Бычкова Минск

Аллергодиагностика методом
проточной цитометрии
Бычкова Наталия Владимировна
Старший научный сотрудник лаборатории клинической иммунологии
ФГБУ Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им.
А.М. Никифорова МЧС России
Минск, декабрь 2015
Диагностика аллергических заболеваний
является комплексной, основывается
преимущественно на описании клинической
картины
и
тщательно
собранного
аллергологического анамнеза, а также тестах
in vivo.
Лабораторная диагностика используется
при сомнительных результатах кожных проб
или имеющихся противопоказаниях к их
применению.
Заболевания, обусловленные реакциями
гиперчувствительности немедленного типа
следствие
IgE-опосредованного
выделения
медиаторов
из
сенсибилизированных
базофилов
и
тучных
клеток
при
контакте
с
причинным аллергеном
- включают анафилаксию, аллергический
ринит,
крапивницу,
бронхиальную
астму, атопический дерматит и др.
Индукция и поддержание
IgE-ответа
IL-4; IL-13
CD40
CD 154
В-клетка
MHC
IL-5
IL-6
CD23
аллерген
+
TCR
Синтез
IgE
Т-клетка
(Тh2)
_
CD8+-Т-кл
IFN-gamma
IL-12
PGE2
Преимущества и недостатки
лабораторной диагностики
Преимущества
Недостатки
Возможность исследования
одномоментно значительного
количества аллергенов
Возможность ложноотрицательных результатов в
период ремиссии
Отсутствие необходимости отмены
антигистаминовых препаратов
Высокая стоимость
Отсутствие противопоказаний для
обследования
Использование
высокотехнологичного
Исключена возможность тяжелых
реакций во время обследования
оборудования, доступного в
специализированных центрах
Возможность тестирования различных
классов лекарственных препаратов
Более длительный период
проведения
Объективность результата
Лабораторная диагностика аллергии
При
использовании
количественных
методов
(определение общего и специфических IgE, IgG4,
эозинофильно-катионного белка, триптазы) возможна
диагностика сенсибилизации, в основном, к пищевым и
ингаляционным аллергенам, некоторым лекарственным
веществам.
Потенциал лабораторной диагностики значительно
увеличивается при использовании функционального теста
оценки реакции базофильных гранулоцитов при
контакте с аллергеном in vitro (пищевым, ингаляционным,
инсектным, значительному спектру лекарственных и др.),
что является аналогом провокационного теста in vivo.
Специфические методы лабораторной
аллергодиагностики реакций
немедленного типа:
- гуморальные - определение свободных
антител в сыворотке крови и секретах
(специфические IgE, IgG4)
- клеточные - выявление связанных с
мембраной тучных клеток и базофилов
антител класса Е
Клеточные тесты на выявление аллергии
- возможность ремоделирования in
vitro контакта предполагаемого
аллергена с базофилами
периферической крови пациента
Клеточные тесты на выявление аллергии
прямая микроскопическая оценка
дегрануляции базофилов по окраске
щелочными красителями
определение концентрации
освобожденного гистамина из
реактивных базофилов после стимуляции
определение количества активированных
базофилов после стимуляции
Области применения метода оценки
активации базофилов
Выявление
аллергенов
различной
природы
для
диагностики и подтверждения IgE-зависимой аллергии и
псевдоаллергических реакций в случаях невозможности
проведения,
противоречивых
или
отрицательных
результатов кожных тестов и анализа специфических IgE
(Hoffmann H.J. et al, 2015).
Оценка эффективности проводимой специфической
иммунотерапии (АСИТ) (Kosnik, 2005) и лечения анти-IgE
препаратами (Nopp А. et al, 2006).
Определение возможности повторного введения продукта
после окончания элиминационной терапии (Rubio A. et al, 2011)
Наборы для выявления активации
базофилов с использованием метода
проточной цитометрии
Flow-CAST (Cellular Antigen
Stimulation Test), (Bühlmann
laboratory)
BASOTEST (Beckton Dickinson)
Allergenicity kit (Beckman Coulter)
Различаются по специфическим
маркерам для выявления базофилов и
оценки их активации.
