Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Северо-Западный
реклама
![](http://s1.studylib.ru/store/data/002674322_1-98a6a7d993a08ed1a10489e878e442c6-768x994.png "Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Северо-Западный")
Государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего профессионального образования "Северо-Западный
государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова"
Министерства здравоохранения Российской Федерации
На правах рукописи
ФИЛИППОВА
Лариса Вячеславовна
ОСОБЕННОСТИ ИММУННОГО ОТВЕТА НА ШТАММЫ CRYPTOCOCCUS
NEOFORMANS РАЗНОЙ ВИРУЛЕНТНОСТИ
03.02.12 – микология
14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология
ДИССЕРТАЦИЯ
на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Научные руководители:
доктор биологических наук, профессор
Васильева Наталья Всеволодовна,
доктор медицинских наук
Киселёва Екатерина Прохоровна
Санкт-Петербург – 2014
2
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ .................................................................................................................. 5
ГЛАВА 1 Криптококк и криптококкоз ..................................................................... 11
1.1
Характеристика комплекса видов
Cryptococcus neoformans / Cryptococcus gattii ................................................ 11
1.2
Патогенность криптококков............................................................................. 16
1.2.1 Основные факторы патогенности C. neoformans и C. gattii ............... 16
1.2.2 Другие факторы патогенности C. neoformans ...................................... 20
1.3
Клинические варианты и факторы риска развития криптококкоза ............. 23
ГЛАВА 2 Штаммы C.neoformans и врожденный иммунный ответ ....................... 26
2.1
Взаимодействие C. neoformans с макрофагами.............................................. 26
2.1.1 Паттерн-распознающие рецепторы....................................................... 26
2.1.1.1 Маннозный рецептор .................................................................. 27
2.1.1.2 Дектин – 1 .................................................................................... 29
2.1.1.3 Toll-рецепторы ............................................................................ 31
2.2
Роль опсонинов в иммунном ответе при криптококкозе .............................. 32
2.2.1 Компоненты комплемента ..................................................................... 32
2.2.2 Антитела .................................................................................................. 33
2.3
Факторы микробоцидности макрофагов ........................................................ 34
2.3.1 Кислородзависимые факторы микробоцидности ................................ 34
2.3.1.1 Образование активных продуктов кислорода.......................... 34
2.3.1.2 Реактивные промежуточные продукты азота ........................ 36
2.3.2 Кислороднезависимые факторы микробоцидности ............................ 37
2.4
Медиаторы иммунного ответа ......................................................................... 38
2.5
Резистентность к антифунгальным препаратам при криптококковой
инфекции ............................................................................................................ 42
3
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 3 Объекты и методы исследования ............................................................. 46
3.1
Объекты исследования ..................................................................................... 46
3.1.1 Штаммы Cryptococcus neoformans ........................................................ 46
3.1.2 Экспериментальные животные ............................................................. 47
3.2
Методы исследования ....................................................................................... 48
3.2.1 Морфология культур C. neoformans...................................................... 48
3.2.2 Видовая идентификация Cryptococcus neoformans ............................. 48
3.2.3 Определение вирулентности криптококков на лабораторных
животных ................................................................................................. 50
3.2.4 Определение фенолоксидазной активности C. neoformans ................ 51
3.2.5 Получение перитонеальных макрофагов и культивирование их
in vitro ....................................................................................................... 51
3.2.6 Определение фагоцитарной активности макрофагов ......................... 52
3.2.7 Методы определения факторов микробоцидности .................................... 53
3.2.7.1 Продукция нитроксид анионов… ........................................... 53
3.2.7.2 Продукция супероксид анионов в тесте с нитросиним
тетразолием ............................................................................... 54
3.2.8 Определение уровня продукции цитокинов макрофагами ................ 55
3.2.9 Определение
цитотоксической
активности
перитонеальных
макрофагов .............................................................................................. 56
3.2.10 Методы
определения
чувствительности
C.
neoformans
к
антифунгальным агентам различного происхождения ....................... 56
3.2.10.1 Определение
чувствительности
C.
neoformans
к
флуконазолу и вориконазолу (CLSI M44-A)...................................... 56
3.2.10.2 Определение чувствительности к протегринам методом
серийных разведений............................................................................ 58
3.2.11 Методы статистического анализа полученных данных .................... 59
4
ГЛАВА 4 Морфо-биологическая характеристика штаммов С. neoformans .......... 61
4.1
Происхождение изолятов С. neoformans ........................................................ 61
4.2
Морфологическая и биологическая характеристика клинических
изолятов C. neoformans .................................................................................... 64
4.3
Определение патогенности криптококков на экспериментальных
животных ........................................................................................................... 68
ГЛАВА 5 Взаимодействие штаммов C.neoformans разной вирулентности с
перитонеальными макрофагами in vitro.................................................................... 71
5.1
Фагоцитарная активность макрофагов в отношении C. neoformans ........... 71
5.2
Влияние штаммов C. neoformans разной вирулентности на продукцию
факторов микробоцидности перитонеальными макрофагами ..................... 77
5.2.1 Влияние
штаммов
C.
neoformans
разной
вирулентности
на
способность макрофагов к продукции супероксиданионов in vitro .. .77
5.2.2 Влияние штаммов C. neoformans на способность макрофагов
продуцировать нитроксидные радикалы in vitro ................................. 78
5.3
Определение цитотоксической активности макрофагов по отношению к
штаммам C. neoformans разной вирулентности ............................................. 82
5.4
Оценка
спектра
цитокинов,
вырабатываемых
макрофагами,
при
взаимодействии с криптококками in vitro ...................................................... 84
5.5
Чувствительность штаммов C. neoformans разной вирулентности к азоловым
препаратам и антимикробным пептидам животного происхождения ........ . 89
ГЛАВА 6 Заключение ................................................................................................. . 94
ВЫВОДЫ ................................................................................................................... 108
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ..................................................................... 109
ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ .................................... 109
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................... 110
СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ................................................................. 142
5
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы исследования. Род Cryptococcus включает около ста
видов микромицетов, из них признанными патогенами является только комплекс
Cryptococcus neoformans / Cryptococcus gattii [120]. Cryptococcus neoformans базидиомицетовый гриб, является причиной тяжелого менингоэнцефалита и
диссеминированных
инфекций,
возникающих
преимущественно
у
иммунокомпрометированных лиц.
В настоящее время криптококковая инфекция является актуальной
медицинской проблемой. Ежегодно из 1 миллиона заболевших криптококкозом в
мире умирает 650 тысяч больных. Летальность составляет 3-5 % в странах
Европы и Америки и до 80% в странах Африки, и зависит от уровня
экономического развития страны
[115]. Без применения противогрибковых
препаратов летальность при криптококкозе составляет 100% [133]. Наряду с этим
периодически регистрируют вспышки криптококкоза у лиц без признаков
иммунодефицита,
которые
обусловлены
гипервирулентными
штаммами
Cryptococcus gattii [247; 81].
В последние годы отмечен рост резистентности грибов рода Cryptococcus к
к флуконазолу [212, 20]. В России показатели резистентности C. neoformans к
флуконазолу, как к основному антимикотическому препарату для лечения
криптококкоза, достигают 15 % [250]. Есть сведения о появлении штаммов C.
neoformans,
устойчивых
обуславливает
поиск
к
действию
новых
вориконазола [212].
альтернативных
Данный
средств,
факт
обладающих
антикриптококковой активностью.
Несмотря на то, что основной путь инфицирования человека криптококками
ингаляционный, криптококковая пневмония
заболевание
диагностируется,
менингоэнцефалита
или
как
правило,
диссеминации.
встречается
на
стадии
Макрофаги
крайне редко и
криптококкового
являются
первыми
иммунными клетками, контактирующими с C. neoformans в легких, поэтому
6
фагоцитоз криптококков макрофагами сегодня рассматривают как один из
главных механизмов, контролирующих возникновение инфекции и ее исход [153].
Вопрос о том, какую стратегию для выживания используют C. neoformans в
зависимости от факторов патогенности после поглощения фагоцитами и какому
из механизмов микробоцидности принадлежит доминирующая роль при
взаимодействии макрофагов с криптококками разной вирулентности, до сих пор
остается открытым. Кроме того, известно, что развитие инфекционного процесса
при
криптококкозе,
как
и
при
других
микотических
заболеваниях,
сопровождаются продукцией провоспалительных и противовоспалительных
цитокинов [133]. Однако данные об особенностях цитокинового профиля
макрофагов после взаимодействия с C. neoformans разной вирулентности
малочисленны и противоречивы.
Учитывая вышеизложенное, мы сконцентрировали свои экспериментальные
исследования на изучении взаимодействия макрофагов со штаммами C.
neoformans разной вирулентности.
Степень разработанности темы исследования. Область исследования
патогенных штаммов C. neoformans в Российской Федерации в основном
охватывает
вопросы,
посвященные изучению
факторов патогенности
C.
neoformans и их роли в патогенезе криптококкоза [Елинов Н.П., Васильева Н.В.,
Цинзерлинг В.А., Майская М.Ю., Тилева Е.А., Босак И.А.]. Особенности
взаимодействия фагоцитарных клеток с разными по вирулентности штаммами C.
neoformans фрагментарно отражены только в работах зарубежных исследователей
[Voelz K., Vecchiarelli A., Missall T., Zaragoza O., Brown G.D. Netea M., Casadevall
A. и др.]. В большинстве случаев проведенные исследования сосредоточены на
сравнении двух или нескольких изолятов криптококков, различающихся между
собой по степени вирулентности. Среди изучаемых штаммов, как правило,
встречаются генетически модифицированные невирулентные мутанты. Поэтому
необходимы дальнейшие исследования для выяснения роли вирулентности C.
neoformans
в иммунопатогенезе
криптококкоза. Для этого
мы
провели
экспериментальное исследование по изучению функциональной активности
7
макрофагов на всех этапах взаимодействия с клиническими изолятами C.
neoformans разной вирулентности in vitro.
Цель исследования. Изучить особенности функциональной активности
макрофагов при взаимодействии со штаммами Cryptococcus neoformans разной
вирулентности in vitro.
Задачи исследования. В рамках поставленной цели были сформулированы
следующие задачи:
1.
Определить вирулентность клинических изолятов C. neoformans на модели
экспериментального криптококкоза у мышей.
2.
Изучить
особенности
макрофагами
фагоцитоза
интактных
мышей
резидентными
штаммов
C.
перитонеальными
neoformans
разной
вирулентности.
3.
Исследовать способность штаммов C. neoformans разной вирулентности
индуцировать продукцию макрофагами активных форм кислорода и оксида
азота.
4.
Оценить продукцию цитокинов (IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17,
IL-23, TNF-α и TGF-β1) резидентными перитонеальными макрофагами
мышей
при
взаимодействии
со
штаммами
C.
neoformans
разной
вирулентности.
5.
Определить влияние факторов патогенности на чувствительность штаммов
C. neoformans к азоловым препаратам и антимикробным пептидам
животного происхождения.
Научная новизна исследования. Впервые проведен сравнительный анализ
влияния вирулентности клинических изолятов Cryptococcus neoformans на
функциональную активность макрофагов in vitro.
Впервые было показано, что все исследованные штаммы C. neoformans не
обладают способностью стимулировать продукцию супероксид и нитроксид
анионов интактными макрофагами. Также впервые показано, что в случае
предварительной
стимуляции
макрофагов
липополисахаридом
сильно
вирулентные штаммы подавляют продукцию оксида азота, а слабовирулентные
8
оказывают
противоположное
первичном
взаимодействии
действие.
Фактором
макрофагов,
микробоцидности
стимулированных
ЛПС,
при
как
с
сильновирулентными, так и со слабовирулентными штаммами C. neoformans
является продукция оксида азота.
Впервые установлены особенности цитокинового профиля перитонеальных
макрофагов мышей при взаимодействии с C. neoformans, характеризующийся
отсутствием
продукции
провоспалительных
цитокинов
и
взаимосвязью
выработки IL-10 и IL-13 с вирулентностью штаммов.
Впервые исследована противогрибковая активность суммарной фракции
протегринов (PG-1, PG-2, PG-3) в отношении клинических изолятов C. neoformans
in vitro и выявлена взаимосвязь чувствительности штаммов C. neoformans к
данным антимикробным пептидам со способностью к меланинообразованию.
Теоретическая и практическая значимость работы. Представленная
диссертационная работа является фундаментальным научным исследованием,
результаты которого вносят вклад в изучение иммунопатогенеза криптококкоза.
Работа
носит
экспериментально-теоретический
характер.
Результаты
исследования создают основу для поиска путей коррекции нарушенных
иммунных процессов и разработки методов прогнозирования течения заболевания
у больных криптококкозом. Изучение чувствительности штаммов C. neoformans к
современным и новым альтернативным противогрибковым средствам вносит
вклад
в
повышение
эффективности
антифунгальной
терапии
больных
криптококкозом.
Результаты диссертационной работы могут быть использованы в научных
исследованиях,
связанных
с
изучением
особенностей
взаимодействия
микромицетов и фагоцитов.
Внедрение
результатов
исследования.
Результаты
настоящего
исследования внедрены в учебный процесс и научную работу кафедры
медицинской микробиологии и кафедры клинической микологии, аллергологии и
иммунологии ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И.И.Мечникова Минздрава России, в
учебный процесс кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии ГБОУ ВПО
9
ПСПбГМУ им. акад. И.П.Павлова Минздрава России, в учебный процесс кафедры
инфекционных болезней (с курсом медицинской паразитологии и тропических
заболеваний) ФГБОУ ВМА им. С.М. Кирова Минобороны РФ.
Методология
и
методы
исследования.
диссертационной работы состояла в
научного
познания.
экспериментального
Работа
основа
последовательном применении методов
выполнена
исследования
Методологическая
с
в
дизайне
использованием
сравнительного
микробиологических,
физико-химических, иммунологических и статистических методов.
Положения, выносимые на защиту:
1. Фагоцитарная активность макрофагов в отношении C. neoformans зависит
от степени вирулентности: активнее поглощаются слабовирулентные
штаммы.
2. Выявлены различия между штаммами C. neoformans в отношении
выработки
оксида
азота
макрофагами,
активированными
липополисахаридом: сильновирулентные штаммы ингибируют продукцию
оксида азота, а слабовирулентные штаммы оказывают стимулирующее
действие.
3. Установлена взаимосвязь вирулентности штаммов C. neoformans с
продукцией макрофагами цитокинов IL-10 и IL-13, определяющими
формирование непротективного иммунного ответа.
4. Штаммы C. neoformans чувствительны к протегринам in vitro независимо от
степени вирулентности. Меланинообразующая способность клеток C.
neoformans снижает их чувствительность к действию протегринов.
Степень достоверности и апробация результатов. Степень достоверности
результатов, полученных при проведении экспериментов, подтверждается
достаточным и репрезентативным объёмом выборки выполненных наблюдений и
контрольных
статистической
исследований,
и
подтверждена
обработки
данных.
Методы
адекватными
методами
математической
обработки
полученных результатов соответствуют поставленным задачам.
10
Материалы
диссертации
доложены
на
17-ом
и
18-ом
конгрессах
международного общества по медицинской и ветеринарной микологии ISHAM
(Токио, Япония, 2009 г.; Берлин, Германия, 2012 г.), на 4-ом и 5-ом конгрессе
«Тенденции в медицинской микологии» (Афины, Греция, 2009 г.; Валенсия,
Испания, 2011 г.), на 9-ой международной конференции
криптококкозу
Всероссийской
ICCC
(Амстердам,
Нидерланды,
научно-практической
по криптококку и
2014),
конференции
по
на
ежегодной
медицинской
микробиологии и клинической микологии «Кашкинские чтения» (СанктПетербург, Россия, 2009, 2010, 2011, 2012, 2013, 2014 гг.) на заседании СанктПетербургского отделения Общества иммунологов Российской Федерации
(Санкт-Петербург, 2013).
Личное участие автора в получении результатов. Автором были
спланированы и лично выполнены все экспериментальные исследования по
проблеме и проведена статистическая обработка данных. В постановке и решении
конкретных задач, организации и выполнении исследований, обработке и
интерпретации полученных результатов автору принадлежит ведущая роль.
Публикации по материалам исследования. По теме диссертации
опубликовано 17 научных работ, в том числе 5 статей, из них 4 - в рецензируемых
изданиях, рекомендованных ВАК при Министерстве образования и науки
Российской Федерации и 12 публикаций в материалах отечественных и
международных конференций и конгрессов.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 142 страницах
машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания
методов исследования, результатов работы и их обсуждения, выводов и списка
литературы, содержащего 299 источников. Текст диссертации иллюстрирован 11
таблицами, 25 рисунками и микрофотографиями.
Диссертационная работа выполнена в НИЛ иммунологии и аллергологии
НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина государственного бюджетного
образовательного учреждения высшего профессионального образования "СевероЗападный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова"
Министерства здравоохранения Российской Федерации.
11
ГЛАВА 1 Криптококк и криптококкоз
1.1 Характеристика комплекса видов
Cryptococcus neoformans / Cryptococcus gattii
Из ста видов базидиомицетовых дрожжей рода Cryptococcus, признанными
патогенами является только комплекс Cryptococcus neoformans / Cryptococcus
gattii (рисунок 1) [120]. C. neoformans в качестве патогена для человека был
идентифицирован еще в 1890-ых годах (Busse О., 1894; Buschke А., 1895).
Комплекс C. neoformans / C. gattii на основании различий в распознавании
полисахаридной капсулы антителами, разделен на C. neoformans серотип A (C.
neoformans var. grubii), серотип D (C. neoformans var. neoformans), серотип A/D и
C. gattii серотипы B и C (прежде C. neoformans var. gattii) [202, 268,255].
В настоящее время другие разновидности криптококков стали относить к
потенциальным патогенам для человека. Отличительной особенностью этих
грибов является неспособность выживать при температуре человеческого тела, и
поэтому они очень редко вызывают развитие заболевания. Насчитывается порядка
15 видов грибов, относящихся к роду Cryptococcus, которые являются
клиническими изолятами и представлены C. adeliensis, C. albidosimilis, С. albidus,
C. curvatis, C. diffuens, C. flavescens, C. gastricus, C. humicola, C. laurentii, C.
liquefaciens, C. luteolis, C. macerans, C. magnus, C. saitoi, C. uzbekistanensis, C.
vishniacii [132]. Все указанные виды криптококков с разной частотой вызывают
криптококкоз у человека: по данным литературы, сообщается о 20 случаях
криптококкоза, вызванного C. laurentii и о 18 случаях С. albidus [167].
В
последние
годы
генетическоготипирования,
возбудителя.
отмечается
развитие
позволяющих
методов
быстро
молекулярно-
идентифицировать
12
Рисунок 1 – Филогенетическое дерево представителей рода Cryptococcus [132].
13
Широко используются электрофоретическое кариотипирование с использованием
полиморфизма длин амплифицированных фрагментов ДНК (AFLP), а также
цепная полимеразная реакция (PCR). Однако мультилокусное сиквенирование
(MLST) является референтным методом для типирования криптококков [73].
пульс-гель электрофореза, метод случайной амплификации полиморфной ДНК
(RAPD), метод полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ДНК (RFLP),
метод ДНК- гибридизации, метод Достижения в этой области позволили, в
соответствии с имеющейся классификацией, определить девять главных
генотипов криптококков: C. neoformans var. grubii молекулярные типы VNI, VNII
и VNB; C. neoformans var. neoformans молекулярный тип VNIV; серотип A/D
молекулярный тип VNIII и C. gattii (серотипы В и С) с молекулярными типами
VGI, VGII, VGIII и VGIV (рисунок 2) [205, 136, 132].
Рисунок 2 – Схема идентификации комплекса видов C. neoformans/C. gattii. [132].
Идентификация криптококков посредством MLST очень надежна, но не
всегда доступна в связи с высокой стоимостью и длительностью исполнения
исследований. Поэтому требуется внедрение в диагностику дополнительных
методов, позволяющих быстро идентифицировать и типировать возбудителя.
Одним
из
таких
методов
является
матрично-активированная
лазерная
десорбционно-ионизационная времяпролетная масс-спектрометрия (MALDI-TOFMS), которая активно внедряется в лабораторную микологию в последнее
14
десятилетие. В 2011 г. L.R. McTaggart с соавторами представили успешный опыт
идентификации c использованием MALDI-TOF-MS C. neoformans var. neoformans,
C. neoformans var. grubii и C. gattii. В работе C. Firacative и соавторов показано,
что MALDI-TOF-MS является надежным методом разделения C. neoformans и C.
gattii, а также продемонстрирована возможность применения некоторых методов
анализа масс-спектров для внутривидового типирования изолятов. В частности, с
помощью построения MSP-дендрограммы и псевдогелей изоляты удалось
разделить на группы, соответствующие молекулярным типам этих видов по
MLST. Аналогичные результаты представлены в сообщении B. Posteraro и
соавторов. По-видимому, это одни из первых успешных попыток применения
протеомного субтипирования C. neoformans в последние несколько лет [228, 192,
118].
C. neoformans вызывает заболевание у лиц с выраженным нарушением
иммунитета, хотя в литературе описаны и исключения [84]. Криптококки
обнаруживают повсеместно в окружающей среде, но чаще всего в помете голубей
или почве. Большинство изолятов C. neoformans относят к серотипу A или к
серотипу D. А и D серотипы эволюционно разделились, и их всегда описывали
как варианты, а не как отдельные разновидности [173]. Однако недавно
предложено описывать эти два серотипа C. neoformans как различные виды [246],
потому что они разделились до такой степени, что нормальное спаривание стало
невозможным, а при сравнении их геномов доказано отсутствие обмена
генетической
информации
между
ними
[166].
Необходимы
дальнейшие
исследования для анализа продолжающегося внутреннего видообразования.
Серотип A - преобладающий серотип C. neoformans, ответственен за
возникновение 95% всех случаев криптококкоковой инфекции [135]. По MLSTсиквинированию и AFLP-типированию, классификация на три молекулярных
типа (VNI,VNII,VNB) подтверждена данными, полученными при проведении
сравнительной геномной гибридизации (CGH) [5, 205,72]. VNI - наиболее общий
молекулярный
тип,
встречающийся
у
78%
изолятов
C.
neoformans.
15
Первоначально, VNB штаммы были найдены только в Ботсване [205], но недавно
они также были выделены в Руанде, в Португалии, и в Бразилии [246].
Штаммы серотипа D обнаруживают повсеместно, но наиболее они
распространены в регионах с умеренным климатом, например, в Европе, где в
30% случаев выделяют серотип D. Это ограниченное распространение может
быть обусловлено тем фактом, что штаммы серотипа D более чувствительны к
действию высоких температур, чем клетки серотипа A [191]. Клинические
проявления инфекции у человека, вызванной серотипом A или D похожи, но
некоторые авторы сообщали об их различиях по вирулентности, определяемой на
экспериментальных моделях [70, 154].
Серотип AD - результат слияния между штаммами серотипа A и серотипа
D, с последующим нарушенным мейозом из-за геномной несовместимости [136,
176]. Поэтому штаммы AD являются диплоидными, содержат два набора
хромосом, и несут аллели двух спаривающихся типов. Штаммы серотипа AD
обнаруживают сравнительно часто: недавним анализом природных и клинических
изолятов C. neoformans в Северной Америке показано, что ~7.5% штаммов,
изолированных из окружающей среды – AD гибриды. Большинство изолятов
серотипа AD обнаружено в Африке [189].
Определение генотипа и изучение эпидемиологии разновидностей C.
neoformans привело к выделению C. neoformans var. gattii в отдельную
разновидность, которая основана на генетической изменчивости и недостаточной
очевидности генетической рекомбинации между C. neoformans и C. gattii [174].
Кроме
того,
C.
gattii
характеристиками,
отличается
естественной
от
C.
средой
neoformans
фенотипическими
обитания,
эпидемиологией,
клиническими проявлениями болезни, и ответом на антифунгальную терапию.
Распространение
C.
gattii
географически
ограничено
тропическим
и
субтропическим регионами, за исключением Британской Колумбии. C. gattii
вызывает заболевание, главным образом, у иммунокомпетентных лиц, поэтому
вспышка криптококкоза у здоровых лиц в Британской Колумбии выдвинула на
первый план потенциал C. gattii как этиологического фактора криптококкоза [267,
16
80]. Подъем уровня заболеваемости на Острове Ванкувер достиг 36 случаев на
миллион населения в год в течение 2002-2005 годов [247]. Есть свидетельства,
подтверждающие, что вспышка с тех пор распространилась к материку, к СевероЗападу Тихого океана [203, 53, 119, 248, 42, 247].
Bovers и др. предложили рассматривать четыре известных молекулярных
типа C. gattii (VGI, VGII, VGIII, VGIV) как различные варианты, точно так же как
вариант neoformans и вариант grubii [185, 246]. Большинство клинических
изолятов C. gattii относятся к штаммам с сильной вирулентностью и принадлежат
генотипу VGII [25]. В настоящее время изоляты этого генотипа разделены на три
подтипа: генотип VGIIa гипервирулентных клинических изолятов, генотип VGIIb,
характерный, главным образом, природным изолятам, и генотип VGIIc, присущий
гипервирулентным изолятам, выделенным в Штате Орегон, США [71, 203, 25].
1.2 Патогенность криптококков
1.2.1 Основные факторы патогенности C. neoformans
В настоящее время к основным факторам патогенности криптококков
относятся: способность к образованию полисахаридной капсулы и меланина, рост
при 37 С, экспрессия уреазы, фосфолипазы и тип спаривания [263, 274] . Особые
споры ведутся о способности криптококков к образованию полисахаридной
капсулы и меланина, как о хорошо известных и изученных составляющих
патогенности
с
одной
стороны
и,
оказывающих
множественное,
разнонаправленное действие на иммунную систему макроорганизма, с другой [27,
74, 34, 126]. Помимо основных факторов вирулентности, существует большое
количество белков и ферментов, которые недавно стали ассоциировать с
вирулентностью криптококка.
Адаптация микроорганизмов к окружающей их среде часто ассоциируют с
выработкой свойств, которые помогают
выживать в определенных условиях.
Одним из таких свойств, характерным для многих микроорганизмов, являются их
17
капсулы. В окружающей среде, капсула играет важную роль в защите организма
против неблагоприятных условий, например таких, как обезвоживание [255].
Клетки
C.
neoformans
микроскопически
в
тканях
и
в
культуре
характеризуются как капсулированные сферические дрожжи. Размер капсулы
зависит от штамма и условий культивации. Штаммы с капсулой среднего размера
чаще всего имеют диаметр клетки 4-10 мкм, слабо капсулированные штаммы – 25 мкм, в то время как диаметр клетки сильно капсулированных изолятов
достигает 80 мкм [58]. Размер криптококковой капсулы изменяется в зависимости
от условий окружающей среды. У природных изолятов C. neoformans редко
определяется большая капсула, в отличие от клинических. Микромицеты, для
того, чтобы они смогли бы проникнуть в альвеолы через верхние дыхательные
пути, должны иметь диаметр менее 4 мкм [58]. Однако, при развитии инфекции,
капсула динамически увеличивается в размере и изменяется в зависимости от
локализации процесса. Например, ткани легких и головного мозга, действуют как
активный индуктор роста капсулы [209]. Размер капсулы может также
экспериментально модулироваться путем выращивания C. neoformans на жидком
бульоне Сабуро в присутствии сыворотки, или в среде с низким содержанием
железа [230, 280]. Эти условия существуют во внутренней среде макроорганизма
и могут, таким образом, способствовать увеличению капсулы [185].
Криптококковая капсула состоит в основном из полисахарида, при этом
содержание воды в ней составляет 99 % всего веса. Полисахаридная капсула
обладает отрицательным зарядом, обусловленным карбоксильным остатком
глюкуроновой кислоты в полисахариде. Полисахариды капсулы – физически
организованные
волокна,
которые
можно
наблюдать
при
электронной
микроскопии [57, 226]. Плотность волокон и молекул полисахарида изменяются
согласно пространственному расположению.
Капсула состоит из двух типов полисахаридов: глюкуроноксиломаннана
(GXM) и галактоксиломаннана (GalXM). GXM составляет приблизительно 9095%, а GalXM – 5-8% от общей массы полисахарида. Кроме того, в составе
капсульного полисахарида идентифицировано 1-3 % маннопротеинов и следы
18
сиаловых кислот. Роль этих компонентов в архитектонике капсулы остается
неизвестной [217].
На основании анализа GXM, выделенного из супернатанта грибов,
установлено, что этот компонент имеет высокую молекулярную массу со сложной
структурой. Средняя молекулярная масса может варьировать от 1700 до 7000 kDa
в зависимости от штамма. Структурно, главная цепь GXM состоит из линейного
α-(1,3)-маннана с β-(1,2)-глюкуроновым кислотным остатком, формируя основной
кор, который является повторяющейся единицей для всех серотипов. Маннозные
остатки могут быть 6-O-ацетильными и могут быть заменены на ксилозильные
единицы β-(1,2)–или β-(1,4) – происхождения, в зависимости от серотипа.
Соотношения ксилозы, маннозы и глюкуроновых кислотных остатков изменяются
в зависимости от серотипа в пропорции 1:3:1, 2:3:1, 3:3:1 и 4:3:1 для серотипов D,
A, B и C, соответственно.
GalXM содержит в своей основе α-(1,6) – галактан и четыре коротких
олигосахаридных ответвленных структуры, состоящих из α-(1,3) – маннозы и α(1,4) – маннозы, β-галактозидазы с различным количеством β-(1,2)- или β-(1,3) –
ксилозных групп [193]. Композиционным анализом GalXM, подтвержденным
газовой хроматографической масс-спектрометрией, показано содержание в
полисахариде: ксилозы –22 %; маннозы –29 % и галактозы–50 % [88].
В некоторых экспериментальных исследованиях установлено, что штаммы
без капсулы менее вирулентны, чем клетки грибов с большой капсулой, поэтому
изучению влияния капсульного полисахарида C. neoformans на течение
инфекционного процесса посвящено много экспериментальных работ. Важность
капсулы как фактора вирулентности подтверждается и тем фактом, что штаммы
C. neoformans, у которых отсутствует капсула, значительно реже вызывают
заболевание криптококкозом [30]. Однако, хотя наличие капсулы и способствует
значительному вкладу в вирулентность C. neoformans, это - не единственное
условие. Многие из non-neoformans
криптококков обладают капсулой и не
являются патогенными [185]. Также, в одном из исследований, штамм C.
neoformans без капсулы являлся причиной персистирующей инфекции головного
19
мозга безтимусных мышей, чего не наблюдалось у мышей только с дефектами
врожденного иммунитета [58]. Из этого следует, что при существенном
повреждении иммунитета даже штаммы без капсулы сохраняют потенциал
вирулентности [185].
Показано, что этот структурный полимер обладает иммуномодулирующими
свойствами и способствует выживанию криптококков в пределах макроорганизма
[255, 204]. Например, капсула ингибирует фагоцитоз C. neoformans макрофагами
в отсутствии опсонинов [170] и препятствует перевариванию в фагосоме [261].
Высокие уровни антигенов капсульного полисахарида в спинномозговой
жидкости могут изменять осмолярность ЦСЖ [109]. Кроме того, показано, что
капсульный материал подавляет миграцию фагоцитов (например, нейтрофилов)
[102, 101, 107], вмешивается в цитокиновую секрецию [55, 56], способен
напрямую ингибировать Т-клеточную пролиферацию [278] и препятствовать
созреванию и активации дендритных клеток [258, 110].
