-40, начиная с 6 месячного возраста, периода возникновения первых спонтанных опухолей, и до естественной гибели животного, оказало аналогичное влияние. А именно число животных с опухолями и, соответственно, частота возникновения наследственных гепатом снизились на 27,3%. Также уменьшилось число опухолей и объем опухолевой массы на одного животного, а также средний объём одной опухоли. 76 Обсуждая полученные результаты, можно отметить, что при воздействии сухого экстракта комплексного фитоадаптогена фм-40, как и при влиянии жидкой формы препарата, наблюдали снижение уровня наследственного опухолеобразования у самцов высокораковой линии СВА. Иными словами, сухая форма фм-40, вероятно, обладает адгезиогенным действием, как и его водно-спиртовый вариант. Полученные результаты выявили, что применение сухой формы фм-40 в раннем онтогенезе может вызывать долговременное усиление тканевой интеграции, или взаимной адгезивности клеток ткани-мишени, в данном случае печени. Вместе с тем, очевидно, наблюдается повышение функциональной активности Т-лимфоцитов, что сопровождается ростом экспрессии молекул лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1 и снижением сывороточного уровня ИЛ-6 и ИЛ-10. В результате, в позднем онтогенезе определено снижение частоты спонтанных гепатокарцином (доли мышей с опухолями), а также числа и объёма опухолей у одного животного). При введении фитоадаптогена высокогепатомным мышам СВА кратковременно (в течение одного месяца) в другое время, минуя критический период завершения дифференцировки ткани печени, описанные эффекты реализуются не в полной мере. Применяя фитоадаптоген, например, только в период завершения полового созревания (в течение третьего месяца постнатального онтогенеза), совпадающего с окончанием увеличения абсолютной массы тимуса (завершением формирования главного органа клеточного иммунитета), а также в период образования первых опухолей (в течение восьмого месяца онтогенеза), долговременная коррекция тканевых и иммунных параметров не наблюдается. Кроме того, высокий уровень частоты наследственных опухолей печени, соответствующий интактным высокогепатомным самцам линии мышей СВА не изменяется. Однако средний размер опухолей в данном случае оказался меньшим, чем в контроле, что, по-видимому, 77 свидетельствует о задержке опухолевого роста даже при кратковременном повышении изучаемых характеристик [Бочарова О.А. и др., 1997]. Следует подчеркнуть, что в настоящей работе сухой экстракт фм-40 применяли в зрелом онтогенезе в течение всего периода роста опухолей (с 6ти мес до естественной гибели животных, т.е в течение минимум 17-20 мес), а не в течение одного месяца. В результате было выявлено, что у животных в возрасте 8 месяцев частота возникновения опухолей на мышь не отличалась от уровня контрольных животных. Вместе с тем в позднем онтогенезе у мышей данной группы наблюдали снижение частоты спонтанного опухолеобразования, так же как и во 2-й группе, примерно, на 30% по сравнению с контрольными животными. Число и общий объем опухолей на мышь в 3-й группе также оказался достоверно ниже по сравнению с не леченными животными. Можно полагать, что приём препарата в сухой форме на первых этапах образования опухолей (начиная с 6-го месяца постнатального онтогенеза), способствует эффективной элиминации опухолевых клеток иммунными эффекторами. Последнее лизис опухолевых клеток происходит, возможно, благодаря поддержанию подавления ускользания опухоли от иммунобиологического надзора, в том числе с помощью усиления экспрессии лейкоцитарных интегринов и связанной с этим инфильтрации и деструкции опухоли иммунными эффекторами. Иными словами, можно полагать, что коррекция ослабленной гомотипической адгезии (обусловливающей высокую наследственную предрасположенность ткани к опухолям) адгезиогенным препаратом в виде сухого экстракта в завершающий период ее дифференцировки вызывает долговременный эффект усиления тканевой интеграции. Последнее может способствовать коррекции экспрессии изученных лейкоцитарных интегринов и цитокинов, приводя к снижению частоты возникновения и размеров опухолей у экспериментальных животных. Кратковременное воздействие (в течение одного месяца) в любой другой период 78 постнатального онтогенеза, вероятно, не приводит к выраженному повышению взаимной адгезивности клеток печени, отсюда - лишь замедление роста опухолей без изменения частоты их возникновения. Долговременный (в течение многих месяцев) вариант применения адгезиогенного препарата в виде сухого экстракта, вероятно, всё же способствует поддержанию коррекции адгезивных взаимодействий на некотором уровне. В данном случае выявлены соответствующие изменения экспрессии изученных лейкоцитарных интегринов на иммунных эффекторах и сывороточного уровня определенных цитокинов. Следовательно, при этом возможно снижение процента мышей с гепатомами, торможение их роста и подавление общего объёма опухолей у одного животного. Усиление взаимной адгезивности клеток печени при подавлении сывороточного содержания ИЛ-6 и ИЛ-10 может нарушать защиту опухолевых клеток в том числе специфическими антителами, что, вероятно, связано с усилением экспрессии молекул гетеротипической адгезии (включая LFA-1, Mac-1, ICAM-1,-2,-3), обеспечивающих контактные взаимодействия иммунных эффекторов и клеток-мишеней [Eukaszewicz M. et al., 2007; Kim D. Et al., 2009]. Таким образом может быть обусловлено долговременное повышение иммунореактивности, которая, вероятно, приводит к гибели опухолевых клеток. В результате выявлено снижение интенсивности наследственного опухолеобразования при том и другом режиме применения адгезиогенного препарата в виде сухой формы. Следует подчеркнуть, что профилактические в отношении опухолей эффекты препаратов принято корректным выявлять либо при лечебном воздействии на предраковое заболевание, либо учитывая превентивное действие на спонтанное опухолеобразование у линейных животных. В наших предыдущих работах показан лечебный эффект водно-спиртовой формы фм40 в отношении предракового заболевания лейкоплакии слизистой оболочки полости рта [Бочарова О.А., Чекалина Т.Л. и др., 2003; Бочарова О.А., 79 Пожарицкая М.М. и др. 2004б)в)], а также его профилактическое действие в отношении спонтанного опухолеобразования у самцов высокораковой линии СВА [Бочарова О.А., Бочаров Е.В. и др., 2014б)]. Следовательно, с высокой долей вероятности можно утверждать, что фм-40 в виде сухого экстракта также обладает профилактическим действием в отношении опухолевых заболеваний. 80 Таблица 5 Изменение частоты возникновения и размеров спонтанных гепатом у мышей самцов линии СВА в возрасте 8 месяцев под воздействием сухого экстракта комплексного фитоадаптогена Число Группы мышей мышей в группе 1.Контроль 20 Число Число мышей с опухолями 3 (15,0%) опухолей/ мышь (M±m) 0,20 ± 0,10 Объем Объём одной опухолевой опухоли, массы/мышь мм3 мм3 (M±m) (M±m) 22,6±11,9 4,5±3,1 0 0 11,5 0,77±0,77 2.Прием фм-40 до1 15 0 0 мес 3. Прием фм-40 с 6- 20 1(5%) ти месс р1-2≥0,05 р р1-3≥0,1 р2-3≥0,1 0,05 ± 0,05 р1-2 = 0,15 р1-2=0,001 р1-2=0,21 р1-3 = 0,25 р1-3 = 0,70 р1-3 = 0,31 Р2-3= 0,37 р2-3= 0,33 р2-3 > 0,05 81 Таблица 6 Изменение частоты возникновения и размеров спонтанных гепатом у мышей самцов линии СВА в возрасте 22 месяца под воздействием сухого экстракта комплексного фитоадаптогена Число Группы мышей мышей в группе 1. Число мышей с опухолями Число Объем Объём опухолей/ одной опухолевой мышь опухоли, массы/мышь (M±m) мм3 мм3 13 13 (100%) 2,8 ± 0,5 393,6±102,3 1120,2±350,5 фм-40 до1 15 10(66,7%) 1,5 ± 0,4 258,4±71,3 378,9 ± 126,8 8 (72,7%) 1,4 ± 0,4 66,3±17,5 90,4 ± 32,6 Контроль 2. Прием мес 3. Прием фм-40 с 6- 11 ти месс р1-2 ≤0,001 р1-2 = 0,03 р р1-3 ≤0,001 р1-3=0,04 р2-3 ≥ 0,1 р2-3=0,84 р 1-2=0,35 р1-3=0,048 Р2-3=0,036 р 1-2 = 0,04 р1-3 = 0,01 Р2-3 = 0,07 82 3.4. Морфологическое исследование ткани печени высокораковых мышей в разных режимах применения сухого экстракта фитоадаптогена На данном этапе работы было проведено морфологическое исследование ткани печени мышей высокораковой линии СВА контрольной и опытных групп на разных этапах онтогенеза. На рисунке 1 в качестве примера представлен срез ткани печени контрольного животного в возрасте 4 месяцев. Как видно из рисунка, гепатоциты с характерными ядрами и цитоплазмой образуют печёночные балки. Такое строение свойственно нормальной печени. Вместе с тем, микроскопическое строение ткани печени животных опытных групп в возрасте 4 месяцев не отличалось от такового контрольных животных. У мышей всех групп в этом возрасте опухолей не было выявлено. На рисунке 2 в качестве примера представлен образец нормальной ткани печени животного 3-й группы в возрасте 8 месяцев. Срез ткани демонстрирует строение печени в норме: рисунок печеночных балок, наличие желчных капилляров. Подобное строение мы выявили у 85% животных этой группы. Аналогичный микроскопический рисунок печени мы наблюдали у всех мышей 2-й опытной группы и у 86,7% мышей контрольной группы, свидетельствующий об отсутствии признаков опухолевого процесса. Между тем, известно, что первые опухоли в печени самцов высокораковой линии СВА возникают в период, близкий к шестимесячному возрасту [Н.Н. Медведев, 1964]. В нашем эксперименте в контрольной группе мышей в возрасте 8 месяцев макроскопически и микроскопически опухоли были выявлены у 15% исследованных животных (см. таблицу 5). На рисунке 3 в качестве примера показан гистологический препарат печени с гепатокарциномой контрольного животного в возрасте 8 месяцев. На препарате видны полиморфные опухолевые клетки, образующие тяжи (трабекулы), практически печеночных балок. В лишь данном отдалённо похожие на структуры случае гистологически опухоль можно 83 оценить как умеренно-дифференцированную трабекулярную гепатокарциному. На рисунке 4 в качестве примера представлен гистологический препарат опухолевой ткани печени животного контрольной группы в возрасте 22 месяцев. В данном случае на срезе видны полиморфные опухолевые клетки с гиперхромными ядрами, расположенные в виде трабекул и характерных атипичных полостей (ацинусов). Увеличено соотношение «ядро-цитоплазма». В синусоидах между трабекулами и просветах ацинусов отмечаются эритроциты, муцинозное вещество или желчный пигмент. По своему строению наблюдаемая ткань далека от нормального морфологического наблюдается строения печени. низкодифференцированная В данном случае трабекулярно-ацинарная гепатокарцинома, т.е. опухоль смешанного строения. На рисунке гепатокарциномы 5 представлен гистологический препарат мыши в возрасте 22 месяцев из 2 группы, в которой животные получали сухой экстракт фм-40 в течение первого месяца постнатального инфильтрирована онтогенеза. массой Из рисунка активированных видно, что опухоль лимфоцитов, которые располагаются тяжами и группами. Наблюдаются также деструктивные элементы клеток опухоли. На рисунке 6 продемонстрирована ткань опухоли печени мыши линии СВА в возрасте 22 месяцев из 3-й группы, животные которой получали сухой экстракт фм-40 с шестимесячного возраста постнатального онтогенеза в лечебном режиме. Опухоль также можно оценить как трабекулярноацинарную гепатокарциному. Представленный участок гепатокарциномы инфильтрирован лимфоцитами, ткань опухоли также подвержена деструкции. Таким образом, у мышей линии СВА, предрасположенных к развитию спонтанных гепатокарцином, в возрасте 4 месяцев опухолей печени макрои микроскопически выявлено не было. 84 В возрасте 8 месяцев у контрольных мышей были выявлены опухоли трабекулярного строения умеренной степени дифференцировки, что, повидимому, указывает на процесс опухолеобразования в начальном периоде. В позднем онтогенезе (в возрасте 22 месяца) у мышей контрольной и опытных групп морфологически были выявлены более злокачественные опухоли, многие из которых достигали весьма больших размеров и являлись низкодифференцированными гепатокарциномами трабекуляно-ацинарного строения. У опытных мышей в отличие от контрольных животных в гепатокарциномах определена выраженная, вероятно активированными лимфоцитами, инфильтрация и деструкция опухолевой ткани. При этом у опытных животных наблюдали снижение частоты и размеров опухолей (см таблицу 6). Очевидно, что миграция в опухолевую ткань активированных лимфоцитов служит положительным прогностическим признаком опухолевого процесса. Активированные лимфоциты, нейтрофилы, NKклетки, которые являются клеточными составляющими противоопухолевого надзора, контактируют с клетками-мишенями, что может являться критическим фактором, который приводит в конечном итоге к гибели опухолевых клеток [Барышников А.Ю. и др., 2008; Chiou S. et al., 2005; Lu P. еt al., 2009; Sasada T. еt al., 2011]. Морфологические изменения в гепатокарциномах в результате профилактического и лечебного воздействия сухого экстракта комплексного фитоадаптогена сочетаются с полученными результатами о соответствующем повышении экспрессии лейкоцитарных интегринов на клетках крови и снижении сывороточного содержания ИЛ-6 и ИЛ-10 у мышей линии СВА. Действительно, по данным литературы, циркуляция, миграция и накопление лимфоцитов в опухолевом очаге могут быть обусловлены усилением экспрессии на эффекторах иммунитета молекул адгезии, в том числе лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1. Экспрессия последних 85 может быть индуцирована их лигандами (например, ICAM-1, -2, -3) на клетках-мишенях с помощью регуляторных реакций при участии цитокинов (ИЛ-6, -10, 12, ИФН-гамма, ФНО и др.) [Oble D. et al., 2009]. Таким образом, снижение уровня спонтанного опухолеобразования, наблюдаемое у мышей опытных групп, принимавших сухой экстракт комплексного фитоадаптогена, можно, вероятно, объяснить в том числе выраженной лимфоцитарной инфильтрацией и деструкцией опухолевых узлов, выявляемых при морфологическом анализе гепатокарцином. 