ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ И КЛИНИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ»

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
«НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ И КЛИНИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ»
На правах рукописи
НЕЩАДИМ
Дмитрий Владимирович
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ НАНОРАЗМЕРНЫХ АЛМАЗНЫХ ЧАСТИЦ
НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ СТАТУС МАКРОФАГОВ IN VITRO
14.03.03 – патологическая физиология
03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология
ДИССЕРТАЦИЯ
на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Научные руководители:
заслуженный деятель науки РФ,
академик РАН,
доктор медицинских наук, профессор
Шкурупий Вячеслав Алексеевич
доктор биологических наук
Архипов Сергей Алексеевич
г. Новосибирск – 2015
2
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ ................................................................................. 5
ВВЕДЕНИЕ ................................................................................................................................ 7
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................................. 12
1.1. Общие сведения о наноразмерных алмазных частицах ..................................................... 12
1.2. Биологические свойства наноразмерных алмазных частиц............................................... 13
1.2.1. Биотропность наноразмерных алмазных частиц............................................................. 14
1.2.2. Биосовместимость наноразмерных алмазных частиц ..................................................... 18
1.2.3. Биологические эффекты, оказываемые наноразмерными алмазными частицами......... 22
1.3. Наноразмерные алмазные частицы в сфере биомедицины................................................ 25
1.3.1. Использование наноразмерных алмазных частиц в биологии........................................ 25
1.3.2. Перспективы и проблемы использования наноразмерных алмазных частиц в медицине............................................................................................................................................. 28
1.4. Современные представления о воспалении........................................................................ 31
1.5. Современные представления о макрофагах, клетках системы мононуклеарных фагоцитов ........................................................................................................................................... 37
1.6. Влияние наноразмерных алмазных частиц на функциональный статус макрофагов....... 44
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ .................................................... 46
2.1. Методы выделения и культивирования перитонеальных макрофагов.............................. 46
2.2. Характеристика наноразмерных алмазных частиц, методика приготовления суспензии раствора наноразмерных алмазных частиц для инкубации в культуре макрофагов ........ 47
2.3. Методы изучения свойств биотропности наноразмерных алмазных частиц в отношении макрофагов .......................................................................................................................... 48
2.3.1. Методы светооптического и флуоресцентного микроскопического исследования
макрофагов, подвергнутых воздействию наноразмерных алмазных частиц........................... 48
2.3.2. Методы электронно-микроскопического исследования макрофагов, подвергнутых
воздействию наноразмерных алмазных частиц ........................................................................ 49
2.4. Методы изучения свойств биосовместимости наноразмерных алмазных частиц в отношении макрофагов.................................................................................................................. 50
2.4.1. Методы изучения жизнеспособности макрофагов.......................................................... 50
2.4.2. Методы изучения продукции активных форм кислорода макрофагами ........................ 51
2.5. Методы изучения функциональной активности макрофагов, подвергнутых воздействию наноразмерных алмазных частиц....................................................................................... 51
3
2.5.1. Методы изучения влияния наноалмазных частиц на показатели эндоцитозной активности и «распластывания» макрофагов ............................................................................... 52
2.5.2. Методы изучения влияния наноалмазных частиц на функциональное состояние
вакуолярно-лизосомальной системы макрофагов и процессы фагосомно-лизосомного
слияния........................................................................................................................................ 53
2.6. Методы изучения биологических эффектов, оказываемых наноразмерными алмазными частицами в макрофагах .................................................................................................. 54
2.6.1. Иммуноцитохимические методы выявления внутриклеточной продукции провоспалительных, гидролитических и ростовых факторов в макрофагах ...................................... 54
2.6.2. Иммуноцитохимические методы выявления секреции гидролитических и ростовых
факторов на миллипоровых фильтрах....................................................................................... 56
2.7. Методы статистического анализа ....................................................................................... 57
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.......................................................................... 58
3.1. Результаты исследования свойств биотропности наноразмерных алмазных частиц в
отношении макрофагов .............................................................................................................. 58
3.1.1. Результаты светооптического и флуоресцентного микроскопического исследования макрофагов, подвергнутых воздействию наноразмерных алмазных частиц .................... 58
3.1.2. Результаты электронно-микроскопического исследования макрофагов, подвергнутых воздействию наноразмерных алмазных частиц ................................................................. 61
3.2. Результаты исследования свойств биосовместимости наноразмерных алмазных частиц в отношении макрофагов..................................................................................................... 65
3.2.1. Результаты исследования влияния различных концентраций и экспозиций наноразмерных алмазных частиц на жизнеспособность макрофагов.............................................. 65
3.2.2. Результаты исследования влияния наноразмерных алмазных частиц на продукцию
активных форм кислорода макрофагами................................................................................... 65
3.3. Результаты исследования влияния наноразмерных алмазных частиц на функциональную активность макрофагов............................................................................................... 67
3.3.1. Результаты исследования показателей эндоцитозной активности и «распластывания» макрофагов, подвергнутых воздействию наноразмерных алмазных частиц .................. 67
3.3.2. Результаты исследования влияния наноразмерных алмазных частиц на функциональное состояние вакуолярно-лизосомальной системы и процессы фагосомнолизосомного слияния макрофагов ............................................................................................. 70
3.4. Результаты исследования биологических эффектов, индуцированных наноразмерными алмазными частицами в макрофагах ............................................................................... 74
4
3.4.1. Результаты исследования влияния наноразмерных алмазных частиц на экспрессию
провоспалительных факторов макрофагами ............................................................................. 74
3.4.2. Результаты исследования влияния наноразмерных алмазных частиц на экспрессию
и секрецию лизосомальных гидролаз и матриксных металлопротеиназ макрофагами .......... 75
3.4.3. Результаты исследования влияния наноразмерных алмазных частиц на экспрессию
и секрецию ростовых факторов макрофагами .......................................................................... 82
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ............................................................................. 88
ЗАКЛЮЧЕНИЕ .......................................................................................................................... 103
ВЫВОДЫ.................................................................................................................................... 104
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ .......................................................................................................... 105
ПРИЛОЖЕНИЕ .......................................................................................................................... 131
5
СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АФК – активные формы кислорода
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
ИАМФ – индекс активации макрофагов
ИП АФК – индекс продукции активной формы кислорода
ИР – индекс «распластывания»
ИЭА – индекс эндоцитозной активности макрофагов
мас.% – массовая доля
МФ – макрофаг(-и)
НА – наноразмерная(-ые) алмазная(-ые) частица(-ы), наноалмазы
НСТ-тест – тест с нитросиним тетразолием
ПЛМЛ – показатель лабильности (пермеабилизации) мембран лизосом
ПЖ – показатель жизнеспособности
УДА – ультрадисперсный(-ые) алмаз(-ы)
УФ-излучение – ультрафиолетовое излучение
ФИ – фагоцитозный индекс (или индекс фагоцитоза)
ФЛИ – индекс фагосомно-лизосомного слияния
ФЧ – фагоцитозное число
ЭИ – эндоцитозный индекс (или индекс эндоцитоза)
Bcl-X – белок B-клеток лимфомы (англ. B-cell lymphoma extra large или small)
b-FGF (или FGF-2) – основной фибробластический ростовой фактор (англ. basic fibroblast
growth factor 2 или beta)
CCL2 – цитокин, относящийся к группе CС-хемокинов (англ. C-C motif ligand 2)
Cxcl2 – цитокин, относящийся к группе C-X-С-хемокинов (англ. C-X-C motif ligand 2)
GM-CSF – гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (англ. colony
stimulating factor 2 или granulocyte-macrophage)
EGF – эпидермальный фактор роста (англ. epidermal growth factor)
IFN-γ – интерферон гамма (англ. interferon gamma)
IL-1 – интерлейкин 1 (англ. interleukin-1)
iNOS – индуцибельная синтаза оксида азота (англ. inducible isoform nitric oxide synthase)
KGF (или FGF-7) – фактор роста кератиноцитов (англ. keratinocyte growth factor)
MMP(-s) – матриксная(-ые) металлопротеиназа(-ы) (англ. matrix metalloproteinase)
MAPK – сигнальный путь, с участием митоген-активируемой протеинкиназы (англ. mitogenactivated protein kinase)
6
NF-κB – сигнальный путь, с участием транскрипционного фактора «каппа-би» (англ. nuclear
factor κB)
PDGF – фактор роста тромбоцитов (англ. platelet-derived growth factor)
PI3K – сигнальный путь с участием фермента фосфоинозитид-3-киназы (англ. phosphoinositide
3-kinases)
TGF-β – трансформирующий ростовой фактор бета (англ. transforming growth factor beta)
TNF-α – фактор некроза опухоли альфа (англ. tumor necrosis factor alpha)
VEGF – фактор роста эндотелия сосудов (англ. vascular endothelial growth factor)
7
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Важной биологической проблемой в широком смысле является
характер взаимодействия клеток и корпускулярных факторов не биологической природы. Частным случаем этой проблемы, имеющей прикладное значение, является взаимоотношение клеточных систем с наноразмерными объектам нетканевой природы, среди которых одним из актуальных объектов являются наноразмерные синтетические наноалмазы.
В настоящее время в различных отраслях промышленности и науки используют множество наноразмерных искусственно созданных материалов, в том числе и наноразмерных алмазов
(НА) (Бгатова Н.П. и др., 2008; De Jong W.H., Borm P.J., 2008; Lewinski N. et al., 2008;
Schrand A.M. et al., 2009; Shenderova O.A., Gruen D.M., 2012). В медицине одним из важнейших
свойств наноматериалов являются их биосовместимость (Онищенко Г.Г. и др., 2007). Однако
сведений, касающихся биосовместимости НА, еще недостаточно для их широкого использования в фармации и медицинской практике как с позиции биобезопасности, так и сопряженной с
нею вероятности проявлений различного рода эффектов, которые могут быть факторами риска
в конкретной патологической ситуации в связи с конкретными клеточными и тканевыми системами организма (Медведева Н.В. и др., 2006; Novikova M.S. et al., 2008; Schrand A.M. et al.,
2009; Arkhipov S.A. et al., 2010).
В настоящее время в медицине и косметологии в качестве одного из перспективных наноматериалов рассматривают искусственно созданные НА (Schrand A.M., Huang H. et al., 2007;
Schrand A.M. et al., 2009; Li J. et al., 2010). Это обусловлено тем, что среди всех известных на
данный момент наночастиц, используемых в биомедицинских технологиях, НА обладают наименьшей цитотоксичностью в отношении клеток различного гистогенеза (Schrand A.M. et al.,
2009; Shenderova O.A., Gruen D.M., 2012). Более того, в ряде исследований на моделях in vivo
было показано, что в отличие от других наноматериалов, предлагаемых в качестве носителей
для транспортировки лекарств, наноалмазы не вызывали воспаления в местах их введения или в
«тканях-мишенях» и не вызывали профиброгенных эффектов (Пузырь А.П. и др., 2005a, 2005b,
2005c; Тян А.Г., 2005; Лазаренко Л.И., 2008, 2009; Прохоренко В.И. и др., 2014; Thomas V. et al.,
2012). Показано, что гидрозоли НА не оказывают патологического действия на органы и ткани
экспериментальных животных при различных способах их введения (Тян А.Г., 2005; Dolmatov V.Y., 2006). При введении НА непосредственно в область, где развивается воспалительный
патологический процесс, отмечали купирование воспаления (Лазаренко Л.И., 2008, 2009).
Имеются данные о способности НА стимулировать в очаге воспаления регенераторнопластические процессы (Лазаренко Л.И., 2008, 2009). Однако имеются пока лишь единичные
работы, в которых делаются попытки дать объяснения указанному феномену высокой биосовместимости наноалмазов и особенностям их влияния на такие типовые патологические про-
8
цессы, развивающиеся вслед за повреждением клеток и тканевых структур, как воспаление и
фиброз.
Показано, что НА, несмотря на их относительную химическую инертность, не инертны в
биологическом смысле. Так, например, будучи захваченными макрофагальными клетками, они
ингибируют в них экспрессию генов хемокинов CCL2 и фактора роста тромбоцитов (PDGF;
Thomas V. et al., 2012). Как известно, макрофаги (МФ) – клетки, способные к захвату многих
корпускулярных объектов, причастны, так или иначе, к развитию ряда типовых патологических
процессов в организме, таких как некроз, воспаление, фиброз (Струков А.И., Серов В.В., 2013;
Burke B.,
Lewis C.E.,
2002;
Serhan C.N. et al.,
2010;
Biswas S.K.,
Mantovani A.,
2014;
Kumar V. et al., 2014). В основе механизмов развития типового патологического процесса лежит
целый комплекс взаимосвязанных изменений – повреждения и одновременно развивающихся
процессов защиты, компенсации, репарации и приспособления (адаптации) (Струков А.И., Серов В.В., 2013; Serhan C.N. et al., 2010; Kumar V. et al., 2014). Таким образом, изучение влияния
НА частиц на функциональный статус МФ, их гидролитический и прорегенераторный потенциалы, определяющие развитие и течение типовых патофизиологических процессов, ассоциированных с МФ, является актуальным направлением исследований в области биомедицинских
технологий.
Поскольку МФ рассматривают как один из главных «дирижеров» развития воспаления и
ассоциированного с ним фиброза, как неполноценного (substitucio) репаративного заместительного процесса, так и полноценной (restitucio) репаративной регенерации (Струков А.И., Серов В.В., 2013; Burke B., Lewis C.E., 2002; Biswas S.K., Mantovani A., 2014), представляется актуальным проведение исследований, в которых можно было бы в «чистом виде» изучить влияние НА частиц на проявления их функциональной активности, ассоциированной с их возможным участием в развитии и исходе воспалительной реакции организма при модулировании изменений их: фагоцитозной активности; выраженности процесса фагосомно-лизосомного слияния; экспрессии цитокинов, обладающих провоспалительной и антивоспалительной активностью; экспрессии и секреции гидролитических ферментов, принимающих участие в «санации»
очага воспаления; в индукции или ингибировании фибропластического процесса (по экспрессии и секреции цитокинов – регуляторов этого процесса); в регенераторных процессах (по экспрессии факторов роста, обладающих прорегенераторной активностью). Все это определило
цель и задачи исследования.
Цель исследования. Изучить влияние наноразмерных алмазных частиц марки «УДА-ВГО», эндоцитированных макрофагами, на их функциональный статус, вероятность модуляции
ими типовой реакции воспаления и его исходов.
9
Задачи исследования.
1.
Изучить биотропность наноразмерных алмазных частиц марки «УДА-В-ГО» в отно-
шении макрофагальных клеток in vitro.
2.
Изучить биосовместимость наноразмерных алмазных частиц марки «УДА-В-ГО» в
отношении макрофагальных клеток in vitro.
3.
Изучить in vitro влияние наноразмерных алмазных частиц марки «УДА-В-ГО», эндо-
цитированных макрофагами, на экспрессию ими цитокинов, определяющих их провоспалительный и профиброгенный потенциал.
4.
Изучить in vitro влияние наноразмерных алмазных частиц марки «УДА-В-ГО», эндо-
цитированных макрофагами, на экспрессию и секрецию ими гидролитических ферментов, потенциально способных модулировать процессы воспаления и регенерации (substitucio и restitucio).
5.
Изучить in vitro влияние наноразмерных алмазных частиц марки «УДА-В-ГО», эндо-
цитированных макрофагами, на экспрессию и секрецию ими ростовых факторов, потенциально
способных модулировать развитие процесса воспаления на разных этапах его развития.
Научная новизна.
Впервые in vitro показано, что захват наноразмерных алмазных частиц марки «УДА-ВГО» макрофагами может осуществляться одновременно различными механизмами эндоцитоза:
активным адсорбционным пиноцитозом, эндоцитозом с формированием клатриновых эндоцитозных везикул и эндоцитозом крупных агрегатов наноалмазов (фагоцитозом), формирующихся
внеклеточно.
Впервые установлено, что наноразмерные алмазные частицы марки «УДА-В-ГО», эндоцитированные макрофагами in vitro, в широком диапазоне доз не индуцируют цитотоксические
эффекты, существенно не влияют на фагоцитозную активность в отношении корпускулярного
материала биологической природы и степень пермеабилизации мембран лизосом, но стимулируют процесс фагосомно-лизосомного слияния.
Впервые in vitro установлено, что наноразмерные алмазные частицы марки «УДА-В-ГО»,
эндоцитированные макрофагами, «неоднонаправлено» модулируют экспрессию ими различных
цитокинов, определяющих их провоспалительный и профиброгенный статусы.
Впервые in vitro показано, что наноразмерные алмазные частицы марки «УДА-В-ГО», эндоцитированные макрофагами, модулируют экспрессию, продукцию и секрецию макрофагами
гидролитических и ростовых факторов, потенциально способных модулировать развитие как
воспалительного процесса в целом, так и процессы регенерации и/или фиброза.
Впервые in vitro выявлено отсутствие прямой зависимости между продукцией и секрецией
макрофагами гидролитических ферментов и ростовых факторов, а также «однонаправленности»
10
модуляции экспрессии последних макрофагами после эндоцитоза ими наноразмерных алмазных частиц марки «УДА-В-ГО».
Научно-практическая значимость работы.
В работе получены данные, свидетельствующие о том, что наноразмерные алмазные частицы, воздействуя на макрофаги и изменяя их функциональный статус, потенциально «позитивно» могут модулировать процесс воспаления во всех фазах его развития: повреждения, воспаления и репарации, - в связи с умеренным увеличением их гидролитического и прорегенераторного потенциала в локусе повреждения и ингибированием процесса постдеструктивного
воспаления и фиброзирования. Это предполагает возможность использования результатов данного исследования при разработке новых лекарственных средств на основе наноразмерных алмазных частиц для лечения поврежденных органов и тканей. Кроме того, эти данные могут
быть использованы для уточнения патогенеза процессов неспецифического воспаления и некоторых профессиональных заболеваний легких у человека, в преподавании этих вопросов по
курсу общей патологии, патофизиологии воспаления и процессов репаративной регенерации в
медицинских университетах и на медицинских факультетах классических университетов.
Основные положения, выносимые на защиту.
1.
Наноразмерные алмазные частицы марки «УДА-В-ГО» в диапазоне концентраций
10-30 мкг/мл обладают высокой биотропностью и биосовместимостью в отношении макрофагальных клеток in vitro. Наноразмерные алмазные частицы марки «УДА-В-ГО» при концентрации в культуральной среде 20 мкг/мл обладают способностью модулировать in vitro провоспалительный и профиброгенный статус макрофагов: стимулируют экспрессию GM-CSF и IFN-γ,
снижают экспрессию IL-1α, не изменяя экспрессии TNF-α; повышают экспрессию, продукцию
и секрецию факторов роста EGF, TGFB1/TGF-β, KGF/FGF-7 и в то же время снижают экспрессию и продукцию b-FGF/FGF-2.
2.
Наноразмерные алмазные частицы марки «УДА-В-ГО», эндоцитированные макрофа-
гами in vitro, при концентрации 20 мкг/мл модулируют функциональный статус и гидролитический потенциал макрофагов: повышают экспрессию, продукцию и секрецию металлопротеиназ
MMP-1 и MMP-9, катепсина B и катепсина D, стимулируют процесс фагосомно-лизосомного
слияния в макрофагах, не изменяя их фагоцитозной активности в отношении корпускулярных
объектов биологической природы, и потенциально способны изменять процесс воспаления в
фазе деструкции и неполноценной регенерации (фиброза).
Внедрение результатов работы в практику. Основные положения работы внедрены в
практику научных исследований и преподавания на кафедре патологической анатомии и патологической физиологии ГБОУ ВПО НГМУ Минздрава России в соответствующие разделы:
11
«Неспецифическое воспаление», «Регенерация. Заживление ран», «Склероз», «Профессиональные заболевания легких»; и «Воспаление», «Патология тканевого развития».
Апробация работы. Результаты работы были доложены на 5-ой Всероссийской научнопрактической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (г. Новосибирск, 2011 г.), конференции «Фундаментальных и прикладных исследований в медицине» (г. Сочи, 2011 г.). Основные положения и материалы диссертационной работы обсуждались на межлабораторных семинарах отдела общей патологии ФГБНУ «Научно-исследовательсуий институт экспериментальной медицины» (2014,
2015 гг.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 3
статьи в журналах, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России для публикации материалов диссертационных исследований.
Автор выражает признательность ОАО ФНПЦ (НПО) «Алтай» (Россия, г. Бийск) за любезно предоставленные для изучения в данной диссертационной работе наноразмерные алмазные частицы марки «УДА-В-ГО». С особой признательностью автор благодарит д.б.н., профессора, заместителя декана ФЕН и профессора кафедры физиологии ФЕН НГУ (ННИГУ) Шестопалову Л.В. и д.б.н., профессора, заведующую лабораторией клеточной биологии и фундаментальных основ репродукции сектора морфологии и молекулярно-клеточных технологий
ЦНИЛ ГБОУ ВПО НГМУ Минздрава России Айдагулову С.В. за помощь в подготовке экспериментального материала и проведении его исследования методом электронной микроскопии.
12
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Общие сведения о наноразмерных алмазных частицах
Наноразмерные алмазные частицы (НА) представляют широкое семейство наноуглеродных соединений (вместе с фуллеренами, нанотрубками, нанографитом, «луковичной» формой
углерода), обладающих разнообразными свойствами в зависимости от способа их синтеза,
постсинтезной обработки и модификации (Shenderova O.A. et al., 2002). Наноразмерными частицами называются изолированные твердофазные объекты, размеры которых во всех трех измерениях составляют от 1 до 100 нм 1. В отечественной литературе можно также встретить синонимическое название НА – ультрадисперсный алмаз (УДА) (Даниленко В.В., 2004; Долматов В.Ю. и др., 2004).
Получение НА проходит в три этапа: синтез, постсинтезный процессинг и модификация.
Каждый этап, в свою очередь, может включать еще несколько подэтапов. В настоящее время
существует несколько способов получения НА (Mochalin V.N. et al., 2012):
1. Получение из природных алмазов физическими методами.
2. Синтез при сверхвысоких давлениях и температурах.
3. Электронно- и ионно-лучевые методы, использующие облучение углеродсодержащего
материала пучками электронов и ионами аргона.
4. Химическое осаждение углеродсодержащего пара при высоких температурах и давлениях.
5. Детонационный синтез.
6. Электрохимическое осаждение на аноде.
Наиболее распространенным методом синтеза является детонационный синтез или синтез
с использованием энергии взрыва (Даниленко В.В., 2003; Mochalin V.N. et al., 2012). Его преимуществом по сравнению с другими является наибольший процент выхода конечного наноалмазного продукта и его наименьшая рыночная стоимость продукта (Schrand A.M. et al., 2009).
Первоначальным сырьем для получения НА выступает широкое разнообразие взрывчатых веществ (Долматов В.Ю., 2001; Даниленко В.В., 2003), которые подвергались плановой утилизации боеприпасов.
В суспензии НА агрегируют и образуют либо сферические скопления, либо образуют удлиненные древоподобные цепочки. Деагломерация НА до размера первичных частиц является
важной задачей для биомедицинского применения. Были предложены методы механической
деагломерации частиц при помощи сверхтонкого измельчения (Krüger A. et al., 2005) или ультразвукового измельчения при помощи шариков (Ozawa M., 2007). Таким методом была получена суспензия НА размером от 4 до 5 нм с очень небольшой фракцией частиц размером око1
URL: http://ec.europa.eu/health/scientific_committees/emerging/docs/scenihr_o_032.pdf
13
ло 30 нм (Ozawa M., 2007). Однако такой метод деагломерации приводит к нежелательным побочным эффектам, таким как загрязнение суспензии частицами циркония и образование в процессе измельчения графитовых слоев на поверхности НА (Osawa E., 2007). Отечественные авторы, В.С. Бондарь и А.П. Пузырь (2004), разработали метод деагрегации с использованием
ультразвука в солевом растворе хлорида натрия, который в результате приводил к очистке НА и
возможному адсорбированию ионов натрия поверхностью наночастиц. Привлекательной особенностью данного метода стала возможность высушивать гидрозоль НА до порошка с последующим повторным получением суспензии без агломерации частиц. С помощью данного метода был получен порошок НА с последующим восстановлением суспензии, содержащий средний
размер частиц около 40 нм.
НА являются уникальными частицами среди класса углеродных наночастиц из-за собственной гидрофильной поверхности, которая является одной из многих причин, почему эти наночастицы предлагаются для биомолекулярного применения (Mochalin V.N. et al., 2012). Поверхность НА содержит сложный спектр поверхностных групп, в том числе карбоновых кислот,
сложных эфиров, простых эфиров, лактонов, аминов и др. Изменения в поверхностных группах
детонационных НА за счет различных химических реакций могут приводить к изменению
свойств данных частиц. Например, радикальные реакции замещения были одними из первых,
исследованных на порошковых образцах НА. В этих реакциях концевой водород мог заместиться на радикал, образуя связь с карбоксильной группой (Tsubota T. et al., 2004), оксидом азота (Tsubota T. et al., 2006), пероксида бензоила и дикарбоновой кислоты (Ida S. et al., 2003). В
целом были использованы две стратегии поверхностной функционализации. Первые стратегии
были связаны с концевым кислородом алмазов, остальные были направлены на формирование
углерод-углерод, углерод-галоген и углерод-азот связей на месте концевого водорода. Данная
модификация позволяла ссадить на поверхность НА разнообразные химические соединения,
модифицировать коллоидные свойства, менять заряд наночастиц и многое другое.
Помимо поверхностных химических структур, которые могут подвергаться необходимой
модификации, НА частицы обладают великолепными механическими и оптическими свойствами, высокой суммарной сорбционной площадью (Mochalin V.N. et al., 2012). Также НА являются не цитотоксичными, что делает их наравне с физико-химическими свойствами уникальными
для биомедицинских применений (Schrand A.M. et al., 2009).
1.2. Биологические свойства наноразмерных алмазных частиц
В настоящее время в различных отраслях промышленности, науки и медицины исследуют
и используют множество наноразмерных искусственно созданных материалов. Но в медицине,
одним из важнейших, кроме искомых свойств, являются их биосовместимость (Онищенко Г.Г. и др., 2007). В настоящее время в медицине и косметологии в качестве одного из пер-
14
спективных наноматериалов рассматривают искусственно созданные НА (Schrand A.M.,
Huang H. et al., 2007; Schrand A.M. et al., 2009; Li J. et al., 2010). Однако очевидно, что сведений,
касающихся биотропности и биосовместимости НА еще недостаточно для их широкого использования в фармации и медицинской практике как с позиции биобезопасности, так и сопряженной с нею вероятностью проявлений различного рода эффектов, которые могут быть факторами
риска в конкретной патологической ситуации в связи с конкретными клеточными и тканевыми
системами организма (Медведева Н.В. и др., 2006; Novikova M.S. et al., 2008; Schrand A.M. et al.,
2009; Arkhipov S.A. et al., 2010).
1.2.1. Биотропность наноразмерных алмазных частиц
Перед тем как внедрять любые наночастицы в биомедицинские технологии, необходимо
тщательное рассмотреть их взаимодействие с биологическими системами. Особую настороженность вызывает высокая цитотоксичность, обнаруженная у наночастиц по сравнению с более
крупными частицами находящимися в суспензии для одного и того же вещества (Oberdörster G. et al., 2000; Donaldson K. et al., 2002; Braydich-Stolle L. et al., 2005; Hussain S.M. et al.,
2005). Для оценки времени пребывания наночастиц в биологических системах в 2004 г. была
предложена новая сфера изучения под названием «нанотоксикология» (Donaldson K. et al., 2004;
Arora S. et al., 2012). До этого времени и в последующие годы множество исследователей открывали новые и непредсказуемые пути, по которым накапливались наночастицы в клетках,
например, локализуясь в крайне важных органеллах, таких как митохондрии (Foley S. et al.,
2002), или перемещаясь из дыхательных путей в клетки нервной системы (Oberdörster G. et al.,
2005), а также проникая через гематоэнцефалический барьер (Gulyaev A.E. et al., 1999). Таким
образом, несмотря на уникальные свойства, которыми может обладать та или иная наночастица,
необходимым этапом является изучение ее биотропности и биосовместимости.
На данный момент времени исследования захвата и интернализации НА частиц в литературе оснащены недостаточно хорошо и имеют пока фрагментарный характер. По некоторым
работам (Iversen T.-G. et al., 2011) известно, что различные наночастицы попадают в клетку по
большей части эндоцитозом, в частности клатрин- и кавеолин-зависимым способами, хотя не
исключены иные способы (например, фагоцитоз, макропиноцитоз или прямое проникновение
через цитоплазматическую мембрану клетки) (Smith P.J. et al., 2012). Например, А.В. Малюгин,
Х. Гхандехари (2011) и T. Yu et al. (2011) показали, что МФ клеточной линии RAW264.7 осуществляют захват силикатных наночастиц преимущественно пиноцитозом, а не фагоцитозом.
R. Roy et al. (2014) также показали, что захват наночастиц оксида цинка осуществляется перитонеальными МФ, полученными от инбредной линии мышей BALB/с, преимущественно путем
клатрин-зависимого, кавеолин-зависимого эндоцитоза и эндоцитоза посредством scavengerрецепторов. Ряд исследований (Jordan A. et al., 1999; Iversen T.-G. et al., 2011) показывают важ-
15
ность способа захвата в зависимости от размера, химической структуры и электрохимического
заряда частиц, а также типа самих клеток (Smith P.J. et al., 2012). Традиционно в литературе
принято считать, что клатрин-зависимый эндоцитоз осуществляется для частиц размером
меньше 50 нм, с наибольшой скоростью захвата частиц размером около 25 нм (Zhang S. et al.,
2009), однако имеются данные о захвате таким путем и частиц около 100-150 нм, которые также
захватываются и макропиноцитозом (Murkherjee S. et al., 1997; Marsh M., McMahon H.T., 1999;
Rejman J. et al., 2004; Iversen T.-G. et al., 2011). Кавеолин-зависимый эндоцитоз осуществляется
в отношении частиц от 200 до 500 нм (Rejman J. et al., 2004).
Было показано также, что захват НА осуществляется преимущественно клатринзависимым эндоцитозом (Faklaris O. et al., 2009; Schrand A.M. et al., 2010; Schrand A.M. et al.,
2011; Prevedebtseva E. et al., 2013) и макропиноцитозом (Liu K.-K. et al., 2009; SolarskaŚciuk K. et al., 2014). K.-K. Liu et al. (2009) при помощи электронного микроскопа показали, что
100 нм карбоксилированные НА частицы (Diamond Innovations, США) захватывались раковыми
клетками из альвеолярного эпителия линии A549 и эмбриональными фибробластами линии
3T3-L1 клатрин-зависимым эндоцитозом и макропиноцитозом. Другая исследовательская группа (Prevedebtseva E. et al., 2013) также показала, что карбоксилированные НА (Kay Diamond
Products, США) размером 100 нм захватывались как раковой клеточной культурой (A549), так и
не раковыми клеточными культурами (HFL-1 и Beas-2b) преимущественно клатрин-зависимым
способом. K. Solarska-Ściuk et al. (2014) исследовали при помощи электронного и конфокального микроскопов захват 20 нм карбоксилированных НА частиц, меченных флуоресцеином (Department of Molecular Biophysics, University of Lodz, Польша), клеточными культурами HUVECST и A549. Их результаты также подтверждали клатрин-зависимый эндоцитоз и макропиноцитоз НА частиц. A.M. Schrand et al. (2011) при помощи электронного и флуоресцентного микроскопа проследили путь интернализации НА, меченных флуорофором TARMA (ООО «Новые
технологии», г. Челябинск), в культуре нейробластомы N2A и предложили следующую модель
данного процесса. В первые часы НА захватываются и попадают в ранние эндосомы. На 3-6 часе ранние эндосомы сливаются с лизосомами и образуют вторичные лизосомы. На 24 часе частицы НА можно было обнаружить в вакуолях, а некоторые частицы находились свободно в цитозоле (но не в ядре!) (Schrand A.M. et al., 2010). O. Faklaris et al. (2009) также показали при помощи конфокального микроскопа, что флуоресцентные НА частицы (Element Six, Нидерланды),
захваченные раковыми клетками из раковой опухоли шейки матки линии HeLa, оказываются
как во внутриклеточных вакуолях (эндосомы и лизосомы), так и непосредственно представлены
«свободно» в цитозоле клеток. Причины и механизм, почему и как НА частицы оказываются в
цитозоле вне вакуоли, пока до конца не установлены. Таким образом, для восстановления полной картины захвата и интернализации НА частиц требуются дополнительные исследования.
16
Наиболее хорошо изученный на данный момент времени тип эндоцитоза – клатринзависимый тип эндоцитоза, его еще называют рецепторно-зависимым (Льюин Б. и др., 2011;
Попова Н.В. и др., 2013). Главной особенностью данного типа эндоцитоза является интернализация лиганд-рецепторных комплексов и передача сигнала извне в клетку по строго определенному адресу. После связывания молекулы рецептора с лигандом и его активации возможным
становится связывание внутриклеточной части рецептора с белками-адаптерами, которые опосредуют взаимодействие рецепторов с молекулами клатрина, образующими впоследствии оболочку пузырька. Сформировавшиеся покрытые клатрином пузырьки, содержащие рецепторы,
отсоединяются от цитоплазматической мембраны при помощи белка динамина, стягивающего
горлышко формирующихся пузырьков. В частности, запуск клатрин-зависимого эндоцитоза
происходит вследствие активации рецепторов, сопряженных с G-белками (англ. G-proteincoupled receptors, сокр. GPCR). Помимо GPCR при клатрин-зависимом эндоцитозе могут активироваться также рецепторы тирозинкиназы, сопряженные с различными внутримембранными
эффекторами, которые, в свою очередь, запускают различные сигнальные пути (Roy C.L.,
Wrana J.L., 2005; Sorkin A., von Zastrow M., 2009; Scita G., Di Fiore P.P., 2010). Активация различных рецепторов может происходить как на мембране, в процессе образования клатриновых
ямок, так и при интернализации лиганда внутрь клетки. GPCR и рецепторы тирозинкиназы сопряжены с MAPK- и PI3K-сигнальными путями.
Пиноцитоз относится к актин-зависимому эндоцитозу, в процессе которого формируются
мелкие (0,07-0,1 мкм) и крупные (ок. 0,2 мкм) эндоцитотические пузырьки неодинакового размера и формы, называемые соответственно микро- и макропиносомами (Swanson J.A., Watts C.,
1995). Данный вид эндоцитоза обеспечивает неселективный захват растворенных в интерстициальном пространстве макромолекул. Этот процесс включает в себя обширную перестройку
плазматической мембраны и интернализации большого количества внеклеточной жидкости.
Пиноцитоз зависит от передачи сигнала к цитоскелету, и поэтому он сильно зависит от активности белков семейства Rho (G-белки) и связанных с ними эффекторов, таких как Ras и PI3K
(Hoeller O. et al., 2013).
При исследовании биологических эффектов немаловажным является изучение сигнальных
путей, которые могут приводить к функциональному изменению статуса многих клеток. К сожалению, в литературе нет данных о сигнальных путях, которые специфически запускают НА
частицы. Тем не менее, есть некоторые данные (Roy R. et al., 2014), свидетельствующие в пользу возможной неспецифичности запуска сигнальных путей искусственными наночастицами,
таких как: сигнальный путь с участием митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK), сигнальный пусть с участием фермента фосфоинозитид-3-киназы (PI3K) и сигнальный путь с участием транскрипционного фактора «каппа-би» (NF-κB). Как отмечено в ряде работ, НА частицы
17
захватываются клетками преимущественно клатрин-зависимым эндоцитозом или макропиноцитозом (Faklaris O. et al., 2009; Liu K.-K. et al., 2009; Prevedebtseva E. et al., 2013; SolarskaŚciuk K. et al., 2014). В частности, по клатрин-зависимому механизму осуществляется эндоцитоз активированных рецепторов, находящихся на поверхности клетки (Roy C.L., Wrana J.L.,
2005). Клатрин-зависимый эндоцитоз связан с возможным запуском, по крайней мере, двух
сигнальных путей, таких как MAPK и PI3K (Adams A. et al., 2000; Gaidarov I. et al., 2001;
Howe C.L. et al., 2001; Haucke V., 2005). По аналогии с наноразмерными частицами оксида цинка можно предположить, что НА частицы также могут активировать сигнальные пути: MAPK,
PI3K и дополнительно NF-κB (Huang H. et al., 2007; Roy R. et al., 2014).
Сигнальные пути MAPK – группа мультифункциональных внутриклеточных сигнальных
путей, содержащих одну из митоген-активируемых протеинкиназ (Imajo M. et al., 2006). У млекопитающих известно четыре основных MAPK-сигнальных пути: пути ERK (англ. extracellular
signal-regulated kinase), ERK5 (англ. extracellular signal-regulated kinase 5), JNK (англ. c-Jun Nterminal kinase) и p38 (рис. 1.П.). Как правило, сигнальные пути ERK отвечают на ростовые
факторы, в то время как JNK и p38 реагируют на клеточный стресс. Сигнальный путь ERK5 активируется преимущественно под действием морфогенетических сигналов (например, гормонов), что приводит к формированию эндотелия полостей организма в процессе эмбриогенеза
(Glatz G. et al., 2013). Активация ERK-пути приводит к «выживанию» клеток, пролиферации и
увеличению подвижности клеток (Mendoza M.C. et al., 2011). Активация путей JNK и p38 приводит к апоптозу, блокированию роста или деления клеток и клеточной дифференцировке
(Imajo M. et al., 2006). Сигнальный путь PI3K – внутриклеточный сигнальный путь, центральными компонентами которого являются ферменты фосфоинозитид-3-киназа, киназы AKT и
mTOR (рис. 1.П.; Mendoza M.C. et al., 2011). Это один из универсальных сигнальных путей, характерных для большинства клеток. Он отвечает за уход от апоптоза, рост, пролиферацию клеток и метаболизм. Сигнальный путь NF-κB – внутриклеточный сигнальный путь, центральным
компонентом которого является транскрипционный фактор NF-κB (рис. 1.П.; Berridge M.J.,
2012). Этот сигнальный путь активируется в ответ на такие внешние стимулы, как TNF-α, IL-1 и
некоторые характерные для патогенов молекулы (англ. pathogen-associated molecular patterns,
сокр. PAMP). NF-κB контролирует очень большую группу генов, которые отвечают за процесс
воспаления, пролиферацию клеток и апоптоз.
Однако на сегодняшний день не хватает данных, чтобы выстроить четкую картину запуска
сигнальных путей НА частицами. Равно как нет данных, какое влияние, в этой связи, играет
размер НА частиц, их агрегатное состояние и химический состав поверхности частиц, равно как
нет данных о влиянии нахождения НА частиц в вакуолярном аппарате на клетку. Данная область является актуальной для дальнейшего исследования в связи с проблемой перспективных
18
исследований НА для медицины, так как сигнальные пути – основа всех клеточных процессов,
сопряженных с процессами взаимодействия клеток организма с факторами внеклеточной среды, таких как обмен информацией, рост, метаболизм, а также апоптоз (программа клеточной
смерти, которая запускается при получении рецепторами определённых сигналов).
1.2.2. Биосовместимость наноразмерных алмазных частиц
Исследование бисовместимости наночастиц проводится в клеточных культурах in vitro и
на животных in vivo (Barile F.A. et al., 1994; Eisenbrand G. et al., 2002; Oberdörster G. et al., 2005).
Первый способ является довольно быстрым и достаточно недорогим, чтобы оценить первоначальный риск использования наноматериала. В качестве клеточных культур использовались:
альвеолярные МФ (дыхательной системы) (Lam C.W. et al., 2004; Oberdörster G. et al., 2005;
Warheit D.B. et al., 2004), кератиноциты и фибробласты (кожных покровов ягодиц) (Shvedova A.A. et al., 2005), нейробластомы (злокачественные клетки из опухоли симпатической
нервной системы) и линии клеток феохромоцитомы PC-12 (злокачественных клеток, происходящих из нейрональных клеток хромаффинных клеток мозгового вещества надпочечников), а
также клетки крови и эпителиальные клетки (Schrand A.M., Dai L. et al., 2007). Тем не менее,
исследование биосовместимости на выбранной модели биологической системы: клеточная
культура (in vitro) или животное (in vivo), - может нести в себе экспериментальную вариабельность получаемых данных и требует учета в целом уникальной роли каждого типа изучаемых
клеток в организме. Белые кровяные клетки (такие как нейтрофилы, лимфоциты, моноциты и
их производные) являются, прежде всего, ответственными за иммунный ответ и опосредуют все
типовые патологические реакции в ответ на чужеродный материал, что делает и организовывает их более универсально пригодными для изучения биологических эффектов наноматериалов.
Универсальной реакцией клеток, отражающей биологический ответ на воздействие наночастицами, является так называемый окислительный стресс с образованием активных форм кислорода (АФК), и, как следствие, вероятное повреждение целостности мембран клеток, что определяет необходимость исследования этого феномена при исследовании биотропности и биосовместимости НА (Nel A. et al., 2006).
Ранее было показано, что большинство углеродсодержащих материалов обладают химической инертностью с минимальной химической активностью по отношению к клеткам организма
млекопитающего (Freitas R.J., 2003). Однако наноразмерные формы углерода (такие как нанотрубки, фуллерены, НА), с очень маленькими размерами, высокой площадью по отношению к их
объему и реакционной поверхностью, значительно влияют на проницаемость и движение клеток (Dai L., 2006; Hurt R.H. et al., 2006). Необходимо сразу отметить, что углеродсодержащие
материалы обладали более высоким показателем биосовместимости, чем остальные искусственные наноматериалы, такие как наночастицы металлов и их оксиды, «квантовые точки» (Ан-
19
дреев Г.Б. и др., 2008; Фатхутдинова Л.М. и др., 2009). G. Jia et al. (2005) обнаружили, что цитотоксичность углеродных наноматериалов увеличивается в следующей последовательности: НА,
черная сажа (англ. carbon black, CB), многослойные углеродные нанотрубки (англ. multi-walled
nanotubes, MWNT) и однослойные нанотрубки (англ. single wall nanotubes, SWNT), - в различных типах клеток, включая нейробластомы, кератиноциты и МФ, после инкубации 24 часа. В
целом ряде работ (Yu S.J. et al., 2005; Huang H. et al., 2007; Liu K.-K. et al., 2007; Schrand A.M.,
2007; Schrand A.M., Dai L. et al., 2007) было показано, что НА захватываются различными клеточными линиями, оставаясь при этом биосовместимыми с ними. При этом НА не вызывали
воспалительных или цитотоксических реакций, обусловленных образованием АФК, морфологических изменений клеток, изменений их жизнеспособности.
Во многих работах, исследующих НА по биосовместимости, практически не упоминается
влияние «химии» поверхности НА и наличия примесей, что затрудняет делать выводы о влиянии
данных
параметров
на
показатель
биосовместимости.