Способность C. neoformans к выработке меланина была обнаружена
Штайбом в 1960-ые годы [216]. Меланин - отрицательно заряженный,
гидрофобный пигмент с высоким молекулярным весом, который сообразуется
путем окислительной полимеризации фенольных составляющих [59]. Синтез
меланина у C. neoformans катализируется лакказой в присутствии некоторых oдифенольных составляющих, таких как 3,4-дигидрофенилаланин (L-ДОФА) [275].
Лакказа – гликопротеин, локализующийся в клеточной стенке гриба. Такая
локализация выгодна для криптококка по двум причинам [271, 273]. Во-первых,
возникает препятствие для проникновения в цитоплазму потенциально токсичных
побочных продуктов меланогенеза, и, во-вторых, отложение меланина на
клеточной стенке защищает криптококк от токсинов, антибиотиков и других
вредных
факторов.
neoformans
гораздо
В
действительности,
более
устойчивы
меланизированные
к
штаммы
антифунгальным
C.
препаратам
(амфотерицину, флуконазолу, каспофунгину), чем немеланизированные [106].
Следовательно, меланогенез развился для обеспечения защиты от воздействия
вредных
условий
окружающей
среды
[242,
272].
Другими
авторами
20
продемонстрировано, что клетки C. neoformans, выделенные из мозговой ткани
больных криптококкозом - меланизированные [111], а исследования по
разрушению гена, ответственного за образование меланина, указывают, что
меланин-продуцирующие C. neoformans являются более вирулентными [59].
Важно обратить внимание на тот факт, что некоторые non-neoformans
криптококки, например Cryptococcus podzolicus, также способны образовывать
меланин [26], хотя и не являются патогенными [185, 215].
Различные виды меланинов обладают иммуномодулирующей активностью
посредством ингибирования синтеза провоспалительных цитокинов [103, 36, 41,
251]. Меланизированные клетки более резистентны к поглощению и киллингу
фагоцитами [103]. Вероятное объяснение этого феномена состоит в том, что
фагоцитоз нарушается за счет снижения электрического заряда клеточной стенки,
и, благодаря своим электрохимическим свойствам, меланин может выступать как
донором, так и акцептором электронов [194, 198]. Также меланин защищает
патогены от воздействия таких факторов микробоцидности как выработка
фагоцитарными клетками супероксиданиона и оксида азота. Было показано, что
меланин имитирует действие супероксиддисмутазы, дополнительно препятствуя
действию “респираторного взрыва” [229].
1.2.2 Другие факторы патогенности C. neoformans
Для природных изолятов криптококков оптимальный температурный режим
соответствует 25º С - 28º С, а для патогенных видов, обитающих в организме
человека или животных этот диапазон достигает 35º С - 38º С. Эта способность
патогенных грибов к росту при 37 С всегда закреплена на генетическом уровне
[3].
Уреаза является ферментом класса гидролаз, который катализирует
гидролиз мочевины до аммиака и углекислого газа. При сравнении штаммов C.
neoformans, различающихся по этому ферменту, выявлена более низкая
выживаемость
животных,
зараженных
штаммами
с
высокой
уреазной
21
активностью [262, 3]. Подавляющее большинство штаммов С. neoformans
образуют этот внеклеточный фермент, хотя спорадически в литературе
сообщается и об уреазо-отрицательных изолятах [43, 243]. Некоторые авторы
полагают, что образование аммиака в непосредственной близости от клеток
эндотелия может привести к возрастанию адгезии криптококка к эндотелию и
способствовать гематогенной диссеминации в ЦНС [263]. Таким образом,
накопление криптококков внутри сосудов является важным механизмом,
посредством которого экспрессия уреазы способствует инвазии С. neoformans в
мозг. Механизм, посредством которого уреаза способствует закупорке сосудов,
остается неизвестным. Предполагают, что одним из возможных путей может быть
образование аммиака из мочевины и/или других азотистых продуктов,
присутствующих в плазме макроорганизма [5]. В последнее десятилетие
показано, что экспрессия уреазы приводит к дисбалансу иммунных реакций
макроорганизма и их сдвигу в сторону непротективного Th2 иммунного ответа
[75].
В результате накопления новых экспериментальных данных постоянно
пополняется перечень метаболитов и ферментов C. neoformans, способных
выступать в роли факторов патогенности. В настоящее время в качестве
возможных факторов вирулентности рассматривают ДНК-азу, аминопептидазу и
фосфолипазу, но их вклад в патогенность микроорганизма еще предстоит изучить
[134]. Фосфолипазу относят к гетерогенной группе ферментов, способных
гидролизовать
эфирные
связи
в
глицерофосфолипидах.
Показано,
что
фосфолипаза необходима для индукции первичной инфекции С. neoformans в
легких, дальнейшей диссеминации криптококков в лимфатические узлы и кровь, а
также для выживания внутри макрофагов [234].
В последние годы особое внимание уделяется вновь открытым факторам
патогенности криптококков. Показано, что штаммы С. neoformans способны
продуцировать специфические белки, которые непосредственно влияют на
взаимодействие с фагоцитарными клетками. Один из этих протеинов был открыт
совсем недавно и охарактеризован как антифагоцитарный протеин 1 (Арр1)
22
[68,137]. Из необработанного цитоплазматического экстракта криптококка был
изолирован и очищен белок, названный криптококковым фактором, который
специфически ингибирует фагоцитоз. Предполагаемый ген, кодирующий этот
белок, был идентифицирован и определена его последовательность как для
штаммов С. neoformans серотипа А, так и для штаммов серотипа D. В 2002 году
тот же ген был независимо идентифицирован методом ПЦР в лаборатории
Медицинского Университета Штата Южная Каролина в США, как ген, чья
экспрессия
регулируется
уровнем
инозитол-фосфорил-церамид-синтетазной
(Iрс1) активности [240]. App1 представляет собой секретируемый белок, который
защищает
C.
neoformans
от
поглощения
макрофагами
независимо
от
антифагоцитарного действия грибковой капсулы. Этот белок специфически
взаимодействует с CD11b на поверхности макрофагов и предотвращает
связывание iC3b-опсонированных клеток C. neoformans [37]. Удаление App1 из
клеток C. neoformans приводит к изменению его фенотипа. Криптококк
становится гиповирулентным мутантом, если попадает в макроорганизм,
дефицитный по комплементу, и, напротив, гипервирулентным штаммом в
организме Т- и NK-дефицитных мышей. Таким образом, полученные авторами
результаты приводят к выводу, что поглощение грибов фагоцитарными клетками
играет
положительную
роль
для
криптококка
в
случае
отсутствия
в
макрорганизме Т-клеток [68,137].
В дополнение к факторам вирулентности, описанным выше, в настоящее
время рассматриваются вновь открытые белки и ферменты, которые связаны с
вирулентностью штаммов криптококка. RIM 1 имеет решающее значение для
вирулентности C. neoformans, поскольку он вовлечен в реакции рН и участвует в
сборке
капсулы.
Другим
примером
является
недавно
открытый
и
ассоциированный с вирулентностью штаммов C. neoformans белок DEAD-box
(VAD 1). При дефиците этого белка у штамма криптококка, иммунная система
макроорганизма быстро элиминирует патоген, однако функция VAD 1 пока еще
не выявлена. В дополнение к вышеупомянутому App1, у C. neoformans
существуют другие антифагоцитарные механизмы, опосредованные обширной
23
регуляторной сетью. Ключевую роль играет транскрипционный фактор 201
семейства Gata (Gat201), известен Gat204 и Barwin-подобный протеин 1(Blp1).
Blp1 был описан как семейство глюканаз и целлюлаз грибов и растений, но их
функция у C. neoformans до сих пор не выяснена. В тоже время, Blp1- мутанты C.
neoformans никогда не имеют гиповирулентного фенотипа, а Gat201 и Gat204
показывают снижение колонизации криптококков в легких [68].
1.3 Клинические варианты и факторы риска развития криптококкоза
С 1981 года криптококковая инфекция стала основной причиной
заболеваемости и смертности у лиц с угнетенной иммунной системой вследствие
эпидемии ВИЧ-инфекции. В настоящее время криптококкоз входит в число трех
наиболее опасных для жизни оппортунистических инфекций у больных СПИДом
[177, 6]. Распространенность криптококкоза у ВИЧ-инфицированных лиц резко
снизилась
после
внедрения
высокоактивной
антиретровирусной
терапии
(ВААРТ), но несмотря на это, сохраняется сложная эпидемическая ситуация в
странах Африки и Юго-Восточной Азии, в которых до 30% пациентов со СПИД
больны криптококкозом [90]. Не следует забывать и о том, что криптококкоз у
ВИЧ-негативных пациентов с тяжелыми нарушениями иммунной системы также
может достигать высокого уровня летальности [77].
Заболевание криптококкозом у людей, как правило, возникает после
ингаляции базидиоспор или капсулированных клеток дрожжей из окружающей
среды. Следовательно, дыхательные пути служат входными воротами, а легкие –
как ткань, первичной локализацией инфекционного агента. Вслед за ингаляцией
клеток криптококка, происходит формирование первичного очага в легких. В
большинстве случаев у здоровых лиц симптомы заболевания не развиваются либо
из-за элиминации патогена, либо из-за существования в организме дрожжей в
латентном состоянии [92]. Возможность длительной персистенции грибов у
пациентов, прибывших из тропических стран, подтверждали тем, что заболевание
развивалось через несколько лет после возвращения людей из эндемичных по
24
криптококкозу районов. Garcia-Hermoso и др. проанализировали клинические
изоляты, выделенные от пациентов, у которых криптококкоз был диагностирован
во Франции, но рождены они были в Африке. RAPD-профили изолятов,
исследованных
методом
случайной
амплификации
полиморфной
ДНК,
значительно отличаются от тех, которые были получены от 17 больных
европейцев, предполагая, что инфицирование произошло задолго до развития
клинических проявлений криптококкоза, поскольку эти пациенты жили во
Франции приблизительно 10 лет и не были в Африке около 13 лет [92].
Клинически
плевральными
легочная
болями
форма
в
заболевания
груди,
может
лихорадкой,
проявляться
диспноэ,
потерей
кашлем,
веса
и
недомоганием. Развитие пневмонии и острого респираторного дистресссиндрома, главным образом, характерно для иммунокомпрометированных
пациентов [224, 54]. Для легочной формы криптококкоза характерны признаки от
возникновения бессимптомных гранулем до развития острого респираторного
дистресс-синдрома.
Были
проанализированы
166
случаев
заболевания
криптококкозом и установлено, что кашель у 58 % лиц, одышка у 46%, и
лихорадка у 38% больных являются самыми частыми проявлениями инфекции
[40].
Диссеминация возбудителя происходит среди пациентов с существенными
изменениями в иммунной системе, включая пациентов, которых длительно
лечили кортикостероидами, либо были диагностированы гематологические
новообразования
или
ВИЧ-инфекция.
При
генерализованной
форме
криптококкоза с поражением различных органов и систем, криптококки,
распространяемые гематогенным путем, могут формировать вторичные очаги
поражения. Культуры C. neoformans могут быть выделены из крови больных при
фунгемии, которая протекает в постоянной или перемежающейся форме, в
зависимости от тяжести процесса. Cryptococcus spp. могут вызывать и локальные
поражения с вовлечением кожи, глаз, миокарда, костей, суставов, легких,
простаты, мочеполового тракта [79]. Наиболее частой и тяжелой формой
криптококкоза является поражение центральной нервной системы. Как показано
25
многочисленными исследованиями, патогенные виды криптококков обладают
выраженным нейротропизмом, поэтому подавляющее большинство заканчивается
поражением ЦНС в виде менингита или менингоэнцефалита. Таким образом,
необходимо проведение новых научных исследований для понимания механизмов
патогенеза при взаимодействии C. neoformans с клетками иммунной системы
человека с целью предотвращения заболевания и улучшения терапии [3, 268, 292].
26
ГЛАВА 2 Штаммы C. neoformans и врожденный иммунный ответ
Основными эффекторными клетками начальной стадии взаимодействия
между макрорганизмом и патогенами являются макрофаги, дендритные клетки и
нейтрофилы [207]. Известно, что основной путь попадания C. neoformans в
организм человека аэрогенный, поэтому клиренс патогенов из легких во многом
зависит от готовности резидентных альвеолярных макрофагов разрушать клетки
дрожжей, тем самым предотвращая их диссеминацию [157, 113,181]. Эти факты
подтверждены и гистологическими исследованиями. Установлено, что после
первоначального притока нейтрофилов, основными клетками в легких крыс,
инфицированных С. neoformans, были макрофаги, что определяло важную роль
макрофагов в защите организма против криптококковой инфекции [127].
2.1 Взаимодействие C. neoformans с макрофагами
2.1.1 Паттерн-распознающие рецепторы
Процесс фагоцитоза состоит из поглощения патогена и последующих
стадий, обеспечивающих его разрушение. Быстрое распознавание патогенов
обусловлено экспрессией, так называемых, паттерн-распознающих рецепторов
(pattern recognition receptors, PRRs) на макрофагах. Эти рецепторы распознают
патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (pathogen-associated molecular
pattern, PAMPs), которые обычно встречаются у самых различных возбудителей,
но не у млекопитающих [207]. Распознавание PAMPs с помощью PRRs, как
правило, приводит к поглощению патогена и активирует внутриклеточные
сигнальные пути макрофагов, которые модулируют такие защитные ответы, как
активация микробицидных механизмов и продукция цитокинов [266]. Таким
образом, макрофаги рассматриваются и как фагоцитарные клетки, и как основные
антигенпрезентирующие клетки (АПК).
27
Как
уже
структурами,
было
указано,
включая
C.
neoformans
глюкуроноксиломаннан
обладает
(GXM),
поверхностными
галактоксиломанн
(GalXM), β-глюканы, хитин и маннопротеины, которые могут распознаваться
PRRs, такими как маннозный рецептор (MR), β-глюкановый рецептор - дектин-1,
рецептор комплемента 3 (CR3), SIGN-R1, CD14, толл-подобные рецепторы (tolllike receptors, TLRs) [207]. TLRs непосредственно не участвуют в поглощении
грибов, но они играют важную роль в последующем созревании фаголизосом,
представлении
антигенов
и
индукции
секреции
специфического
набора
цитокинов [46].
2.1.1.1 Маннозный рецептор
Маннозный рецептор (MR) - лектиновый C-тип рецепторов фагоцитов,
который распознает олигосахариды, имеющие в своей структуре маннозу и фукозу
[32]. Известно, что капсульный полисахарид криптококков богат маннозой.
Связываясь с C. neoformans посредством MR, макрофаги способны поглощать их,
и продуцировать провоспалительные цитокины, такие как TNF-α, IL-1α, IL-6 IL-1β
и IL-12 [266, 276]. Генетически модифицированные (нокаутные) мыши,
фагоцитирующие
клетки
которых
лишены
MR,
обладают
повышенной
восприимчивостью к заражению C. neoformans [237]. Однако показано, что
распознавание C. neoformans посредством МR играет бóльшую роль в
поглощении их дендритными клетками, чем макрофагами [179].
Рисунок 3 – Паттерн-распознающие рецепторы на иммунных клетках, их лиганды на поверхности A. fumigatus, C.
neoformans and C. albicans и сигнальные пути, вовлеченные в антифунгальный ответ [227].
2.1.1.2 Дектин -1
Дектин-1 является основным рецептором для распознавания β-1,3связанных и β-1,6-связанных гликанов, главных компонентов клеточной стенки
большинства грибов [99]. Данный PRR относится ко второму С-типу лектиновых
рецепторов, представленных на макрофагах и дендритных клетках. Связывание βгликана клеточной стенки с дектином-1 макрофагов облегчает поглощение грибов
и вызывает активацию NADPH-оксидазы [184], генерирующую реактивные
промежуточные продукты кислорода (ROIs, reactive oxygen intermediates) [207], и
продукцию
цитокинов
разнонаправленного
действия,
таких
как
противовоспалительный IL-10 и провоспалительный TNF-α [151].
Однако существуют противоположные мнения о возможности вовлечения
дектина-1 в развитие протективного иммунного ответа при взаимодействии
фагоцитарных клеток с C. neoformans. Одними авторами было установлено, что
дектин-1 не требуется для распознавания C. neoformans, в отличие от C. albicans,
A. fumigatus и P. carinii [91]. В тоже время другими исследователями показано, что
поглощение C. neoformans, лишенных капсулы, опосредовано маннозным и бетаглюкановым рецепторами макрофагов [74]. Также получены данные о том, что
непосредственно
через
дектин-1
может
происходить
активация
генов,
ответственных за продукцию цитокинов дендритными клетками, но не
макрофагами, хотя этот рецептор опосредует связывание с грибами и поглощение
обоими типами клеток [98,257].
30
Таблица 1 – Петтерн-распознающие рецепторы фагоцитов, взаимодействующие с C. neoformans
Лиганды
( растворимые и клеточные)
Рецепторы
Маннозный
(MR)
рецептор
Дектин-1
(dectin-1)
Дектин-2 (dectin-2)
кооперации с FcγR
Растворимые маннопротеины,
маннопротеины капсулы
β-гликаны клеточной стенки
в
CD14
(корецептор TLR-4)
Биологический эффект
(ответные реакции)
Фагоцитоз
Цитокины
TNF-α, IL-1β, IL-6,
+
IL-12
TNF-α, IL-6
IL-23, IL-17,
+
IL-10
TNF-α, IL-1β, IL-6
IL-23
α- маннаны
маннопротеины GXM
TLR-2
GXM, маннаны,
хитин клеточной стенки
TLR-4
маннаны, ЛПС
TLR-7
РНК
CD18,
CD11b/CD18,
CD11c/CD18
Syk /
NF-κB
NF-κB, CARD9,
NF-κB, CARD9
NF-κB
NF-κB, CARD9
+
Ссылка
[188, 220]
[74, 231]
[227,258]
[95, 48]
TNF-α, IL-1β
TGF-β, IL-10
IL-17
TNF-α, IL-1β,
IFN-γ
IFN-γ, IL-12
ДНК
GXM
β-гликаны клеточной стенки
CARD9, NF-κB
+
TNF-α, IFN-α
TLR-9
Адаптерные белки
и ключевые
сигнальные
молекулы
IL-6,
MyD88 / NF-κB
MyD88 / MAPKERK-cFOS
NF-κB
IRF3
MyD88, MAL/
IRAK, IRF-7
MyD88, MAL/
IRAK, IRF-7, NFκB
[164, 48,
260]
[258]
[227]
[227]
[252,48]
31
2.1.1.3 Toll-рецепторы
Toлл-подобные рецепторы являются паттерн-распознающими рецепторами
микроорганизмов. Эти рецепторы - первый тип трансмембранных белков,
которые характеризуются наличием внеклеточной области, содержащей 25
повторностей, богатых лейцином, и внутриклеточную Toll-IL-1 рецепторную
(TIR) область [265]. После связывания с лигандом активируется TLR-сигнальный
путь, заканчивающийся в перемещении фактора транскрипции NF-kB в ядро, где
в свою очередь инициирует транскрипцию множества генов, включающих синтез
факторов микробоцидности (оксида азота или нитроксид анионов, ROIs),
цитокинов и хемокинов [253].
Установлено, что компоненты криптококковой капсулы, могут напрямую
распознаваться TLRs фагоцитирующих клеток. В зависимости от вида грибов и их
морфотипа. Компоненты стенки грибов - зимозан, фосфолипоманнан и
глюкуроноксиломаннан,
были
идентифицированы
как
лиганды
(или
специфические PAMPs) для TLR2, тогда как GXM и O-связанный маннан лигандами для TLR4 [152].
Роль различных клеточных рецепторов фагоцитов во взаимодействии с
различными штаммами криптококков была изучена на мутантных (нокаутных)
мышах, лишенных гена, кодирующего синтез того или иного рецептора. Yauch et
al. изучали значение CD14, TLR2 и TLR4 и функцию MyD88 (внутриклеточного
адаптера TLRs), при взаимодействии грибов с фагоцитами in vitro. В результате
показано, что MyD88 является ключевой сигнальной молекулой в развитии
криптококкоза, в то время как TLR2 и CD14 отводится незначительная роль [164].
В этой работе продемонстрировано, что MyD88-нокаутные мыши погибают от
инфекции C. neoformans значительно раньше, чем контрольные мыши при
интраперитонеальном или внутривенном инфицировании. У MyD88-нокаутных
мышей, при аспирационном заражении грибами, увеличивалось число КОЕ в
легочной ткани, и повышался уровень GXM в легких и в сыворотке. Эти
32
показатели коррелировали со сниженной выживаемостью мышей. Кроме того, у
мышей с недостатком TLR2 значительно снижалась выживаемость только после
интратрахеального заражения грибами, в то время как CD14-нокаутные мыши
показали
тенденцию
к
снижению
выживаемости
после
внутривенного
инфицирования. Так как MyD88-нокаутные мыши были более восприимчивы к
криптококкозу, чем TLR2- и TLR4- мутантные экспериментальные животные,
авторы предположили, что возможно в будущем будут идентифицированы другие
рецепторы макрофагов для которых MyD88 также является внутриклеточным
адаптером [88]. Предполагается, что эти рецепторы, возможно, не вовлечены в
связывание GXM макрофагами.
2.2 Роль опсонинов в иммунном ответе при криптококкозе
Согласно классическим представлениям существует два типа опсонинов,
которые облегчают фагоцитоз макрофагами C. neoformans. К ним относят
компоненты комплемента и антитела, которые связываются с капсульным
полисахаридом.
2.2.1 Компоненты комплемента
Опсонизированные сывороткой C. neoformans распознаются рецептором
компонента комплемента CR1(CD35) или гетеродимерным β2-интегриновым
рецептором CR3 (CD11b/CD18) и CR4 (CD11c/CD35). Изучение рецепторов,
гетерологично экспрессированных на овариальных клетках китайских хомяков
показали, что связывание компонентов комплемента с любым из рецепторов
происходит независимо, преимущественно с CR3, затем с CR1 и CR4 [204].
Установлено, что капсульный полисахарид GXM способен активировать
комплемент по альтернативному пути и что уровень C3 компонента комплемента
зависит от степени инкапсуляции клеток. Также показано, что клетки с большой
капсулой
связывают
значительно
меньшее
количество
C3
[255].
33
Противоречивость вышеизложенных данных подтвердилась использованием в
работе конфокальной микроскопии. Выявлено, что депонирование C3 в капсуле
грибов различается у клеток с маленькими и большими капсулами. В клетках с
большой капсулой C3 рецептор расположен ближе к клеточной стенке, на
удалении
от
края
капсулы.
Следовательно,
увеличение
капсулы
гриба
препятствует контакту C3 компонента комплемента с рецепторами фагоцитов
[282]. Однако одного связывания рецептора C3 с капсулой C. neoformans не
всегда достаточно для индукции фагоцитоза, так как известны штаммы
криптококков, которые не поглощаются фагоцитами в присутствии комплемента
[255].
2.2.2 Антитела
Известно, что специфические антитела к компонентам капсулы и клеточной
стенки гриба появляются только после индукции гуморального звена иммунного
ответа. Для проведения экспериментальных исследований многочисленными
исследователями получены специфические антитела, которые распознают GXM
[61, 33]. Установлено, что IgG связываются с капсулой C. neoformans и
индуцируют фагоцитоз посредством взаимодействия с Fc-рецепторами (FcRI,
FcRIII) макрофагов, нейтрофилов, и дендритных клеток [125, 213]. Фагоцитоз C.
neoformans в присутствии IgM-антител осуществляется через связывание GXM с
рецепторами компонентов комплемента и опосредован через CD18. Вероятнее
всего,
при
связывании
антител
с
капсулой
происходит
реорганизация
компонентов капсулы гриба, способствующая фагоцитозу через CR [252].
Подобный эффект продемонстрирован для IgG-антител и F(ab)2 фрагментов
антител [282]. Образовавшиеся антитела к компонентам капсулы могут
активировать комплемент по классическому пути, что приводит к быстрому
депонированию комплемента в капсуле. Также показано, что прикрепление
моноклональных антител к капсуле вызывает не только активацию комплемента
по
классическому
пути,
но
и
приводит
к
увеличению
комплемент-
34
опосредованного фагоцитоза [281]. Другими авторами установлено, что GXM
может непосредственно взаимодействовать с рецептором FcgRIIB, который
вовлечен в поглощение C. neoformans фагоцитарными клетками [245].
Таким образом, процесс распознавания C. neoformans макрофагами носит
сложный характер и особенности взаимодействия различных лигандов капсулы и
клеточной стенки гриба с рецепторами макрофагальных клеток недостаточно
изучены. Значение процесса распознавания также связано с тем, что поглощение
патогена фагоцитами активирует микробоцидные механизмы и продукцию
цитокинов.
2.3 Факторы микробоцидности макрофагов
Вслед за поглощением грибов макрофагами образуются внутриклеточные
вакуоли (фагосомы). Затем происходит слияние фагосомы с лизосомами и
формируются фаголизосомы. Этот процесс называют созреванием фагосом.
Вновь
сформированная
фаголизосома
обладает
множеством
свойств,
повреждающих грибную клетку, включая низкое значение pH, наличие
гидролитических ферментов, бактерицидных пептидов и способность к генерации
токсических окислительных компонентов [265]. Оптимальное ограничение роста
грибов
происходит
посредством
комбинации
кислородзависимых
и
кислороднезависимых механизмов.
2.3.1 Кислородзависимые факторы микробоцидности
2.3.1.1 Образование активных продуктов кислорода
При инициации фагоцитоза, криптококки, как и другие микроорганизмы,
становятся объектом воздействия механизма деградации. Выработка реактивных
промежуточных продуктов кислорода, называемая «респираторным взрывом»,
как полагают, является основным компонентом противогрибковой защиты
фагоцитов и опосредована через многокомпонентный белковый комплекс
35
фагоцитарной
NADPH-оксидазы
(никотинамидадениндинуклеотидфосфат-
оксидаза). Этот комплекс собирается на фагосомальной мембране или мембране
плазмалеммы после активации клеточных рецепторов, передает электроны от
цитоплазматической NADPH-оксидазы к O2 и в результате образуется супероксид
анион. Супероксиданион имеет ограниченную токсичность, то есть обладает не
самой
высокой
бактерицидной
активностью.
Однако
он
способен
преобразовываться посредством ряда процессов, таких как реакция Габер-Вейса, в
токсичные молекулы, включая гидроксильные радикалы и перекись водорода
[264]. Другими эффективным фунгицидным окислителями является хлорноватистая кислота, которая образуется из перекиси водорода под действием
миелопероксидазы. Фермент находится в азурофильных гранулах нейтрофилов и
в лизосомах моноцитов [178]. «Респираторный взрыв» играет решающую роль в
ряде случаев иммунного ответа на грибковую инфекцию, как это было показано
при тяжелом аспергиллезе у пациентов с хронической грануломатозной болезнью
и недостаточностью NADPH-оксидазной системы. Однако у этих больных
моноциты/макрофаги, не вырабатывающие активные формы кислорода, не
осуществляют киллинг дрожжей таким путем, а демонстрируют другие
механизмы цитотоксичности. Обращает внимание противоречивость данных о
роли различных факторов микробоцидности в развитии криптококковой
инфекции. Сообщалось, что слабовирулентные мутантные штаммы гриба без
капсулы способны стимулировать окислительный респираторный взрыв [124].
Добавление
к
фагоцитам
специфических
ингибиторов
каталазы
и
супероксиддисмутазы снижает их способность к киллингу грибов [265]. В работе
других исследователей на примере трех штаммов C. neoformans разной
вирулентности показана неспособность макрофагов мышей к продукции перекиси
водорода после их поглощения [31]. Также показано, что оксид азота и его
производные имеют значение для резистентности к C. neoformans [9].
36
2.3.1.2 Реактивные промежуточные продукты азота
Выработка нитроксид аниона зависит от активности индуцибельной NOсинтазы (iNOS) и является еще одной окислительной системой фагоцитов,
которая, как полагают, обладает фунгицидной активностью. Провоспалительные
цитокины, такие как фактор некроза опухоли – альфа (TNF-α) и интерферон –
гамма (IFN-γ), активируют iNOS, что приводит к продукции оксида азота через
окислительное дезаминирование L-аргинина. Оксид азота взаимодействует с
супероксидом и образуется высокотоксичное соединение пероксинитрит, который
участвует в киллинге грибов [264]. Большое число литературных данных
(некоторые из них противоречивы) посвящено изучению роли нитроксиданиона в
защите от грибковых инфекций в лабораторных условиях. Результаты,
полученные при проведении экспериментальных работ с использованием iNOSдефицитных мышей, подтверждают, что это эта форма защиты может быть
эффективна только в отношении С. neoformans [28]. Также противоречивы
данные о способности разных по вирулентности штаммов индуцировать
выработку iNOS в макрофагах. В работе H.K. Naslund с соавт. показано, что
капсулированные штаммы C.neoformans в отличие от С. аlbicans и Н. capsulatum
не стимулируют активацию iNOS в макрофагальных клеточных линиях in
vitro[206]. Клетки интактной макрофагальной линии J774.1 не способны
фагоцитировать
стандартный
штамм
криптококков
H99.
Опсонизация
криптококков специфическими антителами усиливает поглощение клеток грибов,
но не стимулирует продукцию нитроксиданионов. Не выявлено ингибиторов
транскрипции iNOS в культуральной жидкости, полученной после совместной
инкубации грибов с клетками макрофагальной линии. Однако мутантные штаммы
без капсулы индуцируют продукцию оксида азота, в то время как штаммы с
небольшой капсулой неспособны к этой индукции. Это не связано с различиями в
фагоцитозе дрожжей, так как штаммы с небольшой капсулой и штаммы без
капсулы эффективно поглощаются фагоцитами. В литературных источниках
отмечено, что C. neoformans индуцируют выработку оксида азота при
37
взаимодействии с крысиными альвеолярными макрофагами in vitro [221], и
установлена экспрессия гена, кодирующего индуцибeльную форму NO-синтазы
при
криптококковом
менингоэнцефалите
у
мышей
[87].
Другими
исследователями показано, что C. neoformans не стимулирует синтез оксида азота
в экспериментальных условиях мышиными [206] и альвеолярными макрофагами
[31].
2.3.2 Кислороднезависимые факторы микробоцидности
Известно, что кроме кислородзависимых механизмов микробицидности
макрофагов, их гранулы содержат большой спектр протеолитических ферментов,
активность которых в процессе разрушения криптококков изучена существенно
меньше. Пристальное внимание уделялось изучению свойств одного из
антимикробных пептидов - кателицидина, называемого hCAP-18, который
обнаружен у людей и мышей в гранулах нейтрофилов, моноцитах, естественных
киллерах, лимфоцитах, эпителиальных клетках и в некоторых секретах
(например, поте, семенной жидкости, и плазме). Расщепление hCAP-18 приводит
к продукции LL-37 и другим пептидам, которые обладают антифунгальной
активностью [218]. LL-37 и другие кателицидины способны вызывать гибель
Candida spp. и Cryptococcus spp., повреждая их клеточную мембрану, хотя и
неэффективны против нитчатых грибов, таких как Aspergillus spp. [256,122].
Однако по другим данным, дефицит мышиного кателицидина MCRAMP не
влияет in vivo на устойчивость к заражению С. аlbicans [35].
Изучение
роли
кислороднезависимых
факторов
микробицидности
представляет определенную сложность в связи с их многочисленностью и
отсутствием адекватных экспериментальных подходов. Тем не менее, изучение
влияния
этих
соединений
на
жизнеспособность
грибов
представляет
определенный интерес для создания средств антимикробной терапии на основе
природных соединений. Таким образом, данные о роли различных факторов
микробоцидности в
развитии
криптококковой
инфекции,
представленные
разными исследователями, неоднозначны и требуют дальнейшего изучения.
