017186 B1 017186 B1 (11) 017186

Евразийское
патентное
ведомство
(19)
(11)
017186
(13)
B1
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45)
Дата публикации и выдачи патента
2012.10.30
(21)
Номер заявки
200971124
(22)
(51) Int. Cl. G01N 33/80 (2006.01)
G01N 33/543 (2006.01)
G01N 33/537 (2006.01)
G01N 33/569 (2006.01)
Дата подачи заявки
2008.06.06
(54)
МНОЖЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ ОБРАЗЦОВ КРОВИ
B1
017186
(72)
Изобретатель:
(74)
Представитель:
(57)
Изобретение относится к способу обнаружения множества антигенных молекул, которые несут
эритроциты, и/или множества антиэритроцитарных антител индивидуума, включающий в себя
приведение образца в контакт с распознаваемыми микросферами, на которых присоединены:
а) антитела, специфичные для указанных антигенов, или b) эритроциты, фрагменты мембраны
эритроцитов или антигены группы крови.
Бюффьер Фредерик, Рэзэн Ив,
Ривалэн Эльян, Санхуан Ампаро (FR)
Медведев В.Н. (RU)
B1
(56) WO-A-9821593
WO-A-8501354
US-A1-2001054580
US-A1-2003194818
GARRATTY G. ET AL.: "Applications of flow
cytometry to transfusion science." TRANSFUSION,
vol. 35, no. 2, January 1995 (1995-01), pages 157-178,
XP000983723 abstract page 159, column 1, paragraph
2 - page 160, column 1, paragraph 1 page 161, column
2, paragraphs 2,3. page 165, column 2, last paragraph page 166, column 2, paragraph 1 page 167, column 2,
paragraph 1 page 170, column 1, last paragraph - page
171, column 2, paragraph 1 page 172, column 2, last
paragraph - page 173, column 2, paragraph 2
FREEDMAN J. ET AL.: "Applications of flow
cytometry in transfusion medicine" TRANSFUSION
MEDICINE REVIEWS, vol. 9, no. 2, April 1995
(1995-04), pages 87-109, XP005441355 abstract page
93, column 1, paragraph 2 - page 102, column 1,
paragraph 2
017186
(31) 0755624; 60/929,052
(32) 2007.06.08; 2007.06.11
(33) FR; US
(43) 2010.06.30
(86) PCT/EP2008/057116
(87) WO 2008/148886 2008.12.11
(71)(73) Заявитель и патентовладелец:
БИО-РАД ЭННОВАСЬОН (FR)
017186
Изобретение относится к анализу группы крови и фенотипа эритроцитов, а также к скринингу на
предмет атипичных антиэритроцитарных антител, к определению совместимости донора и реципиента, и
к демонстрации эритроцитов, покрытых антителами или активированными фракциями комплемента сыворотки.
Переливание крови в настоящее время заключается во внутривенном введении препаратов концентратов красных клеток крови (концентратов клеток крови), полученных от доноров крови. При выполнении трансфузии первичный риск связан с возможностью соединения антитела и его эритроцитарного
антигена в организме реципиента (индивидуума, которому производят трунсфузию). Фактически речь
идет о мембранных антигенах на поверхности эритроцитов, также называемых красные клетки крови, в
частности антигены группы крови (или системные), способные быть распознаными иммунной системой
и вызывать иммунный ответ с гемолизом красных клеток крови. Последствия такой иммунологической
реакции могут варьировать от неэффективной трансфузии без клинических симптомов до незначительной клинической реакции (тревожности, озноба), серьезной клинической реакции (шока, гемоглобинурии, почечной недостаточности) или драматической клинической реакции (шока, диссеминированного
внутрисосудистого гемолиза), приводящей к смерти. Красные кровяные клетки донора считаются совместимыми с кровью реципиента, если у реципиента не имеется любых циркулирующих антител, направленных на эритроцитарный антиген донора.
Среди всех антигенных вариантов мембранного антигена эритроцитов, составляющих группы крови, к настоящему времени для человека было определено более чем двадцать систем эритроцитарных
антигенов: система АВО с антигенами А, В и Н, система Резус (RH), в частности антигены D (отсутствие
антигена D обозначается как d), С, Е, с и е, система Kell (KEL), в частности два антигена K и k, система
Duffy (FY), в частности антигены Fya и Fyb, система Kidd (JK), в частности антигены Jka и Jkb, или в
качестве альтернативы другие системы, которые менее часто исследуются в практике, такие как система
MNS, система Lewis (LE) и т.д. Индивидуумы, имеющие одинаковый комплекс эритроцитарных антигенов, относятся к одной и той же группе крови.
За исключением патологических ситуаций, таких как в случае аутоиммунных заболеваний, сыворотка индивидуума может содержать два типа антител, направленных на эритроцитарные антигены:
(i) антитела, называемые типичными и направленные на антигены системы АВО (например, антиА-антитела в организме индивидуума с группой крови В);
(ii) антитела, называемые атипичные (или иммунные), присутствие которых в сыворотке или плазме является зависящим от обстоятельств и которые направлены главным образом против антигенов, не
относящихся к системе АВО.
Типичные или нормальные антитела представляют собой иммуноглобулины изотипа М и/или
А, которые способны к агглютинированию клеток крови in vitro. Этот феномен применяется для определения группы крови индивидуума по системе АВО при помощи тестов Beth-Vincent и Simonin (соответственно, прямое или обратное определение группы), причем тест Beth-Vincent делает возможным определение антител, которые несут клетки крови индивидуума (антигенного фенотипа), а тест Simonin делает возможным выполнение комплементарного исследования, т.е. определение циркулирующих анти-А
и/или анти-В антител, присутствующих в сыворотке индивидуума. В тесте Beth-Vincent клетки крови
индивидуума приводят в контакт с исследуемой сывороткой или исследуемыми антителами, каждое из
которых имеет определенную специфичность антител, направленную на антиген системы АВО. Следовательно, он представляет собой тест агглютинации красных клеток крови исследуемой сывороткой.
В тесте Simonin, также называемом обратный тест, сыворотка или плазма индивидуума, содержащая циркулирующие антитела последнего, приводится в контакт с исследуемыми красными клетками
крови или исследуемыми эритроцитами, каждый из которых принадлежит к определенной антигенной
группе системы АВО. Следовательно, он представляет собой тест агглютинации сыворотки исследуемыми красными клетками крови.
Атипичные, или нерегулярные или иммунные антитела представляют собой наиболее часто
антитела изотипа G, появляющиеся при наличии антигенной стимуляции чужими красными клетками
крови, например, вследствие иммунизации против одного или более антигенов во время переливания
крови или же во время беременности, особенно во время родов, вследствие иммунной реакции организма
матери, направленной на эритроцитарные антигены плода, которые не относятся к группе крови матери.
Тестирование наличия этих атипичных антител называется исследованием на наличие атипичных
агглютининов (AAS) (Atypical Agglutinin Screen). Этот тест применяется для обнаружения наличия или
отсутствия в крови индивидуума антител, направленных на различные эритроцитарные антигены. Анализ заключается в попытке продемонстрировать связывание этих антител (IgG и/или IgM) с тестируемыми красными клетками крови, антигены которых известны. Параллельные процедуры выполняются со
многими типами красных клеток крови, причем сравнение результатов делает возможным установление
специфичности или специфичностей присутствующих антител.
Риск, ассоциированный с иммунологической реакцией, является еще большим, если в эту реакцию
вовлекается наиболее иммуногенные антигены, такие как антигены системы Резус (причем градиент
-1-
017186
опасности для этой системы следующий: D>E>c>e>C), затем, в соответствии с порядком снижения иммуногенности, антиген K системы Kell, антигены Fya и Fyb системы Duffy, антигены Jka и Jkb системы
Kidd и т.д.
На практике невозможно принять во внимание все эти антигены для выполнения трансфузии, иначе
никогда не было бы возможности иметь нужную группу крови в нужный момент, и даже более того, поскольку некоторые комбинации антигенов являются очень редкими. При стандартной трансфузии, следовательно, наиболее часто принимают во внимание только группу по системе АВО и системе Резус D
(Rh+ или Rh-). Однако в ситуациях, когда существует риск появления атипичного агглютинина, принимается во внимание ряд других систем, в частности Резус С, с, Е и е и Kell, или даже другие системы.
Для этих рискованных ситуаций следует придерживаться совместимости группы крови донора с группой
крови реципиента, принимая во внимание наличие или риск появления этих атипичных агглютининов.
Следовательно, в организме реципиента, имеющего атипичные антиэритроцитарные антитела или в ситуации риска, такой как, в частности, при многократных трансфузиях у пациентов, которые не имеют
атипичных антиэритроцитарных антител, и у беременных женщин, необходимо выбирать образцы эритроцитарных концентратов, которые будут перелиты таким образом, что красные клетки донора должны
будут не иметь антигенов, на которые направлены или могут появиться антитела реципиента. На практике при трансфузии в настоящее время профессионалы могут занимать две позиции:
или они систематически контролируют наличие атипичных антител в сыворотке или плазме пациента, и если такие антитела присутствуют, они выбирают эритроцитарные концентраты, лишенные рассматриваемых антигенных структур (эта ситуация наиболее часто встречается во Франции),
или они осуществляют прямое определение совместимости крови донора и реципиента с красными
клетками крови донора в присутствии сыворотки или плазмы реципиента, при котором не должно наблюдаться агглютинации и/или реакции лизиса.
В клинической практике при трансфузии определение фенотипа эритроцитов, которое соответствует выявлению и определению антигенов группы крови на поверхности красных клеток крови (за исключением конкретно системы АВО, для которой также исследуется наличие соответствующих типичных
антител), включает и реципиента, и донора.
Для реципиентов и доноров существует три уровня определения эритроцитарного фенотипа для
предоставления реципиенту совместимых эритроцитарных концентратов, что соответствует трем степеням риска:
определение фенотипа по системе АВО (или определение группы крови по АВО) и стандартного
фенотипа по системе Резус (наличие или отсутствие антигена D);
определение фенотипа по системе Резус Kell (наличие или отсутствие антигенов С, Е, с, е и K); и
определение расширенного (или детализованного) фенотипа, т.е. определение наличия или отсутствия антигенов системы Duffy, Fya и Fyb, системы Kidd, Jka и Jkb, системы MNS и системы Lewis, и других антигенов, которые могут также быть исследованы в соответствии с природой риска и/или атипичных антител, выявленных в сыворотке реципиента.
Методы, обычно применяемые для определения фенотипа, заключаются, как правило, в скрининге
на наличие или отсутствие исследуемого антигена с применением тестируемой сыворотки, содержащей
соответствующие антитела. Предпочтительно эти антитела, содержащиеся в этих тестируемых сыворотках, в природе являются агглютинирующими (IgM или IgA), что, таким образом, делает возможным получение тотальной или частичной агглютинации эритроцитов, фенотип которых определяют, когда последние несут антиген, соответствующий антителу, присутствующему в тестируемой сыворотке. Тем не
менее, возможно применение неагглютинирующих тестируемых антител (типа IgG), причем их наличие
демонстрируется агглютинацией за счет антииммуноглобулина (непрямой метод Кумбса).
Для определения и идентификации в исследуемом образце сыворотки или плазмы пациента антител
к антигену группы крови, которые являются типичными антителами для установления группы крови по
системе АВО или атипичными антителами в случае AAS, сыворотка или плазма пациента обычно приводится в контакт с тестируемыми эритроцитами (также называемыми тестируемыми красными клетками
крови) известной антигенности в некотором числе систем группы крови (АВО, Резус, Kell, Duffy, Kidd,
MNS и т.д.)). Для AAS, для которого антитела, которые могут присутствовать, являются скорее антителами неагглютинирующего типа, применяемые методы выполняются непрямым способом Кумбса, посредством агглютинации с антииммуноглобулином или посредством иммуноадгезии на твердой фазе и
обнаружения при помощи красных клеток крови, покрытых антииммуноглобулином, как описано в патенте ЕР 0367468.
В случае AAS первым этапом применяется скрининговый набор красных клеток крови (два или
три вида красных клеток крови из различных групп выбирают таким образом, чтобы они содержали все
антигены, учитываемые при трансфузии, для обнаружения (но не идентификации) наличия или отсутствия атипичных антител). Если результат скрининга является положительным, специфичность присутствующего атипичного антитела или антител затем определяется посредством по меньшей мере одного
набора идентифицирующих красных клеток крови, обычно содержащего от 10 до 15 или даже 20 раз-2-
017186
личных видов красных клеток крови, фенотипированных в подавляющем большинстве известных систем
групп крови.
При определении совместимости группы крови донора и реципиента также применяется непрямой
метод Кумбса. Таким образом, красные клетки крови донора, полученные из образцов, взятых из пакетов, которые могут быть использованы для транфузии, сыворотку реципиента и антиглобулин объединяют вместе. Такой анализ приводит только к определению наличия или отсутствия антител и не дает
возможности определять их специфичность. Существует большое количество вариантов методов, применяемых для фенотипирования или AAS в области переливания крови, причем эти методы могут осуществляться вручную на опалиновом планшете, в пробирке или в лунке микропланшета, или в колонке
геля, или полностью автоматически посредством робота для дозирования образца и реагента, шейкера,
инкубатора, центрифуги и автоматического устройства для считывания, программы которых пригодны
для осуществляемых методов.
Настоящие методы, тем не менее, имеют некоторые ограничения.
В настоящее время при определении группы крови конечный результат соответствует накоплению
нескольких отдельных результатов, которые нельзя определить с использованием одного и того же тестируемого образца. Применение нескольких тестируемых образцов, взятых у одного и того же пациента,
влияет на достоверность теста. Кроме того, необходимо забирать большой объем крови, что может быть
проблематично для некоторых пациентов (например, у детей и пациентов, страдающих тяжелой анемией).
Для определения, в частности, группы крови по системе АВО анализ является результатом комбинации и интерпретации двух типов анализов: исследований сыворотки с использованием сыворотки или
плазмы и клеточных исследований с применением осадка клеток крови.
В случае поиска атипичных антител скрининг обычно выполняется в первую очередь, и затем, если
результаты положительные, образец исследуется с целью идентификации специфичности антител. Эти
две стадии удлиняют время получения результата и могут вызывать разрушение образцов. Кроме того,
часто обнаруживают, что объем образца является недостаточным для продолжения исследования (это
происходит, в частности, в случае смесей антител), что создает необходимость забора дополнительного
образца у пациента. Многочисленность этих стадий требует настройки точных, последовательных процедур для предотвращения ошибок.
Кроме того, все тесты для определения группы крови и фенотипирования, основанные на принципе
агглютинации, невозможны для некоторых систем (например, Duffy), в которых доступны только антитела человека изотипа G, причем последние неспособны к прямому агглютинированию красных клеток
крови, несущих специфический антиген. В этом случае применяется дополнительный реагент (AHG),
который выявляет эти иммуноглобулины человека и делает возможным соединение между антителами,
связанными с исследуемыми красными клетками крови. Однако этот тип реагента не может быть применен в случае пациентов, имеющих красные клетки крови, сенсибилизированные антителами in vivo (аутоиммунная анемия, новорожденные и т.д.), поскольку существует риск вызвать реакцию неспецифической агглютинации (агглютинация даже в отсутствие рассматриваемого антигена на поверхности красной клетки крови). Следовательно, для этой категории пациентов невозможно определение фенотипа, и
это является причиной реальной проблемы общественного здоровья.
Поэтому в этом случае врач, выполняющий трансфузию, вынужден переливать красные клетки
крови, для которых максимальное число антигенных маркеров является отрицательным, причем такие
красные клетки крови не всегда доступны в терапевтических подразделениях.
Кроме того, с применением методов, доступных на данный момент, время, которое требуется для
предоставления годного для использования результата, который часто складывается из комбинации результатов нескольких тестов, составляет, по меньшей мере, порядка двадцати-тридцати минут, тогда как
ситуации, требующие трансфузий, обычно являются неотложными ситуациями, для которых желательно
определение совместимости донора и реципиента настолько быстро, насколько возможно.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение решает эти проблемы путем предоставления быстрого и простого способа,
который может быть полностью автоматизирован и который делает возможным определение группы
крови и фенотипирование красных клеток крови, выявление атипичных антиэритроцитарных антител,
определение совместимости между донором и реципиентом и демонстрацию красных клеток крови, покрытых или антителами, или фракциями сывороточного комплемента, причем способ предпочтительно
выполняется в мультиплексном формате с использованием единственного образца.
