ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ИВАНОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ
advertisement
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ИВАНОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МАТЕРИНСТВА И ДЕТСТВА ИМЕНИ В.Н. ГОРОДКОВА» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ На правах рукописи КАДЫРОВА ЛЮДМИЛА ВИКТОРОВНА ДИФФЕРЕНЦИРОВКА Т-ЛИМФОЦИТОВ В ДИНАМИКЕ БЕРЕМЕННОСТИ 14.03.09 –клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: д.м.н., профессор Н.Ю.Сотникова Иваново – 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………..……4 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………...13 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ……………………….....34 2.1. Организация работы и объем исследований .……………………………34 2.2. Иммунологические методы исследования .……………………………...35 2.3 Статистическая обработка данных…………..……………………………40 Глава 3. ХАРАКТЕРИСТИКА ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ Т-ЛИМФОЦИТОВ В ДИНАМИКЕ НЕОСЛОЖНЕННОЙ БЕРЕМЕННОСТИ И У ЖЕНЩИН С РАЗВИВШИМСЯ ВПОСЛЕДСТВИИ САМОПРОИЗВОЛЬНЫМ ВЫКИДЫШЕМ………………………………………...42 3.1. Особенности внетимической дифференцировки наивных Т-лимфоцитов в популяциях Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов периферической крови при неосложненной беременности в динамике гестационного процесса………....42 3.2. Особенности дифференцировки клеток памяти в популяциях Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов периферической крови при неосложненной беременности в динамике гестационного процесса………………………………...50 3.3. Особенности дифференцировки Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов периферической крови женщин с развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем……………………………………………………………………………56 3.4. Характеристика внутриклеточной продукции цитокинов и цитолитических молекул наивными клетками и клетками памяти в популяциях Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов периферической крови при неосложненной беременности в динамике гестационного процесса ………………………………..61 Глава 4. СОДЕРЖАНИЕ IL-2 И IL-15 В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ В ДИНАМИКЕ НЕОСЛОЖНЕННОЙ БЕРЕМЕННОСТИ И У ЖЕНЩИН С РАЗВИВШЕМСЯ ВПОСЛЕДСТВИИ САМОПРОИЗВОЛЬНЫМ ВЫКИДЫШЕМ……………………………………………………………………….69 3 Глава 5. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ………………………73 ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………………………….93 ВЫВОДЫ……………………………………………………………………...............94 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ……………………………………………...97 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ…………………………………………………………...99 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………………….......100 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность научного исследования В настоящее время известно, что иммунные механизмы играют крайне важную роль в развитии беременности, определяя формирование маточноплацентарного комплекса и обеспечивая сосуществование двух семиаллогенных организмов [9]. Нарушение тех или иных звеньев в сложной цепочке иммунорегуляции ведет к возникновению патологических процессов в системе мать-плацента-плод [171, 9, 182, 47]. Популяция Т-хелперов является важнейшим звеном в запуске реакций адаптивного иммунитета, при этом усиление функциональной активности той или иной субпопуляции Т-хелперов определяет тип иммунного ответа [39]. Цитотоксические Т-лимфоциты являются одним из основных компонентов эффекторной стадии иммунного ответа, осуществляющие цитолитическое действие в отношении различных клеток-мишеней благодаря продукции большого количества цитокинов и цитолитических молекул [39]. В последние годы было показано, что уровень функциональной активности Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов определяется стадией их дифференцировки [105, 86, 77, 95, 171]. При этом различают 4 пула Т-лимфоцитов, которые получили название наивных клеток, центральных, претерминально-дифференцированных и терминально-дифференцированных клеток памяти, характеризующихся различной экспрессией ряда функциональных и адгезионных молекул [30, 19, 95, 171]. Переход клеток на новую стадию дифференцировки определяет путь рециркуляции клеток через лимфоидную ткань, изменяет их цитолитические свойства, продукцию цитокинов и цитолитических молекул [77, 178, 105]. Однако в литературе практически отсутствуют данные о характере дифференцировки Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов неосложненном течении беременности в динамике гестационного процесса. при 5 Известно, что беременность сопровождается инволюцией тимуса, выраженной в снижении его массы и клеточности [210, 43, 84]. Предполагается, что во время беременности механизмом компенсации частичного подавления тимического пути развития лимфоцитов, является процесс экстратимической дифференцировки Т-клеток [35, 42]. Так в работах ряда авторов показано, что экстратимическая дифференцировка лимфоцитов может проходить в лимфатических узлах, дренирующих матку, в децидуальной оболочке матки и в печени [35, 42]. Однако данный механизм поддержания пула Т-лимфоцитов при беременности не исследовался. В настоящее время для изучения функциональной активности тимуса предлагается определять в лимфоцитах кольца реаранжировки генов α-цепи антигенраспознающего рецептора или TREC [65, 186]. В литературе представлены работы о снижении уровня TREC при различных патологических состояниях [160, 54, 78, 104, 188]. Можно предположить, что и при беременности, которая сопровождается транзиторной атрофией тимуса, должен изменяться уровень экспрессии TREC периферическими Т-лимфоцитами. Однако данные об изменении количества TREC при беременности крайне малочисленны. В связи с этим планируемая работа является актуальной и позволит уточнить особенности поддержания иммунного гомеостаза во время беременности. Цель работы – установить особенности поддержания иммунного гомеостаза в динамике гестационного процесса с учетом дифференцировки наивных Т-клеток и Т-клеток памяти, на основании чего разработать новый способ прогнозирования раннего самопроизвольного выкидыша. Задачи научного исследования 1. Выявить особенности дифференцировки клеток памяти в популяциях Тхелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов периферической крови в динамике гестационного процесса. 6 2. Оценить содержание клеток памяти, внутриклеточно продуцирующих цитокины и цитолитические молекулы, в популяциях Т-хелперов (IL-4, IFNγ) и цитотоксических Т-лимфоцитов (Perforin и Granzyme B) в динамике гестационного процесса. 3. Выявить особенности содержания IL-2 и IL-15 в сыворотке периферической крови в динамике гестационного процесса. 4. Оценить уровень ранних тимических эмигрантов на основании изучения содержания CD31+thymic и СD31-central клеток в популяциях периферических Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов и экспрессии ДНК TREC Тлимфоцитами в динамике гестационного процесса. 5. Разработать выкидыша способ у прогнозирования женщин с раннего неосложненной на самопроизвольного момент обследования беременностью. Научная новизна исследования Впервые установлено, что неосложненное течение беременности сочетается с изменением характера дифференцировки наивных клеток и клеток памяти и их функциональной активности, как в популяции Т-хелперов, так и популяции цитотоксических Т-лимфоцитов. Выявлено, что отличительной чертой дифференцировки клеток памяти у беременных женщин является снижение содержания в периферической крови во 2 и 3 триместрах центральных клеток памяти в популяции Т-хелперов, а в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов уменьшение уровня претерминальнодифференцированных клеток памяти в 1 и 2 триместрах. Установлено, что для беременных женщин характерно изменение продукции цитокинов разными субпопуляциями клеток памяти: в популяции Тхелперов усилена внутриклеточная продукция IL-4 и IFNγ наивными клетками в 1 триместре, повышена продукция IFNγ в пулах претерминально- и терминальнодифференцированных клеток и IL-4 в пуле терминально-дифференцированных 7 клеток во 2 триместре; в популяции ЦТЛ снижена внутриклеточная продукция перфорина центральными и претерминально-дифференцированными клетками памяти, повышена выработка Granzyme B наивными клетками в 1 триместре, снижена продукция Perforin всеми типами клеток памяти во 2 триместре, снижена продукция Perforin центральными, претерминально- и терминально дифференцированными клетками памяти в 3 триместре. Показано, что содержание различных пулов клеток памяти и их функциональная активность меняются в зависимости от срока гестации: в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов уровень центральных клеток памяти снижается во 2 триместре по сравнению с показателями 1 триместра, в 3 триместре количество претерминально-дифференцированных ЦТЛ повышается по сравнению с таковым во 2 триместре; также во 2 триместре относительно 1 триместра увеличивается внутриклеточная терминально-дифференцированными снижается выработка Perforin продукция клетками наивными в IL-4+ популяции клетками и и IFNγ+ Т-хелперов; терминально- дифференцированными клетками, а также уровень Granzyme B наивными клетками в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов; в 3 триместре уменьшается внутриклеточная продукция IFNγ претерминально- и терминальнодифференцированными клетками и IL-4 терминально-дифференцированными клетками памяти в популяции Т-хелперов, но повышается продукция Perforin наивными цитотоксическими Т-клетками. Установлено, что во время беременности повышается сывороточный уровень IL-2 в 1 и 2 триместрах и IL-15 на протяжении всего гестационного периода. Показано, что во время неосложненной беременности в отличие от небеременных женщин увеличено содержание наивных клеток в популяции Тхелперов на протяжении всего гестационного периода и в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов - в 1, 2 триместрах, что сочетается со снижением в крови уровня ранних эмигрантов из тимуса в популяциях и Т-хелперов, и ЦТЛ, при этом уровень экспрессии ДНК TREC снижается во 2 триместре. 8 Впервые выявлено, что снижение в 5-8 недель беременности в периферической крови уровня центральных клеток памяти в популяции Тхелперов на фоне повышения содержания терминально-дифференцированных клеток памяти в популяции Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов, а также повышение сывороточного уровня IL-15 предшествуют развитию самопроизвольного выкидыша в 10-12 недель беременности. Впервые установлено, что высокое содержание в периферической крови CD45RA+CD62L+ лимфоцитов в популяции периферических Т-хелперов является прогностическим критерием раннего самопроизвольного выкидыша. Методология и методы исследования Для достижения поставленной цели в работе было проведено обследование 85 женщин лонгитудинально в динамике гестационного процесса в 1 (5-8 недель гестации), 2 (16-20 недель гестации) и 3 (28-32 недели гестации) триместрах беременности, обратившихся в территориальную женскую консультацию № 2 г. Иваново для ведения беременности. При обследовании женщин использовался комплекс современных иммунологических методов - многоцветная проточная цитометрия, PCR в масштабе реального времени, твердофазный ИФА. Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием пакета современных компьютерных программ прикладного статистического анализа. Положения, выносимые на защиту Развитие гестационного процесса ассоциируется с изменением дифференцировки и функциональной активности наивных Т-клеток и Т-клеток памяти. Начиная с ранних сроков при неосложненной беременности, в результате воздействия антигенов плодового происхождения и стимулирующего влияния IL2 и IL-15, в периферической крови усиливается процесс экстратимической 9 дифференцировки наивных клеток в популяциях Th1, Th2 и цитотоксических Тлимфоцитов без последующего образования центральных и эффекторных клеток памяти, на фоне угнетения цитолитического потенциала клеток памяти. Чрезмерная стимуляция антигенами плода на фоне повышения сывороточного уровня IL-15 определяет усиление дифференцировки клеток памяти в популяции Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов до терминальных этапов, что может приводить к развитию цитотоксических реакций, направленных на преждевременное прерывание беременности. Высокое содержание CD45RA+CD62L+ клеток в популяции CD4+ лимфоцитов периферической крови является прогностическим критерием раннего самопроизвольного выкидыша. Практическая значимость научного исследования В гинекологической практике предлагается использовать новый способ прогнозирования определении в раннего самопроизвольного периферической крови выкидыша, основанный относительного на содержания CD45RA+CD62L+ клеток в популяции CD4+ лимфоцитов. Установлены нормативные показатели содержания наивных клеток, центральных, претерминально-дифференцированных и терминально- дифференцированных клеток памяти в популяциях Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов периферической крови в динамике гестационного процесса. Внедрение результатов работы в практику Разработанный «Способ прогнозирования самопроизвольного выкидыша» (положительное решение о выдаче патента от 14.05.2014г) прошел предрегистрационное испытание в гинекологической клиники Федерального государственного бюджетного учреждения «Ивановский научно- 10 исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Нормативные показатели содержания наивных клеток, центральных, претерминально-дифференцированных и терминально-дифференцированных клеток памяти в популяциях Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов периферической крови в динамике гестационного процесса используются в работе врачей акушеров-гинекологов гинекологической клиники Федерального государственного бюджетного учреждения «Ивановский научно- исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова» Министерства здравоохранения Российской Федерации и в учебном процессе на кафедре патофизиологии, клинической патофизиологии и иммунологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ивановская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Степень достаточным достоверности количеством полученных клинических результатов наблюдений. подтверждается Обследованы 85 беременных женщин лонгитудинально троекратно в динамике 1-3 триместров гестации и 36 практически здоровых небеременных женщин фертильного возраста. Личное участие автора Автором самостоятельно проводился отбор пациенток на основании заключений врачей акушеров-гинекологов. Автор лично осуществлял все этапы иммунологических исследований, проводил систематизацию, статистико- математическую обработку данных, анализ и описание полученных результатов; сформулированы выводы и практические рекомендации. 11 Апробация работы Основные результаты исследований докладывались и обсуждались на VI Съезде иммунологов России, Объединенном иммунологическом форуме, VI конференции по иммунологии репродукции (Нижний Новгород 2013г.); на V Российской конференции клинические аспекты» «Иммунология (Иваново, репродукции. 2012г.); VI Теоретические Всемирный конгресс и по иммунопатологии и респираторной аллергии, VIII Съезде аллергологов и иммунологов СНГ, V Съезде иммунологов России (Москва 2011г.); на XIV Всероссийском научном форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2011г.); на VIII конференции иммунологов Урала (Сыктывкар, 2010г.); IV Всероссийской конференции «Иммунология репродукции» (Пермь 2010г.); на научно-практической конференции молодых ученых ФГБУ “ИвНИИ МиД им. В.Н. Городкова” Минздрава России, Иваново 2011г., 2013 г; научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Неделя науки - 2011», «Неделя науки - 2013» в рамках областного фестиваля «Молодая наука - развитию Ивановской области» (Иваново, 2011, 2013гг.). Публикации По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 12 в рецензируемых журналах, включенных в перечень журналов, рекомендованных ВАК Минобрнауки России для публикаций научных результатов диссертаций. Объѐм и структура диссертации Материалы диссертации изложены на 119 страницах машинописного 12 текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 2 глав собственных исследований, главы «Обсуждение полученных результатов», заключения, выводов и практических рекомендаций. Список литературы включает 215 источников, в том числе 39 отечественных и 176 иностранных. Работа иллюстрирована 19 таблицами и 4 рисунками. 13 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Участие иммунной системы матери в контроле гестационного процесса в настоящее время ни у кого не вызывает сомнений [32, 21, 9]. В основе фундаментальных механизмов иммунологической толерантности организма матери к плоду и формирования фето-плацентарного комплекса лежит регуляция материнского иммунного ответа, осуществляемая активированными клонами Тхелперов, цитотоксических Т-лимфоцитов, регуляторных Т-лимфоцитов, ЕК, макрофагами и продуцируемыми ими цитокинами [9]. Начальным этапом развития адаптивных реакций иммунной системы является доставка антигена в органы иммунной системы и процесс презентации антигена специфичным клонам лимфоцитов [39]. Популяция Т-хелперов является основным звеном в запуске реакций адаптивного иммунитета, при этом усиление функциональной активности определенной субпопуляции Т-хелперов определяет тип иммунного ответа [39]. Цитотоксические Т-лимфоциты являются одним из важных компонентов эффекторной стадии иммунного ответа и осуществляют цитолитическое действие в отношении различных клеток-мишеней, опосредованное продукцией различных цитокинов и цитолитических молекул, а также индукцией апоптоза [39]. В последние время было показано, что уровень функциональной активности Тхелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов определяется стадией их дифференцировки [171, 95, 19, 30]. Беременность является уникальной моделью для изучения естественного парабиоза между генетически отличающимися организмами. Иммунные механизмы при беременности включаются уже на стадии имплантации оплодотворенной яйцеклетки и в дальнейшем в значительной мере обуславливают ее физиологическое течение [9]. Через 96 часов после 14 оплодотворения, клетки развивающегося эмбриона начинают экспрессировать МНС АГ отцовского происхождения, т.е. при беременности создается ситуация, определяющаяся постоянным контактом материнской иммунной системы с антигенами семиаллогенного плода [9, 27, 184, 113, 92]. Однако материнская иммунная система не только не отторгает, но и защищает плод. Основным барьером, препятствующим массированному проникновению АГ плода в кровоток матери является плацента. При гемохориальном типе плаценты существует разделение материнского и плодового кровотоков [20]. Однако плацента не является непреодолимым барьером. Многочисленными исследованиями было показано, что в кровоток матери на протяжении всего гестационного процесса попадают небольшие фрагменты ворсин хориона, микрочастицы синцитиотрофобласта [18, 27, 66, 92, 113, 183, 184, 149, 167]. Однако клетки ворсин трофобласта и синцитиотрофобласта не экспрессируют наиболее полиморфные антигены главного комплекса гистосовместимости класса Iа HLA-A,-B, и-C, а присутствующие на них антигены класса Ib MHC обладают низким уровнем полиморфизма и слабой способностью вызывать аллогенный ответ [194]. Данные об отсутствии молекулы МНС II класса на клетках трофобласта в настоящее время оспариваются [70], но большинство исследователей сходятся во мнении, что клетки трофобласта не экспрессируют молекулы МНС II класса [144, 194]. Несмотря на наличие этих механизмов, препятствующих стимуляции материнской иммунной системы антигенами плода, в последнее время появляются все больше работ, свидетельствующих о поступлении через плаценту в материнский кровоток различного материала, несущего эмбриональные антигены [147, 46]. Впервые фетальные клетки у беременных женщин обнаружили в 1960-е года уже на 15 неделе гестации [58, 203]. Так как во время беременности происходит длительная персистенция фетальных клеток в организме матери, то это приводит к развитию микрохимеризма. Микрохимеризм представляет собой явление, характеризующееся присутствием в многоклеточном организме небольшого количества клеток, которые происходят и самостоятельно 15 передаются в обход полового размножения от другого родственного многоклеточного организма и, следовательно, генетически отличны от клеток хозяина-носителя [147, 46, 58]. В последнее время эти данные получают все больше подтверждений и определяют новое направление в иммунологии беременности – исследование явления микрохимеризма [147, 46, 58, 203, 55, 211, 138]. Предполагают, что трансплацентарная миграция фетальных клеток естественна для нормального развития плаценты и плода, и их циркуляция во время беременности осуществляет важную роль в индукции иммунологической энергии и/или толерантности у матери и плода [93]. В настоящее время известно, что фетальный микрохимеризм возможен уже на ранних стадиях беременности вскоре после имплантации [55, 211] и нарастает по мере прогрессирования беременности [127, 162]. После родового процесса количество фетальных клеток снижается, но их можно обнаружить и спустя большое количество лет [138]. Так, Bianchi с соавторами обнаружили мононуклеарные клетки плода в материнском кровотоке через 27 лет после родов [138]. Кроме того, в литературе имеются сведения о том, что микрохимерные клетки можно выявить в щитовидной железе, сердце [138]. Значительное количество клеток плода, попадая в организм матери, в силу анатомических особенностей, прежде всего, накапливаются в дренирующих матку лимфатических узлах, где и происходит знакомство материнских Т-лимфоцитов с антигенами плода [35], но могут присутствовать в селезенке [71] и печени [120]. Выявление фетальных клеток в материнских тканях на протяжении продолжительного времени после беременности регистрируется значительно чаще, чем миграция материнских клеток в кровоток плода [136]. Все эти данные свидетельствуют о том, что во время беременности контакт материнских иммунных клеток с антигенами плода отцовского происхождения осуществляется в течение длительного времени. Такая ситуация, казалось бы, должна сопровождаться патологическим ответом со стороны иммунной системы матери, но в норме этого не происходит, и только при осложнениях гестационного процесса отмечается развитие цитотоксических и аутоиммунных реакций [166, 195]. Как показывают исследования, микрохимеризм предполагает 16 присутствие в организме человека не более 1% чужеродных клеток от всех клеток индивида [46]. При патологии беременности, в частности при преэклампсии и досрочном прерывании беременности количество клеток микрохимер плодового происхождения в организме матери значительно выше [166, 38, 195], что, вероятно, может способствовать развитию цитотоксических и аутоиммунных реакций, направленных на отторжение плода [176, 102]. Как предполагают различные исследователи, повышение уровня антигенного материала плодового происхождения в периферическом кровотоке беременной женщины при патологии беременности происходит в результате нарушения плацентарных барьеров [9, 184]. Следовательно, стимуляция иммунной системы матери антигенами плода является необходимым фактором нормального развития беременности [9], но избыточное поступление АГ при нарушении барьерной функции плаценты приводит к формированию патологии беременности [167, 152]. Согласно современным представлениям, беременность на всем протяжении сопровождается изменением состояния иммунной системы матери, направленным на сохранение плода [9]. Представления об иммунологическом взаимодействии матери и плода все еще во многом остаются гипотетическимии. Существует большое количество гипотез, пытающихся объяснить феномен неотторжения плода [57, 69, 98, 151, 76, 56], однако, самостоятельно ни одна из выдвинутых теорий не объясняет до конца сути феномена. Рабочими в настоящее время являются следующие гипотезы: об иммуномодулирующих свойствах клеток трофобласта и уникальном наборе антигенов главного комплекса гистосовместимости, экспрессируемом на них [57], инволюция тимуса во время беременности [69], продукции блокирующих растворимых факторов, поддерживающих иммунное равновесие при беременности [98], усиление активности клеток с супрессивным действием [151, 76], изменение баланса в соотношении Th1/Th2 клеток в сторону преобладания Т-хелперов 2 типа [56]. Последняя из теорий являлась наиболее популярной теорией в иммунологии репродукции. В ней Wegmann T.G. с соавторами (1993) показали, что 17 преимущественное развитие иммунного ответа по гуморальному типу менее опасно для плода, в то время как Th1 тип иммунного ответа определяет потенциально враждебный для плода клеточно-опосредованный иммунный ответ [56]. Однако был получен ряд экспериментальных и клинических данных, не укладывающиеся в рамки этой теории [68, 164]. Оказалось, что выявление в крови повышенного содержания комплекса цитокинов Th1 типа иммунного ответа не всегда коррелирует с неблагоприятным течением и исходом беременности и, наоборот, при акушерской патологии может отмечаться высокий уровень цитокинов Th2 типа иммунного ответа [68, 164]. Цитокины, продуцируемые Th1 и Th2 клетками, определяют характер иммунного ответа, при этом активация Тхелперов 1 типа способствует развитию клеточного, а Тh2 - гуморального иммунного ответа [12]. С другой стороны развитие того или иного типа иммунного ответа ассоциируется с определенным цитокиновым фоном [39]. Считается, что неадекватный ответ материнской иммунной системы играет важную роль в развитии привычного невынашивания, идиопатического бесплодия, самопроизвольного выкидыша и преэклампсии [41, 9, 133, 163]. В последнее время большое внимание уделялось исследованию супрессии материнского иммунного ответа в результате увеличения во время гестации уровня регуляторных Т-лимфоцитов [48, 209, 169]. Известно, что иммунный ответ на антиген включает индукцию не только эффекторных Т-клеток, осуществляющих элиминацию антигена, но и регуляторных Т-лимфоцитов, специфичных к антигену и ограничивающих экспансию эффекторных Тлимфоцитов и иммунный ответ в целом [207]. Различают 2 типа Тreg: натуральные (естественные) и индуцированные. Натуральные Тreg развиваются в тимусе путем селекции, опосредованной высокоавидным взаимодействием Тклеточного рецептора c соответствующим лигандом и в последующем расселяются в периферические лимфоидные органы [52]. Скорость образования натуральных Treg постоянна в течение всей жизни. Естественные Treg играют важную роль в механизмах системного гомеостаза, контролирующего в организме общее количество лимфоцитов [7]. 