Получение и характеристика рекомбинантного белка тиоредоксин пероксидазы Opisthorchis felineus Петренко Василий Антонович Научный руководитель: к.б.н., с.н.с. Катохин А. В. Новосибирский Государственный Университет Факультет естественных наук ИЦиГ СО РАН Лаборатория молекулярных механизмов патологических процессов Объект исследования 1 мм тип Platyhelminthes, класс Trematoda, подкласс Digenea, отряд Plagiorchiida, семейство Opisthorchiidae - Opisthorchis felineus Постановка проблемы Молекулярные и клеточные механизмы взаимоотношений O.felineus с окончательным хозяином: – Механическое воздействие на эпителий печеночных протоков; – Выделение паразитом экскреторно-секреторного продукта (ЭСП): • Протеолитическое разрушение клеток хозяина (пищеварительная функция) • Выделение продуктов жизнедеятельности • Обеспечение иммуномодуляторных эффектов • Нейтрализация защитных реакций со стороны хозяина, в том числе со стороны иммунных эффекторных клеток Ферменты антиоксидантной системы • Каталазы • Супероксиддисмутазы • Пероксиредоксины Функции пероксиредоксинов у трематод защита от активных форм кислорода, продуцирующихся в результате собственного метаболизма паразита защита от активных форм кислорода, выделяемых иммунными эффекторными клетками хозяина Схема реакции нейтрализации пероксидов пероксиредоксином (TPx) Классификация пероксиредоксинов Семейства: • • • • • • Prx1/AhpC PrxQ/BCP Tpx AhpE Prx5 Prx6 (typ 2-Cys) (typ 2-Cys) (typ 2-Cys) (typ 2-Cys) (atyp 2-Cys) (1-Cys) (Nelson, K. J et al. 2011) Классификация внутри семейства Prx1/AhpC • Prx1/AhpC – a, b.. – m (митохондриальный) (Wood Z.A. et al. 2003) Цель Получение рекомбинантного белка тиоредоксин пероксидазы O. felineus и описание его структурных и иммуногенных характеристик. Задачи 1. Проведение сравнительного анализа структуры белка тиоредоксин пероксидазы O. felineus; 2. создание генно-инженерной конструкции тиоредоксин пероксидазы O. felineus и наработка рекомбинантного белка тиоредоксин пероксидазы O. felineus; 3. получение поликлональных антител на рекомбинантный белок тиоредоксин пероксидазу O. felineus и анализ их реактивности с различными антигенами для определения специфичности; 4. проведение иммуногистохимического анализа тканевой локализации белка. Структурная характеристика тиоредоксин пероксидазы O. felineus MGFAITVIVCTISLVSAMALLPNQPAPEFSGMAVVNGEFKNISLKDYRGKYVILLFYPLDFTF VCPTELIAFSDAAEEFKSKNCVIIGCSTDSVYAHLQWTKMDRKAGGLGKMNIPLLSDKNMKIS RAYHVLDEEEGHAFRGQFLIDPKGILRQITVNDRPVGRSVEEAIRLLEAFHFHEQHGDVCPAN WKPKGKTMKADPVAAQEYFSSVN Подчеркнута последовательность сигнального пептида (c 1 по 17 аа). Красным отмечены пероксидазный и «разрешающий» цистеины - Cys 65 и Cys 186. При помощи BLASTp-анализа против базы данных CDD (NCBI) TPx O. felineus однозначно классифицируется как типичный 2-цис пероксиредоксин Структурная характеристика тиоредоксин пероксидазы O. felineus Схема вторичной структуры TPx O. felineus, предсказанной с помощью сервера PSIPRED Красными прямоугольниками отмечены консервативные цистеиновые участки; синим – обозначена консенсусная последовательность NXS/T, необходимая для N- гликозилирования Анализ степени консерватизма функциональных сайтов белка Выравнивание аминокислотных последовательностей TPx плоских червей. Желтым – обозначены высококонсервативные цистеиновые домены. Серым обозначена консенсусная последовательность NXS/T, необходимая для Nгликозилирования Филогенетическое дерево белков семейства пероксиредоксинов у плоских червей Исследуемый белок был отнесен к подсемейству Prx1b Создание генно-инженерной конструкции для получения белка TPx O. felineus мРНК 6 His tag T5 promoter кДНК кДНК TPx-Of Bam HI Hind III pQE31 3463 bp Bam HI Hind III Последовательность без лидерного пептида TpX Of (585bp) лигирование pQE31-TpX 4048 bp Экспрессия, анализ растворимости и очистка Ni-NTA хроматографией recTPx O. felineus 1 2 3 Получение поликлональных антител Иммунизация кролика белком recTPx-Of 1 день – иммунизация с полным адъювантом Фрейнда; забор крови в качестве контроля; 14 день - иммунизация с неполным адъювантом Фрейнда; 28 день - иммунизация с неполным адъювантом Фрейнда; 42 день – иммунизация с раствором чистого антигена; 61 день – первый забор крови Проверка специфичности полученной сыворотки 1.200 1.000 1.000 0.800 0.800 0.600 PreIm 0.400 TPx-Ab 0.400 0.200 0.200 Проверка реактивности различных сывороток recTPx-Of PreIm TPx-Ab 1/128000 1/64000 1/32000 1/16000 1/8000 0.000 1/4000 Разведение сыворотки 0.600 1/2000 1/500 1/1000 1/2000 1/4000 1/8000 1/16000 1/32000 1/64000 1/128000 1/256000 1/512000 0 0.000 OЕ 1/1000 1.200 OЕ Разведение сыворотки Оценка реактивности антител TPx-Ab с recTPx-Of Проверка специфичности полученной сыворотки 1.200 OЕ 1.000 0.800 0.600 0.400 0.200 Антиген 0.000 лизат клеток E.coli recTPx-Of preim recGST-Of TPx-Ab Оценка взаимодействия TPx-Ab и отрицательного контроля с различными антигенами Проверка взаимодействия сыворотки с соматическим антигеном Som-Ag 3.500 Som-Ab OЕ 3.000 2.500 2.000 1/1000 preIm 1/1000 TPx-Ab 1/1000 Som-Ab 1.500 1.000 0.500 0.000 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125 0.0625 Разведение антигена Взаимодействие различных сывороток с соматическим антигеном Определение тканевой локализации TPx O. felineus а б 1 3 3 4 1 2 200 µm 5 3 200 µm Иммунохимическая окраска гистологических срезов печени золотистых хомячков, зараженных O. felineus: а. преиммунной сывороткой; б. сывороткой с TPx-Ab (зараженность 2 месяца). Стрелками и цифрами обозначены: ткани хозяина – 1. эпителий печеночных протоков, 2. паренхима; органы взрослой особи O. felineus – 3. кишечник, 4. матка, 5. брюшная присоска. Выводы 1. Анализ структуры белка TPx O. felineus выявил признаки класса типичных 2Цис пероксиредоксинов и наличие сайта возможного N-гликозилирования, консервативного у описторхид, филогенетический анализ позволил уточнить классификацию и отнести белок тиоредоксин-пероксидазу O. felineus к подсемейству Prx1b. 2. Создана генно-инженерная конструкция на основе вектора pQE31 для экспрессии тиоредоксин пероксидазы (без сигнального пептида) O. felineus и наработан рекомбинантный белок recTPx-Of в бактериальной системе E. coli размером 24kDa. 3. В результате иммунизации кроликов были наработаны поликлональные антитела против recTPx-Of и при проверке на специфичность дали положительный ответ при взаимодействии с соматическим антигеном, что свидетельствует о соответствии рекомбинантного белка recTPx-Of тиоредоксин-пероксидазе O. felineus. 4. При помощи иммуногистохимического окрашивания показано, что белок TPx присутствует во всех тканях паразита. Спасибо за внимание Клонирование гена TPx O. felineus Электрофорез ПЦРфрагмента Маркер λДНК/BssT1 TpX Of ПЦР-скрининг колоний после трансформации вектором Маркер λДНК/BssT1 1 2 3 4 5 6 7 8 11 12 13 14 15 16 17 18 9 10 925 421 19 20 925 bp 421 bp 925 421 1-20 - номера колоний; Маркер Лямбда ДНК/BssT1 Обобщенная схема окислительновосстановительного цикла белка TPx (S. McGonigle et al., 1998) 1. 2. 3. A.K. Abbas, A.H. Lichtman. Basic Immunology, 2004 Литература • McGonigle S., Dalton J.P., James E.R.. Peroxidoxins: A New Antioxidant Family //Parasitology Today, 1998, vol. 14, p.139145 • Nelson, K. J., Knutson, S. T., Soito L., Klomsiri C., Poole, L. B., and Fetrow, J. S.. Analysis of the peroxiredoxin family: using active site structure and sequence information for global classification and residue analysis// Proteins, 2011, vol. 79, 947-964 • Wood Z.A., Schroder E., Harris J.R., Poole L.B.. Structure, mechanism and regulation of peroxiredoxins//TRENDS in Biochemical Sciences, 2003, vol.28, 32-40