Активные формы кислорода и антиоксидантная система

Российский университет дружбы народов
медицинский факультет
кафедра биохимии
*
Активные формы кислорода и
антиоксидантная система.
Регуляция клеточного редоксстатуса в норме и при патологии.
Профессор кафедры биохимии,
доктор биологических наук Е.В. Калинина
Активные формы кислорода и
антиоксидантная система.
Регуляция клеточного редокс-статуса в
норме и при патологии.
Роль глутатиона и глутатион-зависимых
ферментов в редокс-зависимых
механизмах формирования лекарственной
устойчивости опухолевых клеток.
Редокс-зависимая регуляция механизмов
гибели опухолевых клеток
Проблема свободных радикалов в последнее десятилетие произвела
настоящую революцию в понимании многих процессов, происходящем в
организме человека.
Сегодня свободные радикалы рассматриваются в качестве источника
многочисленных нарушений, приводящих к возникновению целого ряда
болезней.
В основе образования этих агрессивных радикалов, которые окрестили
«молекулярными акулами», обладающими неутолимым аппетитом в
результате потери одного электрона, как ни удивительно, лежит один из
самых значительных элементов для жизни человека – кислород.
Свободные радикалы — это высокоактивные молекулы
или атомы, имеющие один или несколько неспаренных
электронов на внешней орбитали, что делает их
особенно активными и «агрессивными».
Свободные
радикалы
стремятся
вернуть
себе
недостающий электрон, отняв его от окружающих
молекул
Наиболее известные свободные радикалы
Формула
Название
O·–
Оксид
O2·–
Супероксид
°O3·–
Озонид
HO·
Гидроксил
HO2·
Гидродиоксид
NO·
Окись азота
LO·
L·
LOO·
Липидные радикалы
ClO–
Гипохлорит
RO·
Алкоксил
C2H5O·
Этоксил
RО2·
Алкилдиоксил
Для биологических систем наиболее важны
кислородные свободные радикалы, которые
включены в группу активных форм кислорода – АФК.
Поэтапное одноэлектронное восстановление
кислорода протекает с образованием промежуточных
свободнорадикальных состояний кислорода, в
частности, супероксид-аниона и гидроксильного
радикала:
O2 + ē
O2·– + ē
супероксид-анион радикал
Н2О2 + ē
•ОН
+ ē
гидроксильный радикал
время полужизни ≈ 10-9с
Н2O
Около 95% всего потребляемого кислорода в клетке восстанавливается в
митохондриях до Н2O в процессе окислительного фосфорилирования.
Остальные 5% процентов
в результате различных реакций
превращаются в АФК:
1) в результате «утечки» ē в электронтранспортной цепи митохондрий
(I и III комплексы - НАДН:убихинол-оксидоредуктаза и убихинол:цитохром
с-оксидоредуктаза соответственно) с участием КоQ.
O
O
H3CO
CH3
H3CO
R
O
окисленный
кофермент Q
ē
OH
H3CO
CH3
H3CO
R
ē, 2Н+
O•
семихинон
О

2
H3 CO
CH3
H3 CO
R
OH
 O2
восстановленный
кофермент Q
2) в результате «утечки» ē в электронтранспортной системе мембран
эндоплазматического ретикулума и ядра, включающие в себя
цитохромы Р-450 и b5, а также НАДФН- и НАДН-зависимые редуктазы (в
том числе НАДФН-цитохром Р-450-зависимую редуктазу в микросомах).
3) за счет активности ферментов: НАДФН-оксидазы,
ксантиноксидазы, циклооксигеназы, липоксигеназы, NO-синтазы,
моноаминооксидазы, оксидазы АМК и др.