18 Индуцированные Тreg появляются на периферии в результате иммунной стимуляции клеток CD4+CD25-Foxp3- или могут быть стимулированы ex vivo [103]. Высокая значимость популяций регуляторных Т-лимфоцитов в индукции материнской толерантности к полу-аллогенному плоду была установлена, как в экспериментальных работах на лабораторных животных [50, 41, 49, 63], так и при исследовании беременности человека [50, 76, 148, 99, 214, 62]. Было установлено, что уровень Treg, циркулирующих в периферической крови и находящихся в децидуальной оболочке плаценты, увеличивается в период ранней беременности, достигает максимального уровня во втором триместре и постепенно снижается к родам до уровня небеременных [50, 76, 148, 99, 214]. Считается, что рост уровня Treg при беременности непосредственно связан с подавлением реактивности на анти-отцовские аллоантигены [214, 62]. Наряду с вышесказанным, высокая значимость Treg в поддержании иммунного гомеостаза во время беременности подтверждается данными о снижении их уровня при спонтанных абортах [41, 76] и преэклампсии [45, 159, 168]. Тreg могут продолжительное время выживать без деления вне контакта со специфическим антигеном [191]. Эти клетки экспрессируют на своей поверхности L-селектин и находятся при этом в циркуляции как наивные Т-лимфоциты [191]. Тreg могут оседать в лимфатических узлах, а при непосредственном контакте со специфическим антигеном начать пролиферировать [191]. При этом Тreg эффективно угнетают иммунный ответ и препятствуют выходу эффекторных Т-клеток, снижая экспрессию их хемокиновых рецепторов [191]. При первичном иммунном ответе на инфекционные антигены эти клетки сдерживают активность эффекторных Тлимфоцитов, подавляя их пролиферацию, цитотоксическую активность и продукцию цитокинов Th1 и Th2 типов иммунного ответа [3]. Повторные антигенные стимуляции не только усиливают иммунитет, пополняя пул Т-клеток памяти, но и повышают супрессорную активность CD4+CD25+Foxp3+ Treg [3]. Таким образом, при беременности существует особый баланс между процессами активации одних реакций иммунной системы и супрессией других [9, 50, 169, 52]. Только в этом случае запускается каскад реакций, регулирующих 19 формирование фето-плацентарного комплекса и способствующий пролонгированию беременности [9]. Нарушение баланса между супрессорными и активирующими сигналами может привести к развитию патологических состояний [9, 41, 76, 45, 159, 168]. Важным механизмом иммунорегуляции при беременности является активация Т-лимфоцитов, изменение характера их дифференцировки, продукции цитокинов и цитолитических молекул. Как известно, Т-клеточный гомеостаз в организме определяется балансом между процессами образования лимфоидных клеток и их гибели [94]. Основным источником Т-клеток является тимус, который играет ключевую роль в установлении и поддержании периферического Тклеточного пула [161]. Дифференцирующиеся в тимусе Т-клетки являются наивными, так как ранее не вступали в контакт с чужеродными антигенами [129, 34]. Формирующиеся в тимусе Т-клетки проходят процессы позитивной и негативной селекции, и поступают в периферический кровоток, обладая потенциальной способностью взаимодействовать с конкретным антигеном [197, 200]. Известно, что у взрослых людей наивные Т-лимфоциты пролиферируют с небольшой интенсивностью, делению на периферии подвергается только около 1% наивных CD4+ и CD8+ клеток [199]. Однако при некоторых патологических состояниях механизмы пополнения наивных Т-клеток отличаются от таковых в норме [1]. Так, при многих аутоиммунных заболеваниях, лимфомах, вируснобактериальных процессах, наблюдается изменение показателей Т-клеточного гомеостаза (общего количества лимфоцитов, соотношения CD4+/CD8+, CD45RA+/CD45RO+ лимфоцитов и др.) [1]. Иммунная система матери во время беременности также подвергается воздействию целого ряда факторов [184, 9, 33], что может определять включение иных механизмов поддержания Т-клеточного гомеостаза при данном физиологическом состоянии. Во многих работах указывается, что беременность сопровождается атрофией тимуса, выраженной в снижении его массы и клеточности, главным образом за счет атрофии коркового слоя и истощения популяции кортикальных тимоцитов [210, 43, 84]. Но это не 20 вызывает изменений в абсолютном содержании периферических лимфоцитов на всем протяжении гестации [38]. Предполагается, что во время беременности механизмом компенсации частичного подавления тимического пути развития лимфоцитов является процесс экстратимической дифференцировки Т-клеток [33, 87]. Так в работах ряда авторов было показано, что экстратимическая дифференцировка лимфоцитов во время беременности может проходить в лимфатических узлах, дренирующих матку, в децидуальной оболочке матки и в печени [35, 42]. Согласно данным литературы, Т-клетки экстратимического происхождения немногочисленны особенно в детском возрасте, когда в тимусе еще не происходит возрастная инволюция. Однако по мере старения организма количество таких экстратимически клеток возрастает [43]. дифференцированных Показано, Т-клеток что количество увеличивается при аутоиммунных заболеваниях, стрессе и во время беременности [43]. Ряд исследователей считают, что экстратимическая дифференцировка во время неосложненной беременности может индуцироваться эстрогенами плаценты и активацией симпатических нервов [81, 88, 143]. Кроме того, на процесс внетимической дифференцировки Т-лимфоцитов могут оказывать влияние цитокины плаценты и децидуальной оболочки беременной матки, в частности OSM (онкостатин М), концентрация которого в сыворотке беременных женщин значительно выше по сравнению с аналогичным показателем небеременных женщин [36, 37]. Наряду с усилением экстратимического пути дифференцировки, постоянный уровень Т-лимфоцитов при различных состояниях, связанных с нарушением тимической дифференцировки, гомеостатической пролиферацией наивных Гомеостатическая пролиферация клеток может клеток на реализуется компенсироваться периферии при помощи [126]. как гуморальных, так и контактных механизмов [39]. Основную роль в поддержании наивных Т-клеток играет IL-7. По литературным данным известно, что IL-7 в небольших количествах продуцируется стромальными клетками костного мозга, 21 эпителием тимуса, кератиноцитами и клетками фетальной печени [11]. Показано, что при полном отсутствии этого цитокина Т-клетки погибают в течение 2-4 недель. Предполагают, что в организме человека существует гомеостатический механизм регуляции числа Т-лимфоцитов на периферии, построенный по принципу обратной связи [11]. Однако данный механизм поддержания пула Тлимфоцитов при беременности не исследовался. Несмотря на то, что важная роль тимуса как центрального органа иммунной системы и Т-клеточной дифференцировки, установлена уже давно, до недавнего времени изучение функции тимуса было затруднено из-за отсутствия прямых методов исследования. В настоящее время для изучения функциональной активности тимуса применяют метод определения в лимфоцитах колец реаранжировки генов α-цепи антигенраспознающего рецептора или TREC (T-cell receptor rearrangement excision circles). Измерение количества TREC методом полимеразной цепной реакции позволяет выявить клетки, недавно вышедшие из тимуса, и, таким образом, оценить его функциональную активность тимуса [65, 186]. Считается, что содержание TREC можно оценивать преимущественно как показатель Т-лимфопоэтической функции тимуса [39]. TREC формируется при перестройке генов Т-клеточного рецептора в тимоцитах, при этом образуется последовательность нехромосомной кольцевой ДНК, которая присутствует только в наивных Т-лимфоцитах и в последующем не реплицируется при их митозе и в процессе деления клетки переходит лишь к одной из дочерних клеток [65, 186]. В случае внетимусного созревания Тлимфоцитов, TREC в клетках не определяется [65]. Наиболее высокое содержание TREC характерно для недавних эмигрантов из тимуса [6]. Напротив, Т-клетки памяти, участвовавшие в иммунном ответе, т.е. ранее отвечавшие пролиферацией на действие антигена, практически лишены TREC [6]. Следовательно, уровень TREC в Т-лимфоцитах периферической крови показывает интенсивность двух процессов – эмиграции Т-клеток из тимуса (чем она выше, тем больше TREC определяется в Т-клетках) и уровня пролиферации в 22 периферическом отделе иммунной системы (она снижает содержание TREC в Тклетках) [6]. В литературе представлены работы о снижении уровня TREC при различных патологических состояниях, таких, как первичный Т-клеточный иммунодефицит, вариабельный неклассифицируемый иммунодефицит, кожная Тклеточная лимфома, ревматоидный артрит, рассеянный склероз [160, 54, 78, 188, 104]. При ВИЧ-инфекции на ранней стадии наблюдается увеличение количества TREC в CD4+ Т-клетках, что обусловлено как увеличением гибели зрелых CD4+ Т-клеток, так и большей по сравнению со здоровыми донорами эмиграцией клеток из тимуса [75]. На поздней стадии ВИЧ-инфекции уровень TREC снижается, что может быть связано со снижением тимопоэза вследствие дефектов костномозговых предшественников лимфоидной линии [189], однако после успешного завершения противовирусной терапии оно способно восстановливаться до нормальных значений [190, 89]. Также имеются данные о снижении уровня TREC в периферической крови под влиянием сублингвальной и подкожной аллерген-специфической терапии больных с аллергией к клещам Dermatophagoides pteronyssinus [185]. Кроме того, определение экспрессии ДНК TREC используется для оценки интенсивности тимопоэза в поддержании Тклеточной популяции на периферии после аллогенной трансплантации костного мозга или стволовых кроветворных клеток [51]. Показано, что как у детей, так и у взрослых, количество TREC достигает границы нормы примерно спустя 6 месяцев после трансплантации [156, 199]. При полном удалении тимуса наблюдается обратная ситуация. Так по данным литературы, TREC могут определяться в крови до десяти лет после перенесенной тимэктомии [53, 198]. Это совпадает с данными, полученными на обезьянах, в течение года после перенесенной операции количество TREC снижалось примерно на один порядок [112]. Предполагают, что признаки активности тимуса после полного удаления этого органа могут быть обусловлены функционированием дополнительной тимусной ткани – так называемого 23 «шейного тимуса» - эктопической ткани тимуса в шейном отделе позвоночника [170]. Однако при различных физиологических состояниях характер экспрессии TREC остается мало изученным. Известно, что с возрастом происходит инволюция тимуса и уменьшается количество островков, где происходит процесс тимопоэза [210, 43, 84]. Это, в свою очередь, сказывается на количестве наивных Т-клеток, выходящих из тимуса и соответственно на концентрации TREC, которая уменьшается с возрастом, что свидетельствует о снижении функциональной активности тимуса [65, 140, 8]. Особенно быстрое снижение уровня TREC регистрируется впервые 10 лет жизни человека, далее этот процесс замедляется, но неуклонно прогрессирует в каждом последующем десятилетии [6]. Это позволяет предположить, что и при беременности, которая сопровождается транзиторной атрофией тимуса, должен изменяться уровень экспрессии TREC периферическими лимфоцитами. Однако данных об изменении количества TREC при беременности крайне малочисленны. В литературе имеется лишь одна работа о снижении уровня TREC у беременных женщин во 2 триместре гестации относительно показателей у небеременных женщин [100]. Кроме того, в настоящее время наряду с исследованием уровня экспрессии TREC лимфоцитами, в качестве маркера функционирования тимуса предлагается рассматривать молекулу CD31 [129]. Молекула CD31, известная также как PECAM-1, относится к адгезионным молекулам межклеточного взаимодействия семейства Ig-подобных белков и представляет собой одноцепочечную молекулу, содержащую 6 Ig-подобных внеклеточных доменов, короткий трансмембранный сегмент и хвост, погруженный в цитоплазму [34]. Предпологается, что CD31 функционирует как молекула клеточной адгезии за счет наличия Ig-подобных доменов и их высокой плотности в эндотелиальных межклеточных пространствах [34]. Экспериментальные исследования выявили, что моноклональные антитела, специфичные к CD31, блокируют миграцию моноцитов и нейтрофилов [150]. Однако, в противоположность этому, исследования in vitro [181] и in vivo [44] 24 показали, что наличие экспрессии CD31 на лимфоцитах отрицательно коррелирует с их миграцией. CD31 экспрессируется на поверхности наивных Т-лимфоцитов, недавних выходцев из тимуса, а внетимическое созревание наивных Т-лимфоцитов совпадает с прогрессирующим уменьшением экспрессии CD31 [202]. Дальнейшие исследования ряда авторов показали, что у взрослых людей периферические Тклетки в основном не экспрессируют CD31, причем это относится, главным образом, к клеткам памяти [64]. Более того, утрата молекулы CD31 наблюдалась при активации и дифференцировке Т-лимфоцитов [60], особенно этим отличались CD4+ T-клетки [154]. Однако, механизм, лежащий в основе потере CD31 с поверхности T-клеток, в настоящее время не известен. Доказательством того, что молекулу CD31 возможно использовать в качестве прямого маркера для характеристики активности тимуса человека, является то, что после аутологичной трансплантации стволовых клеток практически все вновь появившиеся наивные CD4+ Т-клетки экспрессировали на своей поверхности CD31 [83]. Известно, что у человека доля CD31-позитивных CD4+ и CD8+ лимфоцитов коррелирует с объемом тимуса, уровнем TREC и снижается с возрастом [61]. На основании всех этих данных в настоящее время предлагается выделять CD31+ thymic и CD31- central наивные Т-лимфоциты [121], что позволяет идентифицировать наивные клетки тимического происхождения. Однако данные об особенностях содержания CD31+ thymic и CD31- central наивных Т-лимфоцитов при беременности отсутствуют. Достаточная продолжительность непосредственного контакта материнских лимфоцитов с разнообразными антигенами плода во время гестационного процесса позволяет «иммунологической предположить памяти», возможность сопровождающейся формирования изменением процесса дифференцировки лимфоцитов и формированием особых пулов клеток-памяти [18, 27, 66, 92, 113, 183, 184, 149, 167]. Развитие иммунологической памяти, которая формируется в ходе иммунного ответа на антиген, представляет очень важный феномен, поскольку способность формировать клетки памяти обеспечивает одно из наиболее кардинальных отличий адаптивного иммунитета 25 от врожденного иммунитета [39]. Кроме того, формирование клеток памяти обеспечивает вторичный иммунный ответ, который является более быстрым, мощным и результативным, чем первичный ответ [123, 124, 135, 179, 201]. Фактически клетки памяти обеспечивают собственно наличие иммунитета к конкретному антигену. Феномен иммунологической памяти является одной из самых изучаемых проблем фундаментальной иммунологии в последнее десятилетие. Однако основные исследования этого вопроса проводились в области инфекционной иммунологии [40, 82, 105, 109, 123, 124, 174], онкологии [86, 128] и при аутоиммунной патологии, в частности при ревматоидном артрите [77]. Исследования последних лет существенно поменяли наше представление о процессе дифференцировки Т-лимфоцитов. Клетки памяти образуются в ходе иммунного ответа, и проходят ряд определенных стадий, характеризующихся своими особенностями [123, 124, 135, 179, 201]. В настоящий момент предложены различные модели формирования Т-клеток памяти, по-разному трактующие этапность их дифференцировки [129, 130, 135, 136, 137]. Линейный путь дифференцировки клеток памяти долгое время являлся наиболее популярной моделью, предполагающей последовательное развитие клеток памяти по схеме: наивные клетки → коротко живущие эффекторные клетки → клетки памяти [192]. При этом предполагается, что развитие клеток памяти происходит либо после удаления АГ, либо при значительном снижении его концентрации [135]. Вариантом линейной модели является гипотеза снижения эффекторного потенциала [123, 179], предполагающая, что эффекторные клетки утрачивают свои функциональные свойства и быстро уходят в апоптоз после длительной антигенной стимуляции, при этом количество Т-клеток памяти уменьшается [123]. Однако спустя некоторое время после элиминации антигена эффекторные клетки могут переходить в клетки памяти и восстанавливать свою функцию [123, 179]. В более поздних работах рассматривается возможность параллельного формирования пула коротко живущих эффекторных клеток и клеток памяти из наивных клеток, или формирования клеток памяти и из пула эффекторных клеток 26 и непосредственно из наивных лимфоцитов после антигенной стимуляции [196,119,122]. По литературным данным, процесс формирования клеток памяти запускается в течение 3-5 дней после контакта с антигеном [73, 109, 157, 171]. После взаимодействия со специфическим антигеном наивные лимфоциты дифференцируются в короткоживущие эффекторные клетки и клетки памяти [47, 192]. Многие исследователи считают, что переход клеток на различные этапы дифференцировки ассоциируется с изменением экспрессии изоформ молекул CD45 и наличием молекул L-селектина (CD62L) [95, 171]. Формирующиеся пулы клеток памяти, имеют отличный от наивных клеток фенотип, и характеризуются различной экспрессией молекул CD44, CD45RA, CD45RO, CD62L, СD27, CD28, CD11b, CD11a, CD49d, FasL, хемокиновых рецепторов и продукцией ряда цитокинов [47, 192, 95, 77, 171, 201, 204]. Благодаря этим молекулам определяются путь миграции лимфоцитов во вторичные лимфоидные органы или в ткани, проявление их функциональных свойств и устойчивость к апоптозу [47, 131]. В соответствии с экспрессией изоформ CD45 молекул, наличием CD62L и CCR7 молекул принято выделять пулы наивных клеток (Tn), центральных клеток памяти (Tcm), претерминально-дифференцированных эффекторных клеток памяти (Tem) и терминально-дифференцированных клеток памяти (Temra), различающиеся фенотипически и обладающие различными эффекторными функциями [47, 171, 95, 204]. Пул наивных клеток имеет фенотип CD45RA+CD45RО-CD62L+CCR7+ CD27+CD28+ [101]. Эти лимфоциты не примированы в отношении конкретного антигена и не обладают способностью к выполнению эффекторной функции [39]. У человека наивные клетки несут на своей поверхности молекулы CD62L (Lселектин) и CCR7, что позволяет им мигрировать преимущественно во вторичные лимфоидные органы, такие как лимфатические узлы, пейеровы бляшки и селезенку [131]. Эти органы представляют места, где дендритные клетки, нагруженные АГ, представляют комплекс АГ-МНС наивным Т-клеткам и 27 обеспечивают соответствующие ко-стимуляторные сигналы для инициации иммунного ответа, при этом важная костимулирующая роль принадлежит молекуле CD28, через которую в Т-лимфоцит проходит дополнительный импульс, приводящий к усилению синтеза IL-2, активации генов выживания и запуску пролиферации Т-клетки [131]. Наивные Т-лимфоциты, циркулируя на периферии и не контактируя с чужеродными антигенами, могут существовать многие месяцы, и даже годы [39, 101]. Данные о содержании наивных клеток в различных популяциях периферических Т-лимфоцитов неоднозначны. Так, у взрослых доноров уровень наивных клеток в популяции периферических CD4+ лимфоцитов колебался в пределах 30-50% [145], в популяции периферических CD8+ цитотоксических лимфоцитов – 12,9-36,3% [80], в популяции Treg – 20-50% [67]. Известно, что антигенная стимуляция запускает сложный многоступенчатый процесс дифференцировки клеток адаптивного иммунного ответа [95]. После контакта со специфическим антигеном наивные лимфоциты дифференцируются в эффекторные клетки, а часть из них приобретают свойства клеток памяти [95, 213, 39]. При этом наивные Т-клетки переключаются на синтез низкомолекулярной изоформы молекулы CD45RO. Как показали исследования Hamann D. с соавторами (1996 год), переключение фенотипа CD45RA+ на CD45RO+ проходит через стадию двойных позитивных CD45RA+CD45RO+ клеток [101]. Биологический смысл изменений структуры молекулы CD45 неясен. Предполагают, что формирование иммунного синапса с участием клеток, несущих укороченный вариант молекулы CD45, облегчается благодаря устранению помех для взаимодействия клеток, создаваемых протяженной молекулой CD45RA [39]. Помимо этого показано, что CD45RA+ Т-клетки при действии активирующих сигналов более подвержены апоптозу [39]. Т-клетки памяти дифференцируются из активированных Т-лимфоцитов (CD4+ и CD8+) в Т-зонах лимфоидных органов под действием антигена, презентируемого им дендритными клетками [39]. Развитие CD8+ Т-клеток памяти нуждается в помощи CD4+ Т-клеток [39]. 28 Принято центральные считать, клетки что после памяти, контакта с имеющие антигеном фенотип формируются CD45RA- CD45RO+CD62L+CCR7+CD28+CD11a+/CD18+CD11b+/CD18+CD49d+, которые в этом своем состоянии не проявляют эффекторные функции, но могут быстро отвечать на антиген при повторной стимуляции [95, 192, 184, 77, 86]. Благодаря экспрессии на своей поверхности CD62L и CCR7, Tcm также как и Tn преимущественно мигрируют во вторичные лимфоидные органы и костный мозг кроме того, осуществляют миграцию через активированный эндотелий в ткани [131, 204]. Установлено, что центральные клетки памяти имеют гипоацетилированные гены цитокинов и не имеют или имеют низкую эффекторную функцию, но эффективно дифференцируются в Th1 или Th2 эффекторные клетки после стимуляции TCR в присутствии IL-12 или IL-4 [141, 201, 171]. Цитотоксические Т-лимфоциты на этой стадии дифференцировки после стимуляции продуцируют в больших количествах IFNγ, TNFα, перфорин и гранзимы [95]. Центральные клетки памяти в популяции Т-хелперов продуцируют комплекс цитокинов, характерных либо для Th1 типа, либо для Th2 типа иммунного ответа или иных субпопуляций Т-хелперов [77, 101]. Однако в настоящее время показано, что Т-хелперы обладают свойством пластичности, заключающееся в том, что под воздействием ряда факторов окружающей среды при повторной стимуляции специфическим антигеном центральные CD4+ клетки памяти сохраняют способность реагировать на сигналы окружающей среды и ситуационно экспрессировать соответствующие, атипичные гены цитокинов противоположных линий [130]. При вторичном иммунном ответе, Tcm клетки генерируют новые волны эффекторных клеток в антиген-дренирующих лимфатических узлах [132, 171]. По завершению иммунного ответа часть пула Tcm гибнет, уходя в апоптоз, т.к. эти клетки не отличаются высоким уровнем экспрессии CD95L молекул [215]. Помимо этого, центральные клетки памяти обладают высоким пролиферативным потенциалом и способностью к самообновлению [39, 213], что позволяет части из 29 них продолжать циркулировать в периферической крови, обеспечивая проявление феномена иммунологической памяти на системном уровне [97, 134]. Другая фракция клеток памяти получила название эффекторных клеток памяти. Эти лимфоциты проходят в своем развитии через стадии претерминально-дифференцированных эффекторных клеток памяти (Tem) с фенотипом CD45RA-CD45RO+CD62L-CCR7-СD28+/- дифференцированных клеток памяти (Temra), и терминально- имеющих фенотип CD45RA+CD45RO-CD62L-CCR7-CD28-CD11a+CD11b+CD49d+FasL+ [192, 95, 77, 86, 171, 201]. Тem и Temra лимфоциты появляются на 5 день после антигенной стимуляции, локализуются преимущественно в нелимфоидных органах и в слизистых [30, 131, 174]. В отличие от Tcm, претерминально-дифференцированные и терминальнодифференцированные клетки памяти не экспрессируют на своей поверхности CD62L и CCR7, что обуславливает значительное ослабление их способности эффективно рециркулировать через лимфатические узлы и пейеровы бляшки, мигрировать в Т-зоны вторичных лимфоидных органов [131, 87]. Вместо этого, оба этих клеточных типа мигрируют в периферические и нелимфоидные ткани, где они могут обеспечивать эффективную цитотоксическую активность [131]. Большинство Tem и Temra проявляют значительную миграционную избирательность для определенных тканей, таких как кишечник или кожа, в зависимости от набора рецепторов и места поступления антигена [165]. Считают, что эти субпопуляции демонстрирующими являются тропизм к единственными периферическим клеточными тканям, типами, зависящий от происхождения презентируемого АГ [85, 142]. Все это обеспечивает быстрое развитие вторичного иммунного ответа эффекторными клетками памяти в периферических тканях [132, 171]. Пул Тem клеток в естественных условиях имеет поляризованные ацетилированные паттерны генов цитокинов и быстро производят большие количества цитокинов и ряда функциональных молекул при антигенной стимуляции [86, 77, 141]. 