Например,
в
работе
I. Dion et al. (1993) по исследованию гемосовместимости использовали порошок НА (de Beers
Industrial Diamond Division Ltd., Швейцария), содержащих следующие примеси: 0,05 мас.%
алюминия, 0,05 мас.% железа, 0,15 мас.% кремния и 1,00 мас.% циркония. Тем не менее, эти
низкие концентрации примесей не оказали цитотоксического действия на другие клеточные
культуры (Dion I. et al., 1994). Однако в настоящее время большинство примесей в НА удаляется в процессе их глубокой очистки, которая к тому же изменяет «химию» поверхности наночастиц. Например, некоторые исходные порошки НА (Институт биофизики СО РАН,
г. Красноярск; НПО «Алтай», г. Бийск) содержали около 5,7% железа, после очистки содержали
уже около 1,2% (Бондарь В.С., Пузырь А.П., 2004). Влияние «химии» поверхности НА изучали
A.M. Schrand, L. Dai et al. (2007). Они показали, что НА (NanoCarbon Research Institute Ltd.,
Япония) размером от 2 до 10 нм, полученные детонационным синтезом и прошедшие очистку
крепкими кислотами и основаниями, в концентрации до 100 мкг/мл, были не токсичны для разных линий клеток после инкубации в течение 24 часов. Для оценки жизнеспособности клеток
авторы использовали тест на проницаемость митохондриальных мембран (англ. mitochondrial
membrane permeabilization, сокр. MMP-тест). Было обнаружено заметное различие в реакции на
НА частицы между двумя типами клеточных культур – МФ и нейробластомы, связанное с относительно повышенным количеством углеродного наноматериала, захваченного МФ. Авторы
отмечали, что МФ по сравнению с клетками нейробластомы в большей степени присуща функция инициирования воспалительной реакции или запрограммированной смерти клетки (апоптоз). Несмотря на эти различия, в целом наблюдали небольшую продукцию АФК и сохранение
целостности мембран митохондрий в обеих клеточных линиях. Авторы сообщали о том, что
присутствие примесей (например, железа) имеет большое влияние на окислительный стресс
20
клеток. Эти данные также в связи с невыясностью влияния НА в ряде других химических примесей и возможных вариантов их количественного присутствия требуют исследования их
свойств в каждом случае и определения отнесения их к относительно химически инертным материалам.
Важными характеристиками биосовместимости наночастиц также являются её дозозависимость и зависимость от размера частиц. По сравнению с другими авторами (Chao J.I. et al.,
2007), работавшими с карбоксилированными НА (Microdiamant, Швейцария; General Electric
Company, США), в работах отечественных исследователей А.П. Пузыря с соавторами
(2004 a, b; 2005 a, b, c) концентрация используемых частиц НА (Институт биофизики СО РАН,
г. Красноярск; НПО «Алтай», г. Бийск) была немного выше (соответственно 1 мг/мл и
1,25 мг/мл). В данных работах авторы не изучали непосредственное влияние концентрации НА
частиц на клетки, так как данный параметр считался малозначимым фактором биосовместимости. Это было обусловлено тем, что в более ранних работах (Tse R.L., Phelps P., 1970; Spilberg I. et al., 1982; Higson F.K., Jones O.T., 1984) с частицами алмазов микронного размера (10-6)
проводились исследования при относительно высоких концентрациях от 4 до 10 мг/мл, при которых частицы проявляли свою относительную биосовместимость при их инкубировании с клеточной культурой во временном промежутке от 12 минут до 4 часов. Недавние исследования
биосовместимости НА были ограничены дозировкой в 100 мкг/мл с целью избежать чрезмерной агрегации наночастиц и биологической перегрузки клеток, так как использование НА даже
в этих дозах представляется нереалистичным с точки зрения терапевтического воздействия.
J.I. Chao et al. (2007) обнаружили, что инкубирование in vitro клеток легочного эпителия человека (A549) с 5 нм и 100 нм карбоксилированными НА (Microdiamant, Швейцария; General Electric Company, США) в концентрации до 1000 мкг/мл не привело к изменениям структурной организации или жизнеспособности клеток, однако довольно часто наночастицы обнаруживали на
поверхности или внутри живых клеток при использовании спектроскопии комбинационного
рассеяния света (или рамановской спектроскопии) или флуоресцентного конфокального микроскопа. Однако не так давно V. Thomas et al. (2012) показали, что карбоксилированные НА размером 6-100 нм (98 мас.%) (Nanostructured and Amorphous Materials, Inc., США; Hyprez-Engis
Inc.,
США),
инкубированные
с перевиваемой
макрофагальной клеточной
культурой
(RAW264.7), снижали пролиферацию клеток при концентрации наночастиц 50 мкг/мл, а также
одновременно снижали метаболическую активность при концентрации наночастиц 200 мкг/мл.
K.-K. Liu et al. (2007) обнаружили небольшое, но существенное, снижение жизнеспособности клеток после инкубации с карбоксилированными НА небольшого размера (5 нм) (ultrFine
Diamond, Россия) по сравнению с крупными наночастицами (100 нм) (General Electric Company,
США). Тем не менее, S.J. Yu et al. (2005), используя различные методы анализа, подтвердили
21
высокую биосовместимость флуоресцентных НА размером от 2 до 100 нм (Element Six, США).
Они исследовали биосовместимость сравнительно крупных синтетических наноалмазных частиц (около 100 нм), которые предварительно облучали ультрафиолетовым излучением (УФизлучением), для образования довольно стабильных и ярко флуоресцирующих азот-вакантных
центров (англ. nitrogen-vacancy center, NV-центров). Они обнаружили при помощи MMP-теста
высокую биосовместимость данных НА после инкубирования их с клетками человеческой почки (293T) в течение 3 часов и при концентрациях наночастиц, достигающих 400 мкг/мл.
A.M. Schrand (2007), A.M. Schrand, L. Dai et al. (2007) и H. Huang et al. (2007) изучали более
мелкие нелюминесцентные НА (от 2 до 10 нм; NanoCarbon Research Institute Ltd., Япония) при
более низких концентрациях наночастиц (до 100 мкг/мл) и в течение более продолжительного
времени инкубации (обычно 24 ч). Хотя в данных исследованиях не был показан эффект влияния размера на показатель биосовместимости, более малые частицы размером 5 нм (ultraFine
Diamond, Россия), содержащие более 15% углеродных атомов на своих поверхностях, продемонстрировали разнообразные свойства по сравнению с частицами большего размера (100 нм)
(General Electric Company, США) (Tu J.-S. et al., 2006). V. Thomas et al. (2012) при помощи проточной цитометрии показали значительное снижение жизнеспособности макрофагальной клеточной культуры (RAW264.7) в ответ на взаимодействие с НА (Nanostructured and Amorphous
Materials, Inc., США; Hyprez-Engis Inc., США) размером от 6 до 500 нм в связи с их некрозом
независимо от размера частиц. Использование животных, таких как лабораторные мыши, крысы и кролики, для in vivo исследований биосовместимости наночастиц позволяет понять кинетику накопления и выведения наноматериалов. Исследования НА in vivo показывают стабильные положительные результаты (Пузырь А.П. и др., 2004a, b; 2005a, b, c; Бондарь В.С. и др.,
2005; Dolmatov V.Y., 2006). Например, НА (Институт биофизики СО РАН, г. Красноярск; НПО
«Алтай», г. Бийск) при концентрациях от 0,002 до 0,05 мас.% не влияют на показатели веса и
репродуктивную способность мышей, а также не вызывают воспалительных процессов у крыс.
На крысах было показано, что низкой цитотоксичностью обладает гидрозоль НА с полулетальной дозой (средней дозой, вызывающей гибель половины членов группы животных) более
7000 мг/кг по сравнению с раствором хлорида натрия с полулетальной дозой 3000 мг/кг (Dolmatov V.Y., 2006). Также данными авторами было показано, что гидрозоли НА обладают свойством энтеросорбента (агент детоксикации). В 2005 г. в России была защищена диссертационная
работа, в которой исследовали морфологическую характеристику органов (печени, почки и легкого) экспериментальных животных (белые беспородные мыши линии ICR) при пероральном
введении детонационных наноалмазов (Тян А.Г., 2005). Примечательным является тот факт, что
автор данной работы использовала НА той же марки, что и в данной диссертационной работе
(«УДА-В-ГО»). В данном экспериментальном исследовании впервые было установлено, что по-
22
стоянное пероральное введение НА в течение шести месяцев в организм мышей не вызывает
гибели животных и не вызывает нарушений в гистологической структуре исследуемых органов.
На основании полученных данных впервые было установлено, что детонационные НА марки
«УДА-В-ГО» обладают высокой биосовместимостью при конкретном способе введения, не
дающем представления о реальной действующей дозе на конкретные клеточные системы. Тем
не менее, до сих пор не исследованы механизмы высокой биосовместимости НА как в in vitro,
так и in vivo. Для четкого понимания данного феномена необходимы дальнейшие исследования.
Таким образом, необходимо отметить, что вопрос биосовместимости и биологических эффектов дозозависимости и зависимости от размера НА частиц равно как и химических примесей на
данный момент времени в связи с их слабой изученностью (конкретно в отношении каждого из
вариантов НА), в связи с целевыми особенностями их использования и достаточно противоречивый характером имеющихся данных требует дальнейшего изучения.
1.2.3. Биологические эффекты, оказываемые наноразмерными алмазными частицами
Многие наноразмерные частицы (например, металлы и их оксиды, оксид кремния и др.)
могут способствовать усилению воспалительной реакции, происходящему в связи с повреждением лизосомных мембран, выбросом гидролитических ферментов и повышением экспрессии
провоспалительных медиаторов и цитокинов (Arora S. et al., 2012). Они, в свою очередь, «информируют» иммунные и другие типы клеток о наличии и месте деструктивного процесса или
антигенов, побуждая их мигрировать в область поражения и для удаления патогена, а также
восстановления целостности ткани через воспалительные, пролиферативные и репаративные
процессы (Шкурупий В.А., 2007; Струков А.И., Серов В.В., 2013). Выбор типа клеток как для
исследования биосовместимости, так и для исследованных биологических эффектов, оказываемых наноматериалами, может быть основан на их способности участвовать в вышеупомянутых
процессах, а также на их способности к взаимодействию с наночастицами (Swan A. et al., 1990).
С этой точки зрения оптимальным клеточным объектом и процессом являются соответственно
МФ и процесс воспаления на всех этапах его развития.
Будучи захваченными клетками, наночастицы (например, металлов и их оксиды, оксид
кремния и др.) могут взаимодействовать с клеточными органеллами, белками, нуклеиновыми
кислотами; могут быть вовлечены в процессы внутриклеточного сигналинга и пролиферации
(Bogunia-Kubik K., Sugisaka M., 2002; Lewinski N. et al., 2008) и потенциально могут вызывать
нарушения
этих
процессов
(De Jong W.H.,
Borm P.J.,
2008;
Nel A. et al.,
2006;
Shvedova A.A. et al., 2003). Были хорошо изучены и продолжают изучаться биологические эффекты многих искусственных наночастиц (Андреев Г.Б. и др., 2008), однако биологические эффекты, которые могут оказывать частицы НА, остаются малоизученными. Данный феномен
23
обусловлен тем, что интерес к НА появился не так давно, и только в последние десятилетия
стали возникать задачи использования их в биомедицинской сфере (Даниленко В.В., 2004;
Schrand A.M. et al., 2009).
В ранних работах оценивали биологические эффекты частиц алмазов микронного размера,
более крупных, чем НА (Yang W. et al., 2002; Huang T.S. et al., 2004; Poh W., Loh K., 2004). Они
обладали низкой реакционной активностью и высокой биосовместимостью. Несколько исследований полиморфноядерных лейкоцитов показали, что «микронные» алмазы (4-8 мкм; Institute
of Cellular and Molecular Pathology, Бельгия) не вызывают экспрессии АФК (Hedenborg M.,
Klockars M., 1989) с отсутствием дегрануляции или секреции факторов клеточной подвижности
(Higson F.K., Jones O.T., 1984), а также могут фагоцитироваться без хемотаксической активности (Tse R.L., Phelps P., 1970). На других типах клеток, таких как МФ, которые могут захватывать большое количество чужеродных частиц, было показано, что «микронные» алмазы (<0,5 и
1-2 мкм) (The Warren Diamond Power Co., США) не оказывают влияние на профиброгенный
статус МФ (Schmidt J.A. et al., 1984). Они (2-4 мкм; Diamond Products, Sales Ltd.; Triefus, Великобритания) не влияют на жизнеспособность клеток в течение 30 часов (Allison A.C. et al., 1966)
и не активируют (не изменяют) клеточную структуру или продукцию интерлейкина IL-1β
(Nordsletten L. et al., 1996). В клетках соединительной ткани, в том числе и в фибробластах, алмазы микронного размера не вызывают профиброгенной активности (2-4 мкм; Diamond Products, Sales Ltd, Великобритания) (Luhr H.G., 1958; Allison A.C. et al., 1966), высвобождения факторов пролиферации (<0,5 и 1-2 мкм; The Warren Diamond Power Co., США) (Schmidt J.A. et al.,
1984) и не оказывают митогенного эффекта (1-5 мкм; A. Landau Co., США) (Cheung H.S. et al.,
1984). K. Bakowicz-Mitura et al. (2007) исследовали влияние «микронных» алмазов (0,2-1,8; 0,81,0 и 9,1-72,7 мкм; Laboratory of Biomedical Engineering, Technical University, Польша) на экспрессию некоторых человеческих генов: SOD1, FRAP1, JUN и GADD45, - которые ответственны за развитие клеточного ответа на стресс: ингибирование окислительного стресса (SOD1),
генотоксический стресс (FRAP1 и GADD45) и тепловой шок (JUN). Авторы показали, что данные «микронные» алмазы имеют высокую биологическую активность на молекулярном уровне
и влияют на изменение экспрессии данных генов. «Микронные» алмазные частицы повышали
экспрессию ингибитора окислительного стресса SOD1 (антиоксидантное действие), снижали
экспрессию генов, ответственных за развитие генотоксического стресса (FRAP1 и GADD45), и
снижали экспрессию гена теплового шока (JUN). По этим данным «микронные» алмазные частицы подавляли развитие клеточного ответа на стресс.
Более поздние работы с НА частицами (2-100 нм; Element Six, США; 2-10 нм; NanoCarbon
Research Institute Ltd., Япония) также продемонстрировали, что они обладают высокой биосовместимостью с различными типами клеток, такими как альвеолярные МФ, кератиноциты,
24
клетки нейробластомы, клетки феохромоцитомы PC-12 и другими (Yu S.J. et al., 2005;
Schrand A.M. et al., 2007). Было показано, что данные НА как и «микронные» алмазы не вызывают образования АФК (Schrand A.M. et al., 2008). K.-K. Liu et al. (2009) показали, что 100 нм
карбоксилированные НА (General Electric Company, США), захваченные как раковой линией
клеток A549 из альвеолярного эпителия, так эмбриональными фибробластами 3T3-L1, в течение 10 дней деления равномерно распределялись между дочерними клетками и не попадали в
область ядра. При адипогенной дифференцировке эмбриональных фибробластов НА также не
вызывали никаких нарушений. Полученные данные также свидетельствуют о том, что НА не
являются цитотоксичными при делении и дифференцировке вышеупомянутых клеток (Liu K.K. et al., 2009). Однако в научной литературе имеются противоречивые данные, что НА от разных отечественных производителей (ЗАО «Алмазный центр», г. Санкт-Петербург; Красноярский научный центр СО РАН, г. Красноярск; НПО «Алтай», г. Бийск; Институт биофизики
СО РАН, г. Красноярск) вызывают разрушение белых кровяных телец и гемолиз эритроцитов
(Puzyr A.P. et al., 2004). Последующий анализ данного феномена показал, что возможно гемолиз
связан со свойствами химической поверхности, агрегацией, «чистотой» и «стерильностью» используемых НА. H. Huang et al. (2007, 2008a, 2008b) на макрофагальной линии RAW264.7 осуществили мониторинг генов, вовлеченных в воспалительные процессы. Они показали, что 28 нм НА (NanoCarbon Research Institute Ltd., Япония) в концентрации 100 мкг/мл в течение 24-х
часов значительно не повышали экспрессию цитокинов: интерлейкина IL-6, фактора некроза
опухоли альфа (TNF-α), индуцибельной синтазы оксида азота (iNOS), - и не снижали уровень
белка, регулирующего апоптоз (Bcl-X), что свидетельствовало о бисовместимости НА in vitro с
макрофагальной линией клеток, что не наблюдали при использовании других наночастиц.
V. Thomas et al. (2012) показали, что влияние НА различного размера (6-500 нм; Nanostructured
and Amorphous Materials, Inc., США; Hyprez-Engis Inc., США) значительно снижает экспрессию
цитокинов, IL-1β и TNF-α, хемокина CCL2 и фактора роста PDGF в макрофагальной линии
RAW264.7. H.-C. Li et al. (2013) показали, что 35 нм НА (Microdiamant, Швейцария; Element Six,
США), полученные синтезом при сверхвысоких давлениях и температурах, не оказывали значительного повышения уровня цитокинов IL-1β и IL-6 у мышей in vivo. Таким образом, немногочисленные данные свидетельствуют в пользу того, что НА частицы, несмотря на их относительную химическую инертность, не инертны в биологическом смысле, что требует дальнейшего более углубленного изучения.
25
1.3. Наноразмерные алмазные частицы в сфере биомедицины
В последнее десятилетие постепенно возрастает интерес к НА частицам благодаря их уникальным
физико-химическим
и
биологическим
свойствам
(Даниленко В.В.,
2004;
Schrand A.M. et al., 2009; Mochalin V.N. et al., 2012). НА частицы стали проникать в сферу биомедицины, где обнаруживают перспективу их широкого использования.
1.3.1. Использование наноразмерных алмазных частиц в биологии
Последние достижения в области химической манипуляции с НА показали уникальность
данных наночастиц по сравнению с другими хорошо изученными наночастицами. Было показано, что карбоксилированные НА (Институт биофизики СО РАН, г. Красноярск; НПО «Алтай»,
г. Бийск) способны неспецифично абсорбировать на себе рекомбинатные белки апообелина и
люциферазы (Бондарь B.C. и др., 2004). Было предположено, что использование хроматографических методов с набором адсорбирующих белков позволит получить более быструю физическую адсорбцию. С данной целью сравнивали термодинамику связывания лизоцима с 100 нм
частицами карбоксилированных НА (Kay Diamond Products, США) и наночастицами кремнезема (Wu V.W.-K., 2006). Показано, что данные НА обладают, по сравнению с наночастицами оксида кремния, в десять раз большей способностью к связыванию, что может быть обусловлено
в пять раз большей площадью поверхности пористых НА агрегатов. В дополнение к физической адсорбции белков НА могут быть использованы для адсорбции малых молекул, что может
заменить традиционные алюмосиликатные энтеросорбенты для удаления афлатоксина (ядовитого вещества, выделяемого спорами грибка Aspergilus flaws) во время подачи зерна скоту (Пузырь А.П. и др., 2007; Gibson N. et al., 2007). Например, было подсчитано, что 5 нм НА
(ООО «Новые технологии», г. Челябинск) могут нести на себе до двух молекул цитохрома С.
Методы прямого связывания малых молекул и биомолекул с поверхностью НА частиц на данный момент переводятся на методы связывания с функциональной поверхностью данных наночастиц. Одним из первых сообщений такого поверхностного связывания было получение
конъюгатов пептид-НА (Krüger A. et al., 2006). Химическое связывание агента к поверхности
НА дает большую устойчивость конструкции, так как связывание уже не зависит от электростатических сил. Например, возможно связать белок стрептавидина с поверхностью НА (Gansu
Lingyun
Corp.,
Китай),
используя
биотинилированные
НА
(Neugart F. et al.,
2007;
Hens S.C. et al., 2008; Krüger A. et al., 2008). Таким образом, путем химического связывания белок-специфичного зонда с поверхностью наночастиц можно данные зонды использовать для
белок-специфической селекции. Кроме того, последующий электрофорез связанного биоматериала дает возможность аналитически определять количество белка в биологическом образце.
Данный способ может также быть использован для селекции интересующей дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), комплементарной к ДНК, связанной с НА (ООО «Новые техноло-
26
гии», г. Челябинск) (Hens S. et al., 2007), что может быть использовано для создания ДНКмикрочипов на основании НА.
Были достигнуты некоторые результаты в биотехнологии, используя НА частицы в качестве аналитического субстрата. Одной из хорошо изученных сфер является идентификация белка при помощи времяпролетного масс-анализатора масс-спектроскопии (англ. matrix-assisted
laser desorption/ionization time-of-flightmass spectrometry, сокр. MALDI-TOF-MS), где НА используют в качестве подложек для простого сосредоточения биомолекул за счет физической
адсорбции. Порог обнаружения белков был улучшен в два раза (Kong X.L. et al., 2005a). Используя поли-L-лизин-связанные частицы НА (Kay Diamond Products, США) можно накапливать и отделять олигонуклеотиды ДНК от белков (Kong X. et al., 2005b). Кроме того, может
быть осуществлено ферментативное расщепление ДНК, связанного с поверхностью НА.
W.S. Yeap et al. (2008) связали НА частицы (International Technology Center, США) через силановый линкер к специфически связывающим гликопротеинам, чтобы можно было разделить в
белковой матрице и идентифицировать гликопротеины связавшийся с НА при помощи того же
MALDI-TOF-MS. НА хорошо подходят для биологических образцов вследствие их высокой
связывающей способности биомолекул, гидрофильности и большой поверхностной площади по
отношению к объему. Кроме того, НА совместимы с матрицами MALDI и они являются оптически прозрачными для ионного лазера за счет чего это приводит к меньшим помехам по сравнению с другими микрошариками (Kong X.L. et al., 2005a, 2005b; Yeap W.S. et al., 2008). Эти
исследования MALDI-TOF-MS могут проложить путь для дальнейшего развития белкового и
генетического анализа при помощи частиц НА. Можно использовать НА для другого аналитического метода – высокоэффективной жидкостной хроматографии (англ. high pressure liquid
chromatography, сокр. HPLC), основанной на способности выделять люциферазу из загрязненных веществ за счет высокого сродства данного белка с НА матрицами (Пуртов К.В. и др.,
2008). Также было показано, что HPLC на основе НА способен отделять другие небольшие молекулы (Nesterenko P.N., Fedyanina O.N., 2010).
НА являются подходящим материалом для создания платформ, связанных с высокой биосовместимостью наночастиц и их сродству как с малыми, так и с большими молекулам. Это не
удивительно, с учетом успешного применения алмазных пленок (Railkar T.A. et al., 2000) в качестве биосовместимого материала (Yang W. et al., 2002) в электрохимических датчиках
(Fortin E. et al., 2005) и биочипах (Bajaj P. et al., 2007). Кроме того, было показано, что НА порошки (Laboratory of Biomedical Engineering, Technical University, Польша), полученные двумя
разными способами (химическим осаждением из паровой фазы и детонационным синтезом),
нанесенные на подложки, влияли на уровень экспрессии генов, ответственных за развитие клеточного ответа на стресс (окислительный, генотоксический и теплового шока), что приводило к
27
антираковой и антиоксидантной активности (Bakowicz-Mitura K., 2007). Биочипы на основе НА
могут быть изготовлены различными способами, например, с помощью электрофореза или непосредственного ковалентного связывания. А.П. Пузырь с соавторами (2004) показали, что люминесцентные НА биочипы (Институт биофизики СО РАН, г. Красноярск) могут быть изготовлены с использованием белка люциферазы. Также было обнаружено, что НА пленки обладают
большей биосовместимостью по сравнению с платиновыми или кремниевыми пленками, что
обеспечивает большую адгезию и пролиферацию клеток различных линий, включая клетки человека (Bajaj P. et al., 2007). Кроме того, поверхностные свойства, такие как: гидрофобность или
гидрофильность, структурные особенности кристаллов, шероховатость и способность белков
связываться с НА посредством простой физической адсорбции, - также могут повлиять на пролиферацию клеток (Kalbacova M. et al., 2007; Kloss F.R. et al., 2007). Например, культивирование человеческих остеобластов SAOS-2 на НА пленках, окисленных кислородом, показали повышенную метаболическую активность в зависимости от шероховатости поверхности (Kalbacova M. et al., 2007). Таким образом, изменение поверхностных свойств НА пленок может обеспечить создание устройств более высокого уровня сложности, таких как 3D-ткани «скаффолд»
(англ. scaffold technology – культивирование клеток на трехмерных подложках-носителях естественного или искусственного происхождения с целью пространственного формирования клеточного трансплантата) и диагностического оборудования.
Захват НА и эффект, оказываемый наночастицами на клетки, были специально исследованы для биотехнологического применения, такого как доставка ДНК-векторов для трансформации клеток. Было показано, что НА частицы могут быть прослежены внутри клетки как в виде
«голых» НА (Warren Superabrasives, Китай) (Smith B.R. et al., 2007), так в виде конъюгированных с флуорофором TARMA (ООО «Новые технологии», г. Челябинск) (англ. 5(-and-6)carboxytetramethylrhodamine) (Schrand A.M., 2007; Schrand A.M. et al., 2011), а также благодаря
повышенной фотолюминесценции НА (Microdiamant, Швейцария; Element Six, США) (Fu C.C. et al., 2007). Был успешно осуществлен биобаллистический способ доставки ДНК плазмид и
малых молекул, прикрепленных к НА частицам, внутрь клеток. С этой целью можно осуществлять трансфекцию кишечной палочки Escherichia coli (E. coli) и дрожжевых клеток для последующего анализа клеточной экспрессии, используя поли-L-лизин-НА частицы, связанные с
ДНК. В недавней работе были использованы флуоресцентные НА (Element Six, США) для исследования кишечного тракта нематоды Caenorhabditis elegans (C. elegans) (Mohan N. et al.,
2010). Авторы следили за продвижением как «голых» НА, так и конъюгированных частиц с
декстраном и альбумином бычьей сыворотки. НА были инъецированы в гонады и доставлены в
эмбрионы нематоды для оценки их репродуктивного потенциала. Авторы отмечают высокую
яркость, отличную светостойкость и нетоксичность используемого наноматериала, что позво-
28
лило им непрерывно визуализировать всю пищеварительную систему и процесс развития организма за несколько дней. На данный момент времени НА стали популярными для отслеживания
внутриклеточных процессов (McGuinnes L.P. et al., 2011).
1.3.2. Перспективы и проблемы использования наноразмерных алмазных частиц в
медицине
Исследование НА, «голыми» или связанными с небольшими молекулами, дали основания
предположить возможность их применения в качестве средства адресной доставки лекарств в
таких
областях
как
онкология,
кардиология,
гастроэнтерология
и
дерматология
(Bhosale R.R. et al., 2013). Открытые атомы углерода на поверхности НА позволяют связывать
аминокислоты, пептиды, белки, углеводы, нуклеиновые кислоты и различные лекарственные
вещества. Конъюгированные НА (ЗАО «Алмазный центр», г. Санкт-Петербург; NanoCarbon
Research Institute Ltd., Япония; Department of Physics, National Dong Hwa University, Китай) с
различными соединениями показали хорошую эффективность при использовании в терапии рака, а также при доставке лекарственных средств в различные типы клеток (например, клетки
альвеолярного эпителия, макрофаги и др.), сохраняя при этом конформацию и активность прикрепленных молекул (Grichko V. et al., 2006; Huang H. et al., 2007; Cheng C.-Y. et al., 2007). Например, карбоксилированные НА частицы (General Electric, США; NanoCarbon Research Institute
Ltd., Япония), связанные с энзимами или лекарственными веществами (например, с лизоцимом), повышают летальность бактерии (Perevedentseva E. et al., 2007) или раковых клеток
(Huang H. et al., 2007).
Адсорбенты на основе углерода традиционно используются в медицине и фармакологической промышленности для связывания попавших в организм токсинов, которые могут оказаться
смертельными для людей и животных (Anisimov V.N. et al., 1998, 1999a, 1999b; Phillips T.D.,
1999). Существующим адсорбентам доступны для связывания не все токсические вещества.
Например, такой микотоксин как афлатоксин (продукт грибов рода Aspergillus) не является легкодоступным для энтеросорбентов (Phillips T.D., 1999). В процессе изучения физикохимических свойств НА частиц (ООО «Новые технологии», г. Челябинск) обнаружено, что они
способны связывать афлатоксин, что было исследовано методом флуоресцентной микроскопии
и HPLC (Gibson N.M. et al., 2011). В.И. Прохоренков с соавторами (2014) в своей работе обсуждали возможности применения НА частиц (Институт биофизики СО РАН, г. Красноярск) в качестве нового адсорбента для профилактики контактных аллергических дерматитов, вызываемых ионами двухвалентных металлов.
НА могут быть использованы для создания антибактериальной поверхности на имплантатах посредством присоединения ферментов (например, лизоцим) или ионов металлов (таких как
ионы серебра), чтобы уменьшить риск развития инфекции (Ibrahim H.R. et al., 1994;
29
Pace C.N. et al., 1995; Nguyen T.T.B. et al., 2007). Было показано, что комплекс лизоцим-НА
(Element Six, США; General Electric, США) связывался и нарушал внешнюю клеточную мембрану кишечной палочки E. coli, что выразилось в уменьшении бактериальных колоний по
сравнению с контрольным лизоцимом в растворе (Nguyen T.T.B. et al., 2007; Perevedentseva E. et al., 2007). Другие исследования с НА (NanoBlox, Inc., США), помещенными в зольгель синтезированных эпоксиликатных покрытий, продемонстрировали бактерицидное действие против плесневых грибов (Bojkova A.I. et al., 2008).
Различные виды углеродных покрытий, среди которых были представлены алмазоподобные углероды (англ. diamond-like carbon, сокр. DLC) и алмазы, осажденные на поверхности имплантатов, увеличивали их биосовместимость и гемосовместимость, снижали тромбообразование, и, кроме того, повышали коррозийную стойкость данных медицинских изделий (Hauert R.,
2003; Thomas V. et al., 2012). НА покрытия представляют собой перспективный материал для
медицинских ортопедических имплантатов, например, для бедренного или коленного суставов
(Amaral M., Abreu C.S., 2007) и для покрытия определенных компонентов искусственных сердечных клапанов (Mitura S. et al., 1999; Bajaj P. et al., 2007) благодаря их чрезвычайной высокой
химической инертности, гладкости поверхности и хорошей адгезии покрытий к подложке. Как
уже упоминалось выше, исследования показали, что НА частицы не являются бионеактивными
на молекулярном уровне – они оказывают воздействие на уровень экспрессии генов и подавляют развитие окислительного, клеточного и генотоксического стресса (Bakowicz-Mitura K.,
2007).
НА также рассматривают для применения в лечебных целях за счет связывания наночастиц с биологическими материалами, улучшения прочности и надежности композиций, обеспечивающих защиту от вредного УФ-излучения, а также в связи с адсорбцией свободных радикалов и защитой от вирусов и бактерий (Лункин В.В., 2005; Chien-Min S. et al., 2005; Dolmatov V.Y., 2006; Shenderova O. et al., 2007). Например, НА частицы использовали для локального
введения инсулина в очаг воспаления, чтобы помочь бороться с инфекцией после ранения
(Ugazio E. et al., 2002; Shimkunas R.A. et al., 2009). НА, конъюгированные с инсулином
(NanoCarbon Research Institute Ltd., Япония), вносили в гели, мази и на бинты. Когда комплекс
инсулин-НА попадает в среду со слабощелочной pH, инсулин освобождался от НА. Поскольку
раневые поверхности, инфицированные бактериями, имеют pH выше, чем физиологический показатель (pH = 7,4), инсулин будет высвобождаться только там, где имеет место очаг воспаления. Таким образом, в данном случае реализуется локальное высвобождение препарата. Другим
потенциальным применением НА в медицинских препаратах является защита от УФ-излучения
(Shenderova O. et al., 2007). Например, неорганические соединения, такие как сульфат бария,
карбонат стронция, двуоксид титана и оксид цинка, нашли свое применение в солнцезащитных
30
средствах, используемых человеком (Nash J.F., 2006). Было показано, что НА также могут быть
использованы в солнцезащитных средствах, так как множественные дефекты кристаллической
решетки наночастиц поглощают УФ-излучение, способствуя его ослаблению (Zaitsev A.M.,
2001). Фотолюминисцентные дефекты (NV-центры), которые могут быть возбуждены под
влиянием УФ-излучения,
O. Shenderova et al. (2007)
излучают
свет
в
продемонстрировали,
«безопасной» видимой области
что
НА,
размером
около
спектра.
50-100 нм
(ООО «Новые технологии», г. Челябинск), эффективно поглощают УФ-излучение без ущерба
для прозрачности образца в солнцезащитных кремах.
Положительные результаты по адресной доставке или клеточному отслеживаю при помощи НА дали дополнительный толчок для изучения лечебных свойств НА частиц на животных
(мыши, собаки) и на людях, больных раком (Huang L.C.L., Chang H.C., 2004; Grichko V. et al.,
2006; Chao J.I. et al., 2007; Neugart F. et al., 2007). Лечение аденокарциномы у экспериментальных мышей линии Af при помощи перорального применения суспензии НА (СКТБ «Технолог»,
г. Санкт-Петербург) продлевала срок жизни приблизительно на 38% по сравнению с контрольной группой (Долматов В.Ю., Кострова Л.Н., 2000; Долматов В.Ю., 2003a, 2003b). Помимо этого, введение высоких концентраций НА (от 2,5 до 3% водной суспензии), произведенных ЗАО
«Алмазный центр» (г. Санкт-Петербург), показало, что они не обладают мутагенными свойствами в половых клетках мышей (Dolmatov V.Y., 2006). Ряд исследований В.Ю. Долматова с соавторами (Долматов В.Ю., Кострова Л.Н., 2000; Долматов В.Ю., 2003b; Dolmatov V.Y., 2006) на
людях с четвертой стадией рака продемонстрировали способность водных и масляных суспензий используемых ими НА при пероральном применении улучшать состояние пациентов не зависимо от локализации начальной опухоли (кишечник, желудок и др.) после химио- и радиотерапии.
Приведенные выше результаты многочисленных работ свидетельствуют о перспективности использования НА частиц как в сфере биологии, так и в сфере медицины. Тем не менее, для
внедрения НА частиц непосредственно в медицину требуется глубокое изучение их биосовместимости и биологических эффектов, которые они могут оказывать как на клетку, так и на организм в целом, так как это является необходимым этапов для оценки цитотоксических воздействий наноматериалов (Онищенко Г.Г. и др., 2007). В настоящее время имеется ряд работ, показавших относительно высокую биосовместимость НА in vitro и in vivo (Тян А.Г., 2005;
Schrand A.M. et al., 2009; Shenderova O.A., Gruen D.M., 2012). Однако имеющихся данных в настоящее время пока не хватает для полного обоснования и объяснения механизмов, оказываемых НА частицами на клетку и на организм в целом на конкретных моделях типовых патологических процессов, в которых эффекты только НА могут быть очевидны. Для этого в большей
степени, подходят исследования in vitro фагоцитирующих клеток, участвующих в опосредова-
31
нии всех типовых реакций организма на повреждающие факторы на разных стадиях ответной
реакции организма. Условия in vitro более точно отражают характер реакций фагоцитов на интернализацию НА частиц, нежели в условиях in vivo, поскольку они предполагают модулирующее влияние на МФ и их функции регуляторных систем организма и клеток иного гистогенеза,
мишенью которых МФ являются. Тем не менее, можно ожидать, что НА как и другие наночастицы ксенобиотической природы могут оказывать разного рода влияние на характер развития
типовых патофизиологических реакций (Hurt R.H. et al., 2006; Arora S. et al., 2012). Одним из
важнейших типовых патофизиологических реакций для организма человека является воспаление (Воложин А.И., Порядин Г.В., 2006; Струков А.И., Серов В.В., 2013).
1.4. Современные представления о воспалении
По современным представлениям воспаление является ответной защитно-компенсаторной
реакцией организма на повреждения разного генеза: механических, физических, химических и
биологических факторов (Воложин А.И., Порядин Г.В., 2006; Serhan C.N. et al., 2010; Струков А.И., Серов В.В., 2013; Kumar V. et al., 2014). Воспаление – одна из самых древних реакций
организма животных и человека на патогенные воздействия и представляет собой наиболее
часто встречающуюся форму типового компенсаторно-приспособительного процесса (Ehlers S.,
Kaufmann S.H.E., 2010; Okin D., Medzhitov R., 2012). Воспаление составляет патогенетическую
основу многих болезней.
Воспаление по своим проявлениям может быть острым (длиться несколько минут или часов), подострым (несколько дней или недель) и хроническим (длящимся от нескольких месяцев до пожизненного с момента ремиссии и обострения) (Струков А.И., Серов В.В., 2013;
Kumar V. et al., 2014). Воспаление представляет собой единый двухфазный защитнокомпенсаторный процесс, включающий два основных взаимосвязанных компонента: деструктивно-экссудативный и репаративно-регенеративный. Оно может развиваться с преобладанием
как деструктивных, так и восстановительных проявлений (полноценных и неполноценных).
Любое воспаление в своём развитии, как правило, проходит через три стадии, выраженные в
той или иной степени (Воложин А.И., Порядин Г.В., 2006; Струков А.И., Серов В.В., 2013):
1) альтерацию – повреждение клеток и тканей,
2) экссудацию – выход жидкости и клеток крови из сосудов в ткани и органы,
3) пролиферацию (или продуктивную стадию) – размножение клеток и разрастание соединительной (волокнистой и дифференцированной паренхиматозной) тканей, в результате чего и происходит восстановление в той или иной мере целостности разрушенных структур организма.
В зависимости от характера агента, вызывающего воспаление, различают септическое
(инфекционное) и асептическое (неинфекционное) воспаление (Новицкий В.В. и др., 2009).
32
Асептическое воспаление возникает под влиянием механических, физических (лучевая и электрическая энергия, высокие и низкие температуры, различного рода травмы) и химических повреждающих воздействий (различные химические вещества, токсины и яды). Инфекционное
воспаление возникает при внедрении в ткани живых возбудителей болезни (вирусы, бактерии,
грибы и животные паразиты) и развивается преимущественно остро и тяжелее асептического.
При некоторых видах инфекции и микотических поражениях воспаление приобретает подострое и хроническое течение. Для аэробной инфекции, вызываемой стрептококками, синегнойной палочкой и некоторыми другими микроорганизмами, характерно гнойное воспаление. Под
воздействием факультативных анаэробов развивается гнилостное воспаление.
В зависимости от преобладания той или иной фазы также различают экссудативное и пролиферативное (продуктивное) воспаление (существование ранее выделявшегося альтеративного
воспаления в настоящее время отвергается) (Каминский Ю.В. и др., 2005). По характеру развития стадии экссудации выделяют: серозное, фибринозное, гнойное, гнилостное, геморрагическое, катаральное (слизистое) и смешанное воспаление. По характеру продуктивной (пролиферативной) стадии выделяют: гранулематозное, межуточное (интерстициальное) воспаление,
воспаление с образованием полипов и остроконечных кондилом и воспаление вокруг животных-паразитов и инородных тел (Роуз А.Г., 2010; Пауков В.С., Литвицкий П.Ф., 2012).
Альтерация – повреждение биологических структур на всех уровнях их организации, является инициальной фазой воспаления и проявляется различного вида дистрофией и некрозом
(Воложин А.И., Порядин Г.В., 2006; Струков А.И., Серов В.В., 2013). На этой фазе воспаления
происходит выброс биологически активных веществ – медиаторов воспаления. Медиаторы воспаления могут быть плазменного (гуморального) и клеточного (тканевого) происхождения.
Плазменные медиаторы воспаления – это представители калликреин-кининовой (кинины,
калликреины), свертывающей и противосвертывающей (XII фактор свертывания крови, или
фактор Хагемана, плазмин) и комплементарной (компоненты C3-C5) систем. Медиаторы этих
систем повышают проницаемость микрососудов, активируют хемотаксис полиморфно-ядерных
лейкоцитов (или нейтрофилов), фагоцитоз и внутрисосудистую коагуляцию.
Основными клетками, регулирующими развитие воспаления (клеточные медиаторы
воспаления), служат тучные клетки и МФ, которые выделяют ряд медиаторов или способствуют выделению факторов, влияя на приток лейкоцитов из сосудистого русла в поврежденные
ткани (Пальцев М.А. и др., 2003). Эти факторы регулируют тонус сосудов и их проницаемость.
Дегрануляция базофилов приводит к выделению воспалительных медиаторов, включая гистамин, аденозинтрифосфат (АТФ) и серотонин. Под их действием усиливается синтез простагландинов, тромбоксанов, лейкотриенов и фактор активации тромбоцитов (англ. plateletactivating factor, сокр. PFA) как в базофилах, так и в других клетках, которые способствуют ди-
33
латации сосудов. Под действием плазменного каликреина из кининогена плазмы в зоне воспаления образуется брадикреин (Michel C.C., Currt F.E., 1999). При активации брадикреина происходит стимуляция выделения оксида азота (NO) эндотелиальными клетками, также способствующего вазодилатации (увеличение просвета кровеносных сосудов). Провоспалительные цитокины IL-1 и TNF-α продуцируются многими клетками, включая в первую очередь активированные моноциты и МФ (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008; Ярилин А.А., 2010;
Male D. et al., 2013). Они индуцируют экспрессию на эндотелиальных клетках ряда адгезивных
молекул, секрецию эндотелием IL-6 и металлопротеиназ, а также изменяют сократимость гладкомышечных клеток сосудов. Таким образом, при воспалении синтезируется и продуцируется
ряд вазоактивных компонентов, источником которых являются клетки воспалительного инфильтрата, эндотелий и компоненты плазмы (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008).
Экссудация – фаза, быстро следующая за альтерацией и выбросом медиаторов (Воложин А.И., Порядин Г.В., 2006; Serhan C.N. et al., 2010; Струков А.И., Серов В.В., 2013;
Kumar V. et al., 2014). Она складывается из ряда стадий: реакция микроциркуляторного русла с
нарушением реологических свойств крови, повышение сосудистой проницаемости на уровне
микроциркуляторного русла, экссудация составных частей плазм крови, эмиграция клеток крови, фагоцитоз, образование экссудата и воспалительного клеточного инфильтрата. Изменение
микрососудов начинается с рефлекторного спазма, уменьшающего просвет артериол и прекапилляров, который быстро сменяется расширением всей сосудистой сети зоны воспаления.
Изменение тонуса сосудов сопровождается нарушением сосудистой проницаемости, в частности барьерной функции эндотелия (Aaronson D.S., Horvath C.M., 2002). Нейтрофилы способствуют усилению проницаемости макромолекул сквозь эндотелиальный барьер путем продукции лейкотриена B4, C5a, 1-формил-метионл-лейцин-фенилаланина и PFA. Гистамин, брадикинин, серотонин и лейкотриен C4 могут инициировать усиление проницаемости независимо
от присутствия нейтрофилов (Michel C.C., Currt F.E., 1999). Дегрануляция тучных клеток также
вызывает нарушение эндотелиального барьера, особенно в зоне посткапиллярных венул. Моноциты/МФ и лимфоциты являются источником IL-1, TNF-α, IL-2 и IL-8, способствуют продукции эндотелиальными клетками свободных радикалов кислорода, NO и фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), усиливающих нарушения барьерной функции (Kubes P., Ganger D.N.,
1992). Помимо провоспалительных цитокинов, ряд клеток, в частности субпопуляция Tлимфоцитов, базофилов и тучные клетки, продуцируют в очаге воспаления IL-4 и IL-10, способствующие экспрессии на поверхности эндотелия адгезивных молекул и моноцитарного хемотаксического
протеина-1
(англ. monocyte
chemoattractant
protein
1,
сокр. MPC-1)
(Mantovani A. et al., 1997). Адгезия лейкоцитов на поверхности эндотелия является важным этапом воспаления для последующей их миграции в очаг поражения (Воложин А.И., Порядин Г.В.,
34
2006; Струков А.И., Серов В.В., 2013; Kumar V. et al., 2014). Образование экссудата и воспалительного клеточного инфильтрата завершает описанные выше процессы экссудации (Струков А.И., Серов В.В., 2013).