4) фагоциты (гранулоциты и моноциты крови) и тканевые
макрофаги для борьбы с бактериями образуют O2·– при активации
НАДФН-оксидазного комплекса на цитоплазматической мембране
O2
НАДФН (Н+)
О

2
миелопероксидаза
Н2О2
Cl–,
H+
Fe2+
HOCl
•ОН
гипохлорид
5) ионы Fe2+ (а также ионы других металлов переменной
валентности Cu2+, Co2+) способствуют образованию •ОН радикалов
посредством реакции Фентона:
H 2 O 2  Fe2 
 Fe3   OH  OH 
6) автоокисление гемоглобина Hb(Fe2+):
Hb(Fe2+)
7) УФ, радиация
Hb(Fe3+) +
ē
Таким образом, ряд биохимических процессов,
протекающих в аэробных организмах, сопряжен с
образованием АФК, таких как супероксидный
анион-радикал (O2·–), гидроксильный радикал (•ОН ),
перекись водорода (H2O2), синглетный кислород
(1O2), гипохлорная кислота (HOCl).
К АФК относят также пероксинитрит ( ONOO ),
обладающий высокой реакционной способностью.
Свободные радикалы разделяют на
первичные, вторичные и третичные (Владимиров Ю.А.).
Первичные свободные радикалы
жизнедеятельности организма в
бактерий, вирусов, чужеродных и
выделяют и используют свободные
микроорганизмов и раковых клеток.
постоянно образуются в процессе
качестве средств защиты против
опухолевых клеток. Так, фагоциты
радикалы в качестве оружия против
Вторичные радикалы, в отличие от первичных, не выполняют
физиологически полезных функций.
Напротив, они оказывают разрушительное действие на
клеточные структуры, стремясь отнять электроны у
«полноценных» молекул, вследствие чего «пострадавшая»
молекула
сама
становится
свободным
радикалом
(третичным), но чаще всего слабым, не способным к
разрушающему действию.
Образующиеся АФК могут выполнять полезные для клетки
функции:
* участвуют (через АФК-зависимый сигналинг) в регуляции
клеточных процессов (клеточное деление, дыхание и др.),
* бактерицидное действие,
* активируют иммунные реакции лейкоцитов.
Однако это возможно при низком уровне АФК в клетке.
При высоком уровне АФК развивается окислительный
(оксидативный) стресс, который приводит к нарушению
функций клетки, развитию ряда заболеваний (атеросклероз,
ИБС, диабет, ХОБЛ, болезнь Альцгеймера, болезнь
Паркинсона, злокачественные образования и др.), гибели
клеток путем апоптоза или некроза.
Таким
образом,
свободные радикалы совершенно
необходимы,
так
как
они
участвуют
во
многих
физиологических
процессах
организма.
Однако
свободные радикалы в организме могут причинить вред,
когда их количество возрастает и значительно превосходит,
необходимое для осуществления окислительных процессов.
Где та норма, при которой свободные радикалы полезны?
Как контролировать свободнорадикальные процессы в
организме?
Живые клетки имеют систему защиты от повышенной
продукции
свободных
радикалов
антиоксидантную
систему,
механизм
действия
которой
направлен
на
блокирование
действия
свободных
радикалов.
Антиоксидантная
система
образована
низкомолекулярными
антиоксидантами
и
антиоксидантными ферментами.
Антиоксиданты «ловят» радикалы, отдавая им свои
электроны, таким образом, обезвреживая их. При этом
структура антиоксидантов остается стабильной.
Низкомолекулярные антиоксиданты:
Токоферол (вит. Е)
Ретинол (вит. А)
Аскорбиновая кислота (вит. С)
Глутатион восстановленный
N-ацетилцистеин
Мочевина, мочевая кислота, билирубин
Карнозин и другие гистидинсодержащие дипептиды
Ключевыми
антиоксидантными
ферментами
являются
супероксиддисмутаза (СОД), каталаза, глутатионпероксидаза.