38
Кроме того их активность во многом регулируется различными медиаторами
иммунного ответа.
2.4 Медиаторы иммунного ответа
Многочисленные исследователи оценивали роль цитокинов в борьбе с
инфекцией, вызванной С. neoformans [239, 50, 140]. Макрофаги способны
продуцировать широкий спектр провоспалительных цитокинов, таких как TNF-α,
IL-1 и IL-12 [82]. Известно, что интерлейкин -12 (IL-12) играет ключевую роль в
индукции иммунного ответа по T-хелперам 1 типа (Th1) [140, 105,139]. В свою
очередь, макрофаги, активированные цитокинами, продуцируемыми Th1 (CD4+T-лимфоцитами), эффективно уничтожают внутриклеточные криптококки,
и это имеет важное значение в защите против криптококковой инфекции [244, 78,
51, 222, 24, 158, 160].
В последнее время появились данные о том, что макрофаги имеют
различные эффекторные свойства. Так при взаимодействии с определенными
инфекционными агентами макрофаги продуцируют IL-12 и IL-18, которые
активируют естественные киллеры и Т-лимфоциты к продукции интерферон-γ
(IFN-γ).
IFN-γ
совместно
с
TNF-α,
являясь
основными
цитокинами,
активирующими микробоцидные механизмы макрофагов, индуцируют NOсинтазу макрофагов. Такие макрофаги считаются классически активированными
макрофагами, и их главной функцией является очищение организма от патогенов.
Роль
классически
активированных
макрофагов
в
защите
организма
от
внутриклеточных патогенов представлена в нескольких исследованиях [239, 232,
21,46]. Так было установлено, что длительность жизни у мышей, фагоцитарные
клетки которых не продуцировали IL-12, после инфицирования криптоккоками
была ниже, по сравнению с контрольными мышами [150]. Введение IL-12 мышам
снижает пролиферацию грибов в органах и увеличивает выживаемость мышей,
инфицированных С. neoformans [66, 131, 117]. Кроме того, была показана роль
39
другого провоспалительного цитокина, фактора некроза опухоли альфа (TNF-α),
при моделировании экспериментальной криптококковой инфекции. Установлено,
что TNF-α повышает фагоцитарную и киллерную активность макрофагов по
отношению к C. neoformans и нейтрализация этого цитокина приводит к
обострению инфекции [69,238]. Повышение экспрессии TNF-α и IL-1 в мозговой
ткани мышей, инфицированных криптоккоками, коррелировала с усилением
резистентностью к инфекции [86]. Так же установлено, что у резистентной к
криптококкозу линии мышей SJL/J по сравнению с чувствительной линией
C57BL/6J клетки легочной ткани in vivo и альвеолярные и перитонеальные
макрофаги in vitro при стимуляции их клетками гриба вырабатывали повышенное
количество TNF-α и KC/CXCL1, причем передача внутриклеточного сигнала
происходила через NF-kB фактор [113]. Cделан вывод, что адекватный
врожденный
иммунный
ответ
определяет
защиту
от
криптококкоза
у
резистентной линии мышей по сравнению с чувствительной. Но это одно из
немногих исследований, где оценивалась активность фагоцитирующих клеток по
их способности к продукции цитокинов при взаимодействии с грибами разной
вирулентности.
Известно, что дифференцировка Т-лимфоцитов в Th2 индуцируется IL-4 и
IL-13 [245, 23, 89]. Причем именно эти два тесно связанных цитокина [64, 94]
принимают участие в регулировании функциональной активности макрофагов
[195]. Принципиальной особенностью данной группы цитокинов является то, что
IL-4 и IL-13 вызывают развитие альтернативно активированных макрофагов
(aaМФ) [128]. Их значение в характере исхода инфекционного процесса было
установлено в экспериментальных исследованиях. Показано, что при заражении
мышей Leishmania major [155,38], способность этого внутриклеточного патогена
стимулировать трансформацию классически активированных макрофагов (каМФ)
в aaMФ была связана с повышением чувствительности эксперементальных
животных к инфекции. Особенностью aaМФ является то, что эти макрофаги не
продуцируют реактивные промежуточные метаболиты азота, но характеризуются
повышенным уровнем аргиназы-1, экспрессией IL-4R, маннозного рецептора
40
(CD206) и протеина семейства хитиназы YM1, и приобретали этот фенотип после
обработки IL-4 и IL-13 in vitro [225, 128]. В дальнейшем было установлено, что
IL-4 и IL-13 индуцируют в aaМФ фермент аргиназу-1, которая успешно
конкурирует с индуцибельной NO-синтазой (iNOS) за аргинин, который
необходим iNOS для производства реактивных метаболитов азота [97]. В
экспериментальных исследованиях in vivo было установлено, что индукция
большого числа aaМФ после заражения генетически модифицированных по IFN-γ
мышей C. neoformans может быть связана с их повышенной летальностью от
криптококкоза по сравнению с контрольными животными [235]. Эти данные были
подтверждены при исследовании роли IL-4 в восприимчивости мышей к
заражению C. neoformans [163,44]. Однако значение IL-13 в патогенезе
криптококковой менее охарактеризовано и в основном изучалась in vivo [235,
100,112]. В одной из экспериментальных работ на трансгенных мышах было
показано, что повышенная продукция IL-13 у генномодифицированных животных
приводила к значительному снижению их резистентности к криптококковой
инфекции, о чем свидетельствовало снижение выживаемости мышей и
повышение пролиферации грибов в легочной ткани. Следует отметить, что
повышенная продукция IL-13 у трансгенных мышей не имела обратной
корреляционной связи с функциональной активностью Th1, оцениваемой по
продукции IFN-γ. Также в другом исследовании не было установлено влияния IL4 и IL-10 на продукцию IFN-γ [100]. Выработка IFN-γ оказалась аналогичной
между устойчивыми и восприимчивыми линиями мышей к криптококкозу. Таким
образом, был сделан вывод, что Тh2-ассоциированные цитокины имеют большое
значение в развитии и исходе криптококкоза легких у экспериментальных
животных. Только в отсутствие этих цитокинов, IFN-γ в состоянии оказывать
стимулирующее
влияние
на
фунгицидную
активность
макрофагов.
Это
обусловлено тем, что кроме рецепторов к TNF-α и IFN-γ, макрофаги
экспрессируют IL-4R 2 типа, которые связываются с IL-4 и IL-13 и могут
индуцировать развитие aaMФ [100]. Развитие ааМФ, как представляется, может
быть маркером предрасположенности к криптококкозу. Также было показано, что
41
хитин, который является важным компонентом клеточной стенки С. neoformans
[21], может вызывать повышенную продукцию IL-4 эозинофилами и базофилами,
что опосредовало активацию альтернативно активированных макрофагов [63].
Существенно меньше исследований посвящено исследованию способности
грибов активировать макрофаги к продукции данного цитокина in vitro.
Во многих экспериментальных исследованиях большое внимание уделялось
изучению роли противовоспалительных цитокинов в развитии иммунного ответа
при криптококковой инфекции. Известно, что IL-10 продуцируется различными
клетками, в том числе альтернативно и классически активированными
макрофагами, дендритными клетками, В-лимфоцитами и регуляторными Тлимфоцитами [111, 129]. Blackstock R. и cоавторы продемонстрировали, что
продолжительность жизни генетически модифицированных мышей, клетки
которых лишены способности продуцировать IL-10, была больше по сравнению с
контрольными мышами после инфицирования С. neoformans [96]. Также
установлено, что у мутантных по IL-10 мышей был повышен уровень продукции
IL-12, TNF-α и снижен IL-4 [100]. Однако существенно меньше работ посвящено
изучению способности криптококков индуцировать продукцию этого цитокина in
vitro.
В последние годы открыто новое семейство IL-17 и изучается их влияние
на течение инфекционных процессов, вызванных различными патогенами. IL-17
активируют клетки к защите от внеклеточных микроорганизмов [142] за счет
индукции медиаторов воспаления, таких, как TNF-α, IL-1β, IL-6 рассмотрены в
[200], а также Г-КСФ, который вызывает хемотаксис нейтрофилов в место
инфекции [182,145]. Т-лимфоциты, NКТ-клетки, NK-клетки и нейтрофилы
способны вырабатывать IL-17 [210, 142, 146, 147, 168, 148, 144, 143]. Цитокины
TGF-β, IL-6 или IL-21 необходимы для индукции Тh17 из наивных CD4+ Т-клеток
мышей,
а
IL-23
поддерживает
их
пролиферацию.
IL-6
способствует
дифференцировке Th17, но ингибирует синтез TNF-α и IL-1β [19].
Роль IL-17 в развитии грибковых инфекции противоречива [161, 233].
Показано, что IL-17, способен как повышать резистентность, так и усиливать
42
чувствительность
к
различным
грибковым
патогенам.
Нейтрализация
моноклональными антителами IL-23 или IL-17 в течение экспериментального
диссеминированного кандидоза и кандидоза полости рта, а также при легочном
аспергиллезе усугубляла патологию. У этих экспериментальных животных
снижалась нейтрофильная инфильтрации, увеличивалось количество грибов в
органах и тканях и снижались уровни хемокинов в органах мишенях [254, 233,
272]. IL-17 также связывают с защитой от пневмоцистной инфекции [162].
Противоположные данные показали, что активация Th17 клеток усиливала
иммунопатологическое воспаление и замедляла очищение от грибов при
экспериментальном
криптококкозе,
легочном
аспергиллезе
и
кандидозе
желудочно-кишечного тракта [149]. При моделировании экспериментальной
криптококковой инфекции установлено, что увеличение продукции IL-17А
связано со снижением выделения криптококков из органов у экспериментальных
мышей после заражения грибами [94, 422, 43]. Выявлено, что добавление IL-17 к
макрофагам, инкубированным с C. neoformans in vitro, способствовало снижению
пролиферации дрожжей в фагоцитах по сравнению с обработкой их IL-4 и IL-13.
Однако нет данных об исследованиях, посвященных изучению влияния разных по
вирулентности штаммов грибов к индукции макрофагов к продукции IL-17.
2.5 Резистентность к антифунгальным препаратам при криптококковой
инфекции
Успех антифунгальной этиотропной терапии зависит от определения
чувствительности выделенных
от больного
грибов к
противогрибковым
препаратам. Всего в арсенале противогрибковых средств насчитывается свыше
ста наименований и более двадцати форм лекарственных препаратов [16].
Основными препаратами, применяемыми при лечении криптококкоза в настоящее
время являются амфотерицин В (АмВ) и флуконазол. Амфотерицин В относится к
антифунгальным препаратам широкого спектра действия из ряда полиенов и
является препаратом выбора при лечении большинства инвазивных микозов. АмВ
43
обладает
мощным
фунгицидным
эффектом,
обусловленным
прямым
и
необратимым связыванием с эргостерином клеточной мембраны грибов и
индукцией активных форм кислорода в клетке. Главным достоинством АмВ
является медленное развитие к нему резистентности, несмотря на сорокалетний
опыт широкого применения. Поэтому неэффективность лечения, связанная с
развитием устойчивости к АмВ, явление редкое. Однако большим недостатком
амфотерицина
В является
его
способность
вызывать
нефротоксичность,
возможные дисфункции нервной системы и другие побочные явления.
Флуконазол – препарат из группы азолов, обладает высокой специфичностью по
отношению к зависимым от цитохрома Р450 ферментам грибов. Поэтому при
использовании флуконазола не наблюдают побочного действия на синтез
стероидов и других метаболических процессов, связанных с этими цитохромами.
Но в последние годы растет резистентность штаммов криптококка к препарату и в
настоящее время устойчивость достигает порядка 15 % [250, 5]. Вориконазол синтетическое производное флуконазола, триазол, который обладает широким
спектром
противогрибковой
активности.
Вориконазол
продемонстрировал
высокую активность против C. neoformans in vitro, и в настоящее время уже
доказана его клиническая эффективность [269, 270, 183]. Однако появляются
новые данные, свидетельствующие о постепенном развитии устойчивости
штаммов C. neoformans к вориконазолу [20, 212]. Высокая токсичность
амфотерицина В и растущая резистентность штаммов криптококка к флуконазолу
[85, 156] подчеркивают необходимость улучшения имеющихся методов лечения и
возможность применения новых препаратов [81].
Поиск новых подходов к терапии криптококкоза в связи с ростом СПИДассоциированных заболеваний и развитием резистентности C. neoformans к
антифунгальным
эффективные
препаратам,
агенты
с
рассматривать
новые
антикриптококковой
и,
возможно,
активностью
в
более
качестве
перспективных объектов для фармакологических исследований. В настоящее
время в условиях in vitro в качестве таких объектов рассматриваются различные
катионные пептиды, обладающие антимикробной активностью. Синтетический
44
катионный пептид – доластин -10 проявляет фунгицидную активность против C.
neoformans, используя в качестве мишени интрацеллюлярный тубулин. Из этой
группы пептидов доклиническое испытание проходит микопрекс (Хоmа),
полученный из человеческого BPI-фактора, продуцируемого нейтрофилами [16].
Естественные антимикробные пептиды животного происхождения включают в
себя дефенсины, кателицедины, протегрины, цекропины, магейнины и др.
Конечным результатом микробоцидного действия рассматриваемых пептидов
является деполяризация мембран, нарушение их целостности, ведущее к утечке
ионов из клетки и нарушению процессов жизнедеятельности микроорганизмов,
приводящее к их гибели. Таким образом, антимикробное действие пептидов не
связано с каким-либо известным в настоящее время энзиматическим механизмом
[11].
Сходным образом действуют описанные отечественными исследователями
совместно с американскими учеными катионные пептиды из нейтрофилов свиньи
– протегрины [223]. Известны три основные фракции протегринов PG-1, PG-2,
PG-3, являющиеся близкими изоформами. Молекулярная масса протегринов
составляет
~
2000
Da.
Благодаря
этому,
протегрины
являются
более
перспективным объектом для химического синтеза и фармакологических
исследований, чем дефенсины. Антимикробная активность PG-1 сопоставима с
таковой дефенсина кролика NP-1 [223]. Но в других работах было показано, что
не все штаммы C. neoformans являются восприимчивыми к дефенсину кролика
NP-1. Остается неясным, влияет ли капсула на восприимчивость С. neoformans к
NP-1. Получены данные, по которым установлены аналогичные показатели
MIC50 и MFC и для штаммов с выраженной полисахаридной капсулой и для
штаммов без капсулы, которые колебались от 3,75 мкг/мл до 15 мкг/мл [123].
Противоположные
данные
были
получены
авторами,
которые
изучали
чувствительность биопленок C. neoformans к разным классам антимикробных
пептидов, производимых фагоцитарными клетками. Было определено влияние
особенностей
строения
капсулы
разных
штаммов
криптококков
на
их
чувствительность к дефенсинам, протегринам и магейнинам. Установлено, что
45
величина капсулы биопленок разных штаммов грибов колебалась в широких
пределах и не влияла на чувствительность криптококков к антимикробным
пептидам. Но в данной работе было выявлено, что биопленки без меланина были
более восприимчивы к антимикробным пептидам, чем биопленки с высоким
содержанием меланина [190].
Данных отечественной и зарубежной литературы о чувствительности
штаммов C. neoformans в зависимости от вирулентности к антимикробным
пептидам протегринам, мы не обнаружили.
Таким образом, взаимодействие криптококков с макрофагами является
центральным эффекторным механизмом в формировании иммунного ответа к C.
neoformans [139, 159, 214]. В большинстве случаев проведенные исследования по
оценке особенностей этого взаимодействия были основаны на сравнении
небольшого числа штаммов C. neoformans, являющихся, в том числе, и
генетически-модифицированными авирулентными мутантами. Поэтому для
понимания механизмов врожденного иммунного ответа необходима оценка
вирулентности штаммов C. neoformans, полученных от больных криптококкозом
и её влияние на все этапы фагоцитарного процесса при непосредственном
взаимодействии макрофагов с криптококками.
46
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 3 Объекты и методы исследования
Экспериментальное изучение влияния штаммов Cryptococcus neoformans
разной вирулентности на развитие реакций врожденного иммунитета in vitro
определило выбор материалов и методов, используемых в работе.
3.1 Объекты исследования
3.1.1 Штаммы Cryptococcus neoformans
Объектами исследования были 12 штаммов Cryptococcus neoformans РКПГ
№№: Y 1090, Y 1106, Y 1164, Y 1165, Y 1175, Y 1178, Y 1216, Y 1257, Y 1262, Y
1271, Y 1272, Y 1276. Использованные в работе штаммы получены из НИЛ
“Российская
коллекция
патогенных
грибов”
(РКПГ)
НИИ
медицинской
микологии им. П.Н. Кашкина ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И.И. Мечникова (зав. НИЛ
Чилина Г.А.). Все штаммы криптококков являются клиническими изолятами,
выделенными
от
больных
сотрудниками
лаборатории
микологического
мониторинга и биологии грибов НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина
ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И.И. Мечникова (зав. НИЛ, к.б.н. Богомолова Т.С.).
Клетки C. neoformans культивировали в течение 72 часов на скошенном
агаре Сабуро с 4% глюкозой при 370С, затем грибы были отмыты в стерильном
физиологическом растворе и доведены до концентрации 1х106 кл/мл в среде
RPMI–1640
(«РАА»,
Австрия).
Для
оценки
жизнеспособности
грибов
использовали окраску трипановым синим: мертвые (нежизнеспособные) клетки
окрашивались, а живые - не поглощали красителя. Жизнеспособность грибов,
использованных для эксперимента, была равна 98%.
Происхождение изолятов C. neoformans, использованных в работе,
отражено в таблице 2.
47
Таблица 2 – Происхождение штаммов С. neoformans РКПГ
№
№ штамма
Дата выделения
Биосубстрат
п/п
РКПГ
1
Y 1090
17.10.95
кровь
2
Y 1106
04.04.97
ликвор
3
Y 1164
09.02.98
кровь
4
Y 1165
21.04.98
селезенка (аутопсия)
5
Y 1175
14.10.99
ликвор
6
Y 1178
09.12.00
ликвор
7
Y 1216
20.04.04
ликвор
8
Y 1257
28.03.06
ликвор
9
Y 1272
30.05.06
ликвор
10
Y 1276
27.06.06
ликвор
11
Y 1262
12.09.06
ликвор
12
Y 1271
22.01.07
ликвор
3.1.2 Экспериментальные животные
Экспериментальные исследования проведены на мышах – самцах линии
Balb/c весом 18-20 г., полученных из питомника лабораторных животных
«Рапполово» РАМН. Всего в работе использовали 1080 мышей. Животных
содержали при комнатной температуре с 12-часовым циклом свет/темнота,
свободным доступом к воде и пище, на стандартной диете в соответствии с
нормами содержания лабораторных животных [17]. Работа подтверждена
заключением Локального этического комитета ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И.И.
Мечникова о соответствии международным этическим нормам, изложенным в
48
Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Рекомендации
для врачей, занимающихся биомедицинскими исследованиями».
3.2 Методы исследования
3.2.1 Морфология культур C. neoformans
Оценку морфологических характеристик и описание дрожжевых культур
проводили через 72 часа после их выращивания на плотной среде агар Сабуро при
37º С [39, 172]. Микроморфологию клеток криптококков, выросших на плотной
среде агар Сабуро, изучали при микроскопии в «раздавленной капле» и в туши.
Морфометрическое исследование клеток (диаметр клеток, толщина капсулы)
каждого штамма криптококка проводили с помощью светового микроскопа Leica
DM LB, используя программное обеспечение Leica IM 1000, Adobe Photoshop 7,
Excel и персональный компьютер на базе процессора Intel.
3.2.2 Видовая идентификация Cryptococcus neoformans
Видовую
идентификацию
штаммов
C.neoformans
проводили
масс-
спектрометрическим анализом на приборе MALDI-TOF MS Biotyper Autoflex
(Bruker, Германия). Идентификация в MALDI Biotyper происходит в основном по
рибосомальным
белкам,
которые
являются
уникальными
для
всех
микроорганизмов. При MALDI-TOF масс-спектрометрии белки и пептиды
располагаются в спектре по увеличению массы, давая характерный набор пиков,
позволяющий
проводить
видовую
идентификацию
путём
сопоставления
получаемых масс-спектров дрожжей с базой данных [49].
Предварительно штаммы культивировали на 4% сусло-агаре («НИЦФ»,
Россия) при 35° С в течение 48 часов. Для последующего исследования белкового
профиля культуры проводили прямое нанесение ее на 2 позиции мишени массспектрометра с последующей обработкой 1 мкл 70% раствором муравьиной
49
кислоты,
параллельно
из
культур
готовили
белковые
экстракты.
В
деионизованной воде готовили густую суспензию культур C. neoformans, которую
затем отмывали от компонентов среды путем центрифугирования при 15000 g в
течение 2 мин. Полученный осадок клеток ресуспендировали в 0,9 мл
абсолютного этанола, взбалтывали на вортексе («Biosan», Латвия) и выдерживали
при комнатной температуре 30 мин. Затем этанол удаляли повторным
центрифугированием (15000 g, 2 мин). Осадок клеток обрабатывали с помощью
20 мкл 70% раствора муравьиной кислоты, перемешивали на вортексе, затем
добавляли 20 мкл гиперградиентного ацетонитрила для ВЭЖХ и перемешивали
пипетированием. Клетки осаждали центрифугированием при 25000 g 2 минуты, а
надосадочную жидкость (белковый экстракт) в объеме 2 мкл использовали в
работе. На обработанную кислотой культуру и высохший белковый экстракт на
мишени наносили 1 мкл раствора матрицы, состоящей из свежеприготовленного
насыщенного
при
комнатной
температуре
раствора
α-циано-4-
гидроксициннамовой кислоты в смеси гиперградиентного ацетонитрила (50%),
деионизованной воды (47,5%) и трифторуксусной кислоты (2,5%). Образцы
высушивали под вытяжкой, затем мишень загружали в вакуумный шлюз массспектрометра [13, 49]. Предварительно масс-спектрометр калибровали в
автоматическом режиме по тест-образцу Bruker BTS, который является
универсальным калибрантом для бактерий и для грибов.
Идентификацию проводили с использованием программного обеспечения
MALDI Biotyper RTC 3.1 (Bruker Daltonics, Германия) путем сравнения
полученных результатов с базой референтных спектров II.2014. При видовой
идентификации
придерживались
следующих
критериев
показателей,
рекомендованных производителем: < 1,7 – идентификация не возможна; 1,7-1,99 –
вероятная родовая идентификация; 2,0-2,29 – точная идентификация рода,
вероятная видовая идентификация; >2,3 – видовая идентификация с высокой
вероятностью [187].
Процедуру
идентификации
проводили
максимального значения показателя достоверности.
повторно
до
достижения
50
Работа по определению вида C. neoformans методом масс-спектрометрии
выполнена при непосредственном участии сотрудников НИИ медицинской
микологии им. П.Н.Кашкина СЗГМУ им. И.И.Мечникова И.А. Рябинина и Е.Р.
Рауш.
Ранее в лаборатории молекулярной микологии Центра инфекционных
заболеваний и микробиологии (Австралия, г. Сидней), методами ПЦР-отпечатков
с праймером М13 и RFLP (Restriction Fragment Length Poiymorphism) гена URA5 с
использованием рестриктаз Hhal и Sau96 была пароведена идентификация
использованных в исследовании штаммов C. neoformans РКПГ Y 1164, Y 1165 и Y
1175 [5].
3.2.3 Определение вирулентности криптококков на лабораторных
животных
Модель экспериментального криптококкоза воспроизводили в опытах на
мышах – самцах Balb/с. Использовали штаммы РКПГ №№: Y 1106, Y 1178, Y
1165, Y 1090, Y 1216, Y 1262, Y 1272, Y 1257, Y 1271, Y 1276, Y 1175, Y 1164.
Культуры криптококков выращивали на плотной среде Сабуро при температуре
37° С в течение 72 часов, затем готовили взвеси в стерильном 0,9 % растворе NaCl
и вводили мышам внутривенно по 0,5 мл в хвостовую вену. Животным
контрольной группы вводили по 0,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Доза
патогена составляла 0,5х106 клеток C. neoformans на мышь для каждого штамма. В
каждую группу входило 10 мышей, эксперимент был повторен дважды. Всего в
исследовании по определению патогенности криптококков использовано 360
мышей. Далее, ежедневно регистрировали количество погибших и выживших
животных в течение 70 суток [236]. В качестве характеристики вирулентности
различных штаммов криптококков был принят день гибели 50% животных
(медиана выживаемости).
51
3.2.4. Определение фенолоксидазной активности C. neoformans
Выявление фенолоксидазной активности грибов проводили на среде с LДОФА. В результате ферментативного окисления этого субстрата образуется
меланин [4].
Культуры грибов засевали на чашки с L-ДОФА агаром радиальными
штрихами. Инкубировали при температуре 28ºС и 37ºС в течение 3-х суток.
Результаты контролировали ежедневно. Накопление пигмента оценивали в
баллах, полуколичественно: 3 балла - пигментация штриха интенсивная от темнокоричневой до черной, 2 балла - менее интенсивная коричневая окраска штриха,
1 балл - штрих светло-коричневый, 0 баллов - штрих белый, светлый, окраски нет
[4].
3.2.5 Получение перитонеальных макрофагов и культивирование их in vitro
В работе использовали макрофаги, полученные только от интактных мышей
после дислокации шейных позвонков. Резидентные макрофаги получали путем
перитонеального лаважа по 5 мл на мышь среды RPMI-1640 («РАА», Австрия) с
добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) («Биолот», Россия) и
160 мкг/мл гентамицина (Mapichem AG, Швейцария). Клетки собирали на льду,
пулировали, отмывали центрифугированием и ресуспендировали в указанной
выше среде до концентрации 1х106/мл, затем инкубировали в планшетах или
слайд-камерах (Chamber Slides, LabTek II, США) в течение 18 ч при 37 С в СО2инкубаторе
(Sanyo,
Япония)
с
5%
содержанием
СО2.
Для
изучения
функциональной активности макрофагов, неприлипшие клетки удаляли, а
оставшиеся инкубировали при различных условиях. В эксперименте использовали
интактные макрофаги и макрофаги, обработанные липополисахаридом (ЛПС)
(E.coli 055:B5, Sigma, США) в дозе 1 мкг/мл или ламинарином (Sigma, США) в
дозе 1 мг/мл. Ламинарин представляет собой β(1-3)-β(1-6)-гликан – линейный
полисахарид, обнаруженный в бурых водорослях Laminaria digitata и имеющий
52
сходную химическую структуру с полисахаридами грибов. Соотношение
гликанов β(1-3):β(1-6) в ламинарине - 3:1 [62].
Жизнеспособность
макрофагов
после
периода
культивирования
и
окрашивания 0,4% трипановым синим (Sigma США) составляла 95%.
В эксперименте использовали штаммы C. neoformans, опсонизированные
10% мышиной сывороткой в течение 1 часа при 370 С и грибы C. neoformans без
опсонизации. Свежую мышиную сыворотку получали из крови животных,
используемых в день эксперимента. Сыворотку крови тщательно отделяли от
сгустка, затем центрифугировали (160g, 10 мин).
3.2.6 Определение фагоцитарной активности макрофагов
Для изучения реакций врожденного иммунного ответа мы избрали
несколько
методологических
подходов,
включающих
взаимодействие
резидентных макрофагов интактных животных со штаммами C. neoformans
разной вирулентности in vitro. Сроки проведения экспериментов максимально
достигали 48 часов, что укладывается во временную концепцию развития реакций
врожденного иммунитета (таблица 3).
Таблица 3 – Продолжительность постановки реакций по изучению
иммунного ответа на штаммы C. neoformans.
№ п/п
Название реакции
Продолжительность
постановки реакции, ч
1
Поглотительная активность
(собственно фагоцитоз)
2
2
Продукция NO
48
3
НСТ-тест
Выработка про- и
противовоспалительных
цитокинов
Микробоцидная активность
Фагоцитов
48
4
5
24
48
53
Перитонеальные макрофаги в концентрации 1х106/мл объемом 0,4 мл
помещали в 4-луночные слайд-камеры (Chamber Slides, LabTek II, США) и
инкубировали СО2-инкубаторе в течение 18 часов. Затем макрофаги отмывали
забуференным физиологическим раствором, добавляли клетки C. neoformans
(соотношение макрофагов и грибов 1:2) и инкубировали в аналогичных условиях
2 часа. Клетки трижды отмывали физиологическим раствором, фиксировали
этанолом
и
окрашивали
по
Романовскому-Гимзе
[277].
Препараты
микроскопировали при 1000-кратном увеличении. Фагоцитарная функция
макрофагов
оценивалась
прямым
визуальным
подсчетом
поглощенных
микроорганизмов. Фагоцитарный индекс (ФИ) определяли при подсчете не менее
300 клеток как отношение числа макрофагов, поглотивших криптококки, к
общему числу макрофагов, выраженное в процентах. Фагоцитарное число (ФЧ)
определяли как среднее количество криптококков, захваченных одной клеткой
(оценка проводилась только в отношении фагоцитирующих клеток).
3.2.7 Методы определения факторов микробоцидности
3.2.7.1 Продукция нитроксид анионов
Клетки перитонеальных макрофагов в концентрации 1х10 6/мл вносили в
лунки 96-луночного планшета в количестве 0,1 мл. Добавляли равный объем
среды RPMI с 10% ЭТС без ЛПС (спонтанная продукция) или с ЛПС
(стимулированная продукция) в дозе 1 мкг/мл ; инкубировали в течение 18 ч при
37 С в СО2-инкубаторе с 5% содержанием СО2. Затем супернатант удаляли, к
макрофагам добавляли 100 мкл культуры C. neoformans в концентрации 1х105/мл
(соотношение 10:1), и равный объем полной среды. В контрольные лунки
(спонтанная и стимулированная продукция) вносили 200 мкл полной среды. Во
всех
опытах
проводилась
постановка
контроля
проводились трижды в трех параллельных пробах [199].
среды,
эксперименты
54
Через 48 часов инкубации макрофагов в СО2-инкубаторе, полученный
супернатант удаляли из лунок в стерильные 1,5 мл центрифужные пробирки типа
Эппендорф и замораживали для последующего определения выработки
нитроксид анионов.
В момент постановки реакции, готовили серию стандартов (разведений
NaNO2) для построения калибровочной кривой. Полученный ранее супернатант
размораживали и центрифугировали, затем 70 мкл каждого стандарта и образца
вносили в 96-луночные планшеты, добавляли равный объем реактива Грисса в
каждую лунку и инкубировали 15 минут при комнатной температуре. Оценку
спектра проводили при 540 нм с использованием планшетного фотометра
(HumaReader HS). Для построения стандартной кривой использовали серию
разведений NaNO2 в полной культуральной среде. Полученные результаты
выражали в нмоль/106 мф NO2- [199, 277].
3.2.7.2 Продукция супероксиданионов в тесте с нитросиним тетразолием
Метод автоматизированного учета теста с нитросиним тетразолием в
спонтанной и индуцированной модификациях использовали для изучения
способности макрофагов к продукции микробоцидных кислородзависимых
радикалов.
Для оценки спонтанной продукции кислородных радикалов, 100 мкл
клеточной суспензии резидентных макрофагов в концентрации 1х10 6кл/мл
вносили
в
96-луночные
плоскодонные
планшеты,
затем
добавляли
культуральную среду RPMI-1640 с 25% содержанием ЭТС. Оценивали
спонтанную
макрофагами.