30 На стадии Temra лимфоциты устойчивы к апоптозу и являются наиболее мощными потенциальными продуцентами цитокинов при повторном контакте с антигеном [97, 134, 192]. Кроме того, благодаря высокому уровню экспрессии CD95L молекул пул терминально-дифференцированных клеток представляют наиболее длительно живущие клетки-памяти, которые могут циркулировать в кровотоке на протяжении всей жизни человека [95, 205]. Как и все клетки памяти Temra клетки способны к пролиферации при непосредственном контакте с антигеном без этапа его представления дендритными клетками и макрофагами [158]. Показано, что аллогенная стимуляция in vitro приводит к изменению дифференцировки как CD4+, так и CD8+ лимфоцитов аналогично изменениям при противовирусном ответе [82]. Однако характер дифференцировки Т-хелперов и цитотоксических Тлимфоцитов в динамике неосложненной беременности остается не изученным. Ранее исследования содержания наивных клеток и клеток памяти в периферической крови и плаценте у беременных женщин с гипертензивными расстройствами проводились по экспрессии CD45RA+ и CD45RO+ молекул. Имеются лишь единичные данные об общем содержании цитотоксических Тлимфоцитов и Т-хелперов в крови и в плаценте при неосложненном течении беременности [9]. Ряд авторов утверждают, что для неосложненной беременности в 3 триместре гестации характерно преобладание в периферической крови CD4+CD45RA+, тогда как для гестоза характерно увеличение содержания CD4+CD45RO+ [111]. По данным Сотниковой Н.Ю. с соавт. при гестозе в периферической крови женщины уровень CD45RO+ клеток снижался [9]. В некоторых работах было установлено увеличение относительного содержания периферических 45RO+ лимфоцитов в популяции Т-хелперов при преэклампсии [45, 139]. В дальнейших исследованиях дифференцировка лимфоцитов с образованием клеток памяти в популяциях CD4+ и CD8+ лимфоцитов изучались более подробно. В настоящее время, большинство работ по изучению характера 31 дифференцировки Т-лимфоцитов посвящены гипертензивным расстройствам во время беременности [4, 24, 17]. Так, в работе Гасановой Д.Д. (2012) в периферической крови беременных женщин с гипертензивными расстройствами в популяции Т-хелперов отмечалось увеличение доли терминально- дифференцированных клеток памяти с фенотипом CD45RA+CD62L- [7], которые способны быстро активироваться и осуществлять эффекторную функцию непосредственно при контакте с антигеном без длительного процесса его презентации [171, 95, 205]. Одновременно в работе Лазаревой Ю.Ю. (2013) выявлено также увеличение в крови женщин с гипертензивными расстройствами во время беременности терминально-дифференцированных клеток памяти в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов [17]. Цитокины традиционно были предметом особого внимания со стороны исследователей, занимающихся проблемами иммунологии репродукции. Практически вся последняя декада была посвящена гипотезе о ведущей роли цитокинов в регуляции иммунного ответа матери во время беременности [9]. Показано, что продукция цитокинов с наступлением беременности значительно меняется [22, 9, 184, 25]. Однако, несмотря на обилие работ в этой области, механизмы поддержания цитокинового баланса во время беременности остаются до конца нераскрытыми. Рядом авторов было показано, что дифференцировка клеток памяти происходит при контакте с антигеном и контролируется рядом цитокинов, таких как IL-2, IL-4 и IL-15 [95, 74, 106, 108, 137, 116], которые способствуют выживанию клеток и медленной гомеостатической пролиферации [180]. Так по литературным данным показано, что IL-7 и IL-15 регулирует выживаемость и самообновление в отсутствие антигена мышиных CD8+ Т клеток памяти [34, 155], тогда как наивные клетки и CD4+ клетки памяти требуют IL-7 и TCR лигандов [172, 173], но не отвечают на IL-15 [155]. Другие авторы утверждают что, человеческие CD4+ Т-клетки памяти могут пролиферировать в ответ на IL-15 TCR-независимым образом и с медленной кинетикой [125], при этом отмечая разную роль IL-15 в поддержании гомеостаза CD4+ Т-клеток памяти у человека и 32 мышей. Это связано с тем, что цитокины участвуют в осуществлении практически всех этапов гестационного процесса [9]. Особого внимания при беременности заслуживают IL-2 и IL-15, которые относятся к цитокинам, регулирующим клеточный иммунитет [11]. Рецепторы этих цитокинов имеют общую β-цепь (CD122), однако, как, показывают проведенные исследования, их присутствие в микроокружении Т-лимфоцитов в результате активации приводит к формированию различных субпопуляций: присутствие IL-2 приводит к преимущественному формированию эффекторных Т-клеток с фенотипом CD62L low, а в присутствии IL-15 формируется пул CD62L hi Т-лимфоцитов [72]. Видимо, направленность дифференцировки Т-лимфоцитов определяется силой сигнала, проведенного через молекулу CD122: слабый сигнал приводит к образованию центральных клеток памяти, а сильный к образованию эффекторных клеток [193]. Однако, несмотря на то, что IL-15 способствует дифференцировке Т-клеток в долгоживущие клетки памяти, его присутствие необходимо и для выживания короткоживущих эффекторных клеток [115]. Основными продуцентами IL-2 являются Т-хелперы, имеющие функциональные признаки Т-хелперов 1-го типа. Кроме того, синтезировать IL-2 способны также дендритные клетки [114]. В отличие от IL-2, IL-15 синтезируется различными типами клеток, в частности, моноцитами/макрофагами, эпителиальными клетками [11]. IL-2 представляет собой секреторный цитокин, тогда как IL-15 находится в основном в виде мембранной формы [208]. IL-2 и IL-15 стимулируют пролиферацию активированных антигеном Т-лимфоцитов. В дополнение к этому IL-15 может поддерживать пролиферацию цитотоксических Т-клеток памяти, но не наивных Т-лимфоцитов и увеличивает жизнеспособность Т-хелперов [206]. Однако в настоящее время имеются лишь единичные работы об изменении уровня IL-2 и IL-15 при патологии беременности [13, 22, 175]. Так, ранее было показано, что при угрозе прерывания беременности отмечалось увеличение содержания IL-2 в сыворотке крови по сравнению с показателями группы женщин с неосложненным течением беременности [13]. Другие исследователи отмечали снижение сывороточного уровня IL-2 при угрозе прерывания беременности в 1 33 триместре гестации [22]. Помимо этого, в литературе имеются данные о более высоком значении уровня IL-15 у беременных женщин 3 триместра гестации с развившейся преэклампсией по сравнению с таковым у беременных женщин с нормальным артериальным давлением [175]. Таким образом, анализ литературы показал, что в настоящее время полностью отсутствуют цитотоксических дифференцировки, исследования Т-лимфоцитов, и проявлении о содержании находящихся ими на Т-хелперов различных функциональной и этапах активности при неосложненной беременности в динамике гестационного процесса. В то же время изучение сложного каскада иммунологических событий, развивающихся в процессе гестационного процесса, и как показывают проведенные исследования, сопровождающиеся динамическим изменением клеточного профиля и цитокинового фона, будет способствовать углублению наших знаний о регуляции иммунного ответа при беременности и позволит уточнить патогенетические механизмы развития различной акушерско-гинекологической патологии. 34 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Организация работы и объем исследования Работа выполнена на базе Федерального государственного бюджетного учреждения “Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова” Министерства здравоохранения Российской Федерации (директор д.м.н. А.И. Малышкина). В работе проводилось лонгитудинальное обследование беременных женщин, вставших на диспансерный учет в территориальной женской консультации № 2 г. Иваново, в течение гестационного процесса в 1-3 триместрах. Лабораторные исследования проводились в лаборатории клинической иммунологии - зав. лабораторией заслуженный врач РФ, д.м.н., профессор Н.Ю. Сотникова. На каждую пациентку заполнялась специально разработанная “карта обследования беременной женщины”, в которую выкопировывались данные анамнеза, результаты исследований и наблюдений из индивидуальной карты беременной и родильницы, истории родов. Каждая женщина давала письменное информированное согласие на участие в исследованиях. Всего было обследовано: - 36 небеременных женщин (контрольная группа); - 85 беременных женщин (основная группа), обследованных лонгитудинально троекратно. При ретроспективном анализе в зависимости от последующего характера течения гестационного процесса среди женщин основной группы были выделены подгруппы женщин: 35 - с неосложненным течением беременности 1 триместра гестации (5-8 недель гестации) n=76; - с неосложненным течением беременности 2 триместра гестации (16-20 недель гестации) n=74; - с неосложненным течением беременности 3 триместра гестации (28-32 недели гестации) n=71; - с развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем (10-12 недель гестации) n=9. Контрольная группа представлена практически здоровыми женщинами фертильного возраста, с реализованной репродуктивной функцией. Отбор проводился во время планового профилактического осмотра. Осложнений беременности у женщин основной группы на всем протяжении гестационного процесса выявлено не было. Беременность у всех женщин с неосложненным течением гестационного процесса закончилась своевременными родами. Материалом для исследования служила периферическая венозная кровь из локтевой вены. Исследования были одобрены локальным этическим комитетом Федерального государственного бюджетного учреждения «Ивановский научноисследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова» Министерства здравоохранения Российской Федерации. 2.2. Иммунологические методы исследования - Получение сыворотки периферической крови Для исследования сывороточного содержания различных биологических продуктов кровь в количестве 1 мл отбирали в сухую центрифужную пробирку, оставляли на 10-15 мин до полного свертывания, сгусток крови осторожно обводили по стенке пробирки длинной иглой и центрифугировали при 1500 об/мин 10 мин. Отделившуюся от сгустка сыворотку аликвотами по 200 мкл 36 разливали в пробирки типа Эппендорф и хранили до проведения исследования в холодильнике при -200 С. При необходимости сыворотки хранили при -800С. - Выделение мононуклеарных клеток Для исследований методом проточной цитофлюориметрии и полимеразной цепной реакции в реальном масштабе времени (RT-PCR) кровь забирали в центрифужные пробирки, содержащие 2,7 % раствор ЭДТА из расчета 3 мл крови на 1 мл раствора ЭДТА. Выделение лимфоцитов из периферической крови осуществляли традиционным методом скоростного центрифугирования при 1500 об/мин в градиенте плотности фиколл-урографина (d-1,078) [59]. - Проточная цитофлюориметрия Поверхностный фенотип лимфоцитов и содержание клеток, внутриклеточно продуцирующих IL-4, IFNγ в популяции CD4+ лимфоцитов и Perforin и Granzyme B в популяции CD8+ лимфоцитов, определяли с помощью моноклональных антител (мАТ) методом проточной цитофлюориметрии на цитометре FACSCanto II с использованием программного обеспечения FACSDiva (Becton Dickinson, США). В качестве флюорохромных меток использовали флюоресцеин изотиоционат (FITC), фикоэритрин (РЕ), аллофикоцианин (APC) и перидининхлорофил протеин 5.5 (PerCP-Cy5.5). Фирма-производитель и клон используемых в исследовании мАТ указаны в таблице 2.2.1. Процедуру окрашивания и фиксации клеток проводили стандартным способом в соответствии с указаниями фирмы-разработчика. При проведении проточной цитофлюориметрии клетки использовали в конечной концентрации 1 х 106 кл/мл. К 50 мкл суспензии клеток в концентрации 1 х 106 кл/мл одновременно добавляли 20 мкл мАТ, меченных PerCP-Cy5.5, 20 мкл мАТ, меченных APC и 20 мкл мАТ, меченных FITC, инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут, затем клетки отмывали в 1 мл фосфатного буфера (PBS), содержащего 0,1% азид натрия, и фиксировали в соответствии со стандартной процедурой. Содержание клеток, внутриклеточно продуцирующих IL-4, IFNγ в популяции CD4+ лимфоцитов и Granzyme B, Perforin в популяции CD8+ 37 лимфоцитов, оценивали, используя процедуру внутриклеточного окрашивания клеток с применением коммерческого набора FIX & PERM cell permeabilization reagents (Invitrogen, США) для пермеабилизации клеточной мембраны. Таблица 2.2.1. Панель моноклональных антител, использованных в исследовании № п/п 1. 2. 3. 4. 5 6. 7. 8. мАТ Human CD8 RPA-T4 Human CD4 OKT4 Human CD45RA HI100 Human CD62L DREG56 Human CD31 WM59 Human IL-4 4D9 Human IFNγ 4S.B3 Human Granzyme B 9. 10. Клон GB11 Human Perforin G9 Mouse IgG1 - Изотип Mouse IgG1 Mouse IgG2b Mouse IgG2b Mouse IgG1 Mouse IgG1 Фирма- Флюорохром производитель ная метка eBioscience, США PerCP-Cy5.5 eBioscience, США PerCP-Cy5.5 eBioscience, США APC eBioscience, США FITC eBioscience, США PE-Cy7 Mouse Beckman Coulter, IgG1 Франция Mouse IgG1 Mouse IgG1 Mouse IgG2b РЕ eBioscience, США РЕ eBioscience, США PE eBioscience, США PE Mouse Becton Dickinson, IgG1 США FITC 38 11. Mouse IgG2a - Mouse Becton Dickinson, IgG2a США PE FITC – флюоресцеинизотиоцианат PE – фикоэритрин APC –аллофикоцианин PerCP-Cy5.5–перидинин-хлорофил протеин 5.5 При проведении процедуры внутриклеточного окрашивания клетки, предварительно меченные анти-CD4+, анти-CD8+, анти-CD62L+ и антиCD45RA+ мАТ, в соответствии со стандартным протоколом, сначала фиксировали в течение 15 мин в 100 l фиксирующего буфера А из набора FIX & PERM cell permeabilization reagents. Далее клетки инкубировали со 100 l пермеабилизирующего буфера В и с анти-IL4-мАТ, c анти-IFNγ-мАТ, с анти-GrB-мАТ, с анти-Perf-мАТ для внутриклеточного окрашивания. В дальнейшем клетки фиксировали в соответствии со стандартной процедурой и использовали для проведения цитометрического анализа. Для анализа неспецифического окрашивания использовали Simultest Control (мышиные IgG1-FITC + IgG2a-PE) ("Becton Dickinson", США). Для наложения оптимального окна дискриминации (гейта) для лимфоцитов на точечном графике прямого и бокового светорассеяния клетки метили анти-CD45-FITC и анти-CD14-PE мАТ ("Becton Dickinson", США). При анализе лимфоцитарный гейт включал не менее 95-98% клеток с фенотипом CD45+CD14-. В каждом образце анализировали не менее 10000 клеток. Анализ результатов проводили в программе "CELLQuest Pro” (Becton Dickinson, USA). -Определение уровня ДНК TREC методом RT-PCR Процедуру выделения ДНК из лимфоцитов проводили стандартным методом согласно инструкции с использованием комплекта реагентов для выделения нуклеиновых кислот «ПРОБА-НК-ПЛЮС» фирмы «ДНК-технология» (Россия). 39 Для определения экспрессии ДНК TREC в общей фракции периферических лимфоцитов использовали метод полимеразной цепной реакции (PCR) в масштабе реального времени. В работе использовали набор реагентов для определения гена TREC (ООО «Синтол», Россия), для определения гена 18s rRNA (Biosourse, США). Анализ производился на приборе iQCycler (Bio-Rad, США). При анализе данных использовали стандартный полуколичественный Ct-метод определения уровня экспрессии ДНК специфических генов. Для этого в каждом образце одновременно определялся пороговый цикл амплификации Ct для ДНК TREC и 18s rRNA, который использовался в качестве гена домашнего хозяйства. Затем уровень экспрессии ДНК TREC нормализовали относительно экспрессии ДНК 18s rRNA. Для этого рассчитывался показатель Ct по формуле: Ct=Ct-TREC - Ct-18s rRNA, где Ct TREC – цикл начала амплификации для гена TREC, Ct 18s rRNA – цикл начала амплификации для гена 18s rRNA. Для полуколичественной оценки результатов RT-PCR, уровень экспрессии ДНК TREC в группе беременных женщин нормализовали относительно соответствующего показателя в контрольной группе. Для этого рассчитывался коэффициент RQ (related quantity) по стандартной формуле [79]. RQ= 2^ (- Ct), где Ct = Ct беременные женщины- Ct контроль Таким образом, все результаты представлены как n-кратные различия между соответствующими показателями в группе беременных женщин и небеременных доноров. ПЦР ставили с использованием набора реагентов TaqMan Universal PCR Master Mix («Applied Biosystems», США) в объеме 25 мкл: 1 цикл - 50ºС 2 мин, 95ºС 10 мин; 45 циклов - 95ºС 15 сек, 60ºС 1 мин, использовали прибор “7300 Real-Time PCR System” («Applied Biosystems», США). -Определение содержания цитокинов методом ELISA 40 Содержание цитокинов в сыворотке периферической крови определяли методом ELISA на микропланшетном ридере Multiscan EX (Labsystems, Финляндия). Анализ и интерпретацию результатов осуществляли в соответствии с рекомендациями фирмы-разработчика. В таблице 2.2.2 представлена характеристика использовавшихся в работе тест-систем для проведения ELISA. Таблица 2.2.2 Характеристика тест-систем для ELISA, использованных в работе Исследуемый Фирма-производитель Чувствительность показатель системы IL-2 INVITROGEN, США от 4.0 пг/мл IL-15 INVITROGEN, США от 11 пг/мл 2.3. Статистическая обработка данных Статистическая обработка данных проводилась по общепринятым методам вариационной статистики после проверки рядов на нормальность распределения по критериям Колмагорова-Смирнова, Лиллифорса и Шапиро-Уилка [26]. В тех случаях, когда распределение значений показателей соответствовало нормальному, достоверность различий показателей в группах определялась по tкритерию Стьюдента. В тех случаях, когда распределение не соответствовало нормальному, использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Расчет нормативных центральных, показателей содержания претерминально-дифференцированных наивных и клеток, терминально- дифференцированных клеток памяти в популяциях CD4+ и CD8+ лимфоцитов периферической крови проводился на основе 95% доверительного интервала. Статистический анализ осуществлялся в пакете прикладных лицензионных программ “Statistica 6.0.”, “Microsoft Office 2007”, “MedCalc”. Общее количество проведенных лабораторных исследований составило 3312 (табл. 2.3.1.). 41 Таблица 2.3.1. Количество проведенных исследований Метод исследования Количество исследований Проточная цитометрия 2998 ПЦР в масштабе реального времени 78 ИФА 236 Итого: 3312 42 Глава 3. ХАРАКТЕРИСТИКА ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ Т-ЛИМФОЦИТОВ В ДИНАМИКЕ НЕОСЛОЖНЕННОЙ БЕРЕМЕННОСТИ И У ЖЕНЩИН С РАЗВИВШИМСЯ ВПОСЛЕДСТВИИ САМОПРОИЗВОЛЬНЫМ ВЫКИДЫШЕМ 3.1. Особенности внетимической дифференцировки наивных Т-лимфоцитов в популяциях Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов периферической крови при неосложненной беременности в динамике гестационного процесса Тимус является основным источником наивных Т-клеток и играет ключевую роль в установлении и поддержании периферического Т-клеточного пула [161]. Известно, что беременность сопровождается инволюцией тимуса, выраженной в снижении его массы и клеточности, в основном за счет атрофии коркового слоя и истощения популяции кортикальных тимоцитов. Но это не вызывает изменений в абсолютном содержании периферических лимфоцитов на всем протяжении гестации [38]. Можно предположить, что во время беременности механизмом компенсации частичного подавления тимического пути развития лимфоцитов является процесс активации экстратимической дифференцировки Т-клеток. Учитывая эти данные, мы провели изучение особенностей экспрессии ДНК TREC на поверхности лимфоцитов периферической крови, что позволяет выявить клетки, недавно вышедшие из тимуса, и, таким образом, оценить функциональную активность тимуса [65, 186]. Помимо этого, в нашей работе мы оценивали относительное содержание молекулы CD31, которая является маркером недавно мигрировавших из тимуса клеток, и также позволяют оценить функцию тимуса [129]. Как известно, только CD31+ лимфоциты в популяции наивных Т-клеток являются истинными ранними выходцами из тимуса, в то 43 время как при внетимической дифференцировке молекулы CD31 не экспрессируются наивными Т-лимфоцитами периферической крови [202]. На основании этих данных в настоящее время выделяют две фракции, получившие название тимических и центральных наивных Т-лимфоцитов – CD31+ thymic и CD31- central [121]. Результаты, характеризующие особенности содержания наивных клеток в популяции периферических Т-хелперов в динамике неосложненной беременности, приведены на рисунке 3.1.1. Нами было установлено, что в периферической крови женщин с неосложненным течением беременности, содержание наивных клеток в популяции периферических CD4+ лимфоцитов, начиная уже с 1 триместра беременности, было достоверно выше по сравнению с аналогичным показателем группы контроля (34,46±1,55%) и составило 38,98±1,58% (p<0,05). Максимальное повышение уровня Tn в популяции Т-хелперов периферической крови нами отмечалось в группе женщин с неосложненным течением беременности 2 триместра гестации относительно показателя небеременных женщин. Уровень наивных клеток во 2 триместре неосложненной беременности составил 42,07±2,36% (p<0,01). Достоверной разницы в содержании наивных клеток в популяции периферических CD4+ лимфоцитов во 2 триместре гестации в группе женщин с неосложненным течением беременности по сравнению с аналогичным показателем группы беременных женщин 1 триместра гестации нами выявлено не было (p>0,05). В 3 триместре неосложненной беременности уровень клеток с фенотипом CD45RA+CD62L+ в популяции периферических Т-хелперов оставался достоверно более высоким по сравнению с аналогичным показателем группы доноров и составил 39,74±1,50% (p<0,05). Относительно 2 триместра гестации достоверных различий в содержании Tn в популяции CD4+ лимфоцитов периферической крови в 3 триместре беременности выявлено не было (p>0,05) (рис. 3.1.1.). 44 50 % *** * 40 * 30 20 10 0 доноры 1 триместр 2 триместр 3 триместр Рис. 3.1.1. Содержание наивных клеток в популяции периферических CD4+ лимфоцитов в динамике неосложненной беременности * - коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с группой небеременных доноров (*- p<0,05;*** - p<0,01). Результаты, характеризующие особенности содержания наивных клеток в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов в динамике гестационного процесса, приведены на рисунке 3.1.2. Анализ данных в содержание наивных клеток в 1 триместре неосложненной беременности в популяции CD8+ лимфоцитов периферической крови выявил, что данный показатель был достоверно выше аналогичного параметра группы контроля (33,19±1,49%) и составил 38,18±1,97% (p<0,05). В группе женщин с неосложненным течением беременности 2 триместра гестации в популяции периферических ЦТЛ нами также отмечалось достоверное повышение содержания наивных клеток по сравнению с аналогичным показателем группы небеременных женщин, которое составило 39,93±2,48 (p<0,05), при отсутствии достоверных различий по сравнению с аналогичным параметром группы женщин 1 триместра неосложненной беременности (p>0,05). Содержание клеток с фенотипом CD45RA+CD62L+ в 3 триместре неосложненной беременности составило 37,55±2,20 и не имело достоверных различий по сравнению, как с 45 группой доноров, так и с группой беременных женщин 2 триместра гестации (p>0,05 в обоих случаях) (рис. 3.1.2.). 50 % * * 40 30 20 10 0 доноры 1 триместр 2 триместр 3 триместр Рис. 3.1.2. Содержание наивных клеток в популяции периферических CD8+ лимфоцитов в динамике неосложненной беременности * - коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с группой небеременных доноров (*- p<0,05). Данные, характеризующие содержание CD31+thymic и CD31-central клеток в популяции наивных Т-хелперов у женщин с неосложненным течением беременности в динамике гестационного процесса представлены в таблице 3.1.1. Проведенный статистический анализ содержания наивных клеток с фенотипом ранних эмигрантов из тимуса (CD31+thymic) в популяции периферических CD4+ лимфоцитов выявил достоверное снижение данного показателя в равной степени во все сроки неосложненной беременности по сравнению с аналогичным параметром группы небеременных доноров (p<0,001 в 1 триместре, p<0,01 во 2 и 3 триместрах). Содержание CD31+thymic в пуле наивных Т-хелперов в 1, 2 и 3 триместрах беременности достоверно не различалось между собой (р>0,05 во всех случаях) (таблица 3.1.1.). 46 Таблица 3.1.1. Относительное содержание CD31+ thymic и CD31- central клеток периферической крови в популяции наивных CD4+ лимфоцитов в динамике неосложненной беременности CD4+CD45RA+CD62L+, % (n=14) Группы обследуемых женщин CD31+ thymic CD31- central 56,52±2,59 43,48±2,59 1 триместр беременности 43,61±1,89**** 56,39±1,89**** 2 триместр беременности 41,76±3,28*** 58,24±3,28*** 3 триместр беременности 43,77±2,98*** 56,23±2,98*** Небеременные доноры В скобках дано число проведенных исследований. *- коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с группой небеременных женщин (*** - p<0,01;**** - p<0,001). Уровень CD31-central клеток в популяции периферических наивных CD4+ лимфоцитов на протяжении всей беременности превышал аналогичный показатель в группе небеременных доноров (p<0,001 в 1 триместре, p<0,01 во 2 и 3 триместрах). Нами не было выявлено статистически значимых различий показателя CD31-central клеток в зависимости от срока беременности в 1, 2 и 3 триместрах гестации (р>0,05 во всех случаях) (таблица 3.1.1.). Данные, характеризующие содержание CD31+thymic и CD31-central клеток в популяции наивных цитотоксических Т-лимфоцитов у женщин с неосложненным течением беременности в динамике гестационного процесса представлены в таблице 3.1.2. В популяции периферических наивных CD8+ лимфоцитов в группе женщин с неосложненным течением беременности нами отмечалось снижение количества CD31+thymic клеток на протяжении всего гестационного процесса по сравнению с аналогичным показателем группы небеременных доноров (p<0,001 во всех случаях). 