Они катализируют реакции, в результате которых свободные
радикалы и перекиси превращаются в неактивные
соединения
Супероксиддисмутаза (разные формы содержат Cu/Zn
и Mn):
О2-  + О2-  + 2Н+
Н2О2 + О2
Каталаза (гемсодержащий фермент):
2 Н2О2
2 Н2О + О2
Глутатионпероксидаза (содержит остаток
селеноцистеина):
2GSH + Н2О2
GSSG + 2Н2O
БАЛАНС АФК В ЖИВЫХ КЛЕТКАХ
ГЕНЕРАЦИЯ
АФК
Дыхательная цепь
митохондрий, NADPH-оксидаза
нейтрофилов, микросомальное
окисление, неферментативное
окисление биогенных аминов
ТУШЕНИЕ
АФК
СОД, Каталаза, Пероксидазы,
Низкомолек. антиоксиданты
(мочевая кислота, таурин,
витамины A, C, E, карнозин, Nацетилцистеин, глутатион),
xелаторы ионов железа
В норме существует баланс между образованием
АФК и уровнем антиоксидантной системы, который
обеспечивает
физиологически
необходимый
уровень АФК.
Баланс
процессов
окислительно-восстановительных
в клетке определяет клеточный
редокс-статус (от англ. redox — reduction-oxidation
reaction).
Баланс между продукцией АФК и уровнем
антиоксидантной системы вносит значительный
вклад в состояние клеточного редокс-статуса
Поддержание клеточного редокс-статуса играет
важную роль в таких процессах как синтез ДНК,
экспрессия генов, ферментативная активность.
Изменения редокс-состояния молекул, являющиеся
следствием
стрессовых
воздействий
или
результатом активности самих клеток, вовлечены в
редокс-регуляцию клеточных процессов.
Важную роль в поддержании клеточного редоксстатуса и в редокс-регуляции играют
тиолсодержащие молекулы: трипептид
глутатион (GSH: γ-глутамил-L-цистеинилглицин) и
редокс-зависимые белки - тиоредоксины,
глутаредоксины и пероксиредоксины
Роль в поддержании клеточного редокс-статуса
за счет участия в SH –S–S– обмене, что
обеспечивает регуляцию целого ряда функций
клетки, в том числе регуляцию генной экспрессии,
делает GSH весьма важным для жизнеспособности
клеток.
Благодаря высокой внутриклеточной концентрации (от 0,1 до
10 мМ) GSH является важным внутриклеточным
антиоксидантом, играя роль “ловушки” свободных
радикалов и косубстрата в реакциях детоксикации
пероксидов, катализируемых глутатионпероксидазами
(GPx) и глутатионтрансферазами (GST), а также в
восстановлении окисленной формы глутаредоксина (Grx).
Восстановление окисленной формы глутатиона (GSSG)
катализирует глутатионредуктаза (GR)
Схема основных путей метаболизма глутатиона
GSX GSSG
GSX
транспортер
НАДФН
γ-glu-аминокислота
аминокислота
cys
cys-gly
GSH
γ-GT
GSH
транспортер
экстраклеточно
gly
дипептидаза
транспортеры
аминокислот
внутриклеточно
GSSG
γ-gluаминокислота
ROH
GR
γ-глутамилциклотрансфераза
GPx
аминокислота
5-оксопролин
ROOH
НAДФ+
ATФ
5-оксопролиназа
gly
GSH
GSX
GST
X
AДФ
GS
AДФ
cys
γ-glu-cys
ATФ
AДФ
γ-GCS
glu
ATФ
Поддерживание оптимального для клетки
соотношения GSH/GSSG является важным для ее
жизнеспособности.
Повышение уровня GSH способствует росту
клеточной резистентности к действию радиации,
подавляет гибель клеток путем апоптоза или
некроза.
Снижение уровня восстановленного GSH ниже
обычных (для показателей нормы) значений служит
индикатором дефицита антиоксидантной защиты.
Нарушение внутриклеточного баланса GSH
(снижение GSH/GSSG) наблюдается при ряде
патологий, включая злокачественные
новообразования, ВИЧ, ИБС, ХОБЛ,
нейродегенеративные заболевания, болезнь
Паркинсона, патогенетическим фактором которых
является окислительный стресс.
На основании первичной аминокислотной
последовательности, субстратной специфичности и
субклеточной локализации установлено 7 изоформ
глутатион пероксидазы (GPx) у человека и млекопитающих.