и
индуцированную
Для
определения
продукцию
кислородных
индуцированного
показателя
радикалов
НСТ-теста
использовали ЛПС в дозе 1 мкг/мл, 0,1% суспензию зимозана и / или штаммы C.
neoformans в концентрации 1х105 кл/мл. Краситель нитросиний тетразолий (НСТ,
Sigma, США), приготовленный на забуференном физиологическом растворе
(ЗФР), добавляли в объеме 50 мкл на лунку в конечной концентрации 1мкг/мл.
55
Через 1 час инкубации клетки отмывали 1 раз ЗФР и 2 раза 70 этанолом путем
центрифугирования. После высушивания планшет на воздухе, образовавшийся в
лунках диформазан растворяли путем добавления в каждую лунку 120 мкл 2М
КОН (UNID, Корея) и 140 мкл ДМСО (GCC, США). Содержимое лунок
суспендировали
и
содержание
восстановленного
красителя
оценивали
спектрофотометрически при длине волны 620 нм на аппарате EMS Reader MFV2.
Результаты выражали в единицах оптической плотности (едОП) на 1х106
перитонеальных макрофагов [10, 104, 47].
3.2.8 Определение уровня продукции цитокинов макрофагами
Для определения способности перитонеальных макрофагов к продукции
цитокинов, клетки в концентрации 1х106кл/мл вносили в 24-луночные планшеты
(Orange Scientific, Бельгия) в окончательном объеме 1,5 мл. Предварительная
инкубация протекала в аналогичных для вышеперечисленных тестов условиях в
течение 18 часов без добавления или с добавлением ЛПС, и с ламинарином. Затем
планшеты
центрифугировали,
супернатант
удаляли.
Клетки
макрофагов
инкубировали совместно с C. neoformans (в концентрации 1х105 кл/мл в равном
объеме полной среды) 24 часа при 37o в СО2-инкубаторе (соотношение 10:1). В
качестве контроля была выбрана спонтанная выработка цитокинов макрофагами.
Продукцию цитокинов интерлейкина - 1β (IL-1β), интерлейкина - 6 (IL-6),
интерлейкина - 10 (IL-10), интерлейкина - 12p70 (IL-12p70), интерлейкина – 13
(IL-13), интерлейкина – 17 (IL-17), интерлейкина – 23 (IL-23), фактора некроза
опухоли альфа (TNF-α) и трансформирующего фактора роста бета (ТGF-β)
оценивали в супернатанте методом твердофазного иммуноферментного анализа
(ELISA, R&D Systems) в соответствии с инструкцией к наборам [277].
56
3.2.9 Определение цитотоксической активности перитонеальных макрофагов
Клетки макрофагов в концентрации 1х106/мл вносили в лунки 96луночного планшета в количестве 0,1 мл. Добавляли равный объем среды RPMI с
10% ЭТС без ЛПС или с ЛПС в дозе 1 мкг/мл ; инкубировали 18 ч при 37 С СО2инкубаторе. Затем супернатант удаляли, к макрофагам добавляли 100 мкл
культуры C. neoformans в концентрации 1х105/мл (соотношение 10:1), и равный
объем полной среды. Во всех опытах проводилась постановка контроля
криптококков без макрофагов. Через 48 часов совместной инкубации макрофагов
и криптококков в СО2-инкубаторе, полученный супернатант удаляли. Затем в
каждую лунку 96-луночного планшета вносили 100 мкл 0,02% додецил-сульфат
натрия (Sigma), суспендировали и лизат добавляли в пробирки. Клетки
дополнительно отмывали в 200 мкл стерильной дистиллированной Н 2О. Из
полученной смеси готовили разведение в соотношении 1:10, затем 100 мкл
образца засевали на чашки Петри с плотной средой Сабуро, с последующей
инкубацией в термостате при 370 С в течение 72 часов. Каждый эксперимент
проводили в двукратной повторности. Киллерную активность оценивали как
процент жизнеспособных клеток грибов после инкубации с макрофагами по
сравнению с контрольным ростом грибов без макрофагов.
3.2.10 Методы определения чувствительности C. neoformans к
антифунгальным агентам различного происхождения
3.2.10.1 Определение чувствительности C. neoformans к флуконазолу и
вориконазолу (CLSI M44-A)
При определении чувствительности к противогрибковым препаратам дискодиффузионным методом (CLSI М44-А) использовали бумажные диски диаметром
6 мм, пропитанные флуконазолом – содержание препарата в диске 25 мкг (Oxoid)
57
и вориконазолом, – содержание препарата в диске 1 мкг (Oxoid) [67]. Взвеси C.
neoformans приготавливали из выращиваемых в течение 3 суток при +37°С
культур на агаре Сабуро в чашках Петри, затем клеточную массу снимали с
поверхности агара бактериологической петлей, суспендировали в пробирке с
0,85% стерильным раствором натрия хлорида до густоты рабочих взвесей 0,5 ЕД
по Мак-Фарланду. Взвесь распределяли по всей поверхности чашки с агаром
Мюллера-Хинтон с добавлением 2% глюкозы и 0,5 мкг/мл метиленового синего
одноразовым стерильным тампоном (хлопок-дерево). Инкубацию проводили при
350 С 18-24 часа [67]. Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК)
определяли с помощью микробиологического анализатора BIOMIC Vision (Giles
Scientific, США) по образующейся зоне задержки роста. Для контроля качества
постановки опытов по определению чувствительности к антимикотическим
препаратам использовали штамм Candida parapsilosis ATCC 22019. Диаметр зоны
подавления роста грибов для флуконазола составлял более 23 мм, для
вориконазола – более 28 мм [67, 14].
Критерии
интерпретации
результатов
определения
чувствительности
к
флуконазолу и вориконазолу приведены в таблице 4.
Таблица 4 – Критерии определения чувствительности к флуконазолу и
вориконазолу
Категория
чувствительности
Чувствительный
S
Умеренно
чувствительный
SDD
Резистентный
R
Флуконазол
Вориконазол
Диаметр,
МИК,
Диаметр,
МИК,
мм
мкг /мл
мм
мкг /мл
≥19
≤8
≥17
≤1
15-18
16-32
14-16
2-4
≤14
≥64
≤13
≥8
58
3.2.10.2 Определение чувствительности к протегринам методом серийных
разведений
Протегрины PG-1, PG-2, PG-3 - антимикробные пептиды лейкоцитов
свиньи, близкие изоформы с молекулярной массой ~ 2000 Da, были получены
сотрудниками отдела общей патологии Научно-исследовательского института
экспериментальной медицины СЗО РАМН Кокряковым В.Н. и Кораблевой Е.С.
Для получения использовали метод кислотной экстракции с последующей
очисткой с помощью обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной
хроматографии [223].
Чувствительность криптококков к суммарной фракции протегринов
определяли методом серийных разведений путем совместной инкубации 1×10 4
кл/мл C. neoformans с различными концентрациями PG-1,2,3 в стерильном
растворе фосфатно-солевого буфера (0,5; 1; 2,5; 5; 7,5 мкг/мл) [12]. После 30 мин
инкубации при 370 С, 100 мкл взвеси засевали на чашки с агаром Сабуро и
инкубировали 72 ч при 370 С. В контрольных образцах, вместо протегринов,
использовали аналогичное количество раствора фосфатно-солевого буфера.
Антифунгальную
активность
протегринов
оценивали
по
числу
колониеобразующих единиц (КОЕ) с последующим определением минимальной
фунгицидной концентрации (MFC50) для каждого штамма C. neoformans. За
величину MFC50 принимали наименьшую концентрацию суммарной фракции
протегринов,
фунгицидную
при
которой
концентрацию
погибало
50%
определяли
криптококков.
путем
Минимальную
построения
графиков
зависимости фунгицидной активности протегринов от концентрации пептидов по
усредненным значениям трех независимых экспериментов.
59
3.2.11 Методы статистического анализа полученных данных
-
Статистическую обработку полученных в результате экспериментов
медико-биологических данных проводили c помощью программной системы
STATISTICA for Windows (версия 6.0).
В соответствии с целями и задачами исследования, а также с учетом
специфики анализируемых переменных [1, 2, 15, 18] нами выполнялись:
- построение и визуальный анализ графиков и диаграмм разброса данных;
- построение гистограмм разброса данных;
- расчет элементарных статистик (средние значения, ошибки средних,
среднеквадратические отклонения, размах разброса данных);
- построение и визуальный анализ корреляционных полей связи между
анализируемыми параметрами;
- расчет корреляционных матриц на основе линейной корреляции и
непараметрических методов.
сопоставление частотных характеристик качественных показателей проводилось с
помощью
непараметрических
методов
2
.
Сравнение
количественных
характеристик в исследуемых группах осуществлялось с использованием
критериев Манна–Уитни с указанием медианных значений показателей с
интерквартильным размахом 25%-75%, Ме (Lq - Hq) [1, 18].
Анализ выживаемости животных
проводили на основе определения
выживаемости по методу Каплана-Мейера.
Для сравнения двух групп использовался многовыборочный критерий,
который представляет собой развитие критерия Вилкоксона, обобщенного
Геханом [15, 18].
Для визуализации структуры полученных результатов, использовали
графические возможности системы Statstica for Windows, включая построение
кривых выживаемости по методу Каплана-Мейера, и модуль построения
диаграмм
Microsoft
Office.
Количественные
показатели
в
исследуемых
60
подгруппах были представлены в форме «Box & Whisker Plot» с отражением
среднего значения, ошибки среднего и стандартного отклонения для указанного
параметра [15,18].
Используемые в работе методы статистического анализа не требуют
специального контроля достаточности количества наблюдений, все допустимые
оценки
и
заключения
делаются при
автоматическом
учете
фактически
имеющихся данных [2, 18].
Критерием статистической достоверности полученных результатов считали
общепринятую в медико-биологических исследованиях величину р<0,05 [1, 2, 15,
18].
61
ГЛАВА 4 Морфо-биологическая характеристика штаммов
С. neoformans
Криптококкоз относится к оппортунистическим инфекциям и важную роль
в развитии заболевания играют, как известно, иммунные факторы. Учитывая
ингаляционный путь заражения, взаимодействие патогена с макрофагами,
которые являются первой линией защиты, определяет в значительной мере
возникновение криптококкоза. Из клинических наблюдений известно, что
криптококкоз может развиваться как стремительно, так и иметь хроническое
течение. Для изучения факторов, влияющих на тяжесть течения криптококкоза от
факторов
вирулентности
С.
была
neoformans,
выбрана
модель
экспериментального криптококкоза на животных.
Классическая триада факторов вирулентности С. neoformans представлена
способностью к росту при 37° С, способностью к капсуло – и меланинообразованию. Для изучения взаимодействия С. neoformans разной вирулентности
с макрофагами, патогенность была охарактеризована по этим показателям. С
помощью проведенных экспериментов мы моделировали ранний этап иммунного
ответа, который является ключевым в развитии криптококковой инфекции и
дальнейшего исхода заболевания.
4.1 Происхождение изолятов С. neoformans
Исследовано
12
штаммов
криптококков,
полученных
от
больных
криптококкозом с 1995 по 2007 годы в г. Санкт-Петербурге и Ленинградской
области. Девять изолятов из них были получены от ВИЧ–инфицированных
пациентов.
Преобладающей
клинической
формой
заболевания
был
криптококковый менингоэцефалит, основным биосубстратом, из которого
выделены криптококки – цереброспинальная жидкость. У двух пациентов
заболевание
криптококкозом
развилось
на
фоне
идиопатической
Т-
лимфоцитопении и после трансплантации почки. В одном случае у пациентки при
62
жизни не было установлено состояний, сопровождающихся
иммуносупрессией, но, по данным
выраженной
эпидемиологического анамнеза, был
установлен контакт с попугаем (таблица 5).
Среди больных криптококкозом было 9 мужчин и 3 женщины. Медиана
возраста больных составила 35,5 ± 2, 66 года (от 20 до 50 лет), у больных ВИЧинфекцией средний возраст составил 34,89 ± 2,47 года (от 24 до 43 лет).
Во всех случаях заболевание криптококкозом привело к летальному исходу.
63
Таблица 5 – Происхождение штаммов С. neoformans
№ № штамма Дата
п/п РКПГ
выделения
Инициалы
больного
Возраст
Пол
(лет)
1
Y 1090
17.10.95
С.А.И.
м
42
кровь
Клиникоэпидемиологические
факторы риска
ВИЧ-инфекция
2
Y 1106
04.04.97
Н.Т.П.
м
38
ЦСЖ
ВИЧ-инфекция
3
Y 1164
09.02.98
Х.Г.М.
ж
42
кровь
контакт с попугаем
4
Y 1165
21.04.98
Б.Э.И.
м
43
5
Y 1175
14.10.99
А.А.
м
50
ЦСЖ
6
Y 1178
09.12.00
Д.И.Н.
ж
20
ЦСЖ
идиопатическая
т-лимфоцитопения
трансплантация почки
7
Y 1216
20.04.04
Н.А.Е.
м
42
ЦСЖ
ВИЧ-инфекция
8
Y 1257
28.03.06
И.И.Б.
м
26
ЦСЖ
ВИЧ-инфекция
9
Y 1272
30.05.06
К.А.В.
м
39
ЦСЖ
ВИЧ-инфекция
10
Y 1276
27.06.06
З.П.И.
м
29
ЦСЖ
ВИЧ-инфекция
11
Y 1262
12.09.06
П.Ю.А.
ж
24
ЦСЖ
ВИЧ-инфекция
12
Y 1271
22.01.07
В.А.С.
м
31
ЦСЖ
ВИЧ-инфекция
Биосубстрат
селезенка
(аутопсия)
ВИЧ-инфекция
64
4.2Морфологическая и биологическая характеристика клинических
изолятов C. neoformans
Использованные в работе штаммы криптококков характеризовали по
морфо-биологическим свойствам. Штаммы образовывали слизистые блестящие
колонии светло-кремового или кремового цвета при температуре инкубации 37 ° С
на агаре Сабуро в течение 3-х суток. При микроскопическом исследовании
нативных препаратов, клетки всех исследуемых штаммов были округлыми,
одиночными или почкующимися, образовывали полисахаридную капсулу, что
соответствовало описанию грибов рода Cryptococcus в определителе дрожжей
[172].
Средний диаметр клеток штаммов C. neoformans определяли в пределах от
7,20 ± 0,06 мкм до 14,33 ± 0,51 мкм. При микроскопии у всех штаммов
криптококка выявляли капсулу, размер которой также значительно варьировал от
1,66 ± 0,07 мкм до 8,70 ± 0,54 мкм (таблица 6).
Таблица 6 – Морфометрия капсулы штаммов C. neoformans и размера клеток на
3-и сутки инкубации при 37° C.
№ п/п
№ штамма
РКПГ
Диаметр клетки,
мкм; (М±m)
Толщина капсулы,
мкм; (М±m)
1
Y 1106
14,33±0,51
8,70±0,54
2
Y 1175
8,23±0,17
2,46±0,11
3
Y 1165
9,65±0,17
4,48±0,18
4
Y 1262
10,39±0,14
3,23±0,14
5
Y 1178
9,22±0,20
2,69±0,13
6
Y 1090
9,04±0,14
2,26±0,06
7
Y 1257
7,66±0,15
1,71±0,11
8
Y 1271
8,37±0,13
1,89±0,05
9
Y 1272
8,32±0,10
1,93±0,06
10
Y 1276
7,20±0,06
1,66±0,07
11
Y 1216
7,36±0,12
1,97±0,08
12
Y 1164
7,34±0,16
1,66±0,09
65
а)
б)
Рисунок 4 – Световая микроскопия препаратов в туши (ув. х 400):
а) C. neoformans РКПГ Y 1106, толщина капсулы 8,70±0,54 мкм;
б) C. neoformans РКПГ Y 1276 толщина капсулы 1,97±0,08 мкм.
66
Фенолоксидазная активность криптококков является одним из факторов
патогенности. Оценку фенолоксидазной активности проводили по способности к
меланинообразованию. Установлено, что при выращивании криптококков при
температуре близкой к окружающей среде 28° С, все исследуемые культуры были
способны к образованию меланина уже на 1-е сутки инкубации. Полученные
результаты варьировали
от видимого отсутствия пигмента на поверхности
колоний (0 баллов) до коричневой окраски образовавшегося пигмента (3 балла).
При температуре человеческого тела 37° С, способность к меланинообразованию
была выражена значительно меньше. Образование пигмента наблюдали только ко
второму дню исследования, а у некоторых штаммов (РКПГ Y 1276, Y 1257, Y
1106, Y 1262, Y 1164) пигмент не накапливался и на третьи сутки инкубации при
37° С. Результаты экспериментов представлены в таблице 7.
Таблица 7 – Способность к меланинообразованию штаммов C. neoformans разной
вирулентности при температурах 28° С и 37° С в зависимости от степени
накопления пигмента на среде с L-ДОФА.
Y 1106
1-е
сутки
1
28° С
2-е
сутки
2
1-е
сутки
0
37° С
2-е
сутки
0,5
3-и
сутки
2
3-и
сутки
0,5
2
Y 1175
1
3
3
0
1
2
3
Y 1165
1
3
3
0
1
1
4
Y 1262
0,5
2
3
0,5
0,5
0,5
5
Y 1178
1
3
3
0,5
2
2
6
Y 1090
0,5
2
3
0,5
1
1
7
Y 1257
1
3
3
0
0
0,5
8
Y 1271
1
3
3
0,5
1
1
9
Y 1272
0,5
2
3
0
1
1
10
Y 1276
0,5
2
2
0
0
0
11
Y 1216
1
3
3
0,5
2
2
12
Y 1164
1
3
3
0
0,5
0,5
№
п/п
№
штамма
РКПГ
1
Примечание. Способность штаммов C. neoformans к меланинообразованию
выражена в баллах от 0 до 3.
67
Видовую идентификацию грибов проводили с использованием MALDI-TOF
масс-спектрометрии белков в культуре. Был подтвержден вид криптококков и
установлен вариант C. neoformans.
Таблица 8 – Результаты видовой идентификации C. neoformans, полученные
методом MALDI-TOF MS.
№
п/п
Коэффициент
№
штамма
Вид микромицета
Вариант
РКПГ
достоверности
идентификации
MALDI-TOF MS
1
Y 1090
Cryptococcus neoformans
var. grubii
2,105
2
Y 1106
Cryptococcus neoformans
var. grubii
2,014
3
Y 1164
Cryptococcus neoformans
var. grubii
2,053
4
Y 1165
Cryptococcus neoformans
var. grubii
2,122
5
Y 1175
Cryptococcus neoformans
var. grubii
1,877
6
Y 1178
Cryptococcus neoformans
var. neoformans
1,860
7
Y 1216
Cryptococcus neoformans
var. grubii
2,136
8
Y 1257
Cryptococcus neoformans
var. neoformans
1,713
9
Y 1272
Cryptococcus neoformans
var. neoformans
1,815
10
Y 1276
Cryptococcus neoformans
var. grubii
2,032
11
Y 1262
Cryptococcus neoformans
var. grubii
1,993
12
Y 1271
Cryptococcus neoformans
var. grubii
1,904
Все штаммы, используемые в эксперименте, были отнесены к виду
Cryptococcus neoformans, у 9 штаммов был определен var. grubii, у 3 штаммов var. neoformans. Большинство штаммов удалось идентифицировать с высоким
значением коэффициента достоверности (2,1-1,9). Однако у 4 штаммов РКПГ: Y
68
1175, Y 1178, Y 1257 и Y 1272 коэффициент идентификации при многократных
повторных определениях не превышал значения порядка 1,9.
Кроме того, ранее три из исследованных штаммов (РКПГ Y 1164, РКПГ Y
1165, РКПГ Y 1175) были идентифицированы в лаборатории молекулярной
микологии Центра инфекционных заболеваний и микробиологии (Австралия, г.
Сидней), методами ПЦР-отпечатков с праймером М13 и RFLP (Restriction
Fragment Length Poiymorphism) гена URA5 с использованием рестриктаз Hhal и
Sau96. Результаты по определению вида и варианта для этих трех штаммов
криптококков, полностью совпали с нашими исследованиями, полученными
методом MALDI-TOF MS.
Таким
образом,
криптококков
и
подтверждена
определение
возможность
варианта
видовой
возбудителя
идентификации
методом
масс-
спектрометрического анализа.
4.3 Определение патогенности криптококков на экспериментальных
животных
Следующий
этап
работы
заключался
в
характеристике
степени
вирулентности каждого штамма и разделении С. neoformans на группы.
Вирулентность штаммов C. neoformans определяли после внутривенного
введения одной дозы патогена (1х106/мл), как указано в главе 3. Показатели
выживаемости
экспериментальных
животных,
зараженных
клиническими
изолятами C. neoformans, в течение 70 суток ежедневного наблюдения отражены в
таблице 3. Установлено, что сроки гибели экспериментальных животных после
внутривенного
заражения
мышей
двенадцатью
штаммам
C.
neoformans
варьировали (рисунок 5, таблица 9). На основании этих результатов все штаммы
разделили на две группы: в первой группе сроки гибели 50% животных составили
от 8 до 16 дней, во второй группе – 27-65 дней. В таблице 9 медиана
выживаемости (срок гибели 50% животных) указана в порядке возрастания.
69
Таблица 9 – Вирулентность изолятов C. neoformans в зависимости от штаммовой
принадлежности
Вирулентность
медиана выживаемости
степень
(дни)
8
п/п
№
№ штамма РКПГ
1
Y 1106
2
Y 1175
11
3
Y 1165
14
4
Y 1262
15
5
Y 1178
16
6
Y 1090
27
7
Y 1257
30
8
Y 1271
39
9
Y 1272
51
10
Y 1276
51
11
Y 1216
65
12
Y 1164
65
сильновирулентные
штаммы
слабовирулентные
штаммы
Таким образом, 5 штаммов C. neoformans, вызвавших гибель животных в
ранние сроки, были отнесены к сильновирулентным штаммам. Вторую группу из
7 штаммов криптококков, при заражении которыми мыши погибали значительно
позже, рассматривали как слабовирулентные штаммы (таблица 9). В контрольной
группе все животные были живы в течение всего срока наблюдения.
При проведении 2-х мерного анализа по всем парным критериям и
многомерному χ-квадрату, группы криптококков достоверно различались по
вирулентности (p<0,001). Результаты статистического анализа представлены на
рисунке 5.
70
Cumulative Proportion Surviving (Kaplan-Meier)
Complete
Censored
1,0
Cumulative
Proportion Surviving
выживаемость
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
-0,1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Слабов ирулент ные
Сильнов ирулент ные
дни после
инфицирования
Time
Рисунок 5 – Выживаемость мышей, инфицированных штаммами C.
neoformans разной вирулентности. По оси ординат – кумулятивная доля
выживших животных. По оси абсцисс – время от начала эксперимента, сутки
(р<0,001).
Таким образом, все исследованные клинические изоляты C. neoformans
обладали факторами патогенности (рост при 37° С, способность к капсулообразованию и меланинообразованию) и в эксперименте проявляли разную
степень вирулентности.
71
ГЛАВА 5 Взаимодействие штаммов C. neoformans разной вирулентности с
перитонеальными макрофагами in vitro
Для функциональной характеристики активности макрофагов использовали
набор
классических
макроорганизма:
активности
методов
поглотительной
(продукции
активных
оценки
противоинфекционной
активности
форм
макрофагов,
кислорода
и
защиты
микробоцидной
оксида
азота)
и
цитотоксичнской (киллерной) активности, как результирующей взаимодействия
живых C. neoformans с фагоцитами. Иммунорегуляторную функцию фагоцитов,
которая определяет дальнейшее развитие адаптивного иммунитета, оценивали по
способности
макрофагов
к
продукции
провоспалительных
и
противовоспалительных цитокинов.
5.1 Фагоцитарная активность макрофагов в отношении C. neoformans
При сравнении фагоцитарной активности интактных перитонеальных
макрофагов
in
vitro
в
отношении
сильно
и
слабовирулентных
неопсонизированных штаммов C. neoformans, были выявлены статистически
значимые различия между группами. Показатели фагоцитарного индекса были
выше по отношению к слабовирулентным штаммам C. neoformans (рисунок 6).
При оценке фагоцитарной активности макрофагов, стимулированных ЛПС,
по отношению к штаммам C. neoformans разной вирулентности установлено, что
фагоцитарный
индекс
был
сходен
с
показателями,
полученными
при
взаимодействии с интактными макрофагами, при этом разница в показателях
фагоцитоза между сильно и слабовирулентными штаммами сохранялась (рисунок
6).
72
ФИ%
p<0,05
16
p<0,05
14
12
10
8
6
4
2
0
МФ+C.n.
МФлпс+C.n.
сильновирулентные штаммы (n=5)
Рисунок
6
–
Показатели
слабовирулентные штаммы (n=7)
фагоцитарной
активности
макрофагов,
активированных ЛПС, в отношении неопсонизированных штаммов C. neoformans
разной вирулентности (M±m).
73
Рисунок 7 – Фагоцитарная активность интактных макрофагов в отношении
сильновирулентного штамма C. neoformans РКПГ Y 1106 (ФИ – 6%). (Увеличение
х 1000, окраска по Романовскому-Гимзе)
Рисунок 8 – Фагоцитарная активность интактных макрофагов в отношении
слабовирулентного штамма C. neoformans
РКПГ Y 1216 (ФИ – 14%).
(Увеличение х 1000, окраска по Романовскому-Гимзе).
74
После предварительной опсонизации клеток грибов свежей мышиной
сывороткой отмечали повышение фагоцитарной активности макрофагов в 2 раза
при взаимодействии как с сильновирулентными (ФИ 8,88±0,29% vs 17,65±0,92%),
так и со слабовирулентными штаммами криптококков (ФИ 14,32±0,44% vs
29,62±1,89%)
(рисунок
9).
При
фагоцитозе
опсонизированных
штаммов
криптококков статистически значимые различия сохранялись: предварительная
обработка криптококков сывороткой повышала поглотительную активность
макрофагов, при этом фагоцитоз сильновирулентных штаммов оставался на
достаточно низком уровне (рисунок 9).
p<0,05
29,62
Фагоцитарный индекс, %
Фагоцитарное число
p<0,05
17,65
1,3
3
14,32
1,53
1,5
1,41
8,88
МФ+C.n.
МФ+C.n.опс
сильновирулентные штаммы
МФ+C.n.
МФ+C.n.опс
слабовирулентные штаммы
Рисунок 9 – Показатели фагоцитарной активности интактных макрофагов
(фагоцитарный индекс и фагоцитарное число) в отношении опсонизированных и
неопсонизированных штаммов C. neoformans разной вирулентности р<0,05;
(M±m).
При подсчете фагоцитарного числа было определено, что каждый макрофаг,
участвующий в фагоцитозе, был способен к поглощению не более 1-2
криптококков. Показатели фагоцитарного числа не зависели от степени
вирулентности штаммов и их предварительной опсонизации (рисунок 9).
75
При проведении корреляционного анализа выявлена прямая зависимость
между поглотительной активностью интактных макрофагов в отношении
штаммов C. neoformans и выживаемостью мышей (r=0,65; p<0,05). Таким образом,
в эксперименте наблюдали следующую закономерность: чем выше степень
вирулентности криптококков, тем ниже показатели фагоцитарной активности.
В
результате
поглотительной
проведенного
активностью
корреляционного
макрофагов
и
анализа
шириной
между
капсулы
у
неопсонизированных (а) и опсонизорованных (б) штаммов C. neoformans
выявлена обратно пропорциональная зависимость (рисунок 10 а, б; р<0,05): чем
больше ширина капсулы, тем ниже показатели фагоцитарной активности.
а)
б)
Correlation: r = -,4137
Correlation: r = -,4106
14
14
12
12
10
ширина капсулы, мкм
ширина капсулы, мкм
10
8
6
4
8
6
4
2
2
0
0
-2
0
5
10
15
20
ФИ % (мф+C.n.)
25
30
95% confidence
35
-2
0
10
20
30
40
ФИ % ( C.n.опс)
50
60
70
80
95% confidence
Рисунок 10 – Корреляционная зависимость между поглотительной активностью
макрофагов и шириной капсулы в отношении неопсонизированных (а: r = - 0,42
; р<0,05) и опсонизированных (б: r = - 0,41; р<0,05) штаммов C. neoformans.
Корреляционный анализ Спирмена: по оси абсцисс – фагоцитарный индекс (%);
по оси ординат – ширина капсулы для каждого штамма C. neoformans (мкм).
Полученные в результате эксперимента данные подтверждают, что
полисахаридная капсула играет важную роль, препятствующую поглощению C.
neoformans макрофагами. Общеизвестно, что фагоцитоз микроорганизмов
опосредуется рецепторами на поверхности макрофагов. Имеются данные
76
литературы о том, что в фагоцитоз грибов макрофагальными клетками
преимущественно опосредован через dectin-1 [125].
Для того чтобы оценить участие рецептора dectin-1 в фагоцитозе
криптококков, мы использовали вещество растительного происхождения –
ламинарин, который является общепринятым блокатором рецептора dectin-1 [74].
Ламинарин представляет собой β(1-3)-β(1-6)-гликан – линейный полисахарид и
имеет сходную химическую структуру с полисахаридами грибов.
После предварительной обработки макрофагов ламинарином наблюдали
двукратное снижение поглотительной активности макрофагов в отношении как
сильновирулентных, так и слабовирулентных штаммов C. neoformans (рисунок
11). При этом ламинарин нивелирует разницу в фагоцитарной активности
макрофагов между сильно и слабовирулентными штаммами. Корреляционной
зависимости между фагоцитозом криптококков, предварительно обработанных
ламинарином, и толщиной капсулы выявлено не было (r = – 0,20).
p<0,05
%
16
МФ+C.n.
14
12
10
p<0,05
МФ+C.n.
8
МФлам+C.n.
6
МФлам+C.n.
4
2
0
сильновирулентные штаммы (n=5)
слабовирулентные штаммы (n=7)
Рисунок 11 – Влияние ламинарина на поглотительную активность макрофагов в
отношении неопсонизированных штаммов C. neoformans разной вирулентности,
(M±m). Каждый эксперимент проводили в 3 повторностях и повторяли трижды.
77
Следовательно, результаты проведенных исследований показали, что
ламинарин,
блокируя
макрофагальный
рецептор
dectin-1,
препятствует
фагоцитозу криптококков независимо от степени их вирулентности.
Таким образом, установлено, что фагоцитарная активность макрофагов
зависит от степени вирулентности и ширины капсулы штаммов C. neoformans.
Ламинарин препятствует фагоцитозу криптококков независимо от степени их
вирулентности.
5.2 Влияние штаммов C. neoformans разной вирулентности на
продукцию факторов микробоцидности перитонеальными макрофагами
5.2.1 Влияние штаммов C. neoformans разной вирулентности на
способность макрофагов к продукции супероксид анионов in vitro
Полученные в результате эксперимента данные показали, что показатели
спонтанной реакции НСТ-теста у перитонеальных макрофагов определялись на
низком уровне. Установлено, что все штаммы C. neoformans, независимо от
степени их вирулентности, не оказывали влияния на способность макрофагов к
продукции супероксиданионов in vitro (рисунок 12).
Для подтверждения способности макрофагов вырабатывать активные
формы кислорода, использовали зимозан, который входит в состав клеточной
стенки дрожжей и взаимодействует с макрофагами через рецептор TLR2, через
который происходит фагоцитоз глюкуроноксиломаннана. В эксперименте при
стимуляции макрофагов зимозаном отмечали повышение выработки активных
форм кислорода. При добавлении штаммов C. neoformans разной вирулентности к
макрофагам, стимулированным зимозаном, уровни продукции супероксиданионов
не изменялись (рисунок 12). Корреляционной зависимости между показателями
продукции кислородных радикалов и способностью к капсулообразованию и
меланинообразованию не выявлено (р>0,05).