86 Рисунок 1. Ткань печени самца линии СВА контрольной группы в возрасте 4 месяца (увеличение х 400, окраска гематоксилином и эозином). Рисунок 2. Ткань печени самца линии СВА группы 3 (применение сухого экстракта фм-40 в зрелом онтогенезе) в возрасте 8 месяцев (увеличение х 400, окраска гематоксилином и эозином). 87 Рисунок 3. Трабекулярная гепатокарцинома умеренной дифференцировки у животного контрольной группы в возрасте 8 месяцев (окраска гематоксилином и эозином, увеличение × 400) Рисунок 4. Трабекулярно-ацинарная гепатокарцинома низкой дифференцировки. Самец линии СВА контрольной группы в возрасте 22 месяца (окраска гематоксилином и эозином, увеличение × 400) 88 Рисунок 5. Трабекулярно-ацинарная гепатокарцинома низкой дифференцировки, инфильтрированная лимфоцитами. Самец линии СВА в возрасте 22 месяца из 2-й группы, получавший сухой экстракт фм-40 в раннем онтогенезе (окраска гематоксилином и эозином, увеличение × 400) Рисунок 6. Трабекулярно-ацинарная гепатокарцинома, инфильтрированная лимфоцитами. Самец линии мышей СВА в возрасте 22 месяцев, получавший сухой экстракт фм-40 в зрелом онтогенезе (окраска гематоксилином и эозином, увеличение × 400). 89 3.5. Иммунофенотипирование опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов гепатокарцином у высокораковых мышей, получавших сухой экстракт фитоадаптогена На рисунке 7 представлена иммуногистохимическая реакция с CD8 антигеном на лимфоцитах, инфильтрирующих трабекулярно-ацинарную гепатокарциному, самца линии мышей СВА 2-й группы в возрасте 22 мес, получавшего сухой экстракт фм-40 в течение 1-го месяца жизни. На рисунке 8 представлена иммуногистохимическая реакция с CD11a антигеном на лимфоцитах, инфильтрирующих трабекулярно-ацинарную гепатокарциному, самца линии мышей СВА 2 группы в возрасте 22 мес. На рисунке 9 представлена иммуногистохимическая реакция с CD11b антигеном на лимфоцитах, инфильтрирующих трабекулярно-ацинарную гепатокарциному, самца линии мышей СВА 2 группы в возрасте 22 мес. На рисунке 10 представлена иммуногистохимическая реакция с CD8 антигеном на лимфоцитах, инфильтрирующих трабекулярно-ацинарную гепатокарциному, самца линии мышей СВА 3 группы в возрасте 22 мес, получавшего сухой экстракт фм-40, начиная с 6-ти мес до естественной гибели животного. На рисунке 11 представлена иммуногистохимическая реакция с CD11a антигеном на лимфоцитах, инфильтрирующих трабекулярно-ацинарную гепатокарциному, самца линии мышей СВА 3 группы в возрасте 22 мес. На рисунке 12 представлена иммуногистохимическая реакция с CD11b антигеном на лимфоцитах, инфильтрирующих трабекулярно-ацинарную гепатокарциному, самца линии мышей СВА 3 группы в возрасте 22 мес. Как видно из представленных рисунков, в результате иммуногистохимического анализа стало ясно, что все исследуемые антигены были выявлены на лимфоцитах, которые мигрировали в гепатокарциномы мышей, получавших сухой экстракт фм-40 в обоих режимах введения. Таким образом, с высокой долей уверенности можно сделать вывод о том, что воздействие сухого экстракта комплексного фитоадаптогена в том и 90 другом режимах применения способствует инфильтрации опухолевых узлов цитотоксическими CD8+ лимфоцитами, что обеспечивается адгезионными механизмами с участием CD11a и CD11b лейкоцитарных интегринов. Очевидно, это имеет значение для подавления возникновения и прогрессии спонтанных гепатокарцином, а также, соответственно, улучшения выживаемости и соматического состояния животных. Обсуждая полученные результаты, можно указать, что как правило инфильтрация злокачественной опухоли цитотоксическими (CD8+) лимфоцитами считается положительным фактором, который связывают с хорошим прогнозом заболевания [van der Horst P., Wang Y. et al., 2012]. Однако, как показали исследования, такой вывод можно сделать не всегда. К сожалению, опухоли редко преодолевают ускользание от иммунологического надзора [Gooden M.J., de Bock G.H. et al., 2011]. Вместе с тем, иммунная система в состоянии подавить или усилить опухолевую прогрессию. Одни исследования демонстрируют, что опухоли, подвергшиеся инволюции, обильно инфильтрированы лейкоцитами (ОИЛ). Другие исследования показывают, что инфильтрация опухоли лейкоцитами сочетается с прогрессией опухолевого процесса и неблагоприятным прогнозом. Иными словами, полагают, что функции ОИЛ плейотропны и имеют как эффекторный, так и супрессорный потенциал [Gattinoni L., Powell D.J. et al., 2006; Smith M.J. et al., 2006; Sasada T., Suekane S., 2011]. ОИЛ могут быть клетками миелоидного ряда (гранулоциты, макрофаги, микрофаги, клетки-супрессоры миелоидного происхождения) и некоторыми другими группами лимфоцитов (Т, В, NK), каждая из которых по-разному влияет на опухолевую прогрессию. Результаты исследований на экспериментальных животных и в клинике показывают, что любая отдельная популяция лейкоцитов может быть связана с позитивным или негативным прогностическим фактором заболевания: стадийность, наличие метастазов, безрецидивная или общая выживаемость. Например, инфильтрация опухолей разного генеза миелоидными клетками и CD4 лимфоцитами (Тh2 фенотипа) в 91 основном связана с опухолевой прогрессией, в то время как присутствие CD8-лимфоцитов приводит к регрессии опухоли и сочетается с хорошим прогнозом. Однако следует подчеркнуть, что лишь небольшое число исследований показывает связь отдельных популяций ОИЛ с выживаемостью [Wesch D. et al. 2001; Lo Presti E. et al. 2014]. В частности, данные литературы указывают в пользу того, что CD4 (Th2) лимфоциты, мигрировавшие в опухоль, продуцируют ИЛ-17. Последний стимулирует продукцию проопухолевых и проангиогенных факторов VEGF, TGF-β, ИЛ-1β, -6, -8, -15 и -23 макрофагами и дендритными клетками, которые, в свою очередь, таким образом поддерживают дифференцировку CD4 (Th2) клеток, синтезирующих Ил-10, -17 и TGF-β. Круг замыкается. В конечном итоге, в опухоли развиваются сосуды. Опухолевые клетки получают дополнительный стимул к пролиферации, что усиливает метастазирование и прогрессию опухолевого процесса [Flavel R.A., Sanjaby S. et al., 2010; Wakita D., Sumida K., Iwakura Y. et al., 2010; Catalano V, Turdo A. et al., 2013]. В связи с вышеизложенным, можно полагать, что при подавлении указанных факторов, в том числе ИЛ-6 и -10, в результате, происходит нарушение инфильтрации опухоли СD4+лимфоцитами и макрофагами, а также снижение уровня иммуносупрессии и опухолевой прогрессии. Вместе с тем, действительно, главной целью противоопухолевой иммунотерапии является индукция реактивности СD8+ цитотоксических лимфоцитов. лимфоциты Опухоль должны дифференцировки инфильтрирующие обладать при (CD57+лимфоциты), цитотоксические этом конечной продуцировать (CD8+) степенью ИФН-гамма и высокий уровень порфирина. Эти события выявлены при ингибировании секреции опухолевыми клетками трансформирующих факторов роста, в частности, TGF-β и γ. Если все эти условия не соблюдаются, то клинический эффект подавления опухолевого процесса не наблюдают. [Beatty P.L., Cascio S., Lutz E., 2011]. 92 Учитывая приведенные данные литературы, а также полученные в нашей работе положительные клинические результаты подавления размеров и частоты возникновения гепатокарцином можно полагать, что мигрующие в опухоль цитотоксические CD8+ лимфоциты, экспрессирующие на своей поверхности молекулы гетеропитической адгезии лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1, обладают при этом конечной степенью дифференцировки (CD57+лимфоциты), а также продуцируют высокий уровень ИФН-гамма и порфирина. Вероятно, вместе с подавлением продукции таких цитокинов, как TGF-β и γ, а также ИЛ-6 и -10, это позволяет противоопухолевым реакциям иммунитета реализоваться в большей мере: миграция лимфоцитов и обязательный их контакт с клетками-мишенями, перфорирование мембран последних, введение токсических агентов и, в результате, наблюдаемая деструкция и гибель опухолевых клеток. Таким образом, можно полагать, что экспрессия лейкоцитарных интегринов, обеспечивающая адгезивные взаимодействия лимфоцитов и клеток опухоли, является существенным условием реализации иммунореактивности в цепочке событий, которые важны для ослабления механизмов ускользания опухоли иммунологического надзора и подавления опухолевого процесса. от 93 а) б) Рисунок 7. Иммуногистохимическая реакция с CD8 антигеном на лимфоцитах, инфильтрирующих трабекулярно-ацинарную гепатокарциному, самца линии мышей СВА 2 группы в возрасте 22 мес, получавшего сухой экстракт фм-40 в раннем онтогенезе: а – положительная реакция с CD8 антигеном на лимфоцитах, б – контрольный срез, не покрытый моноклональными антителами. а) б) Рисунок 8. Иммуногистохимическая реакция с CD11a антигеном на лимфоцитах, инфильтрирующих трабекулярно-ацинарную гепатокарциному, самца линии мышей СВА в возрасте 22 мес, получавшего сухой экстракт фм40 в раннем онтогенезе. а) – положительная реакция с CD11a-антигеном на лимфоцитах; б) – контрольный срез, не покрытый моноклональными антителами. 94 а) б) Рисунок 9. Иммуногистохимическая реакция с CD11b антигеном на лимфоцитах, инфильтрирующих трабекулярно-ацинарную гепатокарциному, самца линии мышей СВА в возрасте 22 мес, получавшего фм-40 в раннем онтогенезе: а) – положительная реакция с CD11b антигеном на лимфоцитах; б) – контрольный срез, не покрытый моноклональными антителами. а) б) Рисунок 10. Иммуногистохимическая реакция с CD8 антигеном на лимфоцитах, инфильтрирующих трабекулярно-ацинарную гепатокарциному, самца линии мышей СВА 3 группы в возрасте 22 мес, получавшего сухой экстракт фм-40 в зрелом онтогенезе: а) – положительная реакция с CD8 антигеном на лимфоцитах; б) – контрольный срез, не покрытый моноклональными антителами. 95 а) б) Рисунок 11. Иммуногистохимическая реакция с CD11a антигеном на лимфоцитах, инфильтрирующих трабекулярно-ацинарную гепатокарциному, самца линии мышей СВА 3 группы в возрасте 22 мес, получавшего сухой экстракт фм-40 в зрелом онтогенезе: а) – положительная реакция с CD11a антигеном на лимфоцитах; б) – контрольный срез, не покрытый моноклональными антителами. а) б) Рисунок 12. Иммуногистохимическая реакция с CD11b антигеном на лимфоцитах, инфильтрирующих трабекулярно-ацинарную гепатокарциному, самца линии мышей СВА 3 группы в возрасте 22 мес, получавшего сухой экстракт фм-40 в зрелом онтогенезе: а) – положительная реакция с CD11b антигеном на лимфоцитах; б) контрольный срез, не покрытый моноклональными антителами. 96 3.6. Изучение воздействия сухой формы фитоадаптогена на качество жизни и продолжительность жизни мышей с высокой частотой спонтанного опухолеобразования Качество жизни мышей высокораковой линии СВА контрольной группы, а также опытных групп, получавших сухой экстракт комплексного фитоадаптогена в двух режимах введения, оценивали по весу животных и состоянию шёрстного покрова. Контрольное взвешивание мышей проводили в возрасте 4, 8 и 22 месяцев (таблица 7). Как видно из таблицы, в возрасте 4 мес у животных всех групп вес тела практически одинаковый (30,0 ± 0,2 г; 31,0 ± 0,4 г и 30,5 ± 0,5 г соответственно; р1-2= 0,1; р1-3= 0,6). В возрасте 8 мес у животных всех групп наблюдали достоверное увеличение веса тела. В позднем онтогенезе (в возрасте 22 мес) средний вес животных контрольной группы снизился до 27,9 ± 0,4 г; р8-22=0,0003), в то время как средний вес животных опытных групп не изменился по сравнению с результатами взвешивания в 8 месяцев. Полученные результаты свидетельствуют о том, что у животных контрольной группы, не получавших сухой экстракт фитоадаптогена, в той или иной степени выражены кахектические явления, что, очевидно, связано с возрастными изменениями и наличием опухолевого процесса у 100% животных этой группы. Вместе с тем, у мышей контрольной группы выявлено увеличение в сыворотке крови содержания интерлейкинов -6 и -10, участвующих в патогенезе кахексии, в частности, способствуя повышению сывороточного уровня С-реактивного белка и расщеплению мышечных белков [Krzystek-Korpaska M. et al., 2008; Deans D. et al., 2009]. У животных опытных групп сохранение стабильного веса и отсутствие кахектических явлений сочеталось с уменьшением сывороточного уровня ИЛ-6 и ИЛ-10. Вероятно, сухой экстракт фм-40 при обоих режимах введения уменьшает воспалительную реакцию и препятствует распаду белков и, соответственно, потере мышечной массы. 