Преимущества исследования активации
базофилов с помощью проточной
цитометрии
использование
небольшого
количества
образца
идентификация базофилов
без их выделения
исследование маркеров
активации
на
уровне
одной клетки
получение результата в
относительно
короткие
сроки
исследование
активации базофилов
в цельной крови
Принцип проведения оценки
активации базофилов
Сравнение различных методик оценки
активации базофилов методом проточной
цитометрии
Выделение
лейкоцитов
Идентификация
базофилов
Выявление
активации
базофилов
FLOWCAST
рекомендовано
BASOTEST
Allergenicity kit
не нужно
не нужно
рецептор
для IgE
(FcεRI )
рецептор для
IgE (FcεRI )
CD3-CRTH2+
CD203c+
CD63+
CD63+
CD203c+++
Почему предпочтительно использование
цельной крови в тесте активации
базофилов?
Условия инкубации базофилов в цельной
крови с аллергенам in vitro в большей
степени соответствуют процессам in vivo
(присутствие анти-IgE антител, антител к
рецепторам IgE, циркулирующих
иммунных комплексов, компонентов
комплемента и лекарств)
CRTH2
(Chemoattractant Receptor TH2)
Молекула из семейства рецепторов
хемоаттрактантов
Не менее половины Т-хелперов 2
экспрессируют CRTH2
Кроме Т-хелперов 2 молекула CRTH2
экспрессируется на базофилах, эозинофилах и
тучных клетках, небольшой субпопуляции
CD8+ T клеток, моноцитах
Т-хелперы 2, экспрессирующие CRTH2,
являются циркулирующими антигенактивированными эффекторными Т-хелперами
(circulating allergen-responsive Th2) и
продуцируют интерлейкины 4, 5 и 13
(Iwasaki M. et al, 2002)
CRTH2
(Chemoattractant Receptor TH2)
Содержание Т-хелперов 2, экспрессирующих
CRTH2, в периферической крови невелико (в
здоровой популяции взрослых людей не более
1,3%, у детей в зависимости от возраста 0,10,7%), но степень их активации, оцениваемая
по маркерам CD69, CD45RO, CD25, CD95 и
HLA DR, выше, чем у негативных по CRTH2.
(Bahbouhi B., et al, 2007)
Маркеры активации базофилов
CD63
Семейство
На каких
клетках
представлены
CD203c
суперсемейство семейство
тетраспинов
эктонуклеотид
пирофосфатаз/
фосфодистераз
базофилы,
базофилы
тучные клетки,
тромбоциты,
макрофаги
Выбор маркеров для проведения теста
активации базофилов
Наилучшими комбинациями маркеров для
выявления базофилов признаны CD3-/CRTH2+ и
CD123+/HLA DR- (Hoffmann H.J. et al, 2015).
Клиническая значимость использования для оценки
активации базофилов CD63 и CD203c признана
сопоставимой (Mikkelsen S. et al, 2010), но выявленные
особенности экспрессии этих маркеров должны
учитываться как при заборе крови, хранении и
подготовке образцов, так и при оценке
позитивности теста.
Специфичность и чувствительность
теста активации базофилов
Вид аллергена
Пищевые
Рентгенконтрастные вещества
β-лактамные
антибиотики
Пыльца луговых
трав
Специфичность
Чувствительность
Автор
90
91
Rubio A. et al,
2011
(молоко)
100
62,5
Salas M. et al,
2013
80
55
Eberlein B. et al,
2010
100
92,3
Potapinska O. et
al, 2009
Аллергены для теста активации
базофилов
Желательно
использовать
стандартизованные
аллергены,
адаптированные для клеточных тестов (Al
de Weck et al, 2008).
Также применяют аллергены для
кожных проб (Nopp A. et al, 2006), готовят
экстракты самостоятельно (Tokuda R. et al, 2009) и
используют лекарственные препараты.
Необходимые характеристики
аллергенов для теста активации
базофилов
- Отсутствие цитотоксичности (добавки,
консерванты)
- Отсутствие неспецифической
активации (эндотоксины, лектины)
- Способность вызывать специфическую
активацию клеток
Алгоритм исследования
активации базофилов in vitro
Исследование спонтанной активации
базофилов – негативный контроль
Исследование индуцированной активации
базофилов, стимулированной анти-IgEантителами - позитивный контроль
Исследование индуцированной активации
базофилов, стимулированной различными
аллергенами - тест
Методика теста активации базофилов
Allerginicity kit
Окрашивание цельной периферической крови
тройным коктейлем моноклональных антител
CRTH2-FITC/CD203c-PE/CD3-PC7 в присутствии
буферного раствора (негативный контроль), антиIgE антител (позитивный контроль) или жидких
анестетиков (тест) в течении 15 минут при 370С в
темноте
Лизис эритроцитов лизирующим фиксирующим
реагентом
Оценка 500 базофилов методом проточной
цитометрии в мультипараметрическом протоколе с
многоэтапным гейтированием
Стратегия выбора зоны анализа
Гейт по региону S
Регион S включает все лейкоциты
Регион X исключает эозинофилы
Стратегия выбора зоны анализа
Гейт по регионам S и X
Гейт по регионам S, X и Y
Регион Y содержит все базофилы Регион Z содержит активированные базофилы
CD3- CRTh2+CD203c+
CD3-CRTh2+CD203cbright
Гистограммы спонтанной и
индуцированной активации базофилов
Гейт по регионам S, X и Y
Спонтанная активация
базофилов
Гейт по регионам S, X и Y
Индуцированная анти-IgE антителами
активация базофилов (позитивный контроль)
Гистограммы индуцированной активации
базофилов
Гейт по регионам S, X и Y
Гейт по регионам S, X и Y
Индуцированная активация базофилов Индуцированная активация базофилов
на аллерген коровьего молока
на аллерген домашней пыли
Оценка спонтанной активации
базофилов
Базальный уровень активации базофилов (CD63+)
ниже 2% - принцип «все или ничего» (Al De Weck et al, 2003).