Изобретение, таким образом, предоставляет способ идентификации in vitro антигенных молекул,
которые несут эритроциты, и также антиэритроцитарных антител, которые могут присутствовать в индивидууме, предпочтительно в мультиплексном формате, включающий в себя приведение образца в контакт с распознаваемыми микросферами, к которым присоединены а) антитела, специфичные для указанных антигенов, или b) эритроциты, фрагменты мембраны эритроцитов или антигены группы крови, в
условиях, которые позволяют антителам связываться со своими антигенами, когда это требуется, с активацией фракции комплемента сыворотки, без агглютинации, в частности, эритроцитов или распознавае-3-
017186
мых микросфер.
Более конкретно, целью изобретения является способ идентификации in vitro антигенных молекул,
которые несут эритроциты, и/или антиэритроцитарных антител индивидуума, включающий
a) идентификацию множества антигенных молекул, которые несут эритроциты, в биологическом
образце посредством
(i) приведения указанного образца, содержащего эритроциты, в контакт в одной или нескольких
емкостях для исследования с группой распознаваемых микросфер, причем каждая группа распознаваемых микросфер несет на себе специфичное для антигенной молекулы, которую несут эритроциты, антитело, по которому разные группы микросфер отличаются друг от друга, в условиях, которые делают возможным связывание эритроцитов с антителами без агглютинации, причем указанные эритроциты метят
перед или после того, как они будут приведены в контакт с указанными группами шариков,
(ii) элиминация эритроцитов, которые не связались с указанными антителами, и
(iii) идентификация группы микросфер, которые связали меченые эритроциты, что делает таким образом возможной идентификацию антигенов, которых несут обнаруженные эритроциты; и/или
b) идентификация множества антиэритроцитарных антител в биологическом образце посредством
(i) приведения указанного образца в контакт, в одной или нескольких емкостях для исследования, с
группами разпознаваемых микросфер, несущих (1) эритроциты, (2) фрагменты мембраны эритроцитов
или (3) антигены группы крови, известного фенотипа, который различается от одной группы микросфер
к другой, в условиях, которые позволяют антителам или активированным фракциям сывороточного комплемента, присутствующим в образце, связываться с эритроцитами, фрагментами мембраны эритроцитов
или антигенами группы крови без агглютинации,
(ii) элиминации антител или активированных фракций сывороточного комплемента, которые не
связались с указанными эритроцитами или с указанными фрагментами мембран эритроцитов или с указанными антигенами группы крови,
(iii) мечения связанных антител и/или связанных активированных фракций сывороточного комплемента и
(iv) определение групп микросфер, которые связали меченые антитела или меченые активированные фракции сывороточного комплемента, что, таким образом, делает возможной идентификацию присутствующих антиэритроцитарных антител.
Предпочтительно вариант (а) и/или вариант (b) выполняются в мультиплексном формате в единственной емкости. Последняя стадия a-(iii) или b-(iv) тогда включает в себя анализ смеси для того, чтобы
определить, какая группа микросфер связала меченые эритроциты или связала антитела или активированные фракции сывороточного комплемента, соответственно.
Целью изобретения также является набор реагентов для выполнения вышеописанного способа обнаружения, содержащий группы микросфер, причем каждая из них несет по меньшей мере один конкретный физический параметр, который может быть определен, и они относится по меньшей мере к двум
различным группам, причем одна из групп несет иммобилизованное антитело, специфичное для антигенной молекулы, которую несут эритроциты, а другая группа несет (1) эритроциты, (2) фрагмент мембраны эритроцитов или (3) иммобилизованный антиген, который представляет собой антиген группы
крови.
Подробное описание изобретения
Определения.
В настоящем описании термины эритроцит или красная клетка крови применяются взаимозаменяемо для обозначения одной и той же клетки крови.
Термин мультиплексный означает, что несколько различных реакций типа антиген-антитело исследуются одновременно для одного образца в одной емкости и с применением одной считывающей системы.
Термин симплексный означает, что реакции типа антиген-антитело анализируются в нескольких
отдельных емкостях. Предпочтительно анализы, тем не менее, выполняются одновременно и предпочтительно с применением одной считывающей системы.
Выражение антигенная молекула, которую несут эритроциты обозначает не только любой эритроцитарный антиген, обнаруживаемый в норме на поверхности эритроцитов, в частности антиген группы
крови, но также антигены, присутствующие на поверхности эритроцитов как результат иммунологических реакций, присущих эритроцитарным антигенам. В этом случае термин антигенная молекула, которую несут эритроциты включает в себя антитела или активированные элементы фракции сывороточного
комплемента, который несут эритроциты/ сенсибилизированные in vivo. Как правило, антигенные молекулы, которые несут эритроциты, выбирают, следовательно, из группы, состоящей из антигенов мембраны эритроцитов, составляющих группы крови, активированных фракций сывороточного комплемента,
которые несут эритроциты, и антител, присутствующих на поверхности сенсибилизированных эритроцитов. Также включены антигенные молекулы, адсорбированные на эритроцитах, но источником которых
являются другие клеточные популяции (в частности, молекулы антигенов Льюиса).
-4-
017186
Выражение антиэритроцитарное антитело обозначает любое антитело, которое связывается специфически с антигеном, который несут эритроциты. Термин мечение связанных антител и/или связанных активированных фракций сывороточного комплемента следует понимать как обозначающий мечение антител или активированных фракций сывороточного комплемента, которые обратимо связаны с или
непосредственно встроены в мембрану эритроцитов.
Термин индивидуум предназначен для обозначения любого животного, имеющего множество
групп крови. В качестве животного, имеющего множество групп крови, можно упомянуть, например,
собаку, у которой к настоящему времени были определены восемь различных групп крови, и кошку, которая имеет три. Разумеется, термин индивидуум также относится к человеку, причем включая стадию
плода.,
Термин биологический образец предназначен для обозначения любой фракции биологический
жидкости или биопсии ткани, которая может содержать эритроциты или антиэритроцитарные антитела,
являются ли они физиологическими или патологическими. В качестве биологического образца можно
упомянуть, таким образом, образец крови и, в частности, тотальный образец крови или образец клеточной массы крови (или из пакета с кровью), или любой другой препарат крови, но также слюну, пот, слезы, молоко или мочу, когда они содержат кровь. Также возможно применение образца плазмы или сыворотки для скрининга антител. Для определения антигенов, которые несут эритроциты, биологический
образец может состоять из пакета с клетками крови. Образец, применяемый в варианте (а) может быть
идентичным или отличаться от образца, применяемого в варианте (b). Когда образцы идентичны, варианты (а) и (b) могут быть выполнены в одной и той же емкости, одновременно. Биологический образец
может не подвергаться предварительной обработке.
Термин антитело относится к целому антителу или функциональному фрагменту антитела, содержащему или состоящему по меньшей мере из одного сайта связывания антигенов, который делает
возможным связывание указанного антигена по меньшей мере с одной антигенной детерминантой антигенного вещества. В качестве примера фрагментов антитела, можно упомянуть фрагменты Fab, Fab' и
F(ab')2 и также цепи scFv (одноцепочечный вариабельный фрагмент), цепи dsFv (духспиральный вариабельный фрагмент) и т.д. Эти функциональные фрагменты могут, в частности, быть получены с применением генной инженерии.
Термин иммобилизованный антиген предназначен для обозначения антигенного фрагмента, фиксированного на твердом компоненте, который способен распознаваться антителами и сохраняет аффинность к связыванию последних. Антиген группы крови, присоединенный к шарикам, является антигеном
группы крови, который может представлять собой синтетический антиген, получаемый при помощи химических процессов или посредством генетической рекомбинации. Он может также представлять собой
антиген, очищенный из биологического образца.
Термин иммобилизованное антитело предназначен для обозначения антитела или части антитела,
фиксированных на твердом компоненте, которые сохраняют способность удерживать по меньшей мере
одну антигенную детерминанту антигенного соединения, присутствующего в биологическом образце, за
счет аффинного связывания.
Антитела, применяемые в качестве средств обнаружения, могут представлять собой поликлональные антитела или моноклональные антитела. Продукция моноклональных антител или поликлональных
антител, которые могут быть применены в контексте изобретения, выполняется традиционными методами.
Моноклональные антитела могут быть получены в соответствии с традиционным способом слияния
лимфоцитов и культуры гибридомы, описанным Kohler и Milstein (Nature, 256, p. 495-497(1975)) . Также
известны другие способы получения моноклональных антител (Harlow et al. editors, Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)). Моноклональные антитела могут быть получены посредством иммунизации млекопитающего (например, мыши, крысы, кролика или даже человека и т.д.) и
с применением метода слияния лимфоцитов с получением гибридом (Kohler and Milstein, 1975, выше).
Существуют методы, альтернативные этому стандартному методу. Моноклональные антитела могут, например, быть получены посредством экспрессии нуклеиновой кислоты, клонированной из гибридомы. Антитела могут также быть получены методом фагового дисплея, посредством введения кДНК
антитела в векторы, которые обычно представляют собой нитевидные фаги (например, fUSE5 для Е. coli,
Scott et al. (Science, 249, pp. 386-390 (1990)). Последние составляют библиотеки и имеют фрагменты scFv
на своей поверхности. Протоколы для построения библиотек этих антител описаны в Marks et al. (1991)
(J. Mol. Biol., 222, pp. 581-597, (1991)).
Поликлональные антитела могут быть получены из сыворотки животного, иммунизированного антигеном, предпочтительно пептидной природы, в соответствии с обычными процедурами. Как правило,
полипептид, в частности рекомбинантный полипептид, или олигопептид могут быть применены, например, в качестве иммуногена. В соответствии с традиционным протоколом кроликов иммунизируют эквивалентом 1 мг пептидного иммуногена, в соответствии с процедурой, описанной Benoit et al. [PNAS USA,
79, pp. 917-921 (1982)].
-5-
017186
Микросферы.
Микросферы, как правило, состоят из полимеров, которые являются инертными относительно компонентов биологических образцов; они являются твердыми и нерастворимыми в образцах. Применяемые
полимеры могут представлять собой полиэфиры сложных и простых эфиров, полиолефины, полиамиды,
полисахариды, полиуретаны или целлюлозы. Могут также применяться связывающие вещества для придания частицам целостности и структуры. Функциональные группы могут быть включены в эти полимеры таким образом, чтобы делать возможным присоединение или связывание интересующих биологических макромолекул (белков, жиров, углеводов, нуклеиновых кислот). Эти функциональные группы, которые известны специалистам в данной области, могут представлять собой группы аминов (-NH2) или
аммония (-NH3+ или -NR3+), спиртов (-ОН), карбоновых кислот (-СООН) или изоцианатов (-NCO). Мономерами, наиболее часто применяемыми для введения СООН-групп в полиолефины, являются акриловая кислота или метакриловая кислота.
Присоединение реагентов к поверхности микросфер может осуществляться посредством электростатического притяжения, аффинных взаимодействий, гидрофобных взаимодействий или ковалентного
соединения. Ковалентное соединение является предпочтительным.
Микросферы, применяемые в изобретении, представляют собой частицы приблизительно сферической формы, размер их может составлять от 0,5 до 40 мкм, предпочтительно от 4 до 9 и более предпочтительно от 5 до 8 мкм.
Микросферы, применяемые в данном изобретении, являются распознаваемыми, поскольку они
имеют отличающие маркеры, которые позволяют отличать их один от другого при помощи соответствующего детектора. Каждая группа микросфер, таким образом, имеет различные физикохимические
свойства (размер, плотность, размер частиц, шероховатость, поглощающую способность, флуоресценцию, парамагнитные компоненты), которые позволяют отличать их один от другого посредством пригодных детекторов или инструментов, например проточного цитометра.
В качестве дифференциального параметра для распознавания тех или иных частиц, в частности,
можно использовать размер частиц, посредством выбора неперекрывающихся диапазонов размера. В
другом предпочтительном варианте осуществления распознаваемые частицы испускают флуоресцентные
сигналы. Микросферы, которые включают в себя различные флуоресцентные метки, могут фактически
быть распознаны по их флуоресцентному спектру. Для этого микросферы могут быть импрегнированы
одним или более красителями (например, флуоресцентным, люминесцентным и т.д.), при необходимости, в различных концентрациях, или радиоизотопной меткой, ферментной меткой и т.д.
(Venkatasubbarao S. Microarrays-Status and prospects Trends in Biotechnology Dec 2004, 22(12):630637; Morgan et al, Cytometric bead array: a multiplexed assay platform with applications in various areas of
biology, Clin. Immunol. (2004) 100:252-266). Рассеяние или испускание света или их комбинация также
могут быть применены для распознавания частиц. В предпочтительном варианте осуществления распознаваемые микросферы испускают люминесцентные или флуоресцентные сигналы. Применяемые микросферы могут представлять собой суперпарамагнетики, магнетики или быть способны к намагничиванию. В качестве микросфер, которые могут быть применены в соответствии с изобретением, можно упомянуть микросферы, описанные в US 6872578. В соответствии с особенно предпочтительным вариантом
осуществления применяемые микросферы являются флуоресцирующими и суперпарамагнетиками. Эти
физикохимические свойства делают возможным отделение, во время реакции с биологическим образцом,
фракций, захваченных этими микрочастицами, от фракций, которые не связаны. Эта сепарация может
быть выполнена, в числе прочего, посредством центрифугирования, фильтрации или намагничивания.
Отделение посредством намагничивания является предпочтительным, и для этого могут применяться
микросферы, содержащие парамагнетики, ферромагнетики, ферримагнетики и метамагнетики.
Предпочтительными являются парамагнетики, например железо, кобальт, никель или оксиды металлов, такие как Mn2O3, Cr2O или Fe3O4. Количество магнетиков может составлять от 2 до 50 мас.% и
предпочтительно от 3 до 25 мас.%.
Антитела могут быть присоединены к микросферам (в соответствии с а) с применением подходящего метода. Они могут быть присоединены ковалентно или нековалентно, в частности, посредством
пассивной адсорбции или за счет аффинности. Прямое ковалентное присоединение может быть выполнено посредством активации карбоксильных групп, присутствующих на поверхности микросфер, включая связывание посредством, например, гидроксисукцинимида или карбодиимида. В конкретном варианте осуществления антииммуноглобулиновые антитела сначала присоединяются к микросферам посредством ковалентной связи, и затем микросферы приводятся в контакт с присоединенными антителами.
Эритроциты, фрагменты мембраны эритроцитов или антигены группы крови могут быть присоединены к микросферам посредством нековалентного связывания через поли-L-лизин, или лиганд любого
типа, такой как поликатионы типа красителя. Эритроциты, фрагменты мембраны эритроцитов или синтетические антигены могут также быть присоединены к микросферам посредством ковалентной связи, в
частности, с применением йоднокислого натрия.
Неожиданно было замечено, что присоединение красных клеток крови или мембранных фрагмен-6-
017186
тов, ковалентное или нековалентное, не ухудшает свойство микросфер распознаваться в соответствии с
процессом проточной цитометрии.
Более того, возможно таким же образом присоединить к поверхности этих микросфер синтетические антигены, которые являются гомологичными некоторым антигенам группы крови, представленным
на поверхности эритроцитов. Присоединение этих антигенов также не нарушает способность микросфер
к распознаванию. Такие синтетические антигены могут, например, представлять собой полисахариды.