78
ед ОПх1000
200
p>0,05
180
160
140
120
p>0,05
100
80
60
40
20
0
контроль МФ
МФ+C.n.
контроль Мфзим
сильновирулентные штаммы (n=5)
Рисунок 12 –
НСТ-тесте
МФ+C.n.+зим
слабовирулентные штаммы (n=7)
Показатели продукции кислородных радикалов макрофагами в
при
взаимодействии
со
штаммами
C.
neoformans
разной
вирулентности. Все эксперименты проводили в 3 повторностях и повторяли
трижды.
Установлено, что штаммы C.neoformans разной вирулентности не влияли на
продукцию активных форм кислорода перитонеальными макрофагами интактных
мышей in vitro.
5.2.2 Влияние штаммов C. neoformans разной вирулентности на способность
макрофагов продуцировать нитроксидные радикалы in vitro
При взаимодействии C. neoformans разной вирулентности с интактными
макрофагами мышей показано отсутствие индукции криптококками выработки
оксида азота. Опсонизация клеток криптококков свежей мышиной сывороткой
также не влияла на продукцию оксида азота (рисунок 13а).
79
а)
нмоль/106 мф
p>0,05
350
300
250
200
150
100
50
0
контроль МФ
МФ+C.n.
сильновирулентные штаммы (n=5)
МФ+C.n. опс
слабовирулентные штаммы (n=7)
нмоль/106 мф
б)
p<0,05
350
*
300
p<0,05
250
**
**
200
150
100
50
0
контроль МФ
контроль МФлпс
МФлпс+C.n.
сильнов ирулентные штаммы (n=5)
Рисунок
13
–
Продукция
нитроксидных
МФлпс+C.n.опс
слабов ирулентные штаммы (n=7)
радикалов
перитонеальными
макрофагами (М±m):
а) при взаимодействии с неопсонизированными и опсонизированными штаммами
C. neoformans разной вирулентности (p > 0,05).
б) предварительно активированными ЛПС в дозе 1 мкг/мл, при взаимодействии со
штаммами C. neoformans разной вирулентности.
* - активация макрофагов ЛПС (р<0,05); ** - различия между штаммами (р<0,05).
80
Стимуляция макрофагов ЛПС в течение 18 часов индуцировала продукцию
нитроксидных радикалов фагоцитарными клетками (рисунок 13б). Добавление
криптококков к макрофагам, предварительно обработанных ЛПС, привело к тому,
что сильновирулентные штаммы достоверно снижали продукцию оксида азота
(рисунок 14а), а слабовирулентные, напротив, дополнительно стимулировали
продукцию NO2 - макрофагами (рисунок 14б).
а)
Сильновирулентные штаммы
360
340
320
нмоль х106/кл
300
280
260
240
220
200
М
М±SE
M±1,96*SE
180
160
контроль мф ЛПС
мф ЛПС+C.n.
б)
Слабовирулентные штаммы
360
340
нмоль х 106/кл
320
300
280
260
240
М
М±SE
M±1,96*SE
контроль мф ЛПС
мф ЛПС+С.n.
Рисунок 14 – Выработка нитроксидных радикалов макрофагами, предварительно
активированными ЛПС при взаимодействии со штаммами C. neoformans:
а) сильновирулентные штаммы; б) слабовирулентные штаммы
(p<0,05 - по сравнению с контролем макрофагов, стимулированных ЛПС).
Каждый эксперимент проводили в 3 повторностях и повторяли трижды.
81
нмоль/106мф
350
300
250
200
150
100
50
0
контроль МФ
контроль МФлам
МФ+C.n.
сильнов ирулентные штаммы (n=5)
Рисунок
15
–
макрофагами,
Продукция
нитроксидных
предварительно
МФлам+C.n.
слабов ирулентные штаммы (n=7)
радикалов
обработанными
перитонеальными
ламинарином,
при
взаимодействии со штаммами C. neoformans разной вирулентности (М±m).
Проведенный
корреляционный
анализ
между
продукцией
NO2-
макрофагами, стимулированными ЛПС, выявил обратную корреляционную
зависимость с капсулой (r =- 0,58; р<0,05).
Использование в эксперименте предварительной обработки макрофагов
ламинарином в концентрации 1 мг/мл не приводило к статистически значимому
повышению продукции оксида азота макрофагами (рисунок 16). При добавлении
криптококков к макрофагам, обработанным ламинарином, различий во влиянии
сильно и слабовирулентных штаммов C. neoformans на показатели продукции
нитроксид анионов нами не выявлено (рисунок 15.)
Таким образом, впервые выявлены штаммные различия C. neoformans в
отношении
индукции
сильновирулентные
слабовирулентные
оксида
штаммы
штаммы
азота
макрофагами,
ингибировали
оказывали
стимулированными
продукцию
стимулирующее
ЛПС:
нитроксид-анионов,
действие.
а
Полученные
результаты свидетельствуют, что фактором микробоцидности при взаимодействии
макрофагов со штаммами C. neoformans разной вирулентности, является продукция
фагоцитами NO2-.
82
5.3 Определение цитотоксической активности макрофагов по отношению к
штаммам C. neoformans разной вирулентности
Исследована цитотоксическая активность макрофагов как интегральный
показатель завершенности фагоцитарного процесса в отношении штаммов C.
neoformans разной вирулентности. Выявлены статистически значимые различия
микробицидной активности фагоцитов при взаимодействии как с сильно, так и со
слабовирулентными штаммами криптококков (рисунок 16). При этом медианные
значения киллерной активности макрофагов достигали 14% (интерквартильный
размах 7% - 20%) Me(Lq–Hq) для сильновирулентных и 25% (21%-30%) для
слабовирулентных штаммов, что свидетельствует о низкой микробоцидной
активности интактных макрофагов в отношении штаммов C. neoformans.
Установлено, что предварительная опсонизация грибов не приводила к
достоверному
повышению
цитотоксической
(киллерной)
активности
перитонеальных макрофагов (рисунок 16).
% 70
60
50
40
p<0,05
30
20
10
0
МФ+C.n.
сильновирулентные штаммы (n=5)
МФ+C.n. опс
слабовирулентные штаммы (n=7)
Рисунок 16 – Влияние предварительной опсонизации штаммов C. neoformans
разной вирулентности на цитотоксическую активность интактных макрофагов,
Me (Lq–Hq).
83
Стимуляция макрофагов ЛПС повышала цитотоксическую активность в
отношении всех исследованных изолятов (рисунок 17). Опсонизация
C.
на фоне активации макрофагов ЛПС приводила к усилению
neoformans
микробоцидной активности макрофагов только в отношении слабовирулентных
штаммов (рисунок 17).
При
проведении
выживаемость
мышей,
корреляционного
зараженных
анализа,
штаммами
было
C.
выявлено,
neoformans
что
разной
вирулентности в высокой степени коррелировала с цитотоксической активностью
макрофагов, стимулированных ЛПС (r = 0,75; p < 0,05).
%
70
60
p<0,05
p<0,05
50
p<0,05
40
30
20
10
0
МФ+C.n.
сильновирулентные штаммы (n=5)
МФлпс+C.n.
МФлпс+C.n. опс
слабовирулентные штаммы (n=7)
Рисунок 17 – Влияние опсонизации штаммов C. neoformans разной вирулентности
на киллерную активность макрофагов, предварительно стимулированных ЛПС ,
Me (Lq–Hq).
Таким образом, киллерная активность макрофагов, стимулированных ЛПС,
была более выражена в отношении слабовирулентных штаммов.
84
5.4 Оценка спектра цитокинов, вырабатываемых макрофагами, при
взаимодействии с криптококками in vitro
Макрофаги распознают микроорганизмы и индуцируют Т-лимфоциты к
различным типам иммунного ответа, определяющим исход взаимодействия
иммунных клеток макроорганизма и патогенов. В настоящее время признанными
являются 4 типа иммунного ответа (Тh1, Тh2, Тreg, Тh17). В связи с этим, мы
исследовали способность макрофагов продуцировать различные цитокины при
взаимодействии с криптококками разной вирулентности для того, чтобы
определить, какой тип ответа они преимущественно индуцируют.
Нами установлено, что все изученные штаммы C. neoformans не
стимулировали перитонеальные макрофаги к выработке провоспалительных IL12р70, IL-1β, TNF-α, IL-23, IL-6 и противовоспалительного цитокина TGF-β
(рисунок 18). В то же время, нами были получены результаты, указывающие на
статистически значимое повышение продукции интактными макрофагами IL-13,
IL-10 и IL-17 (рисунок 18).
пг/мл
450,0
*
400,0
350,0
300,0
250,0
200,0
150,0
100,0
*
*
IL-10
IL-13
50,0
0,0
IL-1β
TNF-α
TGF-β
IL-12
IL-23
контроль МФ
Рисунок
18
–
Продукция
IL-6
IL-17
МФ +С.n.
цитокинов
интактными
макрофагами
взаимодействии со всеми изученными штаммами С. neoformans. * - p<0,05.
при
85
При анализе продукции IL-13, IL-10 и IL-17 интактными макрофагами были
выявлены различия в показателях при взаимодействии с сильновирулентными и
слабовирулентными штаммами (рисунок 19).
пг/мл
*
500
450
400
*
350
300
250
200
150
*
*
*
100
*
50
0
IL-10
контроль
IL-13
сильновирулентные штаммы (n=5)
IL-17
слабовирулентные штаммы (n=7)
Рисунок 19 – Продукция IL-10, IL-13 и IL-17 интактными макрофагами при
взаимодействии со штаммами С. neoformans разной вирулентности, Me (Lq–Hq).
* - с контролем, p<0,05.
Корреляционный анализ Спирмена подтвердил прямо пропорциональную
зависимость между вирулентностью грибов и способностью к индукции данных
цитокинов (IL-13, r = 0,63 (p<0,05); IL-10, r = 0,62 (p<0,05); IL-17, r =0,82; p<0,05).
В ходе дальнейших исследований было изучено влияние C. neoformans
разной вирулентности на продукцию IL-13, IL-10 и IL-17 при взаимодействии с
макрофагами, предварительно обработанными ЛПС или ламинарином.
Добавление ЛПС к интактным макрофагам повышало выработку IL-10.
Было установлено, что сильновирулентные штаммы грибов статистически
значимо
повышали
продукцию
IL-10
макрофагами,
предварительно
86
стимулированными ЛПС (по сравнению с контролем – концентрацией,
продуцируемой макрофагами, стимулированным только ЛПС) (рисунок 20).
пг/мл
120
p<0,05
*
IL-10
p<0,05
100
*
*
*
80
*
60
40
20
0
МФ+C.n.
контроль
МФ лпс+C.n.
сильнов ирулентные штаммы (n=5)
МФ лам+C.n.
слабов ирулентные штаммы (n=7)
Рисунок 20 – Влияние С. neoformans разной вирулентности на продукцию IL-10
макрофагами, культивированными с липополисахаридом или ламинарином.
* - между группами сильно и слабовирулентных штаммов по отношению к
контролю (по Манну-Уитни, Me (Lq–Hq) , p<0,05).
После
предварительной
обработки
интактных
макрофагов
ЛПС
и
ламинарином сохранялась их способность к продукции IL-10 при взаимодействии
с C. neoformans, при этом различия в показателях между сильно и
слабовирулентными штаммами нивелировалась (рисунок 20).
При оценке продукции IL-13 было выявлено, что сильновирулентные
штаммы статистически значимо снижали выработку IL-13 макрофагами как
предварительно стимулированными ЛПС, так и макрофагами, обработанными
ламинарином (рисунок 21).
87
пг/мл
**
120
*
100
IL-13
*
**
80
*
60
40
20
0
МФ+C.n.
контроль
МФ лпс+C.n.
МФ лам+C.n.
сильновирулентные штаммы (n=5)
слабовирулентные штаммы (n=7)
Рисунок 21 – Влияние С. neoformans разной вирулентности на продукцию IL-13
макрофагами, культивированными с липополисахаридом или ламинарином; Me
(Lq–Hq). * - между штаммами (по Манну-Уитни, p<0,05);
** - между группами сильновирулентных штаммов по отношению к опыту с
интактными макрофагами (по Манну-Уитни, p<0,05).
В результате проведенных исследований по оценке продукции IL-17
макрофагами, предварительно стимулированными ЛПС, установлено, что
сильновирулентные
штаммы
усиливали
его
продукцию
в
отличие
от
слабовирулентных штаммов С. neoformans (рисунок 22). Эксперименты по
изучению способности макрофагов, обработанных ламинарином, к выработке IL17, не проводились.
88
пг/мл
p<0,05
700,0
IL-17
*
600,0
p<0,05
500,0
*
400,0
*
300,0
200,0
100,0
0,0
МФ+C.n.
контроль
МФ лпс+C.n.
сильнов ирулентные штаммы (n=5)
слабов ирулентные штаммы (n=7)
Рисунок 22 – Влияние С. neoformans разной вирулентности на продукцию IL-17
макрофагами, культивированными с липополисахаридом, Me (Lq–Hq).
*
-
статистически
значимые
различия
между
группами
сильно
и
слабовирулентных штаммов по отношению к контролю.
Таким образом, сильновирулентные штаммы C. neoformans достоверно
выше, по сравнению со слабовирулентными штаммами, активировали макрофаги
к продукции
IL-13, IL-10 IL-17. Предварительная обработка макрофагов
липополисахаридом или ламинарином приводила к снижению способности
сильновирулентных штаммов C. neoformans индуцировать выработку IL-13.
89
5.5 Чувствительность штаммов C.neoformans разной вирулентности к
азоловым препаратам и антимикробным пептидам животного происхождения
Проблемой
современной
химиотерапии
криптококкоза,
является
резистентность штаммов к антимикробным препаратам.
При определении чувствительности штаммов C.neoformans к флуконазолу и
вориконазолу установлено, что из 12 изученных штаммов чувствительными к
флуконазолу были 8 штаммов, что составило 67% от общего числа изолятов,
умеренно чувствительными – 2 штамма и резистентными - 2 штамма C.
neoformans. Все исследуемые штаммы были чувствительны к вориконазолу.
Результаты определения чувствительности C. neoformans к антифунгальным
препаратам приведены в таблице 10.
Таким образом, из 5-ти исследованных сильновирулентных штаммов C.
neoformans – 1 штамм (Y 1175) был резистентен к флуконазолу, и два штамма (Y
1106 и Y 1262) обладали промежуточной чувствительностью. Из слабовирулентных
штаммов
только
для
штамма
Y
1090
была
определена
резистентеность к флуконазолу.
Таблица 10 – Результаты определения чувствительности к флуконазолу и
вориконазолу для штаммов C. neoformans.
№
п/п
№ штамма
РКПГ
1
Флуконазол
Вориконазол
Диаметр,
мм
МИК,
мкг/мл
Чувстви- Диаметр, МИК, Чувствительность
мм
мкг/мл тельность
Y 1106
18
32
SDD
29
0,125
S
2
Y 1175
14
96
R
29
0,125
S
3
Y 1165
26
4
S
38
<0,06
S
4
Y 1262
18
32
SDD
27
0,125
S
5
Y 1178
29
2
S
38
<0,06
S
6
Y 1090
12
256
R
25
0,25
S
7
Y 1257
22
12
S
32
0,06
S
8
Y 1271
21
12
S
32
0,06
S
90
Продолжение таблицы 10
№
п/п
№ штамма
РКПГ
9
Флуконазол
Вориконазол
Диаметр,
мм
МИК,
мкг/мл
Чувстви- Диаметр, МИК, Чувствительность
мм
мкг/мл тельность
Y 1272
25
6
S
35
0,06
S
10
Y 1276
249
2
S
41
<0,06
S
11
Y 1216
24
8
S
32
0,06
S
12
Y 1164
24
8
S
34
0,06
S
Примечание. R- резистентные штаммы, SDD– штаммы с промежуточной
чувствительностью, S – чувствительные штаммы. МИК – минимальная
ингибирующая концентрация.
При исследовании чувствительности криптококков к антимикробным
пептидам установлено, что величина минимальной фунгицидной концентрации
MFC50 суммарной фракции протегринов PG-1, PG-2, PG-3 для штаммов C.
neoformans варьировала от 0,8 мкг/мл до 3,7 мкг/мл (рисунок 23, таблица 11).
Таблица 11 – Результаты определения чувствительности к суммарной фракции
протегринов PG-1, PG-2, PG-3 для штаммов C. neoformans в зависимости от
факторов патогенности.
№
п/п
№ штамма
РКПГ
MFC50
(мкг/мл)
1
Y 1164
0,8
Образование
меланина
(37оС)
на 3-и сутки
0,5
2
Y 1262
0,8
3
Y 1276
4
Медиана
выживаемости
(дни)
Размер капсулы
(мкм)
(М±m)
65
1,66±0,09
0,5
15
3,23±0,14
1,1
0
51
1,660,07
Y 1257
1,2
0,5
30
1,71±0,11
5
Y 1106
1,4
0,5
8
8,70±0,54
6
Y 1090
2,0
1
27
2,26±0,06
7
Y 1272
2,3
1
51
1,93±0,06
8
Y 1271
2,4
1
39
1,89±0,05
9
Y 1165
2,6
1
14
4,48±0,18
10
Y 1216
2,9
2
65
1,97±0,08
91
Продолжение таблицы 11
№
п/п
№ штамма
РКПГ
MFC50
(мкг/мл)
11
Y 1178
3,5
Образование
меланина
(37оС)
на 3-и сутки
2
12
Y 1175
3,7
2
Примечание.
В
таблице
данные
Медиана
выживаемости
(дни)
Размер капсулы
(мкм)
(М±m)
16
2,69±0,13
11
2,46±0,11
представлены
в
порядке
снижения
чувствительности к суммарной фракции протегринов, способность штаммов C.
neoformans к меланинообразованию выражена в баллах.
а)
контроль
РКПГ Y 1216: MFC50 - 2,9 мкг/мл
контроль
РКПГ Y 1272: MFC50 - 2,3 мкг/мл
б)
Рисунок 23 – Пример фунгицидной активности суммарной фракции протегринов
PG-1, PG-2, PG-3 по отношению к слабовирулентным штаммам C. neoformans,
культивируемых in vitro в концентрациях от 0,5 мкг/мл до 5 мкг/мл в течение 30
минут при 370 С.
92
Поскольку в литературе имеются данные о том, что образование
полисахаридной капсулы и синтез меланина могут препятствовать действию
протегринов
на
криптококки,
мы
решили
оценить
эти
факторы
при
взаимодействии клинических изолятов C. neoformans с протегринами in vitro.
[279, 197]. Нами был проведен корреляционный анализ, позволяющий выявить
возможную степень зависимости чувствительности криптококков к действию
протегринов от их способности проявлять защитные свойства в виде образования
меланина или капсулы.
Согласно полученным данным, суммарно представленным в таблице 6,
выявлена прямая корреляционная зависимость между MFC50 и способностью
штаммов C. neoformans к меланинообразованию in vitro (r = 0,92, р<0,05; рисунок
24).
Scatterplot: MFC 50 vs. меланинообразование (Casewise MD deletion)
меланинообразование = ,73296 + ,61557 * MFC 50
Correlation: r = ,92167
3,2
3,0
2,8
2,6
2,4
2,2
2,0
1,8
1,6
меланинообразование
1,4
1,2
1,0
0,8
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
MFC 50
4,0
95% confidence
Рисунок 24 – График корреляционной зависимости между MFC50 и способностью
штаммов C. neoformans к меланинообразованию ( r = 0,92; р <0,05).
В результате эксперимента нами не было выявлено корреляционной
зависимости
концентрацией
между
толщиной
протегринов
капсулы
MFC50.
Также
и
минимальной
нами
не
было
фунгицидной
установлено
статистически значимых различий и корреляции между степенью вирулентности
93
штаммов C. neoformans и чувствительностью к суммарной фракции протегринов
(рисунок 25, p>0,05).
4,0
3,5
MFC 50,мкг/мл
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
1
2
сильновирулентные слабовирулентные
штаммы
Медиана
25%-75%
Мин-Макс
Рисунок 25 – График определения МFС50 к суммарной фракции протегринов в
зависимости от степени вирулентности штаммов C. neoformans, Me(Lq – Hq);
p>0,05).
Таким образом, чувствительность штаммов C. neoformans к суммарной
фракции протегринов напрямую зависит от способности криптококков к
меланинообразованию и не зависит от степени вирулентности и толщины
капсулы грибов.
94
ГЛАВА 6 ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Cryptococcus neoformans является оппортунистическим патогеном, который
в мире ежегодно вызывает около 1 млн случаев заболевания криптококкозом
[115]. Летальность от криптококкоза, несмотря на применение современных
антимикотических препаратов, достигает 20-70% в зависимости от уровня
экономического
развития
страны
[48,
133].
Глобальная
заболеваемость
криптококкозом, согласно данным международной организации LIFE (Leading
international fungal education) 2014 года, составляет от 0,01 до 20 случаев на 100
000 населения, в том числе в России этот показатель достигает 0,21 случаев. [219,
114, 180].
Как
правило,
криптококкозом
заболевают
лица
с
приобретенной
дисфункцией иммунитета, в частности с дефектами Т-клеточного звена. Больные
ВИЧ/СПИД – инфекцией (80-90%), лимфомами или длительно получающие
иммуносупрессивные препараты, подвергаются наибольшему риску развития
криптококковой инфекции [211]. Особое внимание обращают на себя вспышки
заболеваемости криптококозом в связи с появлением новых гипервирулентных
штаммов, поражающих лиц без видимых признаков нарушения иммунитета.
Установлено, что C. gattii поражает преимущественно иммунокомпетентных
людей, и этот факт указывает на важность изучения уже известных и еще
недостаточно
охарактеризованных
факторов
вирулентности,
присущих
криптококкам, и оценки вклада этих факторов в развитие и исход заболевания
[247].
Несмотря на то, что в связи с развитием молекулярно-генетических
технологий в последние годы появились новые данные о факторах патогенности
криптококков, феномен вирулентности штаммов комплекса C. neoformans / C.
gattii требует дальнейшего изучения [227, 5]. Учитывая, что основной путь
заражения при криптококкозе ингаляционный, криптококковая пневмония
встречается редко и заболевание диагностируется, как правило, на стадии
криптококкового
менингоэнцефалита.
Поэтому
мы
сосредоточили
свои
95
исследования на взаимодействии изолятов C. neoformans, полученных от больных
криптококкозом, с перитонеальными макрофагами мышей – самцов линии Balb/c.
В работу были включены 12 штаммов C. neoformans (РКПГ №№: Y 1106, Y
1178, Y 1165, Y 1090, Y 1216, Y 1262, Y 1272, Y 1257, Y 1271, Y 1276, Y 1175, Y
1164). При оценке морфо-биологических особенностей штаммов C. neoformans
изучили их патогенность на животных (мыши линии Balb/c). Нами установлено,
что все исследованные штаммы обладали разной степенью вирулентности. После
наблюдения в течение 70 дней, сроки гибели 50% животных, зараженных одной
дозой патогена (1х106/мл), для разных штаммов C. neoformans составили от 8 до
65 дней. На основании полученных данных, все исследованные штаммы в
зависимости от сроков гибели мышей, были разделены на две группы (р<0,05).
Полученные данные совпадают с результатами других исследователей о
различиях клинических изолятов C. neoformans по степени вирулентности [3].
Попытки
применения
протеомного
типирования
криптококков
в
медицинской микологии начались несколько лет назад и в настоящее время ещё
не имеют широкого распространения. В отечественной и зарубежной литературе
отражены немногочисленные исследования в этой области [228, 192, 118, 8].
Методом MALDI-TOF-MS мы подтвердили не только вид криптококков,
включенных в эксперимент, но и установили варианты C. neoformans, что
недоступно при проведении традиционных методов идентификации грибов. Хотя
в современной микологии «золотым стандартом» диагностики
микромицетов
является метод мультилокусного сиквенирования (MLST), наряду с ним,
применение MALDI-TOF-MS
рассматривается
как
альтернативный
метод
диагностики, обладающий преимуществом с точки зрения экономической
целесообразности и более быстрого получения результатов исследования.
Проведенная ранее идентификация 3-х из исследованных штаммов (РКПГ Y 1164,
Y 1165, Y 1175) методами ПЦР-отпечатков с праймером М13 и RFLP (Restriction
Fragment Length Poiymorphism) гена URA5 с использованием рестриктаз Hhal и
Sau96 [5], и полное совпадение с результатами по определению вида и варианта
для этих трех штаммов криптококков методом MALDI-TOF MS. В настоящее
96
время
используемый
метод
еще
не
внедрен
в
рутинную
практику
микробиологических лабораторий, но открывает перспективы для дальнейших
исследований в этой области, в том числе и по определению вирулентности
методами протеомного анализа.
Следует заметить, что данные о влиянии вирулентности штаммов C.
neoformans на особенности иммунного ответа при взаимодействии с клетками
врожденного иммунитета ограничены. Одни авторы считают, что это связано с
состоянием иммунной системы макроорганизма, другие придерживаются мнения
о необходимости учитывать факторы вирулентности патогена [29, 5]. Полученные
экспериментальные данные указывают, что выявленные различия в иммунном
ответе при взаимодействии с криптококками связаны со степенью вирулентности
штаммов.
Нами установлено, что все исследованные штаммы соответствовали
классической триаде факторов вирулентности С. neoformans: способности к росту
при температуре макроорганизма (37° С), способности к капсулообразованию и
меланинообразованию. Способность исследованных С. neoformans к росту при
физиологических температурах тела не менее важна, чем любые другие факторы
патогенности. При сравнении C. neoformans с другими представителями рода
Cryptococcus было выявлено, что многие криптококки обладают факторами
вирулентности, такими как капсула и лакказа, но при этом они не являются
патогенными только потому, что они не способны к росту при температуре тела
млекопитающих [26]. Одним из важных факторов патогенности криптококков
является их способность к капсулообразованию [255]. В проведенном нами
исследовании при микроскопии у всех штаммов С. neoformans выявляли
полисахаридную капсулу, размер которой варьировал от 1,66 ± 0,07 мкм до 8,70 ±
0,54 мкм. Полученные результаты согласуются с данными зарубежной
литературы о роли капсулы как одного из основных факторов патогенности [92,
180, 284]. В окружающей среде капсула также играет важную роль в защите
организма против неблагоприятных условий, таких, как обезвоживание [255],
97
поэтому существующая гипотеза отечественных ученых об общебиологической
роли капсулы С. neoformans сохраняет свою актуальность [7].
Способность
криптококков
к
меланинообразованию
оценивали
при
выращивании на среде с L-ДОФА при t° 28° С и 37° С. Все исследуемые культуры
уже на 1-е сутки инкубации при t° 28° С проявляли фенолоксидазную активность.
Активность фермента при температуре инкубации 28° С была значительно выше,
чем при 37° С. В нашей работе установлено, что штаммы C. neoformans проявляли
разную фенолоксидазную активность, их способность к меланинообразованию in
vitro не коррелировала со степенью вирулентности.
С одной стороны,
полученные результаты не вполне согласуются с данными о том, что меланинпродуцирующие штаммы C. neoformans являются более вирулентными [59]. С
другой стороны, они совпадают с аналогичными результатами в других
исследованиях, в том числе с теми, в которых криптококки, не относящиеся к
патогенным, способны образовывать меланин [26]. Это можно объяснить
штаммными различиями C. neoformans в сочетании факторов патогенности и
выраженности их действия.
Это не вполне согласуется с данными отечественной и зарубежной
литературы, согласно которым меланин рассматривается как один из основных
факторов патогенности [185, 60].
С течением времени грибы приобрели различные способы уклонения от
защитных механизмов иммунной системы макроорганизма. Выбор способа
выживания зависит от продукции специфических факторов патогенности и/или от
условий, которые эти патогены находят в организме-хозяине. Однако механизмы,
посредством которых криптококки уклоняются от поглощения фагоцитами и
разрушения внутри фаголизосом клетки, остаются мало изученными [30].
Можно предположить, что исход взаимодействия между грибами и
макрофагами зависит от состояния иммунной системы макроорганизма и степени
вирулентности грибов. В этом отношении, фагоцитоз грибов макрофагами можно
рассматривать
как
главный
механизм
врожденной
контролирующий возникновение инфекции, и ее исход.
иммунной
системы,
98
Для выявления механизмов взаимодействия С. neoformans с фагоцитарными
клетками in vitro, оценивали влияние криптококков разной вирулентности на
поглотительную активность макрофагов, “респираторный взрыв”, продукцию
оксида
азота,
выработку
широкого
спектра
провоспалительных
и
противовоспалительных цитокинов и киллинг криптококков макрофагами.
При проведении серии экспериментов нами было показано, что интактные
макрофаги мышей обладали слабой поглотительной активностью по отношению
ко всем исследованным штаммам С. neoformans. Но при этом макрофаги более
эффективно фагоцитировали клетки C. neoformans слабовирулентных штаммов по
сравнению с сильновирулентными (р<0,05). Нами также выявлена обратнопропорциональная зависимость между шириной капсулы C. neoformans и
фагоцитарным индексом макрофагов (r=-0,42; р<0,05). Полученные данные
согласуются с результатами других исследователей, которые установили, что
генетически модифицированные штаммы криптококков, у которых отсутствует
капсула, успешно поглощаются макрофагами, тогда как криптококки с
выраженной капсулой более резистентны к фагоцитозу [279, 92, 165]. Наши
результаты также подтверждают мнение других ученых о том, что
капсула
оказывает влияние на процесс поглощения С. neoformans, и представлять собой
барьер, предотвращающий контакт между лигандами клеточной стенки гриба,
такими как маннаны или β-гликаны, и их рецепторами на фагоцитах [69, 169].
Входящий в состав клеточной стенки большинства микромицетов и
расположенный непосредственно под капсулой гриба β-гликан взаимодействует с
рецепторами макрофагов, в основном с dectin-1, и стимулирует микробицидную
активность фагоцитов [74]. Использованный в нашей работе ламинарин
представляет собой β(1,3)-гликан с β(1,6)-связями – полисахарид, выделенный из
бурых водорослей Laminaria digitata и обладает сродством к рецептору на
макрофагах. В проведенном исследовании выявлено, что ламинарин снижал
способность макрофагов поглощать клетки грибов как слабовирулентных, так и
сильновирулентных штаммов (р<0,05). Это позволяет нам сделать предположение
об участии капсулярных β-гликанов в фагоцитозе криптококков. Вероятно,
99
данный
полисахарид доступен для распознавания рецепторами макрофагов.
Полученные результаты очень противоречивы, но они согласуются с новыми
данными, которые подтверждают наличие β-гликанов в составе капсулы C.
neoformans [65].
При
оценке
влияния
криптококков
разной
вирулентности
на
поглотительную активность фагоцитов, предварительно стимулированных ЛПС,
мы не выявили существенного изменения фагоцитарной активности макрофагов
по отношению ко всем исследованным штаммам грибов. Полученные результаты
позволяют
предположить,
что
рецепторы
для
ЛПС
на
макрофагах
непосредственно не участвуют в поглощении C. neoformans [45].
Наряду с этим известно, что инкубация грибов с сывороткой крови
облегчает поглощение микроорганизмов за счет активации альтернативного пути
системы комплемента и отложению значительного количества его фрагментов
С3(iC3b) в капсуле гриба [171, 208]. В соответствии с этими данными с целью
преодоления антифагоцитарных свойств криптококков их обрабатывали свежей
мышиной
сывороткой,
содержащей
компоненты
комплемента.
В
нашем
исследовании установлено, что добавление свежей сыворотки к грибам
существенно усиливало поглотительную активность макрофагов, которые более
эффективно
фагоцитировали
опсонизированные
клетки
C.
neoformans
слабовирулентных штаммов по сравнению с сильновирулентным (таблица 1).