Изоформы GPx в положении 21 аминокислоты содержат
селеноцистеин (Sec). GPx1 локализована в основном в
цитозоле, а также обнаружена и в митохондриях,
восстанавливает водорастворимые гидроперекиси и
экспрессируется практически во всех типах клеток.
Все изоформы GPx катализируют восстановление
органических гидропероксидов:
2GSH  ROOH  GSSG  ROH  H 2 O
GPx активна по отношению к Н2О2 и OONO– :
2GSH  H 2 O 2 Gpx

 GSSH  2H 2 O
2GSH  ONOO  GPx

 GSSG  NO 2  H 2 O
Глутатион S-трансферазы, использующие
нуклеофильный GSH для конъюгации с неполярными
соединениями, содержащими электрофильные атомы
C, N и S.
Суперсемейство GST подразделяется на три
субсемейства: цитозольные, митохондриальные GST и
микросомальные GST.
Основными функциями GST являются: а) детоксикация
ксенобиотиков; б) редокс-регуляция чувствительности
клеток к апоптозу,
б) детоксикация продуктов окислительного стресса:
ROOH  2GSH GST

 ROH  GSSG  H 2 O
Глутаредоксины (Grx) – GSH-зависимые оксидоредуктазы, играющие
важную роль в клеточных редокс-зависимых процессах.
В Grx-зависимой системе перенос электронов происходит от
НАДФН-зависимой глутатионредуктазы на окисленный глутатион
(GSSG) с образованием GSH, который в свою очередь
восстанавливает окисленный Grx. Субстратами для Grx являются
дисульфиды и смешанные дисульфиды.
НAДФH + H+
GSSG
Grx-(SH)2
2 GSH
Grx-S2
Субстрат-S2
глутатионредуктаза
НAДФ+
У млекопитающих и человека
обнаружены три изоформы Grx:
цитозольная Grx1 с аминокислотной
последовательностью в активном
центре Cys-Pro-Tyr-Cys и две
митохондриальных изоформы – Grx2
и Grx5, активный центр которых
содержит аминокислотные
последовательности Cys-Ser-Tyr-Cys и
Cys-Gly-Phe-Ser соответственно.
Субстрат-(SH)2
РЕДОКС-ЗАВИСИМАЯ ПРОТЕКТОРНАЯ РОЛЬ ГЛУТАРЕДОКСИНА 1
ПРОТИВ АПОПТОЗА
Song J.J. et al., 2002
GRx-SH
OXIDATIVE STRESS
Сочетание антиоксидантных свойств и способности активировать
транскрипцию генов, в том числе некоторых антиоксидантных
ферментов, а также ингибировать редокс-зависимые пути активации
апоптоза свидетельствуют о важном вкладе тиоредоксина
(Trx) в антиоксидантную защитную систему. Trx как и Grx является
дисульфидредуктазой и входит в состав суперсемейства
тиоредоксинов.
Trx-зависимая система содержит помимо Trx НАДФ-зависимую
тиоредоксинредуктазу (TrxR), которая восстанавливает
окисленную форму Trx.
Основными изоформами Trx являются цитозольный Trx1и
митохондриальный Trx2.
ТИОРЕДОКСИН И ЕГО РЕДОКС-ЗАВИСИМЫЕ ФУНКЦИИ
Nordberg J., Arner E.S.J., 2001
Пероксиредоксины (Prx), образующие суперсемейство
Se-независимых пероксидаз, открыты около 15 лет
назад.
Prx осуществляют ферментативную деградацию H2O2,
органических гидропероксидов, пероксинитрита.
Известно 6 изоформ Prx (Prx 1-6).