Микросферы измеряют при помощи детектора, такого как проточный цитометр, как описано, например, в заявке на патент Luminex WO 97/14028. Следовательно, подгруппы микросфер, несущие реагент (антитело или эритроцит или мембрану эритроцита), подвергают действию биологическго образца,
причем каждая подгруппа обладает одним или более параметров классификации, которые делают возможным распознавание микросфер одной подгруппы от микросфер других подгрупп. Микросферы, экспонированные таким образом с образцом, затем проходят через зону контроля (например, проточный
цитометр), где собирают данные, относящиеся к параметрам классификации (например, интенсивность
флуоресценции), и предпочтительно также данные, относящиеся к наличию или отсутствию комплекса,
образованного реагентом и интересующим анализируемым веществом (а именно между микросферой и
антигенной молекулой, которую несет эритроцит, в соответствии с (а), или антителом в соответствии с
(b) в способе изобретения).
Введение метки.
Доступные обнаружению меченые эритроциты (в варианте (а)) могут быть помечены с применением любого метода, известного специалистам в данной области. Они могут, например, быть помечены
флуоресцирующим соединением, например флуорофором, который встраивается в мембрану этих клеток. Они могут также быть помечены с применением лиганда, функция которого обеспечивается введенной флуоресцентной меткой, причем этот лиганд способен распознавать структуры на поверхности эритроцитов. Эти лиганды могут, например, представлять собой антитела или животные или растительные
лектины. Эти типы введения метки могут проводиться или не проводиться перед тестом.
В варианте b) метят антитела или, в качестве альтернативы, активированные фракции сывороточного комплемента. Возможно использование любого метода введения метки. Типы введения метки могут
также быть комбинированными.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления антитела приводят в контакт с антителом к
человеческому иммуноглобулину, несущему флуоресцентную, люминесцентную или радиоактивную
метку.
В соответствии с другим конкретным, дополнительно кумулятивным, вариантом осуществления активированные фракции сыворотки приводят в контакт с антителом, которое специфически распознает
активированные фракции сывороточного комплемента, причем указанное антитело несет, например,
флуоресцентную, люминесцетную или радиоактивную метку. Такие антитела могут быть моноклональными или поликлональными и хорошо известны специалистами в данной области.
Удаление несвязанных реагентов.
Перед выполнением стадии анализа реагенты, которые не были связаны во время контактирования
и инкубации реагентов, должны быть удалены. Желательно, как можно полнее удалить несвязанный реагент с целью снижения фона и, таким образом, получения хорошей специфичности теста, но условия,
которые являются слишком жесткими, могли бы снижать чувствительность указанного теста. Остаточное присутствие несвязанных реагентов обычно является, таким образом, допустимым. Условия получения приемлемого компромисса между чувствительностью и специфичностью способа могут быть с легкостью определены специалистами в данной области при помощи рутинных экспериментов.
Удаление несвязанных реагентов может быть выполнено с применением любого метода, известного
специалистам в данной области, такого как промывание посредством повторяющихся раундов центрифугирования или применения микросфер со свойствами суперпарамагнетиков и применения магнита.
Предпочтительные варианты осуществления
Как определено выше, способ в соответствии с изобретением делает возможным или идентификацию антигенов в соответствии с (а), или идентификацию антител, или еще идентификацию активированных фракций сывороточного комплемента, которые связаны. Он также дает возможность примененять
сочетания нескольких типов идентификации. Так, идентификация антигенов в соответствии с (а) и идентификация антител в соответствии с (b) может быть выполнена одновременно или по отдельности.
Идентификация антител в соответствии с (b) может быть выполнена посредством обнаружения и
антител, и активированных фракций комплемента сыворотки.
Емкость может представлять собой твердый контейнер, например пробирку, лунку микропланшета
или любую емкость, которая делает возможными реакции в автоматической системе. Центрифугирование емкостей не является необходимым.
Смешивание реагентов и интересующего анализируемого вещества выполняется в условиях (в частности, рН, температуре, ионной силе и т.д.), которые делают возможным специфическое связывание
антигенов, которые несут эритроциты, антителами без агглютинации. Фактическое отсутствие агглютинации делает возможным применение, в частности, проточного цитометра. Для предотвращения любой
-7-
017186
реакции агглютинации, благоприятным является корректирование количества и размера частиц, а также
концентрации образца. Реакции агглютинации подчиняются математическим законам, которые, в частности, были описаны Н.Е. Hart, Bulletin of mathematical biology, vol 42, 17-36, K.C. Chak, Bulletin of
mathematical biology, vol 42, 37-56 и С. DeLisi, Journal of Theoretical Biology, 1974, vol 45, pages 555-575.
Эти законы включают некоторые параметры, такие как, в частности, размер реагентов и также их численное соотношение. Специалисты в данной области будут, таким образом, выбирать условия реакции
посредством приложения этих математических законов как функции применяемых реагентов, таким образом, чтобы не происходило существенной агглютинации. Например, когда применяются эритроциты и
микросферы такого же размера, как эритроциты, т.е. порядка 7 мкм, специалисты в данной области будут
выбирать отношение числа эритроцитов к числу микросфер, варьирующее от 30 до 150.
Преимущественно является предпочтительным включение стадии химического или ферментативного разрушения гемоглобина, такого как гемолиз, предпочтительно после присоединения, но до идентификации антигенов (в соответствии с а) или антител (в соответствии с b).
Гемолиз может производиться различными путями. Например, смесь может быть инкубирована в
среде с низкой осмолярностью. Термин среда с низкой осмолярностью предназначен, как правило, для
обозначения среды, имеющей осмолярность, меньшую или равную 100 мосмоль/л. В качестве пригодной
среды с низкой осмолярностью можно упомянуть о растворах хлорида аммония, имеющих концентрацию 40 мМ или менее, или о дистиллированной воде. Гемолиз может также быть выполнен посредством
обработки ультразвуком.
Применения.
Способ дает возможность проведения фенотипирования и/или определения групповой принадлежности эритроцитов в мультиплексном формате.
Антигены, идентифицированные при помощи варианта осуществления (а) способа в соответствии с
изобретением, могут представлять собой любой антиген группы крови, т.е. системы АВО с антигеном А,
антигеном В, экспрессируемыми одновременно антигенами А и В или антигеном Н, системы Резус с антигенами D, Е, е и С или с, системы Kell с антигенами K или k, системы Duffy (Fya, Fyb), системы Kidd
(Jka, Jkb) или еще каких-либо систем, которые исследуются в практике менее часто, но также существуют, таких как MNS, Lewis и т.д.
Вариант осуществления (а) способа по данному изобретению также предлагает возможность идентификации фенотипа с применением биологического образца, полученного от пациента, эритроциты которого сенсибилибированы in vivo антителами или же фракциями комплемента сыворотки. Считается,
что эти пациенты являются позитивными по прямому тесту Кумбса. Ими являются, в частности, новорожденные или пациенты, страдающие, например, от гемолитической анемии. Тот факт, что красные
клетки крови этих пациентов покрыты иммуноглобулинами типа G, препятствует применению реагентов, которые предполагают вовлечение вторичного реагента, направленного на человеческий глобулин.
Следовательно, непрямой тест Кумбса не может быть применен в таком случае. Эта особенность значительно ограничивает возможности биологов в установлении полного фенотипа у этого типа пациентов.
Действительно, многие фенотипирующие реагенты существуют только в форме раствора специфических
антител человека типа IgG и требуют применения вторичного реагента, направленного на человеческий
глобулин. В некоторых случаях, таким образом, невозможно выполнение анализа и, следовательно, невозможно проведение пациенту трансфузии, что может, разумеется, влиять на качество лечебных мероприятий. Напротив, способ в соответствии с изобретением не требует применения вторичного реагента,
направленного на человеческий иммуноглобулин, и, следовательно, позволяет идентифицировать эритроцитарные антигены эритроцитов, сенсибилизированных in vivo.
Антитела или активированные фракции сывороточного комплемента, присутствующие на поверхности эритроцитов, сенсибилизированных in vivo, способны сами формировать антигены, которые несут
эритроциты, которые могут быть идентифицированы при помощи варианта осуществления (а) способа в
соответствии с изобретением.
Преимуществом является то, что способ по данному изобретению также делает возможным определение изотипа иммуноглобулинов, присутствующих на поверхности эритроцитов. Поскольку некоторые
изотипы являются более опасными, чем остальные, преимуществом является возможность определить
структуру обнаруженных антител, позволяя, таким образом, клиницистам организовать лечебные мероприятия пациента. Таким образом, в соответствии с вариантом осуществления b, посредством применения меток для антител, специфичных для изотипов иммуноглобулинов, может быть определен изотип
атипичного антитела.
Вариант осуществления (а) способа в соответствии с изобретением также делает возможным обнаружение множественных популяций красных клеток крови, т.е. красных клеток крови различных фенотипов (двойная популяция), иногда встречающихся у пациентов после многократных трансфузий, когда
они подвергались многократным переливаниям крови, не идеально совместимой с их группой крови.
Способ по данному изобретению также делает возможным контроль эффективности трансплантации костного мозга при помощи очень малых количеств красных клеток крови, вновь синтезированных
-8-
017186
трансплантатом пациента.
Способ по данному изобретению также дает возможность, при необходимости, в качестве замены
теста Kleihauer, идентифицировать красные клетки крови плода, присутствующие в образце крови матери.
Кроме того, способ делает возможным, например, посредством анализа флуоресценции, количественное определение соотношения антигенов на поверхности эритроцитов в образце.
Способ изобретения также дает возможность количественного анализа антител. Следовательно, полученный результат может иметь численное выражение и быть доступным для облегченной интерпретации посредством электронной системы обработки данных.
Кроме того, способ по данному изобретению дает возможность идентификации множества антиэритроцитарных антител (в соответствии с b). Как правило, способ дает возможность идентификации
любого типа специфичности по группе АВО для обратного теста Simonin или любых других типов специфичности в контексте обнаружения атипичных антител. Обычно эти антитела способны к стабильному
связыванию со своими антигенами, т.е. не только связыванию со своими антигенами, но и сохранению
их присоединенными, в частности, в условиях выполнения способа в соответствии с изобретением. Эти
антитела могут быть идентифицированы посредством варианта осуществления (b) способа в соответствии с изобретением.
Кроме того, в настоящее время хорошо известно, что некоторые конкретные антиэритроцитарные
антитела, вследствие своего изотипа и своей зависимости реактивности от температуры, не способны
сохранять присоединенными соответствующие антигены. С одной стороны, эти антитела способны активировать все белки, составляющие систему комплемента, и в частности, сывороточные фракции CIq, С3
и С4. Результат этой активации приводит к образованию таких модифицированных белков, как белки 3b,
C3dg и C3d, которые, в случае двух последних, остаются закрепленными на мембране эритроцитов, тогда
как инициирующее антитело удаляется с поверхности красной клетки крови. Этот комплексный процесс,
однако, непосредственно связан с начальной и специфической реакцией первичного связывания антитела
эритроцитарным антигеном. Вариант осуществления (b) способа в соответствии с изобретением, который идентифицирует активированные фракции сыворотки, делает возможной идентификацию исходного
антитела.
Преимуществом является то, что способ по данному изобретению также делает возможным определение изотипа иммуноглобулинов, присутствующих в сыворотке пациентов, например беременных
женщин. Существует большой интерес в наблюдении за анемией плода. Это связано с тем, что к настоящему времени было продемонстрировано, что тяжесть гемолитической болезни новорожденных зависит
от изотипа антител, присутствующих в организме матери и направленных на антигенные детерминанты
эритроцитов ребенка (Lambin et al. Transfusion, 2002, vol. 42, pp. 1537-1546). Поскольку некоторые изотипы являются более опасными, чем другие, преимуществом является возможность определить структуру обнаруженных антител, позволяя, таким образом, клиницистам организовать лечебные мероприятия
пациента.
Кроме того, особенно преимущественно то, что способ в соответствии с изобретением дает возможность полного определения группы крови индивидуума в системе АВО как с эритроцитарными антигенами, которые несут красные клетки крови, так и антиэритроцитарными антителами, присутствующими в крови обследуемого индивидуума, с использованием единственного тестируемого образца, посредством выполнения вариантов осуществления (а) и (b) способа по данному изобретению одновременно и в
одной и той же емкости.
Дополнительно, в соответствии со специфическим вариантом осуществления способа по данному
изобретению последний выполняется для верификации совместимости донора и реципиента. Следовательно, возникает вопрос о перекрестной совместимости всех антигенов групп крови (не только АВО). В
этом случае, (i) образец сыворотки или плазмы пациента в условиях, которые делают возможным связывание присутствующих антител с эритроцитами, приводится в контакт, одновременно, предпочтительно
в одной емкости для исследования, с группами распознаваемых микросфер, несущих эритроциты, которые должны быть перелиты, (ii) антитела, которые не связаны указанными эритроцитами, удаляют, (iii)
связанные антитела метят, в частности, с применением меченого антиглобулина, например, флуоресцентной меткой, затем (iv) смесь анализируют предпочтительно посредством проточной цитометрии,
таким образом, чтобы определить, была ли группа микросфер связана антителами, причем связывание
группы микросфер означает, что эритроциты, которые должны быть перелиты, не являются идеальными
для пациента.
Такое применение стало возможным вследствие высокой достоверности способа изобретения.
Преимущественно способ дает возможность получения полных, достоверных результатов в течение
всего нескольких минут. Более точно, возможно дать полный результат менее чем за час или даже менее
чем 30 мин.
Кроме того, способ по данному изобретению имеет очень высокую чувствительность, по меньшей
мере такую же, как у методов, применяемых в настоящее время, таких как колоночная гель-фильтрация.
Способ по данному изобретению также делает возможным значительно уменьшить объем забирае-9-
017186
мого тестируемого образца. В настоящее время реакции, как правило, осуществляются с применением
исследуемого образца объемом 25 мкл для каждого теста, т.е. 575 мкл в случае AAS с 20 различными
красными клетками крови и 3 скрининговыми красными клетками крови. Для осуществления способа по
данному изобретению достаточными являются, например, от 50 до 100 мкл.
Следующие фигуры и примеры иллюстрируют изобретение без ограничения его объема.
Описание фигур
Фиг. 1 представляет собой схему, которая иллюстрирует прямую иммобилизацию антител на микросфере Luminex.
Фиг. 2 представляет собой схему, которая иллюстрирует иммобилизацию антител на микросферах
за счет аффинности на микросфере Luminex.
Фиг. 3 представляет собой схему, которая иллюстрирует мечение красных клеток крови различных
фенотипов флуоресцирующим встраивающимся в мембрану соединением.
Фиг. 4 представляет собой схему, которая иллюстрирует процедуру иммобилизации красных клеток
крови на микросферах Luminex посредством поли-L-лизина.
Фиг. от 5А до 5D показывают мультиплексное фенотипирование красных клеток крови.
Фиг. 6 представляет собой схему, которая иллюстрирует одновременную идентификацию и мультиплексное фенотипирование красных клеток крови пациента, позитивного по прямому тесту Кумбса.
Фиг. 7 представляет собой схему, которая иллюстрирует мультиплексное обнаружение анти-Dантитела.
Фиг. 8 представляет собой график, который показывает мультиплексную калибровку анти-Dантитела.
Фиг. 9 представляет собой график, который показывает простую калибровку анти-D-антитела в
контрольной сыворотке из Centre de Reference pour les Groupes Sanguins (CNRGS) [Контрольный центр
групп крови].
Фиг. 10 представляет собой схему, которая иллюстрирует мультиплексное обнаружение анти-D и
анти-Fya-антител.
Фиг. 11 представляет собой схему, иллюстрирующую мультиплексное определение групп в образцах типа осадка клеток крови или тотального образца крови.
Примеры
Пример 1. Фенотипирование и определение группы крови.
Целью этого анализа является идентификация, посредством специфических моноклональных антител, антигенов группы крови, присутствующих на поверхности красных клеток крови донора или пациентов (группы ABO, RH, Duffy, Kidd, Lewis и т.д.).
Для демонстрации возможностей фенотипирования/определения группы крови красных клеток
крови с применением технологии по данному изобретению для иммобилизации антител к красным клеткам крови применяются флуоресцентные микросферы. Антитела с различной антигенной специфичностью могут, таким образом, быть связаны с различными участками микросфер, которые имеют различные цвета.
В случае красных кровяных телец их метят флуоресцентным соединением, сочетаемым с длиной
волны лазера аппарата, который продается под торговым названием "Bioplex 200" компанией Bio-Rad.