Важнейшим этапом, связывающим стадию экссудации и пролиферации, является «очищение» зон деструкции (Steed D.L., 1997). Главным участником в процессе «очищения» поврежденного очага являются фагоцитирующие клетки. Пролиферативные процессы начинаются
вскоре после начала воспаления, но особенно активно они развиваются после отторжения и
гидролиза лизосомальными ферментами МФ некротических масс и уничтожения болезнетворных агентов. Важным моментом данной стадии является то обстоятельство, что чем более эффективно осуществляется «очищение» раны от поврежденных тканей, лейкоцитов и микроорганизмов, тем эффективнее происходит пролиферация элементов тканей с восстановлением их
структуры и функциональной целостности. «Очищение» раны происходит благодаря фагоцитозу в основном за счет нейтрофилов и тканевых МФ, а также лизису макрофагами за счет секреции во внеклеточное пространство гидролитических ферментов и аутолизу поврежденных тканей.
Среди ферментов, осуществляющих деградацию тканей, основную роль играют протеазы
(коллагеназа, эластаза, рибонуклеазы и др.), активность которых индуцируется цитокинами и
простагландинами (Пальцев М.А. и др., 2003; Воложин А.И., Порядин Г.В., 2006). К аспартатным протеиназам относится катепсин D – гликопротеин, обнаруженный в лизосомах, который
вовлекается во внутриклеточный метаболизм, механизм эндоцитоза белков. Цистеиновые протеиназы – катепсины B, L, N и S – также лизосомальные ферменты. Катепсины B и L расщепляют ряд матриксных белков: коллаген IV типа, ламинин, фибронектин, протеогликаны в кислой pH. Действие этих пропептидов во внеклеточном матриксе подобно их действию во внутриклеточной фаголизосоме, однако, полагают, что понижение pH сокращает область внеклеточного действия этих протеиназ и позволяет им действовать только внутри клетки. Сериновые
протеазы – эластаза, катепсин G, активатор плазминогена тканевого типа (tPA), активатор
плазминогена урокиназного типа (uPA) и плазмин – активны при нейтральном pH и требуют
предварительной активации.
Семейство матриксных металлопротеиназ (MMPs) играет ключевую роль в ремоделинге
тканей, как в норме, так и при патологических процессах (воспаление) (Birkedal-Hanses H. et al.,
1993; Chandler S. et al., 1997; Johansson N. et al., 2000). Они участвуют в миграции клеток, расщеплении белков внеклеточного матрикса, активации цитокинов, ростовых факторов и адгезивных молекул, формировании их растворимых форм, способствующих усилению или ингибированию биологических эффектов. MMPs – члены семейства цинкзависимых эндопептидаз,
функционирующих вне клеток. Они секретируются фибробластами, фагоцитами и другими
35
клетками в неактивной форме проэнзимов и активируются во внеклеточном матриксе. Все
MMPs можно подразделить на пять групп: коллагеназы (MMP-1, -8 и -13), стромелизины
(MMP-3, -7, -10, -11 и -12), желатиназы (MMP-2 и -9), MMPs мембранного типа (MT-MMP:
MMP-14, -15, -16, -17 и -24) и другие MMPs (MMP-19, -20 и -23).
Регуляция различными цитокинами активности протеиназ, ответственных за деградацию
внеклеточного матрикса, и контроль синтеза компонентов внеклеточного матрикса – важные
механизмы поддержания локально гомеостатического баланса в организме (Пальцев М.А. и др.,
2003; Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008). Одни и те же цитокины и ростовые факторы
(IL-1, TNF-α и трансформирующий фактор роста бета/TGF-β) в зависимости от действия различных факторов могут оказывать разнонаправленные биологические действия (плейоморфное
свойство). Во многом эффект того или иного цитокина определяется местным микроокружением клетки, секретирующей данный цитокин.
Стадия пролиферации клеток является завершающей фазой воспаления, направленной
на восстановление поврежденных тканей (Воложин А.И., Порядин Г.В., 2006; Serhan C.N. et al.,
2010; Струков А.И., Серов В.В., 2013; Kumar V. et al., 2014). Она представлена регенерацией и
рубцеванием. Процесс репаративной регенерации может развиваться как в структурах организма, производных мезенхимы в соединительнотканных элементах организма (наиболее часто),
так и в паренхиматозных элементах путем митозов, эндомитозов и ацитокинетических митозов
(Маянский Д.Н., 1981), а также путем внутриклеточной регенерации (Саркисов Д.С., Втюрин Б.Ю., 1969). В процессе репарации поврежденной ткани дегрануляция тромбоцитов приводит к высвобождению TGF-β – одного из основных регуляторов репаративных процессов, а
также фактора роста PDGF (Пальцев М.А. и др., 2003; Воложин А.И., Порядин Г.В., 2006). Местное выделение PDGF усиливает пролиферацию мезенхимальных клеток, в частности фибробластов (Vaday G.G., Lider O., 2000). TGF-β влияет на продукцию клетками-мишенями других
цитокинов и ростовых факторов (PDGF, IL-1, TNF-α, фибробластические ростовые факторы bFGF/FGF-2, KGF/FGF-7 и эпидермальный ростовой фактор/EGF) (Wahl S.B., 1994). Кроме того,
TGF-β является мощным хемоаттрактантом для моноцитов/МФ, которые инфильтруют зону повреждения и на более поздних этапах заживления становятся основным источником как провоспалительных цитокинов, так и фиброгенных факторов роста. Взаимодействие моноцитов/МФ с другими клеточными популяциями и межклеточным матриксом реализуется благодаря большому количеству секретируемых ими медиаторов. Для активации репаративных процессов мононуклеарные лейкоциты синтезируют PDGF, TGF-β, IL-1, EGF и b-FGF/FGF-2.
В механизме восстановления строения и функций тканей важнейшая роль принадлежит
пролиферации фибробластов (основных клеток соединительной ткани) (Воложин А.И., Порядин Г.В., 2006; Струков А.И., Серов В.В., 2013; Kumar V. et al., 2014). Взаимодействие различ-
36
ных клеток с фибробластами приводит к их миграции и ускоренной пролиферации, дифференцировке, синтезу и секреции коллагена и других компонентов матрикса. Вновь образуемая
строма из извитых капилляров, называемая грануляционной тканью, начинает заполнять раневое пространство. Затем в зону дефекта мигрируют фибробласты синтезирующие белки основного матрикса. Если процесс репарации развивается в коже, кератиноциты, прилегающие к области повреждения, также оказывают влияние на ход процесса раневого заживления. Синтезируемые ими различные изоформы TGF-β, а также PDGF, регулируют действие на пролиферацию фибробластов, их миграцию в область повреждения и продукцию ими компонентов внеклеточного матрикса (Fleischmajer R. et al., 1998). Пролиферация кератиноцитов при повреждении кожи в свою очередь регулируется инсулин-подобным ростовым фактором-1 (англ. insulinlike growth factor 1, сокр. IGF-1), EGF и KGF/FGF-7. В грануляционной ткани активно развивается процесс неоваскуляризации (патологическое разрастание сосудов). В регуляции ангиогенеза принимают участие FGF-1, b-FGF/FGF-2, TGF-β, IL-6, IL-8 и др. (Ziche M. et al., 1996;
Hanahan D., 1997). Ингибиторами ангиогенеза выступают: TNF-α, IL-1, IL-4, IL-12, интерферон
гамма/IFN-γ и др. (Мнихович М.В. и др., 2012).
В результате комплексного взаимодействия различных воспалительных клеток, компонентов внеклеточного матрикса и медиаторов начинается контракция поврежденного участка
(Пальцев М.А. и др., 2003). Фибробласты приобретают фенотип миофибробластов, появление
которых свидетельствует о формировании полноценной соединительной ткани и начале контракции. Контракция регулируется в основном балансом TGF-β-1, -2 и -3, а также PDGF, при
помощи которых регулируется прикрепление фибробластов к внеклеточному матриксу. Ремоделирование внеклеточного матрикса играет ключевую роль в процессе перехода от грануляционной ткани к рубцевой (Ghahary A. et al., 1996). Одной из основных причин, приводящих к образованию рубца, является избыточная продукция фиброгенных цитокинов, в первую очередь
TGF-β (Tuan T.-L., Nichter L.S., 1998). К другим причинам, способствующим избыточной фиброплазии, относят недостаточность ферментных систем, ответственных за деградацию внеклеточного матрикса, в частности плазминоген, металлопротеиназ и др., а также усиленную пролиферацию фибробластов и повышение продукции ими компонентов внеклеточного матрикса
(Brew K. et al., 2000).
Несмотря на строгую последовательность развития воспалительного процесса, уже в первые часы инициации данного типового патологического процесса запускается активная и скоординированная программа ее последующего разрешения (резолюции) (Serhan C.N., Savill J.,
2005). Попадая в ткани, нейтрофилы способны преобразовывать простагландины арахидоновой
кислоты и лейкотриены (медиаторы воспаления) в липоксины, которые инициируют последовательность терминации воспаления. Как следствие прекращается поступление новых лейкоцитов
37
в очаг воспаления. Данные события совпадают с биосинтезом из омега-3 полиненасыщенных
жирных кислот резолвинов и протектинов, которые сокращают период инфильтрации нейтрофилов и инициируют их апоптоз. Апоптозированные нейтрофилы подвергаются фагоцитозу
макрофагами, что приводит к очистке очага воспаления от нейтрофилов и высвобождению противовоспалительных и репаративных цитокинов, таких как TGF-β1. Провоспалительная программа заканчивается с уходом МФ через лимфатические сосуды.
Необходимо отметить, что ключевая роль в процессе воспаления, начиная с фазы альтерации и заканчивая фазой пролиферации, принадлежит МФ (Карр Я., 1978; Маянский А.Н., 1983;
Струков А.И., Серов В.В., 2013; Van Furth R., 1982). МФ в очаге воспаления является «дирижером» межклеточных взаимодействий (Маянский Д.Н., 1981; Пальцев М.А. и др., 2003; Ярилин А.А., 2010). В зависимости от стадии МФ может менять свой функциональный статус и
проявлять как провоспалительные, гидролитические, профибротические, так и фагоцитозные
свойства.
1.5. Современные представления о макрофагах, клетках системы мононуклеарных
фагоцитов
Моноциты и тканевые макрофаги (МФ) образуют мононуклеарную фагоцитирующую систему организма и наряду с дендритными клетками являются ведущими клетками иммунного
ответа, обеспечивающими переработку антигенов и их презентацию (Карр Я., 1978; Маянский А.Н., 1983; Ярилин А.А., 2010; Van Furth R., 1982; Male D. et al., 2013). МФ способны к
активному захвату и перевариванию бактерий, остатков погибших клеток и других чужеродных
или токсичных для организма частиц. Моноцит представляет собой циркулирующий вариант
предшественников МФ. Дифференцировка моноцита в МФ происходит под влиянием тканевого
микроокружения и сопровождается активацией экспрессии ряда генов. Разнообразие МФ млекопитающих представлено моноцитами крови, МФ белой и красной пульпы, альвеолярными
МФ легких, клетками Купфера в печени, микроглией в нервной ткани.
МФ являются важными участниками раннего неспецифического и специфического иммунного ответа. МФ могут инициировать и модулировать специфический иммунный ответ
вследствие следующих процессов: фагоцитоза микроорганизмов или опсонизированных и иммунных комплексов (Male D. et al., 2013), «обработки» и «представления» антигена иммунокомпетентным клеткам (Wijburg O.L.С. et al., 1997; Fujisawa H., 2001; Burleson G.R., Burleson F.G., 2007;), секреции различных растворимых медиаторов и многочисленных ферментов
(Черношей Д.А. и др., 2010; Zhang P. et al., 2000). Помимо этого, МФ играют ключевую роль в
развитии воспалительного процесса, начиная с фазы альтерации и кончая фазой пролиферации
(Карр Я., 1978; Маянский Д.Н., 1981; Маянский А.Н., 1983; Струков А.И., Серов В.В., 2013;
Van Furth R., 1982).
38
В настоящее время выделяют два основных фенотипа активированных МФ: классически
(М1) и альтернативно активированные (M2) МФ (Монастырская Е.А. и др., 2008; Stable M.J. et al., 2011). M1 МФ активируется под влиянием IFN-γ и TNF-α, в то время как М2 МФ
активируется в результате воздействия интерлейкинов IL-4 и IL-13 (Пинегин Б.В., Карсонова М.И., 2009; Данилец М.Г., 2011; Mantovani A. et al., 2004; Sica A. et al., 2006). МФ фенотипа
М1 обладают провоспалительными свойствами: вырабатывают оксид азота, АФК, провоспалительную группу цитокинов (IL-1, 6, 12, 15, 18, 23; TNF-α), обладают фагоцитозной и микробицидной способностью, индуцируют апоптоз инфицированных клеток и др. М2 МФ продуцируют группу противовоспалительных цитокинов (IL-4, -10, -13, IL-1Ra, IL-18-связывающий белок;
TGF-β), способствуют ангиогенезу и репарации ткани (Sica A. et al., 2006). По функциональной
экспрессии альтернативных маркеров активации в популяции МФ фенотипа M2 выделяют еще
три подмножества: M2a, M2b и M2c (Benoit M. et al., 2008). Было показано, что активация МФ
является пластичной, быстрой и полностью обратимой, предполагается, что популяции МФ являются динамичными и могут сами инициировать повреждение, принимать непосредственное
участие в процессе воспаления, а затем участвовать в его завершении (Porcheray F. et al., 2005;
Benoit M. et al., 2008; Porta C. et al., 2009; Herbein G., Varin A., 2010). В очаге воспаления МФ
изменяют функциональное состояние, вызываемое изменениями в микроокружении (Stout R.D.,
Suttles J., 2004).
Активация МФ определяет изменение его функционального статуса. В частности статус
представленный в его провоспалительном, репаративном, гидролитическом и других видах потенциалов. Активированные МФ могут оказывать влияние на развитие типового патофизиологического ответа организма (например, на повреждение, воспаление и репарацию) (Карр Я.,
1978; Маянский Д.Н., 1981; Маянский А.Н., 1983; Ярилин А.А., 2010; Струков А.И., Серов В.В.,
2013; Van Furth R., 1982; Male D. et al., 2013). Также непосредственно МФ участвуют в таких
важных патофизиологических процессах клетки как: апоптоз, некроз, атрофия и др. Таким образом, для прогноза развития патологического процесса необходимо иметь представление о
функциональном статусе МФ и его изменениях, вовлеченных в данный процесс на разных стадиях его развития.
Одним из важнейших параметров функционального статуса активированного МФ в развитии воспаления и реакции врожденного иммунитета является его провоспалительный и репаративный потенциалы, которые представлены секрецией цитокинов и ростовых факторов (Маянский Д.Н., 1981; Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008; Ярилин А.А., 2010). Цитокины –
ключевые клеточные гуморальные факторы воспаления, необходимые для реализации различных защитных и иных функций организма равно как и функций врожденного и приобретенного
иммунитета. Спектр цитокинов, секретируемых МФ, очень широк: цитокины семейства IL-1 и
39
другие провоспалительные цитокины: TNF-α, IL-6, IL-12, IL-23, IL-27 (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008). МФ продуцируют все три разновидности колониестимулирующих факторов
(GM-CSF, G-CSF и M-CSF), интерфероны (IFN-α, а также IFN-β и IFN-γ), гомеостатический цитокин IL-15, супрессорные цитокины (IL-10 и TGF-β), ростовые или ангиогенные факторы
(фибробластный – FGF, тромбоцитарный – PDGF и сосудистый эндотелиальный – VEGF). Также МФ образуют большую часть провоспалительных хемокинов, макрофагальных хемотаксических белков и другое. Для анализа трансформации функционального статуса МФ в связи с
захватом ими НА частиц и для прогнозирования функционального состояния МФ на разных
стадиях развития процесса воспаления были выделены следующие ключевые цитокины, продуцируемые МФ: IL-1α, TNF-α, GM-CSF и IFN-γ.
IL-1 – собирательное обозначение семейства белков, включающих более 11 молекул (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008; Ярилин А.А., 2010). Наиболее изученными являются IL1α и IL-1β, которые традиционно называют IL-1, поскольку они взаимодействуют с одним и тем
же
рецептором
и
их
эффекты
мало
различимы.
Молекулярная
масса
молекулы-
предшественника IL-1 составляет 30 кДа, а масса зрелых белков – около 18 кДа. IL-1 продуцируется главным образом МФ и в меньшей степени дендритными клетками, эндотелиоцитами,
фибробластами, натуральными киллерами, кератиноцитами и некоторыми Т-хелперами 2-го
типа (Th2-клетки). У IL-1 существует больше 50 различных биологических функций, а мишенями служат клетки практически всех органов и тканей (Dinarello C.A. et al., 1986). Благодаря
столь широкому спектру биологической активности, IL-1 является одним из ключевых цитокинов развития воспалительного и иммунного ответов в организме. При этом его действие может
реализовываться как на системном, так и на местном уровнях. На системном уровне IL-1 вызывает активацию нейроэндокринной системы, влияет на иммунопоэз, иммуностимуляцию, синтез острофазовых белков в печени и стимуляцию костномозгового кроветворения. На местном
уровне IL-1 является главным медиатором развития местной воспалительной реакции и острофазного ответа на уровне организма.
Индукция синтеза IL-1α может быть вызваны целым рядом биологических веществ, главными из которых являются компоненты клеточных стенок бактерий (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008). IL-1α может выполнять, по крайней мере, три основные функции: внутриклеточный регулятор экспрессии различных генов, растворимый биологически активный цитокин и мембранная форма, которая является основным вариантом выполнения IL-1α своих биологических функций. В частности мембранная форма IL-1α стимулирует пролиферацию Tлимфоцитов в очаг воспаления. Помимо этого, IL-1 очень быстро активирует практически все
типы клеток, участвующих в формировании локальной воспалительной реакции, включая фибробласты, эндотелий, резидентные МФ и все типы лейкоцитов крови. Помимо стимуляции вы-
40
хода нейтрофилов в очаг воспаления IL-1 вызывает их активацию, усиливая адгезию, хемотаксис, фагоцитоз и продукцию АФК. Данное влияние IL-1 опосредовано путем индукции синтеза
МФ, эндотелиальными клетками и фибробластами других цитокинов, главным образом IL-18
(Нестерова И.В. и др., 1993). Таким образом, данный провоспалительный цитокин играет ключевую роль при развитии воспалительного процесса на стадии альтерации и экссудации.
На стадии пролиферации IL-1 влияет на метаболизм соединительной ткани и в том числе
костной ткани (Van Damme J. et al., 1987). С одной стороны, IL-1 стимулирует пролиферацию
фибробластов и увеличивает продукцию ими простагландинов, ростовых факторов и ряда цитокинов,
включая
колониестимулирующие
факторы,
интерлейкины
и
интерферон
(Van Damme J. et al., 1987). С другой стороны, IL-1 стимулируя пролиферацию и функциональную активность как остеобластов, так и остеокластов, способствует резорбции хряща и кости.
Под влиянием IL-1 клетки соединительной ткани увеличивают синтез одновременно коллагена
и коллагеназы, а также других ферментов, включая нейтральные протеазы и металлопротеиназы. Роль IL-1 заключается в регуляции общего процесса перестройки соединительной ткани и
кости (Van Damme J. et al., 1987).
TNF-α – представитель другого семейства иммунологически значимых белков (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008; Ярилин А.А., 2010). Это провоспалительный цитокин с широким спектром активности. Трансмембранная форма про-TNF имеет массу 27 кДа, а зрелая
секреторная форма – 17 кДа. Биоактивный TNF представляет собой полипептид с молекулярной массой 52 кДа. Рецепторы TNF присутствуют на всех клетках организма, исключая эритроциты (Brockhaus M. et al., 1990). Основными продуцентами TNF являются МФ, но и другие
клетки организма могут его продуцировать, например, нейтрофилы (Tracey K., Cerami A., 1994).
TNF-α и его рецепторы играют важную роль в защите от инфекций, главным образом от внутриклеточных инфекций (например, Mycobacterium tuberculosis). TNF необходим для оптимальной координации дифференцирования специфических Т-клеток, продуцирующих цитокины
Th1, и развития гранулемы, предотвращающей бактериальный рост и распространение в организме. В течение инфекции TNF увеличивает фагоцитоз и осуществляет функцию инициации
прямого киллинга бактерий совместно с IFN-γ. Действие IL-1 и TNF-α на различные клетки в
условиях in vitro, так же как и системное влияние in vivo, часто биологически неразличимо
(Пальцев М.А. и др., 2003). Как и IL-1 TNF- α является критическим фактором для привлечения
клеток воспаления путем стимуляции хемокинов и продукции адгезивных молекул, приводящих к накоплению мононуклеарных клеток в месте нахождения патогена. На стадии пролиферации TNF-α стимулирует пролиферацию фибробластов, тем самым способствуя заживлению
ран.
41
GM-CSF – это один из трех колониестимулирующих факторов (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008; Ярилин А.А., 2010). Эти факторы называют колониестимулирующими, поскольку впервые были идентифицированы по способности инициировать образование и поддерживать in vitro колонии гемопоэтических клеток соответствующего состава. GM-CSF поддерживает рост как смешанных гранулоцитарно-моноцитарных колоний, так и отдельно колонии гранулоцитов и моноцитов/МФ. Молекулярная масса зрелого белка GM-CSF составляет
22 кДа. Колониестимулирующие факторы продуцируются эндотелиальными клетками и фибробластами, а также моноцитами/МФ. Кроме того, GM-CSF синтезируется еще Tлимфоцитами. Основное биологическое действие GM-CSF направлено на стимуляцию пролиферации и дифференцирования костномозговых предшественников нейтрофильных гранулоцитов (начальные фазы воспаления). Под его действием усиливается фагоцитоз у нейтрофилов,
продукция кислородных радикалов и антителозависимая цитотоксичность. Способность клеток
системы мононуклеарных фагоцитов реагировать на формирование патологического процесса
обусловлена регуляторным механизмом, действующим по типу обратной связи (Маянский А.Н., 2004; Spikermann K. et al., 1997). Значительная роль в осуществлении этой связи
принадлежит как раз CSF. CSF вовлекает моноциты из костного мозга в циркуляцию и способствует их последующей трансформации в МФ. Таким образом, GM-CSF играет решающую
роль в дифференцировании клеток воспаления (в частности, МФ) на стадии экссудации.
IFN-γ занимает в семействе интерферонов особое место (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008; Ярилин А.А., 2010). Его противовирусная активность выражена слабо, однако
он обладает сильным иммунорегуляторным действием и занимает одно из центральных мест в
регуляции адаптивного иммунного ответа на бактерии. Молекулярная масса мономера IFN-γ
составляет 18 кДа. Активная форма IFN-γ представлена в виде димера. IFN-γ образуют преимущественно лимфоидные клетки. В отсутствие иммунного ответа основными его продуцентами являются натуральные киллеры, при иммунном ответе главным источником IFN-γ становятся Т-лимфоциты, а именно цитотоксические Т-клетки (Т-киллеры) и особенно Т-хелпер 1-го
типа (Th1-клетки). Показано, что IFN-γ могут синтезировать и миелоидные клетки, в том числе
МФ и дендритные клетки. IFN-γ обладает противовирусной и антипролиферативной активностью. Необходимо отдельно отметить роль IFN-γ в развитии фиброза, патологического процесса, который характеризуется избыточным замещением нормальной паренхиматозной и соединительной утраченной ткани клетками производными мезенхимы и внеклеточным матриксом,
продуцируемыми этими клетками. Было показано, что при активации синтеза IFN-γ наряду с
низкой активацией синтеза TGF-β, TNF-α и b-FGF/FGF-2 макрофагами, оказывает антифиброгенное действие (Бондарь И.А. и др., 2011; Prior C., Haslam P.L., 1992; Miyazaki Y. et al., 1995).
42
Таким образом, на заключительной стадии воспаления IFN-γ препятствует чрезмерному разрастанию соединительной ткани в очаге поражения.
Ростовые факторы также играют важную роль в регуляции воспаления и репарации (Варюшина Е.А., 2012; Зайцева Е.Л., Токмакова А.Ю., 2014). В данной работе были выделены следующие ключевые ростовые факторы: EGF, TGF-β, b-FGF/FGF-2 и KGF/FGF-7.
EGF – эпидермальный ростовой фактор, стимулирующий клеточный рост, пролиферацию
и дифференцировку клеток путем связывания с рецептором EGF (Harris R.C. et al., 2003;
Herbst R.S., 2004). В частности EGF ускоряет рост и деление эпителиальных клеток. Молекулярная масса EGF составляет около 6 кДа. Впервые EGF был обнаружен в 1986 году в подчелюстных железах мыши, но после этого он также был найден в слюнных железах человека. EGF
помимо слюны также содержится в тромбоцитах, МФ, моче, молоке и в плазме крови
(Kumar V. et al., 2014). Биологическое воздействие EGF слюны заключается в участии в процессе заживления язв в слизистой полости рта и гастроэзофагеальных язв, ингибировании секреции
желудочной кислоты, стимуляции синтеза ДНК, а также в защите слизистой оболочки от интралюминальных (внутрипросветных) вредных факторов, таких как желудочные и желчные кислоты, пепсин, трипсин, и от физических, химический и бактериальных агентов (Venturi S.;
Venturi M., 2009). В процессе развития воспаления EGF способствует росту мезенхимальных
клеток на стадии пролиферации при заживлении в очаге поражения.
TGF-β был описан в 1981 году в составе группы ростовых факторов (Кетлинский С.А.,
Симбирцев А.С., 2008; Ярилин А.А., 2010). Свое название он получил в связи со способностью
индуцировать «трансформированный» фенотип у нормальных клеток, растущих в культуре
(феномен контактного торможения, отделение от субстрата, реорганизация цитоскелета). Он
представляет собой гомодимер с молекулярной массой 25 кДа. Продуцентами TGF-β служит
огромное число клеток, включая стромальные, эпителиальные клетки, МФ, регуляторные Тлимфоциты, многие разновидности опухолевых клеток. Он секретируется в неактивной форме
и требует протеолитического расщепления молекулы вне клетки, чтобы «приобрести» способность взаимодействовать с высокоаффинными рецепторами. Мишенями этого фактора являются очень многие виды клеток, экспрессирующие рецептор TGF-β. При действии TGF-β на иммунную систему преобладают ингибирующие эффекты (иммуносупрессивное действие). TGF-β
– важный супрессорный цитокин, подавляющий преимущественно воспалительные процессы и
связанные с ними формы T-клеточного иммунного ответа. В тоже время TGF-β способствует
регуляции регенерации и заживлению ран на стадии пролиферации процесса воспаления.
FGF – это семейство факторов роста, участвующих в ангиогенезе, заживлении ран и эмбриональном развитии (Ornitz D.M., Itoh N., 2001). Было обнаружено 22 члена данного семейства, все они – структурно сходные сигнальные молекулы. Молекулярная масса всех FGF нахо-
43
диться между 17 и 34 кДа. Основной фактор роста фибробластов – это b-FGF или FGF-2. Он,
главным образом, синтезируется фибробластами, хотя эпителиальные клетки, МФ и эндотелиальные клетки также синтезируют небольшое количество данного белка. b-FGF/FGF-2 способен
действовать внутриклеточно как активатор пролиферации. Другой немаловажный ростовой
фактор фибробластов при воспалении – KGF или FGF-7 (Rubin J.S. et al., 1995). Он является одним из основных специфических регуляторов активности кератиноцитов и участвует в эпителизации при заживлении ран. KGF синтезируется преимущественно в стромальных и эпителиальных клетках. Таким образом, на стадии пролиферации FGF будут способствовать репаративной
регенерации пораженных структур мезенхимальных клеток и заживлению ран в целом. Однако
при избыточной продукции одновременно FGF и фиброгенного цитокина TGF-β заживление
раны будет приобретать признаки фиброза, что в итоге приведет к образованию келоидной
рубцевой ткани в очаге поражения, возможно, с утратой части функций тканей и органов.
Еще одним параметром функционального статуса МФ является их гидролитический потенциал. Присутствие МФ в ранней стадии воспалительной реакции (после нейтрофилов) является необходимым условием для «очищения» очага деструкции и последующей пролиферации
фибробластов и успешного завершения репаративной фазы воспаления. МФ не только очищают
рану от тканевого и нейтрофильного детрита, но и секретируют факторы, ускоряющие дифференцирование фибробластов и синтез ими коллагена (Серебренникова С.Н., Семинский И.Ж.,
2008). В настоящее время продолжается поиск оптимальных методов стимуляции заживления
ран, ожогов, трофических язв. Для эффективного заживления раневой поверхности ключевыми
моментами остается избыточное количество МФ в ране, а также существенное уменьшение
времени регенерации дефекта (Пальцев М.А. и др., 2003). Экспрессия и секреция протеаз макрофагами может способствовать как лизису патогенов и разрушенных клеток, так и регуляции
процесса заживления на разных стадиях воспаления.
Среди важных протеаз, участвующих в патологических процессах, можно выделить: катепсины и матриксные металлопротеазы (MMPs) (Покровский А.А., Тутельян В.А., 1976; Шкурупий В.А., 1999; Герасимов А.М. и др., 2009; Халикова Т.А. и др., 2009; Аникина А.Г. и др.,
2013; Каллахан Дж.В., Лоуден Дж.А., 1984). В данной работе были выделены следующие ключевые гидролазы и протеазы: катепсин B и D, MMP-1 и MMP-9. Катепсины – в основном внутриклеточные папаиноподобные протеолитические ферменты, локализующиеся главным образом во вторичных эндосомах и лизосомах. Они участвуют в лизисе захваченного макрофагами
чужеродного материала (Немова Н.Н., Бондарева Л.А., 2008). Цистеиновые катепсины B (около
25 кДа) действуют подобно трипсину, а аспарагиновые катепсины D (двух-цепочечный белок –
31 и 13-14 кДа) подобно пепсину. MMPs участвуют в расщеплении различных видов интерстициальных коллагеновых волокон (Соловьева Н.И., 1998). Например, MMP-1 (или интерстици-
44
альная коллагеназа I типа) расщепляет коллагены I-III, VII, X типов, желатин, энтактин, агрекан, казеин и α2-макроглобулин. MMP-2 (или желатиназа A) расщепляет желатины, коллагены
I, IV, V, VII, XI типов, ламины, фибронектин, агрекан, эластин, тогда как MMP-9 (желатиназа
B) расщепляет также желатин, коллагены III-V, XIV типов, агрекан и эластин. Молекулярная
масса активной формы белка MMP-1, MMP-2 и MMP-9 составляет соответственно 41-45, 67 и
84 кДа. MMPs синтезируются и секретируются целым рядом клеток: фибробластами, эпителиальными клетками, фагоцитами, лимфоцитами и онкогенно-трансформированными клетками.
Помимо внутриклеточного лизиса (де Дюв К., 1987) МФ могут участвовать также во внеклеточном лизисе внеклеточных структур, проходящем путем секреции (дегрануляции) гидролитических ферментов (внеклеточный и контактный цитолиз) или путем высвобождения лизосомальных ферментов после разрушения самого фагоцита (аутолиз) (Покровский А.А., Тутельян В.А., 1976; Ярилин А.А., 2010; Каллахан Дж.В., Лоуден Дж.А., 1984). Гидролитические протеазы участвуют в регуляции апоптотической активности, в процессе ангиогенеза и дезинтеграции межклеточного матрикса. Таким образом, гидролитические ферменты, синтезируемые фагоцитами в процессе воспаления, принимают непосредственное участие в разрушении патогена
на начальных стадиях, а также в «расчищении» раны и регуляции заживления очага поражения
на более поздних стадиях воспаления.
1.6. Влияние наноразмерных алмазных частиц на функциональный статус макрофагов
В настоящее время в научной литературе представлено незначительное количество работ
по
изучению
влияния
НА
частиц
на
функциональный
статус
МФ
in vitro.
A.M. Schrand, L. Dai et al. (2007) указывают, что НА (от 2 до 10 нм) (NanoCarbon Research Institute Ltd., Япония) обладают биосовместимостью с альвеолярными макрофагами крысы NR8383
(Schrand A.M., Dai L. et al., 2007). При инкубировании в течение 24 часов МФ с НА от 2 до
10 нм при концентрации частиц 100 мкг/мл не вызывало существенного образования АФК и не
нарушало целостности мембран митохондрий. Однако V. Thomas et al. (2012) на макрофагальной линии RAW264.7 показали влияние размера и дозы НА (Nanostructured and Amorphous Materials, Inc., США; Hyprez-Engis Inc., США) на состояние клеток. Они в своей работе использовали НА размером от 6 до 500 нм. НА размером 6-100 нм приводили к снижению пролиферации
клеток при концентрации 50 мкг/мл, а также к снижению метаболитической активности уже
при концентрации 200 мкг/мл. Данные авторы при помощи проточной цитометрии показали
значительное снижение жизнеспособности МФ под действием НА размером от 6 до 500 нм в
результате некроза независимо от размера частиц. Они также показали, что НА значительно
снижали экспрессию макрофагами генов цитокинов TNF-α и IL-1β, хемокина CCL2 и PDGF по
сравнению с частицами оксида титана размером 8 нм, с непостоянным эффектом на хемокины
45
Cxcl2 и фактор роста VEGF. Например, наночастицы оксида цинка вызывают в перитонеальных
МФ от мышей-самок BALB/c образование активированного азота в клетках и избыточную экспрессию циклооксигеназы 2 (англ. cyclooxygenase, сокр. Cox-2), iNOS, провоспалительных цитокинов (IL-6, IFN-γ, TNF-α, IL-17 и регуляторный цитокин IL-10) (Roy R. et al., 2014).
H. Huang et al. (2007, 2008a, 2008b) с соавторами на МФ (RAW264.7) показали, что 2-8 нм НА
(NanoCarbon Research Institute Ltd., Япония) в концентрации 100 мкг/мл значительно не повышали экспрессию цитокинов: интерлейкина IL-6, TNF-α, iNOS, и не снижали уровень белка BclX, регулирующего апоптоз, что свидетельствовало о биосовместимости наночастиц на генетическом уровне in vitro, и его не наблюдали при использовании других наночастиц. H.C. Li et al. (2013) с соавторами также показали, что 35 нм НА (Microdiamant, Швейцария;
Element Six, США), полученные синтезом при сверхвысоких давлениях и температуре, не оказывали значительного повышения уровня цитокинов IL-1β и IL-6 на мышах in vivo.
Захват клетками и интернализация НА частиц изучалась как на клетках неоплазменного
происхождения,
так
и
на
перевиваемых
клеточных
культурах
разного
гистогенеза
(Faklaris O. et al., 2009; Liu K.-K. et al., 2009; Schrand A.M. et al., 2011; Prevedebtseva E. et al.,
2013; Solarska-Ściuk K. et al., 2014), однако работы по захвату частиц МФ практически в литературе отсутствуют. V. Thomas et al. (2012) при помощи электронного микроскопа показали, что
используемые ими НА (Nanostructured and Amorphous Materials, Inc., США; Hyprez-Engis Inc.,
США) размером около 500 нм захватывались фагоцитозом. Тем не менее, по аналогии с другими клетками, можно предположить, что МФ также захватывают НА посредством клатринзависимого эндоцитоза или макропиноцитоза. Приведенные данные фрагментарны и не исчерпывают знания о биологических эффектах, оказываемых НА частицами на МФ. Также остается
множество вопросов по биотропности и биосовместимости НА с данными типами клеток.
Необходимо отметить, что 31 октября 2007 года в Российский Федерации вышло постановление об ограничении использования наноматериалов in vivo в медицине в связи с рисками
их вероятной цитотоксичности (Онищенко Г.Г. и др., 2007). Для внедрения НА в медицинскую
практику требуется глубокое изучение как раз биологических свойств, а также механизмов, которые они могут оказывать влияние на типовые патологические процессы (среди которых наиболее часто встречающийся – это процесс воспаления). Посредством изменения функционального статуса МФ и других форменных элементов (в частности, провоспалительного, репаративного и гидролитического потенциалов) частицами НА существует определенный риск при использовании средств, содержащих НА частицы. Таким образом, приведенные данные свидетельствуют об актуальности направления исследования обозначенного в данной работе и необходимости его проведения.
46
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Методы выделения и культивирования перитонеальных макрофагов
Работа выполнена на 90 самцах мышей линии BALB/c (возраст два месяца, масса тела 2122 г, из вивария ФГБНУ «НИИ клинической иммунологии», г. Новосибирск). Эксперименты
проводили in vitro на клетках пулированного перитонеального транссудата мышей (от 6-12
мышей в зависимости от количества посадок клеток в культуры, из расчета не менее одного
животного на четыре культуры перитонеальных клеток). Животных умерщвляли методом дислокации шейных позвонков под эфирным наркозом. Перитонеальный транссудат получали путем введения в брюшную полость 3,5 мл питательной среды 199 (серия 031008, Вектор,
г. Новосибирск), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (кат. номер SV30160.03,
HyClone, США), 30 мкг/мл L-глутамата (серия 12-01, Биолот, г. Санкт-Петербург) и 50 мкг/мл
гентамицина (кат. номер 012010101, ОАО «Борисовский завод медицинских препаратов», Республика Беларусь) (далее именуемая «полной средой»), по стандартной методике (Конки Д.,
1989). Суспензии клеток перитонеального транссудата, полученные от разных животных, предварительно оценивали на пригодность для экспериментов (отсутствие агрегатов эритроцитов,
жизнеспособность клеток ≥ 90% в тесте с трипановым синим), проводили подсчет количества
клеток с помощью камеры Горяева. Суспензии перитонеальных клеток, полученные от разных
животных, смешивали, проводили повторную количественную оценку (камера Горяева). Для
изучения биосовместимости, биотропности и биологических эффектов, оказываемых НА частицами на МФ, перитонеальные клетки культивировали на покровных стеклах (106 клеток на
2 мл полной среды), в пластиковых 24-луночных планшетах для культивирования (кат. номер
5530300, Orange Scientific, США) при 37°C. Для исследования способа захвата и интернализации НА частиц внутрь клетки при помощи электронной микроскопии перитонеальные клетки
культивировали в пластиковых культуральных «матрасах» с поверхностью роста 25 см2
(кат. номер 5520100, Orange Scientific, США) (107 клеток на 7-8 мл полной среды) при 37°C. Для
исследования секреции гидролитических и ростовых факторов транссудат с перитонеальными
клетками осаждали на целлюлозные миллипоровые фильтры с диаметром пор 0,22 мкм
(кат. номер GSWP04700, Millipore, Германия), предварительно заложенные в пластиковые
планшеты на 24 лунки, также при 37°С. Культивирование перитонеальных клеток во всех описанных случаях осуществляли в течение 3-х часов для прикрепления МФ к подложке. Через 3
часа неадгезированные клетки смывали средой для культивирования. Полученные первичные
культуры МФ культивировали в течение 24 часов с целью их адаптации. После чего путем замены среды вносили НА частицы в виде предварительно подготовленной суспензии в полной
среде со следующими концентрациями: 10, 20, 30 и 60 мкг/мл. Инкубацию МФ с НА частицами
осуществляли при 37°C в течение следующих временных интервалах: 1, 3, 24 и 48 часов.
47
2.2. Характеристика наноразмерных алмазных частиц, методика приготовления суспензии раствора наноразмерных алмазных частиц для инкубации в культуре макрофагов
В данной работе исследованы НА частицы марки «УДА-В-ГО» (англ. «UDD-W-HO»), которые были любезно предоставлены ОАО ФНПЦ (НПО) «Алтай» (Россия, г. Бийск). Согласно
техническим условиям «ТУ 84-1124-87» (Верещагин А.Л., 2005; Чиганов Г.А. и др., 2009) данный образец представляет собой водную суспензию ультрадисперсных алмазов, полученную
детонационным методом и прошедшую последующую глубокую отчистку. Очистка данного
образца осуществлялась механическим и химическим способами. После механического удаления технологических примесей порошок с целью выделения алмазной фазы подвергался термоокислению составами, содержащими серную и азотную кислоты. Алмаз после отделения от кислотных сред промывали водой. В итоге получали отрицательно заряженные НА частицы с определяющим количеством карбонильных групп на поверхности наночастиц (90%), на порядок
меньше фенольными, затем карбоксилами лактонных группировок и сильными карбоксилами,
количество пероксидных групп незначительно (Ларионова И.С. и др., 2004).
В исследовании использовали искусственно полученные НА, имеющие первичный диаметр 4-6 нм, плотность 3,1±0,1 г/см3 и удельную поверхность 260±30 м2/г, содержание алмазной
фазы не менее 99,0% 2. В гидрозоле также представлены агрегатами в диапазоне от 10 до
550 нм. В эксперимент бралась верхняя фракция гидрозоля, представленная НА агрегатами
меньше 100 нм. Исследование вероятных биоактивных свойств НА в отношении МФ проводили через 1, 3, 24 и 48 часов после внесения наночастиц в первичную 24-часовую культуру. В
полную среду для культивирования вносили 1,6% стерильного гидрозоля НА до конечной концентрации в культуральной среде 10, 20, 30 и 60 мкг на 1 мл. После этого суспензию тщательно
перемешивали и обрабатывали ультразвуком при помощи ультразвукового дезинтегратора
«Надежда-3» (модель УЗА-0,1/22-М, Центр ультразвуковых технологий, г. Бийск) в течение 10
сек. при мощности 75 Вт для разрушения вероятных агрегатов НА частиц. Внесение в культуру
НА осуществляли путем замены изначальной среды культивирования на среду, содержащую
НА в соответствующей концентрации. Контролем служили МФ, в среду для культивирования
которых через 24 часа культивирования вносили свежую полную среду культивирования взамен такой же предыдущей. В нее предварительно вносили бидистиллированную стерильную
воду в объеме, идентичном тому, который вносили с гидрозолем при приготовлении среды
с НА частицами.
2
URL: http://frpc.secna.ru/uda/marks5.php
48
2.3. Методы изучения свойств биотропности наноразмерных алмазных частиц в отношении макрофагов
Свойства биотропности НА частиц исследовали при помощи световой и электронной микроскопии. Для исследования способа захвата и интернализации наночастиц в МФ в обоих видах
микроскопического исследования наночастицы вносили в 24-часовую макрофагальную культуру с биосовместимой концентрацией 20 мкг/мл во временные интервалы 24 и 48 часов. Контрольными точками служили 24-часовые культуры перитонеальных МФ через 24 и 48 часов с
момента замены полной среды, в которую вносили бидистиллированную стерильную воду в
объеме, идентичном тому, в котором получали МФ в суспензии с НА.
2.3.1. Методы светооптического и флуоресцентного микроскопического исследования макрофагов, подвергнутых воздействию наноразмерных алмазных частиц
Исследование выполнено с использованием оборудования ЦКП «Современные оптические системы» на базе «НИИЭКМ». Светооптическое исследование МФ в культурах проводили
с помощью микроскопа «AxioImager Z1» (Zeiss, Германия) в режиме светлого поля, фазового
интерференционного контраста, дифференциально интерференционного контраста и флуоресцентной микроскопии. Препараты клеточных культур фотографировали при помощи цифровой
камеры «AxioCam HRc» (Zeiss, Германия) и микроскопа «AxioImager Z1» (Zeiss, Германия).