Базальный уровень активации базофилов (CD203с++)
может быть значительно выше при массивном
поступлении аллергена (полиноз, Al De Weck et al, 2008),
некоторых заболеваниях (обострение астмы, Emiko Ono et al,
2010), при методических погрешностях, длительном –
более 2-х часов – времени между забором крови и
постановкой теста.
Спонтанная активация базофилов в группах пациентов с
атопическим дерматитом, лекарственной аллергией,
условно здоровых взрослых и условно здоровых детей
CD3-CRTH2+CD203c bright
18,2
20
18
*
16
14
12
% CD203c++
10
8
6
4
2
0
4,7
условно
здоровые
взрослые
6,7
4,9
условно
здоровые дети
атопический
дерматит
* - p<0,05 по сравнению с группами здоровых лиц
лекарственная
аллергия
Спонтанная активация базофилов у
пациентов с атопическим дерматитом в
ремиссии (n=35) и при обострении (n=210)
29,1
30
*
25
СD203c++
%
20
15
8,2 *
10
5
0
ремиссия
* p<0,05
обострение
Взаимосвязь уровня иммуноглобулина Е и
спонтанной активации базофилов у
пациентов с атопическим дерматитом
r=0,575, р<0,01
Значительное повышение иммуноглобулина
Е в сыворотке крови приводит к связыванию
IgE с его рецептором на базофилах, что при
наличии
аллергена
запускает
каскад
активации, приводящий к дегрануляции
клеток с высвобождением медиаторов
аллергического воспаления.
Оценка неспецифической
активации базофилов
Индуктор – поликлональные анти-IgE антитела.
80
79
60
29,1
%CD203c++ 40
*
* p<0,05
20
0
здоровые дети
атопический
дерматит
«Нонреспондеры» 2,5-17% в популяции. Причинами
вариабельности вплоть до полного отсутствия активации базофилов
на стимулы могут быть как проведение исследования в
рефрактерный период, так и индивидуальные особенности
нарушения проведения сигнала от комплекса FcɛRI-IgE с участием
тирозинкиназы Syk (Patil S.U. et al, 2011)
Оценка позитивности теста активации
базофилов
более 5% активированных базофилов, при этом
индекс стимуляции более 2 (Blanca-Lopez, 2013)
индекс стимуляции более 1,73 (Hagau, 2013)
индекс стимуляции более 1,06 (Abuaf, 2012).
Индекс стимуляции – отношение количества
активированных базофилов в пробе с аллергеном
к количеству активированных базофилов в пробе
с буферным раствором
Порог позитивности и
воспроизводимость метода
При индексе более 1,05 реакцию в
пробе с аллергеном рассматривали как
позитивную.
Спонтанная активация базофилов
Пациент А.
4,4 (+0,4%)
4,2 (+0,2%)
3,6 (- 0,4%)
3,8 (- 0,2%)
4,0 (0)
4,0 0,28
Пациент Б.
2,2 (-0,1%)
2,3 (0)
2,5 (+0,2%)
2,4 (+0,1%)
2,1 (-0,2%)
2,3 0,14
Сенсибилизация к белкам коровьего
молока
41 пациент (дети с атопическим дерматитом
от 3 до 12м с положительной пробой при
диагностическом введении продукта).
У 46% выявлены специфические IgE (Immulite,
ОМБ).
У 42% - положительный prick-тест.
Сенсибилизация к белкам коровьего
молока
В качестве аллергена в тесте активации
базофилов использовали аллерген f2 «Коровье
молоко», Immulite.