После введения метки красные клетки крови инкубируют с сенсибилизированными микросферами.
Таким образом, возможно обнаружение красных клеток крови, присоединенных к микросферам, и, следовательно, определение их антигенной специфичности.
1.1 Материал и реагенты.
Микросферы: применяемые микросферы производятся Luminex (Luminex Corp., Austin Texas,
United States). Они представляют собой суперпарамагнитные микросферы диаметром 8 мкм, состоящие
из полистирена и метакриловой кислоты (группа СООН). В этом примере применяются флуоресцентные
суперпарамагнитные микросферы, имеющие различные области 19, 21, 32, 34 (Микросферы внутреннего
контроля (ISB)), 71 и 98 (Контрольные микросферы (ВВ)). Микросферы (ISB), имеющие участок микросферы 34, получают свои функции в результате обработки производной родамина и применяются в качестве внутреннего контроля флуоресценции. Эти микросферы должны испускать флуоресценцию в пределах от 5000 до 15000 RFI (relative fluorence intensity - относительная интенсивность флуоресценции).
Участок 98 ВВ микросфер насыщен бычьим альбумином. Эти микросферы не могут связывать ни
антигены, ни антитела и применяются, следовательно, для верификации отсутствия неспецифического
связывания. Эти микросферы должны испускать флуоресценцию на уровне менее 1000 RFI.
Моноклональные антитела против иммуноглобулину IgG человека, клон 125А15 (Bio-Rad).
Поликлональные антитела против IgM человека (mu) (Bio-Rad).
Моноклональные антитела (Bio-Rad, Millipore) IgG против D (клон H2D5D2F5), IgG против Fya
(клон 5T72A13F5A93) и IgM против S (клон MS94).
Набор для мечения клеток PKH26 (Sigma).
Среда для разведения, продающаяся под названиями "ScanLiss" код 86442 и "Stabiliss" код 86550
- 10 -
017186
компанией Bio-Rad.
Скангель карточки, продающийся под названием "ScanGel Coombs" код 8 64 32 для выявления атипичных антител (Bio-Rad).
Скангель карточки, продающийся под названиями "ScanGelRhK" код 86428 и "ScanGelNeutral" код
86430 (Bio-Rad).
Фенотипированные красные клетки крови, выпускаемые под названиями "ScanPanel" код 86593 и
"ScanCell" код 86595 для выявления атипичных антител с применением метода скангель карточек (BioRad).
Концентрированные осадки фенотипированных клеток крови, консервированные в среде SAGMAN (EFS Nord de France).
Красные клетки крови, позитивные и/или негативные по прямому тесту Кумбса, полученные из образцов пациента.
Покрывающая жидкость или буфер (10 мМ натрия фосфата, 150 мМ NaCl, 0,1% (объемн.) проклина.
Бычий сывороточный альбумин (BSA) (Millipore).
Буфер PBS, рН 7,4 (7 мМ натрия фосфата, 2,7 мМ KCl, 136 мМ NaCl).
1.2. Протокол.
1.2.1. Сенсибилизация микросфер антителами группы крови.
Иммобилизация антител на поверхности микросфер может быть выполнена в соответствии с двумя
различными принципами. В первом случае антитела иммобилизованы посредством ковалентной связи
непосредственно на микросферах (фиг. 1). Второй подход состоит из иммобилизации антител к красным
клеткам крови нековалентно, за счет аффинности. В этом случае присоединение выполняется посредством анти-иммуноглобулинового антитела, присоединенного посредством ковалентной связи к микросфере на первом этапе (фиг. 2). Этот подход выбран в представленных примерах.
Микросферы, имеющие участки 19, 21 и 32, применялись для ковалентной иммобилизации антител
против иммуноглобулина человека. Флуоресцентные микросферы, имеющие участок 71, применялись
для ковалентной иммобилизации антител против IgM человека. Карбоксильные группы, присутствующие на поверхности микросфер, активируют в соответствии с методом, включающим в себя гидроксисукцинимид и карбодиимид. Белки, таким образом, могли бы быть иммобилизованы посредством их
аминогрупп.
Микросферы, полученные таким образом, хранят при +4°С с концентрацией 3 мг/мл в PBS, рН 7,4,
содержащем 10% (мас./об.) BSA, 0,5% (об.) Tween 20 и 0,09% (мас./об.) азида натрия.
Микросферы, несущие иммобилизованные антитела против иммуноглобулина человека, могут быть
сенсибилизированы антителами IgG против D или IgG против Fya. Антитела против иммуноглобулина
человека фактически дают возможность IgG связываться посредством своего Fc-фрагмента. Антитела
группы крови, следовательно, иммобилизованы за счет нековалентной связи на микросферах с применением этого принципа. Каждый участок микросферы сенсибилизирован антителом определенной специфичности. Выбранное антитело против иммуноглобулина человека имеет высокую аффинность к иммуноглобулинам человека, делая, таким образом, возможным стабильное связывание в течение длительного времени. Неочищенные анти-D и анти-Fya антитела применяются в конечных концентрациях 30 и 10
мкг/мл соответственно, с микросферами, функция которых обеспечивается антителом против Fc в концентрации 80 мкг/мг.
Сенсибилизация антителами группы крови осуществляется в PBS, рН 7,4, с перемешиванием при
37°С в течение одного часа. После сенсибилизации микросферы промывают несколько раз и затем хранят при +4°С в PBS, рН 7,4.
Микросферы, несущие иммобилизованные анти-mu антитела, могут быть сенсибилизированы IgM
против S. Анти-mu антитела фактически делают возможным связывание IgM. Аффинность этой анти-mu
поликлональной сыворотки является достаточной для обеспечения связывания, которое сохраняет стабильность в течение времени. Неочищенные анти-S антитела иммобилизуют на микросферах, активированных обработкой анти-mu антителами в концентрации 40 мкг/мг. Сенсибилизация выполняется в PBS,
рН 7,4, с перемешиванием при 37°С в течение часа. После сенсибилизации микросферы несколько раз
промывают и затем хранят при +4°С в PBS, рН 7,4. Перед инкубацией с красными клетками крови (собственно тест) микросферы, сенсибилизированные антителами группы крови, смешивают с контрольными
микросферами с участком 34 (ISB) и микросферами с участком 98 (ВВ).
1.2.2. Введение метки в красные клетки крови.
Мечение красных клеток крови флуоресцентным соединением может быть выполнено с применением различных принципов. В представленных примерах красные клетки крови метят с применением
PKH26, который представляет собой флуорофор, который встраивается в мембрану красных клеток крови. Красные клетки крови с различными фенотипами могут, таким образом, быть помечены в соответствии с одним и тем же протоколом (фиг. 3).
PKH26 представляет собой флуоресцентную метку, выпускаемую компанией Sigma. Эта метка имеет максимум поглощения на 551 нм и максимум испускания при 567 нм. Набор включает флуоресцентную метку, которая имеет длинную алифатическую цепь, позволяющую ей включаться в липидный слой
- 11 -
017186
клеточной мембраны, и также изоосмотический водный разбавитель, не содержащий соли, буфера или
органического растворителя. Этот разбавитель делает возможным поддержание на высоких уровнях
жизнеспособности клеток, растворимости метки и эффективности мечения. Введение метки PKH26 в
красные клетки крови выполняется с применением протокола, рекомендованного производителем. Красные клетки крови, помеченные таким образом, разбавляют в буфере Stabiliss и хранят в темном месте
при +4°С.
Качество, жизнеспособность и стабильность меченых красных клеток крови верифицируется по
прошествии времени посредством выполнения анализа фенотипирования в соответствии с гелевым методом. Антигенная целостность меченых красных клеток крови сравнивается с немечеными красными
клетками крови. Качество и стабильность флуоресцентного мечения, в свою очередь, исследуются путем
выполнения измерений флуоресценции с применением аппарата "Bioplex 200" производства Bio-Rad.
1.2.3. Инкубация микросфер с антителами группы крови и красных клеток крови.
Для демонстрации выполнимости и подтверждения специфичности определения групп крови, соответствующего технологии в соответствии с изобретением, авторы изобретения проводили реакции одним
и тем же образом. В этом случае микросферы, активированные антителами группы крови, инкубируются
индивидуально с красными клетками крови различных фенотипов.
В случае мультиплексных реакций различные образцы крови приводят в контакт по отдельности с
микросферами, имеющими различные участки микросфер, и сенсибилизируют антителами с различной
специфичностью. Этот тип эксперимента дает возможность подтверждения способности обнаружения
нескольких антигенных специфичностей антигенов " группы крови в одном исследуемом образце.
Сенсибилизированные микросферы также смешивают с красными клетками крови таким образом,
чтобы получить отношение количества красных клеток крови к количеству микросфер, составляющее
приблизительно от 50 до 150. Смесь инкубируется в течение 15 мин с перемешиванием при 37°С.
После инкубации комплексы микросферы-красные клетки крови промывают несколько раз дистиллированной водой.
1.2.4. Измерения посредством проточной цитометрии с применением автоматизированного устройства "Bioplex 200" компании Bio-Rad.
После последнего промывания и перед измерениями комплексы разбавляют 185 мкл покрывающей
жидкой среды. Для каждого теста 25 мкл суспензии автоматически впрыскивается в аппарат. Измерения
выполняются посредством захвата 250 микросфер на участок. Для каждого опыта определения группы
крови/фенотипирования выполняется систематический контроль для верификации специфичности исследуемых реакций.
1.3. Примеры простого/мультиплексного фенотипирования/определения группы крови.
Целью этой серии опытов было продемонстрировать выполнимость фенотипирования/определения
группы крови красных клеток крови единичным и мультиплексным образом. Антигены D, Fya и S выбирают в качестве модели. Микросферы, сенсибилизированные антителами против иммуноглобулина человека или цепью анти-mu антитела, применяют для иммобилизации анти-D, анти-Fya и анти-S антител.
1.3.1. Единичное фенотипирование RH D-позитивных красных клеток крови.
Микросферы, сенсибилизированные анти-D антителом, инкубируют с Rh D-позитивными и Rh Dнегативными красными клетками крови, мечеными PKН26, с использованием отношения числа красных
клеток крови к числу микросфер, равного 150.
Применяются две RH D-позитивные красные клетки крови и две RH D-негативные красные клетки
крови. Каждый образец впрыскивают в аппарат в виде двух параллелей.
RH D-позитивные красные клетки генерируют сильно позитивные сигналы порядка 21000-25000
RFI, тогда как RH D-негативные красные клетки крови демонстрируют негативные сигналы в пределах
40-400 RFI.
Контрольные микросферы ISB 34, которые дают сигналы порядка 6500 RFI, и контрольные микросферы ВВ 98, которые дают менее чем 1000 RFI, дают возможность оценить результат. Различные проведенные негативные контроли дают сигналы от 15 до 400 RFI, подтверждая специфичность реакций. RH
D-позитивные и RH D-негативные красные клетки крови фактически не связываются со микросферами в
отсутствие анти-D антител.
Эти результаты демонстрируют возможность четкого распознавания RH D-позитивных и RH Dнегативных красных клеток крови и, следовательно, идентификации антигена D на поверхности красных
клеток крови.
Единичное фенотипирование красных клеток крови по Fya и S может быть выполнено в соответствии с таким же принципом, с применением специфичных для изотипа G или специфичных для изотипа
М антител.
1.3.2. Мультиплексное фенотипирование антигенов D, Fya и S красных клеток крови.
Принцип мультиплексного фенотипирования суммирован на фиг. с 5А по 5D.
В этом случае микросферы с участком 19, сенсибилизированные анти-D антителом, смешивают со
микросферами с участком 21, сенсибилизированными анти-Fya антителом, и также со микросферами с
- 12 -
017186
участком 71, сенсибилизированными анти-S антителом. Эта смесь микросфер инкубируется с красными
клетками крови, имеющими различные фенотипы по антигенам D, Fya и S: D+Fya+S+ / D+Fya-S- / DFya+S- / D-Fya-S- / D-Fya-S+ / D-Fya+S+ / D+Fya-S+ / D+Fya+S-. Применяется отношение числа красных
клеток крови к числу микросфер, равное 50.
Положительные значения сигнала в пределах от 13000 до 29000 RFI получают, когда данное антитело связывает красную клетку крови, имеющую соответствующую антигенную специфичность.
Абсолютная корреляция наблюдалась между измеряемыми флуоресцентными сигналами и фенотипом красных клеток крови, применяемых для выполнения теста.
Если микросфера, сенсибилизированная антителом, приводится в контакт с красной клеткой крови,
которая не несет соответствующий антиген, то получают сигнал менее чем 1000 RFI. Кроме того, контроли, выполненные для микросфер, не сенсибилизированных антителами, дают отрицательный сигнал,
вне зависимости от применяемых красных клеток крови.
Эти результаты демонстрируют, что измеряемые сигналы являются специфичными: связывание
микросферы и красной клетки крови происходит только в тех случаях, когда вовлекается пара антигенантитело.
Эти результаты, полученные с контрольными микросферами ISB 34 (11000 RFI) и ВВ 98 (менее чем
1000 RFI), подтверждают анализы.
Внутритестовые коэффициенты вариации составляют от 1% до 10%, что демонстрирует удовлетворительную воспроизводимость теста.
Эти результаты демонстрируют выполнимость мультиплексного фенотипирования красных клеток
крови с определением трех параметров, соответствующего технологии в соответствии с изобретением.
1.3.3. Мультиплексное фенотипирование красных клеток крови, позитивных по прямому тесту
Кумбса (CD+).
Применение мультиплексного подхода с использованием микросфер делает возможной идентификацию природы CD+ и фенотипирование красных клеток крови одновременно в соответствии с принципом, описанным на фиг. 6.
Микросферы с участком 32, сенсибилизированные анти-Fc антителом, смешиваются со микросферами с участками 19, 21 и 71, соответственно сенсибилизированными анти-D, анти-Fya и анти-S антителами. CD+ красные клетки крови, сенсибилизированные in vivo антителами, могут связываться с антителами против иммуноглобулина человека, которые несут микросферы с участком 32, делая, таким образом, возможной идентификацию параметра CD+. Кроме того, эти красные клетки крови могут также связываться с микросферами 19, 21 и 71, несущими антитела, специфичные для антигенов D, Fya и S, в соответствии со специфичными антигенами, присутствующими на мембранах красных клеток крови.
Этот подход был продемонстрирован с применением отношения количества красных клеток крови
к количеству микросфер порядка 40.
Контрольные микросферы ISB 34 и ВВ 98 дают ожидаемые значения сигналов, т.е. соответственно
порядка 13000 RFI и менее чем 1000 RFI, и подтверждают результаты. Две CD+ красные клетки крови
продуцируют позитивные сигналы, более 30000 RFI со микросферами с участком 32, сенсибилизированными антителом к иммуноглобулину человека. Две CD-негативные красные клетки крови продуцируют,
в свою очередь, негативные сигналы менее 500 RFI с микросферами с таким же участком. Эти результаты демонстрируют возможность идентификации CD+ красных клеток крови посредством их специфического связывания с применением антиглобулина, ранее связанного с микросферой с данным участком.
Кроме того, результаты также демонстрируют, что мультиплексное фенотипирование эритроцитарных
антигенов CD+ красных клеток крови может быть выполнено одновременно с идентификацией природы
CD+. Действительно, один из типов CD+ красных клеток крови фенотипирован как D+Fya-S-, а другой как D+Fya+S+. Фенотип S этих двух образцов верифицируется в соответствии с традиционным методом
с применением анти-S антител типа IgM. Полученные результаты превосходно коррелируют с результатами, полученными в соответствии с новым методом.
С одной стороны, в отношении фенотипа по антигену Fya, такой анализ не может быть выполнен.
Фактически не существует реагента типа IgM для фенотипирования красных клеток крови. Однако наблюдается различие для фенотипа Fya в соответствии с анализируемыми CD+ красными клетками крови,
которое подтверждает результаты и делает возможным исключение феномена неспецифического связывания.
Коэффициенты вариации для большинства образцов составляют от 1% до 5%, что показывает удовлетворительную воспроизводимость теста.