Для анализа накопления НА в МФ был проведен морфометрический анализ микрофотографий
агрегатов исследуемых НА частиц при исследовании их в проходящем свете и флуоресцентном
освещении. Анализ яркостных характеристик НА и их агрегатов на полученных цифровых фотографиях проводили при помощи программы «ВидеоТест Морфо 3.2» (ООО НПК «Зенит»,
г. Санкт-Петербург), позволяющей графически строить и исследовать «яркостные разрезы» исследуемых изображений. Поскольку при исследовании агрегатов НА в проходящем свете и
флуоресцентном освещении они выглядели значительно темнее (5-10 единиц по международной
шкале градаций серого цвета, оцениваемого в диапазоне 0-255), чем подложка (235-250), то для
выявления НА в МФ было использовано комбинированное освещение препаратов – одновременно в проходящем свете при установленной зеленом светофильтре и индуцированной флуоресценции МФ (дополнительно окрашенных акридиновым оранжевым), в «зеленой» области
флуоресценции (при установке узкополосного светофильтра, предназначенного для исследования ФИТЦ-флуоресценции). При таком способе анализа в эндоцитозных вакуолях выявлялся
оптически плотный материал, соответствующей оптической яркости НА (5-10 единиц по международной шкале градаций серого цвета). Для выявления ядер макрофагов был использован
флуоресцентный
краситель
DAPI
«ProLong®
(кат. номер P36941, Life Technologies, США).
Gold
Antifade
Mountant
with
DAPI»
49
2.3.2. Методы электронно-микроскопического исследования макрофагов, подвергнутых воздействию наноразмерных алмазных частиц
Для изучения ультраструктуры МФ материал готовили по стандартной методике (Уикли Б., 1975). Для просвечивающей электронной микроскопии использовали 24-часовую клеточную культуру МФ на пластиковых матрасах с поверхностью для роста клеток 25 см2. Перед
фиксацией клетки отмывали от культуральной полной среды 2 раза по 5 минут фосфатным буфером. Далее отмытые от среды МФ фиксировали 2,5% раствором глутарового альдегида
(кат. номер 253857.1611, Panreac, Испания) на какодилатном буфере (0,1 М pH = 7,2)
(кат. номер RT11654, Electron Microscopy Sciences, США) в течение 30 минут при комнатной
температуре. Клетки отмывали от фиксатора тем же буфером 3 раза по 5 минут. Далее при помощи культурального скребка (кат. номер 734-0385, BD Falcon, США) соскребали зафиксированные
клетки,
добавляли
буфер
и
осаждали
центрифугированием
5 минут
при
1000 оборотов/мин на центрифуге «CM-50» (ELMI SkyLine, Латвия). Для иммобилизации клетки заключали в агарозу (кат. номер 561 079, Ferak, Германия). Для этого 2% буферный раствор
агарозы доводили до кипения в микроволновой печи «NN-3256» (Panasonic, Япония), смесь охлаждали до 37°C и при помощи водного термостата «WB-4MS» (Biosan, Латвия) поддерживали
при такой температуре на протяжении всего времени манипуляций с клетками. В предварительно подогретых дозаторах автоматических пипеток до 37-40°C смешивали равные объемы
2% агарозы и осадка фиксированных клеток. Полученную смесь выдавливали из дозаторов автоматических пипеток тонкой полоской агарозы с МФ на охлажденную до +4°C фольгу. Застывшая смесь агарозы с МФ формировала объемную полоску, которую затем разрезали лезвием на блоки длиной 3-4 мм. Полученные блоки переносили во флаконы с буфером комнатной
температуры для предотвращения высыхания материала.
Постфиксацию образцов проводили в четырехокиси осмия (OsO4) (кат. номер RT19110,
Electron Microscopy Sciences, США). 4% раствор OsO4 готовили заранее, растворяя порошок
OsO4 в бидистиллированной воде. Раствор для фиксации содержал 1% OsO4 на натрий какодилатном буфере (0,1 М pH = 7,2). Продолжительность фиксации при комнатной температуре составляла 1 час (или в течение ночи при 4°C). Затем образцы тщательно отмывали бидистиллированной водой 3 раза по 5-7 минут.
Дегидратацию образцов проводили в растворах этиловых спиртов возрастающей концентрации: 30% 15 мин, 50% 15 мин, 70% 15 мин, 96% 15 мин, ок. 100% 15 мин, затем в ацетоне –
две смены по 10 минут. Абсолютный спирт получали из 96% спирта путем смешивания 100 мл
последнего с 10 г прокаленного медного купороса (кат. номер 451657, Sigma-Aldrich, Германия). Раствор время от времени встряхивали до равномерного распределения порошка в продолжение двух дней, пока медный купорос не приобретал синюю окраску (поглощение воды из
50
96% спирта). Данную процедуру повторяли несколько раз. Для нейтрализации подкисленного
pH из получившегося спирта в него добавляли небольшое количество карбоната кальция
(CaCO3) (кат. номер C4830, Sigma-Aldrich, Германия).
Обезвоженные образцы последовательно пропитывали и инкубировали в растворах эпоксидной смолы «Araldite 502» (кат. номер 37226-48-5, SPI-Chem,. США) и ацетона (серия 260379, ООО ТД «Сибдиамед», г. Новосбирск) в соотношениях 1:3 и 2:2 по 30 мин, 3:1 на 1-1,5 часа,
чистая смола на 1-1,5 часа. После этого образцы переносили в формы для заливки «BEEM»
(кат. номер 69916-12, Electron Microscopy Sciences, США), которые заполняли свежей смесью
смолы с катализатором «DMP-30» (кат. номер 90-72-2, SPI-Chem, США; 250 мкл на 20 мл смолы) и помещали для полимеризации в термостате при 60°C на двое-трое суток. Ультратонкие
срезы делали алмазным ножом на ультрамикротоме «8800 Ultratome III» (LBK, Bromma. Швеция). Срезы помещали на мелкоячеистые медные сетки 200 mesh (кат. номер G200-Cu, Electron
Microscopy Sciences, США) и контрастировали 30 минут водным 1% раствором уранил-ацетата
(кат. номер 73843, Sigma-Aldrich, Fluka, Германия) и 10 минут водным 2% раствором цитрата
свинца (кат. номер 15326, Sigma-Aldrich, Германия) по Рейнольдсу (Reynolds E.S., 1963).
Микрофотографии были получены на трансмиссионном электронном микроскопе
«JEM 1400» (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Для анализа захвата и интернализации НА частиц МФ проводили визуальный анализ полученных изображений для разных
временных точек инкубации МФ с наночастицами и сопоставляли с изображениями, полученными в контроле.
2.4. Методы изучения свойств биосовместимости наноразмерных алмазных частиц в
отношении макрофагов
Степень биосовместимости НА частиц исследовали по показателю жизнеспособности МФ
и продукции ими АКФ. НА частицы вносили в 24-часовую культуру МФ с концентрациями
разведения: 10, 20, 30 и 60 мкг/мл; в разный временные интервалы: 1, 3, 24 и 48 часов.
2.4.1. Методы изучения жизнеспособности макрофагов
Показатель жизнеспособности исследовали при помощи витальной окраски трипановым
синим (2,5% раствор трипанового синего) (кат. номер 699888, Erba Lachema, Чешская Республика). После окрашивания клетки фотографировали с помощью цифровой фотокамеры «Nicon
Coolpix 5000» (Nikon Corporation, Япония) и микроскопа «Axiostar Plus» (Zeiss, Германия) при
увеличении в 400 раз. В пяти полях зрения подсчитывали общее количество МФ и количество
живых МФ (не окрасившихся трипановым синим). Показатель жизнеспособности (ПЖ) для каждого поля зрения рассчитывался по формуле:
ПЖ = (N жив. МФ / N всех МФ) × 100%;
где N жив. МФ – количество живых МФ, а N всех МФ – количество всех МФ.
51
2.4.2. Методы изучения продукции активных форм кислорода макрофагами
Исследование продукции АФК проводили при помощи теста с нитросиним тетразолием
(НСТ-тест). Путем замены культуральной среды, в 24-луночный планшет с 24-часовой культурой МФ добавляли по 1 мл на образец (лунку) приготовленного в полной среде 0,05% раствора
нитросинего тетразолия (кат. номер 14176, Reanal, Венгрия). Инкубацию с нитросиним тетразолием проводили в течение одного часа при 37°C. После восстановления НСТ в МФ до формазана в стандартном и предположительно активированном НА частицами в НСТ-тесте состоянии
культуры, МФ отмывали культуральной средой и далее фиксировали в 4% растворе формалина
(кат. номер 06-001S/M/L, BioVitrum, г. Санкт-Петербург), приготовленном на основе фосфатного буфера (кат. номер B-60201, НЦП «Эко-Сервис», г. Санкт-Петербург), в течение 10 минут
при комнатной температуре. Фиксатор тщательно отмывали дистиллированной водой. Для визуализации ядер и цитоплазмы фиксированный клеточный материал дополнительно докрашивали 0,5% водным раствором сафранина (кат. номер 31031, Sigma-Aldrich, Fluka, США). Для
отмывания от красителя также использовали дистиллированную воду. После высушивания
препаратов их заключали в канадский бальзам (кат. номер 62110, Kremer Pigmente GmbH & Co.
KG, Германия). Клетки на цитологических препаратах фотографировали с помощью специальной встроенной CCD-камеры «AxioCam HRc» (Zeiss, Германия) и микроскопа «AxioVision Z1»
(Zeiss, Германия) при увеличении в 400 раз. Для расчета индекса продукции АФК МФ
(ИП АФК) цифровые изображения пяти полей зрения (с каждого из пяти препаратов) бинаризировали по яркости гранул формазана, характеризующего интенсивность продукций МФ АФК
(Шкурупий В.А. и др., 2009). Автоматический анализ и измерение изображений проводили при
помощи программы «ВидеоТест Морфо 3.2» (ООО НПК «Зенит», г. Санкт-Петербург). Также в
пяти полях зрения подсчитывали количество МФ, содержащих гранулы формазана. Индекс
продукции АФК для каждого поля зрения рассчитывали по формуле:
ИП АФК = S гран. × N гран. МФ;
где S гран. – общая площадь гранул формазана (представленная в кв. пикселях), а N гран. МФ –
количество всех МФ, содержащих формазан.
2.5. Методы изучения функциональной активности макрофагов, подвергнутых воздействию наноразмерных алмазных частиц
Функциональную активность макрофагов, подвергнутых воздействию НА частиц, исследовали по показателям «распластывания» и индексу активации МФ, показателю эндоцитозной
активности МФ, состоянию лизосомальной системы, показателю частоты фагосомнолизосомного слияния и способу захвата и интернализации НА частиц внутрь МФ. Для этого НА
частицы также вносили в 24-часовую культуру МФ с разными концентрациями суспензии НА
частиц в полной культуральной среде: 10, 20, 30 и 60 мкг/мл; в разные временные интервалы: 1,
52
3, 24 и 48 часов. Для исследования влияния НА частиц на состояние лизосомальной системы и
процесс фагосомно-лизосомного слияния в МФ была выбрана биосовместимая концентрация
20 мкг/мл НА. Контрольными точками служили 24-часовые культуры перитонеальных клеток
через соответствующие временные интервалы инкубации с момента замены полной среды, в
которую вносили бидистиллированную стерильную воду в объеме, идентичном тому, что получали МФ в суспензии с НА.
2.5.1. Методы изучения влияния наноалмазных частиц на показатели эндоцитозной
активности и «распластывания» макрофагов
Расчет показателя эндоцитозной активности включает расчет эндоцитозного индекса (ЭИ)
и индекса эндоцитозной активности МФ (ИЭА). Для выявления частиц НА в эндосомах МФ
было использовано комбинированное освещение препаратов – одновременно в проходящем
свете при установленном зеленом светофильтре и индуцированной флуоресценции МФ (в «зеленой» области спектра), дополнительно окрашенных в среде, содержащей 10 мкг/мл акридинового оранжевого (серия 010032, Реахим, Шосткинский завод химреактивов, Украина) в течение 15 минут при 37°C. Препараты клеточных культур при исследовании методами световой и
флуоресцентной микроскопии фотографировали с помощью цифровой камеры «AxioCam HRc»
(Zeiss, Германия) и микроскопа «AxioVision Z1» (Zeiss, Германия). Расчет эндоцитозного индекса или доли МФ с эндоцитозными вакуолями производили по аналогичной формуле как показателя жизнеспособности (п. 2.4.1), где в знаменателе указывали количество МФ, обладающих эндоцитозными вакуолями в цитоплазме клеток (вакуоли размером около 0,2-0,5 мкм). Для
расчета индекса эндоцитозной активности МФ в пяти полях зрения подсчитывали количество
эндоцитозных вакуолей с НА в них. Индекс эндоцитозной активности МФ для каждого из пяти
полей зрения рассчитывался по формуле:
ИЭА = N вак. НА × ЭИ;
где N вак. НА – количество эндоцитозных вакуолей с НА в них, а ЭИ – эндоцитозный индекс.
Расчет показателя «распластывания» включает индекс «распластывания» (ИР) и индекс
активации МФ (ИАМФ). Определение данных индексов осуществляли по цифровым фотографиям, полученным при проведении НСТ-теста (п. 2.4.2). Расчет индекса «распластывания» или
доли «распластывания» МФ производили по аналогичной формуле как показатель жизнеспособности (п. 2.4.1), где в знаменателе указывали количество МФ с высокой степенью «распластывания» (при отношении площади проекции цитоплазмы «распластанных» МФ к площади
проекции ядер ≥ 5). Для расчета индекса активации МФ цифровые изображения для каждого из
пяти полей бинаризировали по яркости окраски цитоплазмы «распластанных» МФ при помощи
программы «ВидеоТест Морфо 3.2» (ООО НПК «Зенит», г. Санкт-Петербург). В данном случае
53
индекс активации МФ соответствовал площади (в кв. пикселях) «распластанных» МФ после
захвата ими НА.
2.5.2. Методы изучения влияния наноалмазных частиц на функциональное состояние
вакуолярно-лизосомальной системы макрофагов и процессы фагосомно-лизосомного
слияния
Для исследования влияния НА частиц на функциональное состояние вакуолярнолизосомальной системы и процессы фагосомно-лизосомного слияния в МФ использовали экспериментальную модель, опубликованную G.M. Olsson et al. (1990). Наночастицы вносили в 24часовую культуру МФ. Ее культивировали на покровных стеклах (106 клеток в 2 мл среды 199,
содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки) в пластиковых 24-луночных планшетах
для культивирования при 37°C. Клетки инкубировали с частицами НА в разведении 20 мкг/мл в
течение 1, 3, 24 и 48 часов. Для исследования состояния вакуолярно-лизосомальной системы
МФ в культуры вносили среду, содержащую лизосомотропный краситель акридиновый оранжевый (10 мкг/мл), и инкубировали в течение 15 минут при 37°C. Для изучения феномена фагосомно-лизосомного слияния в МФ после их инкубации с НА, инкубационную среду заменяли
на аналогичную по составу – для культивирования, содержащую гранулы зимозана (серия
080006, Реахим, Олайнский завод химреактивов, Латвия), представляющую собой лиофилизированные дрожжеподобные грибки Saccharomyces cerevisiae, в разведении 15 мкг/мл (Tapper H.,
Sundler R., 1995). Через час после инкубации клеток с гранулами зимозана в культуры также
вносили среду, содержащую лизосомотропный (избирательно накапливался в вакуолярном аппарате МФ) краситель акридиновый оранжевый (10 мкг/мл), и инкубировали в течение 15 минут при 37°C. В обоих случаях препараты клеточных культур при исследовании методами световой и флуоресцентной микроскопии фотографировали с помощью цифровой камеры «AxioCam HRc» (Zeiss, Германия) и микроскопа «AxioVision Z1» (Zeiss, Германия).
Состояние мембраны лизосом определяли по лабильности (пермеабилизации) мембран лизосом (Denamur S. et al., 2011). Флуоресцентная эмиссия акридинового оранжевого зависит от
концентрации в вакуолярном аппарате: от красного при высоких концентрациях (например, в
лизосомах) до зеленого при низких концентрациях (например, в цитозоле). Полученные прижизненные препараты клеток, захвативших акридиновый оранжевый, фотографировали с помощью цифровой камеры «AxioCam HRc» (Zeiss, Германия) и флуоресцентного микроскопа
«AxioVision Z1» (Zeiss, Германия) при увеличении в 400 раз в двух режимах: зеленый спектр
(530 нм) и красный спектр флуоресценции (620 нм). Показатель лабильности мембран лизосом
(ПЛМЛ) определяли по соотношению размера и интенсивности окрашенной части цитоплазмы
МФ (в кв. пикселях) к размеру и интенсивности окрашенных лизосом МФ по пяти фотографиям
54
с помощью цитометрического анализа цифровых откалиброванных изображений при помощи
программы «ВидеоТест Морфо 3.2» (ООО НПК «Зенит», г. Санкт-Петербург).
Расчет фагоцитозного индекса (ФИ) или доли МФ с фагоцитозными вакуолями, содержащими частицы зимозана, производили по формуле как и показатель жизнеспособности (п. 2.4.1)
или эндоцитозный индекс ранее (п. 2.5.1), где в знаменателе указывали количество МФ, обладающих фагоцитозными вакуолями в цитоплазме клеток, содержащих частицы зимозана. Также
вычисляли фагоцитозное число (ФЧ) – среднее арифметическое число фагоцитированных частиц зимозана на один МФ (по пяти фотографиям). Количество фаголизосом с гранулами зимозана, образующихся в фагоцитах, определяли по числу гранул зимозана, окрашенных в оранжево-красный цвет (Булычев А.Г., 1991; Kielian M., Cohn F.A., 1982). По количеству неокрашенных акридиновым оранжевым гранул зимозана, фагоцитированных МФ, определяли число фагосом, не слившихся с лизосомами. Производили расчет индекса фагосомно-лизосомного слияния (ИФЛ) по следующей формуле (по пяти фотографиям):
ИФЛ = 1/n × (x1 + … + xn) × 100%,
xn = N фаголиз. МФ / N всех фаголиз. МФ;
где n – количество МФ с фагосомами, а x – соотношение количества фаголизосом МФ
(N фаголиз. МФ) по отношению ко всем фагосомам МФ (N всех фагосом. МФ).
2.6. Методы изучения биологических эффектов, оказываемых наноразмерными алмазными частицами в макрофагах
Изучение биологических эффектов, оказываемых НА частицами на МФ, осуществлялось
при помощи иммуноцитохимических методов выявления экспрессии МФ провоспалительных,
гидролитических и ростовых факторов и их секреции на миллипоровых фильтрах.
2.6.1. Иммуноцитохимические методы выявления внутриклеточной продукции провоспалительных, гидролитических и ростовых факторов
Для исследования биологической активности НА частиц использовали непрямой иммуноцитохимический метод выявления внутриклеточной продукции провоспалительных, гидролитических и ростовых факторов (Arkhipov S.A. et al., 2010). Контролем служили МФ, к которым
через 24 часа культивирования вносили свежую среду культивирования взамен предыдущей, в
которую предварительно вносили бидистиллированную стерильную воду в объеме, идентичном
тому, в котором находились МФ в суспензии с НА. Анализ проводили через 24 часа после внесения исследуемых наночастиц в первичную культуру МФ с концентрацией НА 20 мкг/мл, что
и при исследовании цитофизиологических характеристик МФ. МФ культивировали на покровных стеклах (106 клеток в 2 мл полной среды) в пластиковых 24-луночных планшетах.
Клетки фиксировали через 1, 3, 24 и 48 часов после внесения НА частиц 4% раствором
формальдегида, приготовленным на фосфатном буфере (pH = 7,3-7,5), в течение 10 мин, после
55
чего инкубировали в растворе фосфатного буфера в течение 20 минут. Для демаскировки антигенов фиксированные культуры инкубировали в растворе тритона X-100 (0,3% раствор тритона
X-100 в фосфатном буфере pH = 7,3-7,5) в течение 2 минут. Далее препараты МФ культур инкубировали с «первыми антителами» (специфичными в отношении выявляемых маркеров) к
соответствующим антигенам/маркерам.
Экспрессию МФ IL-1α, GM-CSF, TNF-α и IFN-γ выявляли при помощи моноклональных
антител: anti-mouse IL-1α (Isotype: Armenian Hamster Anti-Mouse IgG1, λ1; Clone: ALF-161;
кат. номер 559810, Becton Dickinson Pharmingen, США), anti-mouse GM-CSF (Isotype: Rat AntiMouse IgG2a; Clone: MP1-22E9; кат. номер 554404, Becton Dickinson Pharmingen, США), antimouse TNF-α (Isotype: Rat Anti-Mouse IgG1; Clone: MP6-XT22; кат. номер 554416, Becton Dickinson Pharmingen, США); anti-mouse IFN-γ (Isotype: Rat Anti-Mouse IgG1, κ; Clone: XMG1.2;
кат. номер 559065, Becton Dickinson Pharmingen, США). Экспрессию (и секрецию) МФ катепсина B, катепсина D, металлопротеиназы-1 (MMP-1) и металлопротеиназы-9 (MMP-9) выявляли
при помощи моноклональных антител: anti-Cathepsin B (Isotype: Goat polyclonal antibody IgG,
biotin conjugate; Entrez GeneID: 13030; кат. номер BAF965, R&D Systems, США); anti-Cathepsin
D (Isotype: Rabbit monoclonal antibody IgG; Clone: EPR3057Y; кат. номер ab75852, Abcam,
США), anti-MMP-1 (Isotype: Rabbit polyclonal antibody IgG; Entrez GeneID: 4312; кат. номер
PAB12708, Abnova, США); anti-MMP-9 (Isotype: Rabbit polyclonal antibody IgG; кат. номер
ab38898, Abcam, США). Экспрессию (и секрецию) МФ трансформирующего фактора роста
TGFB1/TGF-β, эпидермального фактора роста EGF, фактора роста кератиноцитов KGF/FGF-7 и
основного фактора роста фибробластов b-FGF/FGF-2 выявляли при помощи моноклональных
антител: anti-TGFB1/TGF Beta 1 (Isotype: Rabbit polyclonal antibody IgG, unconjugate; Epitope:
aa336-385; кат. номер LS-B5663-50; LifeSpan BioSciences, США); anti-mouse EGF (Isotype:
Mouse Anti-Mouse IgG1, unconjugate; Clone: E5; кат. номер LS-C121770, LifeSpan BioSciences,
США); anti-KGF/FGF-7 (Isotype: Rabbit polyclonal antibody IgG, unconjugate; Entrez GeneID:
2252; кат. номер bs-0734R; Bioss Antibodies, США); anti-b-FGF/FGF-2 (Isotype: Rabbit polyclonal
antibody IgG, unconjugate; Entrez GeneID: 14173; кат. номер bs-0217R; Bioss Antibodies, США).
Инкубацию с первичными антителами проводили в течение 60 минут во влажной камере
при комнатной температуре (BD Pharmingen Technical Data Sheet). Для визуализации кроличьих
первичных антител использовали полимерную систему ImmPRESS Anti-Rabbit Ig (peroxidase)
Polymer Detection Kit - Vector Labs MP-7401-15 (США). Для визуализации биотинилированных
антител использовали систему визуализации R.T.U. Vectastain Kit (Vectorlabs, США). Для визуализации первичных антител хомяка использовали биотинилированные антитела AntiHamster (BD Pharmingen, C.N. – 550335) и стрептавидин-HRP из набора для иммуноцитохимии
Novocastra 250 (Великобритания). Для визуализации мышиных первичных антител использова-
56
ли полимерную систему ImmPRESS Anti-Mouse Ig (peroxidase) Polymer Detection Kit - Vector
Labs MP-7402-15 (США). Окраску препаратов проводили в растворе диаминобензидина
(англ. 3,3’-diaminobenzidine, сокр. DAB) с субстратом, содержащим перекись водорода (BD
DAB Kit). Использовали стандартный BD DAB Kit (BD PharmingenTM Technical Data Sheet).
Клетки отмывали от свободного диаминобензидина дистиллированной водой, препараты высушивали при комнатной температуре в течение 1 часа, докрашивали водным 1% раствором
метилового зеленого (серия ТУ 6-09-761-88, ООО ТД «Сибдиамед», г. Новосибирск) в течение
15 минут. Количество МФ, высокоэкспрессирующих гидролитические и ростовые факторы определяли по доле МФ в %, у которых более половины цитоплазмы имела ярко выраженную хромогенную
окраску. Поскольку экспрессия исследуемых ферментов в той или иной степени выявлялась во всех
МФ, то количественный анализ экспрессии гидролитических и ростовых факторов во всех исследуемых популяциях МФ в контрольной и экспериментальной группах проводили при помощи компьютерной морфометрии. Зоны клеточных мембран или цитоплазмы, содержащие выявляемые антигены, окрашивались в специфический коричневый цвет. Интенсивность такой окраски прямо
пропорциональна количеству экспрессируемого маркера. Размеры окрашенных зон цитоплазмы
МФ измеряли морфометрически в условных единицах по общей площади (в кв. пикселях) окрашенных зон (на пяти фотографиях, в которых размещалось от 50 до 70 МФ) после их фотографирования при помощи цифровой камеры «AxioCam HRc» (Zeiss, Германия) и микроскопа
«AxioVision Z1» (Zeiss, Германия) при увеличении в 400 раз и с помощью цитометрического
анализа
цифровых
откалиброванных
изображений
при
помощи
программы
«Видео-
Тест Морфо 3.2» (ООО НПК «Зенит», г. Санкт-Петербург). Далее для всех исследуемых факторов производили расчет средней площади окраски в пересчете на один МФ (в условных единицах).
2.6.2. Иммуноцитохимические методы выявления секреции гидролитических и ростовых факторов на миллипоровых фильтрах
Поскольку, согласно нашим данным, выбранная нами концентрация 20 мкг/мл НА не вызывала
цитотоксических эффектов в отношении МФ in vitro (п. 3.2), то это позволило провести исследование
влияния НА частиц на секрецию МФ изучаемых ферментов при помощи метода культивирования на
нитроцеллюлозных миллипоровых фильтрах, применяемых для иммобилизации белков и других
биомакромолекул. Исследование влияния НА частиц на секрецию гидролитических факторов:
катепсина B и D, металлопротеиназы-1 (MMP-1) и металлопротеиназы-9 (MMP-9), - и ростовых
факторов: TGFB1/TGF-β, EGF, KGF/FGF-7 и b-FGF/FGF-2, - в МФ проводили через 24 и 48 часов после внесения НА в первичные 24-часовые культуры МФ. Эксперименты по исследованию
секреторной активности МФ в отношении исследуемых ферментов проводили по той же схеме,
которую использовали для определения их экспрессии в МФ (Arkhipov S.A. et al., 2010). Для
57
этого в чашки Петри (40 мм) предварительно вносили не покровные стекла, а миллипоровые
мембраны стандартных размеров (10×10 мм). Все последующие операции с МФ, прикрепившимися к мембранам, были аналогичны тем, которые проводили с покровными стеклами. Определение секреторной активности МФ осуществляли иммуноцитохимическим методом. После завершения экспериментов in vitro мембраны с МФ отмывали в растворе Хенкса без фенолового
красного (серия X-12-03, Биолот, г. Санкт-Петербург), а затем проводили иммуноцитохимическую окраску. Зоны миллипоровых мембран вокруг прикрепленных к ним МФ, секретирующих
выявляемые ферменты, окрашивались в специфический коричневый цвет (Рис. П.6), которые
содержали секретируемый продукт. Специфичность окраски верифицировали при постановке контрольных тестов – «отрицательных контролей». В контрольных тестах часть тестируемых мембран
инкубировали не с первичными антителами, используемыми для выявления ферментов, а с неиммунной сывороткой животного того вида, от которого были получены антитела. Яркость «фоновой»
неспецифической окраски мембран принимали за нулевую при бинаризации цифровых фотографий
мембран по яркости. Размеры специфически окрашенных зон на мембранах, обусловленных иммобилизацией секретируемых ферментов, измеряли морфометрически в условных единицах по
общей площади (в кв. пикселях) окрашенных зон на тестируемых мембранах (на пяти фотографиях) после их фотографирования с помощью цифровой камеры «AxioCam HRc» (Zeiss, Германия) и микроскопа «AxioVision Z1» (Zeiss, Германия) при увеличении в 400 раз и с помощью
цитометрического анализа цифровых откалиброванных изображений при помощи программы
«ВидеоТест Морфо 3.2» (ООО НПК «Зенит», г. Санкт-Петербург).
2.7. Методы статистического анализа
Полученные данные были статистически проанализированы с помощью лицензированных
пакетов прикладных программ «Statistica v.6» и «Excel v.7». Вычисляли среднюю величину (M)
и стандартную ошибку среднего (SE или m). Данные представлены в виде M ± m. Вероятность
достоверности различий между исследуемыми средними величинами показателей в экспериментальных группах культур оценивали с помощью непараметрического критерия МаннаУитни. Различия считали достоверными при величине вероятности принятия нулевой гипотезы
о принадлежности сравниваемых независимых выборок к одной и той же генеральной совокупности (H0) с вероятностью p < 0,05.
58
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Результаты исследования свойств биотропности наноразмерных алмазных частиц в отношении макрофагов
3.1.1. Результаты светооптического и флуоресцентного микроскопического исследования макрофагов, подвергнутых воздействию наноразмерных алмазных частиц
На первом этапе исследования эндоцитозной активности МФ в отношении НА использовали метод фазового интерференционного контраста при обычном освещении и метод фазового
контраста в поляризованном свете. На рисунках 1 и 2 представлены культуры МФ, которые исследовали указанными методами через 24 часа после внесения в нее НА (при концентрации
20 мкг/мл). При исследовании культуры МФ методом фазового контраста при обычном освещении выявляемые вакуоли выглядели как достаточно однородные оптически плотные структуры
(Рис. 1). Как видно из рисунка 1 выявляемые вакуоли были гетерогенны по размерам и занимали
значительную часть цитоплазмы МФ. При помощи метода фазово-контрастной микроскопии в
поляризованном свете было показано, что исследуемые вакуоли МФ гетерогенны по оптической
плотности даже в пределах отдельных вакуолей, что свидетельствовало о наличии в них частиц
НА (Рис. 1).
Однако указанные методы не позволяли морфометрически оценить количество НА, накапливающихся в МФ, поскольку метод фазово-контрастной микроскопии «высвечивает» все оптически разнородные клеточные структуры (Рис. 2). Для качественного и полуколичественного
А.
Б.
В.
Рис. 1. Культура перитонеальных макрофагов (МФ) через 24 часа после суточной адаптации
in vitro в культуральной среде (контроль) (А) и через 24 часа после внесения в нее наноразмерных алмазных частиц (НА) в концентрации 20 мкг/мл (Б и В). А и Б. Метод фазового интерференционного контраста. Б. Метод фазового контраста в поляризованном свете. Увеличение 1000.
59
Контроль
DAPI
НА, 20 мкг/мл
DAPI
Рис. 2. Культура перитонеальных макрофагов (МФ) через 24 часа после суточной адаптации
in vitro в культуральной среде (контроль) и через 24 часа после внесения в нее наноразмерных
алмазных частиц (НА) в концентрации 20 мкг/мл (НА, 20 мкг/мл). Метод дифференциального
интерференционного контраста (черными стрелками указаны накопления НА в вакуолярном
аппарате МФ) и флуоресцентный метод выявления ядер МФ красителем DAPI. Увеличение 400.
анализа накопления НА в МФ было проведено исследование культур МФ при комбинированном
освещении – проходящем свете и флуоресцентном освещении, при котором накопившиеся в МФ
частицы НА выглядели значительно темнее (5-10 единиц по международной шкале градаций серого цвета, оцениваемого в диапазоне 0-255), чем стеклянная подложка (235-250). При таком
способе анализа МФ было отчетливо видно, что эндоцитозные вакуоли содержали оптически
плотный материал, соответствующей оптической яркости НА в проходящем свете – 5-10 единиц
(Рис. 3). Большинство эндосом при сходной оптической яркости значительно варьировало по
величине, что косвенно указывало на то, что образование крупных фагосом может происходить
в результате слияния более мелких эндосом, содержащих НА.
На рисунке 4 представлены результаты морфометрического исследования эндоцитозной
активности МФ в зависимости от времени культивирования НА в культуре при концентрации
20 мкг/мл (п. 3.3.1). Установлено, что количество НА частиц в МФ возрастает с увеличением
времени инкубирования МФ с НА частицами. При этом выявлено, что количество НА частиц в
МФ достигает некоторого максимума на 24 часе культивирования. Эти данные косвенно указывают на то, что через 24 часа культивирования в среде, содержащей НА частицы, по-видимому,
МФ полностью «насыщаются» НА, что, вероятно, сопряжено со снижением их эндоцитозной
активности в отношении НА к этому времени.
60
А.
Б.
Рис. 3. Культура перитонеальных макрофагов (МФ) через 24 часа после суточной адаптации
in vitro в культуральной среде (контроль) (А) и через 24 часа после внесения в нее наноразмерных алмазных частиц (НА) в концентрации 20 мкг/мл (Б). Метод комбинированного освещения
препаратов – одновременно в проходящем свете при установленной зеленом светофильтре и
индуцированной флуоресценции клеток, дополнительно окрашенных акридиновым оранжевым
(эндоцитозные вакуоли с различной плотностью накопления в них НА обозначены красными
стрелками). Увеличение 1000.
Условный интегральный показатель
эндоцитоза НА макрофагами, кв. пиксели
2000
1800
1600
**
1400
1200
1000
800
600
400
**
200
0
1
3
24
48
Время инкубации НА с МФ, ч
Рис. 4. Результаты исследования эндоцитоза наноразмерных алмазных частиц (НА) макрофагами (МФ) в культуре в зависимости от времени культивирования (при концентрации НА
20 мкг/мл).
Примечание. Вероятность достоверности различий P между средними величинами исследованных показателей: ** P<0,01.
61
3.1.2. Результаты электронно-микроскопического исследования макрофагов, подвергнутых воздействию наноразмерных алмазных частиц
Для исследования захвата и интернализации НА частиц в биосовместимой концентрации
(20 мкг/мл) (п. 3.2) макрофагами их исследовали в трансмиссионном электронном микроскопе.
Проводили структурный анализ полученных изображений в разные временные периоды инкубации (24 и 48 часов) с наночастицами и при сопоставлении с контрольными точками.
Через 1 сутки после внесения НА в культуры МФ эндосомы, содержащие НА, отмечали
преимущественно в зонах, прилегающих к плазмолемме МФ (Рис. 5). Размеры эндосом варьировали в диаметре от 0,1 до 0,3 мкм. При этом в эндосомах НА располагались в виде агрегатов
в наноразмерном диапазоне 25-50 нм. Наряду с эндосомами в МФ выявлялись вторичные лизосомы, содержащие частицы НА. Плазмалемма образовывала большое количество цитоплазматических выростов (Рис. 5).
Рис. 5. Макрофаг (МФ) из культуры перитонеальных макрофагов мышей линии BALB/c через 1
сутки после внесения в культуру частиц наноразмерных алмазов (НА) в концентрации
20 мкг/мл. Формирование крупных эндосом, содержащих НА в зонах, прилегающих к плазмолемме МФ (черные стрелки). Увеличение 10000.
62
Рис. 6. Макрофаг (МФ) из культуры перитонеальных макрофагов мышей линии BALB/c через 1
сутки после внесения в культуру частиц наноразмерных алмазов (НА) в концентрации
20 мкг/мл. Формирование крупных эндосом (черные стрелки), содержащих НА в перинуклеарной зоне МФ. Увеличение 10000.
В случаях, когда ядро располагалось достаточно близко к плазмолемме, эндосомы с НА
выявлялись в перинуклеарной зоне МФ (Рис. 6). Как видно на рисунке 6 плотность содержания
НА в фагоцитозных вакуолях, количество частиц НА в эндосомах и размеры эндосом – все эти
показатели эндоцитозной активности МФ сильно варьировали по величине. Например, размеры
эндосом варьировали в диапазоне 0,3-1,0 мкм, а количество НА в усл. ед. (площади, занимаемой наночастицами, в мкм2) в пересчете на одну эндосому варьировало от 0,04 до 0,09 мкм2.
Также на 24 и 48 часе инкубации МФ с НА частицами были обнаружены единичные НА в цитозоле МФ.
Наряду с формированием типичных фагоцитозных эндосом, содержащих частицы НА, в
МФ, культивируемых в среде с НА, отмечали в достаточно большом количестве эндосомы
клатринового типа с размерами эндосом 100 нм (Рис. 7). Некоторые клатриновые везикулы находились вблизи крупных эндосом, что может свидетельствовать о высокой вероятности их последующего слияния с ними. Таким образом, накопление НА в МФ могло осуществляться, ве-
63
роятно, в результате работы трех механизмов: в результате активного пиноцитоза питательной
среды, содержащей отдельные НА и их небольшие агрегаты (50-100 нм); эндоцитоза крупных
агрегатов НА (более 100 нм); эндоцитоза с формированием клатриновых эндоцитозных везикул
с НА (в размерном диапазоне 5-10 нм). Отмечена высокая активность плазмалеммы, характеризующаяся образованием большого количества цитоплазматических выростов. При этом плазмалемма имела сложную конфигурацию с формированием смыкающихся друг с другом цитоплазматических выростов, формирующих эндоцитозные вакуоли.
Через 2 суток после внесения НА в культуры МФ эндосомы и вторичные лизосомы, содержащие НА, наблюдали достаточно равномерно по всей цитоплазме, от зоны, прилегающей к
плазмолемме МФ до перинуклеарной зоны (Рис. 8). Размеры эндосом варьировали в диаметре
от 0,5 до 0,9 мкм. В эндосомах НА располагались в виде плотных агрегатов в наноразмерном
диапазоне 50-100 нм. Наряду с типичными эндосомами, содержащими НА, в МФ выявляли
крупные вакуоли, содержащие частицы НА, с менее плотной их «упаковкой» и характерной
компартментализаций, что свидетельствовало, о том, что такие эндоцитозные вакуоли могли
образовываться в результате слияния более мелких эндосом.
Рис. 7. Макрофаг (МФ) из культуры перитонеальных макрофагов мышей линии BALB/c через 2
суток после внесения в культуру частиц наноразмерных алмазов (НА) в концентрации
20 мкг/мл. Формирование смыкающихся друг с другом цитоплазматических выростов плазмалеммы, формирующих крупные эндоцитозные вакуоли. Формирование клатриновых везикул,
содержащих частицы НА (черные стрелки). Увеличение 10000.
64
А.
Б.
Рис. 8. Макрофаг (МФ) из культуры перитонеальных макрофагов мышей линии BALB/c через 2
суток после суточной адаптации in vitro в культуральной среде (контроль) (А) и через 2 суток
после внесения в культуру частиц наноразмерных алмазов (НА) в концентрации 20 мкг/мл (Б).
Эндосомы и вторичные лизосомы, содержащие НА, располагаются равномерно по всей цитоплазме (черные стрелки), от зоны, прилегающей к плазмолемме МФ до перинуклеарной зоны.
Увеличение 5000.
Таким образом, по данным электронно-микроскопического анализа МФ, подвергнутых
воздействию НА частиц в концентрации 20 мкг/мл в культуральной среде, можно предположить, что накопление НА в МФ могло осуществляться тремя механизмами: в результате активного пиноцитоза питательной среды, содержащей отдельные НА и их небольшие агрегаты (50100 нм); эндоцитоза крупных агрегатов НА (более 100 нм); эндоцитоза с формированием клатриновых эндоцитозных везикул с НА (в размерном диапазоне 5-10 нм).
65
3.2. Результаты исследования свойств биосовместимости наноразмерных алмазных
частиц в отношении макрофагов
3.2.1. Результаты исследования влияния различных концентраций и экспозиций наноразмерных алмазных частиц с макрофагами на их жизнеспособность
Для исследования влияния НА частиц на жизнеспособность МФ использовался витальный
краситель трипановый синий, который выявляет клетки с поврежденной цитоплазматической
мембраной. По собранным данным оценивался показатель жизнеспособности (ПЖ). Было показано, что культивирование МФ в культуральной среде, содержащей суспензии частиц НА в
концентрации от 10 до 30 мкг/мл, равно как и время культивирования в пределах, определенных условиями эксперимента, не влияли на показатели жизнеспособности МФ (таблица 1). Исключение составляет период культивирования МФ в течение 48 часов в среде, содержащей
60 мкг/мл НА, после чего количество жизнеспособных клеток уменьшилось на 33%. Таким образом, по данным теста с трипановым синим НА частицы в концентрациях от 10 до 30 мкг/мл в
культуральной среде проявляют свою биосовместимость.
Полученные результаты дополняют данные других исследователей, полученных при исследовании биосовместимости НА в отношении клеток различного гистогенеза, не обладающих
фагоцитозной активностью, и уточняют «границы» биосовместимости НА и клеток, способных
их фагоцитировать – макрофагов и гранулоцитов (Schrand A.M. et al., 2009). При использовании
различных перевиваемых линий нефагоцитирующих клеток показано, что цитотоксические эффекты НА (Nanostructured and Amorphous Materials, Inc., США; Hyprez-Engis Inc., США) в размерном диапазоне 6-100 нм проявляются при относительно высоких концентрациях (от
200 мкг/мл и более) и существенно не зависят от размера использованных частиц (Thomas V. et al., 2012). При использовании различных перевиваемых линий макрофагального происхождения показано, что цитотоксические эффекты НА в размерном диапазоне 6-100 нм проявляются только при использовании концентраций, превышающих 50 мкг/мл (Thomas V. et al.,
2012), что согласуется с результатами нашего исследования.
3.2.2. Результаты исследования влияния наноразмерных алмазных частиц на продукцию активных форм кислорода макрофагами
Для исследования влияния НА частиц на жизнеспособность МФ изучали продукцию АФК
МФ как одного из неспецифических показателей функционального статуса клеток. Оценку
продукции АФК проводили при помощи теста с нитросиним тетразолием (НСТ-тест). В случае
образования клетками АФК молекула нитросинего тетразолия восстанавливается до его водонерастворимой формы – в частицы формазана фиолетово-синего цвета. По имеющимся данным
рассчитывался индекс продукции АФК (ИП АФК). Было установлено, что НА частицы в
66
Таблица 1.
Результаты исследования in vitro влияния наноразмерных алмазов (НА) на жизнеспособность макрофагов (МФ) и продукцию активных форм кислорода (АФК) в зависимости от
концентрации НА в культуральной среде и от времени их инкубации с МФ.
Время инкубации,
часы
1
3
24
48
Концентрация НА,
мкг/мл
Контроль
10
20
30
60
Контроль
10
20
30
60
Контроль
10
20
30
60
Контроль
10
20
30
60
Доля живых МФ
(ПЖ), %
93,5±5,5
95,6±4,3
93,8±5,8
95,9±4,3
94,8±4,1
97,5±3,5
94,9±4,9
96,6±4,6
97,9±3,7
97,4±3,7
97,5±4,3
93,8±5,2
95,1±4,3
97,3±3,6
90,7±3,7
97,3±3,1
98,2±2,7
96,1±2,4
95,7±3,5
66,1±2,6*
Индекс продукции
АФК МФ (ИП АФК)
95,1±5,3
105,0±6,7
120,4±8,2
127,2±7,8
132,1±9,0
124,2±6,9#
139,3±6,4
154,1±7,9
168,4±8,6*
179,7±9,7*
149,0±7,3
162,9±7,2
179,2±8,3
214,8±9,1*
236,4±9,6*
160,7±7,7
182,9±9,2
196,2±8,5*
243,3±10,4*
262,5±11,3*
Примечание. Результаты представлены в виде M±m, где M – средняя величина, m – стандартная
ошибка среднего. Различия между сравниваемыми средними величинами представлены в виде:
* Р<0,05 (при сравнении показателей интактных МФ, или контроля, с показателями в «экспериментальных» группах культур МФ, культивированных с НА, в пределах соответствующего
периода наблюдения: 1, 3, 24, 48 часа после внесения НА в 24-часовые культуры МФ); # Р<0,05
(при попарном сравнении интактных МФ, или контроля, в периоды наблюдения: 1-3, 3-24, 2448 час).