У 71% (29 из 41) в тесте активации
базофилов (CD3-CRTH2+CD203c++, Allerginicity
kit, Beckman-Coulter) выявлен индекс стимуляции
более 1,05, что расценено как положительная
реакция.
Сенсибилизация к белкам коровьего
молока
6 человек (15%) явились «нонреспондерами» активация базофилов в тесте с позитивным контролем
менее, чем на 10%, превышала уровень активации в
пробе с буферным раствором. Их результаты на момент
исследования могли быть ложноотрицательными.
При исключении пациентов-«нонреспондеров»,
чувствительность выявления сенсибилизации к белкам
коровьего молока выросла до 83% (29 из 35).
При повторном исследовании 5 пациентов«нонреспондеров» 4 ребенка на фоне диетотерапии
показали нормализацию ответа в тесте с позитивным
контролем, у 3-ех выявлена положительная реакция на
аллерген коровьего молока с индексами 1,09-5,96.
Низкий порог позитивности
У всех пациентов с индексами
активации в тесте с аллергеном
коровьего молока 1,05-1,1 (7 человек –
24%) найдены специфические IgE, в 75%
случаях были позитивны prick-тесты.
Степень активации базофилов на
аллергены у пациентов с атопическим
дерматитом и условно здоровых лиц
8
6,26 *
6
индекс
4
стимуляции
2
1,4 *
1
2,05 *
0,9
1
0
аллерген из аллерген из аллерген из
коровьего пшеничной домашней пыли
молока
муки
пациенты с АД
условно здоровые лица
* p<0,05
Сравнение результатов исследования
специфических IgE и активации базофилов с
аллергеном коровьего молока (n=320)
31
35
31
30
25
21
17
процент 20
пациентов 15
10
5
0
IgE+BAT-
IgE-BAT+
IgE+BAT+
IgE-BAT-
IgE+ВАТ- выявление специфических IgE, отсутствие активации базофилов
IgE-ВАТ+ отсутствие специфических IgE, активация базофилов на аллерген
IgE+ВАТ+ выявление специфических IgE, активация базофилов на аллерген
IgE-ВАТ- отсутствие специфических IgE, отсутствие активации базофилов
Сравнение результатов исследования
специфических IgE и активации базофилов с
аллергеном пшеницы (n=289)
45
40
35
30
процент 25
пациентов 20
15
10
5
0
43
43
9
5
IgE+BAT-
IgE-BAT+
IgE+BAT+
IgE-BAT-
IgE+ВАТ- выявление специфических IgE, отсутствие активации базофилов,
IgE-ВАТ+ отсутствие специфических IgE, активация базофилов на аллерген
IgE+ВАТ+ выявление специфических IgE, активация базофилов,
IgE-ВАТ- отсутствие специфических IgE, отсутствие активации базофилов
Сравнение результатов исследования
специфических IgE и активации базофилов с
аллергеном домашней пыли (n=353)
40
35
30
25
процент
20
пациентов
15
10
5
0
36
33
24
7
IgE+BAT-
IgE-BAT+
IgE+BAT+
IgE-BAT-
IgE+ВАТ- выявление специфических IgE, отсутствие активации базофилов,
IgE-ВАТ+ отсутствие специфических IgE, активация базофилов на аллерген
IgE+ВАТ+ выявление специфических IgE, активация базофилов,
IgE-ВАТ- отсутствие специфических IgE, отсутствие активации базофилов
Выявление специфических IgE,
активации базофилов
FceR1
CD203c
аллерген
Базофил
IgE
Медиаторы воспаления
IgE
Невыявление специфических IgE,
отсутствие активации базофилов
аллерген
FceR1
Базофил
IgE
Невыявление специфических IgE,
активация базофилов
FceR1
CD203c
аллерген
Базофил
IgE
Медиаторы воспаления
Выявление специфических IgE,
отсутствие активации базофилов
FceR1
аллерген
Базофил
IgE
IgE
IgE
Частота пациентов, у которых
на диетотерапии при повторном исследовании не было
отмечено активации базофилов на соответствующие
аллергены
80
80
77
64
70
63
60
50
40
30
20
10
0
аллерген из
говядины
аллерген из
гречи
аллерген из
рисовой крупы
аллерген из
картофеля
Частота пациентов, у которых
на диетотерапии при повторном исследовании не было
отмечено активации базофилов на соответствующие
аллергены
60
60
50
50
50
44
40
30
20
10
0
аллерген из
коровьего
молока
аллерген из
овсяной крупы
аллерген из
аллерген из
ржаной муки пшеничной муки
ФГБУ ВЦЭРМ им.А.М.Никифорова МЧС России
Россия, 194044, Выборгский р-н, ул Академика Лебедева, д.4/2 тел.: (812)339-39-39
Пациент : П
Регистр.№ 100145880
Дата забора: 15.04.2011
Пол/Возраст: Мужской / 1год 6м
Специфические IgE
F2
F4
F35
F11
Коровье молоко
Пшеничная мука
Картофель
Гречневая крупа
<0,10 МЕ/мл
<0,10 МЕ/мл
<0,10 МЕ/мл
<0,10 МЕ/мл
антител не выявлено
антител не выявлено
антител не выявлено
антител не выявлено
ФГБУ ВЦЭРМ им.А.М.Никифорова МЧС России
Россия, 194044, Выборгский р-н, ул Академика Лебедева, д.4/2 тел.: (812)339-39-39
Пациент : П
Регистр.№ 100145880
Дата забора: 15.04.2011
Пол/Возраст: Мужской / 1год 6м
Активация базофилов in vitro.