Пример 2. Выявление атипичных антител: единичная и мультиплексная методология.
Выявление атипичных антител (AAS), как правило, выполняется в соответствии с наиболее чувствительными способами (фильтрация через гель, выпускаемый компанией Bio-Rad в серии "ScanGel", выпускаемый компанией Diamed под названием "Diamed ID", или в соответствии с методологией иммуноадгезии в формате микропланшета, выпускаемом компанией Immucor, серия Capture). В первых двух
случаях применяются красные клетки крови, фенотип которых известен и которые инкубированы с сывороткой или плазмой, образец которой исследуется. Специфические антитела, возможно присутствую- 13 -
017186
щие, связываются с поверхностью красных клеток крови. Они затем выявляются с применением реагента, содержащего антитело к иммуноглобулину человека. В случае положительной реакции образуются
агглютинаты красных клеток крови. Если реакция негативная, красные клетки крови свободны и аггрегат
не формируется. Путем применения панелей красных клеток крови, которые имеют или не имеют различные антигены, затем возможно определение специфичности антител, присутствующих в образце.
Целью этой серии опытов является применение микросфер, на которых фенотипированные клетки
крови иммобилизованы посредством поли-L-лизина (PLL) для обнаружения антител группы крови типа
IgG, соответствующих технологии в соответствии с изобретением с применением проточного цитометра.
Конъюгат анти-Fc антител, меченных фикоэритрином (РЕ), применяется для обнаружения связанных
атипичных антител.
2.1. Материал и реагенты.
Флуоресцентные суперпарамагнитные микросферы, имеющие участки 17, 21, 32 и 36.
Микросферы хранят при + 4°С в буфере PBS, рН 7,4.
Контрольные флуоресцентные микросферы с участком 34 (микросферы внутреннего стандарта
(ISB)) и с участком 98 (пустые микросферы (ВВ)).
Поли-L-лизин (PLL) с молекулярной массой 70000-130000.
Моноклональное антитело типа IgG к иммуноглобулину человека, клон 125А15 (Bio-Rad), объединенное с фикоэритроном (РЕ) в соотношении 2 эквивалента антитела к эквиваленту РЕ.
Анти-D (клон H2D5D2F5) и анти-Fya (клон 5T72A13F5A93) моноклональные антитела типа IgG
(Bio-Rad).
Анти-RH1 (Национальный стандарт (Centre de Reference pour les Groupes Sanguins [Контрольный
центр групп крови], Франция).
Фенотипированные красные клетки крови, выпускаемые под названиями "ScanCell" и "ScanPanel"
для выявления атипичных антител (Bio-Rad).
Покрывающая жидкость или буфер (10 мМ фосфата натрия, 150 мМ NaCl, 0,1% (объемн.) проклина).
Бычий сывороточный альбумин (BSA) (Millipore).
Буфер PBS, рН 7,4 (7 мМ натрия фосфата, 2,7 мМ KCl, 136 мМ NaCl) .
2.2. Протокол.
2.2.1. Сенсибилизация микросфер посредством PLL.
Нейтральные микросферы с участками 17, 21, 32 и 36 инкубируют с 25 мкг/мл PLL и PBS, рН 7,4, в
течение 18 ч в при комнатной температуре и при перемешивании. В конце данной стадии микросферы
промывают в PBS, рН 7,4, и затем применяют для иммобилизации красных клеток крови.
2.2.2. Иммобилизация красных клеток крови на микросферах.
Реагенты красных клеток крови получают посредством смешивания покрытых PLL микросфер и
красных клеток крови при соотношении количества красных клеток крови к количеству микросфер, равному 100. Инкубация выполняется в PBS, рН 7,4, с перемешиванием в течение 5 мин при комнатной
температуре. Каждый участок микросферы применяется для иммобилизации одного типа красных клеток
крови известных и различающихся фенотипов. В конце этой стадии реагенты, включающие микросферуPLL-красную клетку крови, промывают PBS, рН 7,4, и затем дистиллированной водой. Полученные таким образом реагенты, включающие микросферу-PLL-красную клетку крови, хранят в PBS, рН 7,4, при
+4°С. Принцип иммобилизации красных клеток крови на микросферах посредством PLL суммирован на
фиг. 4.
Связывание красных клеток крови посредством PLL является достаточно прочным для того, что не
допускать их отделения во время экспериментов и анализов.
Перед инкубацией с выявляемыми антителами реагенты, включающие микросферу-PLL-красную
клетку крови, смешивают с контрольными микросферами с участком 34 (ISB) и с участком 98 (ВВ).
2.2.3. Реакция реагентов, включающих микросферу-PLL-красные клетки крови, с антителами.
В случае единичных реакций реагенты, включающие микросферу-красную клетку крови, применяются по отдельности и инкубируются с различными антителами для подтверждения специфичности реакций.
С целью выполнения мультиплексных реакций микросферы, сенсибилизированные различными
красными клетками крови известных фенотипов, смешивают и затем инкубируют с антителом или антителами, которые должны быть обнаружены.
Антитела, количество которых должно быть определено, разводят или в богатом белком буфере
(0,15 M NaCl, 60 г/л BSA), или в буфере PBS, рН 7,4, перед инкубацией с реагентами, включающими
микросферу-PLL-красную клетку крови.
Во всех случаях 125 мкл реагентов, включающих микросферу-PLL-красную клетку крови, смешивается со 125 мкл антител и затем инкубируется в течение 60 г минут с перемешиванием при 37°С. После
инкубации комплексы несколько раз промывают.
2.2.4. Обнаружение комплексов с применением меченых РЕ анти-Fc антител.
Для обнаружения комплексов микросфера-PLL-красная клетка крови-антитело применяют антите- 14 -
017186
ло, специфичное для фрагмента Fc иммуноглобулинов человека и меченое РЕ. Этот конъюгат антител
применяется в концентрации 60 мкг/мл в PBS с рН 7,4, и инкубируется с комплексами в течение 15 мин
при 37°С при перемешивании. Комплексы затем промывают дистиллированной водой.
2.2.5. Измерения.
После окончательного промывания и перед измерениями комплексы переводят в 185 мкл покрывающей жидкости. Для каждого исследования 25 мкл суспензии впрыскивается в аппарат. Измерения
выполняются посредством регистрации флуоресценции от 250 микросфер каждого вида.
Для каждой серии опытов выполняются систематические контроли для верификации специфичности исследуемых реакций. Для каждого исследуемого антитела выполняется отрицательный контроль с
применением фенотипированных красных клеток крови, не имеющих соответствующей антигенной специфичности.
2.3. Примеры простого/мультиплексного AAS.
2.3.1. Мультиплексное обнаружение анти-D моноклонального антитела в богатой белком среде.
Антитело обнаруживают с применением смеси микросфер с различными участками, сенсибилизированных красными клетками крови известных фенотипов.
Микросферы с участком 17, покрытые PLL, применялись для иммобилизации красных клеток крови, фенотипированных D, СС, ее. Красная клетка крови фенотипа D, сс, ЕЕ иммобилизуется на микросферах с участком 32, и красная клетка крови фенотипа d, сс, ее иммобилизуется на микросферах с участком 36.
Микросферы с участком 36, покрытые D-негативными красными клетками крови, применяют в качестве отрицательного контроля для подтверждения специфичности реакции.
Сенсибилизированные микросферы смешивают и затем инкубируют с анти-D моноклональным антителом, полученным в различных концентрациях в буфере с 0,15 М NaCl, 60 г/л BSA. Обнаружение выполняется с применением меченного РЕ конъюгата анти-Fc антител.
Принцип этого подхода суммирован на фиг. 7.
Результаты представлены на фиг. 8.
Наблюдения показывают, что ответ относительно красных клеток крови, которые не имеют антигена D (микросфера 36), демонстрирует значение, меньшее или равное 1000 RFI, которое соответствует
негативным ответам. С другой стороны, для микросфер, несущих красные клетки крови, имеющие антигены D (микросферы 32 и 17), полученные значения гораздо выше (порядка от 2000 до более чем 7000
RFI). Кроме того, положительные значения сигнала коррелируют с концентрацией вовлеченного анти-D
антитела, причем предел обнаружения, соответствующий этому формату, составляет приблизительно 5
нг/мл.
Для одной и той же концентрации анти-D антитело отмечаются вариации позитивного ответа, соответствующие фенотипу красных клеток крови, присоединенных к поверхности микросфер. Этот феномен
известен в иммунной гематологии и имеет отношение к различиям в экспрессии D-антигена. Эти результаты демонстрируют специфичность обнаружения, выполняемого в рассматриваемом мультиплексном
формате.
Кроме того, контрольные микросферы с участком 34 и 98 показывают ожидаемые уровни сигнала,
т.е., соответственно, порядка 11000 RFI и менее чем 1000 RFI.
2.3.2. Единичное обнаружение контрольного анти-D поликлонального антитела в сыворотке сравнения.
Для выполнения единичного обнаружения анти-D антитела в богатой белком среде, которая близка
к плазме, применяется национальный контрольный анти-D стандарт CNRGS [Национального контрольного центра групп крови].
Красные клетки крови с фенотипом D, сс, ЕЕ были иммобилизированы на микросферах с участком
32. Отрицательный контроль выполняется отдельно с применением красных клеток крови с фенотипом
d, cc, ее, иммобилизованных на микросферах с участком 21. Стандарт разводят в буфере с 0,15 М NaCl,
содержащем 60 г/л BSA.
Результаты, представленные на фиг. 9, показывают, что контрольное антитело может быть обнаружено в концентрации менее чем 1 нг/мл в присутствии красных клеток крови фенотипа RH D. Динамический диапазон расширяется линейно до по меньшей мере 100 нг/мл, причем результаты, полученные в
присутствии микросфер, несущих RH D-негативные красные клетки крови, составляют менее 650 RFI.
Значения для контрольных микросфер (ISB и ВВ) делают возможным подтверждение наблюдаемх
результатов.
2.3.3. Мультиплексное обнаружение нескольких моноклональных антител группы крови.
В этом случае микросферы с участком 17 сенсибилизируют красными клетками крови с фенотипом
D, СС, ее, Fya-b+, микросферы с участком 32 сенсибилизируют красными клетками крови с фенотипом
dd, сс, ее, Fya+b- и микросферы с участком 21 сенсибилизируют красными клетками крови с фенотипом
D, сс, ЕЕ, Fya-b+.
3 типа микросфер смешивают и затем инкубируют с анти-D и анти-Fya моноклональными антителами, применяемыми по отдельности или в виде смеси. Все стадии выполняются в PBS, рН 7,4. Принцип
- 15 -
017186
этого подхода представлен на фиг. 10.
Микросферы внутреннего контроля с участками 34 и 98 дают ожидаемые уровни сигнала, т.е., соответственно, порядка 11000 RFI и менее чем 1000 RFI. Наблюдалась полная корреляция между фенотипом красных клеток крови, применяемых во время сенсибилизации микросфер, и антителами, присутствующими в реакционных смесях. Так, положительный сигнал порядка от 6000 до 25000 RFI наблюдается
в тех случаях, когда анти-D и анти-Fya антитела инкубируют в присутствии красных клеток крови, несущих соответствующие антигены. Инкубация антител с красными клетками крови, не несущими соответствующих антигенов, приводит к получению негативного сигнала менее 1000 RFI. Реакции являются
специфическими.
Эти результаты демонстрируют применимость рассматриваемого подхода для выполнения мультиплексного обнаружения нескольких антител, присутствующих в одном и том же образце.
Пример 3. Исследование перекрестной совместимости крови донора и реципиента.
Целью этого исследования является удостовериться в том, что в контексте трансфузии одного или
более концентратов клеток крови донора реципиенту имеется полная совместимость донора и реципиента и, при необходимости, демонстрировать несовместимость, связанную с присутствием антител в плазме реципиента, направленных на структуры группы крови, которые несут красные клетки крови донора(доноров). Для того чтобы продемонстрировать возможность выполнения определения перекрестной
совместимости в технологии по данному изобретению, применяют флуоресцентные микросферы для
иммобилизации красных клеток крови донора посредством поли-L-лизина (PLL). Эта иммобилизация
выполняется посредством простого контакта между микросферами и красными клетками крови донора, в
течение минимального количества времени (5 мин) и без подготовки. Эти микросферы затем помещают в
плазму или сыворотку пациента. Возможное наличие антител реципиента, направленных на антигены
донора, определяют с применением конъюгата анти-Fc антител, меченного фикоэритрином (РЕ).
3.1. Материалы и реагенты.
Флуоресцентные суперпарамагнитные микросферы, имеющие участок 38.
Микросферы хранят при +4°С в буфере PBS, рН 7,4.
Контрольные флуоресцентные микросферы с участком 34 (микросферы внутреннего стандарта
(ISB)) и участком 98 (пустые микросферы (ВВ)).
Поли-L-лизин (PLL) с молекулярной массой 70000-13000.
Моноклональное антитело типа IgG мыши к IgG человека, клон 125А15 (Bio-Rad), связанное с фикоэритрином (РЕ) с соотношением 2 эквивалента антител на эквивалент PE.
Фенотипированные концентраты клеток крови, консервированные в среде SAG-MAN (EFS Nord de
France).
Растворяющая среда, выпускаемая под названием "ScanLiss" код 86442, компанией Bio-Rad
Покрывающая жидкость или буфер (10 мМ фосфата натрия, 150 мМ NaCl, 0,1% (объемн.) проклина).
Бычий сывороточный альбумин (BSA) (Millipore).
Буфер PBS, рН 7,4 (7 мМ натрия фосфата, 2,7 мМ KCl, 136 мМ NaCl).
3.2. Протокол.
3.2.1. Сенсибилизация микросфер посредством PLL.
Реагент, включающий микросферы-PLL, получают посредством инкубации нейтральных микросфер с участком 38 с 50 мкг/мл PLL в PBS, рН 7,4, в течение 18 часов при комнатной температуре и при
перемешивании. В конце этой стадии реагент, включающий микросферу-PLL, промывается буфером
PBS, рН 7,4, и затем применяется для иммобилизации красных клеток крови донора.
3.2.2. Не требующая специальной подготовки иммобилизация красных клеток крови донора на
микросферах.
Реагент, содержащий микросферы-PLL, приводится в контакт с красными клетками крови различных доноров, причем клетки каждого донора обрабатывают отдельно.
Двадцать пять микролитров реагента, содержащего микросферы-PLL, смешивают с 25 мкл красных
клеток крови донора, разведенных в ScanLiss, при отношении количества красных клеток крови к количеству микросфер, равному 100. Инкубация выполняется при перемешивании в течение 5 мин при комнатной температуре.
После инкубации комплексы микросферы-PLL-красные клетки крови промывают несколько раз
дистиллированной водой и затем помещают в 25 мкл PBS-BSA с концентрацией 10 г/л, рН 7,4.
Принцип иммобилизации красных клеток крови на микросферах посредством PLL суммирован на
фиг. 4.
Присоединение красных клеток крови посредством PLL является достаточно прочным для предотвращения их отделения во время теста и исследований.
Полученные таким образом комплексы микросфера-PLL-красная клетка крови и контрольные микросферы с участком 34 и участком 98 затем инкубируются с исследуемыми образцами.
3.2.3. Реакция комплексов, состоящих из микросферы-PLL-красной клетки крови с антителами.
Двадцать пять микролитров комплекса микросфера-PLL-красная клетка крови смешивают с 50 мкл
- 16 -
017186
исследуемой плазмы или сыворотки пациента и инкубируют в течение 15 мин с перемешиванием при
37°С. После инкубации комплексы промывают несколько раз буфером PBS, рН 7,4.
3.2.4. Визуализация комплексов анти-Fc антителами, мечеными РЕ.
Для обнаружения комплексов, включающих микросферу-PLL-красную клетку крови-антитело,
применяется меченое РЕ антитело, специфичное для фрагмента Fc иммуноглобулина человека. Этот
конъюгат антител применяется в концентрации 5 мкг/мл в PBS, рН 7,4, и инкубируется с комплексами в
течение 15 минут при 37°С с перемешиванием. Комплексы затем несколько раз промывают буфером
PBS, рН 7,4.