Обозначения: МФ – макрофаг, НА – наноразмерные частицы алмазов, АФК – активные формы
кислорода, ПЖ – показатель жизнеспособности, ИП АФК – индекс продукции АФК.
концентрациях от 10 до 20 мкг/мл в культуральной среде в пределах 24 часов культивирования
не влияют на продукцию АФК МФ (таблица 1). НА частицы в концентрации 20 мкг/мл только
через 48 часов культивирования с МФ индуцировали статистически значимое повышение продукции АФК макрофагами на 22% (таблица 1). Однако для концентраций НА частиц от 30 до
60 мкг/мл в среде уже с 3 часов культивирования наблюдали статистически значимые различия
показателей продукций АФК клетками по сравнению с контролем. Через 3 часа культивирования МФ с НА частицами в концентрациях 30 и 60 мкг/мл (по сравнению с контролем) продукция АФК увеличилась соответственно в 1,36 и 1,45 раза, через 24 часа – в 1,44 и 1,59 раза и через 48 часов – в 1,51 и 1,63 раза (таблица 1). Таким образом, по данным НСТ-теста НА частицы
в концентрациях от 10 до 20 мкг/мл в культуральной среде проявляют свою биосовместимость,
67
а в концентрациях 30 и 60 мкг/мл в большей степени через 24 и 48 часов культивирования они
способны стимулировать процесс продукции АФК в МФ. Также по данным НСТ-теста была
отмечена зависимость цитотоксичности от дозы и времени инкубации с НА частицами при
концентрации выше 30 мкг/мл и времени культивирования продолжительнее 48 часов.
Полученные данные согласуются с результатами работ других исследователей, полученных при исследовании влияния НА частиц на продукцию АФК клетками, обладающими фагоцитозной активностью, и указывают на относительную «инертность» НА в отношении их способности индуцировать продукцию АФК (Krüger A. et al., 2005; Schrand A.M., Dai L. et al., 2007;
Thomas V. et al., 2012). Показано, например, что при инкубировании в течение 24 часов МФ с
НА (размерностью 2-10 нм) даже использование концентрации частиц 100 мкг/мл не вызывало
существенного повышения уровня образования АФК и не нарушало целостности мембран митохондрий (Schrand A.M., Dai L. et al., 2007). Однако полученные нами данные, указывают на
«относительность» некой «инертности» НА в отношении их способности активировать продукцию АФК, поскольку при достижении какой-то пороговой дозы (для НА марки «УДА-В-ГО»
она составила величину 30 мкг/мл) и увеличении времени после начала захвата НА частиц МФ
отмечено незначительное (относительно контроля) повышение продукции АФК.
3.3. Результаты исследования влияния наноразмерных алмазных частиц на функциональную активность макрофагов
3.3.1. Результаты исследования показателей эндоцитозной активности и «распластывания» макрофагов, подвергнутых воздействию наноразмерных алмазных частиц
Для изучения влияния НА частиц на функциональную активность МФ были проанализированы показатели эндоцитозной активности, представленные эндоцитозным индексом (ЭИ) и
индексом эндоцитозной активности МФ (ИЭА), и показатели «распластывания», представленные непосредственно индексом «распластывания» (ИР) и индексом активации МФ (ИАМФ).
Было показано, что доля МФ с эндоцитозными вакуолями, содержавшими НА частицы
(п. 3.1.1; Рис. 3), очевидно, возрастала по мере увеличения времени культивирования и концентрации НА в культуральной среде (таблица 2). Через 24 часа культивирования МФ с НА частицами при их концентрации 60 мкг/мл отмечали статистически значимое увеличение доли МФ с
эндоцитозными вакуолями на 27%, в то время как через 48 часов культивирования МФ при
концентрациях НА в полной среде 30 и 60 мкг/мл отмечали соответственно увеличение доли
МФ с эндоцитозными вакуолями, содержащими НА (п. 3.1.1; Рис. 3), на 24 и 28% (таблица 2).
Исследование эндоцитозной активности позволило установить, что величины ее индексов
возрастали по мере увеличения времени культивирования и концентрации НА частиц в культуральной среде (таблица 2). Например, можно отметить для НА частиц при концентрации
68
Таблица 2.
Результаты исследования in vitro влияния наноразмерных алмазов (НА) на функциональную активность макрофагов (МФ) в зависимости от концентрации НА в культуральной
среде и от времени их инкубации с МФ.
Время
инкубации,
часы
1
3
24
48
Концентрация
НА,
мкг/мл
Контроль
10
20
30
60
Контроль
10
20
30
60
Контроль
10
20
30
60
Контроль
10
20
30
60
Доля МФ с
эндоцитозными вакуолями (ЭИ), %
0
3,0±0,7
4,6±0,8
5,5±1,1
39,1±3,6#
42,6±3,9
44,2±5,0
45,5±6,0
72,2±5,8#
74,9±6,3
79,6±6,4
91,3±7,3*
75,1±4,4
89,2±5,9
93,3±6,7*
95,8±4,5*
Индекс эндоцитозной активности МФ
(ИЭА), у. ед.
0
17,0±0,9
25,6±1,3*
40,5±2,0*
120,2±6,1#
180,6±9,1*
270,1±13,5*
340,5±17,2*
620,2±31,1#
707,9±35,4
733,7±36,7*
781,3±39,1*
643,2±32,2
738,9±37,0
757,7±37,9*
789,3±39,5*
Доля «распластанных»
МФ (ИР), %
23,1±2,9
42,0±3,5*
47,2±3,3*
51,9±2,3*
74,8±4,2*
62,7±3,6#
71,7±2,6
76,6±4,2*
86,4±4,5*
91,8±3,6*
65,6±4,1
75,2±5,5
89,7±4,5*
92,9±3,3*
79,6±3,9
87,1±4,9#
89,1±3,7
82,5±5,4
75,3±5,7*
51,0±5,8*
Индекс активации МФ
(ИАМФ),
усл. ед.
472,5±26,0
495,1±29,7
517,3±33,6
540,2±32,4
562,5±36,6
675,8±37,1#
697,5±41,9
826,6±53,7*
850,6±55,3*
867,7±52,0*
922,5±50,7#
1152,7±69,1
1491,5±89,6*
1467,2±95,4*
1435,6±86,1*
967,5±58,2
1182,1±65,1
1342,4±87,3*
1167,6±70,2
985,5±64,2
Примечание. Результаты представлены в виде M±m, где M – средняя величина, m – стандартная
ошибка среднего. Различия между сравниваемыми средними величинами представлены в виде:
* Р<0,05 (при сравнении показателей интактных МФ, или контроля, с показателями в «экспериментальных» группах культур МФ, культивированных с НА, в пределах соответствующего
периода наблюдения: 1, 3, 24, 48 час после внесения НА в 24-часовые культуры МФ. Фагоцитозную активность в периоды наблюдения 3, 24 и 48 час оценивали относительно показателя на
1 час, который служил «контролем»); # Р<0,05 (при попарном сравнении интактных МФ, или
контроля, в периоды наблюдения: 1-3, 3-24, 24-48 час).
Обозначения: МФ – макрофаг, НА – наноразмерные частицы алмазов, ЭИ – эндоцитозный индекс (или индекс эндоцитоза), ИЭА – индекс эндоцитозной активности макрофагов, ИР – индекс «распластывания», ИАМФ – индекс активации макрофагов.
20 мкг/мл на 3-м часе по сравнению с 1-м часом культивирования статистически значимое увеличение индекса эндоцитозной активности МФ в 11 раз, а на 24-м часе по сравнению с 3-м часом – в 4 раза (таблица 2). В первый час культивирования индекс эндоцитозной активности МФ
для НА частиц с концентрациями 20 и 60 мкг/мл статистически различаются в 2,4 раза, на третий час – в 1,9, а на 24-й час – в 1,1 раз (таблица 2). Следует, однако, отметить, что начиная с
периода 24-х часов, величина индекса эндоцитозной активности МФ мало зависела от концентрации НА в культуральной среде и, видимо, она была детерминирована только эндоцитозной
69
емкостью вакуолярного аппарата МФ и возможностью формировать эндоцитозные вакуоли.
Следует также отметить, что эндоцитозные вакуоли с НА частицами нередко сливались между
собой, формируя значительно более крупные эндосомы.
Согласно полученным данным захват МФ НА частиц был сопряжен с увеличением количества «распластанных» клеток уже в первый час после их взаимодействия с НА, и динамика
этого процесса была сопряжена с концентрацией НА в среде культивирования (таблица 2). Но
уже начиная с 3 часа по 48 час культивирования МФ в среде с НА частицами вовлечение МФ в
процесс «распластывания» МФ был менее динамичным. Следует отметить, что через 48 часов
количество МФ, помещенных в среду с концентрацией НА в ней 60 мкг/мл, доля «распластанных» МФ уменьшалась на 42%, что можно связать с уменьшением количества жизнеспособных
МФ на 33% в этот же временной период культивирования в среде с аналогичной концентрацией
НА в ней (п. 3.2; таблица 1). Возможно, что это был пул клеток с пониженной жизнеспособностью, что указывает на вероятную цитотоксичность этой дозы НА в культуральной среде, для
проявления которой необходимо время около 48 часов.
Величины индекса активации МФ свидетельствуют о том, что изменения этого параметра
определяются не столько дозой НА в среде культивирования, сколько временем культивирования, или точнее, временем нахождения НА частиц в МФ (таблица 2). Например, на 3 часе культивирования с НА частицами в концентрациях между 20 и 60 мкг/мл отмечали статистически
значимое увеличение показателей индекса активации МФ примерно на 22-28%, а на 24 часе –
56-62%. Согласно этим и приведенным ранее данным можно полагать, что НА в концентрациях
от 10 до 20 мкг/мл в культуральной среде обладают способностью модулировать функциональный статус МФ, не сопряженный с их цитотоксичностью для МФ, т.е. НА в указанных дозах
проявили свою биосовместимость.
Способность МФ к «распластыванию» является интегральным (неспецифическим) показателем
их активности, связанным с конформативными изменениями цитоскелета при осуществлении эндоцитозной функции и ее «энергообеспеченности» (Шкурупий В.А. и др., 2007; Arkhipov S.A. et al.,
2010; Li J. et al., 2010). Согласно полученным данным захват МФ НА был сопряжен с увеличением
количества «распластанных» клеток уже в первый час после их взаимодействия с НА и динамика
этого процесса была сопряжена с концентрацией НА в среде культивирования. Но уже начиная с
первых часов культивирования МФ в среде с НА вовлечение МФ в процесс «распластывания» МФ
был менее динамичным. Динамика изменений величины индекса активации МФ свидетельствует о
том, что параметры изменения функциональной активности МФ определяются не столько дозой НА
в среде культивирования, сколько временем культивирования, или точнее, временем нахождения НА
в МФ.
70
3.3.2. Результаты исследования влияния наноразмерных алмазных частиц на функциональное состояние вакуолярно-лизосомальной системы и процессы фагосомнолизосомного слияния в макрофагах
Для исследования влияния НА частиц на функциональное состояние вакуолярнолизосомального аппарата и процессы фагосомно-лизосомного слияния в МФ использовали экспериментальную модель с лизосомотропным красителем акридиновым оранжевым и фагоцитированием МФ частиц зимозана. Краситель акридиновый оранжевый окрашивает лизосомы в
оранжево-красный цвет (Рис. 9 и 10). В ходе исследования были рассчитаны показатель лабильности мембран лизосом (ПЛМЛ), фагоцитозный индекс (ФИ), фагоцитозное число (ФЧ) и
индекс фагосомно-лизосомного слияния (ИФЛ).
Было показано, что НА частицы в концентрации 20 мкг/мл в культуральной среде в пределах 48 часов культивирования практически не влияют на повышение показателя лабильности
мембран лизосом, определяемой флуоресцентным методом с использованием акридинового
оранжевого (таблица 3). Было отмечено незначительное понижение величины данного показателя во временные точки – 3 и 24 часа, что отражает относительную стабильность лизосом при
культивировании с НА частицами. Также НА частицы в исследуемой концентрации в целом не
влияли на величины фагоцитозного индекса и фагоцитозного числа (таблица 3). Было отмечено
незначительное увеличение фагоцитозного индекса и фагоцитозного числа (относительно контрольной группы) соответственно через 24 и 48 часов. Однако отмечали различия величин индекса фагосомно-лизосомного слияния в экспериментальной группе по сравнению с контролем
уже с первого часа (таблица 3). Через 1 час величина индекса фагосомно-лизосомного слияния
для МФ, культивируемых с НА частицами, была увеличена на 21,6% (относительно контроля),
через 3 часа – на 23,4%, через 24 часа – на 11,1% и через 48 часов – на 12,6% (таблица 3). При
этом абсолютные величины индекса фагосомно-лизосомного слияния в контроле и в экспериментальной группе стала повышаться только через 24 часа культивирования (таблица 3).
Таким образом, по данным анализа влияния НА частиц в концентрации 20 мкг/мл в культуральной среде на функциональное состояние вакуолярно-лизосомального аппарата и процессы фагосомно-лизосомного слияния, было показано, что НА частицы не оказывали существенного влияния на процесс фагоцитоза частиц зимозана МФ и показатель пермеабилизации мембран лизосом. Однако было показано, что НА частицы в концентрации 20 мкг/мл в культуральной среде усиливают процесс фагосомно-лизосомного слияния через 1, 3, 24 и 48 часов, и лабильность лизосомальных мембран при этом была выше. Полученные данные указывают на
способность НА стимулировать фагосомно-лизосомное слияние при одновременном сохранении фагоцитозной активности и стабильности мембран лизосом МФ.
71
Данные, указывающие на способность НА индуцировать фагосомно-лизосомное слияние
при одновременном сохранении фагоцитозной активности и стабильности мембран лизосом
МФ, получены впервые. Они указывают на способность НА стимулировать «разрешение» или
«завершенность» фагоцитозного процесса в отношении микрочастиц биологического происхождения (в данной работе в качестве такого объекта были использованы гранулы зимозана –
лиофилизированные формы дрожжеподобных грибков Saccharomyces cerevisiae). Вместе с тем,
выявленная способность НА стимулировать фагосомно-лизосомное слияние указывает на вероятность изменений развития воспалительного процесса, его модуляции при воздействии НА
частиц на МФ, находящиеся в очаге воспаления.
Таблица 3.
Результаты исследования in vitro влияния наноразмерных алмазов (НА) в концентрации
20 мкг/мл на состояние лизосомальной системы и процессы фагосомно-лизосомного слияния макрофагов (МФ) в зависимости от времени их инкубации с МФ.
Время
инкубации,
часы
1
3
24
48
Группа
Контроль
НА, 20 мкг/мл
Контроль
НА, 20 мкг/мл
Контроль
НА, 20 мкг/мл
Контроль
НА, 20 мкг/мл
Показатель
лабильности
мембран лизосом (ПЛМЛ),
усл. ед.
0,7±0,1
0,4±0,1*
0,3±0,1#
0,1±0,0*
0,1±0,0#
0,1±0,0
Фагоцитозный индекс
(ФИ), %
Фагоцитозное число
(ФЧ), шт.
Фагосомнолизосомный
индекс (ИФЛ),
%
58,7±2,0
55,1±3,2
71,4±1,9##
71,6±2,0
72,0±2,4
84,3±1,0**
78,3±0,9
80,1±1,8
3,3±0,2
3,2±0,1
3,6±0,1
3,7±0,2
4,4±0,2#
4,6±0,2
5,3±0,2#
4,3±0,1*
41,9±3,6
63,5±1,4**
38,2±1,7
61,6±1,4**
56,2±1,9##
67,3±0,8**
65,0±2,4##
77,6±0,8**
Примечание. Результаты представлены в виде M±m, где M – средняя величина, m – стандартная
ошибка среднего. Различия между сравниваемыми средними величинами представлены в виде:
* Р<0,05 и ** P<0,01 (при сравнении показателей интактных МФ, или контроля, с показателями
в «экспериментальных» группах культур МФ, культивированных с НА, в пределах соответствующего периода наблюдения: 1, 3, 24, 48 час после внесения НА в 24-часовые культуры МФ);
# Р<0,05 и ## P<0,01 (при попарном сравнении интактных МФ, или контролей, в периоды наблюдения: 1-3, 3-24, 24-48 час).
Обозначения: МФ – макрофаг, НА – наноразмерные частицы алмазов; Контроль – интактные
МФ, культивируемые в среде, не содержащей НА; НА, 20 мкг/мл – МФ, культивируемые в среде, содержащей НА в разведении 20 мкг/мл; ПЛМЛ – показатель лабильности мембран лизосом, ФИ – фагоцитозный индекс, ФЧ – фагоцитозное число, ИФЛ – индекс фагосомнолизосомного слияния.
72
Контроль
НА, 20 мкг/мл
24 ч
48 ч
Рис. 9. Культура перитонеальных макрофагов (МФ) через 24 и 48 часов после внесения в нее
наноразмерных алмазных частиц (НА) в концентрации 20 мкг/мл. Прижизненная окраска акридиновым оранжевым в течение 10 минут. Зеленым цветом окрашены ядра и цитоплазма клеток,
красным – лизосомы (красные стрелки). Флуоресцентная микроскопия. Увеличение 400.
73
Контроль
НА, 20 мкг/мл
24 ч
48 ч
Рис. 10. Культура перитонеальных макрофагов (МФ), фагоцитировавших гранулы зимозана,
через 24 и 48 часов после внесения в нее наноразмерных алмазных частиц (НА) в концентрации
20 мкг/мл. Инкубацию с гранулами зимозана проводили в течение 1 часа. Прижизненная окраска акридиновым оранжевым в течение 10 минут. Образовавшиеся в фагоцитах фаголизосомы,
содержащие гранулы зимозана, окрашены в оранжевый-красный цвет (красные стрелки). Неокрашенные акридиновым оранжевым гранулы зимозана, фагоцитированные МФ – фагосомы, не
слившиеся с лизосомами (зеленые стрелки). Флуоресцентная микроскопия. Увеличение 400.
74
3.4. Результаты исследования биологических эффектов, индуцированных наноразмерными алмазными частицами в макрофагах
3.4.1. Результаты исследования влияния наноразмерных алмазных частиц на экспрессию провоспалительных факторов макрофагами
Исследовали влияния НА частиц в концентрации 20 мкг/мл и времени культивирования
МФ с НА 48 часов на экспрессию провоспалительных цитокинов: IL-1α, GM-CSF, TNF-α и IFNγ. Согласно данным, представленным в таблице 4, захват МФ НА частиц был сопряжен с увеличением показателей экспрессии макрофагами GM-CSF в 2 раза, а IFN-γ в 2,8 раз (Рис. П.1).
При этом на 39 % уменьшался показатель экспрессии IL-1α, и неизменной осталась экспрессия
TNF-α (таблица 4; Рис. П.1).
Таким образом, полученные данные указывают на высокую биосовместимость НА в определенных дозах и их способность модулировать функциональное состояние МФ. Захват НА марки
«УДА-В-ГО» МФ в обсуждаемой экспериментальной ситуации не сопряжен с очевидной стимуляцией провоспалительного статуса, но предполагает возможность стимулирующих эффектов НА частиц
на способность МФ в отношении процессов пролиферации и антибактериальной защиты.
Таблица 4.
Результаты исследования in vitro влияния частиц наноразмерных алмазов (НА) в концентрации 20 мкг/мл на экспрессию макрофагами (МФ) IL-1α, TNF-α, GM-CSF и IFN-γ.
Группа
МФ интактных
мышей, культивируемые в среде, не содержащей НА
МФ интактных
мышей, культивируемые в среде, содержащей
НА
Экспрессия
IL-1α,
кв. пиксели
Экспрессия
TNF-α,
кв. пиксели
Экспрессия
GM-CSF,
кв. пиксели
Экспрессия
IFN-γ,
кв. пиксели
65,1±3,6
22,0±3,1
12,2±1,6
17,4±3,9
40,2±3,0**
26,1±3,4
25,3±3,0**
47,3±8,0**
Примечание. Результаты представлены в виде M±m, где M – средняя величина, m – стандартная
ошибка среднего. Различия между сравниваемыми величинами представлены в виде: * Р<0,05,
** Р<0,01 (при сравнении показателей у МФ от интактных мышей с показателями в «экспериментальных» группах культур МФ, культивированных с НА в течение 48 час после их внесения
в концентрации 20 мкг/мл в 24-часовые культуры МФ. «Контролем» служили культуры с МФ
от интактных мышей, которые после замены исходной среды для культивирования на новую
через 24 часа предварительного культивирования продолжали культивировать еще 48 часов).
Обозначения: МФ – макрофаг, НА – наноразмерные частицы алмазов.
75
3.4.2. Результаты исследования влияния наноразмерных алмазных частиц на экспрессию и секрецию лизосомальных гидролаз и матриксных металлопротеиназ макрофагами
Для изучения влияния НА частиц на экспрессию гидролитических ферментов были выбраны следующие ферменты: катепсин B, катепсин D, металлопротеиназа-1 (MMP-1) и металлопротеиназа-9 (MMP-9). Согласно результатам, представленным в таблице 5, культивирование
МФ в культуральной среде, содержащей суспензии частиц НА, приводило к увеличению в
культурах количества МФ с выраженной экспрессией выбранных ферментов (Рис. П.2 и П.3).
Это указывало на то, что в популяции МФ, культивируемых в среде, содержащей частицы НА, возрастало количество активированных МФ с повышенным гидролитическим потенциалом (таблица 5).
Таблица 5.
Результаты исследования in vitro влияния частиц наноразмерных алмазов (НА) в
концентрации 20 мкг/мл на экспрессию макрофагами (МФ) катепсина B, катепсина D,
металлопротеиназы-1 (MMP-1) и металлопротеиназы-9 (MMP-9) (по доле высокоэкспрессирующих МФ) в культуре МФ.
Время
инкубации
(часы)
1
3
24
48
Группа
МФ без
НА
МФ + НА
МФ без
НА
МФ + НА
МФ без
НА
МФ + НА
МФ без
НА
МФ + НА
Доля МФ,
экспрессирующих
катепсин D,
%
Доля МФ,
экспрессирующих
металлопротеиназу-1
(MMP-1), %
Доля МФ,
экспрессирующих
металлопротеиназу-9
(MMP-9), %
50,8±6,1
48,5±7,3
29,2±4,4
56,6±7,9
59,9±7,6
59,7±9,2
26,8±4,0
82,4±11,5*
56,1±9,0
51,2±6,7
37,5±5,6
55,1±7,8
64,6±9,3
77,4±8,7**
55,6±6,3*
83,7±13,1**
62,4±7,0
52,6±5,4
44,4±12,7
64,8±8,0
86,5±8,8*
80,1±10,9**
86,6±14,5**
92,2±9,1**
64,3±10,3
54,8±4,3
54,2±6,6
46,9±3,4
91,7±14,7**
88,7±11,4**
92,7±9,4**
89,1±9,7**
Доля МФ,
экспрессирующих
катепсин B,
%
Примечание. Результаты представлены в виде M±m, где M – средняя величина, m – стандартная
ошибка среднего. Различия между сравниваемыми величинами представлены при сравнении
показателей в группах «МФ без НА» (контроль) и «МФ +НА» на соответствующие сроки культивирования в виде: * Р<0,05, ** Р<0,01.
Обозначения: МФ – макрофаг, НА – наноразмерные частицы алмазов, MMP-1 – металлопротеиназа-1, MMP-9 – металлопротеиназа-9.
76
Как известно, исследуемые нами ферменты, сконцентрированы в лизосомах (катепсины) (Guha S.,
Padh H., 2008) и в мелких секреторных везикулах аппарата Гольджи (металлопротеиназы)
(Sbai O. et al., 2008; Hanania R. et al., 2012), представленных во всех макрофагальных клетках. Поэтому экспрессия катепсина B, катепсина D, металлопротеиназы-1 (MMP-1) и металлопротеиназы-9
(MMP-9) в той или иной степени выявлялась во всех культивируемых МФ.
При помощи компьютерной морфометрии было проведено исследование влияния НА частиц на
изменение среднего интегрального показателя экспрессии исследуемых ферментов, отражающего
степень активации всей популяции МФ в контрольной и экспериментальных группах в целом. По
мере увеличения времени культивирования МФ с частицами НА количество МФ, экспрессирующих катепсин B, постоянно увеличивалось и достигло максимума к 48 часам (Рис. 11). Через 24 часа уровень экспрессии фермента в экспериментальной группе по сравнению с контролем увеличился в 1,9 раза, а через 48 часов – в 2,7 раз (Рис. 11). Уровень экспрессии
катепсина D был увеличен по сравнению с контролем через 3 часа и 24 часа соответственно в
4,8 и 2 раза (Рис. 12). Однако уровень экспрессии катепсина D уменьшился через 48 часов культивирования МФ с частицами НА в 2,3 раза (по сравнению с величиной через 24 часа), но величина была больше контрольной в 1,9 раз (Рис. 12). Величина экспрессии катепсина D возросла в
4,8 раза после внесения НА в культуры МФ по сравнению с контролем уже через 3 часа и сохранялась без изменений до 24 часов (Рис. 12).
Исследование экспрессии металлопротеиназы-1 (MMP-1) выявило увеличение уровня экспрессии данного фермента макрофагами только через 24 часа после внесения в культуральную
среду НА, и величина этого показателя по сравнению с контролем была больше в 1,8 раза
(Рис. 13). Через 48 часа культивирования МФ с частицами НА уровень экспрессии макрофагами
MMP-1 снизился в 2,3 раза, но был больше величины экспрессии MMP-1 в контроле в 3 раза
(Рис. 13). При исследовании экспрессии металлопротеиназы-9 (MMP-9) через 1 час культивирования МФ с частицами НА был обнаружен феномен повышения уровня экспрессии данного
фермента как в контроле, так и в экспериментальной группе (Рис. 14). Затем уровень экспрессии макрофагами MMP-9 постепенно снижался вплоть до 48 часов культивирования МФ с частицами НА, но оставался больше, чем в контрольных культурах – соответственно в 2,1, 3 и 2,8
раз (Рис. 14).
Поскольку, согласно нашим данным, выбранная нами концентрация 20 мкг/мл НА не вызывала
цитотоксических эффектов в отношении МФ in vitro (п. 3.2), то это позволило провести исследование
влияния НА частиц на секрецию МФ изучаемых ферментов. Поскольку при изучении всех указанных ферментов их экспрессия в МФ после воздействия НА заметно возрастала через 24 часа, то
изучение их секреции проводили в интервале времени 24-48 часов после введения в культуральную среду НА.
77
Величина экспрессии катепсина B,
кв. пиксели
160
**
140
**
120
100
МФ без НА
80
*
МФ + НА
60
40
20
0
1
3
24
48
Время инкубации НА с МФ, ч
*
Рис. 11. Результаты исследования экспрессии катепсина B макрофагами (МФ) в концентрации
20 мкг/мл при воздействии наноразмерными алмазными частицами (НА) через 1, 3, 24 и 48 часов после внесения НА в культуру клеток.
Примечание. Вероятность достоверности различий P между средними величинами исследованных показателей в контроле («МФ без НА») и в опыте («МФ + НА»): * P<0,05; ** P<0,01.
Величина экспрессии катепсина D,
кв. пиксели
70
**
60
**
50
40
МФ без НА
МФ + НА
30
*
20
10
0
1
3
24
48
Время инкубации НА с МФ, ч
Рис. 12. Результаты исследования экспрессии катепсина D макрофагами (МФ) в концентрации
20 мкг/мл при воздействии наноразмерными алмазными частицами (НА) через 1, 3, 24 и 48 часов после внесения НА в культуру клеток.
Примечание. Вероятность достоверности различий P между средними величинами исследованных показателей в контроле («МФ без НА») и в опыте («МФ + НА»): * P<0,05; ** P<0,01.
78
90
*
Величина экспрессии MMP-1,
кв. пиксели
80
70
60
50
МФ без НА
**
40
МФ + НА
30
*
20
10
0
1
3
24
48
Время инкубации НА с МФ, ч
Рис. 13. Результаты исследования экспрессии металлопротеиназы-1 (MMP-1) макрофагами
(МФ) при воздействии наноразмерными алмазными частицами (НА) в концентрации 20 мкг/мл
через 1, 3, 24 и 48 часов после внесения НА в культуру клеток.
Примечание. Вероятность достоверности различий P между средними величинами исследованных показателей в контроле («МФ без НА») и в опыте («МФ + НА»): * P<0,05; ** P<0,01.
Величина экспрессии MMP-9,
кв. пиксели
60
50
40
МФ без НА
*
30
МФ + НА
*
20
*
10
0
1
3
24
48
Время инкубации НА с МФ, ч
Рис. 14. Результаты исследования экспрессии металлопротеиназы-9 (MMP-9) макрофагами
(МФ) при воздействии наноразмерными алмазными частицами (НА) в концентрации 20 мкг/мл
через 1, 3, 24 и 48 часов после внесения НА в культуру клеток.
Примечание. Вероятность достоверности различий P между средними величинами исследованных показателей в контроле («МФ без НА») и в опыте («МФ + НА»): * P<0,05.
79
Культивирование МФ с частицами НА не привело к увеличению показателя секреции катепсина B (относительно контроля), но он увеличился как в контроле, так и в экспериментальных группах по мере увеличения времени культивирования МФ (Рис. 15). Исследование секреции катепсина D макрофагами после внесения в культуральную среду НА выявило многократное увеличение уровня секреции через 48 часов культивирования МФ с НА по сравнению с
контролем (Рис. 16). Кроме того, время культивирования, видимо, является фактором, стимулирующим секрецию катепсина D, поскольку его секреция через 48 часов культивирования МФ с
НА была существенно большей, чем через 24 часа (Рис. 16).
Согласно полученным данным, секреция MMP-1 макрофагами существенно снижалась к
48 часам культивирования МФ с НА, но в большей степени, чем в контрольной культуре
(Рис. 17). Как следует из данных по секреции MMP-9, было выявлено резкое увеличение секреции данного фермента к 48 часам культивирования МФ с НА (Рис. 18). Через 24 часа после воздействия НА частиц на МФ показатель секреции исследуемого фермента возрастал в экспериментальной группе по сравнению с контролем в 6,1 раза и почти в 15 раз через 48 часов после
инкубации МФ с НА (Рис. 18).
Таким образом, увеличение секреции исследуемых ферментов наблюдали преимущественно через 48 часов после культивирования МФ в культуральной среде с НА (Рис. 15, 16, 17,
18). При этом ни в один из временных периодов не наблюдали сколь-нибудь существенных
проявлений деструкции МФ (п. 3.2). Сопоставление показателей экспрессии катепсина D макрофагами (таблица 5; Рис. 12) и величин показателей его секреции через 24 и 48 часов после начала воздействия НА (Рис. 16) позволяет предположить, что уменьшение доли МФ, экспрессирующих катепсин D, к 48 часу может быть обусловлено достаточно быстрой секрецией катепсина D из МФ во внеклеточную среду, а не «выходом» из МФ в связи с деструкцией плазмалеммы, поскольку в популяции МФ в эти периоды наблюдали только единичные МФ с признаками их деструкции. Схожие результаты были получены в случае сопоставления данных по продукции и секреции MMP-9 (таблица 5; Рис. 14 и 18). В данном случае также выявили достаточно быструю секрецию MMP-9 с одновременным уменьшением продукции данного фермента к 48 часам. Однако уровни продукции и секреции в случае MMP-9 (Рис. 14 и 18) были значительно выше, чем в случае с катепсином D
(Рис. 12 и 16). Для MMP-1 отмечали обратную зависимость (Рис. 13 и 17): более раннюю секрецию на 24 часе с последующей сохраняющейся продукцией данного фермента в МФ. В случае
катепсина B отмечали повышенную продукцию фермента МФ к 48 часам и сохранение его
уровня секреции (Рис. 11 и 15). Возможно, имела место отсроченная секреция продуцируемого
МФ фермента.
80
Величина секреции катепсина B,
кв. пиксели
90000
80000
70000
60000
50000
МФ без НА
40000
МФ + НА
30000
20000
10000
0
24
48
Время инкубации НА с МФ, ч
Рис. 15. Результаты исследования секреции катепсина B макрофагами (МФ) при воздействии
наноразмерными алмазными частицами (НА) в концентрации 20 мкг/мл через 24 и 48 часов после внесения НА в культуру МФ.
Величина секреции катепсина D,
кв. пиксели
90000
**
80000
70000
60000
50000
МФ без НА
40000
МФ + НА
30000
20000
10000
0
24
48
Время инкубации НА с МФ, ч
Рис. 16. Результаты исследования секреции катепсина D макрофагами (МФ) при воздействии
наноразмерными алмазными частицами (НА) в концентрации 20 мкг/мл через 24 и 48 часов после внесения НА в культуру МФ.
Примечание. Вероятность достоверности различий P между средними величинами исследованных показателей в контроле («МФ без НА») и в опыте («МФ + НА»): ** P<0,01.
81
**
*
Рис. 17. Результаты исследования секреции металлопротеиназы-1 (MMP-1) макрофагами (МФ)
при воздействии наноразмерными алмазными частицами (НА) в концентрации 20 мкг/мл через
24 и 48 часов после внесения НА в культуру МФ.
Примечание. Вероятность достоверности различий P между средними величинами исследованных показателей в контроле («МФ без НА») и в опыте («МФ + НА»): * P<0,05; ** P<0,01.
**
*
Рис. 18. Результаты исследования секреции металлопротеиназы-9 (MMP-9) макрофагами (МФ)
при воздействии наноразмерными алмазными частицами (НА) в концентрации 20 мкг/мл через
24 и 48 часов после внесения НА в культуру МФ.
Примечание. Вероятность достоверности различий P между средними величинами исследованных показателей в контроле («МФ без НА») и в опыте («МФ + НА»): * P<0,05; ** P<0,01.
82
Таким образом, НА частицы при концентрации 20 мкг/мл и при времени культивирования
МФ с НА 48 часов значимо в 2,7 и почти в 2 раза повышали показатели экспрессии соответственно катепсинов B и D, а металлопротеиназ MMP-1 и MMP-9 – почти в три раза. НА частицы
при концентрации 20 мкг/мл и при времени культивирования МФ с НА 48 часов значимо в 2,5
раза повышали секрецию катепсина D, через 24 часа в 2,3 раза металлопротеиназы MMP-1 и
через 24 и 48 часов соответственно в 6,1 и 15 раз металлопротеиназы MMP-9. Полученные данные указывают на способность НА модулировать функциональное состояние МФ, внутриклеточный и внеклеточный гидролитический потенциал МФ, проявляющийся повышением уровнем экспрессии и секреции МФ катепсина B, катепсина D, MMP-1 и MMP-9.
3.4.3. Результаты исследования влияния наноразмерных алмазных частиц на экспрессию и секрецию ростовых факторов макрофагами
Для изучения влияния НА частиц на экспрессию ростовых факторов были выбраны следующие маркеры: EGF, TGFB1/TGF-β, KGF/FGF-7 и b-FGF/FGF-2. Согласно данным, представленным в таблице 6, культивирование перитонеальных МФ в культуральной среде, содержащей суспензии частиц НА приводило к увеличению количества МФ, экспрессирующих EGF, TGFB1/TGF-β
и KGF/FGF-7 через 24 часа после внесения НА в культуры клеток. Однако закономерности активации МФ, сопряженные с экспрессией исследуемых ростовых факторов (обусловленной их внутриклеточной продукцией) различались (Рис. П.4 и П.5). Доля МФ, экспрессирующих EGF начинала
возрастать через 24 часа после внесения НА в культуры (таблица 6). Через 48 часов величина этого
показателя в экспериментальной группе по сравнению с контролем увеличилась почти в 2 раза (таблица 6). Доля МФ, экспрессирующих TGFB1/TGF-β, также как и EGF, не изменялась через 3 часа после внесения НА в культуры МФ (таблица 6). Однако через 24 часа этот показатель в экспериментальной группе уже заметно превосходил по величине значение в контроле, через 48 часов – в 1,5
раза (таблица 6). Доля МФ, экспрессирующих KGF/FGF-7, возросла после внесения НА в культуры
МФ по сравнению с контролем через 24 часа (таблица 6). Через 48 часов этот показатель практически
не изменился. Влияние НА частиц на экспрессию b-FGF/FGF-2 в МФ было несколько иным. Во все
периоды наблюдения после воздействия НА частиц на МФ не было выявлено какого-либо их влияния на экспрессию b-FGF/FGF-2 в МФ (при оценке доли высокоэкспрессирующих МФ и при попарном сравнении показателей экспрессии в контрольных и экспериментальных группах) (таблица 6).
Согласно данным, представленным в графиках (Рис. 19, 20, 21, 22), данные исследования по
выявлению МФ с высоким уровнем экспрессии исследуемых факторов роста (таблица 6), практически «совпали» по закономерностям изменений «морфометрических» показателей их экспрессии МФ
после воздействия НА.
83
Таблица 6.
Результаты исследования in vitro влияния наноразмерных алмазов (НА) в концентрации
20 мкг/мл на уровни экспрессии макрофагами (МФ) в культуре (по доле высокоэкспрессирующих МФ) EGF, TGFB1/TGF-β, KGF/FGF-7 и b-FGF/FGF-2.
Время
инкубации
(часы)
Доля МФ,
экспрессирующих
EGF, %
Доля МФ,
экспрессирующих
TGFB1/
TGF-β, %
Доля МФ,
экспресссирующих
KGF/
FGF-7, %
Доля МФ,
экспрессирующих
b-FGF/
FGF-2, %
МФ без НА
45,3±4,2
53,3±5,9
49,5±4,8
35,8±3,5
МФ +НА
51,1±6,4
55,8±6,7
47,9±5,6
32,3±3,0
МФ без НА
47,5±5,3
49,3±4,9
45,3±5,5
39,4±4,2
МФ +НА
МФ без НА
МФ + НА
53,4±6,8
51,7±4,3
69,2±5,9*
51,1±7,5
54,6±4,7
70,3±5,6*
57,6±6,6
48,4±6,8
82,2±9,3**
45,2±5,8
48,4±6,6
55,1±7,7
МФ без НА
53,1±6,7
52,6±6,75
55,3±7,5
52,6±7,3
МФ + НА
93,3±9,5**
75,3±8,23**
76,9±3,3*
48,9±6,3
Группа
1
3
24
48
Примечание. Результаты представлены в виде M±m, где M – средняя величина, m – стандартная
ошибка среднего. Различия между сравниваемыми величинами представлены при сравнении
показателей в группах «МФ без НА» (контроль) и «МФ +НА» на соответствующие сроки культивирования в виде: * Р<0,05, ** Р<0,01.
Обозначения: МФ – макрофаг, НА – наноразмерные частицы алмазов.
40
**
Величина экспрессии EGF,
кв. пиксели
35
30
25
*
МФ без НА
20
МФ + НА
15
10
5
0
1
3
24
48
Время инкубации НА с МФ, ч
Рис. 19. Результаты исследования экспрессии EGF макрофагами (МФ) при воздействии наноразмерными алмазными частицами (НА) в концентрации 20 мкг/мл через 1, 3, 24 и 48 часов после внесения НА в культуру клеток.
Примечание. Вероятность достоверности различий P между средними величинами исследованных показателей в контроле («МФ без НА») и в опыте («МФ + НА»): * P<0,05; ** P<0,01.
84
Уровень экспрессии EGF начинал увеличиваться через 24 часа после внесения НА в культуры (Рис. 19). Через 24 часа величина этого показателя в экспериментальной группе по сравнению с контролем увеличилась в 1,8 раза, а через 48 часов – в 2,9 раз (Рис. 19). Показатель
экспрессии TGFB1/TGF-β, также как и EGF, не изменялся через 3 час после внесения НА в
культуры МФ (Рис. 20). Однако через 24 часа этот показатель в экспериментальной группе уже
превосходил величину экспрессии в контроле в 1,6 раза, а через 48 часов – в 2,3 раза (Рис. 20).
При этом величины исследуемых показателей уменьшались как в контрольной, так и экспериментальной группах.
Доля МФ, экспрессирующих KGF/FGF-7, возросла в 2,9 раза после внесения НА в культуры МФ по сравнению с контролем уже через 3 часа (Рис. 21). Через 24 часа величина этого параметра в экспериментальной группе также превышало этот показатель в контрольной группе
клеток в 1,4 раз (Рис. 21). Однако через 48 часов этот показатель снизился в экспериментальной
группе относительно показателя через 24 часа на 13,2% (Рис. 21). При этом экспрессия
KGF/FGF-7 через 48 часов снизилась по сравнению с величиной в контроле в 1,5 раза, что было
обусловлено увеличением количества МФ, экспрессирующих KGF/FGF-7, в контроле (Рис. 21).
Показатель экспрессии TFGB1/TGF-β,
кв. пиксели
30
*
25
20
**
15
МФ без НА
МФ + НА
10
5
0
1
3
24
48
Время инкубации НА с МФ, ч
Рис. 20. Результаты исследования экспрессии TGFB1/TGF-β макрофагами (МФ) при воздействии наноразмерными алмазными частицами (НА) в концентрации 20 мкг/мл через 1, 3, 24 и 48
часов после внесения НА в культуру клеток.
Примечание. Вероятность достоверности различий P между средними величинами исследованных показателей в контроле («МФ без НА») и в опыте («МФ + НА»): * P<0,05; ** P<0,01.
85
Величина экспрессии KGF/FGF-7,
кв. пиксели
20
**
18
*
16
14
*
12
МФ без НА
10
МФ + НА
8
6
4
2
0
1
3
24
48
Время инкубации НА с МФ, ч
Рис. 21. Результаты исследования экспрессии KGF/FGF-7 макрофагами (МФ) при воздействии
наноразмерными алмазными частицами (НА) в концентрации 20 мкг/мл через 1, 3, 24 и 48 часов
после внесения НА в культуру клеток.
Примечание. Вероятность достоверности различий P между средними величинами исследованных показателей в контроле («МФ без НА») и в опыте («МФ + НА»): * P<0,05; ** P<0,01.
Величина экспрессии b-FGF/FGF-2,
кв. пиксели
30
25
20
МФ без НА
15
**
МФ + НА
10
5
0
1
3
24
48
Время инкубации НА с МФ, ч
Рис. 22. Результаты исследования экспрессии b-FGF/FGF-2 макрофагами (МФ) при воздействии
наноразмерными алмазными частицами (НА) в концентрации 20 мкг/мл через 1, 3, 24 и 48 часов
после внесения НА в культуру клеток.
Примечание. Вероятность достоверности различий P между средними величинами исследованных показателей в контроле («МФ без НА») и в опыте («МФ + НА»): ** P<0,01.
86
Влияние НА частиц на экспрессию b-FGF/FGF-2 в МФ было иное. В течение 24 часов после воздействия НА частиц на МФ не было выявлено какого-либо их влияния на экспрессию bFGF/FGF-2 в МФ (Рис. 22). Через 48 часов отмечено заметное увеличение показателя экспрессии b-FGF/FGF-2 в МФ контрольной группы (Рис. 22). При этом величина экспрессии этого
фактора в экспериментальной группе практически не изменилась. Таким образом, в данном
эксперименте был выявлен эффект ингибирования продукции b-FGF/FGF-2 в МФ через 48 часов в 2,2 раза, если сравнивать показатели его экспрессии в экспериментальной и контрольной
группе культур МФ (Рис. 22).