Количество активированных базофилов (CD3-CRTH2+CD203c+)
в периферической крови (спонтанная активация базофилов)
4.80%
(0.00 - 6.00)
Количество активированных базофилов (CD3-CRTH2+CD203c+)
после инкубации с препаратом 1аллерген из коровьего молока
2.40%
(0.00 - 6.00)
Индекс активации базофилов на препарат 1
Количество активированных базофилов (CD3-CRTH2+CD203c+)
после инкубации с препаратом 2 аллерген из пшеничной муки
0.5
Индекс активации базофилов на препарат 2
Количество активированных базофилов (CD3-CRTH2+CD203c+)
после инкубации с препаратом 3аллерген из картофеля
1.67 *
(0.00 - 1.05)
3.40 %
(0.00 - 6.00)
Индекс активации базофилов на препарат 3
Количество активированных базофилов (CD3-CRTH2+CD203c+)
после инкубации с препаратом 4 аллерген из гречневой крупы
0.71
(0.00 - 1.05)
Индекс активации базофилов на препарат 4
1.43 *
(0.00 - 1.05)
8.00 *% (0.00 - 6.00)
7.80 *% (0.00 - 6.00)
(0.00 - 1.05)
ФГБУ ВЦЭРМ им.А.М.Никифорова МЧС России
Россия, 194044, Выборгский р-н, ул Академика Лебедева, д.4/2 тел.: (812)339-39-39
Пациент : П
Регистр.№ 100145880
Дата забора: 29.09.2011
Пол/Возраст: Мужской / 2года
Специфические IgE
F2
F4
F35
F11
Коровье молоко
Пшеничная мука
Картофель
Гречневая крупа
<0,10 МЕ/мл
<0,10 МЕ/мл
<0,10 МЕ/мл
<0,10 МЕ/мл
антител не выявлено
антител не выявлено
антител не выявлено
антител не выявлено
ФГБУ ВЦЭРМ им.А.М.Никифорова МЧС России
Россия, 194044, Выборгский р-н, ул Академика Лебедева, д.4/2 тел.: (812)339-39-39
Пациент : П
Регистр.№ 100145880
Дата забора: 29.09.2011
Пол/Возраст: Мужской / 2года
Активация базофилов in vitro.