97 Шерстный покров у животных обеих опытных групп был полноценным. В то же время у мышей контрольной группы в 18% случаев отмечались признаки алопеций (рисунок 13). Полноценный шерстный покров мышей опытных групп сочетался со снижением сывороточного уровня ИЛ-6. Последнее может препятствовать потере шерсти в результате стимуляции функциональной активности волосяных фолликулов при подавлении воспалительного процесса в кожном покрове [Biswas S. et al., 2001; Yu M., 2008]. На рисунке 14 представлен внешний вид самца контрольной группы в возрасте 23 месяцев. Как видно на фотографии, шерстный покров животного имеет участки алопеций с признаками седины. Основная масса животных контрольной группы в позднем онтогенезе имели аналогичный внешний вид. На рисунках 15 и 16 в качестве примера представлены животные опытных групп. Как видно на фотографиях, животные имеют полноценный шерстный покров без признаков седины. Следует отметить, что на рис. 16 показан один из двух самцов, которые прожили 36 месяцев. Похожее состояние шерстного покрова без дефектов мы наблюдали и у других опытных мышей. Таким образом, у мышей контрольной группы в позднем онтогенезе было отмечено снижение веса, а также в 17% случаев – нарушение шерстного покрова и наличие признаков алопеции. У животных опытных групп при сохранении стабильного веса признаков алопеции отмечено не было. При этом продолжительность жизни опытных мышей, получавших сухой экстракт комплексного фитоадаптогена в разных режимах, была выше. 98 Таблица 7 Вес мышей высокораковой линии СВА контрольной и опытных групп в разные периоды онтогенеза Вес мышей (г) Группы р 4 мес 8 мес 22 мес 30,0 ± 0,2 32 ± 0,6 27,9 ± 0,4 1. Контрольная р8-22=0,0003 2. Прием фм- 31,0 ± 0,4 40 в течение 1 мес постнатального развития 3. Прием фм- 30,5 ± 0,5 33,2 ± 0,6 33,8 ± 0,3 р4-8=0,03 р8-22=0,3 32,4 ± 0,6 33,5 ± 0,6 40 с 6 мес р р4-8=0,03 р4-8=0,02 р8-22=0,2 р1-2=0,1 р1-2=0,08 р1-2=0,0001 р1-3= 0,6 р1-3= 0,4 р1-3= 0,0001 ФМ с 6 мес (n=10) ФМ с 1-мес (n=13) Контроль (n=13) 20% Без алопеции С признаками алопеции Рисунок 13. Состояние шерстного покрова мышей СВА контрольной и опытных групп в позднем онтогенезе (в возрасте 22 месяцев) 99 Рисунок 14. Внешний вид самца контрольной группы в возрасте 23 мес. (20% мышей с признаками алопеции) Рисунок 15. Внешний вид самца опытной группы 2 в возрасте 33 мес. (100% животных без признаков алопеции) Рисунок 16. Внешний вид самца опытной группы 3 в возрасте 36 мес. 100 В таблице 8 представлены результаты определения выживаемости высокораковых мышей линии СВА при разных схемах введения сухого экстракта фм-40. Из таблицы следует, что средняя продолжительность жизни мышей контрольной группы составила 665,0±20,1 дней (22,1±0,7 месяца). Во 2-й группе при введении комплексного фитоадаптогена в форме сухого экстракта в профилактическом режиме (примерно, за пять месяцев до возникновения гепатом) выживаемость животных увеличилась до 778,6±19,1 дней (25,6±0,4 месяцев, р1-2< 0,001). Таким образом, разница в выживаемости мышей между первой и второй группой оказалась 113 дней. В 3-й группе при введении препарата с шестимесячного возраста и на протяжении дальнейшего онтогенеза) выживаемость мышей повысилась до 811,5±26,8 дней (26,7±0,9 месяцев, р1-3< 0,001). Следовательно, мыши 3-ей группы жили более длительно, по сравнению с контрольной группой на 146 дней. На рисунке 17 представлены кривые выживаемости мышей-самцов линии СВА при разных схемах введения сухого экстракта комплексного фитоадаптогена фм-40. На основании построенных (по методу КапланМейера) графиков, следует, что медиана выживаемости животных контрольной группы составила 617,0 дней (20,5 месяцев). Этот же показатель в опытных группах равен 760,0 дней (2-я группа) и 805,0 дней (3-я группа), или 25,3 и 26,8 мес соответственно. Таким образом, разница по этому показателю между 1-й и 2-й группой составляет 143 дня, в то время как между 1-й и 3-ей – 188 дней. Вместе с тем, следует указать, что самый высокий показатель выживаемости во 2-й группе (1 мышь) составил 1001 день (33мес). В 3 группе самый высокий показатель выживаемости отмечен у 2 животных – 1094 дня (36 мес). В контрольной группе ни одно животное не пережило 1000 дней. Максимальная продолжительность жизни в контроле выявлена у 2 мышей - 990 дней (32 мес). Самая низкая выживаемость в контрольной группе составила 410 дней (14 мес, 11 дней). В опытных группах 2 и 3 самая 101 низкая выживаемость была зафиксирована на уровне 570 дней (19 мес) и 547 дней (18 мес) соответственно. Как видно из представленных результатов, показатели продолжительности жизни в опытных группах 2 и 3, так же как и медианы выживаемости, значимо превосходят таковые в контроле. Таким образом, продолжительность жизни мышей, наследственно предрасположенных к возникновению гепатом, в среднем не достигает двухлетнетнего возраста. Выживаемость высокогепатомных кратковременному в раннем животных, подверженных и долговременному в зрелом онтогенезе воздействию комплексным фитоадаптогеном в сухой форме достоверно превышает таковую у мышей без применения препарата. Оба режима использования сухого экстракта комплексного фитоадаптогена способствует удлинению жизни экспериментальных мышей практически на 113 дней (более 3 мес) и 146 дней (более 4 мес) соответственно. Между тем, если сравнивать эффекты разных режимов воздействия препарата по медиане выживаемости, то последняя при использовании препарата в течение 1-го мес раннего онтогенеза превышает контрольную величину на 143 дней (около 5 мес), в то время как при воздействии в зрелом онтогенезе – на 188 дней (примерно на 6 мес). Вместе с тем во 2-й группе 1 мышь (2,7%) прожила 1001 день (33 мес). При этом у самца выявили 1 гепатому объемом 520 мм3. В 3-й группе 7 мышей (17,1%), принимавших сухой экстракт, прожили больше 1000 дней, что в среднем составило 1076±17,5 дня (около 35 мес), что соответствует примерно 99 человеческим годам. Рекорд по долгожительству при этом побили 2 самца, прожившие 1094 дня (36 мес, или 3 года), что соответствует 102-м человеческим годам. У этих самцов наблюдали по одной опухоли объемом 260,0 и 28,1 мм3. Таким образом, в данной работе получены результаты увеличения продолжительности жизни у высокораковых мышей-самцов на 17% при 102 введении сухого экстракта фм-40 в раннем онтогенезе и на 22% при введении препарата в зрелом онтогенезе. Эти результаты, вероятно, имеют существенное значение, учитывая тот факт, что при этом выявлен противоопухолевый эффект. Сопоставляя полученные результаты по увеличению продолжительности жизни экспериментальных мышей с данными других исследователей, можно отметить их значимость. В частности, щитовидной железы, генетическая модификация ферментов поджелудочной гормонов железы, гипофиза, рецепторов инсулина, гормона роста привела в созданию уникальных мышей (в единственном числе), которые прожили соответственно около 4-х лет (мышь Yoda) [Ladiges W. et all., 2009], свыше 4-х лет (1551 день, мышь Чарли) и 1819 дней (последняя не дожила 6 дней до своего пятилетия) [Bartke A., 2007; Jiang H. et all., 2008]. В основном большинстве исследователи пытаются продлить жизнь мышам, используя низкокалорийную диету. Так, с помощью ограничения калорийности питания американские ученые добились замедления процессов старения у группы лабораторных мышей. Шестеро из них прожили в среднем 1356 дней (примерно 3,5 года) при хорошем качестве жизни, что особенно подчеркивается [Schumacher B. et all., 2008]. Однако в этих исследованиях продление жизни зафиксировано у мышей без опухолевых патологий [Blagosklonny М. et all., 2009]. Вместе с тем нашей работе ближе результаты, полученные при введении скрещенным инбредным мышам (С57Bl/6×BALB/c) антибиотика рапамицина. Рапамицин, введенный в пищу мышам, начиная с возраста 270 и 600 дней, приводил к увеличению выживаемости на 14% у самок и 9% у самцов, замедляя рост опухолей, процессы старения, либо то и другое у мышей, предрасположенных к развитию опухолей. Рапамицмн – антибиотик, синтезируемый почвенной бактерией Streptomyces hygroscopicus. Известно, что рапамицин и низкокалорийная диета подавляет TOR-сигнальный путь, в том числе рапамицин-киназу и увеличивает таким образом выживаемость 103 беспозвоночных, включая дрожжи, нематоды и дрозофилы. Низкокалорийная диета для продления жизни может применяться только, начиная с раннего онтогенеза. Иначе выживаемость не увеличивается. Низкокалорийная диета также вызывает снижение веса животного. Рапамицин может продлевать жизнь без снижения веса животных, если его применять и в среднем и в позднем онтогенезе. Однако рапамицин имеет побочные эффекты, являясь иммуносупрессором. Следовательно, испытания рапамицина на человеческом контингенте практически не возможны [Harrisson D. et all., 2009; Miller R.A., Harrison D.E. et al., 2011]. Мы продемонстрировали, что сухая форма нетоксичного и неканцерогенного комплексного фитоадаптогена, применяемого с питьевой водой в раннем, среднем и позднем онтогенезе, увеличивала выживаемость мышей, повышала вес животных и вызывала иммуномодулирующий эффект, не обладая побочными эффектами. Это отличает наши результаты от таковых с рапамицином и низкокалорийной диетой. Поэтому полученные результаты значимы для обсуждения механизмов противоопухолевых и геропротекторных эффектов препарата, а также для дальнейших исследований его использования для лечения и профилактики возрастных заболеваний у людей. 104 Таблица 8 Выживаемость высокораковых мышей линии СВА при разных схемах введения сухого экстракта комплексного фитоадаптогена Группы 1. Контрольная Кол-во мышей 61 2. Прием фм40 в течение 36 1-го мес 3. Прием фм40 с 6 мес р 41 Продолжительнос Медиана Выживае- ть жизни (M±m), выживаемос мость (%) дни (мес) 665,0±20,1 (22,1±0,7) 778,6±19,1 (25,6±0,4) 811,5±26,8 (26,6±0,9) ти (мес) > 1000 дней 617,0(20,5) 0 1001 760,0 (25,3) (2,7%), n=1 1076±17,5 805,0 (26,8) (17,1%), n=7 р1-2 < 0,001 р1-2 = 0,015 р1-3 < 0,001 р1-3 < 0,001 р2-3 = 0,33 р2-3 = 0,08 105 Выживаемость мышей 1 2 3 120% 110% 100% Выживаемость, % 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% -10% 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 ДНИ Рисунок 17. Кривые выживаемости (по Каплан-Мейеру) контрольной и опытных групп высокораковой линии СВА (р = 0,001) мышей 106 3.7. Воздействие сухого экстракта фитоадаптогена в разных режимах применения на концентрацию тестостерона и кортикостерона в сыворотке крови мышей высокораковой линии СВА. Результаты определения концентрации одного из основных анаболических гормонов, тестостерона, в сыворотке крови у мышей высокораковой линии CВА в разные периоды онтогенеза на фоне двух режимов введения сухого экстракта фм-40 представлены в таблице 9. Из таблицы видно, что в возрасте 4-х месяцев у животных всех трех групп концентрация тестостерона в крови статистически не различалась (р≥0,05). В процессе онтогенеза наблюдалось постепенное уменьшение значений данного показателя. Так, к 22 месяцам у мышей контрольной группы уровень тестостерона снизился с 2,60,3 до 0,30,1 нг/мл, р8-22=0,002 (примерно в 9 раз). При этом у мышей 2-й группы содержание данного гормона упало с 3,60,4 до 0,80,1 1 нг/мл, р8-22=0,002 (примерно в 5 раз). У мышей 3-й группы показатель уменьшился с 2,60,2 до 1,80,2 1 нг/мл, р822=0,002 (примерно в 1,5 раза). Вместе с тем уже в возрасте 8 месяцев отмечено отставание значения концентрации тестостерона у мышей контрольной группы (1,60,4 нг/мл) по сравнению с показателями во 2-й, профилактической, и 3-й, лечебной, опытных группах (2,80,2 и 3,10,3 нг/мл соответственно, р1-2, р1-3=0,01. В позднем онтогенезе это отставание становится более ярко выражено. В контрольной группе концентрация тестостерона составила 0,30,1 нг/мл, во 2й - 0,80,1 нг/мл (р1-2=0,001), в 3-ей - 1,80,2 нг/мл (р1-3=0,0001). При этом у мышей 3 группы, получавших сухой экстракт долговременно курсами, начиная с 6-ти месячного возраста, уровень гормона в позднем онтогенезе был статистически достоверно выше и по сравнению с результатами во 2, профилактической, группе (р2-3=0,0004). 107 В таблице 10 представлены результаты определения концентрации стресс-гормона кортикостерона в сыворотке крови у мышей высокораковой линии CВА в разные периоды онтогенеза на фоне разных режимов воздействия сухого экстракта фм-40. Из таблицы видно, что в раннем онтогенезе у мышей всех групп концентрация кортикостерона в сыворотке крови не различалась (р≥0,07). У мышей контрольной группы с увеличением возраста отмечено постепенное нарастание концентрации этого гормона в крови. Так, к 8 месячному возрасту значение данного показателя статистически достоверно повысилось с 75,61,7 до 96,57,2 нг/мл, р4-8=0,01, к 22 месячному возрасту – до 140,04,5 нг/мл, р8-22=0,0002. У мышей опытных групп к 8 месячному возрасту отмечалась лишь тенденция к увеличению значений данного показателя (р4-8=0,05). В позднем онтогенезе у мышей 2 группы отмечено достоверное повышение концентрации кортикостерона до 105,01,9 нг/мл (р8-22=0,0002). Вместе с тем это значение отстает от такового в контроле (р1-2=0,0002). У мышей 3 группы, получавших препарат длительно, в позднем онтогенезе отмечено снижение концентрации гормона с 81,33,9 до 60,52,4, р8-22=0,0002. Отставание значения данного показателя также достоверно и по сравнению со значениями в других группах в этот же период. Представленные результаты показывают, что у мышей самцов линии СВА в процессе онтогенеза выявлено уменьшение в крови концентрации тестостерона. Это явление закономерно, поскольку известно, что процесс старения организма самца сопровождается постепенным снижением уровня данного гормона. Вместе с тем в результате исследования выявлено увеличение в крови мышей концентрации стрессового гормона кортикостерона, который по определению относят к гормонам старения. Полученные результаты на примере двух гормонов – анаболического тестостерона и катаболического кортикостерона – могут свидетельствовать о нарушении гормонального баланса и усилении катаболических процессов в 108 тканях, в частности в лимфоидных органах. Гормональный дисбаланс приводит к нарушениям реакций иммунной системы, которая, наряду с нервной и эндокринной системами, поддерживает гомеостаз организма. Косвенным показателем низкой иммунореактивности у мышей линии СВА при спонтанном гепатоканцерогенезе является выявленное снижение экспрессии молекул лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1 на эффекторах иммунитета, а также повышение сывороточного уровня интерлейкинов 6 и 10. Этим может быть обусловлена недостаточная активность Т-, цитотоксических лимфоцитов, NK-клеток. Вместе с тем, процесс опухолеобразования представляется как хронический стресс, сопровождающийся выбросом кортикостерона в кровь. Действительно, у животных контрольной группы к 22 месячному возрасту концентрация кортикостерона в крови повысилась практически вдвое. Из литературы известно, например, что индуцирует апоптоз лимфоцитов повышенный крови, уровень кортизола вызывая подавление иммунореактивности организма [Сепиашвили Р.