Известно, что повышение экспрессии и продукции каких-либо ростовых факторов в МФ,
обусловленное их ответом на какой-либо объект фагоцитоза, не всегда сопряжено с активацией
процесса их внеклеточной секреции (Пальцев М.А. и др., 2003; Assoian R.K. et al., 1987). В связи с этим нами было проведено исследование влияния НА частиц не только на внутриклеточную экспрессию в МФ EGF, TGFB1/TGF-β, KGF/FGF-7 и b-FGF/FGF-2, но и на их секрецию
(таблица 7). Поскольку при изучении всех перечисленных факторов, за исключением bFGF/FGF-2, их экспрессия в МФ после воздействия НА заметно возрастала через 24 часа, то
изучение их секреции проводили через этот период времени.
Таблица 7.
Результаты исследования in vitro влияния наноразмерных алмазов (НА) в концентрации
20 мкг/мл через 24 часа культивирования с макрофагами (МФ) на секрецию ими EGF,
TGFB1/TGF-β, KGF/FGF-7 и b-FGF/FGF-2.
Группа
МФ интактных
мышей, культивируемые в среде, не содержащей НА
МФ интактных
мышей, культивируемые в среде, содержащей
НА
Показатель
секреции
EGF,
кв. пиксели
Показатель
Секреции
TGFB1/TGF-β,
кв. пиксели
Показатель
секреции
KGF/FGF-7,
кв. пиксели
Показатель
секреции
b-FGF/FGF-2,
кв. пиксели
290,4±18,0
2065,0±445,5
15448,6±3460,7
2499,8±1240,6
1543,6±493,6**
19033,2±2605,7**
12487,8±2892,2
2948,0±558,7
Примечание. Результаты представлены в виде M±m, где M – средняя величина, m – стандартная
ошибка среднего. Различия представлены при сравнении показателей в группах «интактных
МФ, культивируемых в среде, не содержащей НА» (контроль), и «МФ, культивируемых в среде, содержащей НА», через 24 часа культивирования в виде: * Р<0,05, ** Р<0,01.
Обозначения: МФ – макрофаг, НА – наноразмерные частицы алмазов.
87
Показатель секреции EGF возрастал в экспериментальной группе через 24 часа после воздействия НА по сравнению с контролем в 5,3 раза (таблица 7). Показатель секреции
TGFB1/TGF-β возрастал в экспериментальной группе через 24 часа после воздействия НА по
сравнению с контролем в 9,2 раза (таблица 7). Хотя НА и приводили к значительному повышению экспрессии KGF/FGF-7 в МФ (Рис. 21), это не влияло на уровень внеклеточной секреции
этого фактора (таблица 7). Показатели секреции b-FGF/FGF-2 в контрольной и экспериментальной группах не различались по величине (таблица 7).
Таким образом, НА частицы в концентрации 20 мкг/мл и временем культивирования с МФ
24 и 48 часов значимо повышают показатели экспрессии ростовых факторов EGF соответственно в 1,8 и 2,9 раза и TGFB1/TGF-β в 1,6 и 2,3 раза, в то же время через 48 часов значимо снижают экспрессию KGF/FGF-7 и b-FGF/FGF-2 соответственно в 1,5 и 2,2 раза. НА частицы в
концентрации 20 мкг/мл и временем культивирования с МФ 24 часа значимо повышали индекс
секреции EGF и TGFB1/TGF-β соответственно в 5,3 и 9,2 раза, в то же время не влияли на уровень внеклеточной секреции KGF/FGF-7 и b-FGF/FGF-2. Полученные данные указывают на
способность НА активировать МФ, модулировать их функциональное состояние, изменяя их
прорегенераторный потенциал, обусловленный стимуляцией продукции и секреции таких важных в репаративных процессах ростовых факторов как EGF и TGFB1/TGF-β.
88
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Данная исследовательская работа посвящена изучению одной из актуальных проблем в
современной нанобиологии и наномедицине – изучение биотропности, биосовместимости и
биологических эффектов, которые могут оказывать наноразмерные частицы на клетки организма (Онищенко Г.Г. и др., 2007; Donaldson K. et al., 2004; Arora S. et al., 2012). НА частицы в настоящее времени становятся одним из перспективных наноматериалов (Schrand A.M. et al.,
2009; Mochalin V.N. et al., 2012). По сравнению с другими наночастицами НА обладают относительной
химической
инертностью,
однако
не
инертны
в
биологическом
смысле
(Thomas V. et al., 2012). Имеющиеся знания в отношении биологических свойств НА частиц являются недостаточными, чтобы можно было их активно использовать в медицине, поскольку
способ их получения различается и, следовательно, в каждом случае следует исследовать свойства конкретных НА. Попадая в организм, наночастицы встречаются с защитным барьером организма – иммунной системой (Ярилин А.А., 2010; Male D. et al., 2013). МФ являются одними
из первых клеток иммунной системы, которые способны к активному захвату и перевариванию
чужеродного для организма материала, если они биодеградабельны. Захват многих корпускулярных объектов (в том числе НА, так или иначе, может модулировать развития типовых патологических процессов в организме или «их этапов» (например, альтерации, воспаления, регенерации и фиброза) (Струков А.И., Серов В.В., 2013). Поэтому целью данной исследовательской
работы стало изучение влияния наноразмерных алмазных частиц марки «УДА-В-ГО», эндоцитированных макрофагами, на их функциональный статус в связи с вероятной модуляцией ими
типовой реакции воспаления и его исходов.
Можно предположить, что НА частицы могут оказывать влияние на функциональный статус и структуры МФ, такие как целостность цитоплазматической мембраны, определяющую
жизнеспособность клеток, и другие функции; процессы транспорта наночастиц через клеточную плазмалемму, изменение которых может свидетельствовать о биосовместимости конкретных НА. В процесс анализа биосовместимости НА марки «УДА-В-ГО» необходимо было определить наибольшую концентрацию НА частиц, при которой они, возможно, будут биосовместимы, для последующего исследования свойств биотропности и биологических эффектов, оказываемых ими на МФ. Биотропность исследовали по локализации и накоплению НА частиц на
поверхности и в компартментах МФ, по исследованию захвата и интернализации НА частиц в
МФ. О функциональном активности МФ судили по феномену «распластывания» МФ, показателям эндоцитозной активности, по состоянию лизосомальной системы и процессов фагосомнолизосомного слияния. Биологические эффекты оценивали по экспрессии ими провоспалительных (IL-1α, TNF-α, GM-CSF и IFN-γ), гидролитических (MMP-1, MMP-9 и катепсинов B и D) и
89
ростовых факторов (EGF, TGF-β, b-FGF/FGF-2 и KGF/FGF-7). Помимо экспрессии также исследовали секрецию макрофагами гидролитических и ростовых факторов.
В качестве модели клеточной системы для определения биотропности и биосовместимости НА частиц и биологических эффектов, оказываемых ими на МФ, были выбраны перитонеальные МФ мыши линии BALB/с. Эта модель наиболее оптимальна и адекватна цели исследования, поскольку, с одной стороны, получение перитонеальных МФ не сопряжено с процедурами выделения, которые могли бы повредить клетки или изменить их функциональную активность. С другой стороны, при наличии необходимого лабораторного оборудования эта модель
дает возможность исследовать свойства биотропности, биосовместимости и биологических эффектов in vitro.
В результате проведенных исследований были изучены биологические свойства НА частиц марки «УДА-В-ГО» в отношении МФ, которые могут, в свою очередь, влиять на характер
развития такого типового патологического процесса как воспаление. Было проведено исследование свойств биотропности, биосовместимости и биологических эффектов, которые могут оказывать наночастицы на перитонеальные МФ в модели in vitro.
На первых этапах нашей работы было проведено светооптическое и электронномикроскопическое исследование свойств биологической тропности НА частиц марки «УДА-ВГО» макрофагами в биосовместимых концентрациях (п. 3.2). НА частицы, по литературным
данным, поглощаются различными клетками посредством преимущественно клатринзависимого эндоцитоза (Faklaris O. et al., 2009; Schrand A.M. et al., 2010; Schrand A.M. et al.,
2011; Prevedebtseva E. et al., 2013) и макропиноцитоза (Liu K.-K. et al., 2009; SolarskaŚciuk K. et al., 2014). В работе V. Thomas et al. (2012) при помощи электронного микроскопа показали, что используемые ими крупные частицы НА (Nanostructured and Amorphous Materials,
Inc., США; Hyprez-Engis Inc., США) до 500 нм и агломераты более мелких НА (размером от 6
до 500 нм) захватывались также фагоцитозом. Согласно нашим данным (п. 3.1.2) можно найти
признаки всех видов эндоцитоза НА (ОАО ФНПЦ «Алтай», г. Бийск) в МФ. В пользу клатринзависимого эндоцитоза свидетельствует образование «опушенных» (или «щетинистых») ямок и
везикул размером около 100 нм («опушение» образует белок клатрина) (п. 3.1.2; Рис. 7). В пользу макропиноцитоза НА частиц свидетельствует образование длинных тонких выростовскладок на плазматической мембране и образование макропиносом размером около 200 нм
(п. 3.1.2; Рис. 5 и 7). В пользу фагоцитоза агрегатов НА частиц свидетельствует наличие более
крупных эндосом (более 200 нм), образовавшиеся, возможно, при захвате довольно крупных
агломератов исследуемых наночастиц (п. 3.1.2; Рис. 6). Однако, возможно, одновременно имело
место внутриклеточное слияние первичных эндосом с вторичными. Как и в работах других авторов (Faklaris O. et al., 2009; Schrand A.M. et al., 2010) на 24 и 48 часе инкубации МФ с НА час-
90
тицами были обнаружены единичные НА в цитозоле МФ (п. 3.1.2; Рис. 6). Причины и механизм, почему и как НА частицы оказываются в цитозоле вне вакуоли, пока до конца не установлены. O. Faklaris et al. (2009) и A.M. Schrand et al. (2010) cделали предположение, что это
происходит или в процессе пассивного транспорта через цитоплазматическую мембрану (подобно
облегченной
диффузии),
или
в
ходе
высвобождения
частиц
из
эндосом.
Z. Chu et al. (2014) с соавторами при сравнительном исследовании эндоцитоза наночастиц алмаза, оксида кремния и золота показали, что наночастицы с остроконечными формами, независимо от их поверхностной химии, размера или композиции, могут прокалывать мембраны эндосом, в которых они находились, и попадать в цитоплазму клетки. В свою очередь, значительно
снижается клеточная скорость экзоцитоза наночастиц, оказавшихся в цитозоле. Данный феномен остается пока открытым и требует своего дальнейшего изучения. A.M. Schrand et al. (2011)
показали на культуре нейробластом (N2A), что НА частицы, конъюгированные с флуорофором
TAMRA, попадают в лизосомы уже на третий час культивирования с клетками. В доказательство того, что НА частицы могут проходить полный круг эндоцитоза-экзоцитоза в клетках, можно
привести работу C.-Y. Fang et al. (2011). Они показали, что около 15% (или менее) флуоресцентных НА размером 100 нм после шести дней культивирования с раковыми клетками линии
HeLa и мультипотентными мезенхимными стромальными клетками линии 489-2.1 высвобождались из клеток, а в случае клеточной линии преадипоцитов 3T3-L1 высвобождение достигало
30%.
Таким образом, нами была в соответствии с известными научными литературными данными предложена следующая схема захвата и интернализации НА частиц макрофагами
(рис. 23). НА в ходе взаимодействия, предположительно, с рецепторами, сопряженными с Gбелком, и рецепторами тирозинкиназы (рецепторно-опосредованный эндоцитоз и макропиноцитоз) (Roy C.L., Wrana J.L., 2005; Sorkin A., von Zastrow M., 2009; Scita G., Di Fiore P.P., 2010;
Hoeller O. et al., 2013), а также мембранными β1-интегринами (фагоцитоз опсонизированных
инертных частиц) (Ярилин А.А., 2010) адсорбируются на поверхности МФ. Затем происходит
последующая интернализация НА внутрь МФ посредством клатрин-зависимого пути эндоцитоза или макропиноцитоза, а крупных агломератов НА, возможно, посредством фагоцитоза.
Внутри МФ образуются первичные эндосомы, которые впоследствии превращаются в поздние
эндосомы. Поздние эндосомы, в свою очередь, сливаются как с первичными лизосомами, образуя вторичные, так и с вторичными лизосомами (Покровский А.А., Тутельян В.А., 1976; Шкурупий В.А., 1999; Каллахан Дж.В., Лоуден Дж.А., 1984). Наличие агрегатов НА в эндосомах и
во вторичных лизосомах может быть обусловлено повышением кислотности среды в данных
компартментах. По литературным данным (Ярилин А.А., 2010; Каллахан Дж.В., Лоуден Дж.А.,
1984; Льюин Б. и др., 2011), известно, что pH в межклеточном (интерстициальном)-
91
Наноалмазные
частицы
Формирование
клатриновой
везикулы
Клатриновая
ямка
Динамин
Рецепторы
Актиновые
филаменты
Клатрин
Ранняя
эндосома
Клатриновая
везикула
Макропиносома
Рециклинг
рецепторов
Поздняя
эндосома
Ядро
Первичная
лизосома
Иной способ
эндоцитоза (?)
Вторичная
лизосома
Попадание в
цитозоль (?)
Рис. 23. Схема эндоцитоза наноалмазных частиц в макрофагах (По: Льюин Б. и др., 2011;
Faklaris O. et al., 2009; Liu K.-K. et al., 2009; Schrand A.M. et al., 2010; Schrand A.M. et al., 2011;
Prevedebtseva E. et al.,
2013;
Chu Z. et al.,
2014;
Solarska-Śсiuk K. et al.,
2014).
92
пространстве составляет 7,4, в ранних эндосомах – 6,5 и в лизосомах – 4,5. Обнаружение вакуолей с несколькими агрегатами НА также может быть объяснено за счет повторного слияния нескольких эндосом или лизосом, содержащих единичные агрегаты НА. По литературным данным, НА частицы, находящиеся в эндосомах и лизосомах, могу подвергаться экзоцитозу, однако экскреция наночастиц, попавших в цитозоль, затруднена (Chu Z. et al., 2014).
При исследовании свойств биосовместимости НА частиц марки «УДА-В-ГО» была выявлена дозовая и временна́я зависимость возможной цитотоксичности исследуемых наночастиц.
Цитотоксические эффекты НА частиц в отношении МФ проявились только через 48 часов
культивирования увеличением доли МФ с поврежденной цитоплазматической мембраной (при
концентрации 60 мкг/мл), что, очевидно, было обусловлено их избыточным накоплением в цитоплазме МФ, и началом статистически значимого повышения образования в цитоплазме МФ
АФК (при концентрации 30 мкг/мл) (п. 3.2; таблица 1). В итоге нами была выявлена наиболее
биологически совместимая концентрация НА частиц – 20 мкг/мл. Полученные результаты биосовместимости НА частиц согласуются с данными, имеющимися в научной литературе.
A. Krüger et al. (2005) и A.M. Schrand, L. Dai et al. (2007) указывали, что НА (Физикотехнический институт им. А.Ф. Иоффе РАН, г. Санкт-Петербург; НПО «Алтай», г. Бийск; Gansu
Lingyun Nano-Material Co., Ltd., Китай; NanoCarbon Research Institute Ltd., Япония) обладают
биосовместимостью с перевиваемыми макрофагальными культурами клеток. При инкубировании в течение 24 часов МФ с НА размером от 2 до 10 нм от разных производителей при концентрации частиц 100 мкг/мл не вызывали существенного образования АФК и не нарушали целостности мембран митохондрий МФ. В недавней работе V. Thomas et al. (2012) показали, что
НА частицы (Nanostructured and Amorphous Materials, Inc., США; Hyprez-Engis Inc., США) размером 6-100 нм (98 мас.%), внесенные в культуру МФ RAW264.7, приводили к снижению пролиферации МФ при концентрации 50 мкг/мл, а также к снижению как пролиферации МФ, так и
окислительно-восстановительных процессов (в тесте WST-1) при концентрации 200 мкг/мл. В
данной работе авторы отмечают дозовую зависимость биосовместимости НА частиц. Также
V. Thomas et al. (2012) при помощи проточной цитометрии показали значительное снижение
жизнеспособности макрофагальной клеточной культуры (RAW264.7) по отношению к НА от 6
до 500 нм в результате некроза независимо от размера частиц. Необходимо отметить, что углеродсодержащие материалы обладают более высокими показателями биосовместимости, чем остальные искусственные наноматериалы (Андреев Г.Б. и др., 2008; Фатхутдинова Л.М. и др.,
2009; Pan. Y. et al., 2007). НА в ряде углеродсодержащих наночастиц, таких как однослойные и
многослойные нанотрубки и др., являются наименее цитотоксичными (Jia G. et al., 2005;
Schrand A.M., Dai L. et al., 2007), что делает их более привлекательными для использования.
Также A. Fucikova et al. (2014) показали, что НА частицы (ЗАО «Алмазный центр», г. Санкт-
93
Петербург), как и другие наночастицы, не попадают внутрь клетки «голыми». НА частицы могут адсорбировать на своей поверхности компоненты питательной среды, такие как бычий сывороточный альбумин, аминокислоты, соли и витамины, а в крови сывороточные белки, что
может приводить к изменению электрохимического потенциала наночастиц. Таким образом,
попадая внутрь клеток, поверхность наночастиц может быть некоторое время защищена «белковой короной» (англ. protein-corona), что смягчает, по мнению авторов, возможный цитотоксический эффект наночастиц. C. Carlson et al. (2008) отмечают, что химическая поверхность НА
частиц не обладает цитотоксическими свойствами, такими как соразмеримые наночастицы серебра (15-55 нм). Также необходимо отметить, что образование АФК в МФ непосредственно
сопряжено с процессом фагоцитоза (Ярилин А.А., 2010; Jay H., Torres M., 2002; Apel K., Hirt H.,
2004). При повышении концентрации НА частиц увеличивается вероятность образования крупных агломератов (пригоднях для фагоцитоза), что в свою очередь может повлиять на смещения
соотношения захвата частиц в сторону фагоцитоза и как следствие индукцию образования АФК
(Schrand A.M., Dai L. et al., 2007; Carlson C. et al., 2008; Karpukhin A.V. et al., 2011). Однако,
возможно, имеют место и иные механизмы индукции АФК НА частицами, требующие своей
дальнейшей проверки. Таким образом, было показано, что НА частицы, использованные в нашей работе, при концентрации 20 мкг/мл не влияют на жизнеспособность МФ при культивировании in vitro в течение 48 часов, что позволяло в «чистом» виде исследовать биологическую
активность МФ в ответ на воздействие НА частиц.
Следующий этап исследования был посвящен изучению свойств функциональной активности НА частиц марки «УДА-В-ГО» макрофагами. На данном этапе работы исследовали влияние НА частиц на феномен «распластывания» МФ, на эндоцитозную активность, на функциональное состояние вакуолярно-лизосомального аппарата и процессы фагосомно-лизосомного
слияния.
Способность МФ к «распластыванию» является одним из интегральных (неспецифическим) показателей их активности, связанным с конформативными изменениями цитоскелета
при осуществлении эндоцитозной функции и ее «энергообеспеченности» (Шкурупий В.А. и др.,
2007; Arkhipov S.A. et al., 2010; Li J. et al., 2010). Согласно полученным нами данным НА частицы в дозах, в которых они проявляли свою биосовместимость, способны модулировать функциональную активность МФ (п. 3.3). Воздействие НА частиц на МФ было сопряжено с увеличением количества «распластанных» клеток уже в первый час после их взаимодействия с наночастицами, что указывало на изменение активности цитоскелета МФ, а динамика этого процесса была сопряжена с концентрацией НА в культуральной среде (п. 3.3.1; таблица 2), что, вероятно, было сопряжено с феноменом их захвата фагоцитирующими клетками. В литературе
имеются
неоднозначные
свидетельства
влияния
НА
частиц
на
цитоскелет
клеток.
94
A. Fucikova et al. (2014) показали, что позитивно заряженные НА частицы (ЗАО «Алмазный
центр», г. Санкт-Петербург), представленные смесью частиц размерами 8-10 нм (56,6 мас.%) и
460 нм (43,4 мас.%), при относительно высоких концентрациях (75 мкг/мл) уже на второй час
культивирования нарушали структуру актиновых филаментов мышиных фибробластов (L929) и
человеческих раковых клеток (HeLa), что препятствовало «распластыванию» клеток на поверхности подложки. Поверхность исследуемых наночастиц (ЗАО «Алмазный центр», г. СанктПетербург) была представлена в основном карбоксильными группами, но также присутствовали
различные кетонные, гидроксильные и кислородсодержащие группы. Гидрофильная поверхность НА (кислород-концевая поверхность) (B. Rezek et al. , 2009) обеспечивает повышение адгезии и «распластывания» клеток, и, следовательно, влияет на их жизнеспособность, метаболическую и пролиферативную активность. В нашей работе использовали отрицательно заряженные НА частицы марки «УДА-В-ГО» (ОАО ФНПЦ «Алтай», г. Бийск), поверхность которых
представлена преимущественно карбонильными группами и карбоксильными группами (п. 2.2).
Тем не менее, имеющихся литературных данных пока недостаточно, чтобы полностью раскрыть внутриклеточные механизмы влияния НА частиц на феномен «распластывания» МФ в
нашей работе.
На завершающем этапе нашей работы проводили изучение уровня экспрессии провоспалительных, ростовых и гидролитических факторов в МФ после воздействия НА частицами, а
также секреции ростовых и гидролитических факторов. Одним из важнейших параметров
функционального статуса активированного МФ в развитии процесса воспаления и реакции
врожденного и приобретенного иммунитета является его провоспалительный и репаративный
потенциалы, которые представлены синтезом и секрецией цитокинов и ростовых факторов
(Пальцев М.А. и др., 2003; Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008; Ярилин А.А., 2010;
Male D. et al., 2013). В нашей работе при изучении влияния НА частиц в биосовместимой концентрации на макрофагальную культуру было показано, что НА повышают экспрессию цитокинов GM-CSF и IFN-γ, в то же время значимо снижают уровень экспрессии IL-1α, при этом
экспрессия TNF-α оставалась неизменной (п. 3.4.1; таблица 4). V. Thomas et al. (2012) показали
на макрофагальной культуре (RAW264.7), что НА частицы (Nanostructured and Amorphous Materials, Inc., США; Hyprez-Engis Inc., США) размером от 6 до 500 нм (в концентрациях от 10 до
200 мкг/мл) значимо снижали экспрессию генов цитокинов TNF-α и IL-1β, хемокина CCL2 и
PDGF, с непостоянным эффектом на хемокин Cxcl2 и VEGF. H. Huang et al. (2007, 2008a, 2008b)
было показано, что НА частицы (NanoCarbon Research Institute Ltd., Япония) размером 2-8 нм (в
концентрации 100 мкг/мл) значимо не повышали экспрессию цитокинов: интерлейкина IL-6,
TNF-α, iNOS, и не снижали уровень белка, регулирующего апоптоз Bcl-X. H.-C. Li et al. (2013)
показали, что 35 нм НА, полученные синтезом при сверхвысоких давлениях и температурах
95
(Microdiamant, Швейцария; Element Six, США), не вызывали значительного повышения уровня
цитокинов IL-1β и IL-6 на мышах in vivo.
Подобно другим медиаторам, цитокины служат для межклеточной сигнализации при развитии, в частности, воспалительного процесса и, особенно, на первых этапах: альтерации и экссудации (Ярилин А.А., 2010; Male D. et al., 2013). Как только в очаге воспаления появляются
лимфоциты и мононуклеарные фагоциты, они могут выделять свои собственные цитокины (IL1, TNF-α, IL-4, IFN-γ), которые воздействуют на эндотелий местных сосудов и дополнительно
усиливают клеточную миграцию (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008). В зависимости от
микроокружения МФ могут существенно модифицировать свою активность выполнять роль
про- и антивоспалительных агентов (Chernukh E.R. et al., 2010; Schmid M.C., Varner J.A., 2010;
Martinez F.O., Gordon S., 2014). Активация МФ может происходить как по «классическому» типу (M1), так и «альтернативными» путями (M2a, M2, M2c и др.). МФ фенотипа M1 характеризуются продукцией цитокинов провоспалительного профиля, таких как: IL-1, TNF-α, IL-12 и
IFN-γ, а также генерацией АФК и оксида азота. Для МФ M1 характерны выраженные профагоцитирующие и бактерицидные свойства и способность к уничтожению внутриклеточных паразитов, таких как вирусы и бактерии, а также опухолевых клеток. Для фенотипа М2 характерна
продукция антивоспалительных цитокинов (IL-4, IL-10, IL-13), а также ростового фактора TGFβ, металлопротеиназ и др. МФ M2 способны к уничтожению экстраклеточных паразитов, таких
как гельминты и грибы, содействуют ангиогенезу, репарации и ремоделированию тканей, но
при этом могут способствовать и опухолевому росту. В нашем исследовании мы выявили экспрессию маркеров, характерных как для МФ фенотипа M1 (IFN-γ) (п. 3.4.1; таблица 4), так и
для M2 (TGF-β, G-CSF; b-FGF/FGF-2, EGF; MMPs) (п. 3.4; таблица 4, 5, 6). Необходимо отметить, что в литературе встречаются работы, в которых было показано, что в процессе развития
патологических реакций (например, формирование гранулем) может изменяться соотношение
субпопуляций МФ M1 и M2 (Архипов С.А. и др., 2013). Таким образом, наши данные показывают, что НА частицы могут активировать МФ по двум направлениям, как по фенотипу M1, так
и по фенотипу M2. Тем не менее, в нашем исследовании было показано, что НА частицы в общем существенно не изменяют провоспалительный статус МФ (п. 3.4.1). Таким образом, можно
предположить, что, попадая в организм в биосовместимой концентрации, данные частицы не
приведут к дополнительной стимуляции воспаления на этапе альтерации и экссудации. Ряд отечественных работ подтверждает, что НА частицы (Институт биофизики СО РАН,
г. Красноярск) in vivo не приводят к морфо-структурным нарушениям клеток и ткани (Пузырь А.П. и др., 2004a, b; 2005a, b, c; Бондарь В.С. и др., 2005; Тян А.Г., 2005; Лазаренко Л.И.,
2008, 2009; Dolmatov V.Y., 2006). Можно сделать вывод, что НА частицы могут модулировать
функциональный статус МФ без стимуляции процесса воспаления.
96
Важным промежуточным этапом процесса воспаления является «очищение» зоны деструкции и удаление избыточного экссудата (Steed D.L., 1997). «Очищение» раны происходит
благодаря фагоцитозу в основном за счет нейтрофилов и тканевых МФ, а также лизису макрофагами за счет секреции во внеклеточное пространство гидролитических ферментов и аутолизу
поврежденных тканей. Среди ферментов, осуществляющих деградацию тканей, основную роль
играют протеазы (коллагеназа, эластаза, рибонуклеазы и др.) (Пальцев М.А. и др., 2003; Воложин А.И., Порядин Г.В., 2006). В нашем исследовании мы показали, что НА частицы марки
«УДА-В-ГО» в биосовместимой концентрации значимо повышают экспрессию лизосомальных
катепсинов B и D, а также стимулируют внеклеточную секрецию катепсина D (п. 3.4.2; таблица 5; Рис. 11, 12, 13, 14). Повышенная активация частицами НА экспрессии лизосомальных катепсинов в МФ может способствовать повышению гидролитического потенциала фагоцитов
для резорбции или деградации поглощенного им внеклеточного и захваченного МФ материала
(патогенов и клеточного экссудата). Помимо экспрессии и секреции протеаз для исследования
гидролитического потенциала также важным является рассмотрение эндоцитозной активности,
состояния вакуолярно-лизосомального аппарата и процесса фагосомно-лизосомного слияния
фагоцитов (МФ).
Эндоцитозную активность популяции макрофагальных клеток в культуре по отношению к
НА частицам исследовали по количеству сформированных эндосом в МФ и количеству МФ,
захвативших наночастицы (содержащие сформированные эндосомы). Результаты исследования
показали, что величина эндоцитозных вакуолей в МФ возрастала по мере увеличения времени
культивирования и концентрации НА частиц в культуральной среде (п. 3.3.1; таблица 2). Следует, однако, отметить, что, начиная с периода 24-х часов, количество эндосом мало зависело
от концентрации НА в культуральной среде и, видимо, было детерминировано только эндоцитозной емкостью вакуолярного аппарата МФ. При этом полученные нами данные также указывают на способность НА стимулировать фагосомно-лизосомное слияние без изменения фагоцитозной активности (п. 3.3.2; таблица 3). По литературным данным фагоцитоз напрямую не связан с клатрин-зависимым путем эндоцитоза (по которому предположительно преимущественно
и захватываются наночастицы) (Tse S.M. et al., 2003). Однако все-таки имеется косвенная связка
этих двух видов эндоцитоза посредством белка динамина II и актиновых филаментов. В нашей
работе показано, что при сопоставлении результатов по исследованию эндоцитозной активности (п. 3.3.1) и результатов состояния вакуолярно-лизосомального аппарата (п. 3.3.2) предварительный энзоцитоз НА частиц никак не сказывался на последующем фагоцитозе частиц зимозана, что свидетельствует о том, что НА частицы не влияют на фагоцитозную активность МФ.
Обнаруженная нами в ходе исследования стимуляция процесса фагосомно-лизосомного
слияния МФ частиц зимозана (п. 3.3.2) может быть обусловлена повышением дестабилизации
97
мембранных структур эндосом фагоцитирующих клеток. Можно предположить, что НА частицы могут дестабилизировать мембраны эндосом, в которых они находятся. В пользу данного
предположения свидетельствует наблюдавшееся нами образование крупных эндосом путем
слияния более мелких, что не отмечали в контрольной группе. Фагосомы в процессе своего
формирования могут сливаться с первичными и вторичными эндосомами и другими компартментами клетки (Vieira O.V. et al., 2002). Возможно, фагосома, содержащая зимозан, слившаяся с эндосомой с НА частицами, изменяет свою стабильность, что обеспечивает повышение фагосомно-лизосомного слияния. Однако подобного внутриклеточного механизма данного феномена для НА частиц на данный момент времени в научной литературе не описано, и поэтому
это требует своего дальнейшего изучения. Также необходимо сказать, что сохранение фагоцитозной функции у МФ при взаимодействии клеток с НА частицами играет важную роль при
защите организма от бактерий, вирусов, спор грибов и др. (Маянский А.Н., 1983; Ярилин А.А.,
2010; Струков А.И., Серов В.В., 2013). Помимо этого увеличение фагосомно-лизосомного
слияния также способствует повышению функциональной активности МФ при деградации захваченного чужеродного материала, например, в «очаге» воспаления.
В научной литературе хорошо освещено влияние наноразмерных частиц на дисфункцию
лизосом клетки (SternS.T. et al., 2014). Одной из самых распространенных форм лизосомальной
дисфункции является пермеабилизация лизосомальной мембраны (повышение проницаемости
мембраны лизосом) (Пупышев А.Б., 2011; Stern S.T. et al., 2014). Вследствие пермеабилизации
мембран лизосом может запуститься механизм окислительного стресса посредством закисления
цитозоля протонами водорода или лизосомальными ферментами, а также вследствие утраты
мембранного потенциала митохондриями, что приводит к гибели клетки (апоптозом или некрозом). Например, многослойные нанотрубочки, наночастицы диоксида титана, наночастицы серебра и другие приводят к пермеабилизации мембран лизосом (SternS.T. et al., 2014). В нашем
исследовании НА частицы не влияли на потерю лизосомотропного красителя акридинового
оранжевого из лизосом, что свидетельствует в пользу относительной сохранности мембранных
структур данного компартмента. В недавней работе, посвященной изучению главных механизмов внутриклеточной токсичности металлосодержащих наночастиц, S. Sabella et al. (2014) показали на макрофагальной линии U937, что внутриклеточное высвобождение ионов из лизосом,
вызванное захваченными наночастицами, является индуктором данной цитотоксичности. При
этом эти авторы также показали, что НА частицы размером 5-10 нм (Sigma-Aldrich, Германия)
не обладали цитоксическим эффектом даже при высоких концентрациях (Sabella S. et al., 2014).
Результаты нашего исследования согласуются с результатами указанных исследователей и свидетельствуют о том, что НА марки «УДА-В-ГО» (ОАО ФНПЦ «Алтай», г. Бийск) не приводят к
пермеабилизация лизосомальных мембран МФ в исследуемых концентрациях.
98
Репаративная или восстановительная регенерация наблюдается при различных патологических процессах, сопряженных с повреждением клеток и тканей (Воложин А.И., Порядин Г.В.,
2006; Струков А.И., Серов В.В., 2013; Serhan C.N. et al., 2010; Kumar V. et al., 2014). В последние годы существенно изменились представления о механизмах регуляции репаративных процессов (Мусина Л.А., 2007). При воспалении, как и при регенерации поврежденных тканей, ведущую роль играют МФ. В нашей работе было показано, что НА частицы в биосовместимой
концентрации значимо повышают как экспрессию, так и последующую секрецию ростовых
факторов EGF и TGF-β, в то же время значимо снижают экспрессию и секрецию b-FGF/FGF-2, а
экспрессию KGF/FGF-7 наблюдали только на ранних сроках (п. 3.4.3; таблица 6 и 7;
Рис. 19, 20, 21, 22). Основной фибробластический фактор b-FGF/FGF-2 повышает пролиферацию всех типов клеток в ране, стимулирует продукцию протеаз и хемотаксис не только фибробластов, но и кератиноцитов (Павловская Н.А., 2009; Бондарь И.А. и др., 2011; Голованова Е.В., 2014). TGF-β стимулирует хемотаксис фибробластов и продукцию ими коллагена и
фибронектина, EGF усиливает пролиферацию и миграцию кератиноцитов, а KGF/FGF-7 усиливает заживление и эпителизацию ран. Все рассмотренные нами ростовые факторы являются
профиброгенными факторами. Отсутствие стимуляции экспрессии b-FGF/FGF-2 в МФ в ответ
на НА можно рассматривать как условие для развития регенерации, регулируемой EGF и TGFβ. Поскольку экспрессия KGF/FGF-7 возрастала уже на раннем сроке после воздействия НА, то
можно предположить, что и стимуляция секреторного процесса НА в отношении этого ростового фактора могла происходить несколько раньше выбранного для исследования секреторного
процесса периода времени. По имеющимся литературным данным к антифиброгенным факторам относят экспрессию TNF-α, IFN-γ, IL-10, фактор роста гепатоцитов (сокр. HGF) и др. (Павловская Н.А., 2009; Бондарь И.А. и др., 2011; Голованова Е.В., 2014). Необходимо отметить, что
ранее считалось, что МФ и дендритные клетки не способны экспрессировать IFN-γ, однако в
последние два десятилетия появляется все больше работ, в которых была показана индукция
макрофагами экспрессии IFN-γ, например, в ответ на их стимуляцию цитокинами IL-8 и IL-12
(Munder M. et al., 1998; Darwich L. et al., 2008). IFN-γ, помимо своего участия в воспалении в
качестве провоспалительного антибактериального цитокина, также он обладает мощным антифиброгенным действием (Gurujeyalakshmi G., Giri S.N., 1995; Chen Y. et al., 2005). Сопоставляя
полученные нами результаты с результатами экспрессии провоспалительных факторов можно
отметить (п. 3.4.1), что захват НА частиц в обсуждаемой экспериментальной ситуации не сопряжен с очевидной стимуляцией профиброгенного статуса (по экспрессии IL-1α, IFN-γ, bFGF/FGF-2), но очевидна существенная способность НА модулировать функциональный статус
МФ, в котором они могут активировать репаративные процессы в очаге воспаления.
99
Большинство патологических процессов (например, ожоговые раны, хроническое воспаление и др.), в конечном счете, завершаются фиброзированием поврежденной ткани (Шкурупий В.А. и др., 2012, 2014; Струков А.И., Серов В.В., 2013; Diegelmann R.F., Evans M.C., 2004;
Gurtner G.C. et al., 2008). Фиброзное замещение тканей приводит к постепенной утрате специфических функций органов. Немаловажную роль в развитии процесса фиброзирования поврежденных тканей играют МФ (Шкурупий В.А. и др., 2012, 2014; Аникина А.Г. и др., 2013). Было
показано, что МФ способны экспрессировать и впоследствии секретировать различные металлопротеиназы (MMP-2, MMP-9, MMP-10), принимающие участие в катаболизме фибрилл коллагена и их гидролизе. Помимо металлопротеиназ, МФ могут экспрессировать различные катепсины (Немова Н.Н., Бондарева Л.А., 2008). Катепсины являются преимущественно внутриклеточными, однако некоторые из них (например, катепсин B и D) могут секретироваться и выполнять вспомогательную функцию при расщеплении внеклеточного матрикса (Герасимов А.М. и др., 2009; Халикова Т.А. и др., 2009). В нашем исследовании мы показали, что НА
частицы в биосовместимой концентрации значимо повышают экспрессию катепсинов B и D, а
также металлопротеиназы MMP-1 и MMP-9 (п. 3.3.2; таблица 5; Рис. 8, 9, 10, 11). Дополнительно было определено, что НА частицы способствуют повышению секреции катепсина D и металлопротеиназ MMP-1 и MMP-9 (п. 3.3.2; Рис. 12, 13, 14, 15). Способность МФ экспрессировать внеклеточные и внутриклеточные гидролазы может быть необходима для более быстрой и
эффективной регенерации и заживления поврежденных тканей (например, при ожогах) (Шкурупий В.А. и др., 2012, 2014).
В литературе имеются сведения об эффектах «положительной» или индуцируемой регуляции (англ. up-regulation) некоторых гидролитических ферментов. В частности, IFN-γ может
приводить к повышению экспрессии катепсинов B и D (Laha T.T. et al., 1995; Deiss L.P. et al.,
1996). Ростовой фактор TGF-β также повышает экспрессию металлопротеиназы MMP-2 и
MMP-9 (Kim E.S. et al., 2004). TGF-β экспрессируется в клетке и представлен неактивной латентной формой. Активация данного ростового фактора происходит после секреции в экстраклеточном матриксе после расщепления латентной формы. Активированный ростовой фактор
впоследствии может взаимодействовать со своим рецептором (TβR) и «запускать» два возможных сигнальных пути. «Положительная» регуляция MMP-9 происходит по MAPK-сигнальному
пути (преимущественно с участием p38), что приводит к повышению экспрессии MMP-9. Также
TGF-β может активировать SMAD (или DAXX) сигнальный путь, который приводит к ингибированию экспрессии MMP-9 («отрицательная» регуляция) посредством прямого блокирования
Наноалмазные
частицы
PIP2
GRB2
MAPKKK
PIP3
PI3K
MAPK-путь
Цитозоль
SOS1/2
Рецептор
Интерстициальное
пространство
PTEN
NF-κB-путь
PI3K-путь
RAS
RAS
GDP
GTP
A/B/C-RAF
MEKK1/4
ASK1/2
MLK1/2/3
PDK1/2
IKK-α/β/γ
AKT1/2
IκB-α
p50
p65
IκB-α
mTOR
MAPKK
MMK1/2
MKK3/6
MMK4
MMK7
100
p50
p65
NF-κB
Деградация
MAPK
ERK1/2
p38-α/β/γ/δ
JNK1/2/3
p-ERK1/2
Ядро
p-p38
c-Fos
JNK
AKT1/2
mTOR
p-NF-κB
c-Jun
ДНК
Рис. 24. Схема предположительной активации MAPK, PI3K и NF-κB сигнальных путей в ответ на захват наноалмазных частиц макрофагами
(По:
Imajo M. et al.,
2006;
Mendoza M.C. et al.,
2011;
Berridge M.J.,
2012;
Roy R. et al.,
2014).
101
промоутера гена металлопротеназы или посредством блокирования сигнального пути NF-κB
(Warburton D. et al., 2013). Таким образом, экспрессия цитокина IFN-γ и ростового фактора
TGF-β, индуцированная в МФ после взаимодействия с НА частицами марки «УДА-В-ГО», может принимать участие в «положительной» регуляции экспрессии гидролитических факторов
катепсина D и MMP-9 и тем самым усиливать гидролитический потенциал МФ возможно через
активацию MAPK/p38-сигнального пути.
Пока нет данных о запуске сигнальных путей в ходе взаимодействия и захвата НА частиц
макрофагами. Однако по аналогии с наноразмерными частицами оксида цинка (меньше 50 нм)
можно предположить, что НА частицы также могут активировать сигнальные пути: MAPK,
PI3K и дополнительно NF-κB (Huang H. et al., 2007; Roy R. et al., 2014) (Рис. 24). По литературным данным известно, что экспрессия всех рассмотренных в данной работе провоспалительных
факторов (п. 3.4.1) может происходить по MAPK-сигнальному пути (Wajant H. et al., 2003;
Schroder K. et al., 2004; Ten Hove W. et al., 2007; Weber A. et al., 2010). IFN-γ и GM-CSF в свою
очередь
может
активироваться
через
PI3K-
и
STAT-пути
(Schroder K. et al.,
2004;
Fortin C.F. et al., 2007), в то время как IL-1, TNF-α и GM-CSF также могут дополнительно активироваться через NF-κB путь (Benedettii G. et al., 2013; Cogswell J.P. et al., 1994; Schreck R.,
Baeuerle P.A., 1990). Ростовые факторы EGF, TGF-β, KGF/FGF7 и b-FGF/FGF2 имеют общие
сигнальные пути активации через MAPK и PI3K-пути (Boonstra J. et al., 1995; Itoh N., Ohta H.,
2013; Nakao Y. et al., 2013; Stipursky J. et al., 2012). Дополнительно EGF и TGF-β могут активироваться соответственно через STAT и SMAD-пути (David M. et al., 1996; Stipursky J. et al.,
2012). Из литературных данных также известно, что активация экспрессии генов металлопротеиназы
MMP-1,
катепсинов B
иD
может
также
происходить
по
MAPK-пути
(Murnane M.J. et al., 1988; Park C.H., Chung J.H., 2011; Park S. et al., 2011; Wang F. et al., 2000), в
то время как MMP-9 по PI3K-пути и дополнительно через NF-κB путь (Lee C.W. et al., 2007;
Yeh C.B. et al., 2012). Таким образом, полученные нами данные по активации провоспалительных, ростовых и гидролитических факторов (п. 3.4) говорят в пользу активации MAPK- и PI3Kсигнальных путей, которые активируются при клатрин-зависимом типе эндоцитоза и макропиноцитоза НА частиц. Имеющаяся разность в активации/ингибировании рассмотренных в работе
факторов, возможно, обусловлена активацией не одного, а сразу нескольких различных сигнальных путей (Berridge M.J., 2012). Помимо этого полученные данные в использованных условиях эксперимента свидетельствуют о том, что нет очевидной прямой зависимости увеличения
экспрессии всех исследованных гидролитических и ростовых факторов с их секрецией во вне
(пп. 3.4.2, 3.4.3), т.е. этот процесс характеризуется некой избирательностью. Данный факт также
косвенно указывает на существование нескольких сигнальных путей регуляции активации продукции и последующей секреции исследованных ферментов. Однако необходимо также отме-
102
тить, что разность в продукции и секреции может также быть обусловлена наличием в популяции МФ разных типов (M1 и M2). Тем не менее, выстроенная нами модель интернализации наночастиц и сопутствующая активация сигнальных путей требуют своей дополнительной экспериментальной проверки и дальнейшего изучения.
Полученные данные свидетельствуют о том, что НА частицы марки «УДА-В-ГО» обладают биотропностью к МФ и биосовместимостью с ними в определенных дозовых и временных
пределах и способны модулировать функциональный статус МФ. Они способны индуцировать
фагосомно-лизосомное слияние при сохранении фагоцитозной активности и лизосомального
аппарата МФ, не активируют провоспалительный и профиброгенный статус МФ, однако потенциально способны активировать репаративные процессы в очаге воспаления; увеличивают гидролитический потенциал МФ, что может в свою очередь способствовать модуляции такого типового патологического процесса как воспаление.