Типичные двухцистеиновые Prx1 – Prx4 являются
гомодимерами, и их взаимодействие с Н2О2 приводит к
образованию сульфеновой кислоты, которая может
участвовать в формировании межпептидной
дисульфидной связи, восстанавливаемой действием
Trx. Окисленный Prx6 использует в качестве источника
электронов не Тrx, как другие Prx, а
низкомолекулярные тиолы, в том числе GSH
Механизм действия пероксиредоксинов
ТАКИМ ОБРАЗОМ, в антиоксидантной системе клеток
наряду с ключевыми антиоксидантными
ферментами важную роль играют редокс-белки
тиоредоксин (Trx), глутаредоксин (Grx),
пероксиредоксин (Prx), участвующие в процессах
клеточной редокс-зависимой регуляции
посредством контроля тиол-дисульфидного обмена.
Эти редокс-зависимые белки высоко значимы в
поддержании клеточного редокс-гомеостаза и
редокс-зависимой регуляции целого ряда
внутриклеточных процессов, в том числе
пролиферации, дифференцировки и апоптоза.
Тяжелые
металлы
Метаболические
нарушения
ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ
СТРЕСС
ДЕФИЦИТ
антиоксидантов
Старение
АФК
Нейроденеративные
процессы
Токсиканты
AO
система
Нарушение баланса АФК/антиоксиданты приводит к
развитию
окислительного
стресса,
который
сопровождается
активацией
перекисного
(пероксидного) окисления липидов (ПОЛ).
Наиболее чувствительные к ПОЛ полиненасыщенные
ВЖК липидного бислоя клеточных мембран
ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ
Малоновый диальдегид
Перекисное окисление липидов (ПОЛ) является важной причиной
накопления клеточных дефектов. Основным субстратом ПОЛ являются
полиненасыщенные жирные кислоты, входящих в состав клеточных
мембран, а также липопротеинов. Атака кислородными радикалами
приводит к образованию гидрофобных радикалов. Образующиеся
липидные радикалы, а также 4-гидроксиноненаль и малоновый
диальдегид могут атаковать молекулы белков и нуклеиновых кислот.
Альдегидные группы этих соединений образуют межмолекулярные
сшивки, что сопровождается нарушением структуры макромолекул и их
функций.
ПОЛ изменяет свойства мембран:
*нарушается микровязкость (↑)
*образуются “мега” поры
*растет проницаемость мембран →
набухание
*изменяется ионная проницаемость
(разрушение ионных каналов и
ионных насосов, например, Nа,КАТФазы)
*
Факторы, вызывающие оксидативный стресс
(нарушение
окислительно-восстановительного равновесия в сторону окисления и
образования вторичных свободных радикалов), многочисленны и
напрямую связаны с нашим образом жизни. Это радиация, курение,
напитки с высокой окислительной способностью, хлорированная
вода, загрязнение окружающей среды, антибиотики и ксенобиотики.
Окислительный стресс может являться причиной или осложнять течение
многих опасных заболеваний, таких как астма, артрит, рак, диабет,
атеросклероз, ИБС, ХОБЛ, флебиты, болезнь Паркинсона, болезнь
Альцгеймера, эпилепсия, рассеянный склероз, депрессии и др.
В настоящее время установлено, что АФК могут играть
существенную роль на всех этапах канцерогенеза:
инициации, промоции и прогрессии, а также что
хронический окислительный стресс может приводить к
злокачественной трансформации [Эмануэль Н.М.,
Саприн А.Н.]. Число данных в пользу
свободнорадикальной теории рака постоянно
увеличивается, поэтому она получила широкое
признание и актуальна сегодня.
Одним из наиболее значительных ограничений
эффективности химиотерапии рака является развитие
множественной лекарственной устойчивости.
Среди хорошо известных факторов, вызывающих
развитие множественной лекарственной устойчивости,
включая повышенную экспрессию трансмембранных
транспортеров (Р-гп, MRP, LRP, BCRP), повышение
уровня системы детоксикации, снижение экспрессии и
активности топоизомеразы II, изменение экспрессии
генов, блокирующее развитие апоптоза, остаются
малоизученными свободнорадикальные механизмы.
Образование АФК в результате редокс-цикла
доксорубицина
доксорубицин
Цитотоксический эффект противоопухолевого
препарата доксорубицина (DOX) в значительной
степени связан с прооксидантным действием,
обусловленным наличием хинона в его структуре.