47 Таблица 3.1.2. Относительное содержание CD31+thymic и CD31-central клеток периферической крови в популяции наивных CD8+ лимфоцитов в динамике неосложненной беременности CD8+CD45RA+CD62L+, % (n=14) Группы обследуемых женщин CD31+ thymic CD31- central 76,60±1,05 23,40±1,05 1 триместр беременности 65,58±2,56**** 34,42±2,56**** 2 триместр беременности 57,48±1,92**** хх 42,52±1,92**** хх 3 триместр беременности 58,21±2,58**** 41,79±2,58**** Небеременные доноры В скобках дано число проведенных исследований. *- коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с группой небеременных доноров (**** - p<0,001); х - коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с группой беременных женщин 1триместра гестации (хх - p<0,02). Кроме того, во 2 триместре неосложненной беременности в популяции периферических наивных ЦТЛ достоверно снижался уровень CD31+thymic клеток по сравнению с соответствующим показателем женщин 1 триместра неосложненной беременности (p<0,02). В группе женщин с неосложненным течением беременности 3 триместра гестации нами не было выявлено достоверной разницы в содержании CD31+thymic клеток в пуле наивных цитотоксических Т-лимфоцитов по сравнению с аналогичным показателем группы женщин 2 триместра неосложненной беременности (p>0,05) (таблица 3.1.2.). Уровень CD31-central клеток в популяции наивных CD8+ лимфоцитов периферической крови во все сроки неосложненной беременности был достоверно выше аналогичного показателя группы небеременных доноров (p<0,001 во всех случаях). Причем максимальное повышение данного показателя 48 отмечалось во 2 триместре беременности. Кроме того, в группе женщин с неосложненным течением беременности 2 триместра гестации достоверно повышался уровень CD31-central клеток в популяции периферических наивных CD8+ лимфоцитов по сравнению с аналогичным показателем группы женщин с неосложненным Достоверных течением различий в беременности содержание 1 триместра CD31-central гестации клеток в (p<0,02). популяции периферических наивных ЦТЛ в 3 триместре беременности относительно 2 триместра гестации выявлено не было (р>0,05) (таблица 3.1.2.). С целью уточнения особенностей функционирования тимуса при неосложненной беременности в динамике гестационного процесса нами была проведена оценка уровня экспрессии ДНК TREC методом ПЦР в режиме реального времени. Полученные данные представлены на рисунке 3.1.3. Сравнительный анализ особенностей экспрессии ДНК TREC в общем пуле периферических Т-лимфоцитов в 1 триместре гестации в группе женщин с неосложненным течением беременности выявил, что данный показатель существенно не отличался от аналогичного параметра группы небеременных фертильных доноров и составил 1,07±0,35 (p>0,05). Уровень экспрессии ДНК TREC лимфоцитами периферической крови в группе женщин с неосложненным течением беременности 2 триместра гестации составил 0,20±0,10, что достоверно ниже, чем в группе небеременных женщин и группе женщин с неосложненным течением беременности 1 триместра гестации (р<0,05 в обоих случаях). Результаты исследования уровня ДНК TREC в общем пуле периферических лимфоцитов в 3 триместре неосложненной беременности показали, что экспрессия исследуемого гена лимфоцитами достоверно повышалась по сравнению с аналогичным показателем женщин с неосложненным течением беременности 2 триместра гестации и составила 0,93±0,15 (р<0,001) и практически не отличалась от соответствующего показателя небеременных доноров и беременных женщин 1 триместра гестации (p>0,05 в обоих случаях) (рисунок 3.1.3). 49 RQ 2 1 0 1 триместр 2 триместр 3 триместр Рис. 3.1.3. Экспрессия ДНК TREC в общем пуле периферических Т-лимфоцитов в динамике неосложненной беременности (результаты представлены как n-кратные различия по сравнению с показателем в группе небеременных доноров). Таким образом, в популяциях периферических Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов при беременности отмечалось: достоверное увеличение уровня наивных клеток, сохранявшееся на протяжении всего гестационного процесса в пуле CD4+ лимфоцитов и до 2 триместра в пуле CD8+ лимфоцитов; снижение уровня CD31+thymic клеток и повышение уровня CD31-central в пуле Т-хелперов и ЦТЛ на всем протяжении гестационного процесса. В динамике гестационного процесса отмечалось снижение уровня ДНК TREC периферическими Т-лимфоцитами во 2 триместре беременности относительно 1 триместра гестации и небеременных доноров, а также увеличение экспрессии исследуемого гена в 3 триместре беременности по сравнению со 2 триместром. Эти данные могут свидетельствовать об угнетении тимической продукции и активации экстратимического пути дифференцировки клеток. 50 3.2. Особенности дифференцировки клеток памяти в популяциях Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов периферической крови при неосложненной беременности в динамике гестационного процесса Плацентарный барьер, ограждающий иммунную систему плода от воздействия материнских иммунокомпетентных клеток, не является абсолютно непроницаемым для антигенов плода [18, 27, 66, 92, 113, 183, 184, 149, 167]. Предполагается, что стимуляция иммунной системы матери АГ плода является необходимым фактором нормального развития беременности, а избыточное поступление АГ, при нарушении барьерной функции плаценты, приводит к формированию акушерской патологии [167, 152]. Это позволило нам предположить, что при беременности могут формироваться специфические клоны лимфоцитов, реагирующие на АГ плода, с последующим образованием пулов клеток памяти. В связи с этим нами было проведено исследование особенностей дифференцировки Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов с учетом формирования клеток памяти в периферической крови женщин с неосложненным течением беременности в динамике гестационного процесса. В таблице 3.2.1. представлены данные по содержанию центральных (Tcm), претерминально-дифференцированных (Tem) и терминально- дифференцированных (Temra) клеток памяти в популяции периферических Тхелперов в динамике неосложненной беременности. Как показал сравнительный анализ данных в 1 триместре неосложненной беременности, достоверных отличий в содержании клеток памяти, находящихся на различных этапах дифференцировки, в популяции Т-хелперов периферической крови по сравнению с аналогичными показателями группы небеременных доноров нами выявлено не было (р>0,05 во всех случаях). В группе женщин с неосложненным течением беременности во 2 триместре гестации в популяции периферических CD4+ лимфоцитов отмечалось достоверное снижение уровня CD45RA-CD62L+ небеременных клеток доноров по сравнению (p<0,02), с аналогичным содержание показателем CD45RA-CD62L- и 51 CD45RA+CD62L- клеток в сравниваемых группах не имело достоверных различий (p>0,05 в обоих случаях). Таблица 3.2.1. Содержание центральных, претерминально-дифференцированных и терминальнодифференцированных клеток памяти в популяции периферических CD4+ лимфоцитов в динамике неосложненной беременности Показатель CD45RA-CD62L+ % CD45RA-CD62L- CD45RA+CD62L- (Tcm) (Tem) (Temra) 39,75±1,53 23,11±1,58 2,48±0,40 37,58±1,50 21,76±1,89 2,56±0,41 33,97±1,73** 20,82±1,69 3,19±0,53 34,13±1,41*** 23,36±2,99 2,75±1,76 Группа Небеременные доноры (n=29) 1 триместр (n=41) 2 триместр (n=39) 3 триместр (n=35) В скобках дано число проведенных исследований. * - коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с группой небеременных доноров (** - p<0,02;*** - p<0,01). Сравнение средних значений анализируемых показателей у беременных женщин 3 триместра гестации и небеременных доноров показало, что к концу гестационного процесса в популяции периферических CD4+ клеток сохранялся достоверно сниженный уровень Tcm клеток (p<0,01), при отсутствии достоверных отличий показателей содержания Tem и Temra клеток (p>0,05 в обоих случаях). Нами не было выявлено статистически значимых различий в содержании центральных, претерминально-дифференцированных и терминально- дифференцированных клеток памяти в популяции Т-хелперов периферической крови в зависимости от срока беременности в 1, 2 и 3 триместрах гестации (р>0,05 52 во всех случаях). Наиболее выраженные изменения в содержании клеток памяти в динамике гестационного процесса при неосложненной беременности отмечались нами в популяции периферических CD8+ лимфоцитов. В таблице 3.2.2. представлены данные по содержанию центральных (Tcm), претерминально-дифференцированных (Tem) и терминально- дифференцированных (Temra) клеток памяти в популяции периферических цитотоксических Т-лимфоцитов в динамике неосложненной беременности. Таблица 3.2.2. Содержание центральных, претерминально-дифференцированных и терминальнодифференцированных клеток памяти в популяции периферических CD8+ лимфоцитов в динамике неосложненной беременности Показатель % CD45RA-CD62L+ CD45RA-CD62L- CD45RA+CD62L- (Tcm) (Tem) (Temra) 12,26±0,89 25,75±1,72 28,83±2,44 11,24±0,69 21,36±1,42* 29,23±1,89 8,82±0,57*** ххх 19,06±1,45*** 32,22±2,49 10,79± 4,36 23,45± 2,76 v 28,17±1,95 Группа Небеременные доноры (n=36) 1 триместр (n=54) 2 триместр (n=35) 3 триместр (n=43) В скобках дано число проведенных исследований. * - коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с группой небеременных доноров (*- p<0,05;*** - p<0,01); х - коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с группой беременных женщин 1 триместра гестации (ххх - p<0,01); v - коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с группой беременных женщин 2 триместра гестации (v - p<0,05). 53 При анализе данных содержания клеток памяти, находящихся на различных этапах дифференцировки, в популяции CD8+ лимфоцитов периферической крови нами было установлено, что в 1 триместре гестации в группе женщин с неосложненным течением беременности достоверно снижался уровень претерминально-дифференцированных клеток по сравнению с показателями в группе небеременных доноров (p<0,05). Содержание центральных и терминальнодифференцированных клеток памяти в популяции периферических ЦТЛ в сравниваемых группах не имело достоверных различий (p>0,05 в обоих случаях). Изменения, отмеченные нами в 1 триместре беременности в пуле периферических ЦТЛ в виде достоверного снижения уровня Tem клеток, сохранялись и во 2 триместре гестации, но были более выраженные при сравнении с аналогичным показателем небеременных доноров (p<0,01). Кроме того, во 2 триместре гестации в группе женщин с неосложненным течением беременности наблюдалось достоверное снижение содержания центральных клеток памяти при сравнении, как с группой доноров, так и с группой беременных женщин с неосложненным течением беременности 1 триместра гестации (p<0,01 в обоих случаях). Уровни претерминально-дифференцированных и терминально-дифференцированных клеток в популяции CD8+ лимфоцитов периферической крови во 2 триместре неосложненной беременности достоверно не отличались от аналогичных показателей 1 триместра неосложненной беременности (p>0,05 в обоих случаях). Нами не было выявлено статистически значимых отличий в содержании клеток памяти, находящихся на различных этапах дифференцировки, в 3 триместре гестации в популяции периферических CD8+ лимфоцитов по сравнению c группой небеременных доноров (р>0,05 во всех случаях). Однако в 3 триместре гестации в группе женщин с неосложненным течением беременности в популяции периферических ЦТЛ достоверно повышался уровень Tem клеток (p<0,05), при отсутствии достоверных различий показателей содержания Tcm и Temra клеток относительно аналогичных параметров группы женщин 2 триместра гестации (p>0,05 в обоих случаях). 54 Для оценки состояния иммунной системы дополнительно к стандарту иммунологического гестационного обследования процесса беременной рекомендуется женщины проводить в динамике оценку характера дифференцировочного процесса Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов периферической крови. Для этого мы провели ретроспективный анализ уровня наивных клеток, центральных, претерминально-диффренцированных и терминально-дифференцированных клеток памяти в популяциях CD4+ и CD8+ лимфоцитов периферической крови у 85 женщин с неосложненным течением беременности лонгитудинально в 1 триместре (5-8 недель гестации), 2 триместре (16-20 недель гестации) и 3 триместре (28-32 недели гестации). На основании полученных данных был произведен содержания наивных клеток (Tn), расчет центральных нормативных (Tcm), показателей претерминально- дифференцированных (Tem) и терминально-дифференцированных (Temra) клеток памяти в популяциях периферических Т-хелперов и цитотоксических Тлимфоцитов на основе 95% доверительного интервала. Полученные данные представлены в таблицах 3.2.3., 3.2.4., 3.2.5. Таблица 3.2.3. Нормативные значения содержания наивных клеток, центральных, претерминально- и терминально-дифференцированных клеток памяти в популяциях периферических Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов в 1 триместре неосложненной беременности Показатель, % CD4+ лимфоциты CD8+ лимфоциты CD45RA+CD62L+ (Tn) 35,7-42,7 33,1-43,4 CD45RA-CD62L+ (Tcm) 34,1-40,7 8,4-11,5 CD45RA-CD62L- (Tem) 17,6-26,1 17,1-24,4 CD45RA+CD62L- (Temra) 1,6-3,4 26,4-35,7 55 Таблица 3.2.4. Нормативные значения содержания наивных клеток, центральных, претерминально- и терминально-дифференцированных клеток памяти в популяциях периферических Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов во 2 триместре неосложненной беременности Показатель, % CD4+ лимфоциты CD8+ лимфоциты CD45RA+CD62L+ (Tn) 37,3-46,9 34,9-45,0 CD45RA-CD62L+ (Tcm) 30,5-37,5 7,7-10,0 CD45RA-CD62L- (Tem) 17,4-24,2 16,1-22,0 CD45RA+CD62L- (Temra) 2,1-4,3 27,2-37,3 Таблица 3.2.5. Нормативные значения содержания наивных клеток, центральных, претерминально- и терминально-дифференцированных клеток памяти в популяциях периферических Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов в 3 триместре неосложненной беременности Показатель, % CD4+ лимфоциты CD8+ лимфоциты CD45RA+CD62L+ (Tn) 36,2-44,3 32,6-41,9 CD45RA-CD62L+ (Tcm) 33,8-39,4 8,5-13,0 CD45RA-CD62L- (Tem) 17,8-25,1 20,7-26,8 CD45RA+CD62L- (Temra) 1,9-3,3 24,0-32,6 Таким образом, при неосложненной беременности в периферической крови женщин изменения в содержании клеток памяти определялись снижением содержания центральных клеток памяти в популяции ЦТЛ во 2 триместре и Тхелперов во 2 и 3 триместрах гестации, а также снижением уровня 56 претерминально-дифференцированных клеток памяти в популяции ЦТЛ в 1 и 2 триместрах гестации и повышением пула этих же клеток в 3 триместре гестации относительно 2 триместра беременности. 3.3. Особенности дифференцировки Т-хелперов и цитотоксических Тлимфоцитов периферической крови женщин с развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем Развитие невынашивания беременности сопровождается повышением проницаемости плаценты и ведет к усиленному поступлению антигенов плода в кровоток беременной женщины, что может определять дифференцировку клеток памяти [9, 184]. Переход клеток на новую стадию дифференцировки изменяет их функциональные свойства [105]. Нарушение дифференцировки лимфоцитов может вести к изменению процессов иммунорегуляции, определяя неадекватный иммунный ответ матери на антигены плода, способствуя формированию патологии беременности [171, 9, 182, 47]. Для уточнения иммунных механизмов развития самопроизвольного выкидыша нами было проведено исследование особенностей дифференцировки Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов периферической крови женщин с неоложненным на момент обследования течением беременности 1 триместра гестации и развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем. В таблице 3.3.1. представлены данные по содержанию наивных клеток (Tn), центральных (Tcm), претерминально-дифференцированных (Tem) и терминальнодифференцированных (Temra) клеток памяти в популяции периферических Тхелперов женщин с неосложненным на момент обследования течением беременности 1 триместра гестации и развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем. Анализ данных содержания клеток, находящихся на различных этапах дифференцировки, в популяции периферических CD4+ лимфоцитов в группе женщин с развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем выявил 57 достоверное повышение уровня наивных клеток и терминально- дифференцированных клеток памяти и достоверное снижение содержания центральных клеток памяти (p<0,05 во всех случаях) по сравнению с аналогичными показателями группы женщин с неосложненным течением беременности 1 триместра гестации. Содержание претерминально- дифференцированных клеток в популяции периферических Т-хелперов в сравниваемых группах не имело достоверных различий (p>0,05). Таблица 3.3.1. Содержание наивных клеток, центральных, претерминальнодифференцированных и терминально-дифференцированных клеток памяти в популяции периферических CD4+ лимфоцитов беременных женщин с развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем Неосложненное течение Показатель (%) беременности (n=54) Развившийся выкидыш (n=9) CD45RA+CD62L+ (Tn) 38,98±1,58 46,99±2,93* CD45RA-CD62L+ (Tcm) 37,58±1,50 27,74±3,57* CD45RA-CD62L- (Tem) 21,76±1,89 23,27±2,60 CD45RA+CD62L- (Temra) 2,56±0,41 13,11±4,28* В скобках дано число проведенных исследований. * - коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с группой женщин с неосложненным течением беременности 1 триместра гестации (*p<0,05). В таблице 3.3.2. представлены данные по содержанию наивных клеток (Tn), центральных (Tcm), претерминально-дифференцированных (Tem) и терминальнодифференцированных (Temra) клеток памяти в популяции периферических цитотоксических Т-лимфоцитов женщин с неосложненным на момент обследования течением беременности 1 триместра гестации и развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем. 58 Таблица 3.3.2. Содержание наивных клеток, центральных, претерминальнодифференцированных и терминально-дифференцированных клеток памяти в популяции периферических CD8+ лимфоцитов беременных женщин с развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем Неосложненное течение Показатель (%) беременности Развившийся выкидыш (n=9) (n=54) CD45RA+CD62L+ (Tn) 38,18±1,97 38,98±5,15 CD45RA-CD62L+ (Tcm) 11,24±0,69 8,85±2,61 CD45RA-CD62L- (Tem) 21,36±1,42 15,00±2,70 CD45RA+CD62L- (Temra) 29,23±1,89 37,22±2,90* В скобках дано число проведенных исследований. * - коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с группой женщин с неосложненным течением беременности 1 триместра гестации (*p<0,05). Как видно из приведенных результатов, в группе женщин с развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем в популяции периферических CD8+ лимфоцитов достоверно повышалось содержание терминально- дифференцированных клеток памяти (p<0,05) при сравнении с аналогичным параметрам группы женщин с неосложненным течением беременности 1 триместра гестации. Нами не было выявлено статистически значимых отличий в содержании наивных клеток, центральных и претерминально-дифференцированных клеток памяти в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов периферической крови в группе женщин с развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем по сравнению с соответствующими показателями группы женщин с неосложненным течением беременности 1 триместра гестации (р>0,05 во всех случаях) (таблица 3.3.2.). 59 Для оценки возможности использования показателя содержания наивных лимфоцитов с фенотипом CD45RA+CD62L+ в популяции периферических Тхелперов для прогнозирования самопроизвольного выкидыша у беременных женщин мы провели ретроспективный анализ уровня Tn клеток у 67 беременных женщин 1 триместра гестации. На основании полученных данных был разработан способ прогнозирования самопроизвольного выкидыша по относительному содержанию CD45RA+CD62L+ периферической крови у лимфоцитов беременных в женщин популяции 1 триместра Т-хелперов гестации (положительное решение о выдаче патента от 14 мая 2014г). Способ основан на определении относительного (процентного) содержания CD45RA+CD62L+ клеток в CD4+ лимфоцитарном гейте на проточном цитометре, и при его значении равном или более 46,7% прогнозируют развитие самопроизвольного выкидыша. По заявленному способу у 17 беременных прогнозировался самопроизвольный выкидыш, прогноз подтвердился у 10 беременных женщин. Таким образом, точность способа – 85,1%, чувствительность – 76,9%, специфичность – 88,9%. Преимуществами заявляемого способа являются: высокая точность, хорошая воспроизводимость метода, простота в интерпретации результатов обследования. Способ позволяет в определенные сроки беременности (6-12 недель гестации) прогнозировать самопроизвольный выкидыш у беременных женщин, как при наличии клинических проявлений данной патологии, так и при ее отсутствии на момент обследования, что дает возможность своевременно выбрать правильную тактику ведения женщин с риском развития данной акушерскогинекологической патологии и избежать неблагоприятных исходов беременности. Полученные данные представлены на рисунке 3.3.1. 60 Ra_62L_ 1 A 1 70 100 60 80 Sensitivity 50 <=46,7 Sens: 88,9 Spec: 76,9 60 40 40 30 20 20 0 10 0 20 40 60 80 100 0 100-Specificity Показатель 1 Чувствительность, % CD45RA+CD62L+ 76,9 лимфоциты 0 i Специфичность, % 88,9 Рис. 3.3.1. ROС - анализ показателя CD45RA+CD62L+ лимфоцитов в популяции Т-хелперов периферической крови беременных женщин 1 триместра гестации с развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем Таким образом, в периферической крови женщин с неосложненным на момент обследования течением беременности и развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем направленность дифференцировки, как в популяции CD4+ лимфоцитов, так и в популяции CD8+ лимфоцитов, характеризовалась увеличением уровня терминально-дифференцированных клеток памяти по сравнению с показателями группы женщин с неосложненным течением беременности 1 триместра гестации. Кроме того, у женщин с развившемся впоследствии самопроизвольным выкидышем в популяции периферических Т-хелперов отмечалось увеличение содержания наивных клеток на фоне снижения центральных клеток памяти относительно показателей женщин с неосложненным течением беременности 1триместра гестации. 61 3.4. Характеристика внутриклеточной продукции цитокинов и цитолитических молекул наивными клетками и клетками памяти в популяциях Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов периферической крови при неосложненной беременности в динамике гестационного процесса Как известно, Т-хелперы и цитотоксические Т-лимфоциты продуцируют достаточно широкий спектр цитокинов и цитолитических молекул, обуславливающих характер иммунорегуляции гестационного процесса, тем самым, определяя неосложненное или патологическое течение беременности [39, 9]. Нами оценивалось содержание претерминально-дифференцированных и наивных клеток, центральных, терминально-дифференцированных клеток памяти, внутриклеточно продуцирующих IFNγ и IL-4 в популяции CD4+ лимфоцитов, а также Perforin и Granzyme B в популяции CD8+ лимфоцитов периферической крови женщин с неосложненным течением беременности в динамике гестационного процесса. Данные содержания клеток, находящихся на различных этапах дифференцировки и внутриклеточно продуцирующих IFNγ, в популяции периферических Т-хелперов представлены в таблице 3.4.1. Проведенное исследование показало, что при неосложненной беременности в 1 триместре гестации в популяции CD4+ лимфоцитов достоверно повышался уровень Tn клеток, продуцирующих IFNγ, по сравнению с соответствующим показателем небеременных доноров (p<0,05). Содержание Tcm, Tem и Temra клеток памяти, внутриклеточно продуцирующих IFNγ, в популяции периферических Т-хелперов в 1 триместре беременности не имело достоверных различий по сравнению с показателями небеременных доноров (p>0,05 во всех случаях). Во 2 триместре неосложненной беременности отмечалось достоверное повышение уровня претерминально-дифференцированных клеток памяти, продуцирующих IFNγ, в пуле CD4+ лимфоцитов относительно аналогичного 62 параметра небеременных женщин (p<0,05), при отсутствии достоверной разницы в содержании CD45RA-CD62L-IFNγ+ клеток по сравнению с показателем женщин с неосложненным течением беременности 1 триместра гестации (p>0,05). Таблица 3.4.1. Содержание наивных клеток, центральных, претерминальнодифференцированных и терминально-дифференцированных клеток памяти в популяции периферических CD4+ лимфоцитов, внутриклеточно продуцирующих IFNγ, в динамике неосложненной беременности Показатель (%) доноры 1 триместр 2 триместр 3 триместр (n=36) (n=54) (n=35) (n=43) CD45RA+CD62L+IFNγ+ 4,13±0,55 5,88±0,64* 3,36±1,17 4,78±1,10 CD45RA-CD62L+IFNγ+ 4,28±0,55 4,79±0,69 3,51±1,00 3,85±0,78 CD45RA-CD62L-IFNγ+ 0,93±0,38 1,21±0,31 2,85±0,72* 1,11±0,28v CD45RA+CD62L-IFNγ+ 0,09±0,02 0,31±0,12 1,09±0,23***хх 0,19±0,05vv В скобках дано число проведенных исследований. * - коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с группой небеременных доноров (*- p<0,05;*** - p<0,01); х - коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с группой беременных женщин 1 триместра гестации (хх - p<0,02); v - коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с группой беременных женщин 2 триместра гестации (v- p<0,05;vv - p<0,02). Кроме того, в группе женщин 2 триместра гестации достоверно повышался уровень CD45RA+CD62L-IFNγ+ в популяции Т-хелперов по сравнению с аналогичным показателем, как небеременных женщин, так и женщин в 1 триместре беременности (p<0,01 и p<0,02 соответственно). Достоверных различий в содержании Tn и Tcm клеток памяти в популяции Т-хелперов, внутриклеточно продуцирующих IFNγ, в группе женщин с неосложненным течением беременности 2 триместра гестации относительно группы небеременных женщин и беременных женщин 1 триместра гестации нами выявлено не было (p>0,05 во 63 всех случаях). Для 3 триместра неосложненной беременности в популяции CD4+ лимфоцитов периферической крови было характерно снижение уровня Tem и Temra клеток, внутриклеточно продуцирующих IFNγ, относительно 2 триместра гестации (p<0,05 и p<0,02 соответственно) до соответствующих показателей в группе небеременных доноров (p>0,05 в обоих случаях). Содержание Tn и Tcm клеток, продуцирующих IFNγ, в 3 триместре неосложненной беременности не имело достоверных различий по сравнению с аналогичными показателями в группе небеременных доноров и у беременных женщин во 2 триместре гестации (p>0,05 во всех случаях). Содержание клеток, находящихся на различных этапах дифференцировки и продуцирующих IL-4, в популяции периферических Т-хелперов в динамике гестационного процесса представлено в таблице 3.4.2. Сравнительный анализ данных показал, что в 1 триместре гестации в группе женщин с неосложненным течением беременности в популяции периферических CD4+ лимфоцитов повышалось содержание наивных клеток, продуцирующих IL4, (p<0,05), при отсутствии достоверных различий в содержании центральных, претерминально-дифференцированных и терминально-дифференцированных клеток памяти, внутриклеточно продуцирующих IL-4, по сравнению с группой небеременных доноров (p>0,05 во всех случаях). Во 2 триместре гестации процентное содержание Temra, продуцирующих IL-4, в популяции периферических Т-хелперов было достоверно выше, чем у небеременных доноров и беременных женщин 1 триместра гестации (p<0,05 в обоих случаях). Содержание IL-4+ Tn, Tcm и Tem клеток в пуле CD4+ лимфоцитов в группе женщин с неосложненным течением беременности 2 триместра гестации не имело достоверных различий по сравнению с аналогичными показателями в группе контроля и в группе женщин 1 триместра неосложненной беременности (p>0,05 во всех случаях). В 3 триместре неосложненной беременности отмечалось снижение уровня CD45RA+CD62L-IL4+ в пуле Т-хелперов относительно показателя 2 триместра беременности (p<0,05). 