удк 57.083.3:576.3 получение поликлональных антител к

УДК 57.083.3:576.3
ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ТРАНСКРИПЦИОННОМУ
ФАКТОРУ SOX2 ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА.
¹Секенова А.Е., 2 Огай В.Б., 2 Мукантаев К.Н.,2 Бакирова Г.А.
[email protected]
¹ - Евразийский национальный университет им. Л.Н. Гумилева,
2
- РГП «Национальный центр биотехнологии РК» КН МОН РК, г. Астана,
Казахстан
Научный руководитель – к.б.н., доцент Бекеева С.А.
Транскрипционный фактор Sox2 участвует в процессах пролиферации и
самообновления плюрипотентных стволовых клеток человека и животных. Экспрессия
транскрипционного фактора Sox2 представляет собой эффективный инструмент для
идентификации и изоляции стволовых клеток. Так, например, плюрипотентные ЭСК
могут быть охарактеризованы высоким уровнем экспрессии белка Sox2. Антитела,
специфичные к транскрипционному фактору Sox2, могут быть использованы для
мониторинга
присутствия
дифференцированных
и
недифференцированных
плюрипотентных стволовых клеток человека и мыши [1].
Целью работы является получение поликлональных антител, специфичных к
транскрипционному фактору Sox2 плюрипотентных стволовых клеток.
Материалы и методы. В экспериментах использовали рекомбинатный антигентранскрипционный фактор Sox2, полученный в лаборатории Молекулярной генетики
растений РГП «НЦБ РК» КН МОН РК Хасеновым Б.Б., Балтабековой М.Ж., Лапаевым
С.С. Иммунизацию мышей Balb/с проводили в оптимальных концентрациях антигена
Sox2, 50 мкг/мл и 100 мкг/мл с использованием полного и неполного адъюванта Фрейнда
по схеме Фридлянская И.И. [5]. Для определения титра специфических антител в
сыворотках крови отбирали кровь из хвостовой вены иммунизированного животного.
Электрофорез антигена-транскрипционного фактора Sox2
проводили 12 %-ном
полиакриламидном геле методом V.K. Laemmli et al. Иммуноблотинг осуществляли по
H.Towbin et al. с последующей детекцией исследуемыми поликлональн ыми антителами.
Специфичность связывания поликлональных антител с антигеном определяли
постановкой непрямого ИФА, иммуноцитохимией с использованием вторичных goat- anti
mouse IgG антител, конъюгированных с флуоресцентным красителем Alexa-fluor 595.
Результаты исследования.
В результате проведения электрофореза молекулярная масса белка антигенатранскрипционного фактора Sox2 составила 34 кДа (рисунок-1).
Оптимальная концентрация антигена Sox2 для иммунизаций составила – 50 мкг/мл.
Антитела специфически реагировали только с антигеном Sox2 в иммуноферментном
анализе. Иммунохимическое проявление взаимодействия антигенов, перенесенных после
электрофореза с полиакриламидного геля на нитроцеллюлозную мембрану, с
поликлональными антителами показало выявление полос серого цвета в иммуноблоте
(рисунок-2).
Электрофореграмма антигена Sox2 в 12% полиакриламидном геле
←
←34 кД
Рисунок 1
Рисунок 2
Иммуноблотинг антител
Поликлональные антитела, полученные из сыворотки мышей, иммунизированных в
концентрации 50 мкг/мл, имеют титр в ИФА 1:900 (таблица 1).
Таблица 1 - Исследование специфичности и активности антител с помощью варианта
непрямого ИФА
Вариант ИФА
Концентрация антигена
Активность титра
←
Sox2
Непрямой вариант ИФА
100 мкг/мл
1:300
Непрямой вариант ИФА
50 мкг/мл
1:900
Иммуноцитохимия антител на плюрипотентных СК
А
ЭСК мыши
В
ЭСК человека
Sox2/DAPI
С
Sox2/DAPI
D
ЭС
Рисунок 3К человека (отриц. контроль)
Иммуноцитохимический анализ показал, что полученные антитела специфически
реагируют с нативным транскрипционным фактором Sox2 в плюрипотентных стволовых
клетках мыши и человека (рисунок - 3).
Выводы.
1.
Получены поликлональные антитела, специфичные к транскрипционному
фактору Sox2 плюрипотентных стволовых клеток.
2.
Специфичность
и
иммунохимические
характеристики
полученных
поликлональных антител позволяют использовать их для определения экспрессии белка
Sox2 в плюрипотентных стволовых клетках человека.
Список использованной литературы :
1. Development of antibodies to human embryonic stem cell antigens. Jingli Cai, Judith M
Olson, Mahendra S Rao, Marisa Stanley, Eva Taylor and Hsiao-Tzu Ni*. BMC Developmental
Biology 2005, 5:26 doi:10.1186/1471-213X-5-26.
2.
Фридлянская И.И.
Получение поликлональных антител.
//Методы
культивирования клеток: Сб. науч. трудов, Л.: Наука, 1988. - С. 194-205.