И., Балмасова И.П., 2005]. Выявленный гиперкортицизм, очевидно, является отрицательным фактором, способствующий образованию и развитию спонтанных гепатокарцином. Применение сухого экстракта фм-40 оказало в той или иной степени выраженный гормономодулирующий эффект. В отношении анаболического гормона тестостерона кратковременное и длительное воздействие препарата предотвращало возрастное снижение гормона в процессе онтогенеза животных. В отношении катаболического гормона кортикостерона препарат способствовал подавлению возрастающего в онтогенезе параметра. Наиболее выраженный эффект падения кортикостерона наблюдали при длительном применении препарата, начиная с 6 месячного возраста и до естественной гибели организма. Вместе с тем, гормономодулирующий эффект сопровождался повышением иммунореактивности организма, связанной с усилением экспрессии лейкоцитарных интегринов, нормализацией уровня интерлейкинов 6 и 10, инфильтрацией и деструкцией лимфоцитами 109 гепатокарцином, а также подавлением их частоты образования. В результате, гормономодулирующее действие сухого экстракта фитоадаптогена сочетается с увеличением продолжительности жизни опытных животных, проявляя геропротекторный эффект. Последний может быть связан как с противоопухолевым влиянием препарата, так и с регуляцией механизмов старения. 110 Таблица 9 Результаты разных режимов воздействия сухого экстракта фитомикса40 на концентрацию тестостерона в сыворотке крови у мышей высокораковой линии CВА Группы Тестостерон (нг/мл) 4 мес. 8 мес. 22 мес. р р4-8=0,05 1.Контроль 2,60,3 1,60,4 0,30,1 р8-22=0,002 Р4-22=0,002 2. Прием сухого экстракта фм-40 в течение 1-го р4-8=0,08 3,60,4 2,80,2 0,80,1 Р4-22=0,002 мес 3. Прием сухого экстракта фм-40, 2,60,2 начиная с 6-го Р4-8=0,24 3,10,3 1,80,2 р8-22=0,002 Р4-22=0,01 мес р р8-22=0,002 р1-2=0,07 р1-2=0,01 р1-2=0,001 р1-3=0,2 р1-3=0,01 р1-3=0,0001 р2-3=0,05 Р2-3=0,40 р2-3=0,0004 111 Таблица 10 Результаты разных режимов воздействия сухого экстракта фитомикса-40 на концентрацию кортикостерона в сыворотке крови у мышей высокораковой линии CВА Кортикостерон (нг/мл) Группы 4 мес. 8 мес. 22 мес. р р4-8=0,01 1.Контроль 75,61,7 96,57,2 140,04,5 р8-22=0,0002 Р4-22=0,0002 2. Прием сухого экстракта фм-40 в течение 1-го р4-8=0,05 69,22,9 79,13,6 105,01,9 Р4-22=0,0002 мес 3. Прием сухого экстракта фм-40, 70,93,8 начиная с 6-го Р4-8=0,05 81,33,9 60,52,4 р8-22=0,0002 Р4-22=0,0002 мес р р8-22=0,0002 р1-2=0,07 р1-2=0,05 р1-2=0,0002 р1-3=0,27 р1-3=0,06 р1-3=0,0002 р2-3= 0,72 Р2-3=0,65 Р2-3=0,0002 112 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Результаты работы показали, что эффективность воздействия сухого экстракта фм-40 на уровень экспрессии лейкоцитарных интегринов сравнима с таковой для жидкой формы фитоадаптогена, выявленной в предыдущем исследовании [Бочарова О.А. и др., 2012; 2013]. Учитывая, что контррецепторами молекулы LFA-1 являются молекулы межклеточной адгезии ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3 (которые могут находиться на опухолевых клетках), можно полагать, что увеличение количества лимфоцитов, экспрессирующих лейкоцитарный интегрин CD11a, под воздействием сухой формы фитоадаптогена способствует более высокой иммунореактивности таких животных в осуществлении киллинга клетокмишеней эффекторами иммунитета (NK-клетками, цитотоксическими лимфоцитами) [Maksan S. M. et al., 2004]. Вместе с тем, молекула Mac-1 экспрессируется также на нейтрофилах, лимфоцитах и NK-клетках, являясь лигандом в том числе ICAM-1. Поэтому, аналогичные рассуждения уместны и в отношении повышенного уровня экспрессии CD11b антигена у мышей обоих опытных групп по сравнению с контрольными животными под воздействием сухого экстракта фм-40. В данном случае эффекторов также возможна инфильтрировать активация опухоль, способности контактировать с иммунных клетками- мишенями, что помогает гибели последних. На основании предшествующих и настоящих исследований можно полагать, что у мышей при спонтанном гепатоканцерогенезе сниженная активность Т-лимфоцитов обусловлена в том числе недостатком экспрессии молекул лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1 на эффекторах иммунитета. Сухая форма фитоадаптогена, обладающая, как выявлено, адгезиогенным действием, способна нормализовать обозначенные показатели. Таким образом, при высокогепатомным мышам введении сухой кратковременно в формы раннем препарата постнатальном 113 онтогенезе, включая завершающий период дифференцировки нормальной ткани печени (5-15 день постнатального развития) можно обеспечить длительный по времени эффект повышения экспрессии на клетках крови молекул лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1. Долговременное применение сухой формы фитоадаптогена, начиная с 6 месяцев, периода возникновения опухолей, и до естественной гибели животных, может приводить к аналогичным результатам. Очевидно, курсовое введение адгезиогенного препарата в сухой форме в течение длительного времени способствует поддержанию экспрессии молекул, обеспечивающих контактные взаимодействия между эффекторами иммунитета и клеткамимишенями. Применение комплексного фитоадаптогена в сухой форме в обоих опытных группах также выявило долговременное снижение уровня сывороточного содержания ИЛ-6 и ИЛ-10, которое сопровождается увеличением экспрессии лейкоцитрных интегринов LFA-1 и Mac-1 клетками крови опытных мышей. Следует отметить, что в данном случае, вероятно, подавляется ингибирование экспрессии молекул адгезии ICAM-1 на клетках-мишенях и усиленное образование противоопухолевых антител (блокирующих антигены опухолевых клеток и, следовательно, рецепторы эффекторов иммунитета). В результате, нарушается ускользание опухолевых клеток от иммунологического надзора [Danese S., Semeraro S. еt al., 2005]. Таким образом, комплексный фитоадаптоген в сухой форме может принимать участие в регуляции содержания ИЛ-6 и -10 при спонтанном гепатоканцерогенезе высокораковой линии СВА. Вместе с тем, может происходить «высвобождение» (рост) экспрессии лейкоцитарных интегринов (в том числе LFA-1 и Mac-1), миграция, накопление лимфоцитов в патологическом очаге и обеспечение контакта эффекторов иммунитета с клетками-мишенями. При этом, во-первых, в клетки опухоли активно проникают факторы разрушения, в том числе 114 протеиназы, лимфотоксины и реактивные интермедиаты кислорода, азота, водорода (ОН, О2, Н2О2, NO). Во-вторых, может происходить несекреторный лизис опухолевых клеток при активации на них FasAPO1, или CD95-антигена (члена семейства ФНО) – рецептора апоптоза, запускающего механизм «самоубийтва» клетки. В этом процессе участвуют каспазы (цистеин/аспартат протеиназы), которые расщепляют клеточные белки, что, в конечном итоге, приводит к фрагментации ДНК и гибели клетки. Все эти процессы могут иметь значение при восстановлении иммунореактивности в отношении опухолевых клеток при новообразованиях [ Kovalovich K. Et al., 2001; Narimatsu M. еt al., 2001]. Действительно, гепатокарцином результаты трабекулярного и иммуногистохимического анализа трабекулярно-ацинарного строения умеренной и низкой дифференцировки показали, что воздействие сухого экстракта комплексного фитоадаптогена в разных режимах способствует инфильтрации опухолевых узлов цитотоксическими CD8+ лимфоцитами, что обеспечивается в том числе адгезионными механизмами с участием CD11a и CD11b лейкоцитарных интегринов, которые также были выявлены на лимфоцитах, мигрировавших в гепатокарциномы опытных мышей. Как правило инфильтрация злокачественной опухоли цитотоксическими CD8+ лимфоцитами считается положительным фактором, который связывают с хорошим прогнозом заболевания [van der Horst PH, Wang Y et al., 2012]. Однако, как показали исследования, такой вывод можно сделать не всегда. К сожалению, опухоли редко преодолевают ускользание от иммунологического надзора [Gooden M.J., de Bock G.H. et al., 2011]. Вместе с тем, иммунная система в состоянии подавить или усилить опухолевую прогрессию. Иными словами, функции ОИЛ плейотропны и имеют как эффекторный, так и супрессорный потенциал [Sasada T., Suekane S., 2011; Smith M.J. et al., 2006; Gattinoni L., Powell D.J. et al., 2006]. 115 Например, инфильтрация опухолей разного генеза миелоидными клетками и CD4 лимфоцитами (Тh2 фенотипа) в основном связана с опухолевой прогрессией, в то время как присутствие CD8+лимфоцитов приводит к регрессии опухоли и сочетается с хорошим прогнозом. Вместе с тем, следует подчеркнуть, что лишь небольшое число исследований выявляет связь отдельных популяций ОИЛ с выживаемостью [Lo Presti E., Dieli F. et al., 2014; Wesch D. et al., 2001]. Действительно, мигрировавшие CD4+лимфоциты, в опухоль, продуцируют ИЛ-17. Последний стимулирует продукцию проопухолевых и проангиогенных факторов VEGF, TGF-β, ИЛ-1β , -6, -8, -15 и -23 макрофагами и дендритными клетками, которые, в свою очередь, таким образом поддерживают дифференцировку (поляризацию) CD4 клеток, синтезирующих Ил-10, -17 и TGF-β. Круг замыкается. В результате, происходит васкуляризация опухоли, а опухолевые клетки получают дополнительный стимул к пролиферации, что усиливает злокачественный рост [Catalano V., Turdo A. et al., 2013; Flavel R.A., Sanjaby S. et al., 2010; Wakita D., Sumida K. Et al., 2010]. Можно полагать, что при подавлении указанных факторов, в том числе ИЛ-6 и -10, в результате, может происходить нарушение инфильтрации опухоли СD4+лимфоцитами и макрофагами, а также снижение уровня иммуносупрессии и опухолевой прогрессии. Вместе с тем, действительно, главной целью противоопухолевой иммунотерапии является индукция реактивности СD8+ цитотоксических лимфоцитов. лимфоциты Опухоль должны дифференцировки инфильтрирующие обладать при (CD57+лимфоциты), цитотоксические этом конечной продуцировать (CD8+) степенью ИФН-гамма и высокий уровень порфирина. Эти события выявлены при ингибировании секреции опухолевыми клетками трансформирующих факторов роста, в частности, TGF- β и γ. Если все эти условия не соблюдаются, то клинический 116 эффект подавления опухолевого процесса не наблюдают [Beatty P.L., Cascio S., Lutz E., 2011]. Учитывая данные литературы, а также полученные в нашей работе положительные клинические результаты подавления размеров и частоты возникновения гепатокарцином, можно полагать, что мигрующие в опухоль цитотоксические CD8+лимфоциты, экспрессирующие на своей поверхности молекулы гетеропитической адгезии лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1, обладают при этом конечной степенью дифференцировки (CD57+лимфоциты), а также продуцируют высокий уровень ИФН-гамма и порфирина. Вероятно, вместе с подавлением продукции таких цитокинов, как TGF-β и γ, а также ИЛ-6 и -10, это позволяет противоопухолевым реакциям иммунитета реализоваться в большей мере: миграция лимфоцитов и обязательный их контакт с клетками-мишенями, перфорирование мембран последних, введение токсических агентов и, в результате, наблюдаемая деструкция и гибель опухолевых клеток. Таким образом, экспрессия лейкоцитарных интегринов, обеспечивающая адгезивные взаимодействия лимфоцитов и клеток опухоли, вероятно, является существенным условием реализации иммунореактивности в цепочке событий, которые важны для ослабления механизмов ускользания опухоли от иммунологического надзора и замедления злокачественного роста. Очевидно, это имеет значение для подавления возникновения и прогрессии спонтанных гепатокарцином, а также, соответственно, улучшения выживаемости и соматического состояния животных. Действительно, при воздействии сухого экстракта комплексного фитоадаптогена фм-40, как и при влиянии жидкой формы препарата, наблюдали снижение уровня наследственного опухолеобразования у самцов высокораковой линии СВА. А именно, кратковременное применение сухого экстракта фм-40, захватывая период завершения дифференцировки нормальной ткани печени, привело к снижению числа животных с опухолями и, соответственно, 117 частоты возникновения наследственных гепатом на 33,3% по сравнению с контрольными животными, уменьшению числа опухолей и объема опухолевой массы у одного животного. Длительное применение сухого экстракта фитоадаптогена, начиная с 6 месячного возраста, периода возникновения первых спонтанных опухолей, и до естественной гибели животного, оказало аналогичное влияние. А именно число животных с опухолями и, соответственно, частота возникновения наследственных гепатом снизились на 27,3%. Также уменьшилось число опухолей и объем опухолевой массы у одного животного, а также средний объём одной опухоли. В результате, в данной работе получено увеличение продолжительности жизни высокораковых мышей-самцов на 17% при кратковременном применение сухого экстракта фм-40 в раннем постнатальном онтогенезе и на 22% при длительном применение сухого экстракта фитоадаптогена, начиная