Очевидно, это происходит за счет образования дополнительных сайтов
связывания между поверхностью капсулы грибов, покрытой iC3b, и С3рецепторами на макрофагах. Это наблюдение совпадает с данными других
исследований [208, 92]. Таким образом, установлено, что клетки C. neoformans,
недостаточно активно поглощаются макрофагами.
Известен факт, что фагоцитоз макрофагами C. neoformans опосредован
через рецепторы, обладающие сродством к маннозе – одной из основныз
составляющих глюкуроноксиломаннана полисахаридной капсулы криптококков.
Это обусловлено тем, что полисахарид, продуцируемый C. neoformans,
конкурирует с криптококками за эти рецепторы, по-видимому, выигрывает эту
100
“борьбу” за счет большей биодоступности и поэтому клетки C. neoformans слабо
поглощаются. Однако какова дальнейшая судьба поглощенных штаммов
криптококков
разной
вирулентности
в
макрофагах,
и
какие
факторы
микробоцидности (активные формы кислорода или оксида азота) являются
определяющими в этом процессе, изучено недостаточно.
В нашем исследовании установлено, что все штаммы криптококков не
индуцировали выработку активных продуктов кислорода и оксида азота после
поглощения их интактными макрофагами [286, 290, 291]. Полученные результаты
совпадают с данными ряда исследователей о неспособности C. neoformans
активировать выработку активных форм кислорода макрофагами и синтез оксида
азота мышиными макрофагальными клеточными линиями in vitro [31, 206, 201].
Однако эти данные противоречат результатам других авторов, установившим,
что криптококки индуцируют респираторный взрыв в мышиных макрофагах [138]
и
выработку
оксида
азота
крысиными
альвеолярными
макрофагами
в
экспериментах in vitro [221].
При предварительной стимуляции макрофагов ЛПС было выявлено, что
сильновирулентные штаммы достоверно ингибировали продукцию оксида азота
макрофагами, а слабовирулентные штаммы оказывали стимулирующее действие
(р<0,05). В работе Kawakami K. с соавт. было установлено, что C.neoformans
снижают
выработку
оксида
азота
перитонеальными
макрофагами,
стимулированными бактериальным ЛПС и IFN-γ [83]. При этом супрессирующий
эффект не был опосредован капсульным полисахаридом, так как генетически
модифицированные штаммы криптококков, у которых отсутствует капсула,
показали ингибирующую активность подобную штаммам с капсулой. Таким
образом, впервые были выявлены штаммные различия C. neoformans в отношении
продукции оксида макрофагами, стимулированными ЛПС [299, 286].
Необходимо было изучить цитотоксичную активность макрофагов, как
интегральный показатель завершенности фагоцитоза, по отношению к штаммам
гриба разной вирулентности. Было установлено, что интактные макрофаги
достоверно сильнее разрушали слабовирулентные клетки криптококков, по
101
сравнению с сильновирулентными штаммами и этот показатель коррелировал с
их фагоцитарной активностью. Активация макрофагов ЛПС существенно
усиливала цитотоксичную активность макрофагов по отношению ко всем
исследованным штаммам грибов, хотя между группами сохранялись достоверные
различия. Из полученных экспериментальных данных очевидно, что одним из
факторов микробоцидности макрофагов был оксид азота, а не реактивные
производные
активации
НАДФ-оксидазы
[291,
290,
286].
Опсонизация
макрофагов сывороткой усиливала как фагоцитарную, так и цитотоксическую
активность макрофагов по отношению к грибам, при этом, не влияя на продукцию
оксида азота макрофагами, что свидетельствует о возможном вовлечении других
механизмов микробоцидности, в частности лизосомальных ферментов, в
уничтожение патогенов.
Несмотря на то, что взаимодействие криптококков с макрофагами является
центральным эффекторным механизмом в формировании иммунного ответа к C.
neoformans. Большинство проведенных исследований по оценке особенностей
этого взаимодействия были получены при сравнении не более трех штаммов
грибов, один из которых был невирулентным мутантом [130, 116, 186, 241, 292]. В
нашем исследовании было проведено сравнение 12 штаммов грибов разной
вирулентности, полученных от больных криптококкозом, и исследован широкий
спектр продуцируемых цитокинов при непосредственном взаимодействии
макрофагов с грибами [288, 289, 295].
Важным аспектом первичного взаимодействия макрофагов с криптококками
на раннем этапе является продукция цитокинов, которые определяют дальнейший
ход инфекционного процесса, возможность выживания патогена и развитие
определенного типа иммунного ответа, являющегося наиболее эффективным в
борьбе с данным патогеном. Считается, что протективным типом ответа в борьбе
с грибами является развитие Th1 ответа, которому способствует продукция
провоспалительных цитокинов, а другие типы ответа являются непротективными
и приводят к формированию затяжного течения заболевания [52, 196, 175, 292].
102
Поэтому была поставлена задача по изучению влияния штаммов C. neoformans
разной вирулентности на продукцию цитокинов фагоцитами.
При оценке спектра цитокинов, вырабатываемых макрофагами, выявили,
что все изученные штаммы C. neoformans вне зависимости от степени их
вирулентности, были неспособны стимулировать макрофаги к продукции
провоспалительных цитокинов – IL-12, IL-1β и TNF-α и регуляторных цитокинов
– TGF-β и IL-23. Полученные результаты совпадают с данными литературы о
неспособности
фагоцитарных
клеток
человека
и
мышей
к
выработке
провоспалительных цитокинов при взаимодействии с криптоккоками [208].
Однако другими исследователями показано, что слабовирулентные, генетически
модифицированные штаммы криптококков, лишенные капсулы, способны
стимулировать
продукцию
провоспалительных
цитокинов
[258].
Эти
противоречия можно объяснить тем, что большинство работ по изучению роли
цитокинов
в
течении
криптококковой
инфекции
были
проведены
на
экспериментальных моделях in vivo. Следовательно, в выработке медиаторов
иммунного ответа могли принимать участие другие иммунные клетки. Известно
ограниченное количество исследований, посвященных изучению способности
различных штаммов C. neoformans активировать макрофаги к продукции
цитокинов in vitro. Отсутствие продукции данных цитокинов при поглощении
макрофагами С. neoformans можно объяснить недостатком лигандов в структуре
капсулы и клеточной стенки криптококка. Они необходимы для взаимодействия с
рецепторами, ответственными за активацию молекул внутриклеточной передачи
сигнального каскада для активации соответствующих генов. Это, в свою очередь,
препятствует развитию протективного иммунного ответа. Все исследованные
штаммы С. neoformans не влияли на способность макрофагов, предварительно
стимулированных
ЛПС
или
обработанных
ламинарином,
к
продукции
провоспалительных цитокинов [289].
В настоящее время имеются сведения об ассоциации сильновирулентных
штаммов с минимальным или полностью отсутствующим воспалительным
ответом в тканях, однако роль медиаторов иммунного ответа в развитии этих
103
событий в зависимости от вирулентности штаммов C. neoformans остается
неизвестной [5].
В наших исследованиях было показано, что криптококки стимулируют
макрофаги к продукции IL-10, причем сильновирулентные штаммы С. neoformans
достоверно сильнее активировали его выработку. Уровень продукции IL-10
положительно коррелировал со степенью вирулентности штаммов грибов (r =
0,62;
p<0,05).
Добавление сильновирулентных
штаммов
криптококков к
макрофагам, предварительно обработанным ЛПС, повышало выработку IL-10.
Хотя
в
других
исследованиях
сильновирулентных
штаммов
сообщалось
криптококков
об
отсутствии
индуцировать
способности
макрофаги
к
продукции IL-10, не выявлено влияния грибов на продукцию данного цитокина
макрофагами, стимулированными ЛПС и ИФН-γ [22]. Ламинарин не влиял на
индуцированную криптококками продукцию IL-10, что свидетельствует о том,
что процесс активации синтеза данного цитокина не зависит от связывания
лигандов грибов с рецептором дектин-1 макрофагов.
Ранее предполагали, что при криптококкозе, баланс между цитокинами,
которые вырабатывают Tх1 и Tх2, имеет решающее значение для исхода
заболевания. Установлено, что удлинение сроков жизни мышей, инфицированных
высоковирулентным штаммом С. neoformans, может быть достигнуто за счет
непрерывного введения IL-12 или нейтрализации IL-4. В ряде исследований
подтверждено,
что
развитие
иммунного
ответа
по
Tх1-типу
является
определяющим в защите от С. neoformans [235, 141], в то время как Tх2-тип
ответа способствует прогрессированию инфекции и это связано с индукцией
альтернативно активированных макрофагов [225, 235, 141, 76].
Получены данные по изучению способности С. neoformans разной
вирулентности стимулировать макрофаги к выработке IL-13. Установлено, что
сильновирулентные штаммы сильнее стимулировали фагоциты к продукции этого
Тх2-ассоциированного цитокина, как по сравнению с фоновой продукцией
интактными макрофагами, так и по отношению к действию на макрофаги
слабовирулентных штаммов грибов (p<0,05). Добавление сильновирулентных
104
штаммов криптококков к предварительно инкубированным макрофагам с ЛПС
или обработанным ламинарином привело к отмене их стимулирующего влияния
на макрофаги к продукции IL-13 вероятно за счет блокады рецепторов
макрофагов этими лигандами.
Сопоставляя полученные результаты с данными других исследователей при
моделировании экспериментальной криптококковой инфекции in vivo, можно
предположить, что
макрофагами
они
при
взаимодействии
приобретают
признаки
всех
штаммов криптококков с
альтернативно
активированных
макрофагов: отсутствие продукции провоспалительных цитокинов IL-12, TNF-α и
IL-1β и такого микробицидного фактора как оксид азота, умеренная выработка IL10 и повышенный синтез IL-13. Все штаммы исследованных криптококков были
клиническими изолятами и выделены от больных, погибших от криптококкоза.
Следовательно, несмотря на разную степень их вирулентности, установленную у
экспериментальных животных, они обладали сходными способностями по
влиянию на активность макрофагов, но с разной степенью интенсивности.
Роль IL-17 в развитии грибковых инфекций мало изучена, так как показано,
что
IL-17
способен
чувствительность
как
повышать
экспериментальных
резистентность,
животных
к
так
и
усиливать
различным
грибковым
патогенам [161]. В нашем исследовании установлено, что все штаммы
криптококков, и особенно сильновирулентные штаммы грибов, активировали
фагоциты к продукции IL-17 (r=0,82; p<0,05). Предварительная инкубация
макрофагов с ЛПС и последующее добавление сильновирулентных штаммов С.
neoformans дополнительно стимулировало продукцию данного цитокина, так же
как и IL-10. Да Силва и соавт. установили, что хитин, и другие грибковые
компоненты клеточной стенки грибов, стимулируют макрофаги к продукции IL17 за счет активации TLR2 MyD88-зависимым способом. Эти данные согласуется
с нашими исследованиями, так как добавление грибов к макрофагам,
стимулированным ЛПС, усиливало продукцию и IL-10, и IL-17, вероятно за счет
TLR2, распознающего такие структуры гриба, как глюкуроноксиломаннан.
Предполагается, что TLR4 и дектин-1 участвовали в проведении сигнала внутрь
105
ядра макрофага и индукции IL-13, так как в нашем исследовании показано, что их
блокада приводила к снижению его выработки. Эти данные могут указывать на
синергичную индукцию грибами IL-10, IL-17 отличную от IL-13. Полученные
данные согласуются с исследованиями, которые подтверждают, что IL-17 не
участвует в поляризации эффекторных свойств макрофагов и не влияет на баланс
других цитокинов [249].
Проблема растущей резистентности штаммов криптококка к флуконазолу
[85, 156] диктует необходимость улучшения имеющихся методов лечения и,
соответственно, применения новых препаратов [108]. В настоящее время в
условиях in vitro в качестве перспективных объектов рассматриваются различные
пептиды, обладающие антимикробной активностью (дефенсины, кателицедины,
протегрины,
цекропины,
магейнины
и
др.).
Достоверных
различий
и
корреляционной зависимости между степенью вирулентности штаммов C.
neoformans и MFC50 установлено не было. Данных отечественной и зарубежной
литературы о чувствительности штаммов C. neoformans разной вирулентности к
антимикробным пептидам, в частности к протегринам, мы не обнаружили.
При
исследовании
фунгицидной
активности
суммарной
фракции
протегринов в отношении 12 штаммов клинических изолятов C. neoformans in
vitro было установлено, что они были чувствительны к протегринам в разной
степени. Механизм действия протегринов до конца не выяснен, но считается, что
он универсален для разных катионных пептидов [93].
Поскольку в литературе имеются указания на то, что оба механизма - как
образование полисахаридной капсулы, так и синтез меланина [279, 197], могут
препятствовать действию протегринов на криптококки, мы решили оценить вклад
каждого из этих факторов на модели клинических изолятов.
Далее нами был проведен корреляционный анализ, позволяющий выявить
возможную степень зависимости чувствительности криптококков к действию
протегринов от их способности проявлять защитные свойства в виде образования
капсулы или меланина. Зависимости между шириной капсулы штаммов C.
neoformans и их чувствительностью к протегринам не было выявлено (r = – 0,09;
106
p>0,05). Однако между способностью криптококков к меланинообразованию и их
чувствительностью
к
протегринам
in
vitro
была
выявлена
обратная
корреляционная зависимость (r = – 0,92; p<0,05).
Полученные нами данные об отсутствии связи между толщиной капсулы и
чувствительностью к протегринам in vitro не согласуются с работой O. Zaragoza и
соавт., в которой было показано, что C. neoformans, имеющие меньшую толщину
капсулы (2-3мкм) более чувствительны к действию протегрина PG-1, чем
микромицеты, имеющие капсулу толщиной 10-15 мкм [279]. В нашей работе
эксперименты ставили на разных штаммах криптококков, имеющих исходные
различия по толщине капсулы, которые затем были подвергнуты действию
протегринов в одинаковых условиях. В отличие от этого, в работе O. Zaragoza
исследования проведены на одном и том же штамме C. neoformans Н99 (серотип
А), который помещали в разные условия по составу среды и температуре для
образования большей – в одном случае или меньшей капсулы - в другом случае.
Таким образом, на чувствительность к протегринам могла влиять не только
толщина капсулы, которую оценивали авторы, но и многие другие изменения
жизнедеятельности криптококков, которых авторы не учитывали.
В то же время, мы подтверждаем данные, полученные Doering T.L. и
Martinez L.R., в которых показано, что меланизация криптококков способствует
снижению их чувствительности к протегринам [190, 197]. Из этих работ, особый
интерес представляют исследование Doering T.L. и соавт., в котором установлено,
что при длительном (9-15 сут) культивировании штамма C. neoformans 24067
(серотип D) с добавлением в среду L-ДОФА и последующей меланизацией,
криптококки становятся менее чувствительными к протегрину PG-1, чем без
добавления L-ДОФА. Наши данные дополняют результаты вышеуказанных работ,
а именно впервые такие исследования проведены на клинических изолятах C.
neoformans разной вирулентности (12 штаммов) и показаны статистически
значимые межштаммовые различия [293, 297].
Таким образом, было установлено, что макрофаги слабо поглощали штаммы
C. neoformans (были не способны стимулировать продукцию супероксиданиона и
107
оксида азота интактными макрофагами, не индуцировали выработку IL-1β, IL12р70, TNF-α, IL-23, TGF-β, и, в зависимости от вирулентности штаммов C.
neoformans,
индуцировали
продукцию
других
исследованных
цитокинов.
Наиболее характерной для сильновирулентных штаммов была стимуляция
выработки макрофагами IL-13 и IL-10, подавляющих антигрибковую активность
макрофагов. Эти результаты вносят важный вклад в изучение иммунопатогенеза
криптококкоза и определяют влияние вирулентности штаммов C. neoformans на
функциональную активность макрофагов in vitro. В результате проведенных
исследований доказано, что вирулентность штаммов C. neoformans играет важную
роль во взаимодействии макрофагов и криптококков.
108
ВЫВОДЫ
1. Клинические
изоляты
C.
neoformans
обладают
разной
степенью
вирулентности (медиана выживаемости мышей Balb/c 8-65 дней), (p<0,05).
2. Способность макрофагов к фагоцитозу зависит от вирулентности штаммов
C. neoformans. Макрофаги активнее поглощают слабовирулентные штаммы
криптококков
зависимость
(p<0,05).
между
Установлена
фагоцитозом
обратно
макрофагов
и
пропорциональная
шириной
капсулы
C.neoformans: чем больше размер капсулы, тем ниже фагоцитарная
активность (r = - 0,82; p<0,05).
3. Штаммы C. neoformans не обладают способностью стимулировать
продукцию активных форм кислорода и оксида азота в интактных
макрофагах. Фактором микробоцидности при взаимодействии макрофагов,
активированных липополисахаридом, со штаммами C. neoformans является
продукция фагоцитами оксида азота: сильновирулентные штаммы C.
neoformans, в отличие от слабовирулентных, обладают выраженной
способностью подавлять продукцию нитроксидных анионов (p<0,05).
4. Штаммы C. neoformans, независимо от степени вирулентности, не
индуцируют макрофаги к выработке провоспалительных цитокинов IL-1β,
IL-6, IL-12p70, TNF-α, а также IL-23 и TGF-β1. Сильновирулентные
штаммы, по сравнению со слабовирулентными, активнее повышают
продукцию IL-13, IL-10 и IL-17 макрофагами (p<0,05).
5. Протегрины
обладают
противогрибковой
активностью
in
vitro
по
отношению к штаммам C. neoformans как чувствительным, так и
устойчивым
взаимосвязана
к
флуконазолу.
со
Активность
способностью
антимикробных
штаммов
C.
пептидов
neoformans
к
меланинообразованию: более меланизированые клетки C. neoformans менее
чувствительны к действию суммарной фракции протегринов (r = – 0,92;
p<0,05).
109
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. При доклинических исследованиях новых противогрибковых средств in
vitro в отношении криптококков рекомендуется использовать штаммы C.
с
neoformans
разной
вирулентностью,
способностью
к
меланинообразованию и чувствительностью.
2. Доклинические исследования антифунгальных препаратов in vivo в
экспериментальных моделях целесообразно проводить с использованием
штаммов C. neoformans разной вирулентности.
3. При
доклиническом
изучении
новых
фармакологических
веществ,
способность макрофагов к фагоцитозу C. neoformans in vitro необходимо
оценивать с использованием клинических изолятов, обладающих разной
степенью вирулентности.
ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ
1. Разработка быстрых молекулярно-генетических методов определения
вирулентности штаммов C. neoformans.
2. Изучение потенциальных биомаркеров резистентности штаммов
C. neoformans.
3. Для разработки персонифицированной профилактики, диагностики и
лечения
криптококкоза
изучить
генетические
ассоциированные с заболеванием в группах риска.
детерминанты,
110
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1 Боровиков, В. П. STATISTICA: искусство анализа данных на компьютере для
профессионалов / В.П. Боровиков – Санкт-Петербург: Питер, 2001. – 656 с.
2 Боровиков, В.П. STATISTICA – Статистический анализ и обработка данных в
среде Windows / В.П. Боровиков, И.П. Боровиков – Москва: Филин, 1997. –
608 с.
3 Босак И.А. Сравнительная характеристика природных и клинических
изолятов Сryptococcus neoformans: автореф. дисс…канд. мед. наук: 03.00.24 /
Босак Илья Алексеевич – СПб., 2009. – 24 с.
4 Босак, И.А. Выделение и характеристика изолятов Cryptococcus neoformans
из окружающей среды г. Санкт-Петербурга / И.А. Босак // Проблемы
медицинской микологии – 2009. – Т.11, №3. – С. 43-46.
5 Васильева Н.В. Факторы патогенности Cryptococcus neoformans и их роль в
патогенезе криптококкоза: дисс…докт. биол. наук: 03.00.24 / Васильева
Наталья Всеволодовна – СПб, 2005. – 340 c.
6 ВИЧ-инфекция и центральная нервная система / под ред. Н.А.Белякова,
Т.Н.Трофимовой, В.В. Рассохина. Медицинский тематический архив. СПб:
Балтийский медицинский образовательный центр, 2013. – 122 с.
7 Елинов, Н.П. Прошлое и настоящее Cryptococcus neoformans (Sanfelice)
Vuillemin (1901) как объекта изучения потенциально грозного патогена для
человека / Н.П.Елинов, И.А. Босак // Проблемы медицинской микологии. –
2006. –Т.8, №4. – C.47-52.
8 Идентификация клинических изолятов Cryptococcus neoformans методом
MALDI-TOF MS / А.А.Ацапкина, И.А. Рябинин, Т.С. Богомолова [и др.] //
Проблемы медицинской микологии. − 2014. − Т.16, №2. − С.41.
9 Иммунология / Д. Мейл, Дж. Бростофф, Д.Б. Ройт [и др.] – Москва:
Логосфера, 2007. – 568 с.
111
10 Киселева, Е.П. Метод автоматизированного учета НСТ-теста / Е.П. Киселева,
А.В. Полевщиков // Клиническая лабораторная диагностика. – 1994. – №4. –
С.27-29.
11 Кокряков, В.Н. Очерки о врожденном иммунитете / В.Н. Кокряков. – СПб.:
Наука, 2006. – 261 c.
12 Микологическое исследование объектов окружающей среды и определение
противогрибкововой
активности
различных
веществ:
методические
рекомендации №2. – СПб. – 2008. – 16 с.
13 Определение видов возбудителей инвазивного кандидоза: в поиске быстрых
решений / Е.Р. Рауш, Н.В. Васильева, А.Г. Полищук [и др.] // Проблемы
медицинской микологии. – 2013. – Т.15, №4. – С. 87-91.
14 Определение чувствительности возбудителей инвазивного кандидоза к
флуконазолу и вориконазолу по международным стандартам / Е.Р. Рауш, И.В.
Выборнова, Е.В. Шагдилеева [и др.] // Проблемы медицинской микологии. –
2013. - Т.15, №1. – С. 60-63.
15 Реброва, О.В. Статистический анализ медицинских данных. Применение
пакета прикладных программ «Статистика» / О.В. Реброва – 3-е изд. –
Москва: Медиа Сфера, 2006. – 312 с.
16 Роль патогенных и условно-патогенных грибов в жизни человека: учебное
пособие, выпуск II. / А.Д. Юцковский, Н.В. Васильева, Л.М. Кулагина [и др.]
(под ред. Елинова Н.П.) // СПб.: Политехника-сервис, 2014. – 206 с.
17 Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в
биомедицинских исследованиях: учебное пособие для системы медицинского
и фармацевтического послевузовского образования / под ред.: Н. Н.
Каркищенко, С. В. Грачев. - М.: Профиль, 2010. - 358 с.
18 Трухачева, Н.В. Математическая статистика в медико-биологических
исследованиях с применением пакета STATISTICA / Н.В. Трухачева –
Москва: ГЭОТАР-Медиа, 2012. – 384 с.: ил.
19 Хаитов, Р.М. Иммунология: атлас / Р.М. Хаитов, А.А.Ярилин, Б.В. Пинегин –
М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 624 с.: ил.
112
20 A case of fluconazole, voriconazole-resistant Cryptococcus neoformans isolated
from an immunocompetent patient / N. Mandras, J Roana, V Tullio [et al.] // J
Chemother. –2011.–Vol. 23, № 6. – P. 379-380.
21 A chitin synthase and its regulator protein are critical for chitosan production and
growth of the fungal pathogen Cryptococcus neoformans / I.R. Banks, C.A. Specht,
M.J. Donlin [et al.] // Eukaryot. Cell. – 2005. – Vol. 4. – P. 1902-1912.
22 A differential effect of Cryptococcus neoformans on the production of IL-12p40
and IL-10 by murine macrophages stimulated with lipopolysaccharide and gamma
interferon / K. Kawakami, M.H. Qureshi, Y. Koguchi et al. // FEMS Microbiology
Letters. – 1999. – Vol.175. – P. 87-94.
23 A distinct role for interleukin-13 in Th2-cell-mediated immune responses / G.J.
McKenzie, A. Bancroft, R.K. Grencis [et al.] // Curr. Biol. – 1998. – Vol. 8. – P.
339-342.
24 A proteomic-based approach for the identification of immunodominant
Cryptococcus neoformans proteins / M. Young, S. Macias, D. Thomas [et al.] //
Proteomics. – 2009. – Vol. 9. – P. 2578-2588.
25 A rare genotype of Cryptococcus gattii caused the cryptococcosis outbreak on
Vancouver Island (British Columbia, Canada) / S.E. Kidd, F. Hagen, R.L. Tscharke
[et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2004. – Vol. 101. – P. 17258-17263.
26 A survey of heterobasidiomycetous yeasts for the presence of the genes
homologous to virulence factors of Filobasidiella neoformans, CNLAC1 and
CAP59 / R. Petter, B.S. Kang, T. Boekhout [et al.] // Microbiology. – 2001. – Vol.
147. – P. 2029-2036.
27 A yeast under cover: the capsule of Cryptococcus neoformans / I. Bose, A.J. Reese,
J.J. Cry [et al.] // Eukaryotic Cell. – 2003. –Vol. 2. – N 4. – P. 655-663.
28 Aguirre, K.M., Gibson G.W. Differing requirement for inducible nitric oxide
synthase activity in clearance of primary and secondary Cryptococcus neoformans
infection / K.M. Aguirre, G.W.Gibson // Med. Mycol. – 2000. – Vol. 38. – P. 343353.
113
29 Alanio, A. Dynamics of Cryptococcus neoformans - macrophage interactions
reveal that fungal background influences outcome during Cryptococcal
meningoencephalitis in humans [Electronic resource] / A. Alanio, M. DesnosOllivier, F. Dromera. – Mode of access: http: //mbio.asm.org/content/2/4/e0015811.
30 Alspaugh, J.A. Signal transduction pathways regulating differentiation and
pathogenicity of Cryptococcus neoformans / J.A. Alspaugh, J.R. Perfect, J.
Heitman // Fungal Genet. Biol. – 1998. – Vol. 25. – P. 1-14.
31 An innate immune system cell is a major determinant of species-related
susceptibility differences to fungal pneumonia / X. Shao, A. Mednick, M. Alvarez
[et al.] // J. Immunol. – 2005. – Vol. 175. – P. 3244-3251.
32 An integrated model of the recognition of Candida albicans by the innate immune
system / M.G. Netea, G.D. Brown, B.J. Kullberg [et al.] // Nat. Rev. Microbiol. –
2008. – Vol. 6, № 1. – P. 67-78.
33 Analysis of human monoclonal antibodies elicited by vaccination with a
Cryptococcus neoformans glucuronoxylomannan capsular polysaccharide vaccine
/L. Pirofski, R. Lui, M. DeShaw [et al.] // Infect. Immun. – 1995. – Vol. 63, № 8. –
P. 3005-3014.
34 Antibody interactions with the capsule of Cryptococcus neoformans / M.
Feldmesser, J. Rivera, Y. Kress [et al.] // Infect. Immun. – 2000. – Vol. 68, № 6. –
P. 3642-3650.
35 Anti-fungal activity of cathelicidins and their potential role in Candida albicans
skin infection / B. Lopez-Garcia, P.H. Lee, K. Yamasaki [et al.] // J. Investig.
Dermatol. – 2005. – Vol. 125. – P. 108-115.
36 Anti-inflammatory and immunomodulating properties of grape melanin. Inhibitory
effects on paw edema and adjuvant induced disease / N. Arramidis, A.
Kourounahis, L. Hadjipetrou [et al.] // Arzneimittelforschung. – 1998. – Vol. 48. –
P. 764-771.
114
37 App1: An antiphagocytic protein that binds to complement receptors 3 and 2 / P.
Stano, V. Williams, M. Villani [et al.] // Journal of Immunology. – 2009. – Vol.
182 – P. 84–91.
38 Arginase and polyamine synthesis are key factors in the regulation of experimental
leishmaniasis in vivo / P. Kropf, J.M. Fuentes, E. Fahnrich [et al.] // FASEB J. –
2005. – Vol. 19. – P. 1000-1002.
39 Atlas of clinical fungi: electronic version 3.1. [Electronic resource] / Hoog G.S. de,
Guarro J., Gene J. [et al.].- Utrecht, Reus, 2011. – (СD-ROM).
40 Baddley, J.W. Pulmonary cryptococcosis in patients without HIV infection: factors
associated with disseminated disease / J.W. Baddley, J.R. Perfect, R.A. Oster [et
al.] // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. – 2008. – Vol. 27, № 10. – P. 937-943.
41 Barluzzi, R. Establishment of protective immunity against cerebral cryptococcosis
by means of an avirulent non melanogenic Cryptococcus neoformans strain / R.
Barluzzi, A. Brozetti, G. Mariucci // J. Neuroimmunol. – 2000. – Vol. 109. – P. 7586.
42 Bartlett, K.H. The emergence of Cryptococcus gattii in British Columbia and the
Pacific Northwest / K.H. Bartlett, S.E. Kidd, J.W. Kronstad // Curr. Infect. Dis.
Rep. – 2008. – Vol. 10. – P. 58-65.
43 Bava, A.J. Cryptococcosis produced by a urease negative strain of Cryptococcus
neoformans / A.J. Bava, R. Negroni, M. Bianchi // J. Med. Vet. Mycol. – 1993. –
№ 31. – P. 87-89.
44 Blackstock, R. Role of interleukin-4 in resistance to Cryptococcus neoformans
infection / R. Blackstock, J.W. Murphy / R. Blackstock // Am. J. Respir. Cell Mol.
Biol. – 2004. – Vol. 30. – P.109-117.
45 Blander, J.M. On regulation of phagosome maturation and antigen presentation /
J.M. Blander, R. Medzhitov // Nat. Immunol. – 2006. – Vol. 7, №10. – P. 1029-35.
46 Blander, J.M. Toll-depended selection of microbal antigens for presentation by
dendritic cells / J.M. Blander, R. Medzhitov // Nature. – 2006. – Vol. 440. – P.
808-812.
115
47 Brown, A. Nitrosative and oxidative stress responses in fungal pathogenicity A/
Brown, K. Haynes, J. Quinn. // Curr Opin Microbiol. – 2009. – Vol. 12, №4. –
P.384-391.
48 Brown, G.D. Innate Antifungal Immunity: the key role of phagocytes / G.D. Brown
// Annu. Rev. Immunol. – 2011. – Vol. 29. – P. 1-21.
49 Bruker Daltonics MALDI-TOF biotyper operation procedure – OP for sample
preparation using formic acid extraction method. – 12/15/2010.
50 Buchanan, K.L. Regulation of cytokine production during the expression phase of
the anticryptococcal delayed-type hypersensitivity response / K.L. Buchanan, J.W.
Murphy // Infect. Immun. – 1994. – P.622930-622939.
51 Buchanan, K.L. Requirement for CD4+ T lymphocytes in host resistance against
Cryptococcus neoformans in the central nervous system of immunized mice / K.L.
Buchanan, H.A. Doyle // Infect. Immun. – 2000. – Vol. 68. – P. 456-462.
52 Buckland, K.F. Cytokines / K.F. Buckland, C.M. Hogaboam // Immunology of
fungal infection / G.D., Brown M.G. Netea (eds.) – Springer, 2007. – P. 201-234.
53 Byrnes, E.J. Cryptococcus gattii outbreak expands into the Northwestern United
States with fatal consequences / E.J. Byrnes, J. Heitman // F1000 Biol. Reports . –
2009c. – Vol.1. – pii: 62.
54 Campbell, G.D. Primary pulmonary cryptococcosis / G.D. Campbell // Am. Rev.
Respir. Dis. – 1966. – Vol. 94. – P. 236-243.