64 Таблица 3.4.2. Содержание наивных клеток, центральных, претерминальнодифференцированных и терминально-дифференцированных клеток памяти в популяции периферических CD4+ лимфоцитов, внутриклеточно продуцирующих IL-4, в динамике неосложненной беременности Показатель (%) доноры 1 триместр 2 триместр 3 триместр (n=36) (n=54) (n=35) (n=43) CD45RA+CD62L+IL-4+ 3,04±0,30 4,69±0,58* 3,74±0,85 3,24±0,47 CD45RA-CD62L+IL-4+ 3,12±0,64 2,87±0,39 3,44±0,74 2,93±0,50 CD45RA-CD62L-IL-4+ 0,52±0,12 0,66±0,16 0,88±0,23 1,03±0,23 CD45RA+CD62L-IL-4+ 0,13±0,04 0,22±0,04 0,84±0,26*х 0,19±0,05v В скобках дано число проведенных исследований. * - коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с группой небеременных доноров (*- p<0,05); х - коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с группой беременных женщин 1 триместра гестации (х - p<0,05); v - коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с группой беременных женщин 2 триместра гестации (v- p<0,05). Содержание Tn, Tcm и Tem клеток, внутриклеточно продуцирующих IL-4, в популяции периферических CD4+ лимфоцитов в сравниваемых группах не имело достоверных различий (p>0,05 во всех случаях). Нами также не было выявлено статистически значимых изменений в содержание наивных клеток, центральных, претерминально-дифференцированных клеток памяти, продуцирующих и IL-4, терминально-дифференцированных в популяции CD4+ лимфоцитов периферической крови в 3 триместре неосложненной беременности относительно аналогичных параметров небеременных доноров (р>0,05 во всех случаях) (таблица 3.4.2.). 65 Содержание клеток, находящихся на различных этапах дифференцировки и продуцирующих Perf, в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов в динамике гестационного процесса представлено в таблице 3.4.3. Таблица 3.4.3 Содержание наивных клеток, центральных, претерминальнодифференцированных и терминально-дифференцированных клеток памяти в популяции периферических CD8+ лимфоцитов, внутриклеточно продуцирующих Perforin, в динамике неосложненной беременности Показатель доноры 1 триместр 2 триместр 3 триместр (%) (n=9) (n=19) (n=9) (n=16) 5,83±0,84 6,15±0,89 1,53±0,33****хххх 4,03±0,97v 7,16±0,61 4,26±0,92** 3,58±0,89*** 3,72±0,95*** 17,84±2,47 9,69±1,57** 10,37±1,72* 8,39±2,30** 9,86±1,31 8,93±1,58 3,78±1,20***хх 5,86±1,25* CD45RA+ CD62L+Perf+ CD45RACD62L+Perf+ CD45RACD62L-Perf+ CD45RA+ CD62L-Perf+ В скобках дано число проведенных исследований. * - коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с группой небеременных доноров (*- p<0,05;**- p<0,02;***- p<0,01;**** - p<0,001); х - коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с группой беременных женщин 1 триместра гестации (хх - p<0,02;хххх - p<0,001); v - коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с группой беременных женщин 2 триместра гестации (v- p<0,05). Проведенное исследование внутриклеточной продукции цитолитических молекул клетками, находящимися на различных этапах дифференцировки, показало, что при неосложненной беременности в 1 триместре гестации в популяции периферических CD8+ лимфоцитов снижался уровень Tcm и Tem 66 клеток, продуцирующих Perforin, по сравнению с показателями небеременных доноров (p<0,02 в обоих случаях). Достоверные различия в содержании Tn и Temra клеток, внутриклеточно продуцирующих Perf, в популяции CD8+лимфоцитов в группах беременных женщин в 1 триместре гестации и небеременных доноров отсутствовали (р>0,05 в обоих случаях). Во 2 триместре гестации в группе женщин с неосложненным течением беременности достоверно снижалось содержание наивных клеток, центральных, претерминально- дифференцированных и терминально-дифференцированных клеток памяти, продуцирующих Perforin, в популяции ЦТЛ по сравнению с аналогичными показателями группы небеременных доноров (p<0,001, p<0,01, p<0,05, p<0,01 соответственно). При сравнительном анализе показателей 2 триместра беременности относительно 1 триместра нами было выявлено достоверное снижение в популяции CD8+ лимфоцитов уровня CD45RA+CD62L+Perf+ и CD45RA+CD62L-Perf+ клеток (p<0,001 и p<0,02 соответственно), при отсутствии в сравниваемых группах статистически значимых различий в содержании CD45RA-CD62L+Perf+ и CD45RA-CD62L-Perf+ клеток (р>0,05 в обоих случаях). Группа женщин с неосложненным течением беременности 3 триместра гестации характеризовалась достоверным снижением уровня Tcm, Tem и Temra, внутриклеточно продуцирующих Perforin, в популяции периферических CD8+ лимфоцитов относительно аналогичных параметров группы небеременных женщин (p<0,01, p<0,02, p<0,05 соответственно). Содержание Perforin+ Tn клеток в популяции CD8+ лимфоцитов в 3 триместре беременности было сопоставимым с таковым в группе небеременных доноров (p>0,05). В группе женщин 3 триместра беременности в популяции ЦТЛ периферической крови отмечалось повышение уровня CD45RA+CD62L+Perf+ клеток в популяции CD8+ лимфоцитов по сравнению с аналогичным показателем у женщин 2 триместра гестации (p<0,05), при этом достоверных различий в cодержании Tcm, Tem и Temra клеток памяти, внутриклеточно продуцирующих Perforin, в популяции ЦТЛ между обеими группами женщин выявлено не было (р>0,05 во всех случаях). 67 Содержание клеток, находящихся на различных этапах дифференцировки и продуцирующих Gr B, в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов в динамике гестационного процесса представлено в таблице 3.4.4. Таблица 3.4.4. Содержание наивных клеток, центральных, претерминальнодифференцированных и терминально-дифференцированных клеток памяти в популяции периферических CD8+ лимфоцитов, внутриклеточно продуцирующих Granzyme B, в динамике неосложненной беременности Показатель (%) доноры 1 триместр 2 триместр 3 триместр (n=9) (n=18) (n=10) (n=16) 7,92±1,17*** 3,29±0,58ххх 4,00±0,71 CD45RA+CD62L+GrB+ 4,00±0,44 CD45RA-CD62L+GrB+ 2,36±0,37 2,79±0,50 2,72±0,49 3,23±0,54 CD45RA-CD62L-GrB+ 3,99±1,12 4,58±0,59 3,93±0,95 6,86±1,42 CD45RA+CD62L-GrB+ 2,84±0,39 4,00±0,78 2,84±0,83 5,46±1,83 В скобках дано число проведенных исследований. * - коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с группой небеременных доноров (***- p<0,01); х - коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с группой беременных женщин 1 триместра гестации (ххх - p<0,01). Уровень центральных, претерминально-дифференцированных терминально-дифференцированных клеток памяти, и внутриклеточно продуцирующих Granzyme B, в популяции CD8+ лимфоцитов не претерпевал значительных изменений в динамике неосложненной беременности, и статистически значимых различий в исследуемых показателях нами выявлено не было (p>0,05 во всех случаях). В динамике гестационного процесса в популяции периферических цитотоксических Т-лимфоцитов нами выявлено изменение лишь уровня CD45RA+CD62L+Gr B+ клеток. Так, в 1 триместре гестации в группе женщин с неосложненным течением беременности в популяции CD8+ лимфоцитов 68 отмечалось увеличение уровня наивных клеток, продуцирующих Granzyme B, по сравнению с аналогичным показателем группы небеременных доноров (p<0,01). 2 триместр неосложненной беременности характеризовался снижением уровня Granzyme B+ Tn в популяции ЦТЛ относительно показателя 1 триместра гестации (p<0,01), при отсутствии достоверных различий в содержании исследуемого параметра относительно группы контроля (p>0,05). В 3 триместре беременности также отсутствовали статистически значимые различия в уровне наивных клеток, продуцирующих Granzyme B, в популяции ЦТЛ периферической крови при сравнении, как с группой небеременных доноров, так и с группой женщин 2 триместра гестации (p>0,05 в обоих случаях). Таким образом, при неосложненной беременности в популяции периферических CD4+ лимфоцитов в 1 триместре повышался уровень IFNγ IL4+ Tn клеток по сравнению с группой доноров, во 2 триместре увеличивался уровень IFNγ и IL4+ Temra клеток относительно аналогичных показателей небеременных доноров и беременных женщин 1 триместра гестации, а также уровень IFNγ+ Tem по сравнению с показателями небеременных доноров. В популяции цитотоксических Т-лимфоцитов на протяжении всего гестационного процесса отмечалось снижение содержания Perforin-продуцирующих клеток относительно показателей у небеременных доноров в пуле Tcm и Tem клеток в 1, 2 и 3 триместрах; в пуле Temra клеток во 2 и 3 триместрах; в пуле Tn во 2 триместре беременности. Уровень Granzyme B+ Tcm, Tem и Temra в популяции CD8+ лимфоцитов в динамике неосложненной беременности не претерпевал значительных изменений, отмечалось лишь увеличение содержания Gr B+ Tn в 1 триместре неосложненной беременности при сравнении с группой небеременных доноров. 69 Глава 4. СОДЕРЖАНИЕ IL-2 И IL-15 В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ В ДИНАМИКЕ НЕОСЛОЖНЕННОЙ БЕРЕМЕННОСТИ И У ЖЕНЩИН С РАЗВИВШИМСЯ ВПОСЛЕДСТВИИ САМОПРОИЗВОЛЬНЫМ ВЫКИДЫШЕМ Цитокиновая регуляция материнского иммунного ответа лежит в основе ключевых механизмов иммунологической толерантности к семиаллогенному плоду [9]. Как показали исследования последних лет, характер продукции и значимость тех или иных цитокинов на протяжении гестационного процесса, а также при развитии акушерско-гинекологической патологии, значительно меняются [22, 9, 184, 25]. Особого внимания заслуживают IL-2 и IL-15, относящиеся к непосредственно цитокинам, влияющим регулирующим на клеточный дифференцировку клеток иммунитет [11]. и Однако исследования уровня IL-15 при неосложненной беременности в динамике гестационного процесса и угрозе прерывания беременности 1 триместра гестации отсутствуют, а данные по IL-2 крайне противоречивы [13, 22]. Результаты исследования уровня IL-2 в сыворотке периферической крови у женщин с неосложненным течением беременности в динамике гестационного процесса представлены в таблице 4.1. Сравнительный анализ данных, характеризующих содержание IL-2 в сыворотке периферической крови в динамике неосложненной беременности показал, что с наступлением беременности уровень исследуемого цитокина значительно менялся. В 1 триместре гестации в группе женщин с неосложненным течением беременности нами отмечалось достоверное увеличение содержания IL2 по сравнению с аналогичным показателем группы небеременных доноров (p<0,05). 2 триместр неосложненной беременности характеризовался еще более выраженным увеличением уровня исследуемого цитокина при сравнении с группой небеременных доноров (p<0,05). Достоверных различий в содержании IL-2 в сыворотке периферической крови во 2 триместре гестации по сравнению с 70 аналогичным параметром 1 триместра беременности нами выявлено не было (p>0,05). Таблица 4.1. Содержание IL-2 в сыворотке периферической крови в динамике неосложненной беременности Группы обследуемых женщин IL-2 пг/мл Небеременные доноры 0 (n=14) 1 триместр беременности 0,89±0,44* (n=41) 2 триместр беременности 2,51±1,05* (n=35) 3 триместр беременности 0,29±0,29 v (n=26) В скобках дано число проведенных исследований. * - коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с группой небеременных доноров (*- p<0,05); v - коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с группой беременных женщин 2 триместра гестации (v- p<0,05). В группе женщин с неосложненным течением беременности 3 триместра гестации отмечалось достоверное снижение сывороточного уровня IL-2 относительно группы женщин с неосложненным течением беременности 2 триместра гестации (p<0,05), при отсутствии достоверных различий исследуемого показателя относительно группы небеременных доноров (p>0,05). Результаты исследования содержания IL-15 в сыворотке периферической крови у женщин с неосложненным течением беременности в динамике гестационного процесса представлены в таблице 4.2. Результаты проведенных исследований показали, что сывороточный уровень IL-15 значительно менялся в течение беременности, причем динамика изменения содержания этого цитокина была во многом схожей с изменениями в содержании IL-2. Так с наступлением беременности в 1 триместре гестации в группе женщин с неосложненным течением беременности в периферической 71 крови достоверно возрастало сывороточное содержание IL-15 (p<0,05) по сравнению с аналогичным параметром группы небеременных доноров. Таблица 4.2. Содержание IL-15 в сыворотке периферической крови в динамике неосложненной беременности Группы обследуемых женщин IL-15 пг/мл Небеременные доноры 1,75±0,60 (n=9) 1 триместр беременности 9,06±3,09* (n=35) 2 триместр беременности 15,55±6,11* (n=29) 3 триместр беременности 14,82±4,45*** (n=20) В скобках дано число проведенных исследований. * - коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с группой небеременных доноров (*- p<0,05;***- p<0,01). Во 2 триместре беременности нами также отмечался достоверный рост уровня исследуемого цитокина в сыворотке периферической крови по сравнению с показателями небеременных доноров (p<0,05). Сывороточный уровень IL-15 в 3 триместре в группе женщин с неосложненным течением беременности оставался таким же высоким как во 2 триместре гестации (p>0,05) и был достоверно выше, чем в группе небеременных доноров (p<0,01). Показатели содержания IL-15 в 1, 2 и 3 триместрах гестации у женщин с неосложненным течением беременности достоверно не различались (p>0,05 во всех случаях). Данные по сывороточному уровню IL-2 и IL-15 женщин с неосложненным на момент обследования течением беременности 1 триместра гестации и развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем представлены в таблице 4.3. Оценка содержания IL-2 в сыворотке периферической крови в зависимости от характера течения беременности показала, что в группе женщин с развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем уровень исследуемого цитокина был несколько выше аналогичного показателя группы женщин с неосложненным 72 течением беременности 1 триместра гестации, однако статистически значимых изменений этого фактора нами выявлено не было (p>0,05). Таблица 4.3. Содержание IL-2 и IL-15 в сыворотке периферической крови женщин с развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем Группы обследуемых IL-2 пг/мл женщин Неосложненное течение беременности Развившийся выкидыш IL-15 пг/мл 0,89±0,44 (n=41) 9,06±3,09 (n=35) 1,27±1,05 (n=13) 88,90±36,85* (n=14) В скобках дано число проведенных исследований. * - коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с группой женщин с неосложненным течением беременности 1 триместра гестации (*p<0,05). Результаты исследования особенностей продукции IL-15 в сыворотке периферической крови показали, что для женщин с развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем характерно достоверное увеличение уровня исследуемого цитокина по сравнению с аналогичным показателем женщин с неосложненным течением беременности в 1 триместре гестации (p<0,05). Таким образом, при неосложненной беременности в сыворотке периферической крови отмечалось увеличение уровня IL-2 и IL-15 относительно группы контроля, сохранявшееся на протяжении всего гестационного процесса. Развитие самопроизвольного выкидыша в 1 триместре гестации было ассоциировано с более высокими значениями сывороточного уровня IL-2 и IL-15 по сравнению с аналогичными цитокинами при неосложненной беременности. 73 ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ Беременность является уникальным состоянием, при котором в единой системе существуют два организма (мать и плод) не являющиеся генетически идентичными друг другу. Плод имеет половину генов отцовского происхождения, следовательно, организм матери должен воспринимать его как «чужое» и реагировать реакцией отторжения, аналогичной той, которая возникает при пересадке органов и тканей [9]. Однако при нормальном развитии беременности этого не происходит. Исследование основ «толерантности» материнской иммунной системы к фетальным антигенам является одним из наиболее изучаемых аспектов иммунологии репродукции. Формирование плодово-плацентарного комплекса определяет физиологическую ситуацию, при которой иммунная система матери сталкивается с тканеспецифическими антигенами плода отцовского генома. Иммунные механизмы при беременности включаются уже на стадии имплантации оплодотворенной яйцеклетки и в дальнейшем в значительной мере обуславливают ее физиологическое течение [9]. Физиологическое течение беременности ассоциировано с формированием иммунологической толерантности к аллоантигенам плода. Предполагается, что стимуляция иммунной системы матери антигенами плода является необходимым фактором нормального развития беременности, а избыточное поступление АГ при нарушении барьерной функции плаценты приводит к формированию акушерской патологии [9, 167, 152]. Это позволило нам предположить, что при беременности могут формироваться специфические клоны лимфоцитов, реагирующие на антигены плода, с последующим формированием пулов клеток памяти. Однако характер дифференцировки наивных Т-клеток и Т-клеток памяти при неосложненной беременности в динамике гестационного процесса остается мало изученным. 74 В связи с этим целью проведенного исследования было установить особенности содержания наивных претерминально-дифференцированных клеток (Tn), (Tem) центральных и (Tcm), терминально- дифференцированных (Temra) клеток памяти в популяциях периферических Тхелперов (CD4+) и цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+) у беременных женщин с неосложненным течением беременности в динамике гестационного процесса, а также у женщин с неосложненным на момент обследования течением беременности и развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем в 1 триместре гестации, с параллельным исследованием функциональной активности данных пулов клеток на основании изучения внутриклеточной продукции IFN и IL-4 в популяции CD4+ лимфоцитов и Granzyme B и Perforin в популяции CD8+ лимфоцитов. Было проведено обследование 36 здоровых небеременных женщин с реализованной репродуктивной способностью (контрольная группа), 85 женщин с неосложненным течением беременности в динамике гестационного процесса в 1 (5-8 недель), 2 (16-20 недель) и 3 (28-32 недели) триместрах (основная группа). При ретроспективном анализе в зависимости от последующего характера течения гестационного процесса среди женщин основной группы была выделена подгруппа женщин с развившимся впоследствии ранним самопроизвольным выкидышем. Женщины, у которых развились другие осложнения беременности в разработку не вошли. В ходе нашего исследования было установлено, что в периферической крови женщин с неосложненным течением беременности в динамике гестационного процесса значительно изменялись показатели, характеризующие процесс дифференцировки Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов, причем как наивных Т-лимфоцитов, так и Т-клеток памяти. По данным литературы известно, что основным источником наивных Тклеток является тимус, который играет исключительно важную роль в установлении и поддержании Т-клеточного пула на периферии [161]. Показано, что у взрослых людей наивные Т-лимфоциты пролиферируют с небольшой 75 интенсивностью и делению на периферии подвергается приблизительно 1% CD4+ и CD8+ клеток [199]. Ранее проводились исследования по содержанию наивных клеток, определяемых фенотипом CD4+CD45RA+ и CD8+CD45RA+, только при развитии различной акушерско-гинекологической патологии [9, 45, 139]. Однако использование только маркера CD45RA не позволяет точно оценить эту популяцию клеток, поскольку маркер CD45RA определяется и на терминальнодифференцированных Т-клетках [47, 204, 31]. В настоящее время предлагается использовать более широкий спектр маркеров наивных клеток. Такие работы при беременности являются единичными [9], следует также отметить, что эти исследования проводились срезами, а не лонгитудинальным методом. Многочисленными исследованиями было показано, что беременность сопровождается транзиторной инволюцией тимуса, выраженной в снижении его массы и клеточности, главным образом за счет атрофии коркового слоя и истощения проведенное популяции нами кортикальных исследование тимоцитов показало, что [210, 43, на всем 84]. Однако протяжении неосложненной беременности, как в популяции Т-хелперов, так и популяции цитотоксических Т-лимфоцитов, в периферической крови возрастало содержание наивных клеток с фенотипом CD45RA+CD62L+ по сравнению с аналогичными показателями небеременных доноров. При этом рост уровня наивных лимфоцитов в этот период был связан, видимо, не с усилением лимфопоэза, так как численного увеличения общих популяций CD4+ и CD8+ лимфоцитов у беременных женщин мы не наблюдали. Учитывая этот факт, закономерно возникает вопрос о механизмах увеличения фракции наивных Т-лимфоцитов во время беременности. Одним из показателей, позволяющих оценить характер дифференцировки наивных клеток, является определение колец реаранжировки генов -цепи антигенраспознающего рецептора или TREC [65, 186]. По литературным данным TREC образуется в тимоцитах при перестройке генов Т-клеточного рецептора, при этом образуется последовательность нехромосомной кольцевой ДНК, которая 76 присутствует только в наивных Т-лимфоцитах и в дальнейшем не реплицируется при их митозе и в процессе деления клетки переходит лишь к одной из дочерних клеток [65, 186]. В случае внетимусного созревания Т-лимфоцитов, TREC в клетках не определяется. Следовательно, измерение количества TREC позволяет выявить клетки, являющиеся недавними эмигрантами из тимуса и, таким образом, оценить функциональную активность тимуса [65, 186]. Проведенное нами исследование показало, что с наступлением беременности и на всем ее течении усиление экспрессии ДНК TREC в общей фракции периферических Т-лимфоцитов не наблюдалось. Более того, во втором триместре беременности этот показатель был достоверно снижен по сравнению с аналогичным показателем небеременных доноров. В 3 триместре беременности экспрессия ДНК TREC вновь достигала значений, характерных для небеременных женщин. Результаты наших исследований совпадают с результатами работы швейцарских ученых, которые также отмечали снижение уровня ДНК TREC у женщин с неосложненным течением беременности 2 триместра гестации в популяции Т-хелперов [100]. Поскольку TREC являются маркером тимической дифференцировки Тлимфоцитов, по-видимому, рост уровня наивных Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов в периферической крови при неосложненной беременности не мог определяться данным процессом. Установленное нами уменьшение уровня ДНК TREC в периферических лимфоцитах на всем протяжении гестации свидетельствуют о том, что повышение содержания наивных клеток в популяциях CD4+ и CD8+ лимфоцитов при беременности не определялось усилением выхода клеток из тимуса. Известно, что в качестве еще одного маркера недавно мигрировавших из тимуса клеток рассматривают молекулу PECAM-1 или CD31. Молекула CD31 (PECAM-1) относится к адгезионным молекулам межклеточного взаимодействия семейства Ig-подобных белков [34]. CD31 экспрессируется на поверхности наивных Т-лимфоцитов, недавних эмигрантов из тимуса, а внетимическое созревание наивных Т-лимфоцитов совпадает с прогрессирующим уменьшением 77 экспрессии CD31 [202]. На основании этих данных в настоящее время выделяют две фракции, получившие название тимических и центральных наивных Тлимфоцитов – CD31+ thymic и CD31- central [121]. По нашим данным при беременности рост содержания наивных CD4+ и CD8+ клеток в периферической крови сочетался с увеличением на всем протяжении гестации пула CD31- central клеток и снижением ранних эмигрантов из тимуса CD31+ thymic клеток. Таким образом, проведенные исследования показали, что при беременности рост уровня наивных Т-лимфоцитов на системном уровне не связан с функциональной активностью тимуса, но мог быть обусловлен усилением экстратимической дифференцировки Т-лимфоцитов или пролиферацией клонов наивных лимфоцитов на периферии в результате воздействия факторов ранней беременности. Так, в отдельных работах имеются данные о стимулирующем влиянии при беременности гормонов роста на повышение уровня наивных лимфоцитов [96]. Относительно недавно было установлено, что во время беременности развитие Т-клеток может осуществляться в результате экстратимической дифференцировки лимфоцитов Т-ряда в лимфатических узлах, дренирующих матку, в децидуальной оболочке матки и в печени [35, 42]. Вероятно, этот механизм позволяет компенсировать частичное подавление тимического пути развития Т-клеток во время беременности в результате транзиторной атрофии тимуса. Аналогичный процесс происходит при возрастной инволюции тимуса, когда по мере старения организма отмечается повышение содержания Т-клеток экстратимического происхождения [43]. Ряд исследователей считают, что экстратимическая дифференцировка во время неосложненной беременности может индуцироваться эстрогенами плаценты и активацией симпатических нервов [81, 88, 143]. Кроме того, на процесс внетимической дифференцировки Т-лимфоцитов могут оказывать влияние цитокины плаценты и децидуальной оболочки беременной матки, в частности OSM (онкостатин М), концентрация которого в сыворотке беременных женщин значительно выше аналогичных показателей небеременных женщин [36, 37]. 