с 6 месячного возраста и до естественной гибели животного. При кратковременном введении препарата в раннем онтогенезе рекордсменом по долгожительству был самец, который прожил 1001 день (33 мес). При длительном воздействии фм-40 7 мышей прожили больше 1000 дней, из них двое животных прожили 1094 дня (36 мес, или 3 года), что соответствует продолжительности жизни человека, равной 102 годам. Эти результаты, вероятно, имеют существенное значение, учитывая тот факт, что при этом выявлен противоопухолевый эффект. К тому же, с одной стороны, у мышей самцов линии СВА в процессе онтогенеза выявлено уменьшение в крови концентрации тестостерона. Это явление закономерно, поскольку известно, что процесс старения организма самца сопровождается постепенным снижением уровня данного гормона (гормона молодости). С другой стороны, показано увеличение в крови мышей концентрации стрессового гормона кортикостерона, который по определению относят к гормонам старения. Полученные результаты на примере двух 118 гормонов – анаболического тестостерона и катаболического кортикостерона – могут свидетельствовать о нарушении гормонального баланса и усилении катаболических процессов в тканях, в частности в лимфоидных органах. Гормональный дисбаланс приводит к нарушениям реакций иммунной системы, которая, наряду с нервной и эндокринной системами, поддерживает гомеостаз организма. Косвенным показателем низкой иммунореактивности у мышей линии СВА при спонтанном гепатоканцерогенезе является выявленное снижение экспрессии молекул лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1 на эффекторах иммунитета, а также повышение сывороточного уровня интерлейкинов 6 и 10. Этим может быть обусловлена недостаточная активность Т-цитотоксических лимфоцитов, NK-клеток и др.. Вместе с тем, процесс опухолеобразования представляется как хронический стресс, сопровождающийся выбросом кортикостерона в кровь. Действительно, у животных контрольной группы к 22 месячному возрасту концентрация кортикостерона в крови повысилась практически вдвое. Из литературы известно, например, что индуцирует апоптоз лимфоцитов повышенный крови, уровень кортизола вызывая подавление иммунореактивности организма. Выявленный гиперкортицизм, очевидно, является отрицательным фактором, способствующим образованию и развитию спонтанных гепатокарцином. Применение сухого экстракта фм-40 вызывало выраженный гормономодулирующий эффект. В отношении анаболического гормона тестостерона предотвращало кратковременное возрастное и длительное снижение гормона воздействие в процессе препарата онтогенеза животных. В отношении катаболического гормона кортикостерона препарат способствовал подавлению возрастающего в онтогенезе параметра. Наиболее выраженный эффект падения кортикостерона наблюдали при длительном применении препарата, начиная с 6 месячного возраста и до естественной гибели организма. Вместе с тем, гормономодулирующий эффект сопровождался повышением иммунореактивности организма, связанной с 119 усилением экспрессии лейкоцитарных интегринов, нормализацией уровня интерлейкинов 6 и 10, инфильтрацией и деструкцией лимфоцитами гепатокарцином, а также подавлением их частоты образования. В результате, гормономодулирующее действие сухого экстракта фитоадаптогена сочетается с увеличением продолжительности жизни животных обоих опытных групп, проявляя геропротекторный эффект. Последний может быть связан с противоопухолевым влиянием препарата, с регуляцией механизмов старения, а также с теми и другими событиями вместе. При этом соматическое состояние опытных мышей имело преимущество перед контрольными. У мышей, которым вводили с питьевой водой комплексный фитоадаптоген в сухой форме, не наблюдали похудания, что сочетается с подавлением уровня ИЛ-6. Опытные животные имели относительно полноценный шёрстный покров (у них наблюдали небольшое количество обесцвеченной шерсти без признаков алопеции). Напротив, в контрольных группах у животных наблюдали потерю веса. В 20% в контрольной группе встречались животные с неполноценным шёрстным покровом (седые, с признаками алопеции). В конечном итоге, лучшее соматическое состояние высокогепатомных мышей опытных групп сочетается с увеличением продолжительности жизни по сравнению с контрольными животными. Следует подчеркнуть, что проведенные исследования, в отличие от предыдущих работ, определили, что на поверхности лимфоцитов, инфильтрирующих спонтанные гепатокарцином при воздействии сухой формы фитоадаптогена, находятся CD8, CD11a и CD11b антигены. Также впервые на этой модели проведена оценка роли гормонов: катаболического стресс-гормона кортизола (кортикостерона у мышей) и анаболического полового гормона тестостерона - при столь существенном увеличении продолжительности жизни высокораковых животных. Вместе с тем изучение воздействия сухой формы, практически субстанции препарата фитоадаптогена, на модели спонтанного 120 гепатоканцерогенеза у мышей позволяет с высокой степенью объективности оценить результаты подавления опухолевого процесса и повышения продолжительности жизни животных. Наряду с этим, выявление эффективности сухой формы фитоадаптогена, которая является более современной и перспективной с точки зрения хранения и транспортировки, имеет практическое значение для удобства применения препарата. Также сухая форма имеет приоритет в сравнении с водно-спиртовым экстрактом при противопоказании алкоголя — дети, пожилые люди, водители. Таким образом, повышение экспрессии лейкоцитарных интегринов на иммунных эффекторах периферической крови, подавление сывороточного ИЛ-6 и ИЛ-10, которое сочетается с выраженной инфильтрацией опухоли цитотоксическими CD8+, CD11a+, CD11b+лимфоцитами при её деструкции, а также с увеличением уровня сывороточного тестостерона и снижением кортикостерона под воздействием комплексного фитоадаптогена в сухой форме, вероятно, контролирует противоопухолевые реакции, а также выживаемость и качество жизни высокораковых животных. Сопоставляя полученные результаты по увеличению продолжительности жизни экспериментальных мышей с данными других исследователей, можно отметить их значимость. Показаны результаты, которые при генетической модификации гормонов гипофиза, щитовидной железы, ферментов поджелудочной железы, рецепторов инсулина, гормона роста привели в созданию уникальных мышей (в единственном числе), которые прожили соответственно около 4-х лет (мышь Yoda) [Ladiges W. et all., 2009], свыше 4-х лет (1551 день, мышь Чарли) и 1819 дней (последняя не дожила 6 дней до своего пятилетия) [Bartke A., 2007; Jiang H. et all., 2008]. В основном большинстве исследователи пытаются продлить жизнь мышам, используя низкокалорийную диету. Так, с помощью ограничения калорийности питания американские ученые добились замедления процессов старения у группы лабораторных мышей. Шестеро из них прожили в среднем 1356 дней (примерно 3,5 года) при хорошем качестве жизни, что особенно 121 подчеркивается [Schumacher B. et all., 2008]. Однако в этих исследованиях продление жизни зафиксировано у мышей без опухолевых патологий [Blagosklonny М. et all., 2009]. Вместе с тем нашей работе ближе результаты, полученные при введении скрещенным инбредным мышам (С57Bl/6×BALB/c) антибиотика рапамицина. Рапамицин, введенный в пищу мышам, начиная с возраста 270 и 600 дней, приводил к увеличению выживаемости на 14% у самок и 9% у самцов, замедляя рост опухолей, процессы старения, либо то и другое у мышей, предрасположенных к развитию опухолей. Рапамицмн – антибиотик, синтезируемый почвенной бактерией Streptomyces hygroscopicus. Известно, что рапамицин и низкокалорийная диета подавляет TOR-сигнальный путь, в том числе рапамицин-киназу и увеличивает таким образом выживаемость беспозвоночных, включая дрожжи, нематоды и дрозофилы. Низкокалорийная диета для продления жизни может применяться только, начиная с раннего онтогенеза. Иначе выживаемость не увеличивается. Низкокалорийная диета также вызывает снижение веса животного. Рапамицин может продлевать жизнь без снижения веса животных, если его применять и в среднем и в позднем онтогенезе. Однако рапамицин имеет побочные эффекты, являясь иммуносупрессором. Поэтому проводить испытания с рапамицином в качестве предполагаемого геропротектора не представляется возможным. Следовательно, исследования рапамицина на человеческом контингенте практически не возможны [Harrisson D. et all., 2009; Miller R.A., Harrison D.E. et al., 2011]. Мы продемонстрировали, фитоадаптогена, который является что сухая форма нетоксичным и комплексного неканцерогенным препаратом широкого спектра действия, применяемого с питьевой водой в раннем, среднем и позднем онтогенезе, увеличивала выживаемость мышей, повышала вес животных и вызывала иммуномодулирующий эффект, не обладая побочными эффектами. Это отличает наши результаты от таковых с рапамицином и низкокалорийной диетой. 122 Следовательно, полученные результаты значимы для обсуждения механизмов противоопухолевых и геропротекторных эффектов нетоксичного и неканцерогенного препарата, а также для дальнейших исследований его использования при комплексном лечении и профилактики опухолевых заболеваний. Выводы 1. При воздействии сухой формы комплексного фитоадаптогена в раннем постнатальном онтогенезе в течение первого месяца жизни, включая завершающий период дифференцировки нормальной ткани печени, а также начиная с 6 месяцев, периода появления первых гепатом, до естественной гибели животного, происходит долговременное повышение экспрессии молекул лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1 на клетках периферической крови высокогепатомных мышей-самцов линии СВА. 2. Применение комплексного фитоадаптогена в сухой форме выявило долговременное снижение сывороточного содержания ИЛ-6 и ИЛ-10 в обоих опытных группах. 3. Введение сухого экстракта фитоадаптогена в обоих опытных группах способствует снижению частоты возникновения наследственных гепатом, а также уменьшению числа опухолей и объема опухолевой массы у одного животного. 4. При воздействии сухого экстракта комплексного фитоадаптогена у мышей обоих опытных групп микроскопические и иммуногистохимические исследования выявили инфильтрацию трабекулярных и трабекулярноацинарных гепатокарцином умеренной и низкой дифференцировки цитотоксическими CD8+лимфоцитами, экспрессирующими LFA-1 и Mac-1 лейкоцитарные интегрины, а также деструкцию опухолей. 5. Увеличение продолжительности жизни у высокораковых мышейсамцов СВА на 17% при кратковременном применении в раннем постнатальном онтогенезе на 22% при длительном применении сухого 123 экстракта комплексного фитоадаптогена сочетается с повышением в онтогенезе гормона тестостерона и подавлением стресс-гормона кортикостерона. 6. Геропротекторный эффект сухой формы комплексного фитоадаптогена сочетался с хорошим соматическим состоянием мышей обоих опытных групп, которое характеризовали удовлетворительным шёрстным покровом без алопеций и потери веса в отличие от контрольных животных. Список литературы 1. Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Кадагидзе З.Г., Михайлова И.Н., и др. Современные проблемы биотерапии злокачественных опухолей. // Вестник московского онкологического общества. – 2008. - № 1. – с. 6-10. 2. Бочаров Е.В., Кучеряну В.Г., Крыжановский Г.Н., Бочарова О.А., Кудрин В.С., Белорусцева С.А. Влияние комплексного фитоадаптогена на МФТПиндуцированный паркинсонический синдром у мышей. // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 2006. - Том 141, №5. - С. 495-499. 3. Бочаров Е.В.. Кучеряну В.Г., Бочарова О.А., Карпова Р.В. Нейропротекторные свойства фитоадаптогенов. // Вестник РАМН. -2008. - № 4. – С. 47-50. 4. Бочаров Е.В., Иванова-Смоленская И.А., Полещук В.В., Кучеряну В.Г., Ильенко В.А., Бочарова О.А. Возможности фитоадаптогена- нейропротектора при лечении нейродегенеративного заболевания (на примере болезни Паркинсона). // Бюлл экспер биол и медицины. – 2010. – Т. 149. - № 6. – С. 619-621. 5. Бочаров Е.В., Карпова Р.В., Казеев И.В., Кучеряну В.Г., Бочарова О А. Исследование эксперименте радиозащитной на мышах активности // мультифитоадаптогена Патологическая экспериментальная терапия. – 2013.- № 3. – С. 55-58. физиология в и 124 6. Бочарова О. А., Модянова Е. А. Изменение межклеточных контактов гепатоцитов в онтогенезе у мышей инбредных линий с высокой и низкой частотой спонтанных гепатом. // Онтогенез. - 1982. - № 4. - С. 427-429. 7. Бочарова О.А., Модянова Е.А., Маленков А.Г. Профилактическое действие контактинов-кейлонов на спонтанный канцерогенез у линейных мышей. Экспериментальная онкология, 1983, т.5, №3. – с. 54-58. 8. Бочарова О.А., Куренная О.Н., Серебрякова Р.В. и др. Новый способ биологического тестирования препаратов адаптогенов // Биотехнология. – 1993. – № 8. – С. 28-34. 9. Бочарова О.А., Серебрякова Р.В., Голубева В.А., Фигурин К.М., Бухаркин Б.В., Бодрова Н.Б., Матвеев Б.П., Барышников А.Ю. Изменение механической интеграции клеток переходного эпителия и иммунного статуса больных с опухолями мочевого пузыря. Урология и нефрология, 1994, № 3. – с. 76-80. 10. Бочарова О.А., Матвеев Б.П., Барышников А.Ю., Фигурин К.М., Серебрякова Р.В., Бодрова Н.Б. Влияние экстракта Rhodiola rosea на частоту рецидивов поверхностного рака мочевого пузыря у людей. // Урология и нефрология. – 1995. - № 2. – с. 34-38. 11. Бочарова О.А., Фигурин К.М., Серебрякова Р.В., Филиппова Т.Г., Барышников А.Ю. Коррекция препаратом Rhodiola rosea адгезии клеток уротелия и иммунного статуса у больных поверхностным раком мочевого пузыря. // Иммунология. – 1997. - №1. - c. 51-55. 