Количество активированных базофилов (CD3-CRTH2+CD203c+)
в периферической крови (спонтанная активация базофилов)
5.70%
(0.00 - 6.00)
Количество активированных базофилов (CD3-CRTH2+CD203c+)
после инкубации с препаратом 1аллерген из коровьего молока
2.40%
(0.00 - 6.00)
Индекс активации базофилов на препарат 1
Количество активированных базофилов (CD3-CRTH2+CD203c+)
после инкубации с препаратом 2 аллерген из пшеничной муки
0.42
(0.00 - 1.05)
1.80 %
(0.00 - 6.00)
Индекс активации базофилов на препарат 2
Количество активированных базофилов (CD3-CRTH2+CD203c+)
после инкубации с препаратом 3аллерген из картофеля
0.32
(0.00 - 1.05)
4.20 %
(0.00 - 6.00)
Индекс активации базофилов на препарат 3
Количество активированных базофилов (CD3-CRTH2+CD203c+)
после инкубации с препаратом 4 аллерген из гречневой крупы
0.74
(0.00 - 1.05)
Индекс активации базофилов на препарат 4
0.60
3.40 % (0.00 - 6.00)
(0.00 - 1.05)
Количество Т-хелперов 2 CD3+CRTH2+ (%) в группах
пациентов c атопическим дерматитом (2), больных
рассеянным склерозом (3), лекарственной аллергией на
йодсодержащие препараты (4) и условно здоровых лиц (1)
CD3+CRTH2+
2,4
2,5
*
*
2
1,5
1
0,5
1,2
*
1,4
*
0,6
0
1
2
3
* - р<0,05 по сравнению с условно здоровыми лицами
4
Взаимосвязь уровня иммуноглобулина Е
и количества Т-хелперов 2
R=0,599, p<0,01 пациенты с атопическим дерматитом
(n=245)
R=0,573, p<0,05 пациенты с рассеянным склерозом
(n=53)
подтверждает способность Т-хелперов 2 поддерживать
синтез иммуноглобулина Е плазматическими клетками
Относительное количество Т-хелперов 2 повышается по
мере увеличения длительности заболевания атопическим
дерматитом (Iwasaki M. et al, 2002)
Стандартизированный протокол
исследований лекарственной аллергии
- определение уровня триптазы
- определение уровня специфических Ig
- тест активации базофилов
- кожные пробы (прик-тест, внутрикожные
пробы)
(Лин Хеиз Гарви, 2010)
- определение активности диаминооксидазы
В
случаях,
когда
доказана
сенсибилизация
к
лекарственному
средству (особенно выявлена IgEопосредованная реакция), будущего
введения
данного
лекарственного
средства необходимо избегать, потому
что
риск
аллергической
реакции
слишком высок.
Индукторы в тесте активации базофилов –
ультравист, омнипак, оптирей
Реакция in vitro на какой-либо
исследуемый препарат была выявлена у
16 человек из 49 обследованных (33%).
Не было выявлено превалирования
частоты встречаемости сенсибилизации
in vitro ни к одному из тестированных
препаратов
Ретроспективное исследование
показало
отсутствие
аллергических
реакций на введение рекомендованных
рентгеноконтрастных препаратов у всех
обследованных пациентов.
Пациент Т., гипертоническая болезнь III
стадии, 2 степени, риск 4
При
выполнении
экстренной
коронарографии для решения вопроса о
реваскуляризации миокарда через 5 минут
после введения контраста (ультравист)
развилась типичная анафилактическая реакция
(распространенные
отеки,
затруднение
дыхания, крапивница, падение гемодинамики
АД
70/40мм
рт
ст.)
Оперативное
вмешательство
прервано,
проведена
неотложная терапия.
ФГБУ ВЦЭРМ им.А.М.Никифорова МЧС России
Россия, 194044, Выборгский р-н, ул Академика Лебедева, д.4/2 тел.: (812)339-39-39
Пациент : Т
Регистр.№ 100286492
Дата забора: 23.04.2015
Пол/Возраст: женский / 50лет
Активация базофилов in vitro.
Количество активированных базофилов (CD3-CRTH2+CD203c+)
в периферической крови (спонтанная активация базофилов)
25.0%
(0.00 - 6.00)
Количество активированных базофилов (CD3-CRTH2+CD203c+)
после инкубации с препаратом Ультравист 300 (Bayer)
39.0 %
(0.00 - 6.00)
Индекс активации базофилов на препарат
1.56 * (0.00 - 1.05)
Количество активированных базофилов (CD3-CRTH2+CD203c+)
после инкубации с препаратом Оптирей 350 (Тайко Хэлскэа)
8.3 %
(0.00 - 6.00)
Индекс активации базофилов на препарат
0.33
(0.00 - 1.05)
Количество активированных базофилов (CD3-CRTH2+CD203c+)
после инкубации с препаратом Лидокаин 20мг/мл
8.5%
(0.00 - 6.00)
Индекс активации базофилов на препарат
0.34
(0.00 - 1.05)
Местные анестетики и аллергия
У всех препаратов, используемых во время
проведения анестезии, есть потенциал, чтобы
вызвать аллергические реакции.
Реакции на местные анестетики очень
редко являются аллергическими, чаще это
вазовагальная реакция или непреднамеренное
внутрисосудистое введение препарата.
(Лин Хеиз Гарви, 2010)
Аллергическая реакция во время
анестезии
Необходим персонал, специально обученный
действиям в экстренных ситуациях, который
должен быть готов к оказанию немедленной
помощи.
Желательна
специфическая
диагностика,
направленная на выявление причины реакции с
целью предотвратить в будущем риск ее
развития.