103
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, в результате проведенного исследования выявлено влияние наноразмерных алмазных частиц марки «УДА-В-ГО» на функциональный статус макрофагов. В частности
были изучены свойства биотропности, биосовместимости и биологические эффекты, оказываемые данными наночастицами. Было показано, что наноразмерные алмазные частицы марки
«УДА-В-ГО» обладают биосовместимостью в определенном «дозовом» диапазоне и способны
модулировать функциональный статус макрофагов. Они способны индуцировать фагосомнолизосомное слияние при сохранении фагоцитозной активности и лизосомального аппарата макрофагов, а также продукцию и секрецию протеаз (гидролитический потенциал макрофагов).
Также изученные наноразмерные алмазные частицы не активируют провоспалительный и профиброгенный статус макрофагов, активируют продукцию ростовых факторов, потенциально
способных ускорить репаративные процессы в органах и тканях. Изменение функционального
статуса макрофагов изученными наноразмерными алмазными частицами может, в свою очередь, влиять на характер развития как собственно воспаления на всех этапах его развития, а так
и деструкции и/или репарации. В перспективе, результаты данного исследования могут быть
использованы для изучения данных наноразмерных алмазных частиц как агентов, модифицирующих функциональный статус макрофагов in vivo при ряде патологических процессов, в частности, воспалительного генеза. Результаты данной работы могут послужить научнопрактической основой для применения в сфере биомедицины.
104
ВЫВОДЫ
1.
Наноразмерные алмазные частицы марки «УДА-В-ГО» обладают высокой биотроп-
ностью к макрофагам в диапазоне доз в культуральной среде от 10 до 30 мкг/мл включительно
и захватываются ими in vitro различными механизмами эндоцитоза: адсорбционным пиноцитозом, эндоцитозом с формированием клатриновых эндоцитозных везикул и эндоцитозом крупных агрегатов наноалмазов (фагоцитозом), формирующихся внеклеточно.
2.
Наноразмерные алмазные частицы марки «УДА-В-ГО» в диапазоне доз 10-30 мкг/мл
биосовместимы с макрофагами in vitro и существенно не влияют на: продукцию ими активных
форм кислорода, их фагоцитозную активность в отношении иных, чем наноалмазы, корпускулярных объектов биологической природы и лабилизацию мембран лизосом, но при этом стимулируют процесс фагосомно-лизосомного слияния.
3.
Наноразмерные алмазные частицы марки «УДА-В-ГО», эндоцитированные макрофа-
гами in vitro, в концентрации 20 мкг/мл обладают способностью модулировать провоспалительный и профиброгенный статус макрофагов, стимулируя экспрессию GM-CSF и IFN-γ; снижая
экспрессию IL-1α, b-FGF/FGF-2 и не изменяя экспрессию TNF-α, что свидетельствует о возможности использования наноалмазов без риска усиления проявления процесса воспаления.
4.
Наноразмерные алмазные частицы марки «УДА-В-ГО», эндоцитированные макро-
фагами in vitro, в концентрации 20 мкг/мл повышают экспрессию, продукцию и стимулируют
секрецию макрофагами лизосомальных ферментов (катепсина B и катепсина D) и матриксных
металлопротеиназ (MMP-1 и MMP-9), которые потенциально способны модулировать развитие
процессов повреждения, регенерации или фиброза. Отсутствует прямая зависимость между
продукцией и секрецией гидролитических протеаз при модулирующем воздействии наноразмерных алмазных частиц марки «УДА-В-ГО» на функциональный статус макрофагов после их
эндоцитоза.
5.
Наноразмерные алмазные частицы марки «УДА-В-ГО», эндоцитированные макрофа-
гами in vitro, в концентрации 20 мкг/мл повышают экспрессию, продукцию и стимулируют секрецию макрофагами ростовых факторов: EGF, TGFB1/TGF-β, KGF/FGF-7,- потенциально способных модулировать процессы воспаления, регенерации или фиброза. Отсутствует прямая зависимость между продукцией и секрецией ростовых факторов при модулирующем воздействии
наноразмерных алмазных частиц марки «УДА-В-ГО» на функциональный статус макрофагов
после их эндоцитоза.
105
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Андреев Г.Б., Минашкин В.М., Невский И.А., Путилов А.В. Материалы, производи-
мые по нанотехнологиям: потенциальный риск при получении и использовании // Российский
Химический Журнал (Журнал Всесоюзного химического общества им. Д.И. Менделеева). –
2008. – Т. LII. – №5. – С. 32-38.
2.
Аникина А.Г., Потапова О.В., Шкурупий В.А., Шестопалов А.М. Роль матриксных
металлопротеиназ и их ингибитора в развитии раннего фиброза легких при гриппе A/H5N1
A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 у мышей // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2013. – №7. – С. 17-20.
3.
Архипов С.А., Шкурупий В.А., Ахраменко Е.С., Соломатина М.В., Ильин Д.А. Ис-
следование in vitro фенотипических характеристик макрофагов БЦЖ-гранулем в динамике их
развития // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2013. – №5. – С. 607-610.
4.
Бгатова Н.П., Мешалкин Ю.П., Изаак Т.И., Шедина В.В., Коробчевская К.Ю., Пожи-
даева А.А., Каледин В.И., Бородин Ю.И. Микроциркуляторное русло экспериментальной лимфосаркомы и метастазирование опухолевых клеток при введении наночастиц // Бюллетень СО
РАМН. – 2008. – №5. – С. 18-25.
5.
Булычев А. Г. Сегрегационная функция клетки. – Л.: Наука, 1991. – 111 С.
6.
Бондарь В.С., Барон А.В., Пузырь А.П., Бортников Е.В., Барон И.И., Тян А.Г., Се-
лимханова З.Ю. Изменения биохимических показателей плазмы крови при введении наноалмазов в организм лабораторных животных // Бюллетень сибирской медицины. – 2005. – Т. 4.
(Приложение 1). – С. 182.
7.
Бондарь B.C., Позднякова И.О., Пузырь А.П. Применение наноалмазов для разделе-
ния и очистки белков // Физика твердого тела. – 2004. – Т. 46. – № 4. – С. 737-739.
8.
Бондарь В.С., Пузырь А.П. Наноалмазы для биологических исследований // Физика
твердого тела. – 2004. – Т. 46. – №4. – С. 698-701.
9.
Бондарь И.А., Климонтов В.В., Парфентьева Е.М. Фиброгенные и антифиброгенные
факторы роста в развитии диабетической нефропатии // Сибирский медицинский журнал. –
2011. – Т. 26. – №4-2. – С. 10-15.
10. Варюшина Е.А. Провоспалительные цитокины в регуляции процессов воспаления и
репарации: Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук: 03.03.03 / Варюшина Елена Анатольевна. – СПб., 2012. – C. 45.
11. Верещагин А.Л. Свойства детонационных наноалмазов. – Бийск: Издательство Алтайского государственного технического университета, 2005. – С. 134.
106
12. Воложин А.И., Порядин Г.В. Патофизиология. В 3 т.: учеб. Для студ. Высш. Учеб.
Заведений / Под ред. А.И. Воложина, Г.В. Порядина. – Т.1. – М.: Издательский центр «Академия», 2006. – С. 272.
13. Герасимов А.М., Павлов А.В., Борзова Н.Ю., Керимкулова Н.В. Катепсин D – его физиологическая роль и использование в медицине (обзор литературы) // Клиническая лабораторная диагностика. – 2009. – №3. – С. 3-5.
14. Голованова Е.В. Механизмы фиброзообразования при хронических заболеваниях печени и возможности антифибротической терапии // Consilium medicum. – 2014. – Т. 16. – №8. –
С. 40-48.
15. Даниленко В.В. Синтез и спекание алмаза взрывом. – М.: Энергоатомиздат, 2003. –
С. 271.
16. Даниленко В.В. Из истории открытия синтеза наноалмазов // Физика твердого тела. –
2004. – Т. 45. – №4. – С. 581-583.
17. Данилец М.Г. Фармакологическая регуляция функционального состояния макрофагов при иммунном ответе: Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук: 14.03.06 / Данилец Марина Григорьевна. – Томск, 2011.- C. 43.
18. де Дюв К. Путешествие в мир живой клетки. – М.: Мир, 1987. – С. 256.
19. Долматов В.Ю. Ультрадисперсные алмазы детонационного синтеза: свойства и применение // Успехи химии. – 2001. – Т. 70. – №7. – С. 687-708.
20. Долматов В.Ю. Ультрадисперсные алмазы детонационного синтеза. Получение,
свойства, применение. – СПб.: Издательство СПбГПУ, 2003a. – С. 344.
21. Долматов В.Ю. Биологически активные ультрадисперсные алмазы детонационного
синтеза // Патент РФ № 2203068 C2. МПК A61K33/44. Опубликован в ИСН № 04.27.2003. –
2003b.
22. Долматов В.Ю., Веретенникова М.В., Марчуков В.А., Сущев В.Г. Современные промышленные возможности синтеза наноалмазов // Физика твердого тела. – 2004. – Т. 46. – №4. –
С. 596-600.
23. Долматов В.Ю., Кострова Л.Н. Наноалмазы детонационного синтеза и возможность
создания нового поколения лекарственных средств // Сверхтвердые материалы. – 2000. – №3. –
С. 82-85.
24. Зайцева Е.Л., Токмакова А.Ю. Роль факторов роста и цитокинов в репаративных
процессах в мягких тканях у больных сахарным диабетом // Сахарный диабет. – 2014. – №1. –
С. 57-62.
25. Каллахан Дж.В., Лоуден Дж.А. Лизосомы и лизосомные болезни накопления /
Под ред. Дж. В. Каллахана, Дж. А. Лоудена. – М.: Медицина, 1984. – С. 448.
107
26. Каминский Ю.В., Тимошенко В.С., Полушин О.Г. и др. Учебно-методическое пособие по патологической анатомии и биопсийно-секционному курсу / Ю.В. Каминский, В.С. Тимошенко, О.Г. Полушин и др. - Владивосток: Медицина ДВ, 2005. – С. 400.
27. Карр Я. Макрофаг. Обзор ультраструктуры и функции. – М.: Медицина, 1978. –
С. 189.
28. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины. – СПб.: ООО «Издательство Фолиант»,
2008. – С. 552.
29. Конки Д., Эрба Ф., Фрешни Р., Гриффитс Б., Хэй Р., Ластнитски И., Мауэр Г., Мораска Л., Вилсон Э. Культура животных клеток. Методы. – Пер. с англ. под ред. Р. Фрешни. – М.:
Мир, 1989. – С. 333.
30. Лазаренко Л.И. Клинико-морфологическая характеристика тканей пародонта под
действием гидрозолей наноалмазов: (экспериментальное исследование): Автореферат диссертации на соискание ученной степени кандидата медицинских наук: 14.00.21 / Лазаренко Людмила Ишмуратовна. – Красноярск, 2009. – С. 23.
31. Лазаренко Л.И., Пузырь А.П., Манашев Г.Г., Бондарь В.С., Жуков Е.Л. О лечебном
действии наноалмазов взрывного синтеза при воспалительно-деструктивных изменениях тканей
пародонта животных // Вестник новых медицинских технологий. – 2008. – Т. XV. – №4. –
C. 179-181.
32. Ларионова И.С., Фролов А.В., Полева Л.И., Бычин Н.В. Исследование состава и физико-химических свойств алмазных гидрогелей // Коллоидный журнал. – 2004. – Т. 66. – №3. –
С. 1-3.
33. Лункин В.В. Косметическая композиция // Патент РФ №2257889 C1. МПК A61K
7/48, A61K7/00. Опубликовано в ИСН № 10.08.2005. – 2005.
34. Льюин Б., Кассимерис Л., Лингаппа В.П., Плоппер Д. Клетки / ред. Б. Льюин [и др.];
пер.: И.В. Филиппович, Ю.С. Ченцов. – Мск.: Бином. Лаборатория знаний, 2011. – 951 С.
35. Малюгин А.В., Гхандехари X. Внутриклеточный захват и токсичность неорганических наночастиц // Развитие научно-технического сотрудничества российских научных и научно-образовательных центров с учеными-соотечественниками, работающими за рубежом: Сборник тезисов выступлений. – М., 2011. – C. 60-63.
36. Маянский А.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге : сборник / А.Н. Маянкий,
Д.Н. Маянский : Ред. В.П. Казначеев. – Новосибирск: Наука Сибирского отделения, 1983. –
С. 256.
37. Маянский Д. Н. Клетка Купфера и система мононуклеарных фагоцитов. – Новосибирск: Наука, 1981. – С. 168.
108
38. Маянский А.Н. Внутренний путь апоптоза нейтрофилов и механизмы антиапоптозного эффекта гранулоцитарного колониестимулирующего фактора // Иммунология. – 2004. – №
6. – С. 329-335.
39. Медведева Н.В., Ипатова О.М., Иванов Ю.Д., Дрожжин А.И., Арчаков А.И. Нанобиотехнология и наномедицина // Биомедицинская химия. – 2006. – Т. 52. – №6. – С. 529-546.
40. Мнихович М.В., Гершзон Д., Брикман М., Давидзон Я., Гаврилюк А.А., Фомина Л.В.,
Гуминский Ю.И., Вернигородский С.В., Мигляс В.Г. Морфогенетические механизмы клеточных взаимодействий в процессе ангиогенеза (лекция) // Журнал анатомии и гистопатологии. –
2012. – Т. 1. – №3. – С. 53-65.
41. Монастырская Е.А., Лямина С.В., Малышев И.Ю. M1 и M2 фенотипы активированных макрофагов и их роль в иммунном ответе и патологии // Патогенез. – 2008. – Т. 6. – №4. –
С. 31-39.
42. Мусина Л.А. Функциональная морфология макрофагов при регенерации тканей, индуцированной аллогенными биоматериалами: Автореферат диссертации на соискание ученной
степени доктора биологических наук: 03.00.25 / Мусина Ляля Ахияровна. – Саранск, 2007. –
С. 49.
43. Немова Н.Н., Бондарева Л.А. К вопросу об эволюции протеолитических ферментов //
Биомедицинская химия. – 2008. – Т. 54. – №1. – C. 42-57.
44. Нестерова И.В., Колесникова Н.В., Чудилова Г.А. и др. Влияние рекомбинантного
интерлейкина-1β на функции интактных и поврежденных нейтрофильных гранулоцитов в системе in vivo // Иммунология. – 1993. – №4. – С. 36-39.
45. Новицкий В.В., Гольдберг Е.Д., Уразовая О.И. Патофизиология : учебник : в 2 т. /
Под ред. В.В. Новицкого, Е.Д. Гольдберга, О.И. Уразовой. – 4-е изд., перераб. и доп. –
М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. – Т. 1. – C. 848.
46. Онищенко Г.Г., Арчаков А.И., Бессонов В.В., Бокитько Б.Г., Гинцбург А.Л., Гмошинский И.В., Григорьев А.И., Измеров Н.Ф., Кирпичников М.П., Народицкий Б.С., Покровский В.И., Потапов А.И., Рахманин Ю.А., Тутельян В.А., Хотимченко С.А., Шайтан К.В., Шевелева С.А. Методические подходы к оценке безопасности наноматериалов // Гигиена и санитария. – 2007. – №6. – С. 3-10.
47. Павловская Н.А. Патогенетические аспекты воздействия фиброгенной пыли на организм человека // Микроэлементы в медицине. – 2009. – Т.10. – №3-4. – С. 23-30.
48. Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин С.Е. Межклеточные взаимодействия. – 2-е изд.,
перераб. и доп. – М.: Медицина, 2003. – С. 288.
49. Пауков В.С., Литвицкий П.Ф. Патологическая анатомия и патологическая физиология. Учебник – М.: ГЭОТАР-Медия, 2012. – С. 256.
109
50. Покровский А.А., Тутельян В.А. Лизосомы. – М.: «Наука», 1976. – С. 382.
51. Попова Н.В., Деев И.Е., Петренко А.Г. Клатрин-зависимый эндоцитоз и белкиадаптеры // Acta Naturae (русскоязычная версия). – 2013. – Т. 5. – №3. – С. 66-77.
52. Прохоренков В.И., Васильева Е.Ю., Пузырь А.П., Бондарь В.С. Эффекты наноалмазов взрывного синтеза при локальном воздействии ионов кобальта и хрома на кожу экспериментальных животных // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2014. – Т. 158.
– №8. – С. 235-239.
53. Пинегин Б.В., Карсонова М.И. Макрофаги: свойства и функции: обзор //
Иммунология.- 2009. – Т. 30. – № 4. – С. 241-249.
54. Пузырь А.П., Бондарь В.С., Бортников Е.В., Селимханова З.Ю., Тян А.Г., Манашев Г.Г. Физиологические показатели лабораторных животных при пероральном введении гидрозолей наноалмазов // Бюллетень сибирской медицины. – 2005b. – Т. 4. (Приложение 1). С. 185.
55. Пузырь А.П., Бортников Е.В., Скобелев Н.Н., Тян А.Г., Селимханова З.Ю., Манашев Г.Г., Бондарь В.С. О возможности внутривенного введения стерильных золей модифицированных наноалмазов // Сибирское медицинское обозрение. – 2005c. – №1. – С. 20-24.
56. Пузырь А.П., Бондарь В.С., Селимханова З.Ю., Бортников Е.В., Инжеваткин Е.В,
Бортников Е.В. Результаты исследования возможного применения детонационных наноалмазов
в качестве энтеросорбента // Сибирское медицинское обозрение. – 2004b. – №2-3. – С. 25-28.
57. Пузырь А.П., Бондарь В.С., Селимханова З.Ю., Тян А.Г., Бортников Е.В., Инжеваткин Е.В. Динамика некоторых физиологических показателей лабораторных мышей при длительном пероральном введении суспензий наноалмазов // Сибирское медицинское обозрение.
2004a. – Т. 4. – № 33. – С. 19-23.
58. Пузырь А.П., Бондарь В.С., Селимханова З.Ю., Тян А.Г., Инжеваткин Е.В., Бортников Е.В. Воздействие детонационных наноалмазов in vitro и in vivo на биологические объекты //
Сложные системы в экстремальных условиях. – Красноярск: издательство КНЦ СО РАН, 2005a.
С. 229-240.
59. Пузырь А.П., Позднякова И.О., Бондарь В.С. Создание люминесцентного биочипа с
использованием наноалмазов и бактериальной люциферазы // Физика твердого тела. – 2004. –
Т. 46. – №4. – C. 740-742.
60. Пузырь А.П., Шендерова О.А., Луо М., Бреннер Д.В., Бондарь В.С., Пуртов К.В. Адсорбция афлатоксина В1 наноалмазами детонационного синтеза // Доклады Академии наук. –
2007. – Т. 417. – №1. – С. 117-120.
61. Пупышев А.Б. Пермеабилизация лизосомных мембран как апоптогенный фактор //
Цитология. – 2011. – Т. 53. – №4. – C. 313-324.
110
62. Пуртов К.В., Пузырь А.П., Бондарь В.С. Сорбенты на основе наноалмазов – новые
носители для колоночной хроматографии белков // Доклады Академии наук. – 2008. – Т. 419. –
№4. – С. 560-562.
63. Попова Н.В., Деев И.Е., Петренко А.Г. Клатрин-зависимый эндоцитоз и белкиадаптеры // Acta Naturae. – 2013. – Т. 5. – №3 (18). – С. 66-77.
64. Роуз А.Г. Атлас патологии / Алан Г. Роуз ; пер. с англ. ; под ред. Е.А. Коган. – М.:
ГЭОТАР-Медия, 2010. – С. 576.
65. Саркисов Д.С.,Втюрин Б.Ю. Электронно-микроскопический анализ повышенной выносливости сердца. – М.: Медицина, 1969. – С. 182.
66. Свойства ультрадисперсных алмазов марки УДА-В-ГО [Электронный ресурс] // 2014. Режим доступа: http://frpc.secna.ru/uda/marks5.php (дата обращения: 16.03.2015).
67. Соловьева Н.И. Матриксные металлопротеиназы и их биологические функции //
Биоорганическая химия. – 1998. – Т. 24. – №4. – С. 245-255.
68. Серебренникова С.Н., Семинский И.Ж. Роль цитокинов в воспалительном процессе
(Сообщение 2) // Сибирский медицинский журнал. – 2008. – №8. – С. 5-8.
69. Струков А.И., Серов В.В. Патологическая анатомия: учебник. – М.: ГЭОТАР-Медия,
2013. – С. 880.
70. Тян А.Г. Морфологическая характеристика органов экспериментальных животных
при пероральном введении детонационных наноалмазов: (экспериментальное исследование):
Автореферат диссертации на соискание ученной степени кандидата медицинских наук: 14.00.02
/ Тян Анатолий Геннадьевич. – Красноярск, 2005. – С. 26.
71. Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих: пер. с англ. – М.: Издательство
«Мир», 1975. – 336 С.
72. Фатхутдинова Л.М., Халиуллин Т.О., Залялов Р.Р. Токсичность искусственных наночастиц // Казанский медицинский журнал. – 2009. – Т. 90. – №4. – С. 578-584.
73. Халикова Т.А., Короленко Т.А., Ильницкая С.И. Лизосомные катепсины B, L и D при
развитии экспериментальных лейкозов мышей // Биомедицинская химия. – 2009. – №5. –
С. 621-634.
74. Черношей Д.А., Кирильчик Е.Ю., Канашкова Т.А. Распознавание в системе врожденного иммунитета. Учебно-методическое пособие. – Минск: БГМУ, 2010. – C. 66.
75. Чиганов Г.А., Мордвинова Л.Е., Якимов И.А. Способ обработки наноалмазов // Патент РФ № 2367596 С1. МПК C01B31/06, B82B3/00. Опубликован в ИСН № 20.09.2009. – 2009.
76. Шкурупий В.А. Лизосомотропизм – проблемы клеточной физиологии и медицины :
монография / В.А. Шкурупий, Ю.Н. Курунов, Н.Н. Яковченко. – Новосибирск: Издательство
НГМА, 1999. – С. 288.
111
77. Шкурупий В.А. Туберкулёзный гранулематоз. Цитофизиология и адресная терапия. –
М.: издательство РАМН, 2007. – С. 536.
78. Шкурупий В.А.,
Архипов С.А., Троицкий А.В., Лузгина Н.Г., Зайковская М.В.,
Уфимцева Е.Г., Ильин Д.А., Ахраменко Е.С., Гуляева Е.П., Быстрова Т.Н. Фагоцитоз макрофагами молекулярно-наносомальных гибридных композиций с окисленными декстранами, конъюгированными с гидразидом изоникотиновой кислоты // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2009. – Т. 148. – №12. – С. 633-635.
79. Шкурупий В.А., Карпов М.А., Лузгина Н.Г. Влияние окисленного декстрана на репаративную регенерацию кожи после ожоговой травмы // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2012. – Т. 153. – №5. – С. 600-603.
80. Шкурупий В.А., Карпов М.А., Троицкий А.В., Архипов С.А., Нещадим Д.В. Исследование эффективности композиции на основе окисленного декстрана при лечении термического ожога кожи крыс IIIБ степени // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. –
2014. – Т. 158. – №11. – С. 576-579.
81. Ярилин А.А. Иммунология: учебник. – М.: ГЭОТАР-Медия, 2010. – С. 752.
82. Aaronson D.S., Horvath C.M. A road map for those who don’t know JAK-STAT // Science. – 2002. – V. 296. – P. 1653-1655.
83. Adams A., Thorn J.M., Yamabhai M., Kay B.K., O’Bryan J.P. Intersectin, an adaptor protein involved in clathrin-mediated endocytosis, activates mitogenic signaling pathways // The Journal
of Biological Chemistry. – 2000. – V. 275. - №35. – P. 27414-27420.
84. Allison A.C., Harington J.S., Birbeck M. An examination of the cytotoxic effects of silica
on macrophages // The Journal of Experimental Medicine. – 1966. – V. 124. – P. 141-154.
85. Amaral M., Abreu C.S. Biotribological performace of NCD coated Si2N4-bioglass composites // Diamond and Related Materials. – 2007. – V. 16. – №4. – P. 790-795.
86. Anisimov V.N., Zabezhinski M.A., Popovich I.G., Lieberman A.I., Shmidt J.L. Prevention
of spontaneous and chemicallyinduced carcinogenesis using activated carbon fiber adsorbent. I. Effect
of the activated carbon fiber adsorbent ‘Aqualen’ on spontaneous carcinogenesis and life-span in mice
// Cancer Letters. – 1998. – V. 126. – №1. – P. 23-28.
87. Anisimov V.N., Zabezhinski M.A., Popovich I.G., Lieberman A.I., Shmidt J.L. Prevention
of spontaneous and chemically induced carcinogenesis using activated carbon fiber adsorbent. II. Inhibitory effect of the activated carbon fiber adsorbent ‘Aqualen’ on N-methyl-N’-nitro-Nnitrosoguanidine-induced gastric carcinogenesis in rats // Cancer Letters. – 1999a. – V. 138. – №1-2. –
P. 23-26.
88. Anisimov V.N., Zabezhinski M.A., Popovich I.G., Berstein L.M., Kovalenko I.G., Lieberman A.I., Shmidt J.L. Prevention of spontaneous and chemically induced carcinogenesis using acti-
112
vated carbon fiber adsorbent. III. Inhibitory effect of the activated carbon fiber adsorbent ‘Aqualen’ on
1,2-dimethylhydrazine-induced intestinal carcinogenesis in rats // Cancer Letters. – 1999b. – V. 138. –
№1-2. – P. 27-35.
89. Apel K., Hirt H. Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction // Annual Review of Plant Biology. – 2004. – V. 55. – P. 373-399.
90. Arkhipov S.A., Shkurupy V.A., Bugrimova Y.S. Effect of preliminary load of macrophages
with silicium dioxide on phagocytosis of BCG strain micobacteria by macrophages and antimicrobial
activity // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. – 2010. – V. 149. – №4. – P. 534-536.
91. Arora S., Rajwade J.M., Paknikar K.M. Nanotoxicology and in vitro studies: The need of
the hour // Toxicology and Applied Pharmacology. – 2012. – V. 258. – P. 151-165.
92. Assoian R.K., Fleurdelys B.E., Stevenson H.C., Miller P.L., Madtes D.K., Raines E.W.,
Ross R., Sporn M.B. Expression and secretion of type β transforming growth factor by activated human macrophages // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. – 1987. – V. 84. –
P. 6020-6024.
93. Bajaj P., Akin D., Gupta A., Sherman D., Shi B., Auciello O., Bashir R. Ultrananocrystalline diamond film as an optimal cell interface for biomedical applications // Biomedical Microdevices.
– 2007. – V. 9. – №6. – P. 787-794.
94. Bakowicz-Mitura K., Bartosz G., Mitura S. Influence of diamond powder particles on human gene expression // Surface and Coatings Technology. – 2007. – V. 201. – P. 6131-6135.
95. Barile F.A., Dierickx P.J., Kristen U. In vitro cytotoxicity testing for prediction of acute
human toxicity // Cell Biology Toxicology. – 1994. – V. 10. – №3. – P. 155-162.
96. Benedetti G., Fredriksson L., Herpers B., Meerman J., van de Water B., de Graauw M.
TNF-α-mediated NF-κB survival signaling impairment by cisplatin enhances JNK activation allowing
synergistic apoptosis of renal proximal tubular cells // Biochemical Pharmacology. – 2013. – V. 85. –
№2. – P. 274-286.
97. Benoit M., Desnues B., Mege J.L. Macrophage polarization in bacterial infections // The
Journal of Immunology. – 2008. – V. 181. – №6. – P. 3733-3739.
98. Berridge M.J. Cell Signalling Biology. Module 2. Cell Signalling Pathways [Электронный
ресурс]
/
M.J. Berridge
//
Portland
Press
Limited.
–
2012.
Режим
доступа:
http://www.auburn.edu/academic/classes/biol/6190/CellSignalingBiology/csb002.pdf (дата обращения: 16.03.2015).
99. Bernard B., Lewis C.E. The Macrohage (2nd edition). Oxford University Press, 2014. –
P. 680.
113
100. Bhosale R.R., Osmani R.A., Ghodake P.P., Harkare B.R., Shaikh S.M., Chavan S.R. Nanodiamonds: A new-fangled drug delivery system // Journal of Pharmaceutical Research. – 2013. – V. 3.
– №12. – P. 1395-1403.
101. Birkedal-Hanses H., Moore W.G., Bodden M.K. Windsor L.J., Birkedal-Hansen B., DeCarlo A., Engler J.A. Matrix metalloproteinases: a review // Critical Reviews in Oral Biology and
Medicine. – 1993. – V. 4. – P. 197-250.
102. Biswas S.K., Mantovani A. Macrophages: Biology and Role in the Pathology of Diseases.
Springer, 2014. – P. 615.
103. Bogunia-Kubik K., Sugisaka M. From molecular biology to nanotechnology and
nanomedicine. Biosystems. – 2002. – V. 65. – P. 123-138.
104. Bojkova A.I.,
Shilova O.A.,
Golikova E.V.,
Nikolajchuk N.I.,
Khamova T.V.,
Hashkovskij S.V., Vlasov D.Y., Frank-Kamenetsky O.V., Dolmatov V.Y. Detonation nanodiamond
additives influence on strength and bioproofness of multiphase portland cement clinker materials //
Nanotechnology International Forum/Rusanotech 1908, Abstracts, V. 1M, RUSNANO, Moscow. –
2008. – P. 488–489.
105. Boonstra J., Rijken P., Humbel B., Cremers F., Verkleij A., van Bergen en Henegouwen P.
The epidermal growth factor // Cell Biology International. – 1995. – V. 19. – №5. – P. 413-430.
106. Braydich-Stolle L., Hussain S., Schlager J.J., Hofmann M.C. In vitro cytotoxicity of
nanoparticles in mammalian germline stem cells // Toxicological Sciences. – 2005. – V. 88. – №2. –
P. 412-419.
107. Brew K., Dinakarpandian D., Nagase H. Tissue inhibitors of metalloproteinases: Evolution,
structure and function // Biochemica et Biophysica Acta. – 2000. – V. 1477. – P. 267-283.
108. Brockhaus M., Schoenfeld H.J., Schlaeger E.J., Hunziker W., Lesslauer W., Loetscher H.
Identification of two types of tumor necrosis factor receptors on human cell lines by monoclonal antibodies // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. – 1990. – V. 87. – P. 3127-3131.
109. Burleson G.R., Burleson F.G. Influenza virus host resistance model // Methods. – 2007. –
V. 41. – №1. – P. 31-37.
110. Carlson C., Hussain S.M., Schrand A.M., Braydich-Stolle L.K., Hess K.L., Jones R.L.,
Schlager J.J. Unique cellular interaction of silver nanoparticles: size-dependent generation of reactive
oxygen species // The Journal of Physical Chemistry B. – 2008. – 112. – №43. – P. 13608-13619.
111. Chandler S., Miller K.M., Clements J.M., Lury J., Corkill D., Anthony D.C., Adams S.E.,
Gearing A.J. Matrix, tumor necrosis factor and multiple sclerosis: an overview // Journal of Neuroimmunology. – 1997. – V. 72. – P. 155-161.
114
112. Chao J.I., Perevedentseva E., Chung P.H., Liu K.K., Cheng C.Y., Chang C.C., Cheng C.L.
Nanometer-sized diamond particle as a probe for biolabeling // Biophysical Journal. – 2007. – V. 93. –
№5. – P. 2199-2208.
113. Chen Y., Chen J., Dong J., Liu W. Antifibrotic effect of interferon gamma in silicosis
model of rat // Toxicology Letters. – 2005. – V. 155. – P. 353-360.
114. Cheng C.-Y., Perevedentseva E., Tu J.-S., Chung P.-H., Cheng C.-L., Liu K.-K., Chao J.-I.,
Chen P.-H., Chang C.-C. Direct and in vitro observation of growth hormone receptor molecules in
A549 human lung epithelial cells by nanodiamond labeling // Applied Physics Letters. – 2007. – V. 90.
– №16. – P. 163903-163903.
115. Chernukh E.R.,
Shevela E.Y.,
Sakhno L.V.,
Tikhonova M.A.,
Petrovsky Y.L.,
Ostanin A.A. The generation and properties of human M2-like macrophages: potential candidates for
CNS repair? // Cellular Therapy and Transplantation. – 2010. – V. 2. – №6. – P. 1-8.
116. Cheung H.S., Story M.T., McCarty D.J. Mitogenic effects of hydroxyapatite and calcium
pyrophosphate dihydrate crystals on cultured mammalian cells // Arthritis and Rheumatology. – 1984.
– V. 27. – P. 668-674.
117. Chien-Min S., Michael S., Emily S. Healthcare and cosmetic compositions containing
nanodiamond // US Patent №20050220829 A1. EC B82Y5/00, A61K8/11, A61Q11/00, A61K33/44,
A61Q19/00, A61K8/19, A61Q15/00, A61Q5/02. Published in USPTO 06.10.2005. – 2005.
118. Chu Z., Zhang S., Zhang B., Zhang C., Fang C.-Y., Rehor I., Cigler P., Chang H.-C.,
King G., Liu R., Li Q. Unambiguous observation of shape effects on cellular fate of nanoparticles //
Scientific Reports. – 2014. – V. 4. – №4495.
119. Cogswell J.P., Godlevski M.M., Wisely G.B., Clay W.C., Leesnitzer L.M., Ways J.P.,
Gray J.G. NF-kappa B regulates IL-1 beta transcription through a consensus NF-kappa B binding site
and a nonconsensus CRE-like site // The Journal of Immunology. – 1994. – V. 153. – №2. – P. 712723.
120. Dai L. (Ed.). Carbon nanotechnology: Recent developments in chemistry, physics, materials science and device applications. Elsevier, Amsterdam. – 2006.
121. Darwich L., Coma G., Peňa R., Bellido R., Blanco E.J.J., Este J.A., Borras F.E., Clotet B.,
Ruiz L., Rosell A., Andreo F., Parkhouse R.M.E., Bofill M. Secretion of interferon-c by human
macrophages demonstrated at the single-cell level after costimulation with interleukin (IL)-12 plus IL18 // Immunology. – 2008. – V. 126. – P. 386-393.
122. David M., Wong L., Flavell R., Thompson S.A., Wells A., Larner A.C., Johnson G.R.
STAT activation by epidermal growth factor (EGF) and amphiregulin. Requirement for the EGF receptor kinase but not for tyrosine phosphorylation sites or JAK1 // The Journal of Biological Chemistry. – 1996. – V. 271. – №16. – P. 9185-9188.
115
123. De Jong W.H., Borm P.J. Drug delivery and nanoparticles: Applications and hazards //
International Journal of Nanomedicine. – 2008. – V. 3. – P. 133–149.
124. Deiss L.P., Galinka H., Berissi H., Cohen O., Kimchi A. Cathepsin D protease mediates
programmed cell death induced by interferon-gamma, Fas/APO-1 and TNF-alpha // The EMBO Journal. – 1996. – V. 15. – №15. – P. 3861-3870.
125. Denamur S.,
Tyteca D.,
Marchand-Brynaert J.,
Van Bambeke F.,
Tulkens P.M.,
Courtoy P.J., Mingeot-Leclercq M.P. Role of oxidative stress in lysosomal membrane permeabilization
and apoptosis induced by gentamicin, an aminoglycoside antibiotic // Free Radical Biology and Medicine. – 2011. – V. 51. – P. 1656-1665.
126. Diegelmann R.F., Evans M.C. Wound healing: an overview of acute, fibrotic and delayed
healing // Frontiers in Bioscience. – 2004. – V. 9. – P. 283-289.
127. Dion I., Bordenave L., Lefebvre F., Bareille R., Baquey C., Monties J.R., Havlik P. Physico-chemistry and cytotoxicity of ceramics part II: Cytotoxicity of ceramics // Journal of Materials Science: Materials in Medicine. – 1994. – V. 5. – №1. – P. 18-24.
128. Dion I., Lahaye M., Salmon R., Baquey C., Monties J.R., Havlik P. Blood haemolysis by
ceramics // Biomaterials. – 1993. – V. 14. – №2. – P. 107-110.
129. Donaldson K., Brown D., Clouter A., Duffin R., Macnee W., Renwick L., Tran L., Stone V.
The pulmonary toxicology of ultrafine particles // Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug
Delivery. – 2002. – V. 15. – №2. – P. 213-220.
130. Donaldson K., Stone V., Tran C.L., Kreyling W., Borm P.J. Nanotoxicology // Occupational and Environmental Medicine. – 2004. – V. 61. – P. 727-728.
131. Dinarello C.A.,
Cannon J.G.,
Mier J.W.,
Bernheim H.A.,
LoPreste G.,
Lynn D.L.,
Love R.N., Webb A.C., Auron P.E., Reuben R.C. Multiple biological activities of human recombinant
interleukin 1 // The Journal of Clinical Investigation. – 1986. – V. 77. – P. 1734-1739.
132. Dolmatov V.Y. Application of detonation nanodiamond. In: Ultrananocrystalline diamond:
synthesis, properties, and applications. O. Shenderova and D. Gruen (Eds.), William Andrew Publishing: Norwich, NY, USA. – 2006. – P. 513.
133. Ehlers S., Kaufmann S.H.E. Infection, inflammation, and chronic diseases: consequences of
a modern lifestyle // Trends in Immunology. – V. 31. – №5. – P. 184-190.
134. Eisenbrand G., Pool-Zobel B., Baker V., Balls M., Blaauboer B.J., Boobis A., Carere A.,
Kevekordes S., Lhuguenot J.C., Pieters R., Kleiner J. Methods of in vitro toxicology // Food and
Chemical Toxicology. – 2002. – V. 40. - №2-3. – P. 193-236.
135. Faklaris O.,
Joshi V.,
Irinopoulou T.,
Tauc P,
Sennour M.,
Girard H.,
Gesset C.,
Arnault J.C., Thorel A., Boudou J.P., Curmi P.A., Treussart F. Photoluminescent diamond nanoparti-
116
cles for cell labeling: study of the uptake mechanism in mammalian cells // ACS Nano. – 2009. – V. 3.
– №12. – P. 3955-3962.
136. Fang C.-Y., Vaijayanthimala V., Cheng C.-A., Yeh S.-H., Chang C.-F., Li C.-L., Chang H.C. The exocytosis of fluorescent nanodiamond and its use as a long-term cell tracker // Small. – 2011.
– V. 7. – №23. – P. 3363-3370.
137. Fleischmajer R., Utani A., MacDonald E.D., Perlish J.S., Pan T.C., Chu M.L., Nomizu M.,
Ninomiya Y., Yamada Y. Initiation of skin basement membrane formation at the epidermo-dermal interface involves assembly of laminins through binding to cell membrane receptors // Journal of Cell
Science. – 1998. – V. 111. – P. 1929-1940.
138. Foley S., Crowley C., Smaihi V, Bonfils V., Erlanger B.F., Seta P., Larroque C. Cellular localisation of a water-soluble fullerene derivative // Biochemcal and Biophysical Research Communications. – 2002. – V. 294. – №1. – P. 116-119.
139. Fortin C.F., Larbi A., Dupuis G., Lesur O., Fülöp T. Jr. GM-CSF activates the Jak/STAT
pathway to rescue polymorphonuclear neutrophils from spontaneous apoptosis in young but not elderly
individuals // Biogerontology. – 2007. – V. 8. – №2. – P. 173-187.
140. Fortin E., Tune C.-J., Delabouglise D., Bouvier P., Livache T., Mailley P., Marcus B.,
Mermoux M., Petit J.P., Szunerits S., Vieil E. Interfacing boron doped diamond and biology: An insight on its use for bioanalytical applications // Electroanalysis. – 2005. – V. 17. – №5-6. – P. 517-526.
141. Freitas R.J. Nanomedicine, Volume IIA: Biocompatibility, Landes. Bioscience: Georgetown, TX. – 2003.
142. Fu C.-C., Lee H.-Y., Chen K., Lim T.-S., Wu H.Y., Lin P.-K., Wei P.-K., Tsao P.-H.,
Chang H.-C., Fann W. Characterization and application of single fluorescent nanodiamonds as cellular
biomarkers // Proceedings of National Academy of Sciences USA. – 2007. – V. 104. – P. 727-732.
143. Fucikova А., Valenta J., Pelant I., Hubalek Kalbacova M., Broz A., Rezek B., Kromkab A.,
Bakaevad Z. Silicon nanocrystals and nanodiamonds in live cells: photoluminescence characteristics,
cytotoxicity and interaction with cell cytoskeleton // RSC Advances. – 2014. – V. 4. –– P. 1033410342.
144. Fujisawa H. Inhibitory role of neutrophils on influenza virus multiplication in the lung of
mice // Microbiology and Immunology. – 2001. – V. 45. - №10. – P. 679-688.
145. Gaidarov I., Smith M.E.K., Domin J., Keen J.H. The class II phosphoinositide 3-kinase
C2α is activated by clathrin and regulates clathrin-mediated membrane trafficking // Molecular Cell. –
2001. – V. 7. – P. 443-449.
146. Ghahary A., Pannu R., Tredget E.E. Fibrogenic and anti-fibrogenic factors in wound repair
// Advances in Structural Biology. – 1996. – V. 4. – P. 24-47.
117
147. Gibson N., Shenderova O., Puzyr A., Purtov K., Grichko V., Luo T.J.M., Fitgerald Z.,
Bondar V., Brenner D. Nanodiamonds for detoxification. In: Technical Proceedings of the 2007 NSTI
NanoTechnology Conference and Trade Show. – 2007.
148. Gibson N.M., Luo T.J., Brenner D.W., Shenderova O. Immobilization of mycotoxins on
modified nanodiamond substrates // Biointerphases. – 2011. – V. 6. – №4. – P. 210-217.
149. Glatz G., Gógl G., Alexa A., Reményi A. Structural mechanism for the specific assembly
and activation of the extracellular signal regulated kinase 5 (ERK5) module // The Journal of Biological Chemistry. – 2013. – V. 288. – №12. – P. 8596-8609.
150. Grichko V., Grishko V., Shenderova O. Nanodiamond bullets and their biological targets //
NanoBiotechnology. – 2006. – V. 2. - №1-2. – P. 37-42.
151. Guha S., Padh H. Cathepsins: Fundamental effectors of endolysosomal proteolysis // Indian Journal of Biochemistry and Biophysics. – 2008. – V. 45. – P. 75-90.
152. Gulyaev A.E., Gelperina S.E., Skidan I.N., Antropov A.S., Kivman G.Y., Kreuter J.
Significant transport of doxorubicin into the brain with polysorbate 80-coated nanoparticles // Pharmaceutical Research. – 1999. – V. 16. – №10. – P. 1564-1569.
153. Gurtner G.C., Werner S., Barrandon Y., Longaker M.T. Wound repair and regeneration //
Nature. – 2008. – V. 453. – №7193. – P. 314-321.
154. Gurujeyalakshmi G., Giri S.N. Molecular mechanisms of antifibrotic effect of interferon
gamma in bleomycin-mouse model of lung fibrosis: downregulation of TGF-β and procollagen I and
III gene expression // Experimental Lung Research. – 1995. – V. 21. – №5. – P. 791-808.
155. Hanahan D. Signaling vascular morphogenesis and maintenance // Science. – 1997. –
V. 277. – P. 48-50.
156. Hanania R., Sun H.S., Xu K., Pustylnik S., Jeganathan S., Harrison R.E. Classically activated
macrophages use stable microtubules for matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) secretion // The Journal Biological Chemistry. – 2012. – V. 287. – №11. – P. 8468-8483.
157. Harris R.C., Chung E., Coffey R.J. EGF receptor ligands // Experimental Cell Research. –
2003. – V. 284. – №1. – P. 2–13.