При действии ряда флавопротеинов, в том числе
NADPH-цитохром Р-450-редуктазы, NADHдегидрогеназы, ксантиноксидазы, катализирующих
одноэлектронное восстановление, происходит
образование свободнорадикальной семихинонной
формы DOX, легко способной к рециклу в
присутствии молекулярного кислорода с
образованием супероксид-аниона и последующего
каскада генерации АФК, включая Н2О2 и
высокореакционноспособные .ОН радикалы,
образование которых резко ускоряется в присутствии
ионов Fe2+
Установлено, что
1) формирование лекарственной устойчивости
опухолевых клеток к DOX связано с редоксзависимым скоордининированным
повышением экспрессии генов ключевых
ферментов, контролирующих синтез GSH de
novo.
2) формирование лекарственной
устойчивости опухолевых клеток к DOX
сопровождается ростом отношения
содержания восстановленного GSH к
уровню его окисленной формы GSSG
(GSH/GSSG), что демонстрирует повышение
клеточного редокс-статуса.
3) формирование лекарственной устойчивости
опухолевых клеток к DOX сопровождается
ростом экспрессии генов GSH-зависимых
ферментов: глутатионтрансферазы,
глутатионпероксидазы, глутаредоксина, что
свидетельствует в пользу важной роли GSHзависимых процессов в редокс-механизме
развития лекарственной резистентности.
4) формирование лекарственной
устойчивости опухолевых клеток к DOX
сопровождается повышением экспрессии
генов тиоредоксина и пероксиредоксина, что
способствует росту редокс-зависимых
процессов восстановления дисульфидов и
перекисей
Рост внутриклеточного уровня
глутатионтрансферазы Р1-1, Trx, Grx играет
важную роль в регуляции клеточного
сигналинга путем белок-белковых
взаимодействий с ключевыми киназами,
контролирующими развитие апоптоза – ASK1 и
JNK1. Связываясь с ASK1 и JNK1 эти белки
блокируют пути активации апоптоза.
Поэтому рост экспрессии генов
глутатионтрансферазы Р1-1, Trx, Grx в
резистентных к DOX опухолевых клетках
приводит к подавлению механизма активации
апоптотической гибели клеток.
5) формирование лекарственной устойчивости
опухолевых клеток к DOX сопровождается
редокс-зависимой активацией
транскрипционного фактора Nrf2, что приводит к
скоординированному росту экспрессии генов
ферментов, контролирующих синтез GSH de
novo, GSH-зависимых ферментов
(глутатионтрансферазы, глутатионпероксидазы,
глутаредоксина), редокс-зависимых белков
тиоредоксина, пероксиредоксина
ТРАНСКРИПЦИОННЫЙ ФАКТОР Nrf2 И АКТИВАЦИЯ ЭКСПРЕССИИ
ГЕНОВ АНТИОКСИДАТНЫХ ФЕРМЕНТОВ И ФЕРМЕНТОВ
ДЕТОКСИКАЦИИ
Активные формы кислорода
Nrf2
Активация
Maf
Nrf2
Maf
TGA(G/C)NNNGC
ARE/EpRE
HO-1, Mn-SOD, каталаза, γ-GCS, Trx1, TrxR1, Prx1, Prx2, GR,
γ-GT, GSTP1-1, GSTA4-4, NQO1, H-ферритин, L-ферритин
Таким
образом,
развитие
адаптивного
антиоксидантного ответа на окислительный стресс,
вызываемый доксорубицином является важным
фактором
формирования
резистентности
опухолевых клеток к противоопухолевому действию
этого препарата.
Развитие адаптивного антиоксидантного ответа
доказывается
скоординированным
изменением
экспрессии генов антиоксидантных ферментов,
ферментов, контролирующих синтез GSH de novo,
GSH-зависимых ферментов (глутатионтрансферазы,
глутатионпероксидазы, глутаредоксина), редоксзависимых
белков
тиоредоксина
и
пероксиредоксина