3.2.5. Измерения путем проточной цитометрии с применением аппарата "Bioplex 200" компании
Bio-Rad.
После окончательного промывания и перед измерениями комплексы помещают в 35 мкл покрывающей жидкости. Для каждого теста 25 мкл суспензии впрыскивается в аппарат. Измерения выполняются посредством регистрации флуоресценции 250 микросфер каждого вида.
Применялись красные клетки крови различных доноров. Для каждого донора красных клеток крови
отрицательные контроли выполнялись для подтверждения специфичности исследуемых реакций.
3.3. Пример исследования перекрестной совместимости.
Микросферы с участком 38, покрытые PLL, применялись для иммобилизации красных клеток крови
от трех различных доноров: один донор с фенотипом D, cc, kk, SS, один донор с фенотипом dd, CC, kk и
один донор с фенотипам dd, cc, K+, ss. Каждая пара донор-реципиент исследовалась отдельно. Сенсибилизированные микросферы инкубировались с различными сыворотками, которые демонстрируют реакции анти-D, анти-с, анти-K или анти-S. Эти сыворотки представляли сыворотки реципиентов, которые
потенциально могут показывать несовместимость крови донора и реципиента с выбранными красными
клетками крови донора. Эти сыворотки выбирают таким образом, чтобы они реагировали с антигенными
системами крови, которые отличаются как по структуре, так и по презентации антигенов, а также по
плотности расположения антигена на красной клетке крови.
Образцы плазмы двенадцати доноров также исследовались и применялись в качестве отрицательного контроля для подтверждения специфичности реакции.
Обнаружение выполнялось с применением конъюгата меченых РЕ антител против Fc.
Все результаты представлены в табл. I ниже.
Таблица I. Перекрестная совместимость
Образцы плазмы 12 доноров дают возможность определения среднего отрицательного значения менее 1100 RFI.
Сыворотки, которые не показали несовместимости с красными клетками крови донора, дают значения менее 1000 RFI и отношение значения для образца к среднему отрицательному значению, близкое к
1. С другой стороны, сыворотки, для которых выявлена несовместимость с красными клетками крови
донора, показывают результаты порядка 3000-27000 RFI и отношение значения для образца к среднему
отрицательному значению порядка 3-27.
Кроме того, контрольные микросферы с участком 34 и 98 дают ожидаемые значения сигналов, т.е.,
соответственно, порядка 8000 RFI и менее 1000 RFI.
Этот способ дает возможность ясно продемонстрировать несовместимость донора и реципиента по
различным системам группы крови, таким как Резус, Kell или MNS.
Пример 4. Обратный тест определения группы крови по системе АВО ("сывороточный" или "Simonin").
Цель этого исследования показать наличие или отсутствие в образце крови природных антител, направленных против антигенов группы крови А и/или В. Результат этого анализа, комбинированный с
результатом, полученным в прямом тесте, делает возможным установление группы крови образца по
- 17 -
017186
системе АВО. Образец, применяемый в обратном тесте определения группы крови по системе АВО, может представлять собой сыворотку, плазму или образец цельной крови.
Для демонстрации возможности выполнения такого определения группы крови с применением технологии по данному изобретению на флуоресцентных микросферах иммобилизуются красные клетки
крови известной группы по системе АВО посредством поли-L-лизина (PLL).
Эти микросферы затем приводятся в контакт с исследуемым образцом. Наличие антител выявляется
с применением конъюгата антител против иммуноглобулина человека, меченного фикоэритрином (РЕ).
4.1. Материалы и реагенты.
Флуоресцентные суперпарамагнитные микросферы, имеющие участки 38 и 71.
Микросферы хранят при +4°C в буфере PBS, рН 7,4.
Контрольные флуоресцентные микросферы с участком 34 (микросферы внутреннего стандарта
(ISB)) и участком 98 (пустые микросферы (ВВ)).
Поли-L-лизин (PLL) с молекулярной массой 70000-13000.
Поликлональное антитело козы к IgM человека, 7374V (Bio-Rad), связанное с фикоэритрином (РЕ).
Красные клетки крови группы А и группы В из образца, помещенного в ЭДТА (EFS-Rungis).
Образцы плазмы и цельной крови из образца, к которому добавлен ЭДТА (EFS-Rungis).
Среда для разведения, выпускаемая под названием "ScanLiss", код 86442 компанией Bio-Rad.
Покрывающая жидкость или буфер (10 мМ фосфата натрия, 150 мМ NaCl, 0,1% (объемы.) проклина).
Бычий сывороточный альбумин (BSA) (Millipore).
Буфер PBS, рН 7,4 (7 мМ фосфата натрия, 2,7 мМ KCl, 136 мМ NaCl).
4.2. Протокол.
4.2.1. Сенсибилизация микросфер с применением PLL.
Нейтральные микросферы с участком 38 и участком 71 инкубируют с 50 мкг/мл PLL в буфере PBS,
рН 7,4, в течение 18 часов при комнатной температуре и при перемешивании. В конце этой стадии микросферы промывают буфером PBS, рН 7,4 и затем применяют для иммобилизации красных клеток крови.
4.2.2. Иммобилизация красных клеток крови из образцов на микросферах.
Реагенты, включающие микросферу-красную клетку крови, получают посредством смешивания покрытых PLL микросфер и красных клеток крови, разведенных ScanLiss, при отношении количества красных клеток крови к количеству микросфер, равном 100. Инкубация выполняется с перемешиванием в
течение 5 мин при комнатной температуре.
Микросферы одного вида применяются для иммобилизации определенного типа красных клеток
крови известной группы.
В конце этой стадии реагенты, содержащие микросферу-PLL-красную клетку крови, промывают
несколько раз дистиллированной водой. Реагенты, включающие микросферу-красную клетку крови, полученные таким образом, хранят в PBS с концентрацией BSA 10 г/л, рН 7,4, при +4°С.
Принцип иммобилизации красных клеток крови на микросферах посредством PLL суммирован на
фиг. 4.
Присоединение красных клеток крови посредством PLL является достаточно прочным для предотвращения их отделения во время тестов и исследований.
Перед инкубацией с выявляемыми антителами реагенты, содержащие микросферу-PLL-красную
клетку крови, смешивают с контрольными микросферами с участком 34 (ISB) и участком 98 (ВВ).
4.2.3. Реакция реагентов, содержащих микросферы-PLL-красные клетки крови, с антителами.
Исследуемый образец в этом случае представляет собой или плазму, или образец цельной крови.
Двадцать пять микролитров реагента, содержащего микросферы-PLL-красные клетки крови, смешивают с 50 мкл исследуемого образца и инкубируют в течение 15 мин с перемешиванием при 22°С.
После ицкубации комплексы промывают несколько раз буфером PBS, рН 7,4.
4.2.4. Визуализация комплексов с применением меченых РЕ антител против иммуноглобулина.
Для обнаружения комплексов, включающих микросферы-PLL-красные клетки крови-антитела,
применяется меченое РЕ антитело, специфичное для иммуноглобулина человека. Этот конъюгат антител
применяется в концентрации 5 мкг/мл в PBS, рН 7,4, и инкубируется с комплексами в течение 15 мин
при 37°С с перемешиванием. Комплексы затем промывают несколько раз буфером PBS, рН 7,4.
4.2.5. Измерения методом проточной цитометрии с применением аппарата "Bioplex 200" компании
Bio-Rad.
После окончательного промывания и перед измерениями комплексы помещают в 35 мкл покрывающей жидкости. Для каждого теста 25 мкл суспензии впрыскиваются в аппарат. Измерения выполняются посредством регистрации флуоресценции 250 микросфер каждого типа.
Применяются различные красные клетки крови известных групп. Для каждого типа красной клетки
крови выполнялись отрицательные контроли для подтверждения специфичности исследуемых реакций.
4.3. Пример сывороточного теста на определение группы крови по системе АВО в образцах плазмы
или образцах цельной крови.
Антитела определяют с применением нескольких видов микросфер с различными участками, сен- 18 -
017186
сибилизированных красными клетками крови известных и различающихся групп. Микросферы с участком 38, покрытые PLL, применяют для иммобилизации красных клеток крови группы А. Микросферы с
участком 71, покрытые PLL, применяют для иммобилизации красных клеток крови группы В.
Сенсибилизированные микросферы смешивают и затем инкубируют с образцами плазмы или цельной крови групп А, В, АВ и О для определения положительных и отрицательных случаев; отрицательные
случаи дают возможность подтверждения специфичности реакции для каждого реагента, включающего
микросферы-PLL-красные клетки крови. Обнаружение выполнялось с применением меченного РЕ конъюгата антител против иммуноглобулина человека.
Результаты представлены в табл. II ниже.
Таблица II. Сывороточный тест определения группы крови по системе АВО в образцах плазмы или образцах цельной крови
Образцы, которые не содержат антител против присутствующих красных клеток крови (реагент,
включающий микросферы-PLL-красные клетки крови), показывают значения менее 1000 RFI.
С другой стороны, для образцов, которые имеют антитела против присутствующих красных клеток
крови, полученные значения более высокие (от 2900 до 19000 RFI).
Эти результаты получают для любого типа образца, является ли он образцом типа плазмы или типа
цельной крови.
Кроме того, контрольные микросферы с участками 34 и 98 показывают ожидаемые значения сигналов, т.е., соответственно, порядка 8000 RFI и менее 1000 RFI.
Эти результаты демонстрируют обоснованность рассматриваемого подхода для обнаружения природных антител в образце плазмы или цельной крови.
Пример 5. Определение группы крови в образце цельной крови.
Возможность выполнения определения групп красных клеток крови посредством технологии по
данному изобретению демонстрируется в примере 1 с применением флуоресцентных микросфер для иммобилизации антител против красных клеток крови и посредством мечения красных клеток крови образца флуоресцентным соединением, соответсвующим длинам волн репортерного лазера аппарата "Bioplex
200" (Bio-Rad).
Целью этих тестов является показать, что образец, применяемый в определении групп крови, может
представлять собой не только образец осадка клеток крови, но также и образец цельной крови.
5.1. Материалы и реагенты.
Флуоресцентные суперпарамагнитные микросферы, имеющие участки 36 и 52 .
Микросферы хранят при +4°С в буфере PBS, рН 7,4.
Контрольные флуоресцентные микросферы с участком 34 (микросферы внутреннего (ISB)) и участком 98 (пустые микросферы (ВВ)).
Поликлональные антитела козы против мышиного IgG, код 115-005-164 (Jackson ImM. Lab.)
Поликлональные антитела козы против мышиного IgM, код 115-005-020 (Jackson ImM. Lab.)
Моноклональное антитело типа IgG против антигена В, клон Х9 (Bio-Rad).
Моноклональное антитело типа IgM против антигена А, клон 15750F7 (Bio-Rad).
Образцы осадка клеток крови и цельной крови, помещенные в ЭДТА (EFS-Rungis).
Набор для мечения клеток PKH26 (Sigma).
Среда для разведения, выпускаемая под названиями "ScanLiss" код 86442 и "Stabiliss" код 86550
компанией Bio-Rad.
Покрывающая жидкость или буфер (10 мМ фосфата натрия, 150 мМ NaCl, 0,1% (объемн.) проклина.
Бычий сывороточный альбумин (BSA) (Millipore).
Буфер PBS, рН 7.4 (7 мМ фосфата натрия, 2,7 мМ KCl, 136 мМ NaCl).
5.2. Протокол.
- 19 -
017186
5.2.1. Сенсибилизация микросфер с антителами, направленными против антигенов группы крови.
Принцип иммобилизации антител на поверхности микросфер суммирован на фиг. 2.
Микросферы с участком 36 применяются для ковалентной иммобилизации антител против мышиного IgG.
Флуоресцентные микросферы с участком 52 применяются для ковалентной иммобилизации антител
против мышиного IgM.
Карбоксильные группы, присутствующие на поверхности микросфер, активируют в соответствии с
методом, включающим в себя гидроксисукцинимид и карбодиимид.
Белки могли бы быть, следовательно, иммобилизованы посредством своих аминогрупп. Полученные таким образом микросферы хранят при +4°С в концентрации 3 мг/мл в PBS, рН 7,4, содержащем,
10% (мас./об.) BSA, 0,5% (об.) Tween 20 и 0,09% (мас./об.) азида натрия.
Микросферы, несущие иммобилизованные антитела к мышиному IgG, могут быть сенсибилизированы антителами к антигену В. Микросферы, несущие иммобилизованные антитела к мышиному IgM,
могут быть сенсибилизированы антителами к антигену А. Антитела к иммуноглобулину фактически делают возможным связывание посредством своего фрагмента Fc. Антитела против красных клеток крови,
следовательно, иммобилизованы нековалентно на микросферах с применением этого принципа. Каждый
участок микросферы сенсибилизирован антителом отличающейся специфичности. Выбранные антитела
против иммуноглобулинов имеют высокую аффинность к мышиным иммуноглобулинам, обеспечивая,
таким образом, стабильность связывания во времени.
Неочищенные анти-А антитела и неочищенные анти-В антитела применяются в соответствующих
конечных концентрациях 165 и 640 мкг/мл с микросферами, функция которых обеспечена анти-Fc антителами в концентрации 40 мкг/мг. Сенсибилизация антителами против красных клеток крови выполняется в буфере PBS, рН 7,4, с перемешиванием при 37°С в течение одного часа.
После сенсибилизации микросферы промывают несколько раз буфером PBS, рН 7,4, и затем хранят
при +4°С в StabiLiss.
Перед инкубацией с красными клетками крови микросферы, сенсибилизированные антителами
против красных клеток крови, смешивают с контрольными микросферами с участком 34 (ISB) с участком 98 (ВВ).
5.2.2. Мечение красных клеток крови.
Мечение красных клеток крови выполняется, как в примере 1 с применением PKH26 (фиг. 3). Мечение красных клеток крови PKH26 выполняется с применением протокола, рекомендованного производителем. Меченые таким образом красные клетки крови или разбавляются непосредственно буфером
Stabiliss в случае образца осадка клеток крови, или разбавлены до 40% (объемн.) своей плазмой перед
разбавлением в StabiLiss в случае образца цельной крови. Разбавленные образцы хранят в темноте при
+4°С.
5.2.3. Инкубация микросфер, несущих антитела к красным клеткам крови, с красными клетками
крови.
Исследуемый образец в этом случае является либо осадком клеток крови, либо цельной кровью, с
содержанием красных клеток крови, доходящим до 40%.
Сенсибилизированные микросферы смешивают с образцами для получения отношения числа красных клеток крови к количеству сенсибилизированных микросфер от 50 до 100. Инкубация смеси выполняется в буфере StabiLiss в течение 15 мин с перемешиванием при 22°С.
После инкубации комплексы микросфер красных клеток крови несколько раз промывают дистиллированной водой.
5.2.4. Измерения методом проточной цитометрии с применением аппарата "Bioplex 200" компании
Bio-Rad.
После окончательного промывания и перед измерениями комплексы помещают в 35 мкл покрывающей жидкости. Для каждого теста 25 мкл суспензии впрыскивают в аппарат. Измерения выполняются посредством регистрации флуоресценции 250 микросфер каждого типа.
Для каждой сенсибилизированной микросферы негативные образцы тестируются для подтверждения специфичности исследуемых реакций.
5.3. Пример мультиплексного определения группы крови образцов типа осадка клеток крови или
типа цельной крови.
Принцип мультиплексного определения группы крови суммирован на фиг. 11.
Микросферы с участком 36, сенсибилизированные анти-В антителами, смешивают со микросферами с участком 52, сенсибилизированными анти-А антителами, с контрольными микросферами ISB с участком 34 и с контрольными микросферами ВВ с участком 98.
Эта смесь микросфер инкубируется с образцами групп О, А, В или АВ, с отношением количества
красных клеток крови к количеству сенсибилизированных микросфер приблизительно 50.
Результаты представлены в табл. III ниже.