78 Механизм экстратимической дифференцировки Т-лимфоцитов в настоящее время изучен недостаточно. По мнению одних авторов реаранжировке цепей Тклеточного рецептора подвергаются зрелые лимфоциты в результате его «ревизии» и появления нового репертуара антигенраспознающего центра [15]. Другие авторы рассматривают экстратимическую дифференцировку как процесс реаранжировки -цепей T-клеточного рецептора в незрелых лимфоцитах, эмигрировавших из тимуса [118]. В этом случае формирование -цепей Т- клеточного рецептора должно было бы сопровождаться образованием TREC, однако, как показали наши исследования, при беременности этого не происходит. Следует подчеркнуть, что по нашим данным, образующийся при беременности пул наивных Т-хелперов обладал способностью к продукции цитокинов и Th1, и Th2 типов иммунного ответа. В нашей работе получалось, что пролиферирующие наивные клетки в больших количествах продуцируют IFN – маркер Th1 типа иммунного ответа, так и IL-4 – маркер Th2 типа иммунного ответа. Данные литературы о характере дифференцировки Th1 и Th2 клеток при беременности не однозначны [56, 68, 164], и практически полностью отсутствуют сведения о дифференцировки наивных Т-хелперов. Ранее считалось, что преимущественное развитие иммунного ответа по гуморальному типу менее опасно для плода, в то время как Th1 тип иммунного ответа определяет потенциально враждебный для плода клеточно-опосредованный иммунный ответ [56]. Однако в ряде работ были получены данные, не укладывающиеся в рамки этой теории [68, 164]. Оказалось, что увеличение в крови содержания комплекса цитокинов Th1 типа иммунного ответа не всегда коррелирует с неблагоприятным течением и исходом беременности и, наоборот, при акушерско-гинекологической патологии может быть высокий уровень цитокинов Th2 типа иммунного ответа [68, 164]. Наши данные свидетельствуют о повышении способности иммунной системы матери к индукции как клеточного, так и гуморального иммунного ответа. Усиление дифференцировочного потенциала Т-хелперов при 79 беременности, вероятно, определяется необходимостью быстрого развития иммунного ответа матери на патологическое воздействие факторов внешней среды и изменения внутреннего гомеостаза. Результаты исследований показали, что отличительной чертой пула наивных ЦТЛ являлось усиление их способности к продукции цитотоксических молекул (Granzyme B) в ранние сроки гестации, и последующее снижение цитотоксической и цитолитической активности клеток во 2 триместре беременности. По данным литературы известно, что многие исследователи рассматривают инфекционный фактор как ведущую причину невынашивания беременности [5, 29, 2, 23]. Весомая роль в патогенезе невынашивания принадлежит вирусной инфекции [28, 14, 2]. Показано, что активная вирусная инфекция может вызывать нарушение плацентации [28]. Вероятно, в 1 триместре беременности при отсутствии мощного плацентарного барьера, повышение уровня наивных ЦТЛ, продуцирующих Granzyme B, позволяет ограничить распространение клеток, пораженных вирусом, путем их апоптоза и цитолиза. Во 2 триместре беременности, процесс формирования плацентарных барьеров завершается, и плацента берет на себя функцию ограничения поступления различных патогенов к плоду, что, вероятно, делает этот механизм менее актуальным. Снижение уровня наивных цитотоксических Т-лимфоцитов, продуцирующих Granzyme B и Perforin, в этом случае может свидетельствовать о наличии особых механизмов, ограничивающих цитотоксический потенциал в отношении клеток плодового происхождения. Наряду с процессом экстратимической дифференцировки наивных Тлимфоцитов при беременности увеличение данного пула клеток могло определяться гомеостатической пролиферацией клеток на системном уровне. По данным литературы гомеостатическая пролиферация наивных клеток поддерживается рядом цитокинов, таких как IL-7 и IL-2 [110, 153]. Кроме того, IL-2 является основным ростовым фактором Т-лимфоцитов [39, 11]. Количество IL-2, продуцируемого активированными Т-хелперами, определяет величину Тклеточного иммунного ответа [39]. 80 В связи с этим на следующем этапе нашей работы мы оценили сывороточный уровень IL-2 и попытались выявить возможное влияние этого цитокина на процесс дифференцировки Т-хелперов и цитотоксических Тлимфоцитов при неосложненной беременности в динамике гестационного процесса в 1, 2 и 3 триместрах гестации. Влияние IL-2 на процесс дифференцировки Т-лимфоцитов при беременности остается мало изученным. Однако Лазаревой Ю. Ю. (2013г.) в эксперименте in vitro было показано, что воздействие IL-2 вызывает рост содержания наивных клеток в популяции периферических CD8+ лимфоцитов у беременных женщин 3 триместра гестации [16]. В нашей работе с наступлением беременности отмечалось значительное увеличение сывороточного уровня IL-2, сохранявшееся и во 2 триместре гестации, со снижением к концу гестационного процесса. Как известно, основными продуцентами IL-2 являются CD4+ лимфоциты [39, 11]. Причем, активация гена IL-2 в лимфоцитах происходит только после взаимодействия антигена с Т-клеточным рецептором [39]. Полученные нами данные позволяют предположить, что, начиная уже с ранних сроков беременности, на системном уровне происходит активация Т-хелперов под действием факторов, специфичных для гестационного процесса. К таковыми могут относиться и АГ плодового происхождения. Так как многочисленными исследованиями было показано, что в периферический кровоток матери во время беременности проникают фрагменты синцитиотрофобласта, ДНК и лимфоциты плода [18, 27, 66, 92, 113, 183, 184, 149, 167]. Регуляция IL-2 зависимой пролиферации лимфоцитов прямо связана с присутствием специфического антигена и при его элиминации быстро затухает [39]. Как известно, при акушерской патологии проницаемость плацентарного барьера усиливается, что приводит к большему поступлению антигенов плодового происхождения в кровоток матери [9, 184]. Возможно, именно это обусловило выявленную нами тенденцию к повышению содержания IL-2 в периферической крови женщин с неосложненным на момент обследования 81 течением гестационного процесса и развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем в 1 триместре гестации. Несмотря на то, что некоторые исследователи отмечали снижение сывороточного уровня IL-2 при угрозе прерывания беременности в 1 триместре гестации [22], результаты наших исследований полностью совпадают с данными тех авторов, которые показали увеличение содержания IL-2 в сыворотке крови при угрозе прерывания беременности по сравнению с группой женщин с неосложненным течением беременности [13]. Следовательно, выявленный нами рост уровня наивных клеток в популяции Т-хелперов у женщин с развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем вполне мог быть обусловлен стимулирующим влиянием IL-2. Известно, что для беременности характерно явление микрохимеризма, характеризующееся наличием в организме генетически отличающихся клеток, на которые не происходит развитие иммунного ответа при низком уровне антигенной нагрузки [147, 46, 58, 203, 55, 211, 138]. Микрохимеризм представляет собой явление, характеризующееся присутствием в многоклеточном организме небольшого количества клеток, которые происходят и самостоятельно передаются в обход полового размножения от другого родственного многоклеточного организма и, следовательно, генетически отличны от клеток хозяина-носителя [145, 46, 58]. Ряд авторов предполагают, что трансплацентарная миграция плодовых клеток естественна для нормального развития плаценты и плода, и их циркуляция во время беременности осуществляет важную роль в индукции иммунологической анергии и/или толерантности у матери и плода [93]. При повышении порогового уровня - более 1% от всех клеток организма, идет пролиферация специфических клонов наивных лимфоцитов. Так, в работах некоторых авторов было показано, что при развитии различной акушерскогинекологической патологии, в организме матери отмечается увеличение клеток микрохимер плодового происхождения [166, 195, 138], что связывают с ростом проницаемости плацентарного барьера [9, 184]. Можно предположить, что выявленное нами повышение уровня наивных Т-лимфоцитов в популяции Т- 82 хелперов при развитии самопроизвольного выкидыша определяется, в том числе и этим механизмом. При проведении ретроспективного анализа содержания наивных клеток с фенотипом CD45RA+CD62L+ беременных женщин (5-8 недель гестации) в популяции Т-хелперов периферической крови было установлено, что высокие значения показателя Tn клеток (равное или более 46,7%), позволяют с высокой точностью прогнозировать развитие раннего самопроизвольного выкидыша. Точность способа составляет 85,1%, чувствительность 76,9%, специфичность 88,9%. Установленный нами прогностический параметр может быть рекомендован для внедрения в практическое здравоохранение, что дает возможность своевременно выбрать правильную тактику ведения женщин с риском развития данной акушерско-гинекологической патологии и избежать неблагоприятных исходов беременности. На основании полученных данных нами была оформлена заявка на изобретение «Способ прогнозирования самопроизвольного выкидыша» (положительное решение о выдаче патента от 14 мая 2014 г.) Наивные Т-лимфоциты (CD4+ и CD8+) в Т-зонах лимфоидных органов под действием антигена, презентируемого им дендритными клетками, подвергаются клональной экспансии и дифференцируются в короткоживущие эффекторные клетки, при этом часть из них приобретают свойства клеток памяти [171, 95, 184]. Развитие иммунологической памяти, которая формируется в результате иммунного ответа на антиген, представляет очень важный феномен, так как способность формировать клетки памяти обеспечивает одно из наиболее кардинальных отличий адаптивного иммунитета от врожденного [39]. Исследование особенностей дифференцировки Т-лимфоцитов при беременности представляет несомненный интерес, поскольку во время гестационного процесса возможен непосредственный контакт материнских иммунных клеток с фетальными антигенами [184]. Это может вызывать формирование пулов клетокпамяти, влиять на экстратимическую дифференцировку лимфоцитов, определять особый характер продукции цитокинов. 83 Исследования последних лет показали, что уровень функциональной активности Т-лимфоцитов определяется стадией их дифференцировки, при этом различают 3 пула клеток памяти, характеризующихся различной экспрессией молекул CD45RA, CD45RO, CD62L, CCR7, СD27, CD28, CD11b, CD11a, CD49d, FasL, продукцией ряда цитокинов и функциональных молекул [184, 171, 95, 77]. Вопрос о линейности дифференцировки Т-лимфоцитов до конца не изучен. В настоящее время предлагается несколько вариантов дифференцировки Тлимфоцитов [123, 124, 135, 179, 201]. Однако предполагают, что изменение экспрессии изоформ молекул CD45 непосредственно ассоциировано с переходом клеток на различные этапы дифференцировки [171, 95, 184, 77]. Результаты многочисленных исследований последних лет показывают, что во время беременности в периферический кровоток матери поступают как фрагменты синцитиотрофобласта, ворсин хориона и ДНК плода, так в значительном количестве и его лимфоциты [18, 27, 66, 92, 113, 183, 184, 149, 167]. Такая ситуация, казалось бы, должна сопровождаться патологическим ответом со стороны иммунной системы матери, но в норме этого не происходит, и только при осложнениях гестационного процесса (невынашивании беременности, преэклампсии, фето-плацентарной недостаточности и др.) многие исследователи отмечают развитие цитотоксических и аутоиммунных реакций [166, 195]. При патологии беременности, в частности при преэклампсии и досрочном прерывании беременности количество клеток плодового происхождения в организме матери значительно возрастает [166, 195, 138], что, вероятно, может способствовать развитию цитотоксических и аутоиммунных реакций, направленных на отторжение плода [176, 102]. Как предполагают различные исследователи, повышение уровня антигенного материала плодового происхождения в периферическом кровотоке беременной женщины при патологии беременности происходит в результате нарушения плацентарных барьеров [9, 184]. То есть неадекватный ответ материнской иммунной системы играет важную роль в развитии привычного 84 невынашивания, идиопатического бесплодия и самопроизвольного выкидыша, преэклампсии [41, 9, 133, 163]. Следовательно, стимуляция иммунной системы матери антигенами плода является необходимым фактором нормального развития беременности [9], а избыточное поступление антигенов при нарушении барьерной функции плаценты приводит к формированию патологии беременности [167, 152]. Достаточная продолжительность непосредственного контакта материнских лимфоцитов с разнообразными антигенами плодового происхождения во время гестационного процесса позволяет предположить возможность формирования «иммунологической памяти», сопровождающейся изменением процесса дифференцировки материнских Т-лимфоцитов и формированием особых пулов клеток памяти [18, 27, 66, 92, 113, 183, 184, 149, 167]. Однако проведенное нами исследование не выявило увеличения пропорции различных пулов клеток памяти в популяции Т-хелперов и цитотоксических Тлимфоцитов периферической крови беременных женщин на всем протяжении гестационного процесса при сравнении с небеременными донорами. Более того, наступление неосложненной беременности уже в 1 триместре гестации сопровождалось достоверным снижением уровня претерминально- дифференцированных клеток в популяции CD8+ лимфоцитов по сравнению с показателями небеременных женщин, сохранявшееся и во 2 триместре беременности, с постепенным увеличением до показателей небеременных женщин к 3 триместру гестации. По литературным данным известно, что Тem клетки в естественных условиях имеют поляризованные ацетилированные паттерны генов цитокинов и быстро производят большие количества цитокинов и ряда функциональных молекул при антигенной стимуляции [86, 77, 141, 87]. Претерминально-дифференцированные клетки памяти не экспрессируют на своей поверхности CD62L и CCR7 молекулы, что обуславливает значительное ослабление их способности мигрировать в Т-зоны вторичных лимфоидных органов [131]. Вместо того, Тem клетки мигрируют в периферические и 85 нелимфоидные ткани, где они могут обеспечивать эффективную цитотоксическую активность [131]. Помимо этого, во 2 триместре неосложненной беременности нами отмечалось достоверное снижение уровня центральных клеток памяти как в популяции CD4+ лимфоцитов, так и в популяции CD8+ лимфоцитов при сравнении с показателями небеременных женщин, сохранявшееся и в 3 триместре гестации в пуле Т-хелперов. Установлено, что центральные клетки памяти имеют гипо-ацетилированные гены цитокинов и не имеют или имеют низкую эффекторную функцию, хотя они могут быстро отвечать на антиген при повторной стимуляции. При этом Tcm эффективно дифференцируются в Th1 или Th2 эффекторные клетки после стимуляции TCR в присутствии IL-12 или IL-4 [141, 87]. Как известно, Tcm не обладают эффекторными функциями, хотя они могут быстро отвечать на антиген при повторной стимуляции. Часть пула центральных клеток памяти гибнет при завершении иммунного ответа, уходя в апоптоз, часть – проходит дальнейший этап дифференцировки [134, 215]. Факторы, определившие такие изменения в содержании клеток памяти в популяции CD8+ лимфоцитов неясны. С одной стороны, у беременных женщин нами отмечалось изменение пропорции внутри популяции лимфоцитов в сторону преобладания наивных CD45RA+CD62L+ лимфоцитов [10]. С другой стороны, уже начиная с ранних сроков гестации, патологическое развитие иммунного ответа ограничивается действием регуляторных Т-лимфоцитов [212]. На основании полученных данных нами впервые были разработаны нормативные показатели содержания наивных клеток и клеток памяти в популяциях Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов в динамике неосложненной беременности, расчет которых проводился на основе 95% доверительного интервала. По литературным данным известно, что развитие патологии беременности в большинстве случаев сопровождается усилением проницаемости плацентарного барьера и изменением антигенной нагрузки в результате неполноценного формирования и/или функционирования фето-плацентарного комплекса [184, 113, 86 152]. Этот факт подтверждает наше предположение о значимости стимуляции иммунной системы матери плодовыми АГ в дифференцировке клеток памяти. Об этом свидетельствует и установленный ранее факт, что стимуляция материнских цитотоксических лимфоцитов микрочастицами ворсинчатого хориона при физиологической беременности способствует повышению уровня терминальнодифференцированных цитотоксических Т-лимфоцитов [16]. По данным литературы известно, что процесс дифференцировки Тлимфоцитов существенно меняется при развитии осложнений гестационного процесса [4, 24, 17]. Как показали результаты наших исследований, развитие самопроизвольного выкидыша 1 триместра гестации сопровождалось выраженными изменениями в содержании клеток, находящихся на различных этапах дифференцировки. Так, в популяции периферических Т-хелперов отмечалось снижение уровня центральных клеток памяти относительно беременных женщин с неосложненным течением гестационного процесса. В то же время, в периферической крови женщин с развившимся впоследствии ранним самопроизвольным выкидышем отмечалось достоверное увеличение содержания высокоэффекторных терминально-дифференцированных клеток памяти, как в популяции Т-хелперов, так и популяции цитотоксических Т-клеток. Это могло определяться чрезмерной антигенной стимуляцией плодовыми антигенами, связанной с нарушениями ранних процессов формирования фето-плацентаного комплекса. Известно, что терминально-дифференцированные Т-лимфоциты являются наиболее длительно живущими клетками памяти, способными к циркуляции в кровотоке в течение всей жизни человека [95, 134, 205]. Эти клетки способны к пролиферации при непосредственном контакте с антигеном без этапа его презентации дендритными клетками и макрофагами [158]. В немногочисленных работах, посвященных этой проблеме, формирование эффекторных клеток памяти авторы связывают с усилением проницаемости плаценты для антигенов плодового происхождения [4, 24, 17]. Так, ранее было показано, что в периферической крови беременных женщин с гипертензивными расстройствами 3 триместра гестации в популяциях Т-хелперов и 87 цитотоксических Т-лимфоцитов также отмечалось увеличение доли терминальнодифференцированных клеток памяти с фенотипом CD45RA+CD62L- [4, 17], которые способны быстро активироваться и осуществлять эффекторную функцию непосредственно при контакте с АГ без длительного процесса его презентации [205, 158, 95, 171]. Полученные нами результаты сочетаются с предположениями ряда исследователей о том, что при самопроизвольном выкидыше начало развития патологического иммунного ответа происходит в достаточно отдаленный период времени [9]. По литературным дифференцированные данным лимфоциты известно, образуются на что терминально- конечном этапе дифференцировки, после длительной активации клеток, и обладают мощным цитотоксическим потенциалом, определяемым продукцией ими ряда цитокинов и цитолитических молекул [77, 95, 205, 158]. То есть развитие самопроизвольного выкидыша в 10-12 недель гестации сочеталось с формированием феномена иммунологической памяти, начиная с 4 недели беременности, так как уже в 5-8 недель гестации мы отмечали повышение уровня терминально- дифференцированных Т-клеток памяти в этой группе. Нарушение дифференцировки лимфоцитов может вести к изменению иммунорегуляции, фетальные определяя антигены, неадекватный приводя тем самым иммунный к ответ матери формированию на патологии беременности. Мы предположили, что при неосложненной беременности имеются механизмы, препятствующие проявлению «иммунологической памяти» материнских клеток в отношении плода, а при патологии беременности – эта защита нарушена. Наши исследования показали, что при неосложненной беременности контакт материнской иммунной системы с плодом практически не оказывает влияния на формирования «иммунологической памяти» и приводит к угнетению функции лимфоцитов, способных патологически воздействовать на плаценту и плод. Осложнения формировались беременности клетки «памяти», возникали у обладающие тех женщин, способностью у которых повреждать 88 собственные органы и ткани, а также плаценту и плод. Причем у женщин с неосложненным течением гестационного процесса на момент обследования и развившимся впоследствии самопроизвольным выкидышем в периферической крови в максимальной степени увеличивался уровень наиболее активных терминально-диффренцированных клеток памяти, устойчивых к апоптозу [97], обладающих мощным цитотоксическим потенциалом и способных сохранять свои свойства на протяжении всей жизни [95, 134, 205]. Таким образом, в настоящий момент можно предположить, что при неосложненной беременности на системном уровне в периферической крови действуют факторы, блокирующие формирование пула клеток памяти в популяции Т-хелперов и ЦТЛ, что может приводить к снижению циркулирующего пула высокоактивных эффекторных Т-лимфоцитов, способных к осуществлению антиген-специфических цитотоксических реакций адаптивного иммунитета в отношении антигенов плодового происхождения. По литературным данным известно, что на процесс дифференцировки Тклеток памяти может оказывать влияние IL-15 [74, 106, 108, 137]. Показано, что IL-15 служит гомеостатическим фактором для Т-клеток памяти [11, 206]. Этот цитокин контролирует пролиферацию активированных антигеном Т-лимфоцитов [11] и способствует выживанию клеток памяти [193, 108]. Интерлейкин-15 может синтезироваться различными типами клеток во многих органах, но в периферической крови основными его продуцентами являются моноциты [11]. Характерной особенностью данного цитокина является способность накапливаться в везикулах клетки в отсутствии активационного сигнала без секреции во внеклеточное пространство. Кроме того, IL-15 в значительной степени может существовать в виде биологически активной мембранной форме [11]. По нашим данным с наступлением беременности уровень сывороточного IL-15 возрастал многократно и был достоверно выше на всем ее протяжении по сравнению с показателями небеременных женщин. Это могло быть обусловлено как его синтезом de novo, так и повышенной секрецией из цитоплазматических 89 везикул или шеддингом с мембраны клеток. Однако данное повышение сывороточного уровня IL-15 при неосложненной беременности не сопровождалось ростом содержания центральных и эффекторных клеток памяти в популяциях периферических Т-лимфоцитов. Этот парадокс требует дальнейшего исследования. У женщин с неосложненным на момент обследования течением беременности 1 триместра гестации и развившимся впоследствии ранним самопроизвольным выкидышем среднее значение содержания IL-15 было достоверно выше, чем в группе женщин с неосложненным течением беременности на всем ее протяжении. В литературе имеются данные о том, что IL-15, производимый на ранних сроках беременности, является регулятором миграции и инвазии трофобласта и ремоделирования спиральных артерий матки [90]. Кроме того, этот интерлейкин является мощным ингибитором апоптоза и играет крайне важную роль в плацентарном ремоделировании [91, 26]. Однако на системном уровне роль IL-15 при беременности остается неясной, но можно предположить, что в норме он способствует усилению противоинфекционной защиты матери и плода, а при патологии беременности – развитию цитотоксических реакций, направленных на отторжение плаценты и гибель плода. Известно, что эффекторная функция CD4+ лимфоцитов определяется продукцией цитокинов, регулирующих направленность иммунного ответа [39]. Изучение особенностей функционального состояния клеток памяти при беременности показало, что со 2 триместра во фракции терминальнодифференцированных CD4+ лимфоцитов растет содержание клеток, продуцирующих IL-4. Эти данные хорошо согласуются с теорией T. Wegmann (1993), постулировавшего, что нормальное развитие беременности определяется преобладанием Th2 реакций иммунного ответа. Однако был получен ряд данных, не укладывающихся в рамки этой теории [68, 