55 Capsular polysaccharide of Cryptococcus neoformans induces proinflammatory
cytokine release by human neutrophils / C. Retini, A. Vecchiarelli, C. Monari [et
al.] // Infect. Immun. – Vol. 64 – P. 2897-2903.
56 Capsular polysaccharides galactoxylomannan and glucuronoxylomannan from
Cryptococcus neoformans induce macrophage apoptosis mediated by Fas ligand /
S.N. Villena, R.O. Pinheiro, C.S. Pinheiro [et al.] // Cell. Microbiol. – 2008. – Vol.
10, № 6. – P. 1274-1285.
57 Capsule of Cryptococcus neoformans grows by enlargement of polysaccharide
molecules / S. Frases, B. Pontes, L. Nimrichter [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. – 2009. – Vol. 106, № 4. – P. 1228-1233.
116
58 Casadevall, A. Cryptococcus neoformans / A. Casadevall, J. Perfect // ASM Press.,
1998.
59 Casadevall, A. Melanin and virulence in Cryptococcus neoformans / A. Casadevall,
A.L. Rosas, J.D. Nosanchuk // Curr. Opin. Microbiol. – 2000. – Vol. 3. – P. 354358.
60 Casadevall, A. Virulence factors and their mechanisms of action: the view from a
damage-response framework: Review / Casadevall A., Pirofski L.A. // J. Water
Health. – 2009. – Vol. 7, Suppl. 1. – S2-S18.
61 Characterization of anticapsular monoclonal antibodies that regulate activation of
the complement system by the Cryptococcus neoformans capsule / T.R. Kozel,
B.C.H. DeJong, M.M. Grinsell [et al.] // Infect. Immun. – 1998. – Vol. 66, № 4. –
P. 1538-1546.
62 Chemical nature of an uronic acid-containing polysaccharide in the peritrophic
membrane of the silkworm / K. Nisizawa, T. Yamaguchi, N. Handa [et al.] // J.
Biochem. – 1963. – Vol.54. – P 419 - 426.
63 Chitin induces accumulation in tissue of innate immune cells associated with
allergy / T.A. Reese, H.E. Liang, A.M Tager [et al.] // Nature. – 2007. – Vol. 447.
– P. 92-96.
64 Chomarat, P. Interleukin-4 and interleukin-13: their similarities and discrepancies /
P. Chomarat, J. Banchereau // Int. Rev. Immunol. – 1998. – Vol. 17. – P. 1-52.
65 Chronological aging is associated with biophysical and chemical changes in the
capsule of Cryptococcus neoformans / R.J. Cordero, B. Pontes, A. J. Guimaraes [et
al.] // Infection and Immunity. – 2011. – Vol.79. – P. 4990–5000.
66 Clemons, K.V. Cytokine treatment of central nervous system infection: efficacy of
interleukin-12 alone and synergy with conventional antifungal therapy in
experimental cryptococcosis / K.V. Clemons, E. Brummer, D.A. Stevens //
Antimicrob. Agents Chemother. – 1994. – Vol. 38. – P. 460-464.
67 Clinical and Labjratory Standards Institute (CLSI). Reference method for
antifungal disk diffusion susceptibility testing of yeasts; approved guideline //
CLSI document M44-A. – 2004. – CLSI, Wayne, PA, USA.
117
68 Coelho, C. The Tools for Virulence of Cryptococcus neoformans / C. Coelho, A. L.
Bocca, A. Casadevall // Advances in Applied Microbiology. – 2014. –Vol. 87 –
P.1-41.
69 Collins, H.L. Cytokine enhancement of complement-dependent phagocytosis by
macrophages: synergy of tumor necrosis factor-alpha and granulocyte-macrophage
colony-stimulating factor for phagocytosis of Cryptococcus neoformans / H.L.
Collins, G. J. Bancroft // Eur. J. Immunol. – 1992. – Vol. 22. – P. 1447-1454.
70 Comparative analysis of pathogenicity of Cryptococcus neoformans serotypes A, D
and AD in murine cryptococcosis / F. Barchiesi, M. Cogliati, M.C. Esposto [et al.]
// J. Infect. – 2005. –Vol. 51, № 1. – P. 10-16.
71 Comparative gene genealogies indicate that two clonal lineages of Cryptococcus
gattii in British Columbia resemble strains from other geographical areas / S.E.
Kidd, H. Guo, K.H. Bartlett [et al.] // Eukaryot. Cell. – 2005. – Vol. 4, № 10. – P.
1629-1638.
72 Comparative hybridization reveals extensive genome variation in the AIDSassociated pathogen Cryptococcus neoformans / G. Hu, I. Liu, A. Sham [et al.] //
Genome Biol. – 2008. – Vol. 9, № 2. – P.41.
73 Consensus multi-locus sequence typing scheme for Cryptococcus neoformans and
Cryptococcus gattii / W. Meyer, D.M. Aanensen, T. Boekhout [et al.] // Medical
Mycology. – 2009. – Vol. 47. – P. 561-570.
74 Cross, C.E. Ingestion of acapsular Cryptococcus neoformans occurs via mannose
and β-glucan receptors, resulting in cytokine production and increased
phagocytosis of the encapsulated form / C.E. Cross, G.J. Bancroft // Infect. Immun.
– 1995. – Vol. 63, № 7. – P. 2604-2611.
75 Cryptococcal urease acts as a pulmonary virulence factor by shifting the balance of
the adaptive immune response from a protective T1 response towards a nonprotective T2 response / R. Surana, G. Montano, S. Arora [et al.] // Abstr. 6th
International Conference on Cryptococcus & Cryptococcosis. – Boston, 2005. – P.
147-148.
118
76 Cryptococcal urease promotes the accumulation of immature dendritic cells and a
non-protective T2 immune response within the lung / J.J. Osterholzer, R. Surana,
J.E. Milam, [et al.] // Am. J. Pathol. – 2009. – Vol. 174. – P. 932-943.
77 Cryptococcosis in human immunodeficiency virus-negative patients / S.
Kiertiburanakul, S. Wirojtananugoon, R. Pracharktam [et al.] // Int. J. Infect. Dis. –
2006. – Vol. 10, № 1. – P. 72-78.
78 Cryptococcosis in solid organ transplant recipients: current state of the science / N.
Singh, F. Dromer, J.R. Perfect [et al.] // Clin. Infect. Dis. – 2008. – Vol. 47. – P.
1321-1327.
79 Cryptococcuria as a manifestation of disseminated cryptococcosis and isolated
urinary tract infection / S. Kiertiburanakul, S. Sungkanuparph, B. Buabut [et al.] //
Jpn. J. Infect. Dis. – 2004. – Vol. 57, № 5. – P. 203-205.
80 Cryptococcus gattii dispersal mechanisms, British Columbia, Canada / S.E. Kidd,
P.J. Bach, A.O. Hingston [et al.] // Emerg. Infect. Dis. – 2007. – Vol. 13. – P. 5157.
81 Cryptococcus gattii induces a cytokine pattern that is distinct from other
cryptococcal species [Electronic resource]/ T. Schoffelen, M.-T.Illnait-Zaragozi,
L.A.B. Joosten [et al]. – Mode of access: http://www.plosone.org/article/info%3A
doi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0055579.
82 Cryptococcus neoformans induces macrophage inflammatory protein 1alpha (MIP1alpha) and MIP-1beta in human microglia: role of specific antibody and soluble
capsular polysaccharide / D. Goldman, X. Song, R. Kitai [et al.] // Infect. Immun. –
2001. – P. 691808-691815.
83 Cryptococcus neoformans inhibits nitric oxide production by murine peritoneal
macrophages stimulated with interferon-γ and lipopolysaccharide / K. Kawakami,
T. Zhang, M.H. Qureshi [et al.] // Cell. Immunol. – 1997. – Vol.180. – P. 47-54.
84 Cryptococcus neoformans strains and infection in apparently immunocompetent
patients, China / J. Chen, A. Varma, M.R. Diaz [et al.] // Emerg. Infect. Dis. –
2008. –Vol. 14, № 5. – P. 755-762.
119
85 Currie, B.P. Decreased fluconazole susceptibility of a relapse Cryptococcus
neoformans isolate after fluconazole treatment / B.P. Currie, M. Ghannoum, L.
Bessen [et al.] // Infect. Dis. Clin. Pract. – 1995. – Vol. 4. – P. 318-319.
86 Cytokine and chemokine expression in the central nervous system associated with
protective cell-mediated immunity against Cryptococcus neoformans / W.C.
Uicker, H.A. Doyle, J.P. McCracken [et al.] // Med. Mycol. – 2005. – Vol. 43. – P.
27-38.
87 Cytokine and inducible nitric oxide synthase mRNA expression during
experimental murine cryptococcal meningoencephalitis / C.M.L. Maffei, L.F.
Mirels, R.A. Sobel [et al.] // Infect. Immun. – 2004. – Vol. 72. – P. 2338-2349.
88 De Jesus, M. Spleen deposition of Cryptococcus neoformans capsular
glucuronoxylomannan in rodents occurs in red pulp macrophages and not marginal
zone macrophages expressing the C-type lectin SIGN-R1 / M. De Jesus, C.G. Park,
Y. Su // Med. Mycol. – 2008. – Vol.46, № 2. – P.153-162.
89 de Vries, J.E. Receptors and cytokines involved in allergic TH2 cell responses /
J.E. de Vries, J.M. Carballido, G. Aversa // J. Allergy Clin. Immunol. – 1999. –
Vol. 103. – P. S492–S496.
90 Deciphering the model pathogenic fungus Cryptococcus neoformans / A. Idnurm,
Y. S. Bahn, K. Nielsen [et al.] // Nat Rev Microbiol. – 2005. – Vol. 3, № 10. –
P.753-764.
91 Dectin-1 is not required for the host defense to Cryptococcus neoformans /
K.Nakamura, T. Kinjo, S. Sanjo [et al.] // Microbiol. Immunol. – 2007. – Vol. 51,
№ 11. – P. 1115-1119.
92 Del Poeta, M. Role of phagocytosis in the virulence of Cryptococcus neoformans /
M. Del Poeta // Eukaryotic cell. – 2004. – Vol. 3. – P. 1067-1075.
93 Designing antimicrobial peptides: form follows function / C.D. Fjell, J.A. Hiss,
R.E.W. Hancock [et al.] // Nat. Reviews. – 2012. − Vol.11. − P. 37-49.
94 Differences between IL-4R alpha-deficient and IL-4-deficient mice reveal a role
for IL-13 in the regulation of Th2 responses / M. Barner, M. Mohrs, F. Brombacher
[et al.] // Curr. Biol. – 1998. – Vol. 8. – P. 669-672.
120
95 Differences in outcome of the interaction between Cryptococcus neoformans
glucuronoxylomannan and human monocytes and neutrophils / Monari C., Retini
C., Casadevall A. [et al.] // Eur. J. Immunol. – 2003. – Vol. 33, № 4. – P. 10411051.
96 Differential regulation of immune responses by highly and weakly virulent
Cryptococcus neoformans isolates / R. Blackstock, K.L. Buchanan, A.M. Adesina
[et al.] // Infect Immun. – 1999. – Vol. 67. – P. 3601-3609.
97 Differential regulation of nitric oxide synthase-2 and arginase-1 by type 1/type 2
cytokines in vivo: granulomatous pathology is shaped by the pattern of L-arginine
metabolism / M. Hesse, M. Modolell, A.C. La Flamme [et al.] // J. Immunol. –
2001. – Vol. 167. – P. 6533-6544.
98 Differential use of CARD9 by dectin-1 in macrophages and dendritic cells / H.S.
Goodridge, T. Shimada, A.J. Wolf [et al.] // J. Immunol. – 2009. – Vol. 182. – P.
1146-1154.
99 Distinct patterns of dendritic cell cytokine release stimulated by fungal β-glucans
and Toll-like receptor agonists / H. Huang, G.R. Ostroff, C.K. Lee [et al.] // Infect.
Immun. – 2009. – Vol. 77, № 5. – P. 1774-1781.
100 Distinct roles for IL-4 and IL-10 in regulating T2 immunity during allergic
bronchopulmonary mycosis / Y. Hernandez, S. Arora, J.R. Erb-Downward [et al.]
// J. Immunol. – 2005. – Vol. 174. – P. 1027-1036.
101 Dong, Z.M. Cryptococcal polysaccharides bind to CD18 on human neutrophils /
Z.M. Dong, J.W. Murphy // Infect. Immun. – 1997. – Vol. 65. – P. 557-563.
102 Dong, Z.M. Effects of the two varieties of Cryptococcus neoformans cells and
culture filtrate antigens on neutrophil locomotion / Z.M. Dong, J.W. Murphy //
Infect. Immun. – 1995. – Vol. 63. – P. 2632-2644.
103 Down-regulation of the afferent phase of T cell-mediated pulmonary
inflammation and immunity by a high melanin-producing strain of Cryptococcus
neoformans / G.B. Huffnagle, G.H. Chen, J.L. Curtis [et al.] // J. Immunol. – 1995.
– Vol. 155. – P. 3507-3516.
121
104 Dual role for nitric oxide in paracoccidioidomycosis: essential for resistance, but
overproduction associated with susceptibility. / F.R.F. Nascimento, V.L.G. Calich,
D. Rodriguez [et al.] // J Immunol. – 2002. – Vol. 168. – P. 4593-4600.
105 Early cytokine production in pulmonary Cryptococcus neoformans infections
distinguishes susceptible and resistant mice / K.A. Hoag, N.E. Street, G.B.
Huffnagle [et al.] // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. – 1995. – Vol. 13. – P. 487-495.
106 Effects of melanin upon susceptibility of Cryptococcus to antifungals / R. Ikeda,
T. Sugita, E.S. Jacobson [et al.] // Microbiol. Immunol. – 2003. – Vol. 47. – P. 271277.
107 Effects of the capsular polysaccharides of Cryptococcus neoformans on
phagocyte migration and inflammatory mediators / P.M. Ellerbroek, A.M.
Walenkamp, A.I. Hoepelman [et al.] // Curr. Med. Chem. – 2004. – Vol. 11. – P.
253-266.
108 Efficacy of voriconazole in a murine model of cryptococcal central nervous
system infection / C. Serena, F.J. Pastor, M. Marine [et al.] // Jurnal of
antimicrobial chemotherapy. – 2007. – Vol. 60. – P. 162-165.
109 Elevated cerebrospinal fluid pressures in patients with cryptococcal meningitis
and acquired immunodeficiency syndrome / D.W. Denning, R.W. Armstrong, B.H.
Lewis [et al.] // Am. J. Med. – 1991. – Vol. 91. – P. 267-272.
110 Encapsulation of Cryptococcus neoformans regulates fungicidal activity and the
antigen presentation process in human alveolar macrophages / A.Vecchiarelli, D.
Pietrella, M. Dottorini [et al.] // Clin. Exp. Immunol. – 1994. – Vol. 98. – P.217223.
111 Encapsulation of Cryptococcus neoformans with glucuronoxylomannan inhibits
the antigen-presenting capacity of monocytes / C. Retini, A. Vecchiarelli, C.
Monari [et al.] // Infect Immun. – 1998. – Vol. 66, № 2. – P. 664-669.
112 Enhanced allergic inflammation and airway responsiveness in rats with chronic
Cryptococcus neoformans infection: potential role for fungal pulmonary infection
in the pathogenesis of asthma / D.L. Goldman, J. Davis, F. Bommarito [et al.] // J.
Infect. Dis. – 2006. – Vol. 193. – P. 1178-1186.
122
113 Enhanced innate immune responsiveness to pulmonary Cryptococcus neoformans
infection is associated with resistance to progressive infection / L. Guillot, S.F.
Carroll, R. Homer [et al.] // Infect. Immun. – 2008. – Vol. 76, № 10. – P. 47454756.
114 Epidemiology of opportunistic invasive fungal infections in China: review of
literature / L. Yong, C.Min, T.Hartmann [et al.] // Chin. Med. J. – 2013. – Vol. 126,
№2. – P.361-368
115 Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among
persons living with HIV/AIDS / B.J. Park, K.A. Wannemuehler, B.J. Marston [et
al.] // AIDS. – 2009. – Vol. 23. – P. 525-530.
116 Evans R.J. Macrophages in the immune response against Cryptococcus / R.J.
Evans, R.C. May // Human Fungal Pathogens. - 2nd edition The Mycota XII O.
Kurzai (ed.). – Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2014. – P. 97-108.
117 Expression of cytokines and inducible nitric oxide synthasemrna in the lungs of
mice infected with Cryptococcus neoformans: effects of interleukin-12 / K.
Kawakami, M. Tohyama, X. Qifeng [et al.] // Infect. Immun. – 1997. – P. 13071312.
118 Firacative, C. MALDI-TOF MS Enables the rapid identification of the major
molecular types within the Cryptococcus neoformans / C. gattii species complex
[Electronic resource] / C. Firacative, L. Trilles, W. Meyer. – Mode of access:
http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0037566
119 First reported case of Cryptococcus gattii in the Southeastern USA: Implications
for travel-associated acquisition of an emerging pathogen / E.J. Byrnes 3rd, W. Li,
Y. Lewit [et al.] // PLoS ONE. – 2009b. – Vol. 4. – e 5851.
120 Fonseca, А. Cryptococcus Vuillemin (1901) / A. Fonseca, T. Boekhout, J.W. Fell
// The yeasts: a taxonomic study / Kurtzman C.P., Fell J.W., Boekhout T. (eds.) –
Elsevier Science & Technology, Amsterdam, 2011. – Р.1665-1741.
121 Fungal strategies for overcoming host innate immune response / L. Chai, M.
Netea, A. Vonk [et al.] // Medical mycology. – 2009. – Vol. 7. – P. 227-236.
123
122 Fungicidal activity of five cathelicidin peptides against clinically isolated yeasts /
M. Benincasa, M. Scocchi, S. Pacor [et al.] // J. Antimicrob. Chemother. – 2006. –
Vol. 58. – P. 950-959.
123 Fungicidal properties of defensin NP-1 and activity against Cryptococcus
neoformans in vitro / M.S. Alcouloumre, M.A. Ghannoum, A.S. Ibrahim [et al.] //
Antimicrobial agents and chemotherapy. – 1993. – Vol. 37, № 12. – P.2628-2632.
124 Gancedo, C. The importance of a functional trehalose biosynthetic pathway for
the life of yeasts and fungi / C. Gancedo, C.L. Flores // FEMS Yeast Res. – 2004. –
Vol. 4. – P. 351-359.
125 Gantner, B.N. Dectin-1 mediates macrophage recognition of Candida albicans
yeast but not filaments / B.N. Gantner, R.M. Simmons, D.M. Underhill // EMBO J.
– 2005. – Vol. 24. – P. 1277-1286.
126 Gene expression analysis shows a role for the capsule of Cryptococcus
neoformans in preventing dendritic cell activation / P. Lupo, Y.C. Chang, B.
Kelsall [et al.]
// Abstr. 6th International Conference on Cryptococcus &
Cryptococcosis, June 24-28, 2005, Boston, USA. – P. 142.
127 Goldman, D. Pathogenesis of pulmonary Cryptococcus neoformans infection in
the rat / D. Goldman, S.C. Lee, A. Casadevall // Infect. Immun. – 1994. – P.
624755-624761.
128 Gordon, S. Alternative activation of macrophages / S. Gordon // Nat. Rev.
Immunol. – 2003. – Vol. 3. – P. 23-35.
129 Guerrero, A. Phenotypic switching in Cryptococcus neoformans contributes to
virulence by changing the immunological host response / A. Guerrero, B.C. Fries //
Infect Immun. – 2008. – Vol. 76, № 9. – P. 4322-4331.
130 Hardison, S.E. Receptor-ligand interactions / S.E. Hardison, G.D. Brown //
Fungal infections. Human Fungal Pathogens. 2nd ed. The Mycota XII / O. Kurzai
(ed.). – Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 2014. – P.77-96.
131 Heat killed cells of Cryptococcus neoformans var. grubii induces protective
immunity in rats: immunological and histopathological parameters / J.L. Baronetti,
L.S. Chiapello, M.P. Aoki [et al.] // Med. Mycol. – 2006. – Vol. 44. – P. 493-504.
124
132 Heitman, J. Cryptococcus from human to model yeast / Heitman J. [et al.] –
Washington: ASM Press, 2011. – 620 p.
133 Hidden Killers: Human Fungal [Electronic resource] / G.D. Brown, D.W.
Denning, N.A.R.Gow [et al.]. – Mode of access: http://stm.sciencemag.org /content
/4/165/165rv13.full.html.
134 Hogan, L.H. Virulence factors of medically important fungi / L.H. Hogan, B.S.
Klein, S.M. Levitz // Clin. Microbiol. Rev. –1996. – Vol. 9, № 4. – P. 469-488.
135 Hull, C.M. Genetics of Cryptococcus neoformans / C.M. Hull, J. Heitman //
Annu. Rev. Genet. – 2002. – Vol. 36. – P. 557-615.
136 Hybrid genotypes in the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans / T.
Boekhout, B. Theelen, M. Diaz [et al.] // Microbiology. – 2001. – Vol. 147. – P.
891-907.
137 Identification of App1 as a regulator of phagocytosis and virulence of
Cryptococcus neoformans. / C. Luberto, B. Martinez-Marino, D. Taraskiewicz [et
al.] // J. Clin. Investig. – 2003. – Vol.112 – P.1080–1094.
138 Ikeda, T. Deactivation of macrophage oxidative burstin vitro by different strains
of Histoplasma capsulatum / T. Ikeda, J.R. Little // Mycopathologia. – 1996. – Vol.
132. – P. 133-141.
139 IL-12 and IFN-γ are required for initiating the protective Th1 response to
pulmonary cryptococcosis in resistant C.B-17 mice / K.A. Hoag, M.F. Lipscomb,
A.A. Izzo [et al.] // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. – 1997. – Vol. 17. – P. 733-739.
140 IL-12 protects mice against pulmonary and disseminated infection caused by
Cryptococcus neoformans / K. Kawakami, M. Tohyama, Q. Xie [et al.] // Clin.
Exp. Immunol. – 1996. – Vol. 104. – P. 208-214.
141 IL-13 induces disease-promoting type 2 cytokines, alternatively activated
macrophages and allergic inflammation during pulmonary infection of mice with
Cryptococcus neoformans / U. Muller, W. Stenzel, G. Kohler [et al.] // J. Immunol.
– 2007 – Vol. 179. – P. 5367-5377.
142 IL-17 and Th17 Cells / T. Korn, E. Bettelli, M. Oukka [et al.] // Annu. Rev.
Immunol. – 2009. – Vol. 27. – P. 485-517.
125
143 IL-17 and therapeutic kynurenines in pathogenic inflammation to fungi / L.
Romani, T. Zelante, A. De Luca [et al.] // J. Immunol. – 2008. – Vol. 180. – P.
5157-5162.
144 IL-17 producing gamma-delta T cells are required for a controlled inflammatory
response after bleomycin-induced lung injury / R.K. Braun, C. Ferrick, P.
Neubauer [et al.] // Inflammation. – 2008. – Vol. 31. – P. 167-179.
145 IL-17 Stimulates Intraperitoneal Neutrophil Infiltration Through the Release of
GRO{alpha} Chemokine from Mesothelial Cells / J. Witowski, K. Pawlaczyk, A.
Breborowicz [et al.] // J. Immunol. – 2000. – Vol. 165. – P. 5814-5821.
146 IL-17A inhibits the expansion of IL-17A-producing T cells in mice through
“short-loop” inhibition via IL-17 receptor / E. Smith, M.A. Stark, A. Zarbock [et
al.] // J. Immunol. – 2008. – Vol. 181. – P. 1357-1364.
147 IL-17-producing alveolar macrophages mediate allergic lung inflammation
related to asthma / C. Song, L. Luo, Z. Lei [et al.] // J. Immunol. – 2008. – Vol.
181. – P. 6117-6124.
148 IL-17-producing T cells in lung immunity and inflammation / Nembrini C.,
Marsland B.J. [et al.] // J. Allergy Clin. Immunol. – 2009. – Vol. 123. – P. 986-994.
149 IL-23 and the Th17 pathway promote inflammation and impair antifungal
immune resistance / T. Zelante, A. De Luca, P. Bonifazi [et al.] // Eur. J. Immunol.
– 2007. – Vol. 37. – P. 2695-2706.
150 IL-23 enhances the inflammatory cell response in Cryptococcus neoformans
infection and induces a cytokine pattern distinct from IL-12 / M.A. Kleinschek, U.
Muller, S.J. Brodie [et al.] // J. Immunol. – 2006. – Vol. 176. – P. 1098-1106.
151 Immune recognition of Candida albicans beta-glucan by dectin-1 / N.A. Gow,
M.G. Netea, C.A. Munro [et al.] // J. Infect. Dis. – 2007. – Vol. 196. – P. 15651571.
152 Immune sensing of Candida albicans requires cooperative recognition of
mannans and glucans by lectin and Toll-like receptors / Netea M.G., Gow N.A.,
Munro C.A. [et al.] // J. Clin. Invest. – 2006. – Vol. 116. – P. 1642-1650.
126
153 Immunology of infections with Cryptococcus neoformans. Chapter 17 / P.
Ellerbroek., A. Vecchiarelli, A. Hoepelman [et al.] // Immunology of fungal
infection / Brown G.D., Netea M.G. (eds). – Springer, 2007. – P. 383-407.
154 Impact of mating type, serotype, and ploidy on virulence of Cryptococcus
neoformans / Lin X., Nielsen K., Patel S. [et al.] // Infect. Immun. – 2008. – Vol.
76, № 7. – P. 2923-2938.
155 Impairment of alternative macrophage activation delays cutaneous leishmaniasis
in nonhealing BALB/c mice / C. Holscher, B. Arendse, A. Schwegmann [et al.] //
J. Immunol. – 2006. – Vol. 176. – P. 1115-1121.
156 Increasing in vitro resistance to fluconazole in Cryptococcus neoformans
Cambodian isolates: April 2000 to March 2002 / B. Sar, D. Monchy, M. Vann [et
al.] // J. Antimicrob. Chemother. – 2004. – Vol. 54. – P. 563-565.
157 Inheritance of immune polarization patterns is linked to resistance versus
susceptibility to Cryptococcus neoformans in a mouse model / G.H. Chen, D.A.
McNamara, Y. Hernandez [et al.] // Infect. Immun. – 2008. – Vol. 76. – P. 23792391.
158 Insights into the mechanisms of protective immunity against Cryptococcus
neoformans infection using a mouse model of pulmonary cryptococcosis
[Electronic resource] / K.L. Wozniak, S. Ravi, S. Macias [et al.]. – Mode of access:
http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0006854
159 Interaction between Cryptococcus neoformans and alveolar macrophages / N.T.
Gross, K. Nessa, P. Camner [et al.] // J. Med.Vet. Mycol. – 1997. – Vol. 35. – P.
263-269.
160 Interdependency of interleukin-10 and interleukin-12 in regulation of T-cell
differentiation and effector function of monocytes in response to stimulation with
Cryptococcus neoformans / C. Retini, T.R. Kozel, D. Pietrella [et al.] // Infect.
Immun. – 2001. – Vol. 69. – P. 6064-6073.
161 Interleukin-17 and lung host defense against Klebsiella pneumoniae infection / P.
Ye, P.B. Garvey, P. Zhang [et al.] // Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. – 2001. – Vol.
25. – P. 335-340.
127
162 Interleukin-23 (IL-23)-IL-17 cytokine axis in murine Pneumocystis carinii
infection / X.L. Rudner, K.I. Happel, E.A. Young [et al.] // Infect. Immun. – 2007.
– Vol. 75. – P. 3055-3061.
163 Interleukin-4 weakens host resistance to pulmonary and disseminated
cryptococcal infection caused by combined treatment with interferon-γ-inducing
cytokines / K. Kawakami, M.H. Qureshi, T. Zhang [et al.] // Cell. Immunol. –
1999. – Vol. 197. – P. 55-61.
164 Involvement of CD14, Toll-Like Receptors 2 and 4, and MyD88 in the Host
Response to the Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans in vivo / LE. Yauch,
M.K. Mansour, S. Shoham [et al.] // Infect. Immun. – 2004. – Vol. 72, №. 9. –
5373-5382.
165 Johnston, S.A., Cryptococcus interactions with macrophages: evasion and
manipulation of the phagosome by a fungal pathogen / S. A. Johnston, R. C. May //
Cell. Microbiol. – 2013. – Vol.15, №3. – P. 403 - 411.
166 Kavanaugh, L.A. Recent evolution of the human pathogen Cryptococcus
neoformans by intervarietal transfer of a 14-gene fragment / L.A. Kavanaugh, J.A.
Fraser, F.S. Dietrich // Mol. Biol. Evol. – 2006. – Vol. 23, № 10. – P. 1879-1890.
167 Khawcharoenporn, T. Non-neoformans cryptococcal infections: a systematic
review / T. Khawcharoenporn, A. Apisarnthanarak, L.M. Mundy // Infection. –
2007. – Vol. 35. – P. 51-58.
168 Kish, D.D. CD8 T cells producing IL-17 and IFN-gamma initiate the innate
immune response required for responses to antigen skin challenge / D.D. Kish, X.
Li, R.L. Fairchild // J. Immunol. – 2009. – Vol. 182. – P. 5949-5959.
169 Kozel, T. R. Dissociation of a hydrophobic surface fromphagocytosis of
encapsulated and non-encapsulated Cryptococcus neoformans / T. R. Kozel //
Infect. Immun. – 1983. – Vol. 39. – P. 1214-1219.
170 Kozel, T. R. The capsule of Cryptococcus neoformans passively inhibits
phagocytosis of the yeast by macrophages / T. R. Kozel, E. C. Gotschlich // J.
Immunol. – 1982. – Vol. 129. – P. 1675-1680.
128
171 Kozel, T.R. Kinetic analysis of the amplification phase for activation and binding
of C3 to encapsulated and nonencapsulated Cryptococcus neoformans / T.R. Kozel,
M.A. Wilson, W.H. Welch // Infect. Immun. – 1992. – Vol. 60, №8. – P. 3122-7.
172 Kurtzman, C. The yeasts, a taxonomic study / C. Kurtzman, J.W. Fell, T.
Boekhout (eds). – Elsevier, 2011. – 2354 p.
173 Kwon-Chung K.J. Genetic association of mating types and virulence in
Cryptococcus neoformans / K.J. Kwon-Chung, J.C. Edman, B.L.Wickes // Infect.
Immun. – 1992. – № 60. – P. 602-605.
174 Kwon-Chung K.J., Boekhout T., Fell J.W., Diaz M. Proposal to conserve the
name Cryptococcus gattii against C. hondurianus and C. bacillisporus
(Basidiomycota, Hymenomycetes, Tremellomycetidae) // Taxon. – 2002. – Vol.
51, № 4. – P. 804-806.
175 Leibund Gut-Landmann S. Immunity to fungi / S. Leibund Gut-Landmann, M.
Wüthrich, T.M. Hohl // Curr. Opin. Immunol. – 2012. – Vol. 24, №4. – P. 449-58.
176 Lengeler, K. B. Serotype AD strains of Cryptococcus neoformans are diploid or
aneuploid and are heterozygous at the mating-type locus / K. B. Lengeler, G. M.
Cox, J. Heitman // Infect. Immun. – 2001. – Vol. 69, № 1. – P. 115-122.