- 20 -
017186
Таблица III. Мультиплексное определение группы крови в образцах типа осадка клеток крови или типа
цельной крови
С реагентом, содержащим микросферы-антитела к антигену А, А-позитивные красные клетки крови
продуцируют сигнал более 30000 RFI, тогда как А-негативные красные клетки крови показывают сигнал
от 30 до 50 RFI. Подобным образом с реагентом, содержащим микросферы-антитела к антигену В, Впозитивные красные клетки крови продуцируют сигнал более 30000 RFI, тогда как В-негативные красные клетки крови дают сигнал от 30 до 50 RFI.
Эти результаты получают для образцов любого типа, находятся ли они в виде осадка клеток крови
или в виде цельной крови. Кроме того, контрольные микросферы с участками 34 и 98 показывают ожидаемые значения сигнала, т.е., соответственно, порядка 7500 RFI и менее 1000 RFI.
Эти результаты демонстрируют значимость рассматриваемого подхода для выполнения определения группы крови в образце осадка клеток крови или образце цельной крови.
Пример 6. Обнаружение и идентификация атипичных антител - мультиплексная методология с
применением идентификационной панели 10 типов красных клеток крови.
Обнаружение атипичных антител (AAS) выполняется, как правило, в 2 этапа: первый этап выполняется на ограниченной панели красных клеток крови, и его целью является индикация наличия или отсутствия атипичных антител, направленных против антигенов группы крови, без возможности их идентификации. Когда определено наличие антител, выполняется вторая стадия для идентификации специфичности рассматриваемого антитела или антител.
Этот второй этап с панелью из 10 типов красных клеток крови или более, в зависимости от сложности смеси идентифицируемых антител. Для выполнения двух этапов необходим образец объемом, по
меньшей мере, 350 мкл. Целью этого теста является показать выполнимость идентификации атипичных
антител, возможно присутствующих в образце, непосредственно в единственном тесте и с единственным
исследуемым образцом исследуемой плазмы или сыворотки (от 50 до 100 мкл).
Для демонстрации выполнимости этого исследования в технологии по данному изобретению флуоресцентные микросферы применяются для иммобилизации красных клеток крови панели посредством
поли-L-лизина (PLL). Применяется столько типов микросфер, сколько в панели типов красных клеток
крови, причем каждый участок микросферы применяется для иммобилизации единственного типа красных клеток крови панели, имеющего известный и отличный от других фенотип.
Эти микросферы перемешивают и приводят в контакт с исследуемым образцом, и атипичные антитела определяются с применением конъюгата антител против иммуноглобулина человека, меченного
фикоэритрином (РЕ).
6.1. Материалы и реагенты.
Флуоресцентные суперпарамагнитные микросферы, имеющие участки 6, 8, 36, 38, 52, 71, 79, 81, 94
и 96.
Микросферы хранят при +4°С в буфере PBS, рН 7,4.
Контрольные флуоресцентные микросферы с участком 34 (микросферы внутреннего стандарта
(ISB)) и участком 98 (пустые микросферы (ВВ)).
Поли-L-лизин(PLL) с молекулярной массой 70000-130000.
Моноклональные антитела мыши типа IgG к иммуноглобулину человека, клон 125А15 (Bio-Rad),
связанные с фикоэритрином (РЕ).
Концентраты фенотипированных клеток крови, которые хранят в среде SAG-MAN (EFS Nord de
France).
- 21 -
017186
Среда для разведения, выпускаемая под названием "ScanLiss" код 86442 компанией Bio-Rad.
Покрывающая жидкость или буфер (10 мМ фосфата натрия, 150 мМ NaCl, 0,1% (объемн.) проклина).
Бычий сывороточный альбумин (BSA) (Millipore).
Буфер PBS, рН 7,4 (7 мМ фосфата натрия, 2,7 мМ KCl, 136 мМ NaCl).
Образец плазмы в ЭДТА (EFS-Rumgis).
Образцы сыворотки, содержащие атипичные антитела группы крови со следующей специфичностью: анти-D, анти-Jka, анти-Kell.
6.2. Протокол.
6.2.1. Сенсибилизация микросфер с применением PLL.
Реагент, включающий микросферы-PLL, получают посредством инкубации нейтральных микросфер с участками 6, 8, 36, 38, 52, 71, 79, 81, 94 или 96 с 50 мкг/мл PLL в PBS, рН 7,4, в течение 18 ч при
комнатной температуре и перемешивании. В конце этой стадии комплекс микросфера-PLL промывается
буфером PBS, рН 7,4, и затем применяется для иммобилизации красных клеток крови донора.
6.2.2. Иммобилизация красных клеток крови на микросферах.
Реагенты, содержащие микросферы-PLL-красные клетки крови, получают смешиванием покрытых
PLL микросфер и красных клеток крови панели, разбавленных ScanLiss, при отношении количества
красных клеток крови к количеству микросфер, равному 100. Инкубация выполняется с перемешиванием
в течение 5 мин при комнатной температуре. Десять типов красных клеток крови с известным и отличным от других фенотипом применяют для составления идентификационной панели. Каждый участок
микросферы применяют для иммобилизации единственного типа красных клеток крови этой панели.
После инкубации реагенты, содержащие микросферы-PLL-красные клетки крови, промывают несколько раз дистиллированной водой и затем помещают в PBS с BSA в концентрации 10 г/л, рН 7,4.
Принцип иммобилизации красных клеток крови на микросферах посредством PLL суммирован на
фиг. 4.
Присоединение красных клеток крови посредством PLL является достаточно прочным для предотвращения их отделения во время остальных тестов и анализов.
Реагенты, содержащие микросферы-PLL-красные клетки крови, полученные таким образом, и контрольные микросферы с участком 34 и участком 98 смешивают и затем инкубируют с исследуемыми
образцами.
6.2.3. Реакция реагентов, содержащих микросферы-PLL-красные клетки крови, с антителами.
Смесь реагентов, содержащих микросферы-PLL-красные клетки крови, полученных по отдельности
для различных красных клеток крови, составляет панель для идентификации антител. 25 мкл этой панели
смешивают со 100 мкл исследуемого образца (плазмы или сыворотки) и инкубируют в течение 15 мин с
перемешиванием при 37°С.
После инкубации комплексы несколько раз промывают буфером PBS, рН 7,4.
6.2.4. Визуализация комплексов с применением меченых РЕ анти-Fc антител.
Для обнаружения комплексов микросферы-PLL-красные клетки крови-антитела применяется меченое РЕ антитело, специфичное для фрагмента Fc иммуноглобулина человека. Этот конъюгат антител
применяется в концентрации, 1 мкг/мл в PBS, рН 7,4, инкубируется с комплексами в течение 15 мин при
37°С с перемешиванием. Комплексы затем несколько раз промывают буфером PBS, рН 7,4.
6.2.5. Измерения посредством проточной цитометрии с применением аппарата "Bioplex 200" компании Bio-Rad.
После окончательного промывания и перед измерениями комплексы помещают в 35 мкл покрывающей жидкости. Для каждого теста 25 мкл суспензии впрыскивается в аппарат. Измерения выполняются посредством регистрации флуоресцентного сигнала от 250 микросфер каждого типа.
6.3. Пример AAS для идентификации и специфичности атипичных антител в плазме и/или сыворотке.
Покрытые PLL микросферы с различными участками применяются для иммобилизации 10 типов
красных клеток крови, известных и отличных от других фенотипов: красная клетка крови с фенотипом
D, kk, Jka+b+ иммобилизована на микросферах с участком 6, красная клетка крови с фенотипом D, Kk,
Jka+b- на микросферах с участком 8, красная клетка крови с фенотипом D, kk, Jka+b- на микросферах с
участком 36, красная клетка крови с фенотипом D, kk, Jka+b- на микросферах с участком 38, красная
клетка крови с фенотипом D, Kk, Jka+b+ на микросферах с участком 52, красная клетка крови с фенотипом dd, Kk, Jka-b+ на микросферах с участком 71, красная клетка крови с фенотипом dd, kk, Jka-b+ на
микросферах с участком 79, красная клетка крови с фенотипом dd, Kk, Jka+b+ на микросферах с участком 81, красная клетка крови с фенотипом dd, kk, Jka-b+ на микросферах с участком 94, красная клетка
крови с фенотипом dd, kk, Jka+b+ на микросферах с участком 96.
Сенсибилизированные микросферы перемешивают и затем инкубируют с различными сыворотками, имеющими атипичные антитела группы крови с различной специфичностью (анти-D, анти-Kell, анти-Jka), или смесями этих сывороток так, чтобы воспроизвести смесь антител. Эти сыворотки представляют положительные образцы, которые могут потенциально иметь антитела, направленные против крас- 22 -
017186
ных клеток крови панели. Их выбирают для обнаружения систем антигенов крови, которые отличаются
по структуре и презентации антигена, и также по плотности его расположения на красных клетках крови.
Восемь образцов донорской плазмы, не содержащих атипичных антител, также исследовались и
применялись в качестве отрицательных контролей для подтверждения специфичности реакции.
Обнаружение выполнялось с применением меченного РЕ конъюгата антител против фрагмента Fc
человека.
Результаты представлены в таблице IV ниже.
8 образцов донорской плазмы делают возможным определение среднего отрицательного значения
менее 1100 RFI.
Сыворотки, которые не имеют антител, направленных против красных клеток крови панели, дают
значения менее 1000 RFI.
С другой стороны, сыворотки, которые содержат антитела, направленные против антигенов, которые несут красные клетки крови панели, показывают результаты порядка 2000-31000 RFI и отношений
значения для образца к среднему отрицательному значению порядка 15-207.
Кроме того, контрольные микросферы с участком 34 и с участком 98 дают ожидаемые уровни сигнала, т.е. соответственно порядка 8000 RFI и меньшие или равные 1000 RFI.
Этот способ дает возможность ясно продемонстрировать наличие атипичных антител и идентифицировать их специфичность в различных системах групп крови, таких как Резус, Kell или Kidd.
Таблица IV. AAS для идентификации специфичности атипичных антител в плазме и/или сыворотке
Пример 7. Тест для определения группы клеток крови по системе АВО и сывороточный тест для
определения группы крови по системе АВО, выполняемые одновременно, комбинация антиген-антитело.
Возможность обнаружения антигенов красных клеток крови с применением технологии по данному
изобретению демонстрируется в примерах 1 и 3 посредством применения флуоресцентных микросфер
для иммобилизации антител к красным клеткам крови и посредством мечения красных клеток крови образца флуоресцентным соединением, совместимым с длиной волны репортерного лазера аппарата "Bioplex 200" (Bio-Rad). Подобным образом возможность обнаружения типичных и атипичных антител с
применением технологии по данному изобретению демонстрируется в примерах 2, 4 и 6 с применением
флуоресцентных микросфер для иммобилизации красных клеток крови посредством поли-L-лизина
(PLL) и определения наличия в образце антител против присутствующих красных клеток крови с применением конъюгата антител против иммуноглобулина человека, меченного фикоэритрином (РЕ). Целью
этих тестов является показать, что технология по данному изобретению делает возможным определение
антигенов и антител в одной и той же емкости.
Для демонстрации выполнимости двойного обнаружения выполняется мультиплексный тест, объединяющий флуоресцентные микросферы для обнаружения антигенов А и/или В, которые несут красные
клетки крови исследуемого образца, и флуоресцентные микросферы, связанные с красными клетками
крови известной группы по системе АВО, для обнаружения анти-А и/или анти-В антител, присутствующих в исследуемом образце. Исследуемый образец представляет собой образец цельной крови. Применяются две системы визуализации, описанные выше: мечение красных клеток крови образца флуоресцентным соединением для обнаружения антигенов на поверхности красной клетки крови и применение
меченного РЕ вторичного антитела против иммуноглобулина человека для обнаружения антител в плаз- 23 -
017186
ме исследуемого образца.
7.1. Материалы и реагенты.
Флуоресцентные суперпарамагнитные микросферы, имеющие участки 6, 56, 71, 81 и 94.
Микросферы хранят при +4°С в буфере PBS, рН 7,4.
Контрольные флуоресцентные микросферы с участком 34 (микросферы внутреннего стандарта
(ISB)) и участком 98 (пустые микросферы (ВВ)).
Поликлональные антитела козы против IgG мыши, 115-005-164 (Jackson ImM. Lab.)
Поликлональные антитела козы против IgM мыши, 115-005-020 (Jackson ImM. Lab.)
Концентраты фенотипированных клеток крови, которые хранят в среде SAG-MAN (EFS Nord 'de
France).
Моноклональное анти-В антитело типа IgG, клон Х9 (Bio-Rad) .
Моноклональное анти-А антитело типа IgM, клон 15750F7 (Bio-Rad).
Поликлональные антитела козы против IgM человека, код 709-116-073 (Jackson IMM. Lab.), связанное с фикоэритрином (РЕ).
Набор для мечения клеток PKH26 (Sigma).
Поли-L-лизин(PLL) с молекулярной массой 70000-130000.
Образцы цельной крови в ЭДТА (EFS-Rungis).
Среда для разведения, выпускаемая под названиями "ScanLiss" код 86442 и "Stabiliss" код 86550
компанией Bio-Rad.
Покрывающая жидкость или буфер (10 мМ фосфата натрия, 150 мМ NaCl, 0,1% (объемн.) проклина).
Бычий сывороточный альбумин (BSA) (Millipore).
Буфер PBS, рН 7,4 (7 мМ фосфата натрия, 2,7 мМ KCl, 136 мМ NaCl).
7.2. Протокол.
7.2.1. Получение реагентов.
7.2.1.1. Получение реагентов для обнаружения антигенов: сенсибилизация микросфер антителами,
направленными против антигенов групп крови.
Принцип иммобилизации антител на поверхности микросфер суммирован на фиг. 2.
Микросферы с участком 6 применяются для ковалентной иммобилизации антител против IgG мыши.
Флуоресцентные микросферы с участком 56 применяются для ковалентной иммобилизации антител
к IgM мыши. Карбоксильные группы, присутствующие на поверхности микросфер, активируют в соответствии с методом, включающим гидроксисукцинимид и карбодиимид.
Белки могут таким образом быть иммобилизованы посредством своих аминогрупп.
Полученные таким образом микросферы хранят при +4°С в концентрации 3 мг/мл в PBS, рH 7,4,
содержащем 10% (масса/объем) BSA, 0,5% (объемн.) Tween 20 и 0,09% (мас./об.) азида натрия.
Микросферы, несущие иммобилизованные антитела к IgG мыши, могут быть сенсибилизированы
анти-В антителами. Микросферы, несущие иммобилизованные антитела к IgM мыши, могут быть сенсибилизированы анти-А антителами. Антитела против красных клеток крови являются, таким образом, нековалентно иммобилизоваными на микросферах с применением этого принципа. Каждый участок микросферы сенсибилизирован антителами различной специфичности. Выбранные антитела против иммуноглобулинов дают возможность стабильного связывания в течение времени.
Неочищенные анти-А антитела и неочищенные анти-В антитела применяются в соответствующих
конечных концентрациях 165 и 640 мкг/мл.
Сенсибилизация антителами против красных клеток крови выполняется в PBS, рН 7,4, с перемешиванием при 37°С в течение одного часа.
После сенсибилизации микросферы несколько раз промывают буфером PBS, рН 7,4, и затем хранят
при +4°С в PBS с концентрацией BSA 10 г/л, рН 7,4.
7.2.1.2 Получение реагентов для обнаружения антител: сенсибилизация микросфер PLL и иммобилизация красных клеток крови известной группы и известного фенотипа.
Нейтральные микросферы с участком 71, участком 81 и участком 94 инкубируют с 50 мкг/мл PLL в
PBS, рН 7,4, в течение 18 ч при комнатной температуре и при перемешивании. В конце этой стадии микросферы промывают буфером PBS, рН 7,4, и затем применяют для иммобилизации красных клеток крови.
Реагенты, содержащие микросферу-красную клетку крови, получают посредством смешивания покрытых PLL микросфер и красных клеток крови, разбавленных ScanLiss, при отношении количества
красных клеток крови к количеству микросфер, равном 100.