164]. Оказалось, что выявление в крови повышенного содержания Th1 комплекса цитокинов не всегда ассоциируется с неблагоприятным течением и исходом беременности и, наоборот, при акушерской патологии может отмечаться высокий уровень Th2 цитокинов 90 [68, 164]. В нашей работе в периферической крови женщин с неосложненным течением беременности в популяции Т-хелперов во 2 триместре беременности отмечалось и увеличение уровня претерминально-дифференцированных и терминально-дифференцированных клеток памяти, продуцирующих IFNgamma+. Следует отметить, что наиболее выраженные изменения функционального состояния клеток памяти отмечались нами во 2 триместре неосложненной беременности, а именно - в сроке 16-18 недель гестации. По данным литературы известно, что в 16-18 недель отмечается 2 волна инвазии трофобласта [20]. Можно предположить, что выявленное нами увеличение именно в этом сроке беременности уровня эффекторных популяций Tem и Temra, внутриклеточно продуцирующих интерлейкин-4 и IFNγ, является ответом на эту волну инвазии и отражает развитие материнского иммунного ответа, происходящее на локальном уровне. В 3 триместре беременности уровни IL-4- и IFN-gamma-продуцирующих CD4+ клеток снижались практически до показателей небеременных доноров. Такая динамика полностью соответствует представлениям о формирования эффекторных клеток памяти, при которой на завершающем этапе при уменьшении антигенной нагрузки их уровень снижался [53]. В эти сроки беременности ответ на специфические антигены плода мог реализовываться сформировавшимися клонами клеток памяти. При этом общий баланс в соотношении фракций клеток памяти восстанавливался в результате феномена сокращения (attrition) в результате ограничения их фоновой пролиферации, так как невозможна длительная циркуляция массивных пулов Temra. В популяции CD8+ лимфоцитов на всем протяжении неосложненной беременности основным изменением в проявлении эффекторной функции цитотоксических Т-лимфоцитов являлось угнетение продукции Perforin всеми типами клеток памяти. Известно, что Perforin является цитотоксическим белком, содержащимся в гранулах ЦТЛ и ЕК. Perforin играет важную роль в клеточном цитолизе. При проникновении в цитоплазматическую мембранную клеткимишени, перфорин полимеризуется и образует поры, через которые в клетку 91 поступают цитолитические молекулы, в том числе и гранзим, что приводит к гибели клетки [39]. Ранее было показано, что в популяции ЦТЛ есть клетки, которые осуществляют свою цитотоксическую активность независимо от Perforin [187]. В свете этих данных можно предположить, что при беременности, с одной стороны, функционирует именно эта популяция ЦТЛ. С другой стороны, ситуацию одновременно высокой продукции Granzyme B и низкой экспрессии Perforin можно рассматривать как дополнительный механизм, препятствующий чрезмерной активации эффекторных цитотоксических клеток при неосложненной беременности. Это сочетается с уменьшением фракции CD8+Tem в 1 триместре, Tcm и Tem во 2 триместре неосложненной беременности. Возможно, это объясняется особыми механизмами регуляции функциональной активности цитотоксических Т лимфоцитов при беременности. Так, например, в литературе имеются данные о том, что секретируемый децидуализированным эндометрием гликоделин, способен контролировать экспрессию Perforin в CD8+ клетках. При его воздействии подавляется синтез IL-2Rα и снижается экспрессия Eomes (Eomesodermin), который вместе с IL-2 непосредственно регулирует продукцию Perforin [177], тем самым, препятствуя пролиферации CD8+ Т-лимфоцитов и их созреванию в компетентные цитотоксические клетки. Однако уровень всех Granzyme B-продуцирующих клеток памяти в популяции CD8+ лимфоцитов не претерпевал значительных изменений по сравнению с показателями небеременных женщин и в динамике беременности. Следовательно, при неосложненной беременности существуют механизмы, ограничивающие цитолитическую активность CD8+ лимфоцитов, но не снижающие их цитотоксический потенциал. Природа данных факторов остается не до конца изученной. В настоящее время мы можем лишь предположить, что снижение цитолитического потенциала пула CD8+ клеток памяти в динамике неосложненной беременности может быть одним из факторов, способствующих формированию феномена толерантности иммунной системы матери к АГ плода. 92 Таким образом, гестационный процесс ассоциируется с выраженными изменениями дифференцировки наивных клеток и клеток памяти, как в популяции Т-хелперов, так и популяции цитотоксических Т-лимфоцитов, что, вероятно, связано с изменением цитокинового гомеостаза при беременности и аллогенной стимуляцией. Направленность дифференцировки Т-лимфоцитов, повидимому, зависит от силы и длительности антигенной стимуляции, которая выражена в различной степени при неосложненном течении беременности и при развитии акушерской патологии. 93 Заключение Суммируя полученные данные, можно предположить, что с наступлением беременности под влиянием поступающих антигенов плодового происхождения и изменившегося цитокинового фона, в частности, увеличение уровня IL-2 и IL-15, происходит усиление пролиферации наивных Т-клеток и изменение процесса дифференцировки Т-лимфоцитов. Так, проведенные нами исследования показали, что 1 триместр беременности ассоциируется с усилением синтеза цитокинов Th1 и Th2 типов. Во 2 триместре отмечается снижение пулов клеток памяти в популяциях Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов, а также уменьшение экспрессии ДНК TREC. Кроме того, во 2 триместре нами отмечалось увеличение выработки IFNγ и IL-4 эффекторными клетками памяти. В 3 триместре неосложненной беременности процесс дифференцировки стихает, и все параметры дифференцировки возвращаются к уровню небеременных доноров. Следует отметить, что на протяжении всей гестации, по-видимому, отмечается усиление гомеостатической пролиферации наивных клеток и снижение цитотоксического потенциала ЦТЛ. Таким образом, в динамике гестационного процесса идет активный ответ материнской иммунной системы на антигены плода. Особенностями этого ответа является резкое повышение содержания наивных клеток, не обладающих выраженными цитотоксическими свойствами, но обладающими эффекторным потенциалом, который необходим для защиты материнского организма во время беременности. Нарушение маточно-плацентарного барьера и массивный выход в кровоток матери антигенов плодового происхождения, а также резкое повышение уровня интерлейкина-15 приводят к изменению направленности дифференцировки Тхелперов и ЦТЛ и образованию большого количества высокоэффекторнных терминально-дифференцированных клеток памяти, способных к развитию цитотоксических реакций, направленных на отторжение преждевременное прерывание беременности на ранних сроках. плода и 94 ВЫВОДЫ 1. В периферической крови беременных женщин по сравнению с показателями небеременных женщин в популяции Т-хелперов на протяжении всего гестационного процесса повышено количество наивных клеток, во 2 и 3 триместрах снижен уровень центральных клеток памяти, а в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов увеличено содержание наивных Т-клеток в 1 и 2 триместрах, снижен уровень центральных во 2 триместре и претерминально- дифференцированных клеток памяти в 1 и 2 триместрах. 2. В 1 триместре неосложненной беременности по сравнению с показателями небеременных женщин усилена внутриклеточная продукция IL-4 и IFNγ наивными Т-хелперами, а также увеличена продукция Granzyme B наивными цитотоксическими Т-лимфоцитами, но снижена выработка Perforin центральными и претерминальнодифференцированными клетками памяти в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов; во 2 триместре в популяции Т-хелперов повышена продукция IFNγ в пулах претерминально- и терминально- дифференцированных клеток, продукция IL-4 в пуле терминальнодифференцированных клеток, но снижена выработка Perforin всеми типами клеток памяти цитотоксических Т-лимфоцитов; в 3 триместре уменьшена продукция Perforin центральными, претерминально- и терминально-дифференцированными клетками памяти. 3. В динамике беременности изменения в содержании клеток памяти, находящихся на разных стадиях дифференцировки, в популяции Тхелперов отсутствуют, во 2 триместре снижается уровень центральных клеток памяти по сравнению с показателями 1 триместра, в 3 триместре повышается количество претерминально-дифференцированных клеток памяти по сравнению с таковым во 2 триместре в популяции цитотоксических Т-лимфоцитов. 95 4. Внутриклеточная продукция цитокинов также меняется с увеличением срока беременности: во 2 триместре по сравнению с показателями 1 триместра повышается количество IL-4+ и IFNγ+ терминальнодифференцированных клеток в популяции Т-хелперов; снижается продукция Perforin и Granzyme B наивными клетками, а также уровень Perforin+ терминально-дифференцированных цитотоксических Т-лимфоцитов; в 3 клеток триместре в популяции уменьшается внутриклеточная продукция IFNγ претерминально- и терминальнодифференцированными клетками и IL-4 терминально- дифференцированными клетками памяти в популяции Т-хелперов, но повышается продукция Perforin наивными цитотоксическими Т- клетками. 5. В 1 и 2 триместрах неосложненной беременности по сравнению с показателями небеременных женщин повышен сывороточный уровень IL-2, который в 3 триместре снижается по сравнению с таковым во 2 триместре, сывороточное содержание IL-15 повышается в 1 триместре и остается повышенным на протяжении всего срока беременности. 6. Уровень наивных CD31+thymic клеток по сравнению с параметрами небеременных женщин снижается в 1 триместре и остается сниженным в течение всего гестационного периода, как в популяции Т-хелперов, так и цитотоксических Т-лимфоцитов, а количество наивных СD31-central, наоборот, повышается в 1 триместре и остается повышенным на протяжении всей беременности. Уровень экспрессии ДНК TREC не отличается от такового у небеременных женщин в 1 и 3 триместрах неосложненной беременности и снижается во 2 триместре. Во 2 триместре происходит снижение экспрессии ДНК TREC по сравнению с ее уровнем в 1 триместре, в 3 триместре уровень экспрессии ДНК TREC повышается по сравнению с таковым во 2 триместре. 7. В группе женщин с неосложненной на момент обследования беременностью и развившемся впоследствии ранним самопроизвольным 96 выкидышем по сравнению с показателями беременных женщин с неосложненным течением беременности 1 триместра гестации происходит снижение уровня центральных клеток памяти в популяции Т-хелперов на фоне повышения содержания терминально- дифференцированных клеток памяти в популяции Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов, а также повышается сывороточный уровень IL-15. 8. Высокое содержание CD45RA+CD62L+ лимфоцитов (равное или более 46,7%) в популяции периферических Т-хелперов позволяют с точностью 85,1% прогнозировать развитие самопроизвольного выкидыша в 1 триместре у женщин с неосложненной на момент обследования беременностью. 97 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ У беременных женщин в сроке 6-12 недель для прогнозирования развития раннего самопроизвольного выкидыша рекомендуется определять относительное содержание CD45RA+CD62L+ клеток в популяции Т-хелперов периферической крови и при его содержании равном или более 46,7% прогнозируют самопроизвольный выкидыш с точностью 85,1%. Дополнительно к стандарту иммунологического обследования беременной женщины в динамике гестационного процесса рекомендуется проводить оценку характера дифференцировочного процесса Т-хелперов и цитотоксических Тлимфоцитов периферической крови для оценки состояния иммунной системы. Врачам акушерам-гинекологам рекомендуется использовать нормативные значения содержания наивных клеток, центральных, претерминально- и терминально-дифференцированных клеток памяти в популяциях периферических Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов в 1, 2, 3 триместрах гестации. 1 триместр: CD4+CD45RA+CD62L+ 35,7-42,7%, CD4+CD45RA-CD62L+34,1-40,7 %, CD4+CD45RA-CD62L- 17,6-26,1%, CD4+CD45RA+CD62L-1,6-3,4 %; CD8+CD45RA+CD62L+ 33,1-43,4 %, CD8+CD45RA-CD62L+ 8,4-11,5%, CD8+CD45RA-CD62L- 17,1-24,4%, CD8+CD45RA+CD62L- 26,4-35,7%; 2 триместр: CD4+CD45RA+CD62L+ 37,3-46,9%, CD4+CD45RA-CD62L+ 30,5-37,5%, CD4+CD45RA-CD62L- 17,4-24,2%, CD4+CD45RA+CD62L- 2,1-4,3%; CD8+CD45RA+CD62L+ 34,9-45,0%, CD8+CD45RA-CD62L+ 7,7-10,0%, CD8+CD45RA-CD62L- 16,1-22,0%, CD8+CD45RA+CD62L-27,2-37,3 %; 3 триместр: CD4+CD45RA+CD62L+ 36,2-44,3%, CD4+CD45RA-CD62L+ 33,8-39,4%, CD4+CD45RA-CD62L- 17,8-25,1%, CD4+CD45RA+CD62L- 1,9-3,3%; CD8+CD45RA+CD62L+ 32,6-41,9%, CD8+CD45RA-CD62L+ 8,5-13,0%, CD8+CD45RA-CD62L- 20,7-26,8%, CD8+CD45RA+CD62L- 24,0-32,6%. 98 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 99 АГ – антиген ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ЕК- естественные киллеры мАТ - моноклональное антитело ЦТЛ - цитотоксические Т-лимфоциты APC - аллофикоцианин CD - кластер дифференцировки FITC - флюоресцеинизотиоцианат Gr B - Granzyme B IFNγ - интерферон γ IL - интерлейкин MHC - главный комплекс гистосовместимости OSM - онкостатин М PBS -фосфатный буфер PCR - полимеразная цепная реакция PE - фикоэритрин PerCP - перидинин-хлорофил протеин 5.5 Perf - Perforin RQ- related quantity Tcm - центральные клетки памяти TCR - Т-клеточный рецептор Tem - претерминально-дифференцированные клетки памяти Temra - терминально-дифференцированные клетки памяти Th - Т- хелперы Tn - наивные клетки TREC - кольца реаранжировки генов α-цепи антигенраспознающего рецептора СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 100 1. Блинова Е.А. Количество TREC в периферических Т-лимфоцитах человека в норме и при иммунопатологических состояниях: автореф. дис. … канд. биолог. наук. – Новосибирск, 2012. – 28 с. 2. Бойко Е. Л. Репродуктивное здоровье супружеских пар и его реабилитация при невынашивании беременности: автореф. дис. … д-ра мед. наук. – Иваново, 2006. – 48 с. 3. Воробьев А. А., Быковская С. Н., Пашков Е.П. Роль клеток-регуляторов CD4+CD25+ в развитии хронических инфекционных заболеваний // Вестник Рос. АМН. – 2006. – № 9–10. – С. 24–29. 4. Гасанова Д.Д. Дифференцировка и функциональная активность Т-хелперов при гипертензивных расстройствах у беременных: автореф. дис. … канд. мед. наук. – Иваново, 2012. – 28 с. 5. Доброхотова Ю. Э. инфекционные аспекты невынашивания: учебнометодическое пособие. – М., 2005. – 16с. 6. Донецкова А. Д. Новый подход к исследованию Т-лимфопоэза с помощью определения Т-рецепторных эксцизионных колец в эксперименте и клинике: автореф. дис. … д-ра мед. наук. – М., 2013. – 48 с. 7. Железникова Г. Ф. Регуляторные Т-лимфоциты в иммунном ответе на инфекцию // Журнал инфектологии. – 2011. – Т. 3, № 1. – С. 6–13. 8. Изучение колец реаранжировки генов α-цепи антигенраспознающего рецептора Т-лимфоцитов (TREC) как подход к оценке функции тимуса «in vivo» в норме и патологии / М. В. Головизнин [и др.] // Вестник Уральской медицинской академической науки. – 2010. – № 2/1. – С. 26–27. 9. Иммунологическая загадка беременности / Н. Ю. Сотникова [и др.]. – Иваново: МИК, 2005. – 272 с. 10. Кадырова Л.В., Сотникова Н.Ю., Кудряшова А.В. Дифференцировка Тлимфоцитов в динамике неосложненной беременности и при развитии акушерской патологии // Медицинская иммунология. – 2011. – Т. 13, № 4–5. – С. 424–425. 101 11. Кетлинский С. А., А. С. Симбирцев. Цитокины – С. –Петербург: Изд-во Фолиант, 2008. – 548 с. 12. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Хорева М.В., Соколова Е.В. Система цитокинов, комплемента и современные методы иммунного анализа. Москва, РГМУ.-2001.-158 с. 13. Кравченко Е.Н., Мишутина А.В. Прогнозирование течения беременности и профилактика преждевременных родов посредством определения цитокинов // Медицина и образование в Сибири. – 2012. – № 6. – С. 45–47. 14. Кузьмин В. Н., Адамян Л. В. Вирусные инфекции и беременность. – М.: Дипак, 2005. – 176 с. 15. Куклина Е. М. Ревизия антигенного рецептора Т-лимфоцитов // Биохимия. – 2006. – Т. 71. – № 8. – С. 1021–1033. 16. Лазарева Ю.Ю. Влияние in vitro IL-2 и микроворсин хориона на функциональную активность периферических ЦТЛ при неосложненной беременности и при гестозе // Российский иммунологический журнал. – 2013. – Т. 7(16), № 2 – 3. – С. 278. 17. Лазарева Ю.Ю. Дифференцировка цитотоксических Т-лимфоцитов и их функциональная активность при гипертензивных расстройствах во время беременности: автореф. дис. … канд. мед. наук. – М., 2013. – 28 с. 18. Ломунова М. А., Талаев В. Ю. Клетки трофобласта плаценты человека: пути их созревания и взаимодействие с иммунной системой // Иммунология. – 2007. – Т. 28, №1. – С. 50–58. 19. Лядова И. В. Молекулы CD27: роль в дифференцировке и миграции Тлимфоцитов // Иммунология. – 2008. – Т. 29. – № 4. – С. 244– 248. 20. Милованов А. П. Патология системы мать-плацента-плод: Руководство для врачей. – М.: Медицина, 1999. – 448с. 21. Невынашивание беременности, инфекция, врожденный иммунитет / О. В. Макаров [и др.] // М. – 2007. – 175 с. 102 22. Оценка продукции цитокинов при беременности, осложненной угрозой прерывания в первом триместре / Г. Н. Чистякова [и др.] // пациенток с Фундаментальные исследования. – 2005. – № 5. – С. 96– 98. 23. Оценка содержания иммунокомпетентных клеток у привычным невынашиванием беременности / Т. А. Велижинская [и др.] // Медицинская иммунология. – 2005. – Т. 7, № 2-3. – С. 182. 24. Панова И.А. Иммунные механизмы развития гестоза у беременных женщин: автореф. дис. ... д-ра мед. наук. – М., 2007. – 46 с. 25. Ранние нарушения продукции цитокинов при патологии беременности / Н. Ю. Сотникова [и др.] // Russian Journal of Immunology. – 2007. – Vol. 9. – P. 94. 26. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных – М.: Медиа Сфера, 2002. – 312 с. 27. Сельков С. А., Соколов Д. И. Иммунологические механизмы контроля развития плаценты // Журн. акушерства и женских болезней – 2010. – Т. LIX. – №1. – С. 6–10. 28. Сидельникова В. М., Сухих Г. Т. Невынашивание беременности: Руководство для практикующих врачей. – М.: ООО «медицинское информационное агенство», 2010. – 536 с. 29. Сидельникова В. М., Сухих Г. Т. Привычное Невынашивание и персистирующая вирусная инфекция (подготовка к беременности и ведение беременных) // Российский медицинский журнал. – 1999. – № 4. –С. 3–8. 30. Содержание центральных и эффекторных клеток памяти и функциональные свойства Т–лимфоцитов новорожденных и взрослых при различных способах активации in vitro / В. Ю. Талаев [и др.] // Иммунология. – 2005. – № 5. – С. 267–274. 31. Сотникова Н. Ю. Формирование феномена иммунологической памяти в динамике гестационного процесса // Российский иммунологический журнал. – 2010. – Т. 4 (13), № 4. – С.321–326. 103 32. Сотникова Н. Ю., Анциферова Ю. С., Крошкина Н. В. Иммуномодуляция и иммунорегуляция на системном и локальном уровне при беременности // Медицинская иммунология. – 2001. – Т. 3. – № 2. – С. 251–252. 33. Сотникова Н. Ю., Кудряшова А. В., Анциферова Ю. С. Системные и локальные механизмы регуляции иммунного ответа при неосложненной беременности // Российский иммунологический журнал. – 2004. – № 9(1). – С. 323. 34. Хайдуков С.В. Малые субпопуляции Т-хелперов (Th наивные тимические, Th наивные центральные, Th 9, Th 22 И CD4+CD8+ дважды положительныеТ-клетки) // Медицинская иммунология. – 2013. – Т. 15, № 6. – С. 503– 512. 35. Ширшев С. В. Иммунология материнско-фетальных взаимоотношений. – Екатеринбург: Уро РАН, 2009. – С. 367–375. 36. Ширшев С.В. Механизмы иммуноэндокринного контроля процессов репродукции. Т. 1. – Екатеринбург. 2002. – 430 с. 37. Ширшев С.В. Механизмы иммуноэндокринного контроля процессов репродукции. Т. 2. – Екатеринбург. 2002. – 557 с. 38. Шмагель К. В., Черешнев В. А. Иммунитет беременной женщины. – М.: Медицинская книга, 2003. – С. 20–33. 39. Ярилин А. А. Иммунология. – М.: ГЭОТАР–Медиа, 2010. – 752с. 40. A subset of functional effector–memory CD8+ T lymphocytes in human immunodeficiency virus–infected patients / A.Z. Decrion [et al.] // Immunology. – 2007. – Vol. 121(3). – Р. 405–415. 41. Abnormal T-cell reactivity against paternal antigens in spontaneous abortion: adoptive transfer of pregnancy induced CD4+CD25+ T regulatory cells prevents fetal rejection inamurine abortion model / A.C. Zenclussen [et al.] // Am. J. Pathol. – 2005. – Vol. 166. – P. 811–822. 42. Abo T., Kawamura T., Watanabe H. Physiological responses of extrathymic T cells in the liver // Rev. Immunol. – 2000. – Vol. 174. – P. 135–149. 43. Abo Т. Extrathymic pathways of T-cell differentiation and immunomodulation // 104 Int. Immunol. – 2001. – Vol. 1. – P. 1261-1273. 44. Acceleration of the onset of collageninduced arthritis by a deficiency of platelet endothelial cell adhesion molecule 1 / Y. Tada [et al.] // Arthritis. Rheum. – 2003. – Vol. 48. – P. 3280–3290. 45. Activated T lymphocytes in pre-eclampsia / D. Darmochwal-Kolarz [et al.] // Am. J. Reprod. Immunol. – 2007. – Vol. 58. – P. 39–45. 46. Adams Waldorf K. M., Nelson J. L. Autoimmune disease during pregnancy and the microchimerism legacy of pregnancy // Immunol. invest. – 2008. – Vol. 37. – Р. 631–644. 47. Ahlers J.D., Belyakov I.M. Memories that last forever: strategies for optimizing vaccine T-cell memory // Blood. –2010. – Vol. 115, № 9. –P. 1678–1689. 48. Alijotas-Reig J., Llurba E., Gris J. M. Potentiating maternal immune tolerance in pregnancy: a new challenging role for regulatory T cells // Placenta. – 2014. – Vol. 35(4). – Р. 241–248. 49. Alloantigen enhanced accumulation of CCR5+ „effector‟ regulatory T cells in the gravid uterus / M. Kallikourdis [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2007. – Vol. 104. – P. 594–599. 50. Aluvihare V. R., Kallikourdis M., Betz A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus // Nat. Immunol. – 2004. – Vol. 5. – P. – 266–271. 51. Analysis of immune reconstitution after autologous bone marrow transplantation in systemic sclerosis / D. Farge [et al.] // Arthritis Rheum. – 2005. – Vol. 52(5). – P. 1555–1563. 52. Аnnacker, O., Pimenta-Araujo R., Burlen-Defra O. On the ontogeny and phisiology of regulatory T cells // Immunol. Rev. – 2001. – Vol. 182. – P. 5–17. 53. Assessment of thymic output in adults afterr haematopoietic stem cell transplantation and prediction of T cell reconstitution / D. C. Douek [et al.] // Lancet. – 2000. – Vol. 355. – Р. 1875–1881. 54. Assessment of thymic output in common variable immunodeficiency patients by evaluation of T cell receptor excision circles / V. Guazzi [et al.] // Clin. Exp. Immunol. – 2002. – Vol. 129. – P. 346–353. 105 55. Bianchi D. W. Current knowledge about fetal blood cells in the maternal circulation // J. Perinat. Med. – 1998. – Vol. 16. – Р. 175–185. 56. Bidirectional cytokine interactions in the maternal-fetal relationship: is successful pregnancy a Th2 phenomenon? / T.G.Wegmann [et al.] // Immunol. Today. – 1993. –Vol. 14. – P. 353–356. 57. Billington W. D. The nature and possible functions of MHC antigens on the surface of human trophoblast // Reproductive immunology. – 1999. – Р. 71–77. 58. Blood chimerism in a pair twins / P. B. Booth [et al.] // J. Br. Med. – 1957. – № 1. – Р. 1456–1458. 59. Boyum A. A one-stage procedure for isolation of granulocytes and lymphocytes from human blood. General sedimentation properties of white blood cells in a 1g gravity field // Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. – 1968. – Vol. 97. – P. 51–76. 60. CD31 (PECAM-1) is a differentiation antigen lost during human CD4 T-cell maturation into Th1 or Th2 effector cells / C. E. Demeure [et al.] // Immunology. – 1996. – Vol. 88. – P. 110–115. 61. CD31 (PECAM-1) is a marker of recent thymic emigrants among CD4+ T-cells, but not CD8+ T-cells or gammadelta T-cells, in HIV patients responding to ART / S. Tanaskovic [et al.] // Immunol. Cell. Biol. – 2010. – Vol. 88(3). – P. 321–327. 62. CD4+CD25+ regulatory T cells in human pregnancy: development of a TregMLC-ELISPOT suppression assay and indications of paternal specific Tregs / J. Mjosberg [et al.] // Immunology. – 2007. – Vol. 120. – P. 456–466. 63. CD4+CD25+ regulatory/suppressor T cells prevent allogeneic fetus rejection in mice / G. Darrasse-Jeze [et al.] // Immunol. Lett. – 2006. – Vol. 102. – P. 106– 109. 64. CD45RA-expressing memory/effector Th cells committed to production of interferon-gamma lack expression of CD31 / A. Thiel [et al.] // Immunol. Lett. – 1997. – Vol. 57. – P. 189–192. 65. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection / D. C. Douek [et al.] // Nature. – 1998. – Vol. 396. – P. 690–695. 66. Characterisation of syncytiotrophoblast vesicles in normal pregnancy and pre- 106 eclampsia: expression of Flt-1 and endoglin / D. S. Tannetta [et al.] // Plos one. – 2013. – Vol. 8(2). – е56754. 67. Characterization of CD4+CD25+regulatory T cells in patients treated with highdose interleukin-2 for metastatic melanoma or renal cell carcinoma / G. C. Cesana [et al.] // J. Clin. Oncol. – 2006. – Vol. 24. – Р. 1169–1177. 68. Characterization of type 1 and type 2 cytokine production profile in physiologic and pathologic human pregnancy / M. Marzi [et al.] // Clin. Exp. Immunol. – 1996. – Vol. 106. – P. 127–133. 69. Clarke A.G., Kendall M.D. The thymus un pregnancy: the interplay of neural, endocrine and immune influences // Immunol. Today. – 1994. – Vol. 151. – P. 545–551. 70. Constitutive intracellular expression of human leukocyte antigen (HLA)-DO and HLA-DR but not HLA-DM in trophoblast cells / A. Ranella [et al.] // Hum. Immunol. – 2005. – Vol. 66(1). – Р. 43-55. 