12. Бочарова О.А. Композиция ингредиентов для препарата Фитомикс-40. // Патент РФ N 2099410, 1998 г. 13. Бочарова О.А., Карпова Р.В., Голубева В.А., Филиппова Т.Г., Касаткина Н.Н., Барышников иммуномодулирующей А.Ю. Оценка активности антиметастатической препарата Фитомикс-40 и в эксперименте in vivo. // Бюлл.эксперим.биол. и медицины. – 1999a – Том 128. - № 10, с.403-407. 14. Бочарова О.А., Карпова Р.В., Голубева В.А., Филиппова Т.Г., Касаткина Н.Н., Барышников иммуномодулирующей А.Ю. Оценка активности антиметастатической препарата Фитомикс-40 и в 125 эксперименте in vivo. // Бюлл.эксперим.биол. и медицины. – 1999б – Том 128. - № 10, с.403-407. 15. Бочарова О.А. Адаптогены как средства профилактической онкологии. // Вестник РАМН, 1999, № 5, с. 49-53. 16. Бочарова О.А. Адгезионные взаимодействия в биологии рака. // Вестник РАМН. – 2002.- №1. - с. 22-25. 17. Бочарова О.А., Лыженкова М.А., Куренная О.Н., Княжев В.А. Способ биологического контроля комплексного фитоадаптогена // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 2003. - Т.136. - № 12. - С. 694-699. 18. Бочарова О.А., Чекалина Т.Л., Пожарицкая М.М., Карпова Р.В. Механизмы патогенеза лейкоплакии и возможности их коррекции комплексным фитоадаптогеном. Коллективная монография «Экспериментальная онкология на рубеже веков» п/ред. Барышникова А.Ю., Давыдова М.И., 2003г. - с. 349-381. 19. Бочарова О.А., Карпова Р.В., Матвеев В.Б., Аксенов А.А., Лыженкова М.А., Ершов Ф.И., Мезенцева М.В., Семернина В.В. Иммуномодулирующий и интерфероногенный эффекты комплексного фитоадаптогена при доброкачественной гиперплазии предстательной железы // Российский биотерапевтический журнал. – 2004а.- T.3. - №1. – с.90-95. 20. Бочарова О.А., Пожарицкая М.М., Чекалина Т.Л., Мезенцева М.В., Карпова Р.В., Семернина В.В., Княжев В.А. Роль адгезионных нарушений в патогенезе лейкоплакии и возможности их коррекции неспецифическим иммуномодулятором. // Иммунология. - 2004б. – T. 25. - №1. - C. 36-43. 21. Бочарова О.А., Пожарицкая М.М., Чекалина Т.Л., Лыженкова М.А., Карпова Р.В., Мезенцева М.В., Ершов Ф.И. Лейкоплакия слизистой оболочки полости рта: патогенез и возможности коррекции фитоадаптогеном. // Бюлл. экспер. биол. и мед. – 2004в. - Т. 138. - № 12. С. 652-657. 22. Бочарова О.А., Карпова Р.В. Адгезия в биологии рака (аналитический обзор). Российский биотерапевтический журнал. - 2006. – Т. 5. - № 3. – с. 55-60. 126 23. Бочарова О.А., Матвеев В.Б., Карпова Р.В., Аксенов А.А., Горожанская Э.Г., Чеботарев А.Н., Катосова Л.Д., Платонова В.И., Бочков Н.П. Коррекция клинических и иммунобиологических показателей у мужчин с доброкачественной гиперплазией предстательной железы фитоадаптогеном. // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 2006. - Том 141. - №5. С. 555-559. 24. Бочарова О.А.,Барышников А.Ю., Давыдов М.И. Фитоадаптогены в онкологии и геронтологии (на примере изучения Фитомикса-40). – М.: МИА. – 2008. - 218 с. 25. Бочарова О.А. Профилактическая онкология и фитоадаптогены. Вестник РАМН. – 2009. - № 7. – с. 41-45. 26. Бочарова О.А., Давыдов М.И., Клименков А.А. и др. Перспективы применения фитоадаптогена в лечении распространенного рака желудка. // Бюлл. экспер. биол. и мед. – 2009. – Т. 148. - № 7. - С. 96-99. 27. Бочарова О.А., Карпова Р.В., Ильенко В.А., Бочаров Е.В., Казеев И.В. Экспрессия лейкоцитарных интегринов и некоторых цитокинов при использовании фитоадаптогена у высокораковых мышей. // Технологии живых систем. – 2012. - № 3. – c. 13-17. 28. Бочарова О.А., Барышников А.Ю., Карпова Р.В., Бочаров Е.В., Ильенко В.А., Шевченко В.Е., Шейченко О.П., Давыдов М.И. Способ лечения экспериментальных животных с высокой частотой спонтанного опухолеобразования. Патент РФ №2481849 от 20.05.2013. 29. Бочарова О.А., Карпова Р.В., Ильенко В.А., Бочаров Е.В., Казеев И.В. Лейкоцитарные интегрины при гепатоканцерогенезе мышей высокораковой линии СВА. // Российский биотерапевтический журнал. – 2013. – Т. 12. - № 3. – с. 53-56. 30. Бочарова О.А. Адгезионная концепция в биологии злокачественного роста (обзор). // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. – 2014. - №2. – с. 87-90. 31. Бочарова О.А., Барышников А.Ю., Карпова Р.В., Бочаров Е.В., Ильенко В.А., Шевченко В.Е., Шейченко О.П., Давыдов М.И. Способ профилактики развития опухолей у экспериментальных животных с 127 высокой частотой спонтанного опухолеобразования. Патент РФ на изобретение № 2507599 от 20.02.2014 32. Бочарова О.А., Бочаров Е.В., Карпова Р.В., Ильенко В.А., Казеев И.В., Барышников А.Ю. LFA-1, Mac-1 интегрины и IL-6, -10 цитокины у высокораковых мышей под воздействием фитоадаптогена. // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. – 2014a). – Т. 157. - № 2. – с. 223-226. 33. Бочарова О.А., Бочаров Е.В., Карпова Р.В., Вершинская А.А., Соловьев Ю.Н. Снижение возникновения гепатом при воздействии фитоадаптогена у высокораковых мышей СВА. // Российский биотерапевтический журнал. – 2014б).-Том 13, № 2. - С. 73-76. 34. Бочков Н.П., Бочарова О.А., Аксенов А.А., Горожанская Э.Г., Матвеев В.Б., Карпова Р.В., Катосова Л.Д., Косякова Н.В., Платонова В.И., Чеботарев А.Н. // Частота хромосомных аберраций в лимфоцитах пациентов с доброкачественной гиперплазией предстательной железы. Медицинская генетика. - 2005. - Т. 4. - № 1. - С. 15-19. 35. Брехман И.И. Элеутерококк. – Ленинград: Наука, 1968. – 185 с. 36. Гольдберг Е.Д., Разина Т.Г., Зуева Е.П., Амосова Е.Н., Крылова С.Г., Гольдберг В.Е. Растения в комплексной терапии опухолей. М. - Изд-во РАМН. - 2008. – 432 с. 37. Дардымов И.В. Женьшень, элеутерококк (к механизму биологического действия). – Москва: Наука, 1976. – 184 с. 38. Карпова Р.В., Бочаров Е.В., Казеев И.В., Кучеряну В.Г., Бочарова О.А. Радиозащитная эффективность мультифитоадаптогена в опытах на собаках. // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. – 2013. - № 4. – с. 51-54. 39. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины. //Фолиант, СанктПетербург. – 2008. – 550 с. 40. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Хорева М.Е., Соколова Е.В. Система цитокинов, комплемента и современные методы иммунного анализа. // М.: РГМУ. – 2001. – 158 c. 128 41. Колодняк О.Л., Кропотов А.В., Колдаев В.М. Профилактика глюкокортикоидного остеопороза экстрактом родиолы розовой. // Здоровье. Медицинская экология. Наука. – 2002. - № 1-2. – С. 56-57. 42. Куренная О.Н., Карпова Р.В., Бочарова О.А., Казеев И.В., Бочаров Е.В., Королев В.Г. Антимутагенез мультифитоадаптогена в клетках дрожжейсахаромицетов. // Генетика. – 2013. – Т. 49. - № 12. – с. 1-6. 43. Лобанов С.Л., Клименков А.А., Патютко Ю.И. и др. Прочность межклеточного сцепления при раке желудка // Вопр. онкол. – 1990. – № 4. – С. 451-454. 44. Ломакин М. С. Иммунобиологический надзор. - М., Медицина. - 1990. 256 С. 45. Маленков А.Г. Бочарова О.А., Модянова Е.А. Явление увеличения сил сцепления при межклеточном взаимодействии в эпителиальных тканях в раннем постнатальном периоде. // Открытие № 330, зарегистрир. в гос. реестре открытий СССР 19 фев. 1987 г. 46. Медведев Н.Н. Линейные мыши. // Л.: Медицина. – 1964. – 230с. 47. Модянова Е. А., Бочарова О. А., Маленков А. Г. Профилактическое действие контактинов-кейлонов на спонтанный канцерогенез у линейных мышей. // Экспер. онкол. - 1983. - № 3. - С. 39-42. 48. Саратиков А.С. Краснов Е.А. Родиола розовая (золотой корень). // Томск: Изд-во Томcкого ун-таю - 2004. - 292 с. 49. Сепиашвили Р.И., Балмасова И.П. Физиология естественных киллеров. М., Медицина – Здоровье. – 2005. – 455с. 50. Фактор В.М., Шипова Л.Я. и др. Уровень клеточной ДНК в спонтанных гепатомах мышей линии СВА. // Бюлл. экспер. биол. и мед. – 1984. – Т.97. - №6. – С. 710-713. 51. Хаитов Р.М. Физиология иммунной системы. // М.: ВИНИТИ РАН. – 2005. – 428 с. 52. Чулкова С.В., Бочарова О.А., Клименков А.А., Карпова Р.В., Беневский А.И., Горожанская Э.Г. Возможности повышения эффективности комплексного лечения распространенного рака желудка фитоадаптогеном // Российский биотерапевтический журнал. - 2006. - № 2. - С. 85-92. 129 53. Шейченко В.И., Бочарова О.А., Шейченко О.П., Бочаров Е.В., Быков В.А. Аналитические возможности метода ЯМР для определения компонентов препарата Фитомикс-40. // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. - 2006. - Том 72, № 8. - С. 15-23. 54. Шейченко О. П., Бочарова О. А., Шейченко В. И. и др. Возможности использования электронных спектров поглощения для стандартизации многокомпонентного препарата «Фитомикс-40» // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. - 2007. - № 2. С. 20-25. 55. Шейченко О.П., Бочарова О.А., Крапивкин Б.А., Уютова Е.В., Толкачёв О.Н., Бочаров Е.В., Быков В.А. Определение химического состава летучих соединений фитоадаптогена Фитомикса-40 методом хроматомас-спектрометрии. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. – 2008. – № 5. - С.18-28. 56. Шейченко О.П., Бочарова О.А., Крапивкин Б.А. и др. Исследование комплексного фитоадаптогена методом ВЭЖХ. // Вопр. биол. мед. фарм. химии. - 2012. - № 10. С. 52-59. 57. Шевченко В.Е., Шейченко О.П., Бочарова О.А., Уютова Е.В., Казеев И.В., Бочаров Е.В., Быков В.А. Идентификация и определение содержания гинзенозидов в фитоэкстрактах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией. // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. – 2013. - № 11. – с. 1218 58. Яременко К.В. Адаптогены как средства профилактической медицины. – Томск: изд-во Томского ун-та, 1990. – 92 с. 59. Яременко К.В., Пашинский В.Г. Злокачественные опухоли: лечение и лекарственная профилактика. – СПб.: ЭЛБИ-СПб, 2003. – 166 С. 60. Abbas A.K., Lichtman A.H., Pober J.S. Cellular and molecular immunology. // USA: W.B. Saunders company. – 1994. – 457 p. 61. Ahmed N., Riley C., Rice G., Quinn M. Role of integrin receptors for fibronectin, collagen and laminin in the regulation of ovarian carcinoma 130 functions in response to a matrix microenvironment. // Clin Exp Metastasis. 2005. - Vol. 22, № 5. - P. 391-402. 62. Ahn J.Y., Choi I.S., Shim J.Y., Yun E.K., Yun Y.S., Jeong G., Song J.Y. The immunomodulator ginsan induces resistance to experimental sepsis by inhibiting Toll-like receptor-mediated inflammatory signals. // Eur J Immunol. – 2006. - Vol. 36. - № 1. - P. 37-45. 63. Attele A.S., Wu J.A., Yuan C.S. Ginseng pharmacology: multiple constituents and multiple actions. // Biochem Pharmacol. 1999. – Vol. 58. № 11. p. 1685– 1693. 64. Attele A., Zhou Y., Xie J. et al. Antidiabetic effects of Panax ginseng berry extract and the identification of an effective component // Diabetes. – 2002. – Vol. 51, № 6. – P. 1851-1858. 65. Bae E.A., Han M.J., Shin Y.W., Kim D.H. Inhibitory effects of Korean red ginseng and its genuine constituents ginsenosides Rg3, Rf, and Rh2 in mouse passive cutaneous anaphylaxis reaction and contact dermatitis models. // Biol Pharm Bull. – 2006. – Vol. 29. - № 9. – P. 1862-1867. 66. Balkwill F. Tumor necrosis factor or tumor promoting factor? // Cytokine Growth Factor Rev. 2002. – Vol. 13. - № 2. – p. 135-41. 67. Bao HY, Zhang J, Yeo SJ, Myung CS, Kim HM, Kim JM, Park JH, Cho J, Kang JS. Memory enhancing and neuroprotective effects of selected ginsenosides. // Arch Pharm Res. – 2005. – Vol. 28. - № 3. – p. 335–342. 68. Bartke A. Aging: All in the Head? - Cell Metabolism. – 2007. - № 6. - p153154. 69. Beatty P.L., Cascio S., Lutz E. Tumor immunology: basic and clinical advances. // Cancer Res. – 2011. – Vol. 71. - № 13. – p. 4338-4343. 70. Bhattacharya S. K., Muruganandam A. V. Adaptogenic activity of Withania somnifera: an experimental study using a rat model of chronic stress. // Pharmacol. Biochem. Behav. – 2003. – 75 –P. 547- 555. 71. Bilger A., Bennett L., Carabeo R. et al. A potent modifier of liver cancer risk on distal mouse chromosome 1: linkage analysis and characterization of congenic lines. // Genetics. – 2004. – T. 167. - № 2. - P. 859-66. 131 72. Biswas S., Pinson D., Bronshteyn I.G., LeVine S. IL-6 deficiency allows for enhanced therapeutic value after bone marrow transplantation across a minor histocompatibility barrier in the twitcher (globoid cell leukodystrophy) mouse. // J. Neurosci. Res. – 2001. – Vol. 65. - № 4. – p. 298-307. 73. Blagosklonny M., Campisi J., Sinclair D., Bartke A., Blasco M., Bonner W., Bohr V. Et al. Impact papers on aging in 2009. // AGING. – 2010. – Vol. 2. № 3. – p. 111-121. 74. Вlank C., Brown I., Kacha A. K., Markiewicz M. A., Gajewski T. F. ICAM-1 contributes to but is not essential for tumor antigen cross-priming and CD8+ T cell-mediated tumor rejection in vivo. // J. Immunol. – 2005. – Vol. 174, № 6. –P. 3416-3420. 75. Bogenrieder T., Herlyn M. Axis of evil: molecular mechanisms of cancer metastasis.// Oncogene.- 2003 – Vol. 22, № 42. – P.6524-6536. 76. Bouma-ter Steege J. C., Baeten C. Ir., Thijssen V. L., Satijn S. A., Verhoeven I. С., Hillen H. F., Wagstaff J., Griffloen A. W. Angiogenic profile of breast carcinoma determines leukocyte infiltration. // Clin. Cancer. Res. - 2004. – Vol. 10, № 21. – P. 7171-7178. 77. Brady J., Carotta S., Thong R., Chan C. Et al. The interactions of multiple cytokines control NK cell maturation. // J. Immunol. – 2010. – Vol. 185. - № 11. – p. 6679-6688. 78. Catalano V, Turdo A, Franco S, Dieli F, Torado M, Stassi G. Tumor and its microenvironment: a synergistic interplay. // Semin Cancer Biol (2013) 23: 522-532. 