Местные анестетики
Группа лидокаина: лидокаин
Группа артикаина: артикаин, ультракаин,
убистезин, септанест
Группа мепивикаина: скандонест,
мепивастезин
Частота встречаемости активации
базофилов in vitro на местные анестетики
(n=68)
Препарат
Вазоконстрикторы
Сульфиты
Парабены
Реакция in vitro
Лидокаин
нет
нет
есть
1/26 (4%)
Скандонест
нет
нет
нет
1/25 (4%)
Септанест
есть
есть
нет
2/11 (18%)
Ультракаин
есть
есть
есть
5/31 (16%)
Убистезин
есть
есть
нет
4/24 (17%)
Ретроспективное исследование (n=28)
показало отсутствие аллергических реакций
при
использовании
рекомендованных
анестезирующих препаратов у всех 14
обследованных пациентов, которые их
применяли. 14 человек, несмотря на
проведение лабораторного исследования,
воздержались от использования местных
анестетиков.
Пациент Ш., 51г. Диагноз: гормон
непродуцирующая аденома надпочечника
13.02.2015г. на этапе индукции анестезии и
начала ИВЛ отмечались выраженные явления
бронхоспазма, снижение АД. Состояние
расценено как анафилоктоидная реакция на
препараты, использованные для индукции
анестезии.
Проведены
мероприятия,
направленных на купирование бронхоспазма и
стабилизацию гемодинамических показателей.
Принято решение об отказе от оперативного
вмешательства.
ФГБУ ВЦЭРМ им.А.М.Никифорова МЧС России
Россия, 194044, Выборгский р-н, ул Академика Лебедева, д.4/2 тел.: (812)339-39-39
Пациент : Ш
Регистр.№ 100279415
Пол/Возраст: женский / 51год
Дата забора: 20.02.2015
Активация базофилов in vitro.
Количество активированных базофилов (CD3-CRTH2+CD203c+)
в периферической крови (спонтанная активация базофилов)
2.0%
Количество активированных базофилов (CD3-CRTH2+CD203c+)
после инкубации с препаратом Севофлуран 100% (Baxter)
4.0 %
(0.00 - 6.00)
Индекс активации базофилов на препарат
2.0 *
(0.00 - 1.05)
Количество активированных базофилов (CD3-CRTH2+CD203c+)
после инкубации с препаратом Фентанил 50мкг/мл (ГосЗМП)
3,6 %
(0.00 - 6.00)
Индекс активации базофилов на препарат
1.8 *
(0.00 - 1.05)
Количество активированных базофилов (CD3-CRTH2+CD203c+)
после инкубации с препаратом Лидокаин 20мг/мл (ЛЛАРА)
Индекс активации базофилов на препарат
0.1%
0.05
(0.00 - 6.00)
(0.00 - 1.05)
(0.00 - 6.00)
Пациент Ш., 51г. Диагноз: гормон
непродуцирующая аденома надпочечника
04.03.2015 Операция по удалению правого надпочечника.
Вид анестезии: ОБЩАЯ (комбинированная)
Премедикация: фламакс, дормикум, фентанил.
Индукция анестезии: фентанил, дормикум.
Поддержание анестезии: фентанил, севоран.
Миорелаксация: эсмерон.
После индукции анестезии и начала ИВЛ отмечено высокое
давление
в
дыхательном
контуре.
Аускультативно:
выслушивается масса свистящих сухих хрипов над всей
поверхностью легких.
Введено 12 мг дексаметазона и 240 мг эуфиллина, купированы
симптомы бронхоспазма.
Правый надпочечник мобилизован с клеммированием
надпочечниковой вены, удален кускованием в связи с крайней
травмируемостью и нестабильностью паренхимы.
Выводы
У пациентов с атопическим дерматитом
спонтанная активация базофилов значительно
выше, чем у здоровых лиц.
Существует взаимосвязь уровня общего
иммуноглобулина Е и спонтанной активации
базофилов у пациентов с атопическим
дерматитом.
В периферической крови пациентов с
атопическим
дерматитом,
рассеянным
склерозом
и
наличием
лекарственной
сенсибилизации
отмечается
достоверное
повышение T-хелперов 2.
Выводы
Степень
активации
базофилов
на
ингаляционные аллергены выше, чем на
пищевые.
Наиболее часто выявляемыми аллергенами у
пациентов с атопическим дерматитом являются
злаки (рис, гречиха, овес, пшеница, рожь).