71. Constraints in antigen presentation severely restrict T cell recognition of the allogeneic fetus / A. Erlebacher [et al.] // J. Clin. Invest. – 2007. – Vol. 117. – Р. 1399–1411. 72. Cornish G. H., Sinclair L.V., Cantrell D. A. Differential regulation of T-cell growth by IL-2 and IL-15 // Blood. – 2006. – Vol. 108(2). – P. 600–608. 73. Curtsinger J. M., Johnson C. M., Mescher M. F. CD8 T cell clonal expansion and development of effector function require prolonged exposure to antigen, costimulation, and signal 3 cytokine // J. Immunol. – 2003. – Vol. 171. – P. 5165– 5171. 74. Cytokine synergy in antigen–independent activation and priming of naive CD8+ T lymphocytes / S. Ramanathan [et al.] // Rev. Immunol. – 2009. – Vol. 29. – Р. 219–239. 75. De novo T-cell generation in patients at different ages and stages of HIV-1 disease / M. Nobile [et al.] // Blood. – 2004. – Vol. 104. – P. 470–477. 76. Decidual and peripheral blood CD4+CD25+ regulatory T cells in early pregnancy subjects and spontaneous abortion cases / Y. Sasaki [et al.] // Mol. Hum. Reprod. 107 – 2004. – Vol. 10. – P. 347– 353. 77. Decreased effector memory CD45RA+CD62L–CD8+ T cells and increased central memory CD45RA– CD62L+ CD8+ T cells in peripheral blood of rheumatoid arthritis patients / A. Maldonado [et al.] // Arthritis. Res. Ther. – 2003. – Vol. 5. – Р. 91–96. 78. Decreased T-cell receptor excision circles in cutaneous T-cell lymphoma / K. Yamanaka [et al.] // Clin. Cancer Res. – 2005. – Vol. 11. – P. 5748–5755. 79. Detection of minimal residual disease in hematologic malignancies by real-time quantitative PCR: priciples, approaches, and laboratory aspects. V.H.J. van. Velden [et al.] // Leukemiea. – 2003. – Vol. 17. – Р. 1013-1034. 80. Differential alterations of the CD4 and CD8 T cell subsets in HIV-infected patients on highly active antiretroviral therapy with low CD4 T cell restoration / G. Méndez-Lagares [et al.] // J. Antimicrob. Chemother. – 2012. – Vol. 67(5). – Р. 1228–1237. 81. Differentiation of forbidden T-cell clones and granulocytes in the parenchymal space of the liver in mice treated with estrogen / J. Narita[et al.] // Cell. Immunol. – 1998. – Vol. 185. – P. 1–13. 82. Differentiation of human alloreactive CD4+ and CD8+ T cells in vitro / N. Nikolaeva [et al.] // Transplantation. – 2004. – Vol. 78. – Р. 815–824. 83. Direct assessment of thymic reactivation after autologous stem cell transplantation / A. Thiel [et al.] // Acta. Haematol. – 2008. – Vol. 119. – P. 22– 27. 84. Dooley J., Liston A. Molecular control over thymic involution: From cytokines and microRNA to aging and adipose tissue // Eur. J. Immunol. – 2012. – Vol. 42. – P. 1073–1079. 85. Ebert L.M., Schaerli P., Moser B. Chemokine-mediated control of T cell traffic in lymphoid and peripheral tissues // Mol. Immunol. – 2004. – Vol. 42(7). – P. 799–809. 86. Effector CD8+CD45RO–CD27–T cells have signalling defects in patients with squamous cell carcinoma of the head and neck / I. Kuss [et al.] // Br. J. Cancer. – 108 2003. – Vol. 88. – Р. 223–230. 87. Engelhardt B.,Wolburg H. Mini-review: Transendothelial migration of leukocytes: through the front door or around the side of the house? // Eur. J. Immunol. – 2004. – Vol. 34 (11). – Р. 2955–2963. 88. Estrogen administration activates extrathymic T-cell differentiation in the liver / R. Okuyama [et al.] // J. Exp. Med. – 1992. – Vol. 175. – P. 661–669. 89. Evaluation of thymopoiesis using T cell receptor excision circles (TRECs): differential correlation between adult and pediatric TRECs and naive phenotypes / C.M. Steffens [et al.] // Clin. Immunol. – 2001. – Vol. 97. – P. 95. 90. Expression profiles of interleukin-15 in early and late gestational human placenta and in pre-eclamptic / R. Agarwal [et al.] // Mol. Hum. Reprod. – 2001. – № 7. – P. 97–101. 91. Fehniger, T. A., Caligiuri M. A. Interleukin 15: biology and relevance to human disease // Blood. – 2001. – Vol. 97(1). – Р. 14–32. 92. Fetal cells in maternal blood of pregnancies with severe fetal growth restriction / R. Al-Mufti [et al.] // Hum. Reprod. – 2000. – Vol. 15. – P. 218–221. 93. Fisher S. J., Damsky C. H. Human cytotrophoblast invasion // Semin. Cell. Biol. – 1993. – № 4. – Р. 183–188. 94. Freitas A. Regulation of lymphocyte homeostasis // J. Introduction. – 2002. – № 4. – P. 529– 530. 95. Geginat J., Lanzavecchia A., Sallusto F. Proliferation and differentiation potential of human CD8 memory T–cell subsets in response to antigen or homeostatic cytokines // Blood. – 2003. – Vol. 101. – Р. 4260–4266. 96. Growth hormone enhances thymic function in HIV-1-infected adult / L. A. Napolitano [et al.] // J. Clin. Invest. – 2008. – Vol. 118(3). – P. 1085–1098. 97. Gupta S., Agrawal S., Gollapudi S. Differential effect of human herpesvirus 6A on cell division and apoptosis among naïve and central and effector memory CD4 and CD8 T-cell subsets // J. of Virology. – 2009. – Vol. 83, № 11. – P. 5442–5450. 98. Hammerstrom L., Fuchs T., Smith C.I.E. The immunosuppressive effect of human glycoproteins and their possible rolt in the nonrejection process during 109 pregnancy // Act. Obste. Gynecol. Scand. – 1979. – Vol. 58. – P. 422–477. 99. Heikkinen J., Mottonen M., Alanen A. Phenotype characterization of regulatory T cells in the human deciduas // Clin. Exp. Immunol. – 2004. – Vol. 136. – P. 373–378. 100. Hellberg S., Mehta R. B., Edström M. The export of T helper cells from thymus during pregnancy // Front. Immunol. Conference Abstract: 15th International Congress of Immunology. Milan, Italy. – 2013. 101. Heterogeneity of the human CD4+ T-cell population: two distinct CD4+ T- cell subsets characterized by coexpression of CD45RA and CD45RO isoforms / D. Hamann [et al.] // Blood. – 1996. – Vol. 88. – Р. 3513-3521. 102. Holzgreve W. Disturbed feto-maternal cell traffic in preeclampsia // Obstet. Gynecol. – 1998. – Vol. 91. – Р. 669–672. 103. Hori S., Takahashi T., Sakaguchi S. Control of autoimmunity by naturally arising regulatory CD4+ T-cells // Adv. Immunol. – 2003. – № 81. – P. 331–371. 104. Hug A., Korporal M., Schroder I. Thymic export function and T cell homeostasis in patients with relapsing remitting multiple sclerosis // J. Immunol. – 2003. – Vol. 171. – P. 432–437. 105. Human virus–specific CD8+ T cells: diversity specialists / E.M. Van Leeuwen [et al.] // Immunol Rev. – 2006. – Vol. 211. – Р. 225–235. 106. IL-15 and IL-2: a matter of life and death for T cells in vivo / X. C. Li [et al.] // Nature Medicine. – 2001. – Vol. 7. – Р. 114–118. 107. IL–15 regulates both quantitative and qualitative features of the memory CD8 T cell pool / M.M. Sandau [et al.] // J. Immunol. – 2010. – Vol. 184. – Р. 35–44. 108. IL–15 regulates both quantitative and qualitative features of the memory CD8 T cell pool / M. M. Sandau [et al.] // J. Immunol. – 2010. – Vol. 184. – Р. 35–44. 109. IL–7 receptor alpha chain expression distinguishes functional subsets of virus– specific human CD8+ T cells / E.M. Van Leeuwen [et al.] // Blood. – 2005. – Vol. 106. – Р. 2091–2098. 110 110. IL-7 sustains CD31 expression in human naïve CD4+ T cells and preferentially expands the CD31+ subset in aPI3K dependent manner / R. I. Azevedo [et al.] // Blood. – 2009. – Vol. 113(13). – P. 2999–3007. 111. Immunology of Preeclampsia / L. Matthiesena [et al.] // Chem. Immunol. Allergy. – 2005. – Vol. 89. – Р. 49–61. 112. Impact of thymectomy on the peripheral T cell pool in rhesus macaques before and after infection with simian immunodeficiency virus / S.T. Arron [et al.] // Eur J Immunol. –2005. – Vol. 35(1). – P. 46–55. 113. Inadequate tolerance induction may induce pre-eclampsia / S. Saito [et al.] // J. Reprod. Immunolo. –2007. – Vol. 76(1-2). –P. 30–39. 114. Inducible IL-2 production by dendritic cells revealed by global gene expression analysis // F. Granucci [et al.] // Nat. Immunol. – 2001. – Vol. 2(9). – P. 882–888. 115. Inflammation directs memory precursor and short-lived effector CD8(+) T cell fates via the graded expression of T-bet transcription factor // N. S. Joshi [et al.] // Immunity. – 2007. – Vol. 27(2). – P. 281–295. 116. Interleukin–2 and inflammation induce distinct transcriptional programs that promote the differentiation of effector cytolytic T cells / M. E. Pipkin [et al.] // Immunity. – 2010. – Vol. 32. – Р. 79–90. 117. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo / K. S. Schluns [et al.] // Nat. Immunol. – 2000. – Vol. 1. – Р. 426–432. 118. Intra-and extra-thymic expression of the pre-T-cell receptor alpha gene / L. Bruno [et al.] // Eur. J. Immunol. – 1995. – Vol. 25. – P. 1877–1882. 119. Jameson S. C., Masopust D. Diversity in T cell memory: an embarrassment of riches // Immunity. – 2009. – Vol. 31, № 6. – P. 859–871. 120. Johansson M., Lycke N. A unique population of extrathymically derived TCR+CD4-CD8- T-cells with regulatory functions dominates the mouse female genital tract // J. Immunol. – 2003. – Vol. 170. – Р. 1659-1666. 121. Junge S., Kloeckener-Gruissem B., Zufferey R. Correlation between recent thymic emigrants and CD31+ (PECAM-1) CD4+ T cells in normal individuals during aging and in lumphopenic children // Eur. J. Immunol. – 2007. – Vol. 37. – 111 P. 3270–3280. 122. Kaech S. M., Wherry E. J. Heterogeneity and cell-fate decisions in effector and memory CD8+ T cell differentiation during viral infection // Immunity. – 2007. – Vol. 27, № 3. – P. 393–405. 123. Kaech S. M., Wherry E. J., Ahmed R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development // Nat. Rev. Immunol. – 2002. – Vol. 2(4). – Р. 251-262. 124. Kalia V., Sarkar S., Ahmed R. CD8 T-cell memory differentiation during acute and chronic viral infections // Adv. Exp. Med. Biol. – 2010. – Vol. 684. – Р. 7995. 125. Kanegane H., Tosato G. Activation of naive and memory T cells by interleukin15 // Blood. – 1996. – Vol. 88. – Р. 230–235. 126. Kilpatrick R. D., Rickabaugh T. Homeostasis of the Naïve CD4+ T Cell Compartment during Aging // J. Immunol. – 2008. – Vol. 180(3). – P. 1499–1507. 127. Kinetics of fetal cellular and cell-free DNA in the maternal circulation during and after pregnancy: implications for noninvasive prenatal diagnosis / H. Ariga [et al.] // Transfusion. – 2001. – Vol. 41. – Р. 1524–1530. 128. Klebanoff C. A., Gattinoni L., Nicholas. CD8+ T–cell memory in tumor immunology and immunotherapy // Restif. Immunol. – 2006. – Vol. 211. – Р. 214–224. 129. Kohler S., Thiel A. Life after the thymus: CD31+ and CD31- human naïve CD4+ T-cell subsets // Blood. – 2009. – Vol. 113. – P. 769– 774. 130. Krawczyk C. M., Shen H., Pearce E. J. Functional plasticity in memory T helper cell responses // J. Immunol. – 2007. – Vol. 178 (7). – Р. 4080–4088. 131. Kruger K., Mooren F. C. T-cell homing and exercise // Exerc. Immunol. Rev. – 2007. – Vol. 13. – Р. 37–54. 132. Lanzavecchia A., Sallusto F. Dynamics of T lymphocyte responses: intermediates, effectors and memory cells // Science. – 2000. – Vol. 290. – P. 92– 97. 112 133. Laresgoiti–Servitje E., Gómez–López N., Olson D.M. An immunological insight into the origins of pre–eclampsia // Hum. Reprod. Update. – 2010. – Vol. 16(5). – Р. 510–524. 134. Life and death of lymphocytes: a role in immunesenescence / S. Gupta [et al.] // Immunity & Ageing. – 2005. – Vol. 2, № 12. – P.1–15. 135. Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets / E. J. Wherry [et al.] // Nat. Immunol. – 2003. – Vol. 4. – Р. 225– 234. 136. Long-term fetal microchimerism in peripheral blood mononuclear cell subsets in healthy women and women with scleroderma / P. C. Evans [et al.] // Blood. – 1999 – Vol. 93. – Р. 2033–2037. 137. Ma A., Koka R., Burkett P. Diverse functions of IL–2, IL–15, and IL–7 in lymphoid homeostasis // Annu. Rev. Immunol. – 2006. – Vol. 24. – Р. 657–79. 138. Male fetal progenitor cells persist in maternal blood for as long as 27 years postpartum / D.W. Bianchi [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1996. – Vol. 93. – Р. 705–708. 139. Maternal lymphocyte subpopulations (CD45RA+ and CD45RO+) in preeclampsia / T. Chaiworapongsa [et al.] // Am. J. Obstet. Gynecol. – 2002. – Vol. 187, № 4. – P. 889-893. 140. Measuring recent thymic emigrants in blood of normal and HIV-1-infected individuals before and after effective therapy / L. Zhang [et al.] // J. Exp. Med. – 1999. – Vol. 90. – P. 725–732. 141. Memory and flexibility of cytokine gene expression as separable properties of human T(H)1 and T(H)2 lymphocytes / M. Messi [et al.] // Nat. Immunol. – 2003. – Vol. 4. – Р. 78–86. 142. Mora J.R., von Andrian U.H. T-cell homing specificity and plasticity: new concepts and future challenges // Trends Immunol. – 2006. – Vol. 27(5). – Р. 235–243. 143. Mouse liver T-cells: their change with aging and in comparison with peripheral T-cells / A. Tsukahara [et al.] // Hepatology. – 1997. – Vol. 26. – P. 301–309. 113 144. Murphy S. P., Choi J. C., Holtz R. Regulation of major histocompatibility complex class II gene expression in trophoblast cells // Reprod. Biol. Endocrinol. – 2004. – Vol. 2. – Р. 52–60. 145. Naive human T cells are activated and proliferate in response to the heme oxygenase-1 inhibitor tin mesoporphyrin / T. D. Burt [et al.] // J Immunol. – 2010. – Vol. 185(9). – Р. 5279–5288. 146. Nakayama T., Yamashita M. Initiation and maintenance of Th2 cell identity // Curr. Opin. Immunol. – 2008. – Vol. 20. – №. 3. – P. 265–271. 147. Natural history of fetal cell microchimerism during and following murine pregnancy / K. Khosrotehrani [et al.] // J. Reprod Immunol. –2005. – Vol. 66(1). – Р. 1– 12. 148. Normal human pregnancy is associated with an elevation in the immune suppressive CD4+CD25+ regulatory T-cell subset / D. A. Somerset [et al.] // Immunology. – 2004. – Vol. 112. – P. 38–43. 149. Orozco A. F., Lewis D. E. Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma // Cytometry A. – 2010. – Vol. 77(6). – Р. 502–514. 150. PECAM-1 is required for transendothelial migration of leukocytes / W.A. Muller [et al.] // J. Exp. Med. – 1993. – Vol. 178. – P. 449–460. 151. Phenotypic characterization of regylatory T cells in the human deciduas / J. Heikkinen [et al.] // Clin. Exp. Immunol. – 2004. – Vol. 136. – P.373–378. 152. Placental microparticles, DNA and RNA in preeclampsia / C. Rusterholz [et al.] // Hypertens. Pregnany. – 2011. – Vol. 30, № 3. – P. 364–375. 153. Postthymic expansion in human CD4 naive T cells defined by expression of functional high-affinity IL-2 receptors / M. L. Pekalski [et al.] // J. Immunol. – 2013. – Vol. 190(6). – P. 2554–2566. 154. Post-thymic in vivo proliferation of naive CD4+ T cells constrains the TCR repertoire in healthy human adults / S. Kohler [et al.] // Eur. J. Immunol. – 2005. – Vol. 35. – P. 1987–1994. 155. Potent and selective stimulation of memory-phenotype CD8+ T cells in vivo by IL-15 / X. Zhang [et al.] // Immunity. – 1998. – Vol. 8. – Р. 591–599. 114 156. Prediction of T-cell reconstitution by assessment of T-cell receptor excision circle before allogeneic hematopoietic stem cell transplantation in pediatric patients / X. Chen [et al.] // Blood. – 2005. – Vol. 105(2). – P. 886–93. 157. Prlic M., Hernandez-Hoyos G., Bevan M. J. Duration of the initial TCR stimulus controls the magnitude but not functionality of the CD8+ T cell response // J. Exp. Med. – 2006. – Vol. 203 – P. 2135–2143. 158. Proliferation requirements of cytomegalovirus-specific, effector-type human CD8+ T cells / E.M. Van Leeuwen [et al.] // J. Immonol. –2002. – Vol. 169. – P.5838–5843. 159. Proportion of peripheral blood and decidual CD4(+) CD25(bright) regulatory T cells in pre-eclampsia / Y. Sasaki [et al.] // Clin. Exp. Immunol. – 2007. – Vol. 149. – P. 139–145. 160. Puck J.M. Laboratory technology for population-based screening for severe combined immunodeficiency in neonates: the winner is T-cell receptor excision circles // J. Allergy Clin. Immunol. – 2012. – Vol. 129 (3). – P. 607–616. 161. Quantifying thymic export: combining models of naïve T cell proliferation and TCR excision circle dynamics gives an explicit measure of thymic output / I. Bain [et al.] // J. Immunol. 2009. – Vol. 183. – P. 4329 – 4336. 162. Quantitative analysis of the bidirectional fetomaternal transfer of nucleated cells and plasma DNA / Y. M. D. Lo [et al.] // Clin. Chem. – 2000. – Vol. 46. – Р. 1301–1309. 163. Raghupathy R. Cytokines as Key Players in the Pathophysiology of Preeclampsia // Med. Princ. Pract. – 2013. – Vol. 15. – P. 1–12. 164. Raghupathy R. Pregnancy: success and failure within the Th1/Th2/Th3 paradigm // Semin. Immunol. – 2001. – Vol. 13. – P. 219– 227. 165. Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues. J.R. Mora [et al.] // J. Exp. Med. – 2005. – Vol. 201(2). – Р. 303–316. 166. Redman C. W., Sargent I. L. Microparticles and immunomodulation in pregnancy and pre–eclampsia // Journal of Reproductive. – 2007. – Vol. 76(1). – 115 P. 61–67. 167. Review: Does size matter? Placental debris and the pathophysiology of pre– eclampsia / C. W. Redman [et al.] // Placenta. – 2012. – Vol. 33. – Р. 48–54. 168. Review: hCG, preeclampsia and regulatory T cells / W. Norris [et al.] // Placenta. – 2011. – Vol. 25. – P. 182–185. 169. Robertson Regulatory T-cells and immune tolerance in pregnancy: a new target for infertility treatment? / R. Leigh [et al.] // Hum. Reprod.Update. – 2009. – Vol. 15(5). – Р. 517–535. 170. Saggese D., Ceroni Compadretti G., Cartaroni C. Cervical ectopic thymus: a case report and review of the literature // Int. J. Pediatr. Otorhinolaryngol. – 2002. – Vol. 66(1). – P. 77–80. 171. Sallusto F., Geginat J., Lanzavecchia A. Central memory and effector memory T cell subsets: function, generation, and maintenance // Annu. Rev. Immunol. – 2004. – Vol.22. – Р. 745–763. 172. Seddon B., R. Zamoyska. TCR and IL-7 receptor signals can operate independently or synergize to promote lymphopenia-induced expansion of naive T cells // J. Immunol. – 2002. – Vol. 169. – Р. 3752–3759. 173. Seddon B., Tomlinson P., Zamoyska R. Interleukin 7 and T cell receptor signals regulate homeostasis of CD4 memory cells // Nat. Immunol. – 2003. – Vol. 4. – Р. 680–686. 174. Selective accumulation of differentiated CD8+ T cells specific for respiratory viruses in the human lung / G.J.de Bree [et al.] // J. Exp. Med. – 2005. – Vol. 202. – Р. 1433–1442. 175. Serum levels of tumor necrosis factor-α, interleukin-15 and interleukin-10 in patients with pre-eclampsia in comparison with normotensive pregnant women / F. Kalantar [et al.] // Iranian Journal of Nursing and Midwifery Research. – 2013. – № 18. – P. 463-466. 176. Significant fetal-maternal hemorrhage after termination of pregnancy: implications for development of fetal cell microchimerism / D.W. Bianchi [et al.] // Am. J. Obstet. Gynecol. – 2001. – Vol. 184. – Р. 703–706. 116 177. Soni C., Karande A. A. Glycodelin-A interferes with IL-2/IL-2R signalling to induce cell growth arrest, loss of effector functions and apoptosis in Tlymphocytes // Hum. Reprod. – 2012. – Vol. 27(4). – Р. 1005–1015. 178. Specifically activated memory T cell subsets from cancer patients recognize and reject xenotransplanted autologous tumors / P. Beckhove [et al.] // J. Clin. Invest. – 2004. – Vol.114. – Р. 67-76. 179. Sprent J., Tough D. F. T cell death and memory // Science. – 2001. – Vol. 293. – Р. 245– 248. 180. Sprent J., Tough D. F., Sun S. Factors controlling the turnover of T memory cells // Immunol. Rev. – 1997. – Vol. 156. – Р. 79–85. 181. Studies of lymphocyte transendothelial migration: analysis of migrated cell phenotypes with regard to CD31 (PECAM-1), CD45RA and CD45R0 / I. N. Bird [et al.] // Immunology. – 1993. – Vol. 80. – P. 553–560. 182. Subclinical infection as a cause of inflammation in preeclampsia / P. LópezJaramillo [et al.] // Am. J. Ther. – 2008. – Vol.15. – №. 4. – Р. 373 – 376. 183. Syncytiotrophoblast microparticle shedding is a feature of early onset pre– eclampsia but not normotensive intrauterine growth restriction / D. Goswami [et al.] // Placenta. – 2006. – Vol. 27. – Р. 56–61. 184. Systemic inflammatory priming in normal pregnancy and pre-eclampsia: the role of circulating syncytiotrophoblast microparticles / S. J. Germain [et al.] // J. Immunol. – 2007. – Vol. 178(9). – P. 5949–5956. 185. T cell receptor excision circles (TREC) and recent thymic migrant cells in specific immunotherapy and respiratory allergy to Dermatophagoides pteronyssinus / C. Pereira [et al.] // Eur. Ann. Allergy Clin. Immunol. – 2012. – Vol. 44(2). – P. 61–72. 186. T cell receptor gene deletion circles identify recent thymic emigrants in the peripheral T cell pool / F. K. Kong [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1999. – Vol. 96. – P. 1536–1540. 117 187. Takata H., Takiguchi M. Three memory subsets of human CD8+ T cells differently expressing three cytolytic effector molecules // J. Immunol. – 2006. – Vol. 177. – Р. 4330–4340. 188. T-cell homeostasis in patients with rheumatoid arthritis / K. Koetz [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2000. – Vol. 97. – P. 9203–9208. 189. T-cell progenitor function during progressivee human immunodeficiency virus1 infections and after antiretroviral therahy / D.R. Clark [et al.] // Blood. – 2000. – Vol. 96. – P. 242–249. 190. T-cell repopulation and thymic volume in HIV-1-infected adult patients after highly active antiretroviral therapy / J. M. Franco [et al.] // – Blood. – 2002. – Vol. 99(10). – P. 3702–3706. 191. TGF-beta induces Foxp3 + T-regulatory cells from CD4 + CD25 – precursors / S. Fu [et al.] // Am. J. Transplant. – 2004. – Vol. 4 (10). – P. 1614–1627. 192. Th1/Th2/Th17 and regulatory T-cell paradigm in pregnancy / S. Saito [et al.] // Am. J. Reprod. Immunol. – 2010. – Vol. 63, № 6. – P. 601– 610. 193. The basis of distinctive IL-2- and IL-15-dependent signaling: weak CD122dependent signaling favors CD8+ T central-memory cell survival but not T effector-memory cell development / I. Castro[et al.] // J. Immunol. – 2011. – Vol. 187(10). – P. 5170–5182. 194. The hidden maternal-fetal interface: events involving the lymphoid organs in maternal-fetal tolerance / E. S. Taglauer [et al.] // Int. J. Dev. Biol. – 2010. – Vol. 54 (2– 3). – Р. 421– 430. 195. The role of the immune system in preeclampsia / S. Saito [et al.] // Molecular Aspects of Medicine. – 2007. – Vol. 28, № 2. – Р. 192–209. 38 196. The significance of OX40 and OX40L to T cell biology and immune disease / M. Croft [et al.] // Immunol. Rev. – 2009. – Vol. 229, № 1. –P. 173–191. 197. The thymus has two functionally distinct populations of immature one population is deleted by ligation of T-cells: TCR / T. H. Finkel [et al.] // Cell. – 1989. – Vol. 58. – P. 1047-1052. 198. Thymic function after hematopoietic stem-cell transplantation for the treatment 118 of severe combined immunodeficiency / D. D. Patel [et al.] // N. Engl. J. Med. – 2000. – Vol. 342. – Р. 1332. 199. Thymic output: a bad TREC record / M. Hazenberg [et al.] // Nat. immunol. – 2003. – № 4(2). – P. 97– 99. 200. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes / P. Kisielow [et al.] // Nature. – 1988. – Vol. 333. – P. 742744. 201. Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector functions / F. Sallusto [et al.] // Nature. – 1999. – Vol. 401. – Р. 708– 712. 202. Two subsets of naive T helper cells with distinct T cell receptor excision circle content in human adult peripheral blood / S. Kimmig [et al.] // J. Exp. Med. – 2002. – Vol. 195. – P. 789–794. 203. Ueno S., Suzuki K. Human chimerism in one of a pair of twins // Acta Genet. Stat. Med. – 1959. – № 9. – Р. 47–53. 204. Unsoeld H., Pircher H. Complex Memory T–Cell Phenotypes Revealed by Coexpression of CD62L and CCR7 // J. Virol. – 2005. – Vol. 79. – Р. 4510–4513. 205. Use it or lose it: establishment and persistence of T cell memory / K. Kedzierska [et al.] // Front. Immunol. – 2012 – Vol. 3 – P. 357. 206. Van Belle T., Grooten J. IL-15 and IL-15Ralpha in CD4+T cell immunity // Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). – 2005. – Vol. 53(2). – P. 115–126. 207. Vignali D. A., Collison L. W., Workman C. J. How regulatory T-cells work // Nat. Rev. Immunol. – 2008. № 8 (7). – Р. 523–532. 208. Waldmann T. A. The biology of interleukin-2 and interleukin-15: implications for cancer therapy and vaccine design // Nat. Rev. Immunol. – 2006. – Vol. 6(8). – P. 595–601. 209. What is the role of regulatory T cells in the success of implantation and early pregnancy? / S. Saito [et al.] // J. Assist. Reprod. Genet. – 2007. – Vol. 24. – Р. 379–386. 210. Wnt signaling is required for thymocyte development and activates Tcf-1 mediated transcription / F. J. Staal [et al.] // Eur. J. Immunol. – 2001. – Vol. 31 119 (1). – P. 285– 293. 211. Y chromosome sequence DNA amplified from peripheral blood of women in early pregnancy / M. R. Thomas [et al.] // J. Lancet. – 1994. – Vol. 343. – Р. 413– 414. 212. Zenclusser A. C. Adaptive immune responses during pregnancy // Am. J. Reprod. Immunol. – 2013. – Vol. 69(4). – P. 291–303. 213. Zhang N., Bevan M. J. CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system // Immunity. – 2011. – Vol. 35(2). – P. 161–168. 214. Zhao J. X., Zeng Y. Y., Liu Y. Fetal alloantigen is responsible for the expansion of the CD4+CD25+ regulatory T cell pool during pregnancy // J. Reprod. Immunol. – 2007. – Vol. 75. – P. 71–81. 215. Zhou L.L., Wang L., Yang L.N. The expression of apoptosis related genes Bcl– 2 and Bax protein in dysfunctional uterine bleeding // Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi. – 2008. – Vol. 22(6). – Р. 455–457.