158. Hauert R. A review of modified DLC coatings for biological applications // Diamond and
Related Materials. – 2003. – V. 12. – P. 583-589.
159. Haucke V. Phosphoinositide regulation of clathrin-mediated endocytosis // Biochemical
Society Transactions. – 2005. – V. 33. - №6. – P. 1285-1289.
160. Hedenborg M., Klockars M. Quartz dust-induced production of reactive oxygen metabolites by human granulocytes // Lung. – 1989. – V. 167. – P. 23-32.
118
161. Hens S.C., Cunningham G., Tyler T., Moseenkov S., Kuznetsov V., Shenderova O. Nanodiamond bioconjugate probes and their collection by electrophoresis // Diamond and Related Materials. – 2008. – V. 17. – P. 1858-1866.
162. Hens S., Grichko V., Cunningham G., Shenderova O. Biological uses for chemically derivatized nanodiamonds // Nanobiotechnology. – 2007. – V. 37. – P. 36.
163. Herbein G., Varin A. The macrophage in HIV-1 infection: from activation to deactivation?
// Retrovirology. – 2010. – V. 9. - №7. – P. 33-50.
164. Herbst R.S. Review of epidermal growth factor receptor biology // International Journal of
Radiation Oncology, Biology, Physics. – 2004. – V. 59. – P. 21-26.
165. Higson F.K., Jones O.T. Oxygen radical production by horse and pig neutrophils induced
by a range of crystals // The Journal of Rheumatology. – 1984. – V. 11. – №6. – P. 735-740.
166. Howe C.L., Valletta J.S., Rusnak A.S., Mobley W.C. NGF signaling from clathrin-coated
vesicles: Evidence that signaling endosomes serve as a platform for the Ras-MAPK pathway // Neuron. – 2001. – V. 32. – P. 801-814.
167. Hoeller O., Bolourani P., Clark J., Stephens L.R., Hawkins P.T., Weiner1 O.D., Weeks G.,
Kay R.R. Two distinct functions for PI3-kinases in macropinocytosis // Journal of Cell Science. –
2013. – V. 126. – P. 4296-4307.
168. Huang H.J., Dai L.M., Wang D.H., Tan L.S., Osawa E. Large-scale self-assembly of dispersed nanodiamonds // Journal of Materials Chemistry. – 2008a. – V. 18. – P. 1347-1352.
169. Huang H., Pierstorff E., Osawa E., Ho D. Active nanodiamond hydrogels for chemotherapeutic delivery // Nano Letters. – 2007. – V. 7. – P. 3305-3314.
170. Huang H., Pierstorff E., Osawa E., Ho D. Protein-Mediated Assembly of Nanodiamond
Hydrogels into a Biocompatible and Biofunctional Multilayer Nanofilm // ACS Nano. – 2008b. – V. 2.
– №2. – P. 203-212.
171. Huang L.C.L., Chang H.C. Adsorption and immobilization of cytochrome C on nanodiamonds // Langmuir. – 2004. V. 20. – P. 5879-5884.
172. Hurt R.H., Monthioux M., Kane A. Toxicology of carbon nanomaterials: Status, trends, and
perspectives on the special issue // Carbon. – 2006. – V. 44. – №6. – P. 1028-1033.
173. Huang T.S., Tzeng Y., Liu Y., Chen Y., Walker K., Guntupalli R., Liu C. Immobilization
of antibodies and bacterial binding on nanodiamond and carbon nanotubes for biosensor applications //
Diamond and Related Materials. – 2004. – V. 13. – P. 1098–1102.
174. Hussain S.M., Hess K.L., Gearhart J.M., Geiss K.T., Schlager J.J. In vitro toxicity of
nanoparticles in BRL 3A rat liver cells // Toxicology in Vitro. – 2005. – V. 19. – №7. – P. 975-983.
119
175. Ibrahim H.R., Yamada M., Matsushita K., Kobayashi K., Kato A. Enhanced bactericidal
action of lysozyme to Escherichia coli by inserting a hydrophobic pentapeptide into its C terminus //
The Journal of Biological Chemistry. – 1994. – V. 269. – №7. – P. 5059-5063.
176. Ida S., Tsubota T., Tanii S., Nagata M., Matsumoto Y. Chemical modification of the diamond surface using benzoyl peroxide and dicarboxylic acids // Langmuir. – 2003. – V. 19. – P. 96939698.
177. Imajo R., Tsuchiya Y., Nishida E. Regulatory mechanisms and functions of MAP kinase
signaling pathways // Life. – 2006. – V. 58. – №5-6. – P. 312-317.
178. Itoh N., Ohta H. Pathophysiological roles of FGF signaling in the heart // Frontiers in
Physiology. – 2013. – V. 4. – P. 247.
179. Iversen T.-G., Skotland T., Sandvig K. Endocytosis and intracellular transport of nanoparticles: Present knowledge and need for future studies // Nano Today. – 2011. – V. 6. – P. 176-185.
180. Jay H., Torres M. Reactive oxygen species and cell signaling: respiratory burst in macrophage signaling // American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. – 2002. – V. 166. –
P. 4-8.
181. Jia G., Wang H., Yan L., Wang X., Pei R., Yan T., Zhao Y., Guo X. Cytotoxicity of carbon
nanomaterials: single-wall nanotube, multi-wall nanotube, and fullerene // Environmental Science and
Technology. – 2005. – V. 39. – №5. – P. 1378-1383.
182. Johansson N., Abonen M., Kähäri V.-M. Matrix metalloproteinases in tumor invasion //
Cellular and Molecular Life Sciences. – 2000. – V. 57. – P. 5-15.
183. Jordan A., Scholz R., Wust P., Schirra H., Schiestel T., Schmidt H., Felix R. Endocytosis of
dextran and silan-coated magnetite nanoparticles and the effect of intracellular hyperthermia on human
mammary carcinoma cells in vitro // Journal of Magnetism and Magnetic Materials. – 1999. – V. 194.
– P. 185-196.
184. Kalbacova M., Kalbac M., Dunsch L., Kromka A., Vanecek M., Rezek B., Hempel U.,
Kmoch S. The effect of SWCNT and nano-diamond films on human osteoblast cells // Physica Status
Solidi B – Basic Solid State Physics. – 2007. – V. 244. – №11 – P. 4356-4359.
185. Kielian M.C., Cohn Z.A. Intralysosomal accumulation of polyanions. II. Polyanion internalization and its influence on lysosomal pH and membrane fluidity // The Journal of Cell Biology. –
1982. – V. 93. – №3. – P. 875-882.
186. Kim E.S., Kim M.S., Moon A. TGF-beta-induced upregulation of MMP-2 and MMP-9 depends on p38 MAPK, but not ERK signaling in MCF10A human breast epithelial cells // International
Journal of Oncology. – 2004. – V. 25. – №5. – P. 1375-1382.
187. Kloss F.R., Najam-Ul-Haq M., Rainer M., Gassner R., Lepperdinger G., Huck C.W.,
Bonn G., Klauser F., Liu X., Memmel N., Bertel E., Garrido J.A., Steinmuller-Nethl D. Nanocrystal-
120
line diamond – an excellent platform for life science applications // Journal of Nanoscience Nanotechnology. – 2007. – V. 7. – №12. – P. 4581-4587.
188. Kong X.L., Huang L.C.L., Hsu C.-M., Chen W.-H., Han C.-C., Chang H.-C. High-affinity
capture of proteins by diamond nanoparticles for mass spectrometric analysis // Analytical Chemistry.
– 2005a. – V. 77. – №1. – P. 259-265.
189. Kong X., Huang L.C.L., Liau S.-C.L., Han C.-C., Chang H.-C. Polylysine-coated diamond
nanocrystals for MALDI-TOF mass analysis of DNA oligonucleotides // Analytical Chemistry. –
2005b. – V. 77. – №13. – P. 4273-4277.
190. Krüger A., Kataoka F., Ozawa M., Fujino T., Suzuki Y., Aleksenskii A.E., Vul A.Y.,
Ōsawa E. Unusually tight aggregation in detonation nanodiamond: Identification and disintegration //
Carbon. – 2005. – V. 43. – P. 1722-1730.
191. Krüger A., Stegk J., Liang Y., Lu L., Jarre G. Biotinylated nanodiamond: Simple and
efficient functionalization of detonation diamond // Langmuir. – 2008. – V. 24. – №8. – P. 4200-4208.
192. Krüger A., Liang Y.J., Jarre G., Stegk J. Surface functionalisation of detonation diamond
suitable for biological applications // Journal of Materials Chemistry. – 2006. – V. 16. – P. 2322- 2328.
193. Kubes P., Ganger D.N. Nitric oxide modulates microvascular permeability // American
Journal Physiology. – 1992. – V. 262. – P. 611-615.
194. Kumar V., Abbas A.K., Fausto N., Robbins S.L., Cotran R.S. Robbins and Cotran Pathologic Basis of Disease (9th edition). Philadelphia: Elsevier/Saunders, 2014. – P. 1048.
195. Laha T.T., Hawley M., Rock K.L., Goldberg A.L. Gamma-interferon causes a selective induction of the lysosomal proteases, cathepsins B and L, in macrophages // FEBS Letters. – 1995. –
V. 363. – №1-2. – P. 85-89.
196. Lam C.W., James J.T., Mccluskey R., Hunter R.L. Pulmonary toxicity of single-wall carbon nanotubes in mice 7 and 90 days after intratracheal instillation // Toxicological Sciences. – 2004. –
V. 77. – P. 126-134.
197. Lee C.W., Lin C.C., Lin W.N., Liang K.C., Luo S.F., Wu C.B., Wang S.W., Yang C.M.
TNF-alpha induces MMP-9 expression via activation of Src/EGFR, PDGFR/PI3K/Akt cascade and
promotion of NF-kappaB/p300 binding in human tracheal smooth muscle cells // American Journal of
Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. – 2007. – V. 292. – №3. – P. 799-812.
198. Lewinski N., Colvin V., Drezek R. Cytotoxicity of nanoparticles // Small. – 2008. – V. 4. –
P. 26-49.
199. Li H.-C., Hsieh F.-J., Chen C.-P., Chang M.-Y., Hsieh P.C.H., Chen C.-C., Hung S.-U.,
Wu C.-C., Chang H.-C. The hemocompatibility of oxidized diamond nanocrystals for biomedical applications // Scientific Reports. – 2013. – V. 3. – P. 3044-3051.
121
200. Li J., Zhu Y., Li W., Zhang X., Peng Y., Huang Q. Nanodiamonds as intracellular transporters of chemotherapeutic drug // Biomaterials. – 2010. – V. 31. – P. 8410-8418.
201. Liu K.-K., Cheng C.-L., Chang C.-C., Chao J.-I. Biocompatible and detectable carboxylated nanodiamond on human cell // Nanotechnology. – 2007. – V. 18. – P. 325102–325112.
202. Liu K.-K., Wang C.-C., Cheng C.-L., Chao J.-I. Endocytic carboxylated nanodiamond for
the labeling and tracking of cell division and differentiation in cancer and stem cells // Biomaterials. –
2009. – V. 30. – P. 4249-4259.
203. Luhr H.G. Comparative studies on phagocytosis of coal powders of various carbonification
grades, also of quartz and diamond powders in tissue cultures // Arch Gewerbepath. – 1958. – V. 16. –
P. 355-374.
204. Male D., Brostoff J., Roth D.B., Roitt I.M. Immunology (8th ed.). Elsevier Saunders, 2013.
– P. 472.
205. Mantovani A., Bussolino F., Introna M. Cytokine regulation of endothelial cell function:
from molecular level to the bedside // Immunology Today. – 1997. – V. 18. – №5. – P. 231-240.
206. Mantovani A., Sica A., Sozzani S., Allavena P., Vecchi A., Locati M. The chemokine system in diverse forms of macrophage activation and polarization // Trends in Immunology. – 2004. –
V. 25. – №12. – P. 677-686.
207. Marsh M., McMahon H.T. The structural era of endocytosis // Science. – 1999. – V. 285. –
№5425. – P. 215-220.
208. Martinez F.O., Gordon S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment // F1000Prime Reports. – 2014. – V. 6. – №13. – P. 1-13.
209. Mendoza M.C., Er E.E., Blenis J. The Ras-ERK and PI3K-mTOR Pathways: Cross-talk
and Compensation // Trends Biochemical Sciences. – 2011. – V. 36. – №6. – P. 320-328.
210. McGuinness L.P., Yan Y., Stacey A., Simpson D.A., Hall L.T., Maclaurin D., Prawer S.,
Mulvaney P., Wrachtrup J., Caruso F., Scholten R.E., Hollenberg L.C. Quantum measurement and orientation tracking of fluorescent nanodiamonds inside living cells // Nature Nanotechnology. – 2011. –
V. 6. – №6. – P. 358-363.
211. Michel C.C., Curry F.E. Microvascular permeability // Phisiological Reviews. – 1999. –
V. 79. – P. 703-761.
212. Mitura S., Mitura A., Niedzielski P., Couvrat P. Nanocrystalline diamond coatings // Chaos,
Solitons and Fractals. – 1999. – V. 10. – №12. – P. 2165-2176.
213. Miyazaki Y., Araki K., Vesin C., Garcia I., Kapanci Y., Whitsett J.A., Piguet P.F.,
Vassalli P. Expression of a tumor necrosis factor-alpha transgene in murine lung causes lymphocytic
and fibrosing alveolitis. A mouse model of progressive pulmonary fibrosis // Journal of Clinical Investigation. – 1995. – V. 96. – №1. – P. 250-259.
122
214. Mochalin V.N., Shenderova O., Ho D., Gogotsi Y. The properties and applications of
nanodiamonds // Nature Nanotechnology. – 2012. – V. 7. – P. 11-23.
215. Mohan N., Chen C.S., Hsieh H.H., Wu Y.C., Chang H.C. In Vivo Imaging and Toxicity Assessments of Fluorescent Nanodiamonds in Caenorhabditis elegans // Nano Letters. – 2010. – V. 10. –
№9. – P. 3692-3699.
216. Munder M., Mallo M., Eichmann K., Modolell M. Murine macrophages secrete interferon
gamma upon combined stimulation with interleukin (IL)-12 and IL-18: A novel pathway of autocrine
macrophage activation // The Journal of Experimental Medicine. – 1998. – V. 187. – №12. – P. 21032108.
217. Murkherjee S., Ghosh R., Maxfield F. Endocytosis // Physiological Reviews. – 1997. –
V. 77. – P. 759-803.
218. Murnane M.J., Phipps P.M., Denekamp D.S. Expression and induction of cathepsins B and
D in K562 cells // Experimental Hematology. – 1988. – V. 16. – №1. – P. 33-37.
219. Nakao Y., Mitsuyasu T., Kawano S., Nakamura N., Kanda S., Nakamura S. Fibroblast
growth factors 7 and 10 are involved in ameloblastoma proliferation via the mitogen-activated protein
kinase pathway // International Journal of Oncology. – 2013. – V. 43. – №5. – P. 1377-1384.
220. Nash J.F. Human safety and efficacy of ultraviolet filters and sunscreen products // Dermatologic Clinics. – 2006. – V. 24. – №1. – P. 35-51.
221. Nel A, Xia T., Madler L., Li N. Toxic potential of materials at the nanoleve // Science. –
2006. – V. 311. – P. 622-627.
222. Nesterenko P.N., Fedyanina O.N. Properties of microdispersed sintered nanodiamonds as a
stationary phase for normal-phase high performance liquid chromatography // Journal of Chromatography A. – 2010. – V. 1217. – №4. – P. 498-505.
223. Neugart F., Zappe A., Jelezko F., Tietz C., Boudou J.P., Krüger A., Wrachtrup J. Dynamics
of diamond nanoparticles in solution and cells // Nano Letters. – 2007. – V. 7. – №12. – P. 3588-3591.
224. Nguyen T.T.B., Chang H.C., Wu V.W.K. Adsorption and hydrolytic activity of lysozyme
on diamond nanocrystallites // Diamond and Related Materials. – 2007. – V. 16. – №4-7. – P. 872-876.
225. Nordsletten L., Hogasen A.K., Konttinen Y.T., Santavirta S., Aspenberg P., Aasen A.O.
Human monocytes stimulation by particles of hydroxyapatite, silicon carbide and diamond: in vitro
studies of new prosthesis coatings // Biomaterials. – 1996. – V. 17. – P. 1521-1527.
226. Novikova M.S., Potapova O.V., Shkurupy V.A. Cytomorphological study of the development of fibrotic complications in chronic SiO(2) granulomatosis in the liver during radon treatme //
Bulletin of Experimental Biology and Medicine. – 2008. – V. 149. – №3. – P. 279-282.
123
227. Oberdörster G., Finkelstein J.N., Johnston C., Gelein R., Cox C., Baggs R., Elder A.C.
Acute pulmonary effects of ultrafine particles in rats and mice // Research Report Health Effects Institute. – 2000. – №96. – P. 5-74.
228. Oberdörster G., Maynard A., Donaldson K., Castranova V., Fitzpatrick J., Ausman K.,
Carter J., Karn B., Kreyling W., Lai D., Olin S., Monteiro-Riviere N., Warheit D., Yang H. Principles
for characterizing the potential human health effects from exposure to nanomaterials: elements of a
screening strategy // Particle and Fibre Toxicology. – 2005. – V. 2. – P. 8-42.
229. Olsson G.M., Roberg K., Rundquist I. The use of acridine orange cytofluorometry in the
study of macrophage lysosomal exocytosis // Analytical Cellular Pathology. – 1990. – V. 2. – №3. –
P. 179-188.
230. Okin D., Medzhitov R. Evolution of inflammatory diseases // Current Biology. – 2012. –
V. 22. – №17. – P. 733-740.
231. Ornitz D.M., Itoh N. Fibroblast growth factors // Genome Biology. – 2001. – V. 2. – №3. –
P. 1-12.
232. Osawa E. Recent progress and perspectives in single-digit nanodiamond // Diamond and
Related Materials. – 2007. – V. 16. – P. 2018-2022.
233. Ozawa M., Inaguma M., Takahashi M., Kataoka F., Krüger A., Osawa E. Preparation and
behavior of brownish, clear nanodiamond colloids // Advanced Materials. – 2007. – V. 19. – №9. –
P. 1201-1206.
234. Pace C.N., Vajdos F., Fee L., Grimsley G., Gray T. How to measure and predict the molar
absorption coefficient of a protein // Protein Science. – 1995. – V. 4. – 11. – P. 2411-242.
235. Pan Y., Neuss S., Leifert A., Fischler M., Wen F., Simon U., Schmid G., Brandau W., Jahnen-Dechent W. Size-dependebt cytotoxity of gold nanoparticles // Small. – 2007. – V. 3. – №11. –
P. 1941-1949.
236. Park C.H., Chung J.H. Epidermal growth factor-induced matrix metalloproteinase-1 expression is negatively regulated by p38 MAPK in human skin fibroblasts. – 2011. – V. 64. – №2. –
P. 134-141.
237. Park S., Jung H.H., Park Y.H., Ahn J.S., Im Y.H. ERK/MAPK pathways play critical roles
in EGFR ligands-induced MMP-1 expression // Biochemical and Biophysical Research Communications. – 2011. – V. 407. – №4. – P. 680-686.
238. Railkar T.A., Kang W.P., Windischmann H., Malshe A.P., Naseem H.A., Davidson J.L.,
Brown W.D. A critical review of chemical vapor-deposited (CVD) diamond for electronic applications
// Critical Reviews in Solid State and Materials Sciences. – 2000. – V. 25. – №3. – P. 163-277.
124
239. Rezek B., Michalıґkovґa L., Ukraintsev E., Kromka A., Kalbacova M. Micro-Pattern
Guided Adhesion of Osteoblasts on Diamond Surfaces // Sensors. – 2009. – V. 9. – №5. – P. 35493562.
240. Phillips T.D. Dietary clay in the chemoprevention of aflatoxin-induced disease // Toxicological Sciences. – 1999. – V. 52. – P. 118-126.
241. Porcheray F., Viaud S., Rimaniol A.C., Léone C., Samah B., Dereuddre-Bosquet N.,
Dormont D., Gras G. Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation //
Clinical and Experimental Immunology. – 2005. – V. 142. – №3. – P. 481-489.
242. Porta C., Rimoldi M., Raes G., Brys L., Ghezzi P., Di Liberto D., Dieli F., Ghisletti S.,
Natoli G., De Baetselier P., Mantovani A., Sica A. Tolerance and M2 (alternative) macrophage polarization are related processes orchestrated by p50 nuclear factor kappaB // Proceedings of the National
Academy of Sciences USA. – 2009. – V. 106. – №35. – P. 14978-14983.
243. Prevedebtseva E.,
Hong S.-F.,
Huang K.-J.,
Chiang I.-T.,
Lee C.-Y.,
Tseng Y.-T.,
Cheng C.-L. Nanodiamond internalization in cells and the cell // Journal of Nanoparticle Research. –
2013. – V. 15. – P. 1834-1845.
244. Rejman J., Oberle V., Zuhorn I.S., Hoekstra D. Size-dependent internalization of particles
via the pathways of clathrinand caveolae-mediated endocytosis // The Biochemical Journal. – 2004. –
V. 377. – P. 159-169.
245. Perevedentseva E., Cheng C.-Y., Chung P.-H., Tu J.-S., Hsieh Y.-H., Cheng C.-L. The interaction of the protein lysozyme with bacteria E. coli observed using nanodiamond labeling //
Nanotechnology. – 2007. – V. 18. – №31. – P. 315102-315102.
246. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH an electrono-paque stain in electron microscopy // The Journal of Cell Biology. – 1963. – V. 17. – P. 208-212.
247. Poh W., Loh K. Biosensing properties of diamond and carbon nanotubes // Langmuir. –
2004. – V. 20. – P. 5484–5492.
248. Prior C., Haslam P.L. In vivo levels and in vitro production of interferon-gamma in fibrosing interstitial lung diseases //Clinical and Experimental Immunology. – 1992. – V. 88. – P. 280-287.
249. Roy C.L., Wrana J.L. Сlathrin- and non-clathrin-mediated endocytic regulation of cell signaling // Nature Reviews Molecular Cell Biology. – 2005. – V. 6. – P. 112-126.
250. Roy R., Parashar V., Chauhan L.K.S., Shanker R., Das M., Tripathi A., Dwivedi P.D.
Mechanism of uptake of ZnO nanoparticles and inflammatory responses in macrophages require PI3K
mediated MAPKs signaling // Toxicology in Vitro. – 2014. – V. 28. – P. 457-467.
251. Rubin J.S., Bottaro D.P., Chedid M., Miki T., Ron D., Cheon H.-G., Taylor W.G.,
Fortney E., Sakata H., Finch P.W., LaRochelle W.J. Keratinocyte growth factor // Cell Biology International. – 1995. – V. 19. – №5. – P. 399-411.
125
252. Puzyr A.P., Neshumayev D.A., Tarskikh S.V., Makarskaya G.V., Dolmatov V.Yu., Bondar V.S. Destruction of human blood cells in interaction with detonation nanodiamonds in experiments
in vitro // Diamond and Related Materials. – 2004. – V. 13. – P. 2020-2023.
253. Sabella S., Carney R.P., Brunetti V., Malvindi M.A., Al-Juffali N., Vecchio G., Janes S.M.,
Bakr O.M., Cingolani R., Stellacci F., Pompa P.P. // A general mechanism for intracellular toxicity of
metal-containing nanoparticles // Nanoscale. – 2014. – V. 6. – P. 7052-7061.
254. Sbai O., Ferhat L., Bernard A., Gueye Y., Ould-Yahoui A., Thiolloy S., Charrat E., Charton G.,
Tremblay E., Risso J.J., Chauvin J.P., Arsanto J.P., Rivera S., Khrestchatisky M. Vesicular trafficking and
secretion of matrix metalloproteinases-2, -9 and tissue inhibitor of metalloproteinases-1 in neuronal cells //
Molecular and Cellular Neuroscience. – 2008. – V. 39. – №4. – P. 549-568.
255. Schmid M.C., Varner J.A. Myeloid Cells in the Tumor Microenvironment: Modulation of
Tumor Angiogenesis and Tumor Inflammation // Journal of Oncology. – 2010. – P. 1-10.
256. Schmidt J.A., Oliver C.N., Lepe-Zuniga J.L., Green I., Gery I. Silica-stimulated monocytes
release fibroblast proliferation factors identical to interleukin 1. A potential role for interleukin 1 in the
pathogenesis of silicosis // The Journal of Clinical Investigation. – 1984. – V. 73. – P. 1462-1472.
257. Schrand A.M. Characterization and in vitro biocompatibility of engineered nanomaterials. –
In: The School of Engineering. University of Dayton: Dayton, OH. – 2007. – P. 276.
258. Schrand A.M., Dai L., Schlager J.J., Hussain S.M., Ôsawa E. Differential biocompatibility
of carbon nanotubes and nanodiamonds // Diamond and Related Materials. – 2007. – V. 16. – P. 21182123.
259. Schrand A.M., Hens S.A.C., Shenderova O.A. Nanodiamond particles: properties and perspectives for bioapplications // Critical Reviews in Solid State and Materials Sciences. – 2009. V. 34. –
№1-2. – P. 18-74.
260. Schrand A.M., Huang H., Carlson C., Schlager J.J., Osawa E., Hussain S.M., Dai L. Are
diamond nanoparticles cytotoxic? // The Journal of Physical Chemistry B. – 2007. – V. 111. – №1. –
P. 2-7.
261. Schrand A.M., Johnson J., Dai L., Hussain S.M., Schlager J.J., Zhu L., Hong Y., Ôsawa E.
Cytotoxicity and genotoxicity of carbon nanomaterials. In: Safety of nanoparticles: from manufacturing to clinical applications. Webster T. (Ed.), Springer Publishing, Brown University, Providence, RI.
– 2008.
262. Schrand A.M., Lin J.B., Hens S.C., Hussain S.M. Temporal and mechanistic tracking of
cellular uptake dynamics with novel surface fluorophore-bound nanodiamonds // Nanoscale. – 2011. –
V. 3. – P. 435-445.
126
263. Schrand A.M., Schlager J.J., Dai L., Hussain S.M. Preparation of cells for assessing ultrastructural localization of nanoparticles with transmission electron microscopy // Nature Protocols. –
2010. – V. 5. – №4. – P. 744-757.
264. Schreck R., Baeuerle P.A. NF-kappa B as inducible transcriptional activator of the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor gene // Molecular and Cellular Biology. – 1990. – V. 10. –
№3. – P. 1281-1286.
265. Schroder K., Hertzog P.J., Ravasi T., Hume D.A. Interferon-gamma: an overview of signals, mechanisms and functions // Journal of Leukocyte Biology. – 2004. – V. 75. – №2. – P. 163-189.
266. Scientific basis for the definition of the term «nanomaterial» [Электронный ресурс]: Scentific Committee on Emerging and Newly Identified Health Risks (SCENIHR) // European Union. –
2010.
Режим
доступа:
http://ec.europa.eu/health/scientific_committees/emerging/docs/scenihr_o_032.pdf (дата обращения:
16.03.2015).
267. Scita G., Di Fiore P.P. The endocytic matrix // Nature. – 2010. – V. 463. – P. 464-473.
268. Serhan C.N., Savill J., 2005 Resolution of inflammation: the beginning programs the end //
Nature Immunology. – 2005. – V. 6. – №12. – P. 1191-1197.
269. Serhan C.N., Ward P.A., Gilroy D.W., editors. (eds). (2010). Fundamentals of inflammation // New York: Cambridge University Press. – P. 488.
270. Shenderova O., Grichko V., Hens S., Walsh J. Detonation nanodiamonds as UV radiation
filter // Diamond and Related Materials. – 2007. – V. 16. – P. 2003-2008.
271. Shenderova O.A., Gruen D.M. Ultrananocrystalline diamond: Syntheses, propertie, and applications // William Andrew, 2012. – P. 584.
272. Shenderova O.A., Zhirnov V.V., Brenner D.W. Carbon Nanostructures // Critical Reviews
in Solid State and Materials Sciences. – 2002. – V. 27(3/4). – P. 227-356.
273. Shimkunas R.A., Robinson E., Lam R., Lu S., Xu X., Zhang X.Q., Huang H., Osawa E.,
Ho D. Nanodiamond-insulin complexes as pH-dependent protein delivery vehicles // Biomaterials. –
2009. – V. 30. – №29. – P. 5720-5728.
274. Shvedova A.A., Castranova V., Kisin E.R., Schwegler-Berry D., Murray A.R., Gandelsman V.Z., Maynard A., Baron P. Exposure to carbon nanotube material: assessment of nanotube cytotoxicity using human keratinocyte cells // Journal of Toxicology and Environmental Health. – 2003. –
V. 66. – P. 1909-1926.
275. Shvedova A.A., Kisin E.R., Mercer R., Murray A.R., Johnson V.J., Potapovich A.I., Tyurina Y.Y., Gorelik O., Arepalli S., Schwegler-Berry D., Hubbs A.F., Antonini J., Evans D.E., Ku B.K.,
Ramsey D., Maynard A., Kagan V.E., Castranova V., Baron P. Unusual inflammatory and fibrogenic
127
pulmonary responses to single-walled carbon nanotubes in mice // American Journal of Physiology –
Lung Cellular and Molecular Physiology. – 2005. – V.289. - №5. – P. 698-708.
276. Sica A., Schioppa T., Mantovani A., Allavena P. Tumour-associated macrophages are a
distinct M2 polarised population promoting tumour progression: Potential targets of anti-cancer therapy // European Journal of Cancer. – 2006. – V. 42. – №6. – P. 717 –727.
277. Smith B.R., Niebert M., Plakhotnik T., Zvyagin A.V. Transfection and imaging of diamond
nanocrystals as scattering optical labels // Jornal of Luminescence. – 2007. – V. 127. – №1. – P. 260263.
278. Smith P.J., Giroud M., Wiggins H.L., Gower F., Thorley J.A., Stolpe B, Mazzolini J.,
Dyson R.J., Rappoport J.Z. Cellular entry of nanoparticles via serum sensitive clathrin-mediated endocytosis, and plasma membrane permeabilization // International Journal of Nanomedicine. – 2012. –
V. 7. – P. 2045-2055.
279. Solarska-Ściuk K., Gajewska A., Glińska S., Studzian M., Michlewska S., Balcerzak L.,
Skolimowski J., Kolago B., Bartosz G. Intracellular transport of nanodiamond particles in human endothelial and epithelial cells // Chemico-Biological Interactions. – 2014. – V. 219C. – P. 90-100.
280. Sorkin A., von Zastrow M. Edocytosis and signalling: intertwining molecular networks //
Nature Reviews Molecular Cell Biology. – 2009. – V. 10. – №9. – P. 609-622.
281. Spikermann K., Roesler J., Emmendoerffer A. Functional features of neutrophills induced
by G-CSF and GM-CSF treatment differential effects and clinical implications. // Leukemia. – 1997. –
V. 11. – P. 466-478.
282. Spilberg I., Mehta J., Simchowitz L. Induction of a chemotactic factor from human neutrophils by diverse crystals // Journal of Laboratory and Clinical Medicine. – 1982. – V. 100. – №3. –
P. 399-404.
283. Stables M.J., Shah S., Camon E.B., Lovering R.C., Newson J., Farrow S., Gilroy D.W.
Transcriptomic analyses of murine resolution-phase macrophages // Blood. – 2011. – V. 118. – №26. –
P. 192-208.
284. Steed D.L. The role of growth factors in wound healing // Surgical Clinics of North America. – 1997. – V. 77. – P. 575–586.
285. Stern S.T., Adiseshaiah P.P., Crist R.M. Autophagy and lysosomal dysfunction as emerging
mechanisms of nanomaterial toxicity // Particle and Fibre Toxicology. – 2014. – V. 20. – №20. – P. 117.
286. Stipursky J., Francis D., Gomes F.C. Activation of MAPK/PI3K/SMAD pathways by TGFβ(1) controls differentiation of radial glia into astrocytes in vitro // Developmental Neuroscience. –
2012. – V. 34. – №1. – P. 68-81.
128
287. Stout R.D., Suttles J. Functional plasticity of macrophages: reversible adaptation to changing microenvironments // The Journal of Leukocyte Biology. – 2004. – V. 76. – №3. – P. 509-513.
288. Swan A., Dularay B., Dieppe P. A comparison of the effects of urate, hydroxyapatite and
diamond crystals on polymorphonuclear cells: Relationship of mediator release to the surface area and
adsorptive capacity of different particles // The Journal of Rheumatology. – 1990. – V. 17. – P. 13461352.
289. Swanson J.A., Watts C. Macropinocytosis // Trends in Cell Biology. – 1995. – V. 5. – №11.
– P. 424-428.
290. Tapper H., Sundler R. Protein kinase C and intracellular pH regulate zymosan-induced lysosomal enzyme secretion in macrophages // Journal of Leukocyte Biology. – 1995. – V. 58. – P. 485494.
291. Ten Hove W., Houben L.A., Raaijmakers J.A., Bracke M., Koenderman L. Differential
regulation of TNFalpha and GM-CSF induced activation of P38 MAPK in neutrophils and eosinophils
// Molecular Immunology. – 2007. – V. 44. – №9. – P. 2492-2496.
292. Thomas V., Halloranb B.A., Ambalavananb N., Catledgea S.A., Vohraa Y.K. In vitro studies on the effect of particle size on macrophage responses to nanodiamond wear debris // Acta Biomaterialia. – 2012. – V. 8. – №5. – P. 1939-1947.
293. Tracey K., Cerami A. TNF-a pleiotropic cytokines and therapeutic target // The Annual Review of Medicine. – 1994. – V. 45. – P. 491-503.
294. Tse R.L., Phelps P. Polymorphonuclear leukocyte motility in vitro. V. Release of chemotactic activity following phagocytosis of calcium pyrophosphate crystals, diamond dust, and urate crystals // Journal of Laboratory and Clinical Medicine. – 1970. – V. 76. – P. 403-415.
295. Tse S.M., Furuya W., Gold E., Schreiber A.D., Sandvig K., Inman R.D., Grinstein S. Differential role of actin, clathrin, and dynamin in Fc gamma receptor-mediated endocytosis and phagocytosis // The Journal of Biological Chemistry. – 2003. – V. 278. – №5. – P. 3331-3338.
296. Tsubota T., Tanii S., Ida S, Nagata M., Matsumoto Y. Chemical modification of diamond
surface with various carboxylic acids by radical reaction in liquid phase // Diamond and Related Materials. – 2004. – V. 13. – P. 1093-1097.
297. Tsubota T., Ohno T., Yoshida H., Kusakabe K. Introduction of molecules containing a NO2
group on diamond surface by using radical reaction in liquid phase // Diamond and Related Materials.
– 2006. – V. 15. – P. 668-672.
298. Tu J.-S., Perevedentseva E., Chung P.-H., Cheng C.-L. Size-dependent surface CO stretching frequency investigations on nanodiamond particles // The Journal of Chemical Physics. – 2006. –
V. 125. – P. 174713-174719.
129
299. Tuan T.-L., Nichter L.S. The molecular basis of keloid and hypertrophic scar formation //
Molecular Medicine Today. – 1998. – V. 4. – №1. – P. 19-24.
300. Ugazio E., Cavali R., Gasco MR. Incorporation of cyclosporin A in solid lipid nanoparticles (SLN) // International Journal of Pharmaceutics. – 2002. – V. 241. – №2. – P. 341–344.
301. Vaday G.G., Lider O. Extracellular matrix moieties, cytokines, and enzymes: dynamic effects on immune cell behavior and inflammantion // Journal of Leukocyte Biology. – 2000. – V. 67. –
P. 149-159.
302. Van Damme J., De Ley M., Van Snick J., Dinarello C.A., Billiau A. The role of interferonβ1 and the 26 kDa protein (interferon-β2) as mediators of the antiviral effect of interleukion-1 and tumor necrosis factor // The Journal of Immunology. – 1987. – V. 139. – №6. – P. 1867-1872.
303. Van Furth R. Current view on the mononuclear phagocyte system // Immunobiology. –
1982. – V. 161. – P. 178-185.
304. Venturi S., Venturi M. Iodine in evolution of salivary glands and in oral health // Nutrition
and Health. – 2009. – V. 20. – №2. – P. 119–134.
305. Vieira O.V., Botelho R.J., Grinstein S. Phagosome maturation: aging gracefully // Biochemical Journal. – 2002. – V. 366. – P. 689-704.
306. Wahl S.B. Transforming growth factor-β: The good, the bad and the ugly // The Journal of
Experimental Medicine. – 1994. – V. 180. – P. 1587-1590.
307. Wajant H., Pfizenmaier K., Scheurich P. Tumor necrosis factor signaling // Cell death and
differentiation. – 2003. –V. 10. – №1. – P. 45-65.
308. Wang F., Duan R., Chirgwin J., Safe S.H. Transcriptional activation of cathepsin D gene
expression by growth factors // Journal of Molecular Endocrinology. – 2000. – V. 24. – №2. – P. 193202.
309. Warburton D., Shi W., Xu B. TGF-β-Smad3 signaling in emphysema and pulmonary fibrosis: an epigenetic aberration of normal development? // American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. – 2013. – V. 304. – №2. – P. 83-85.
310. Warheit D.B., Laurence B.R., Reed K.L., Roach D.H., Reynolds G.A., Webb T.R. Comparative pulmonary toxicity assessment of single-wall carbon nanotubes in rats // Toxicological Sciences. – 2004. – V. 77. – №1. – P. 117-125.
311. Weber A., Wasiliew P., Kracht M. Interleukin-1 (IL-1) pathway // Science Signaling. –
2010. – V. 3. – №105. – P. cm1.
312. Wijburg O.L.С., Dinatale S., Vadolas J., Van Rooijen N., Strugnell R.A. Alveolar macrophages regulate the induction of primary cytotoxic T-lymphocyte responses during influenza virus infection // Journal of Virology. – 1997. – V. 71. – № 12. – P. 9450-9457.
130
313. Wu V.W.-K. Adsorption reaction constants between nanosilica/nanodiamond and lysozyme
molecule at pH = 11.0 // Chemistry Letters. – 2006. – V. 35. – №12. – P. 1380-1381.
314. Yang W., Auciello O., Butler J., Cai W., Carlisle J., Gerbi J., Gruen D., Knickerbocker T.,
Lasseter T., Russell J., Smith L., Hamers R. DNA-modified nanocrystalline diamond thin-films as stable, biologically active substrates // Nature Materials. – 2002. – V. 1. – P. 253–257.
315. Yeap W.S., Tan Y.Y., Loh K.P. Using detonation nanodiamond for the specific capture of
glycoproteins // Analytical Chemistry. – 2008. – V. 80. – №12. – P. 4659-4665.
316. Yeh C.B., Hsieh M.J., Hsieh Y.H., Chien M.H., Chiou H.L., Yang S.F. Antimetastatic effects of norcantharidin on hepatocellular carcinoma by transcriptional inhibition of MMP-9 through
modulation of NF-kB activity // PLoS One. – 2012. – V. 7. – №2. – P. 31055-31066.
317. Yu S.J., Kang M.W., Chang H.C., Chen K.M., Yu Y.C. Bright fluorescent nanodiamonds:
no photobleaching and low cytotoxicity // Journal of the American Chemical Society. – 2005. –
V. 127. – P. 17604-17605.
318. Yu T., Malugin A., Ghandehari H. Impact of silica nanoparticle design on cellular toxicity
and hemolytic activity // ACS Nano. – 2011. – V. 5. – P. 5717–5728.
319. Zaitsev A.M. Optical Properties of Diamond, Springer, New York. – 2001. – P. 502.
320. Zhang P., Summer W.R., Bagby G.J., Nelson S. Innate immunity and pulmonary host defense // Immunological Reviews. – 2000. – №173. – P. 39-51.
321. Zhang S., Li J., Lykotrafitis G., Bao G., Suresh S. Size-dependent endocytosis of nanoparticles // Advanced Materials. – 2009. – V. 21. – P. 419-424.
322. Ziche M., Morbidelli L., Donnini S. Angiogenesis // Experimental Nephrology. Science. –
1997. – V. 277. – P. 48-50.
131
ПРИЛОЖЕНИЕ
IL-1α:
Контроль
НА, 20 мкг/мл
48 ч
TNF-α:
48 ч
GM-CSF:
48 ч
IFN-γ:
48 ч
Рис. П.1. Культура перитонеальных макрофагов (МФ) через 48 часов после внесения в нее наноразмерных алмазных частиц (НА) в концентрации 20 мкг/мл. Иммуноферментная окраска
провоспалительных цитокинов: IL-1 α, TNF-α, GM-CSF и IFN-γ. Специфическим коричневым
цветом окрашена цитоплазма клеток. Увеличение 400.
132
Катепсин B:
Контроль
НА, 20 мкг/мл
Контроль
НА, 20 мкг/мл
24 ч
48 ч
Катепсин D:
24 ч
48 ч
Рис. П.2. Культура перитонеальных макрофагов (МФ) через 24 и 48 часов после внесения в нее
наноразмерных алмазных частиц (НА) в концентрации 20 мкг/мл. Иммуноферментная окраска
лизосомальных гидролаз катепсина B и D. Специфическим коричневым цветом окрашена цитоплазма клеток. Увеличение 400.
133
MMP-1:
Контроль
НА, 20 мкг/мл
Контроль
НА, 20 мкг/мл
24 ч
48 ч
MMP-9:
24 ч
48 ч
Рис. П.3. Культура перитонеальных макрофагов (МФ) через 24 и 48 часов после внесения в нее
наноразмерных алмазных частиц (НА) в концентрации 20 мкг/мл. Иммуноферментная окраска
матриксных металлопротеиназ MMP-1 и MMP-9. Специфическим коричневым цветом окрашена цитоплазма клеток. Увеличение 400.
134
EGF:
Контроль
НА, 20 мкг/мл
Контроль
НА, 20 мкг/мл
24 ч
48 ч
TGF-β:
24 ч
48 ч
Рис. П.4. Культура перитонеальных макрофагов (МФ) через 48 часов после внесения в нее наноразмерных алмазных частиц (НА) в концентрации 20 мкг/мл. Иммуноферментная окраска
ростовых ферментов EGF и TGF-β. Специфическим коричневым цветом окрашена цитоплазма
клеток. Увеличение 400.
135
KGF/FGF-7:
Контроль
НА, 20 мкг/мл
Контроль
НА, 20 мкг/мл
24 ч
48 ч
b-FGF/FGF-2:
24 ч
48 ч
Рис. П.5. Культура перитонеальных макрофагов (МФ) через 48 часов после внесения в нее наноразмерных алмазных частиц (НА) в концентрации 20 мкг/мл. Иммуноферментная окраска
ростовых ферментов KGF/FGF-7 и b-FGF/FGF-2. Специфическим коричневым цветом окрашена цитоплазма клеток. Увеличение 400.
136
Б.
А.
В.
Рис. П.6. Культура перитонеальных макрофагов (МФ) на миллипоровой мембране через 24 часов после внесения в нее наноразмерных алмазных частиц (НА) в концентрации 20 мкг/мл. Иммуноферментная окраска матриксной металлопротеиназы MMP-1. Специфическим коричневым
цветом окрашена цитоплазма МФ и зоны миллипоровых мембран, обусловленные иммобилизацией секретируемого фермента на мембране. А. МФ с окрашенной вокруг него зоной иммобилизованного MMP-1; Б. Зона иммобилизованного MMP-1 без МФ, открепившегося от мембраны (красная пунктирная линия); В. МФ на мембране без зоны иммобилизованного MMP-1 вокруг него. Увеличение 1000.