177 Levitz, S. M. Cryptococcus: the once-sleeping giant is fully awake / S. M. Levitz,
T. Boekhout // FEMS Yeast Res. – 2006. – Vol. 6, № 4. – P. 461-462.
178 Levitz, S.M. Killing of Aspergillus fumigatus spores and Candida albicans yeast
phase by the iron-hydrogen peroxide-iodide cytotoxic system: comparison with the
myeloperoxidase-hydrogen peroxide-halide system / S.M. Levitz, R.D. Diamond //
Infect. Immun. – 1984. – Vol. 43. – P. 1100-1102.
179 Levitz, S.M. The molecular basis for the immunogenicity of Cryptococcus
neoformans mannoproteins / S.M. Levitz, C.A. Specht // FEMS Yeast Res. – 2006.
– Vol. 6, № 4. – P. 513-524.
180 Li, S.S. Cryptococcus / S.S. Li, C.H. Mody // Proc. Am. Thorac. Soc. – 2010. –
Vol. 7, №3. – P.186-196.
181 Lin, X. The biology of the Cryptococcus neoformans species complex / X. Lin, J.
Heitman // Annu. Rev. Microbiol. – 2006. – Vol. 60. – P. 69-105.
129
182 Linden, A. Neutrophils, interleukin-17A and lung disease / A. Linden, M. Laan,
G.P. Anderson // Eur. Respir.J. – 2005. – Vol. 25. – P. 159-172.
183 Lutsar, I. Voriconazole concentrations in the cerebrospinal fluid and brain tissue
of guinea pigs and immunocompromised patients / I. Lutsar, S. Roffey, P. Troke //
Clin. Infect. Dis. – 2003. – Vol. 37. – P. 728-732.
184 NADPH oxidase of human dendritic cells: role in Candida albicans killing and
regulation by interferons, dectin-1 and CD206 / M. Donini, E. Zenaro, N. Tamassia
[et al.] // Eur. J. Immunol. – 2007. – Vol. 37. – P. 1194-1203.
185 Ma, H. Virulence in Cryptococcus species / Ma H., May R.C. // Advances in
Applied Microbiology. – 2009. – Vol.67. – P.131-190.
186 Macrophage-Cryptococcus Interactions: An Update / M.K. Mansour, J.L. Reedy,
J.M. Tam [et al.] // Curr. Fungal. Infect. Rep. – 2014. – Vol. 8. – P. 109-115.
187 MALDI Biotyper 3.1. User manual revision 1. Bruker Daltonics. – Bremen. –
2012. – 212 p.
188 Mansour, M.K. Interactions of fungi with phagocytes / Mansour M.K., Levitz
S.M. // Current Opinion in Microbiology. – 2002. – Vol. 5. – P. 359-365.
189 Many globally isolated AD hybrid strains of Cryptococcus neoformans originated
in Africa / A. P. Litvintseva, X. Lin, I. Templeton [et al.] // PLoS Pathog. – 2007. –
Vol. 3, № 8. – e 114.
190 Martinez, L.R. Cryptococcus neoformans cells in biofilms are less susceptible
than planktonic cells to antimicrobial molecules produced by the innate immune
system / L.R. Martinez, A. Casadevall // Infect. Immun. – 2006. – Vol. 74. – P.
6118-6123.
191 Martinez, L.R. Cryptococcus neoformans var. neoformans (serotype D) strains
are more susceptible to heat than C. neoformans var. grubii (serotype A) strains /
L.R. Martinez, J. Garcia-Rivera, A. Casadevall // J. Clin. Microbiol. – 2001. – Vol.
39, № 9. – P. 3365-3367.
192 Matrix-assisted laser desorption ionization – time of flight mass spectrometrybased method for discrimination between molecular types of Cryptococcus
130
neoformans and Cryptococcus gattii / Posteraro B.,Vella A., Cogliati M. [et al.] //
J. Clin. Microbiol. 2012. - Vol. 50, N. 7. –P. 2472 - 2476.
193 McFadden, D.C. The physical properties of the capsular polysaccharides from
Cryptococcus neoformans suggest features for capsule construction / D.C.
McFadden, M. De Jesus, A. Casadevall // J. Biol. Chem. – 2006. – Vol. 281, № 4.
– P. 1868-1875.
194 McGinness, J. Amorphous semiconductor switching in melanins / J. McGinness,
P. Corry, P. Proctor // Science. – 1974. – Vol. 183. – P.853-855.
195 McKenzie, A.N. Interleukin-13: characterization and biologic properties / A.N.
McKenzie, G. Zurawski // Cancer Treat. Res. – 1995. – Vol. 80. – P. 367-378.
196 Medzhitov R. The innate immune system / Medzhitov R. // Fundamental
immunology. –Lippincott Wiliams&Wilkins, 2008. – P. 428-450.
197 Melanin as a potential cryptococcal defence against microbicidal proteins / T.L.
Doering, J.D. Nosanchuk, W.K. Roberts [et al.] // Medical Mycology. – 1999. –
Vol. 37 – P.175-181.
198 Menter, J.M. Electron transfer and photoprotective properties of melanins in
solution / J.M. Menter, I. Willis // Pigment. Cell. Res. – 1997. – Vol. 10. – P. 214217.
199 Migliorini, P. Macrophage NO2 production as a sensitive and rapid assay for the
quantation of murine IFN-γ / P. Migliorini, G. Corradin, S.B. Corradin // J.
immunol. met. – 1991. – Vol. 139. – P. 107-114.
200 Mills, K.H. Induction, function and regulation of IL-17-producing T cells / K.H.
Mills // Eur. J. Immunol. – 2008. – Vol. 38. – P. 2636-2649.
201 Missall, T.A. Mechanisms of resistance to oxidative and nitrosative stress:
implications for fungal survival in mammalian hosts / T.A.Missall, J.K. Lodge, J.E.
McEwen //Eukaryotic Cell. – 2004. – Vol. 3, №4. – P. 835-846.
202 Mitchell, T.G. Cryptococcosis in the era of AIDS: 100 years after the discovery
of Cryptococcus neoformans / T.G. Mitchell, J.R. Perfect // Clin. Microbiol. Rev. –
1995. – Vol. 8. – P. 515-548.
131
203 Molecular evidence that the range of the Vancouver Island outbreak of
Cryptococcus gattii infection has expanded into the Pacific Northwest in the
United States / E.J. Byrnes 3rd, R.J. Bildfell, S.A. Frank [et al.] // J. Infect. Dis. –
2009a. – Vol. 199. – P. 1081-1086.
204 Monari, C. Glucuronoxylomannan exhibits potent immunosuppressive properties
/ C. Monari, F. Bistoni, A. Vecchiarelli // FEMS Yeast Res. – 2006. – Vol. 6, № 4.
– P. 537-542.
205 Multilocus sequence typing reveals three genetic subpopulations of Cryptococcus
neoformans var. grubii (serotype A), including a unique population in Botswana /
A.P. Litvintseva, R. Thakur, R. Vilgalys [et al.] // Genetics. – 2006. – Vol. 172. –
P. 2223-2238.
206 Naslund, P.K. Cryptococcus neoformans fails to induce nitric oxide synthase in
primed murine macrophage-like cells / P.K. Naslund, W.C. Miller, D.L. Granger //
Infect. Immun. – 1995. – Vol. 63. – P. 1298-1304.
207 Nicola, A.M. Fungal killing by mammalian phagocytic cells / A.M. Nicola, A.
Casadevall, D.L. Goldman // Curr. Opin. Microbiol. – 2008. – Vol. 11. – P. 313317.
208 Opsonic Requirements for Dendritic Cell-Mediated Responses to Cryptococcus
neoformans / R.M. Kelly, J. Chen, L.E. Yauch [et al.] // Infect. Immun. – 2005. –
Vol. 73, №1. – P. 592-598.
209 Organ-dependent variation of capsule thickness in Cryptococcus neoformans
during experimental murine infection / J. Rivera, M. Feldmesser, M. Cammer [et
al.] // Infect. Immun. – 1998. – Vol. 66. – P. 5027-5030.
210 Peck, A. Precarious balance: Th17 cells in host defense / A. Peck, E.D. Mellins //
Infect. Immun. – 2010. – Vol. 78. – P. 32-38.
211 Perfect, J.R. Clinical practice guidelines for the management of cryptococcal
disease: 2010 update by the Infectious Diseases Society of America / J.R. Perfect,
W.E. Dismukes, F. Dromer [et al.] // Clin. Infect. Dis. – 2010. – Vol. 50, №3 – P.
291-322.
132
212 Pfaller, М.А. Drug resistance in Cryptococcus epidemiology and molecular
mechanisms / М.А. Pfaller, J.K. Lodge, M.A. Ghannoum // CRYPTOCOCCUS
from human pathogen to model yeast / J.Heitman, T.R.Kozel, K.J.Kwon-Chung,
J.R.Perfect, A.Casadevall (eds). – ASM Press, Washington DC, 2011. – P.203-216.
213 Phagocytic efficacy of macrophage-like cells as a function of cell cycle and
Fcgamma receptors (FcgammaR) and complement receptor (CR)3 expression / Y.
Luo, E. Cook, B.C. Fries [et al.] // Clin. Exp. Immunol. – 2006. – Vol. 145. – P.
380-387.
214 Phagocytosis and growth inhibition of Cryptococcus neoformans by human
alveolar macrophages: effects of HIV-1 infection / C.C. Reardon, S.J. Kim, R.P.
Wagner [et al.] // AIDS. – 1996. – Vol. 10. – P. 613-618.
215 Plonka, P.M. Melanin synthesis in microorganisms –biotechnological and
medical aspects / P.M. Plonka, M. Grabacka // ABP. – 2006. – Vol. 53, № 3. – P.
429-443.
216 Polacheck, I. The discovery of melanin production in Cryptococcus neoformans
and its impact on diagnosis and the study of virulence / I. Polacheck // Zentralbl.
Bakteriol. – 1991. – Vol. 276. – P. 120-123.
217 Polarization optical analysis of the surface structures of various fungi / W. Gahrs,
Z. Ti gyi, L. Emody [et al.] // Acta Histochem. – 2009. – Vol. 111, № 4. – P. 308315.
218 Postsecretory processing generates multiple cathelicidins for enhanced topical
antimicrobial defense / M. Murakami, B. Lopez-Garcia, M. Braff [et al.] // J.
Immunol. – 2004. – Vol. 172. – P. 3070-3077.
219 Price, M.S. Host defenses against cryptococcosis / M.S. Price, J.R. Perfect //
Immunol. Invest. – 2011. – Vol. 40, №7-8. – P. 786-808.
220 Primary dendritic cells phagocytose Cryptococcus neoformans via mannose
receptors and Fc-gamma receptor II for presentation to T lymphocytes / R.M.
Syme, J.C. Spurrell, E.K. Amankwah [et al.] // Infect. Immun. – 2002. – Vol. 70. –
P. 5972-5981.
133
221 Production of nitric oxide by rat alveolar macrophages stimulated by
Cryptococcus neoformans or Aspergillus fumigatus / N.T. Gross, K. Nessa, P.
Camner [et al.] // Med. Mycol. – 1999. – Vol. 37. – P. 151-157.
222 Protection Against Cryptococcosis using a Murine Interferon-gamma Producing
Cryptococcus neoformans Strain / F.L. Jr Wormley, J.R. Perfect, C. Steele [et al.] //
Infect. Immun. – 2007. – Vol. 75. – P. 1453-1462.
223 Protegrins: leukocyte antimicrobial peptides that combine features of corticostatic
defensins and tachyplesins / V.N. Kokryakov, S.S. Harvig, E.A Panyutich [et al.] //
FEBS Lett. – 1993. – Vol. 327, № 2. – P. 231-326.
224 Pulmonary cryptococcosis in nonimmunocompromised patients / H.F. Nadrous,
V.S. Antonios, C.L. Terrell [et al.] // Chest. – 2003. – Vol. 124. – P. 2143-2147.
225 Pulmonary infection with an interferon-producing Cryptococcus neoformans
strain results in classical macrophage activation and protection / S.E. Hardison, S.
Ravi, K.L. Wozniak [et al.] // The american journal of pathology. – 2010. – Vol.
176, № 2. – P. 774-785.
226 Radial mass density, charge and epitope distribution in the Cryptococcus
neoformans capsule / M.E. Maxson, E. Dadachova, A. Casadevall [et al.] //
Eukaryot. Cell. – 2007. – Vol. 6, № 1. – P.95-109.
227 Ramirez-Ortiz, Z.G. The role of dendritic cells in the innate recognition of
pathogenic fungi (A. fumigatus, C. neoformans and C. albicans) / Z.G. RamirezOrtiz, T.K. Means // Virulence. – 2012. - Vol.3, №7. – P.635-646.
228 Rapid identification of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii by
matrix-assisted laser desorption ionization – time of flight mass spectrometry / L.R.
McTaggart, E. Lei, S.E. Richardson [et al.] // J. Clin. Microbiol. 2011. - Vol. 49, N.
8. - pp. 3050 – 3053.
229 Reaction of superoxide anions with melanins: electron spin resonance and spin
trapping studies / W. Korytowski, B. Kalyanamaran, I.A. Menon [et al.] //
Biochim. Biophys. Acta. – 1986. – Vol. 882. – P. 145-153.
230 Regulation of cryptococcal capsular polysaccharide by iron / S.E. Vartivarian,
E.J. Anaissie, R.E. Cowart [et al.] // J. Infect. Dis. – 1993. – Vol. 167. – P. 186-190.
134
231 Reid, D.M. Pattern recognition: recent insights from Dectin-1 / D.M. Reid, N.A.
Gow, G.D. Brown // Curr Opin Immunol. 2009. – Vol.21, №1. – P.30-37.
232 Relative contributions of myeloperoxidase and NADPH-oxidase to the early host
defense against pulmonary infections with Candida albicans and Aspergillus
fumigatus / Y. Aratani, F. Kura, H. Watanabe [et al.] // Med. Mycol. – 2002. – Vol.
40. – P. 557-563.
233 Requirement of interleukin-17A for systemic anti-Candida albicans host defense
in mice / W. Huang, L. Na, P.L. Fidel [et al.] // J. Infect. Dis. – 2004. – Vol. 190. –
P.624-631.
234 Role
of
extracellular
phospholipases
and
mononuclear
phagocytes
in
dissemination of cryptococcosis in a murine model / R. Santangelo, H. Zoellner, Т.
Sorrell [et al.] // Infect. Immun. – 2004. – № 72. – P. 2229-2239.
235 Role of IFN-γ in regulating T2 immunity and the development of alternatively
activated macrophages during allergic bronchopulmonary mycosis / S. Arora, Y.
Hernandez, J.R. Erb-Downward [et al.] // J. Immunol. – 2005. – Vol. 174. – P.
6346-6356.
236 Role of mannoprotein in induction and regulation of immunity to Cryptococcus
neoformans / D. Pietrella, R. Cherniak, C. Strappini [et al.] // Infect. immun. –
2001. –Vol. 69, №5. – P. 2808-2814.
237 Role of the mannose receptor in a murine model of Cryptococcus neoformans
infection / J.M. Dan, R.M. Kelly, C.K. Lee [et al.] // Infect. Immun. – 2008. – Vol.
6. – P. 2362-2367.
238 Role of TNF-alpha in the induction of fungicidal activity of mouse peritoneal
exudate cells against Cryptococcus neoformans by IL-12 and IL-18 / K.
Kawakami, M.H. Qureshi, Y. Koguchi [et al.] // Cell. Immunol. – 1999. – Vol.
193. – P. 9-16.
239 Role of tumor necrosis factor and gamma interferon in acquired resistance to
Cryptococcus neoformans in the central nervous system of mice / K. Aguirre, E.A.
Havell, G.W.Gibson [et al.] // Infect. Immun. – 1995. – Vol. 63. – P. 1725-1731.
135
240 Roles for inositol-phosphorylceramide synthase 1 (IPC1) in pathogenesis of C.
neoformans / C. Luberto, D. L. Toffaletti, E. A. Wills [et al.] // Genes Dev. –2001.
– Vol.15 – P.201–212.
241 Romani, L. Immunity to fungal infections / L. Romani // Nat. Rev. Immunol. –
2011. –Vol. 11. – P. 275-288.
242 Rosas, A.L. Melanization affects susceptibility of Cryptococcus neoformans to
heat and cold / A.L. Rosas, A. Casadevall // FEMS Microbiol. Lett. – 2003. – Vol.
153. – P. 265-272.
243 Ruane, P.J. Disseminated infection caused by urease-negative Cryptococcus
neoformans / P.J. Ruane, L.J. Walker, W.L. George // J. Clin. Microbiol. – 1988. –
№ 26. – P. 2224-2225.
244 Shoham, S. The immune response to fungal infections / Shoham S., Levitz S.M. //
Br. J. Haematol. – 2005. – Vol. 129. – P. 569-582.
245 Signaling via interleukin-4 receptor alfa-chain is required for successful
vaccination against schistosomiasis in BALB/c mice / A.P. Mountford, K.G. Hogg,
P.S. Coulson [et al.] // Infect. Immun. – 2001. – Vol. 69. – P. 228-236.
246 Six monophyletic lineages identified within Cryptococcus neoformans and
Cryptococcus gattii by multi-locus sequence typing / M. Bovers, F. Hagen, E.E.
Kuramae [et al.] // Fungal Genet. Biol. – 2008. – Vol. 45, № 4. – P. 400-421.
247 Spread of Cryptococcus gattii in British Columbia, Canada, and detection in the
Pacific Northwest, USA / L. MacDougall, S.E. Kidd, E. Galanis [et al.] // Emerg.
Infect. Dis. – 2007. – Vol. 13. – P. 42-50.
248 Spread of Cryptococcus gattii into Pacific Northwest region of the United States /
K. Datta, K.H. Bartlett, R. Baer [et al.] // Emerg. Infect. Dis. – 2009. – Vol. 15. – P.
1185-1191.
249 Strain-dependent production of interleukin-17/interferon-γ and matrixremodelingassociated genes in experimental / Candida albicans keratitis // Y. Zou, H. Zhang,
H. Li [et al.] // Mol. Vis. – 2012. – Vol. 18. – P. 1215-1225.
136
250
Susceptibility to fluconazole of Cryptococcus neoformans isolates from patients
in Saint-Petersburg, Russia / T.S. Bogomolova, N.V. Vasilyeva, I.V. Vybornova [et
al.] // Mycoses. – 2013. – Vol. 56, Suppl.4. – P. 64.
251 Synthetic melanin supresses production of proinflammatory cytokines / N.
Mohagheghpour, N. Waleh, S.J. Garger [et al.] // Cell Immunol. – 2000. – Vol. 199. –
P. 25-36.
252 Taborda, C.P. CR3 (CD11b/CD18) and CR4 (CD11c/CD18) are involved in
complement-independent
antibody-mediated
phagocytosis
of
Cryptococcus
neoformans / C.P. Taborda, A. Casadevall // Immunity. – 2002. – Vol. 16. – P. 791802.
253 Takeda, K. Toll-like receptors / K. Takeda, T. Kaisho, S. Akira // Annu. Rev.
Immunol. – 2003. –Vol. 21. – P. 335-376.
254 Th17 cells and IL-17 receptor signaling are essential for mucosal host defense
against oral candidiasis / H.R. Conti, F. Shen, N. Nayyar [et al.] // J. Exp. Med. –
2009. – Vol. 206. – P. 299-311.
255 The capsule of the fungal pathogen Cryptococcus neoformans / Zaragoza O.,
Rodrigues M.L., De Jesus M. [et al.] // Adv. Appl. Microbiol. – 2009. – Vol. 68. – P.
133-216.
256 The human cathelicidin peptide LL-37 and truncated variants induce segregation of
lipids and proteins in the plasma membrane of Candida albicans / A.L. den Hertog, J.
van Marle, E.C. Veerman [et al.] // Biol. Chem. – 2006. – Vol. 387. – P. 1495-1502.
257
The induction of inflammation by dectin-1 in vivo is dependent on myeloid cell
programming and the progression of phagocytosis / M. Rosas, K. Liddiard, M.
Kimberg [et al.] // J. Immunol. – 2008. – Vol. 181. – P. 3549-3557.
258 The presence of capsule in Cryptococcus neoformans influences the gene
expression profile in dendritic cells during interaction with the fungus / P. Lupo, Y.C.
Chang, B.L. Kelsall [et al.] // Infect. Immun. – 2008. – Vol. 76. – P. 1581-1589.
259 The two faces of interleukin 10 in human infectious diseases / J. L. Mege, S.
Meghari, A. Honstettre [et al.] // Lancet Infect. Dis. – 2006. – Vol.6. – P. 557-569.
137
260 TLR-2 and IL-17A in chitin-induced macrophage activation and acute
inflammation / C. A. Da Silva, D. Hartl, W. Liu [et al.] // J. Immunol. 2008. –
Vol.181. – P.4279-4286.
261 Tucker, S. C. Replication of Cryptococcus neoformans in macrophages is
accompanied by phagosomal permeabilization and accumulation of vesicles
containing polysaccharide in the cytoplasm / S. C. Tucker, A. Casadevall // Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. – 2002. – Vol. 99. – P. 3165-3170.
262 Urease as a virulence factor in experimental cryptococcosis / G.M. Cox, A.
Casadevall, J.R. Perfect [et al.] // Infect. Immun. –2000. – Vol. 68, № 2. – P. 443448.
263 Urease expression by Cryptococcus neoformans promotes microvascular
sequestration, thereby enhancing central nervous system invasion / M.A.
Olszewski, M.C. Noverr, G.H. Chen [et al.] // Am. J. Pathol. – 2004. – Vol. 164. –
P. 1761-1771.
264 Vazquez-Torres, A. Macrophages in resistance to candidiasis / A. VazquezTorres, E. Balish // Microbiol. Mol. Biol. Rev. – 1997. – Vol. 61. – P. 170-192.
265 Vieira, O.V. Phagosome maturation: Aging gracefully / O.V. Vieira, R.J.
Botelho, S. Grinstein // Biochem. J. – 2002. – Vol. 366. – P. 689-704.
266 Villar, C.C. Immune defence mechanisms and immunoenhancement strategies in
oropharyngeal candidiasis / C.C. Villar, A. Dongari-Bagtzoglou // Expert. Rev.
Mol. Med. – 2009. – Vol. 10. – e 29.
267 Voelz, K. Cryptococcal interactions with the host immune system / K. Voelz,
R.C. May // Eukaryotic cell. –2010. – Vol. 9, № 6 – Р. 835-846.
268 Voelz, K. Macrophage-Cryptococcus interactions during cryptococcosis / K.
Voelz // PhD Thesis. – 2010. – 220 р.
269 Voriconazole proves
effective
in
long-term treatment
of
a
cerebral
cryptococcoma in a chronic nephropathic HIV-negative patient, after fluconazole
failure / S. Sabbatani, R. Manfredi, M. Pavon [et al.] // Mycopathologia. – 2004. –
Vol. 158. – P. 165-171.
138
270 Voriconazole treatment for less-common, emerging, or refractory fungal
infections / J.R. Perfect, K.A. Marr, T.J. Walsh [et al.] // Clin. Infect. Dis. – 2003. –
Vol. 36. – P. 1122-1131.
271 Wang, Y. Cryptococcus neoformans melanin and virulence: mechanism of action
/ Y. Wang, P. Aisen, A. Casadevall // Infect. Immun. – 1995. – Vol. 63. – P. 31313136.
272 Wang, Y. Decreased susceptibility of melanized Cryptococcus neoformans to UV
light / Y. Wang, A. Casadevall // Appl. Environ. Microbiol. – 1994. – Vol. 60. – P.
3864-3866.
273 Wang, Y. Melanin, melanin“ghosts” and melanin composition in Cryptococcus
neoformans / Y. Wang, P. Aisen, A. Casadevall // Infect. Immun. – 1996. – Vol.
64. – P. 2420-2424.
274 Wickes, B.L. The role of mating type and morphology in Cryptococcus
neoformans pathogenesis / B.L. Wickes // Int. J. Med. Microbiol. – 2002. – № 292.
– P. 313- 329.
275 Williamson, P.R. Laccase and melanin in the pathogenesis of Cryptococcus
neoformans / P.R. Williamson // Front. Biosci. – 1997. – Vol. 2. – e 99-107.
276 Willment, J.A. C-type lectin receptors in antifungal immunity / Willment J.A.,
Brown G.D. // Trends Microbiol. – 2008. – Vol. 16. – P. 27-32.
277 Wormley, F.L. Jr. Immunology of infection caused by Cryptococcus neoformans
/ F.L. Jr. Wormley, J.R. Perfect // Methods in Molecular Medicine. – 2005. –
Vol.118. – P.193-198.
278 Yauch, L.E. Direct inhibition of T-cell responses by the Cryptococcus capsular
polysaccharide glucuronoxylomannan [Electronic resource] / L.E. Yauch, J.S.
Lam, S.M. Levitz. – Mode of access: http://www.plospathogens.org/article/
info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.ppat.0020120.
279 Zaragoza, O. Capsule enlargement in Cryptococcus neoformans confers
resistance to oxidative stress suggesting a mechanism for intracellular survival / O.
Zaragoza, C.J. Chrisman, M.V. Castelli // Cell. Microbiol. – 2008. – Vol. 10, №10.
– P. 2043-2057.
139
280 Zaragoza, O. Experimental modulation of capsule size in Cryptococcus
neoformans / O. Zaragoza, A. Casadevall // Biol. Proced. Online. – 2004. – Vol. 6,
– P. 10-15.
281 Zaragoza, O. Monoclonal antibodies can affect complement deposition on the
capsule of the pathogenic fungus Cryptococcus neoformans by both classical
pathway activation and steric hindrance / O. Zaragoza, A. Casadevall // Cell.
Microbiol. – 2006. – Vol. 8, № 12. – P. 1862-1876.
282 Zaragoza,
O.
The
efficacy
of
complement-mediated
phagocytosis
of
Cryptococcus neoformans is dependent on the location of C3 in the polysaccharide
capsule and involves both direct and indirect C3-mediated interactions / O.
Zaragoza, C.P. Taborda, A. Casadevall // Eur. J. Immunol. – 2003. – Vol. 33. – P.
1957-1967.
Работы по теме диссертации:
283 Влияние вориконазола на взаимодействие макрофагов со штаммами
Cryptococcus neoformans разной вирулентности / Л.В. Филиппова, Н.В.
Васильева, Е.В.Фролова [и др.] // Проблемы медицинской микологии. − 2014.
− Т.16, №2. − С.140.
284 Влияние
размера
капсулы
грибов
Cryptococcus
neoformans
на
их
взаимодействие с перитонеальными макрофагами / Л.В. Филиппова, Н.В.
Васильева, Е.П. Киселева [и др.] // Проблемы медицинской микологии. −
2008. − Т.10, №2. − С.87.
285 Особенности
взаимодействия
Cryptococcus
neoformans
разной
вирулентности и альвеолярных макрофагов / Н.В. Васильева, А.А. Степанова,
Л.В. Филиппова [и др.] // Проблемы медицинской микологии. − 2011. − Т.13,
№4. − С.46-50.
286 Особенности взаимодействия макрофагов с разными по вирулентности
штаммами Cryptococcus neoformans / Л.В. Филиппова, Н.В. Васильева, Е.П.
Киселева [и др.] // Проблемы медицинской микологии. − 2010. − Т.12, №1. −
С.38-41.
140
287 Особенности взаимодействия разных штаммов Cryptococcus neoformans с
макрофагами / Л.В. Филиппова, Н.В. Васильева, Е.П. Киселева [и др.] //
Проблемы медицинской микологии. − 2009. − Т.11, №2. − С.120.
288 Особенности спектра цитокинов, продуцируемых макрофагами, при
взаимодействии
со
штаммами
Cryptococcus
neoformans
разной
вирулентности in vitro / Л.В. Филиппова, Н.В. Васильева, Е.П. Киселева [и
др.] // Проблемы медицинской микологии. − 2011. − Т.13, №2. − С.114.
289 Продукция цитокинов макрофагами при взаимодействии со штаммами
Cryptococcus neoformans разной вирулентности in vitro / Л.В. Филиппова,
Н.В. Васильева, Е.П. Киселева [и др.] // Проблемы медицинской микологии. −
2011. − Т.13, №3. − С.45-49.
290 Факторы микробоцидности макрофагов по отношению к штаммам
Cryptococcus neoformans разной вирулентности / Л.В. Филиппова, Н.В.
Васильева, Е.П. Киселева [и др.] // Проблемы медицинской микологии. −
2010. − Т.12, №2. − С.138-139.
291 Филиппова Л.В. Взаимодействие макрофагов со штаммами Cryptococcus
neoformans разной вирулентности / Л.В. Филиппова, Н.В.Васильева, Е.П.
Киселева // В сб. науч. труд. «По материалам отчетной сессии 2009 года». –
СПб., 2009. – С.14-16.
292 Филиппова, Л.В. Cryptococcus neoformans и врожденный иммунитет / Л.В.
Филиппова, Е.В. Фролова // Проблемы медицинской микологии. − 2011. −
Т.13, №2. − С.10-19.
293 Филиппова, Л.В. Чувствительность штаммов Cryptococcus neoformans к
антимикробным пептидам in vitro / Л.В. Филиппова, Н.В. Васильева, Е.П.
Киселева [и др.] // Проблемы медицинской микологии. − 2012.− Т.14, №2. −
С. 132.
294 Cryptococcosis in Saint Petersburg, Russia, 1990–2008 / N.V. Vasilyeva, N.N.
Klimko, T.S. Bogomolova, I.A. Bosak, L.V. Filippova // Abstracts of the 17th
Congress of the International Society for Human and Animal Mycology, Tokyo,
Japan, May 25-29. – 2009. – Р.472.
141
295 Different virulence Cryptococcus neoformans strains and cytokine production by
macrophages in vitro / L.V. Filippova, N.V. Vasilyeva, E.P. Kiseleva [et al.] //
Keystone Symposia on Fungal Pathogens: From Basic Biology to Drug Discovery,
Santa Fe, New Mexico, USA, January, 15-20. – 2012. – Р.140.
296 Effect of different virulence Cryptococcus neoformans strains on phagocytosis
and cytokine production by macrophages in vitro / L.V. Filippova, N.V. Vasilyeva,
E.P. Kiseleva [et al.] // Mycoses. – 2011. – Vol.54. – P.115.
297 Fungicidal activity of antimicrobial peptides against Cryptococcus neoformans in
vitro / L.V. Filippova, N.V. Vasilyeva, E.P. Kiseleva [et al.] // Mycoses. – 2012. –
Vol. 55. – S.4. – P.108.
298 Interactions of murine phagocytes and Cryptococcus neoformans strains in
combination with voriconazole / L.V. Filippova, N. V. Vasilyeva, E. V. Frolova [et
al.] // Mycoses: Diagnosis. Therapy and prophylaxis of fungal disease. – 2014. –
Vol. 57. – S.1. – P.90.
299 The interaction of macrophages with different Cryptococcus neoformans isolates
/ L.V. Filippova, N.V. Vasilyeva, E.P. Kiseleva [et al.] // Mycoses. – 2009. –
Vol.52. – P.91-92.
142
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
IFN-γ – интерферон гамма
IL – интерлейкин
TGF – трансформирующий фактор роста
TNF – фактор некроза опухоли
ВАК – Высшая аттестационная комиссия
ДОФА - дигидроксифенилаланин
ИФА — иммуноферментный анализ
КОЕ – колониеобразующая единица
ЛПС – липополисахарид
НСТ-тест – тест с нитросиним тетразолием
РКПГ – Российская коллекция патогенных грибов
ФИ – фагоцитарный индекс
ФСБ – фосфатно-солевой буфер
ФЧ – фагоцитарное число
ЦСЖ – церебро-спинальная жидкость
ЭТС – эмбриональная телячья сыворотка