79. Сhae S, Kang KA, Youn U, Park JS, Hyun JW. A Comparative Study of the Potential Antioxidant Activities of Ginsenosides. // J Food Biochem. – 2010. – Vol. 34. – p. 31–43. 80. Chan A.S., Yip E.C., Yung L.Y., Pang H. et al. Immuno-regulatory effects of CKBM on the activities of mitogen-activated protein kinases and the release of cytokines in THP-1 monocytic cells. // Biol Pharm Bull. – 2005. – Vol 28. - № 9. – p. 1645-1650. 81. Chen ZY, Lu TT, Yue XY, Wei N, Jiang YJ, Chen MG, Ni GZ, Liu XF, Xu GL. Neuroprotective effect of ginsenoside Rb1 on glutamate-induced 132 neurotoxicity: With emphasis on autophagy. // Neurosci Lett. 2010. – Vol. 482. - № 3. – p. 264–268. 82. Chiou SH, Sheu BC, Chang WC, Huang SC, Hong-Nerng H. Current concepts of tumor-infiltrating lymphocytes in human malignancies. // Reprod Immunol. – 2005. – Vol. 67. - № 1-2. – p. 35-50. 83. Choi K., Kim M., Ryu J., Choi C. Ginsenosides compound K and Rh(2) inhibit tumor necrosis factor-alpha-induced activation of the NF-kappaB and JNK pathways in human astroglial cells. // Neurosci Lett – 2007. – Vol. 421. - № 1. – p. 37-41. 84. Cohen S., Bigassi P., Yoshida T. Similarities of T-cell function in cellmediated immunity abd antibody production. // Cell. Immunol. – 1974. – V.12. – P. 150-159. 85. Colombo M., Trinchieri G. Interleukin-12 in anti-tumor immunity and immunotherapy // Cytokine Groth Factor Rev – 2002. – V. 13. – P.155-168. 86. Coman D.R. Decreased mutual adhesiveness, a property of cells from squamous cell carcinomas. // Cancer Res. - 1944. - Vol. 4, № 10. - P. 625-629. 87. Coussens LM, Werb Z. Inflammatory cells and cancer: think different! // J Exp Med. 2001. – Vol. 193. - № 6. – p 23-26. 88. Danese S., Semeraro S., Marini M., Roberto I., Armuzzi A., Papa A., Gasbarrini A. Adhesion molecules in inflammatory bowel disease: therapeutic implications for gut inflammation. // Dig Liver Dis. - 2005. - Vol. 37, № 11. P. 811-818. 89. Deans D., Tan B., Ross J. et al. Cancer cachexia is associated with the IL101082 gene promoter polimorphism in patients with gastroesophageal malignancy. // Am. J. Clin. Nutr. – 2009. – Vol. 89. - № 4. – p. 1164-1172. 90. Diamond M.C., Staunton D.E., de Fougerolles A.R. et al. ICAM-1 (CD54) – a counter-receptor for Mac-1 (CD11b/CD18). // J. Cell Biol. – 1990. – Vol. 111. – p. 3129-3139. 91. Dummer W, Becker JC, Schwaaf A, et al. Elevated serum levels of interleukin10 in patients with metastatic malignant melanoma // Melanoma Res. – 1995. – № 5. – p. 67-68. 133 92. Dunn G., Koebel K., Schreiber R. Interferons, immunity and cancer immunoediting. // Nat. Rev. Immunol. – 2006. – V. 6. – P. 836-848. 93. Edelman G.M. Cell adhesion molecules in the regulation of animal form and tissure pattern // Ann. Rev. Cell Biol. – 1986. – Vol. 2. – P. 81-116. 94. Edelman G.M. Topobiology // Sci. American. – 1989. – № 7. – P. 24-32. 95. Enns A., Gassmann P., Schliter K., Korb T., Spiegel H., Senninger N., Haier J. Integrins can directly mediate metastatic tumor cell adhesion within the liver sinusoids. //J. Gastrointest. Surg. - 2004. - Vol. 8, № 8. - P. 1049-1059. 96. Eukaszewicz M., Mroczko B., Szmitkowski M. Clinical significance of interleukin-6 (IL-6) as a prognostic factor of cancer disease. // Pol Arch Med Wewn. – 2007. – Vol. 117. - № 5-6. – p. 247-251. 97. Flavel RA, Sanjaby S, Wrzesinski SH, Licona Limon P. The polarization of immune cells in the tumour environment by TGF-β. // Nat Rev Immunol. – 2010. – Vol. 10. - № 8. – p. 554-567. 98. de Fougerolles A.R., Stacker S.A., Schwarting R., Springer T.A. Characterization of ICAM-2 and evidence for a third counterreceptors for LFA-1. // J. Exp. Med. – 1991. – Vol. 174. – p. 253-264. 99. Gattinoni L, Powell DJ, Jr, Rosenberg SA, Restifo NP. Adoptive immunotherapy for cancer: building on success. // Nat Rev Immunol. – 2006. – Vol. 6. - № 5. – p. : 383-393. 100. Genda T., Sakamoto M., Ichida T. et al. Loss of cell-cell contact is induced by integrin-mediated cell-substratum adhesion in highly-motile and highlymetastatic hepatocellular carcinoma cells // Lab. Invest. - 2000. - Vol. 80, № 3. - P. 387-394. 101. Gooden M.J., de Bock G.H., Leffers N., Daemen T., Nijman H.W. The prognostic influence of tumour-infiltrating lymphocytes in cancer: a systematic review with meta-analysis. Br J Cancer. – 2011. Vol. 105. - № 1. – p. 93-103. 102. Griffin GD, Charron D, Al-Daccak R. Post-traumatic stress disorder: revisiting adrenergics, glucocorticoids, immune system effects and homeostasis. // Clin Transl Immunology. – 2014. - Vol. 3. - № 11. – p. 113-117 103. Guan YY, Zhou JG, Zhang Z, Wang GL, Cai BX, Hong L, Qiu QY, He H. Ginsenoside-Rd from panax notoginseng blocks Ca2+ influx through receptor- 134 and store-operated Ca2+ channels in vascular smooth muscle cells. // Eur J Pharmacol. – 2006. – Vol. 548. - № 1-3. – p. 129-136. 104. Gui G.P., Wells C.A., Browne P.D. Integrin expression in primary breast cancer and its relation to axillary nodal status. // Surgery. - 1995. - Vol. 117, № 1. - Р. 102-108. 105. Guo L., Song L., Wang Z. et al. Panaxydol inhibits the proliferation and induces the differentiation of human hepatocarcinoma cell line HepG2. // Chem Biol Interact. – 2009. – Vol. 181. - № 1. – р. 138-143. 106. Hacham M., White R., Argov S., Segal S., Apte R. Interleukin-6 and interleukin-10 are expressed in organs of normal young and old mice. // Eur Cytokine Netw. – 2004. – Vol. 15. - № 1 – p. 37-46. 107. Hasegawa H., Suzuki R., Nagaoka T. et al. Prevention of the growth and metactasis of murine melanoma through enhanced natural-killer cytotoxity by fatty acid-conjugate of protopanaxatriol // Biol. Pham. Bull. – 2002. – Vol. 25, № 7. – P. 861-866. 108. Harrison D.E., Strong R., Sharp Z.D. et al. Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice. // Nature. – 2009. – Vol. 460. - № 7253. – p. 392-395 109. Heidemann J., Maaser C., Lјgering A., Spahn T., Zimmer K., Herbst H., Rafiee P., Domschke W., Krieglstein C., Binion D., Kucharzik T. Expression of vascular cell adhesion molecule-1 (CD 106) in normal and neoplastic human Esophageal squamous epithelium. // Int. J. Oncol. - 2006. Vol. 28, № 1, P. 77-85. 110. Horvathova M., Ferencik M. Adhesion molecules as the strategic goal of immunotherapy. // Lec Listy. - 2000. - Vol. 101, №3. - Р. 146-151. 111. Hurst S., Wilkinson T., McLoughlin R. et al. IL-6 and its soluble receptor orchestrate a temporal switch in the pattern of leukocyte recruitment seen during acute inflammation. // Immunity – 2001. – V. 11. – P. 705-714. 112. Hynes R.O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. // Science. – 2009. –Vol. 326. – p. 1216-1219. 113. Ichikawa H., Takada Y., Shishodia S., Jayaprakasam B., Nair M.G., Aggarwal B.B. Withanolides potentiate apoptosis, inhibit invasion, and abolish 135 osteoclastogenesis through suppression of nuclear factor-kappaB (NF-kappaB) activation and NF-kappaB-regulated gene expression. // Mol. Cancer Ther. – 2006. – Vol. - № 6. – P. 1434-1445. 114. Isaack A., Lindemann J., Virus interference. I. The Interferon // Proc. Roy. Soc. Series B. – 1957. – V. 147. – P. 258-267. 115. Ivaska J. Adhesion receptors and cell invasion: mechanisms of integrin-guided degradation of extracellular matrix. // Cell Mol. Life Sci. – 2000. – Vol. 57, № 1. – P. 16-24. 116. Jewett A., Bonavida B. MHC-Class I antigens regulate both the function and the survival of human peripheral blood NK cells role of endogenously secretedTNF-alpha. // Clin. Immunol. – 2000. – Vol. 96. – p. 19-28. 117. Jian H., Schiffer E., Song S., Wang J., Zurbic P., Thedieck K., Moes S. Et al. Proteins induced by telomere dysfunction and DNA damage represent biomarkers of human aging and disease. // PNAS. – 2008. – Vol. 105. - № 32. – p. 11299-11304. 118. Jin Y, Kotakadi VS, Ying L, Hofseth AB, Cui XL, Wood PA, Windust A, Matesic LE, Pena EA, Chiuzan C, Singh NP, Nagarkatti M, Nagarkatti PS, Wargovich MJ, Hofseth LJ. American ginseng suppresses inflammation and DNA damage associated with mouse colitis. // Carcinogenesis. – 2008. – Vol. 29. - № 12. – p. 2351–2359. 119. Jones S., Richards P., Scheller J., Rose-John S. IL-6 trans-signalling: the in vivo consequences. // J. Interferon Cytokine Res. – 2005. – V. 25. – P.241-253. 120. Kadioglu A., De Filippo K., Bangert M., Fernandes V. Et al. The integrins Mac-1 and alpha4beta1 perform crucial roles in neutrophil and T cell recruitment to lungs during Streptococcus pneumoniae infection. // J Immunol. – 2011. – Vol. 186. - № 10. – p. 5907-5915. 121. Kaplanski G., Marin V., Montero-Julian F. et al. IL-6: a regulator of the transition from neutrofil to monocyte recruitment during inflammation. // Trends Immunol. – 2003. – V.24. – P. 25-29. 122. Kato Y., Hirano T., Yoshida K., Yashima K., Akimoto Sr., Tsuji K., Ohira T., Tsuboi M., Ikeda N., Ebihara Y., Kato H. Frequent loss of E-cadherin and/or 136 catenins in intrabronchial lesions during carcinogenesis of the bronchial epithelium. // Lung Cancer. – 2005. – Vol. 48, № 3. – P. 323-330. 123. Kawaguchi T. Cancer metastasis: characterization and identification of the behavior of metastatic tumor cell and the adhesion molecules, including carbohydrates. // Curr. Drug. Targets. Cardiovasc. Haematol. Disord. – 2005. – Vol. 5, № 1. –P. 39-64. 124. Kemik O., Kemik A., Begenik H., Erdur F. Et al. The relationship among acute phase responce proteins, cytokines and hormones in various gastrointestinal cancer types patients with cachectic. // Hum. Exp. Toxicol. – 2011. – Vol. 25. № 9. – p. 117-121. 125. Kim D., Oh S., Kwon H., Lee S. et al. Clinical significance of preoperative serum interleukin-6 and C-reactive protein level in operable gastric cancer. // Cancer. – 2009. – Vol. 20. - № 9. – p. 155-161. 126. Kim SW, Kwon H, Chi DW, Shim JH, Park JD, Lee YH, Pyo S, Rhee DK. Reversal of P-glycoprotein-mediated multidrug resistance by ginsenoside Rg(3). // Biochem Pharmacol. 2003. – Vol. 65. - № 1. p. 75–82. 127. Kimura K., Endo Y., Yonemura Y. et al. Clinical significance of S100A4 and E-cadherin-related adhesion molecules in non-small cell lung cancer // Int. J. Oncol. – 2000. – Vol.16 – № 6. – P. 1125-1131. 128. Kioukia-Fougia N., Antoniou K., Bekris S., Liapi C., Christofidis I., Papadopoulos-Diafoti Z. The effects of stress exposure on hypothalamicpituitary-adrenal axis, thymus, thyroid hormones and glucose levels. // Prog Neuropharmacol Biol Psychiatry. – 2002. – Vol. 26. – P. 823-830. 129. Kitagawa S, Takahashi T, Nabekura T, Tachikawa E, Hasegawa H. Inhibitory effects of ginsenosides and their hydrolyzed metabolites on daunorubicin transport in KB-C2 cells. // Biol Pharm Bull. – 2007. – Vol. 30. - № 10. – p. 1979-1981. 130. Kovalovich K., Li W., DeAngelis R. et al. Interleukin-6 protects against Fasmediated death by establishing a critical level of anti-apoptotic hepatic proteins FLIP, Bcl-2 and Bcl-xl. // J. Biol. Chem.. – 2001. – V.276. – P. 26605-26613. 131. Krzystek-Korpacka M., Matusiewicz M., Diakowska D., Grabowski K. Et al. Acute-phase response proteins are related to cachexia and accelerated 137 angiogenesis in gastroesophageal cancers. // Clin. Chem. Lab. Med. – 2008. – Vol. 46. - № 3. – p. 359-364. 132. Kucinskaite A., Briedis V., Savickas A. Experimental analysis of therapeutic properties of Rhodioia rosea L and its possible application In medicine. // Medicina, 2004. – 40 (7). – P. 614-619. 133. Ladiges W., Van Remen H., Strong R., Ikeno Y., Treuting P., Rabinovitch P., Richardson A. Lifespan extension in genetically modified mice. // Aging Cell – 2009. - № 8. – p. 346-352. 134. Lascombe I., Clairotte A., Fauconnet S., Bernardini S., Wallerand H., Kantelip B., Bittard H. N-cadherin as a novel prognostic marker of progression in superficial urothelial tumors. // Clin Cancer Res. - 2006. - Vol. 12, № 9. - P. 2780-2787. 135. Lattanzio G, Libert C, Aquilina M, Cappelletti M, Ciliberto G, Musiani P, Poli V. Defective development of pristane-oil-induced plasmacytomas in interleukin-6-deficient BALB/c mice. // Am J Pathol. 1997. – Vol. 151. - № 3. – p. 689-96. 136. Lee D.C., Lau A.S. Effects of Panax ginseng on Tumor Necrosis Factor-О±Mediated inflammation: A Mini-Review. // Molecules. 2011. – Vol. 16. - № 4. – p. 2802-2816. 137. Lee TK, O’Brien KF, Wang WD, Johnke RM, Sheng C, Benhabib SM, Wang T, Allison RR. Radioprotective effect of American ginseng on human lymphocytes at 90 minutes postirradiation: A study of 40 cases. // J Altern Complement Med. 2010. – Vol. 16. - № 5. – p. 561–567. 138. Levenson D. Physicians should increase knowledge of herbal remedies // Rep. Med. Guidel Outcomes Res. – 2001. – Vol. 12, № 15. – P. 7-9. 139. Li BH, Wang CZ, He TC, Yuan CS, Du W. Antioxidants potentiate American ginseng-induced killing of colorectal cancer cells. // Cancer Lett. 2010. – Vol. № 1. – p. 62–70. 140. Li JQ, Ichikawa T, Jin Y, Hofseth LJ, Nagarkatti P, Nagarkatti M, Windust A, Cui TX. An essential role of Nrf2 in American ginseng-mediated anti-oxidative actions in cardiomyocytes. // J Ethnopharmacol. – 2010. – Vol. 130. - № 2. – p. 222–230. 138 141. Lian-Wen Qi., Chong-Zhi Wang, Chun-Su Yan Ginsenosides from American ginseng: chemical and pharmacological diversity. // Pphytochemistry. – 2011. – Vol. 72. - № 8. – p. 689-699. 142. Licato L.L., Grimm E.A. Multiple inteleukin-2 signaling pathways differentially regulated by microgravity. // Immunopharmacol. – 1999. – Vol. 44. – p. 273-279. 