Инкубация выполняется с перемешиванием в течение 5 мин при комнатной температуре. Каждый
участок микросферы применяется для иммобилизации единственного типа красных клеток крови известной группы. В конце этой стадии реагенты, содержащие микросферы-PLL-красные клетки крови, несколько раз промывают дистиллированной водой. Полученные таким образом реагенты, содержащие
микросферы-красные клетки крови, хранят в PBS с концентрацией BSA 10 г/л, рН 7,4, при +4°С.
- 24 -
017186
Принцип иммобилизации красных клеток крови на микросферах посредством PLL суммирован на
фиг. 4.
Присоединение красных клеток крови посредством PLL является достаточно прочным для предотвращения их отделения во время тестов и исследований.
7.2.2. Мечение красных клеток крови исследуемых образцов.
Мечение красных клеток крови выполняется, как в примере 1 с применением PKH26 (фиг. 3). Мечение красных клеток крови PKH26 выполняется с применением протокола, рекомендованного производителем. Меченые таким образом красные клетки крови разбавляют до 40% (об.) их плазмой.
7.2.3. Инкубация исследуемых образцов с комплексами антитела группы крови-микросферы и
красные клетки крови-микросферы.
Тестируемый образец представляет собой цельную кровь.
Пятьдесят микролитров исследуемого образца смешивают с 25 мкл микросфер, сенсибилизированных красными клетками крови известного фенотипа (реагентами, содержащими микросферы-PLLкрасные клетки крови), инкубируют в течение 10 мин с перемешиванием при 22°С.
Двадцать пять микролитров микросфер, сенсибилизированных антителами против красных клеток
крови (реагентами, содержащими микросферы-антитела против красных клеток крови), затем добавляют
и инкубируют в течение 5 мин с перемешиванием при 22°С.
После инкубации реагенты промывают несколько раз буфером PBS.
7.2.4. Обнаружение позитивных комплексов.
Обнаружение красных клеток крови, связанных с реагентами, содержащими микросферы-антитела
против красных клеток крови (комплексы микросфера-антитело-красная клетка крови), обеспечивается
предварительным мечением красных клеток крови образца.
Для обнаружения связывания антител образца с реагентами, содержащими микросферы-PLLкрасные клетки крови (комплексами микросферы-PLL-красные клетки крови-антитела), применяют меченое РЕ антитело, специфичное для иммуноглобулинов человека. Этот конъюгат антител применяется в
концентрации 5 мкг/мл в PBS, рН 7,4, и инкубируется с комплексами в течение 15 мин при 37°С с перемешиванием. Комплексы затем несколько раз промывают буфером PBS, рН 7,4.
7.2.5. Измерения путем проточной цитометрии с применением аппарата "Bioplex 200" компании
Bio-Rad.
После окончательного промывания и перед измерениями комплексы помещают в 35 мкл покрывающей жидкости. Для каждого теста 25 мкл суспензии впрыскивается в аппарат. Измерения выполняются посредством регистрации флуоресценции 250 микросфер каждого типа.
Для каждой сенсибилизированной микросферы исследуются негативные образцы для подтверждения специфичности изучаемых реакций.
7.3. Пример мультиплексного прямого и непрямого определения группы крови по системе АВО.
Микросферы с участком 94, покрытые PLL, применяются для иммобилизации красных клеток крови группы А, микросферы с участком 71, покрытые PLL, применяются для иммобилизации красных клеток крои группы В и микросферы с участком 81, покрытые PLL, применяются для иммобилизации красных клеток крови группы О. Эти микросферы, сенсибилизированные красными клетками крови с известным фенотипом, смешивают.
Микросферы с участком 6, сенсибилизированные анти-В антителами, смешивают с микросферами с
участком 56, сенсибилизированными анти-А антителами, с контрольными микросферами ISB с участком
34 и с контрольными микросферами ВВ с участком 98. Исследовались образцы цельной крови групп А,
В, АВ и О.
Красные клетки кров и образцов заранее метят так, чтобы дать возможность их обнаружения, если
они связаны с комплексами антитела против красных клеток крови-микросферы. Антитела образцов,
связанные с комплексами красные клетки крови-микросферы, определяют с применением меченного РЕ
конъюгата антител против иммуноглобулина человека.
Результаты представлены в табл. V ниже.
Таблица V. Мультиплексное прямое и непрямое определение группы крови по системе АВО
- 25 -
017186
Результат исследования клеток крови (обнаружение антигенов).
Реагенты, содержащие комплексы микросферы-антитела против А и микросферы-антитела против
В, реагируют соответственно с А-положительными красными клетками крови и В-положительными
красными клетками крови: положительные образцы дают положительные значения сигнала более 28000
RFI, тогда как отрицательные образцы дают более низкие значения сигнала от 1800 до 8300 RFI.
Результаты сывороточного теста (обнаружение антител).
Образцы, которые не содержат антител против присутствующих красных клеток крови, дают значения менее 1800 RFI, со средним отрицательным значением 1020 RFI.
Образцы, которые содержат антитела против красных клеток крови, представленных реагентами,
содержащими комплексы микросферы-PLL-A1 красные клетки крови и микросфера-PLL-B красные
клетки крови, дают положительные значения сигналов от 3000 до 8200 RFI, с отношением значения для
образца к среднему отрицательному значения порядка 3-8.
Кроме того, контрольные микросферы с участком 34 и с участком 98 дают ожидаемые значения
сигналов, т.е., соответственно, порядка 8000 RFI и менее 1400 RFI.
Эти результаты демонстрируют осуществимость выполнения мультиплексного обнаружения антигенов и антител, в одной и той же емкости и с применением единственного тестового образца цельной
крови.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ идентификации антигенных молекул, которые несут эритроциты, и/или антиэритроцитарных антител индивидуума in vitro, где антигенные молекулы представляют собой антигены мембраны
эритроцитов, определяющие группы крови, активированных фракций сывороточного комплемента, которые несут эритроциты, или антител, присутствующих на поверхности сенсибилизированных эритроцитов, включающий следующие стадии:
a) идентификацию множества антигенных молекул, которые несут эритроциты, в биологическом
образце посредством
(i) приведения указанного образца, содержащего эритроциты, в контакт, в единственной емкости
для исследования или в нескольких отдельных емкостях для исследования, с группами распознаваемых
микросфер, причем каждая из распознаваемых микросфер несет данное антитело, специфичное для антигенной молекулы, которую несут эритроциты, отличающее одну группу микросфер от другой, в условиях, которые позволяют эритроцитам связывать антитела без агглютинации, причем указанные эритроциты метят перед или после их приведения в контакт с указанными группами микросфер,
(ii) удаления эритроцитов, которые не связались с указанными антителами, и
(iii) идентификации группы микросфер, связанных мечеными эритроцитами, что делает, таким образом, возможной идентификацию антигенов, которые несут определяемые эритроциты; и/или
b) идентификацию множества антиэритроцитарных антител в биологическом образце посредством
i) приведения указанного образца в контакт в единственной емкости для исследования или в нескольких отдельных емкостях для исследования с группами распознаваемых микросфер, причем каждая
группа распознаваемых микросфер несет (1) эритроциты или (2) фрагменты мембраны эритроцитов известного фенотипа, которые отличают одну группу микросфер от другой, в условиях, которые позволяют
антителам или активированным фракциям сывороточного комплемента, присутствующим в образце, связывать эритроциты или фрагменты мембраны эритроцитов,
(ii) удаления антител или активированных фракций сывороточного комплемента, которые не связались с указанными эритроцитами или фрагментами мембраны эритроцитов,
(iii) мечения связанных антител и/или связанных активированных фракций сывороточного комплемента и
(iv) идентификации группы микросфер, связанных мечеными антителами или мечеными активированными фракциями сывороточного комплемента, делая, таким образом, возможной идентификацию
присутствующих антиэритроцитарных антител.
2. Способ идентификации антигенных молекул, которые несут эритроциты, и антиэритроцитарных
антител индивидуума in vitro, где антигенные молекулы представляют собой антигены мембраны эритроцитов, определяющие группы крови, активированных фракций сывороточного комплемента, которые
несут эритроциты, или антител, присутствующих на поверхности сенсибилизированных эритроцитов,
включающий следующие стадии:
а) идентификацию множества антигенных молекул, которые несут эритроциты, в биологическом
образце посредством
(i) приведения указанного образца, содержащего эритроциты, в контакт в единственной емкости
для исследования или в нескольких отдельных емкостях для исследования с группами распознаваемых
микросфер, причем каждая группа распознаваемых микросфер несет специфичное для антигенной молекулы, которую несут эритроциты, данное антитело, которое отличает одну группу микросфер от другой,
- 26 -
017186
в условиях, которые позволяют эритроцитам связывать антитела без агглютинации, причем указанные
эритроциты метят перед или после их приведения в контакт с указанными группами микросфер,
(ii) удаления эритроцитов, которые не связались с указанными антителами и
(iii) идентификации группы микросфер, связанных мечеными эритроцитами, что делает, таким образом, возможной идентификацию антигенов, которые несут определяемые эритроциты; и
b) идентификацию множества антиэритроцитарных антител в биологическом образце посредством
(i) приведения указанного образца в контакт в единственной емкости для исследования или в нескольких отдельных емкостях для исследования с группами распознаваемых микросфер, причем каждая
группа распознаваемых микросфер несет (1) эритроциты, (2) фрагменты мембраны эритроцитов или (3)
антигены группы крови известного фенотипа, которые отличают одну группу микросфер от другой, в
условиях, позволяющих антителам или активированным фракциям сывороточного комплемента, присутствующим в образце, связывать эритроциты, фрагменты мембраны эритроцитов или антигены группы
крови без агглютинации,
(ii) удаления антител или активированных фракций сывороточного комплемента, которые не связались с указанными эритроцитами, или с указанными фрагментами мембраны эритроцитов, или с указанными антигенами группы крови,
(iii) мечения связанных антител и/или связанных активированных фракций сывороточного комплемента и
(iv) идентификации группы микросфер, связанных мечеными антителами или мечеными активированными фракциями сывороточного комплемента, делая таким образом возможной идентификацию присутствующих антиэритроцитарных антител.
3. Способ идентификации антиэритроцитарных антител индивидуума in vitro, включающий на стадии (b):
(i) идентификацию множества антиэритроцитарных антител в биологическом образце посредством
приведения указанного образца в контакт в единственной емкости для исследования или в нескольких
отдельных емкостях для исследования с группами распознаваемых микросфер, причем каждая группа
распознаваемых микросфер несет антигены группы крови известного фенотипа, которые отличают одну
группу микросфер от другой, в условиях, которые позволяют антителам или активированным фракциям
сывороточного комплемента, присутствующим в образце, связывать антигены группы крови без агглютинации;
(ii) удаления антител или активированных фракций сывороточного комплемента, которые не связались с указанными антигенами группы крови,
(iii) мечения связанных антител и/или связанных активированных фракций сывороточного комплемента и
(iv) идентификации группы микросфер, связанных мечеными антителами или мечеными активированными фракциями сывороточного комплемента, делая, таким образом, возможной идентификацию
присутствующих антиэритроцитарных антител, причем микросферы представляют собой суперпарамагнетики или магнетики или способны к намагничиванию.
4. Способ идентификации антиэритроцитарных антител индивидуума in vitro, включающий на стадии (b):
(i) идентификацию множества антиэритроцитарных антител в биологическом образце посредством
приведения указанного образца в контакт в единственной емкости для исследования или в нескольких
отдельных емкостях для исследования с группами распознаваемых микросфер, причем каждая группа
распознаваемых микросфер несет антигены группы крови известного фенотипа, которые отличают одну
группу микросфер от другой, в условиях, которые позволяют антителам или активированным фракциям
сывороточного комплемента, присутствующим в образце, связывать антигены группы крови без агглютинации;
(ii) удаления антител или активированных фракций сывороточного комплемента, которые не связались с указанными антигенами группы крови,
(iii) мечения связанных антител и/или связанных активированных фракций сывороточного комплемента и
(iv) идентификации группы микросфер, связанных мечеными антителами или мечеными активированными фракциями сывороточного комплемента, делая, таким образом, возможной идентификацию
присутствующих антиэритроцитарных антител, причем распознаваемые микросферы испускают люминесцентные или флуоресцентные сигналы.
5. Способ идентификации антиэритроцитарных антител индивидуума in vitro, включающий на стадии (b):
(i) идентификацию множества антиэритроцитарных антител в биологическом образце посредством
приведения указанного образца в контакт в единственной емкости для исследования или в нескольких
отдельных емкостях для исследования с группами распознаваемых микросфер, причем каждая группа
распознаваемых микросфер несет антигены группы крови известного фенотипа, которые отличают одну
группу микросфер от другой, в условиях, которые позволяют антителам или активированным фракциям
- 27 -
017186
сывороточного комплемента, присутствующим в образце, связывать антигены группы крови без агглютинации;
(ii) удаления антител или активированных фракций сывороточного комплемента, которые не связались с указанными антигенами группы крови,
(iii) мечения связанных антител и/или связанных активированных фракций сывороточного комплемента и
(iv) идентификации группы микросфер, связанных мечеными антителами или мечеными активированными фракциями сывороточного комплемента, делая, таким образом, возможной идентификацию
присутствующих антиэритроцитарных антител, причем антиэритроцитарные антитела представляют собой атипичные антитела.
6. Способ по п.1 или 2, в котором идентификация антигенов в соответствии с (а) и идентификация
антител в соответствии с (b) выполняются одновременно и в одной и той же емкости.
7. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором анализ смеси выполняется посредством проточной цитометрии.
8. Способ по любому из предшествующих пунктов, который также включает стадию химического
или ферментативного разрушения гемоглобина, такую как гемолиз.
9. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором распознаваемые микросферы представляют собой суперпарамагнетики или магнетики или способны к намагничиванию.
10. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором распознаваемые микросферы испускают люминесцентные или флуоресцентные сигналы.
11. Способ по любому из пп.1, 2, 6-9, в котором доступные к обнаружению меченные эритроциты,
используемые на стадии (а), метят флуоресцентным соединением.
12. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором антитела, используемые на стадии
(b), метят посредством приведения в контакт с антителами против иммуноглобулина человека, несущими
флуоресцентную, люминесцентную или радиоактивную метку.
13. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором активированные фракции сывороточного комплемента, используемые на стадии (b), метят посредством приведения в контакт с антителами к фракциям сывороточного комплемента, несущими флуоресцентную, люминесцентную или радиоактивную метку.
14. Способ по любому из предшествующих пунктов, включающий идентификацию множества антиэритроцитарных антител, используемых на стадии (b), в котором антитела представляют атипичные
антитела.
15. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором биологический образец выбирают
из группы, состоящей из цельной крови, плазмы, сыворотки, осадка клеток крови или любого другого
препарата крови.
16. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором источником биологического образца
является индивидуум, эритроциты которого сенсибилизированы антителами in vivo и/или покрыты
фракциями сывороточного комплемента.
17. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором определяют изотип иммуноглобулинов, присутствующих на поверхности эритроцитов и/или в биологической жидкости, полученной от
указанного индивидуума.
18. Способ любому из пп.1-17, дополнительно включающий количественное определение антител,
идентифицированных на стадии (b).
19. Способ определения перекрестной совместимости эритроцитов, которые должны быть перелиты
пациенту, включающий:
(i) одновременное приведение образца сыворотки или плазмы крови пациента в контакт, в одной
емкости для исследования, с группами распознаваемых микросфер, несущих эритроциты, которые должны быть перелиты, в условиях, которые позволяют возможным присутствующим антигенам связывать
эритроциты,
(ii) удаление антител, которые не связаны указанными эритроцитами,
(iii) мечение антител, которые связаны, и
(iv) исследование смеси таким образом, чтобы определить, связаны ли группы микросфер антителами, причем связывание группы микросфер означает, что эритроциты, которые должны быть перелиты,
не
идеально
подходят
для
пациента.
- 28 -
017186
Фиг. 1
Фиг. 2
Фиг. 3
Фиг. 4
- 29 -
017186
Фиг. 5а
Фиг. 5b
Фиг. 5С
- 30 -
017186
Фиг. 5d
Фиг. 6
Фиг. 7
- 31 -
017186
Фиг. 8
Фиг. 9
Фиг. 10
- 32 -
017186
Фиг. 11
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
- 33 -