Геномное секвенирование региона CDR3 генов тяжелых цепей

Геномное секвенирование региона CDR3
генов тяжелых цепей иммуноглобулинов
из архивных препаратов (FFPE) от
больных лимфогранулематозом
Ю.В. Сидорова, Б.В.Бидерман, А.Б. Судариков
ФГБУ “Гематологический Центр” Минздрава РФ
Thomas Hodgkin (1798-1866)
Hodgkin T. On some morbid appearances
of the absorbent glands and spleen.
Med Chir Trans 1832;17:69–97.
Лимфогранулематоз – болезнь Ходжкина –
Hodgkin disease
Hodgkin’s disease watercolor
drawing by Robert Carswell in
1828. This was case 7 in
Hodgkin’s report.
Abdominal lymph nodes
(Hodgkin’s original case 2),
Gordon Museum, GKT, King’s
College London.
Reed-Sternberg cells (клетки
Березовского- Штернберга)
Dorothy Mabel
Reed(1874-1964)
Березовский С.Я. К вопросу о строении и
клиническом течении Lyphadenomae malignae.
Русская медицина, 1890; 39: 611-613.
●Sternberg C. Uber eine eigenartige unter
dem Bilde der Pseudoleukamie verlaufende
Tuberculose des lymphatischen Apparates.
Ztschr Heilk 1898;19:21–90.
●Reed DM. On the pathological changes in
Hodgkin’s disease, with especial reference
to its relation to tuberculosis. Johns
Hopkins Hosp Rep 1902; 10: 133–396.
●
0-1
1-4
5-9
10-14
15-19
20-24
25-29
30-34
35-39
40-44
45-49
50-54
55-59
60-64
65-69
70-74
75-79
80-84
85+
incidence/100,000/annum
Лимфогранулематоз – болезнь Ходжкина –
Hodgkin disease
6
5
4
3
2
1
0
Age (years)
Лимфогранулематоз – болезнь Ходжкина –
Hodgkin disease
Hodgkin and Reed-Sternberg cells
picked from histological sections show
clonal immunoglobulin gene
rearrangements and appear to be
derived from B cells at various stages
of development. R Küppers, K Rajewsky,
M Zhao, G Simons, R Laumann, R
Fischer, and M L Hansmann. Proc Natl
Acad Sci U S A. 1994; 91(23): 10962–
10966.
Ранние иммунофенотипические
исследования клеток БерезовскогоШтернберга (Reed-Sternberg)
предполагали их нелимфоидную
природу (макрофагальную,
гранулоцитарную и т.д.).
Лимфогранулематоз – болезнь Ходжкина –
Hodgkin disease
●
●
●
Немногочисленные многоядерные опухолевые
клетки Березовского-Штернберга (ReedSternberg cells) имеют В-клеточное
происхождение и расположены среди
преобладающего реактивного компонента.
В большинстве случаев реарранжировки IgH
носят продуктивный характер
Наличие VH мутаций свидетельствует о
герминальной или постгерминальной природе
этих клеток
Цели эксперимента:
●
●
Исследовать возможности метода
геномного секвенирования для анализа
спектра перестроенных генов
иммуноглобулинов на ДНК, выделенных
из архивных образцов (FFPE)
Сравнить профили клональности IgH
при лимфогранулематозе и реактивной
лимфоаденопатии (инфекционный
мононуклеоз)
В исследование включены:
●
●
5 проб от больных инфекционным
мононуклеозом
7 проб от больных лимфогранулематозом;
гистологический вариант вариант –
нодулярный склероз, EBV-negative,
возраст 20-40 лет (медиана -29)
Перестройки генов тяжелой цепи
иммуноглобулинов
Параметры амплификации:
35 циклов VH-FR1 - JHcons
10 циклов VH-FR2 - JHcons
Next generation sequencing
Амплифицированные ДНКфрагменты
секвенировали
на платформе GS
Junior (Roche).
RL1: 7294 reads
RL2: 17834 reads
RL3: 6961 reads
RL4: 15047 reads
RL5: 7437 reads
RL6: 6876 reads
RL7: 48673 reads
RL8: 13990 reads
RL9: 11529 reads
RL10: 14412 reads
RL11: 17349 reads
RL12: 11561 reads
Анализ данных производили
при помощи программного
обеспечения GSMapper
(Roche) и при помощи webресурса IMGT/V-QUEST
http://www.imgt.org
IgH clusters
Обсчитывали
последовательности начиная
со 100-кратного перекрытия
Профили клональных перестроек генов тяжелой
цепи иммуноглобулинов
инфекционный
мононуклеоз
лимфогранулематоз
Предварительные выводы:
●
●
●
●
Метод геномного секвенирования на платформе GS Junior
(Roche) обладает достаточной чувствительностью для анализа
спектра перестроенных генов иммуноглобулинов на ДНК,
выделенных из архивных образцов (FFPE).
В образцах от больных лимфогранулематозом определена Вклеточная клональность. В части образцов со значительным
преобладанием одного клона.
В образцах от больных с реактивной лимфоаденопатией
мажорные клоны (почти всегда продуктивные) не выходят за
пределы 1-2%.
Наличие клонов с представительством более 30% (особенно
непродуктивных) позволяет предположить, что тезис о том,
что опухолевый субстрат при лимфогранулематозе представлен
лишь немногочисленными клетками Березовского-ReedSteinberg'а нуждается в дополнительной проверке.
Благодарности:
●
●
Ворониной Ольге Львовне, к.б.н., доценту, с.н.с. отдела
генетики и молекулярной биологии бактерий Института им.
Гамалеи.
Коробан Надежде, Roche Applied Science Application
Specialist.