143. Lin S.H., Pu Y.S. Function and therapeutic implication of C-CAM cell adhesion molecules in prostate cancer. // Oncol. - 1999. - Vol. 26, № 2. -Р. 227-233. 144. Liu K., Caldwell S. A., Abrahams S. I. Cooperative disengagement of Fas and itercellular adhesion molecule-1 function in neoplastic cells confers enhanced colonization efficiency. // Cancer. Res. – 2005. – Vol. 65, № 3. – P. 10451054.Mocellin S., Panelli M.C., Wang E., Nagorsen D., Marincola F.M. The dual role of IL-10 // Trends Immunol – 2003. – V.24. – P.36-43. 145. Lo Presti E., Dieli F., Meraviglia S. Tumor-Infiltrating γδ T Lymfocites: Pathogenic Role, Clinical Significance and differential Programming in the Tumor Microinvironment. // Front Immunol. – 2014. – Nov 24;5: 607-621 146. Lu P, Zhu XQ, Xu ZL, Zhou Q, Zhang J, Wu F. Increased infiltration of activated tumor-infiltrating lymphocytes after high intensity focused ultrasound ablation of human breast cancer. // Surgery. – 2009. – Vol. 145. - № 3. – p. 286-293. 147. Maksan S. M., Araib P. M., Ryschin E., Gebhard M. M., Schimidt J. Immune escape mechanism: defective resting and stimulated leukocyte-endotelium interaction in hepatocellular carcinoma of the rat. // Dig. Dis. Sci. –2004. – Vol. 49, № 5. – P. 859-865. 148. Margulis A., Zhang W., Alt-Holland A., Crawford H. C., Fusening N. E., Garlik J. A. E-cadherin suppression accelerates squamous progression in threedimensional, human tissue constructs. // Cancer. Res. – 2005. – Vol. 65, № 5. – P. 1783-1791. 149. Meydani M. Antioxidants in the prevention of chronic diseases. // Nutr Clin Care. – 2002. – Vol. 5/ - № 2. – P. 47-49. 139 150. Miller R.A., Harrison D.E., Astle C.M. et al. Rapamycin, but not resveratrol or simvastatin, extends life span of genetically heterogeneous mice. // J. Gerontol A Biol Med Sci. – 2011. – Vol. 66. - № 2. – p. 191-201. 151. Milrgineanu E, Cotrutz CE, Cotrutz C.Correlation between E-cadherin abnormal expressions in different types of cancer and the process of metastasis. // Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi. – 2008. - Apr-Jun;112(2):432-6. 152. Mocellin S., Panelli M., Wang E. The dual role of IL-10. // Trends. Immunol. – 2003. – Vol. 24. – p. 36-43. 153. Moore K.W., Malefyt R.W., Coffman R.L., O´Garra A. Interleukin-10 and the Interleukin-10 receptor // Annu Rev Immunol – 2001. – V.19. – P.683-765. Sun F., Sun Y., Yu Z. Et al. Interleukin-10 gene polimorphisms influence susceptibility to cachexia in patients with low-third gastric cancer in a Chinese population. // Mol Diagn Ther. – 2010. – Vol. 14. - № 2. – p. 95-100. 154. Moretta A., Bottino C., Vitale M. Et al., Activating receptors and coreceptors involved in human natural killer cell-mediated cytolysis. // Annu. Rev. Immunol. – 2001. – Vol. 19. – P. 197-223. 155. Morgan D.A., Ruscetti F.W., Gallo R.C. Selective in vitro growth of T lymphocytes from normal human bone marrows // Science – 1976. –V.193, N4257. – P.1007-1008. 156. Moscona A. Rotation-mediated histogenetic aggregation of dissociated cells. Exp. Cell. Res., 1961. – Vol. 22. – p. 445-450. 157. Mukoyama Y, Zhou S, Miyachi Y, Matsuyoshi N. T-cadherin negatively regulates the proliferation of cutaneous squamous carcinoma cells. // J Invest Dermatol. - 2005 – Vol. 124. - № 4. – p.833-8. 158. Nah SY, Kim DH, Rhim H. Ginsenosides: are any of them candidates for drugs acting on the central nervous system? // CNS Drug Rev. 2007. – Vol. 13. - № 4. – p. 381-404. 159. Nakaya Y, Mawatari K, Takahashi A, Harada N, Hata A, Yasui S. The phytoestrogen ginsensoside Re activates potassium channels of vascular smooth muscle cells through PI3K/Akt and nitric oxide pathways. // J Med Invest. – 2007. – Vol. 54. - № 3-4. – p. 381-384. 140 160. Narimatsu M., Maeda H., Itoh S. et al. Tissue-specific autoregulation of the STAT3 gene and its role in interleukin-6-induced survival signals in T-cell. //Moll. Cell. Biol. – 2001. – V. 21. – P. 6615-6625. 161. Ni W, Zhang X, Wang B, Chen Y, Han H, Fan Y, Zhou Y, Tai G. Antitumor activities and immunomodulatory effects of ginseng neutral polysaccharides in combination with 5-fluorouracil. // J Med Food. – 2010. – Vol. 13. - №ю 2. – p. 270-277. 162. Oble D., Loewe R., Yu P., Mihm M, Focus on TILs: Prognostic significance of tumor infiltrating lymphocytes in human melanoma // Cancer Immun. – 2009. – Vol. 9. - № 3. – p. 245-251. 163. Oh G.S., Pae H.O., Choi B.M., Seo E.A., Kim D.H., Shin M.K., Kim J.D., Kim J.B., Chung H.T. 20(S)-Protopanaxatriol, one of ginsenoside metabolites, inhibits inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 expressions through inactivation of nuclear factor-kappaB in RAW 264.7 macrophages stimulated with lipopolysaccharide. // Cancer Lett. – 2005. – Vol. 205. - № 1. – P. 23-29. 164. Oshita F., Kameda Y., Hamanaka N., Saito H., Yamada K., Noda K., Mitsuda A. High expression of integrin beta1 and p53 is a greater poor prognostic factor than clinical stage in small-cell lung cancer. // Am. J. Clin. Oncol. - 2004. Vol. 27, № 3. - P. 215-219. 165. Ota T., Fujikawa-yamamoto K., Zong Z.P. et al. Plant-glycoside modulation of cell surface related to control of differentiation in cultured B16 melanoma cells. // Cancer Res. - 1987. - Vol. 15. - № 14. - P. 3863-3867. 166. Park SC, Yoo HS, Park C, Cho CK, Kim GY, Kim WJ, Lee YW, Choi YH. Induction of apoptosis in human lung carcinoma cells by the water extract of Panax notoginseng is associated with the activation of caspase-3 through downregulation of Akt. // Int J Oncol. 2009. – Vol. 35. - № 1. – p. 121-127. 167. Patel L., Parker B., Yang D., Zhang W. Translational genomics in cancer research: converting profiles into personalized cancermedicine. // Cancer Biol Med. 2013 Dec;10(4):214-220. 168. Patella V, Incorvaia C, Ricciardi L, Florio G, Saija A, Frati F, Gangemi S. The adhesion molecule ICAM-1 is overexpressed in patients with Hymenoptera 141 venom allergy and decreases after ultrarush venom immunotherapy. // J Biol Regul Homeost Agents. – 2011, - Vol. 25. - № 3. – p. 465-468. 169. Peppa D., Micco L., Javaid A. Et al. Blockade of immunosupressive cytokines restores NK cell antiviral function in chronic hepatitis B virus infection. // PloS Pathol. – 2010. – Vol. 16. - № 2. – p. 101-107. 170. Peralta EA, Murphy LL, Minnis J, Louis S, Dunnington GL. American ginseng inhibits induced COX-2 and NFKB activation in breast cancer cells. // J Surg Res. – 2009. – Vol. 157. № 2. - p: 261–267. 171. Portielje J. Et al. IL-12: a promising adjuvant for cancer vaccination. // cancer Immunol. Immunother. – 2003. – V. 52. – P. 133-144. 172. Oh G.S., Pae H.O., Choi B.M., Seo E.A., Kim D.H., Shin M.K., Kim J.D., Kim J.B., Chung H.T. 20(S)-Protopanaxatriol, one of ginsenoside metabolites, inhibits inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 expressions through inactivation of nuclear factor-kappaB in RAW 264.7 macrophages stimulated with lipopolysaccharide. // Cancer Lett. – 2005. – Vol. 205. - № 1. – P. 23-29. 173. Qi F., Li A., Inagak Y., Gao J., Li J., Kokudo N., Li X., Tang W. Chinese herbal medicines as adjuvant treatment during chemo- or radio-therapy for cancer. // Biosci Trends. 2010. – Vol. 4. - № 6. – p. 297-307 174. Rausch WD, Liu S, Gille G, Radad K. Neuroprotective effects of ginsenosides. // Acta Neurobiol Exp. 2006. – Vol. 66. – p. 369–375. 175. Roitt I., Brostoff J., Male D. Immunology. // London: Mosby. – 1996. – 414 p. 176. Sasada T, Suekane S. Variation of tumor-infiltrating lymphocytes in human cancers: controversy on clinical significance. // Immunotherapy. – 2011. – Vol. 3. - № 10. – p. 1235-1251. 177. Schumacher B., van der Pluijm I., Moorhouse M., Kosteas T. et al. Delayed and accelerated aging share common longevity assurance mechanisms. - PLoS Genet. – 2008. –Vol. 4. - № 8. – p. 1050-1061. 178. Sharp J.G., Riches A.C., Littlewood V., Thomas D.B. The incidence, pathology and transplantation of hepatomas in CBA mice. // J. Pathol. – 1976. – Vol. 119. - № 4. – p. 211-220 142 179. Shin H. C., Shiozawa T., Miyamoto T., Kashima H., Kurai M., Konishi I. Immunohistochemical expression of E-cadherin and beta-catenin in the normal and malignant human endometrium: an inverse correlation between E-cadherin and nuclear beta-catenin expression. // Anticancer. Res. – 2004. – Vol. 24, № 6. – P. 3843-3850. 180. Shirai A., Furukawa M., Yoshizaki T. Expression of intercellular adhesion molecule (ICAM)-1 in adenoid cystic carcinoma of the head and neck. // Laryngoscope. - 2003. - Vol. 113, № 11. - P. 1955-1960. 181. Smith M.J., Dunn G.P., Schreiber R.D. Cancer immunosurveilance and immunoediting: the roles of immunity in suppressing tumor development and shaping tumor immunogenicity. // Adv immunol. – 2006. 90:1-50. 182. Spizzo G., Went P., Dirnhofer S., Obrist P., Moch H., Baeuerle P., MuellerHolzner E., Marth C., Gastl G., Zeimet A. Overexpression of epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) is an independent prognostic marker for reduced survival of patients with epithelial ovarian cancer. // Gynecol Oncol. - 2006. Vol. 5. - P. 1287-1292. 183. Strengell M., Maticainen S., Siren J. et al. IL-21 in synergy with IL-15 or IL-18 enhances IFN-gamma production in human NK and T cell. // Immunol. – 2003. – Vol. 170. – p. 5464-5469. 184. Sumagin R., Prizant H., Lomakina E., Waugh R., Sarelius I. LFA-1 and Mac-1 define characteristically different intralumenal crawling and emigration patterns for monocytes and neutrophils in situ. // J Immunol. – 2010. – Vol. 185. - № 11. – p. 7057-7066. 185. Sun F., Sun Y., Yu Z. Et al. Interleukin-10 gene polimorphisms influence susceptibility to cachexia in patients with low-third gastric cancer in a Chinese population. // Mol Diagn Ther. – 2010. – Vol. 14. - № 2. – p. 95-100. 186. Takatsuki H., Komatsu S., Sano R., Takada Y., Tsuji T. Adhesion of gastric carcinoma cells to peritoneum mediated by alpha3beta1 integrin (VLA-3). // Cancer Res. - 2004. - Vol. 64, № 17. - P. 6065-6070. 187. Tanaka H., Yashiro M., Sunami T., Sakate Y., Kosaka K., Hirakawa K. ICAM2 gene therapy for peritoneal dissemination of scirrhous gastric carcinoma. // Clin. Cancer. Res. – 2004. – Vol 10, № 14. –P. 4885-4892. 143 188. Thedieck C., Kuczyk M., Klingel K., Steiert I., Mijller C. A., Klein G. Expression of Ksp-cadherin during kidney development and in renal cell carcinoma. // Br. J. Cancer – 2005. - Vol. 92, № 11. - P. 2010-2017. 189. Trinchieri G. Interleukin-12 and the regulation of innate resistance and adaptive immunity // Nature Rev Immunol – 2003. – V. 3. – p. 133-148. 190. Tsanou E, Peschos D, Batistatou A, Charalabopoulos A, Charalabopoulos K.The E-cadherin adhesion molecule and colorectal cancer. A global literature approach. // Anticancer Res. – 2008. – Vol. 28. - № 6A. – p. 3815-3826. 191. Umerava K., Asakura S., Jim Y.M. et al. Localization of vitronectin- and fibronectin-receptors on cultured human glioma cells. // Brain Res. - 1994. Vol. 659, № 1-2. - Р. 23-32. 192. Van der Horst P.H., Wang Y., Vandenput I. et al. Progesterone inhibits epithelial-to-mesenchymal transition in endometrial cancer. // PLos One. – 2012. – 7(1): e30840. 193. Vogel B.E., Tarone G., Giancotti F.G., Gailit J., Ruoslahti E. A novel fibronectin receptor with an unexpected subunit composition (alpha v beta 1). // J. Biol. Chem. 1990. – Vol. 265. - № 11. – p. 5934-5937. 194. Wakita D., Sumida K., Iwakura Y. et al. Tumor-infiltrating IL-17 producing γδ T cells support the progression of tumor by promoting angiogenesis. // Eur J Immunol (2010) 40:1927-1937. 195. Wang N, Wan JB, Chan SW, Deng YH, Yu N, Zhang QW, Wang YT, Lee SM. Comparative study on saponin fractions from Panax notoginseng inhibiting inflammation-induced endothelial adhesion molecule expression and monocyte adhesion. // Chin. Met. 2011. - Oct 13. – p. 6-37. 196. Weber GF, Bjerke MA, Desimone DW. Integrins and cadherins join forces to form adhesive networks.// J Cell Sci. – 2011. - 124(Pt 8):1183-1193. 197. Wesch D., Glatzel A., Kabelitz D. Differentiation of resting human peripheral blood γδ T cells toward Th1- or Th2-phenotype. // Cell Immunol. - 2001. – Vol. 212. - № 2. – p. :110-117. 198. Wong SY, Hynes RO. Tumor-lymphatic interactions in an activated stromal microenvironment. // J. Cell. Biochem. - 2007;101(4):840-50. 144 199. Yan Z, Yang R, Jiang Y, Yang Z, Yang J, Zhao Q, Lu Y. Induction of apoptosis in human promyelocytic leukemia HL60 cells by panaxynol and panaxydol. // Molecules. – 2011. Vol. 16. - № 7. – p. 5561-5573. 200. Yoneda T. Role of cell adhesion molecules in metastasis. // Clin. Calcium. – 2002. – Vol. 12. № 5. –P. 620-625. 201. Yoshimuda A. Signal transduction of inflammatory cytokines and tumor development. // Cancer Sci. – 2006. – Vol. 97. - № 6. – p. 439-447 202. Yu M., Kissling S., Freyschmidt-Paul P. et al. Interleukin-6 cytokine family member oncostain M is a hair-follicle-expressed factor with hair growth inhibitory properties. // Exp. Dermatol. – 2008. – Vol. 17. - № 1. – p. 12-19. 203. Zeng X. L., Tu Z. G. Induction of differentiation by ginsenoside Rh2 in hepatocarcinoma cell SMNIC-7721// Ai. Zheng. – 2004. – Vol. 23. - № 8. – P. 879- 884. 204. Zhang HM, Chen SW, Xie CG et al. Effects and mechanism of ShenQi compound recipe on inflammation maker in GK rats. // Zhong Yao Cai. – 2006. – Vol. 29. - № 3. - p:249-253. 205. Zhou J., Sargiannidou I., Tuszynski G. The role of adhesive proteins in the hematogenous spread of cancer. // In Vivo. - 2000 - Vol. 14, № 1. - Р. 199-208.