Тест активации базофилов является надежным
методом
выявления
лекарственной
сенсибилизации к йодсодержащим препаратам
и препаратам для анестезии
Заключение
Выявление активации базофилов in vitro на
пищевые аллергены даже при отсутствии
специфических IgE должно учитываться врачомаллергологом
при
составлении
диеты.
Элиминация опасных продуктов из рациона
приводит
к
купированию
кожных
и
респираторных симптомов аллергии. При
повторном исследовании на фоне грамотно
проводимой диетотерапии приблизительно у 6080% активация базофилов на аллергены
исключенных продуктов не выявляется.
Заключение
Пациентам
с
отягощенным
аллергологическим
анамнезом
рекомендуется
проводить
выявление
сенсибилизации
к
йодсодержащим
рентгеноконтрастным
препаратам
и
анестетикам непосредственно перед их
применением с использованием теста
активации базофилов.
Тест на активацию базофилов in vitro доступный и перспективный метод
исследования
гиперчувствительности
немедленного типа. Он подходит для
диагностики бытовой, пищевой и
лекарственной аллергии в клинической
практике.
У «нонреспондеров» можно наблюдать
ложнонегативные результаты в тестах с
аллергенами.
Основные лабораторные маркеры в
диагностике и мониторинге аллергии
Гуморальные
- Содержание общего и специфических IgE, IgG4
- Уровень триптазы, диаминооксидазы в сыворотке крови
Клеточные
- Относительное количество активированных базофилов в пробе с
буфером (спонтанная активация)
- Относительное количество активированных базофилов в пробе с
анти-IgE антителами (неспецифическая активация)
- Относительное количество активированных базофилов в пробе с
аллергеном (специфическая активация)
- Индекс активации в пробе с аллергеном (интенсивность
специфической активации)
- Относительное количество Т-хелперов 2
На что обратить особое внимание
«Нонреспондеры»
нонреспондеры»
и
- Особенности организма
- Особенности аллергена
«частичные
ФГБУ ВЦЭРМ им.А.М.Никифорова МЧС России
Россия, 194044, Выборгский р-н, ул Академика Лебедева, д.4/2 тел.: (812)339-39-39
Пациент : С
Регистр.№ 1002014444
Дата забора: 14.02.2013
Пол/Возраст: Женский / 8 мес
Активация базофилов in vitro.
Количество активированных базофилов (CD3-CRTH2+CD203c+)
в периферической крови (спонтанная активация базофилов)
17.60% (0.00 - 6.00)
Количество активированных базофилов (CD3-CRTH2+CD203c+)
после инкубации с препаратом 1аллерген из коровьего молока
16.80%
(0.00 - 6.00)
Индекс активации базофилов на препарат 1
Количество активированных базофилов (CD3-CRTH2+CD203c+)
после инкубации с препаратом 2 аллерген из пшеничной муки
0.95
Индекс активации базофилов на препарат 2
Количество активированных базофилов (CD3-CRTH2+CD203c+)
после инкубации с препаратом 3 аллерген из домашней пыли
1.09 * (0.00 - 1.05)
Индекс активации базофилов на препарат 3
Позитивный контроль базофилов
Индекс активации базофилов на позитивный контроль
19.20 %
23.80 %
(0.00 - 1.05)
(0.00 - 6.00)
(0.00 - 6.00)
1.35 * (0.00 - 1.05)
18,2
1.03 * (более 1,1)
На что обратить особое внимание
Высокая и низкая спонтанная активация базофилов
Пациент
А
Б
Индекс активации базофилов
1,06
1,06
Спонтанная активация, %
15,8
3,1
Индуцированная активация, %
16,8
3,3
Разница между индуцированной и
спонтанной активацией, %
1,0
0,2
На что обратить особое внимание
Время между забором крови и проведением
анализа – чем меньше, тем лучше.
Пациент Исследование
спонтанной
активации (%) через
1ч 30мин
С
7,1
Исследование
спонтанной активации
(%) через 3ч
13,8
К
3,5
4,9
В
14,5
37,8
На что обратить особое внимание
Токсичность лекарственных препаратов в
тесте in vitro.
Видим
неудовлетворительные
показатели на гистограмме FS/SS –
уменьшаем количество препарата на
тест,
проводим
дополнительное
исследование как спонтанной активации,
так
и
индуцированной
с
этим
препаратом.
На что обратить особое внимание
У
некоторых
пациентов
при
проведении исследования в период
острой
аллергической
реакции
(особенно, при выраженных отеках)
количество базофилов в периферической
крови резко снижается.
По
инструкции
необходимо
анализировать не менее 500 базофилов.
На что обратить особое внимание
Какой вакутейнер лучше использовать
для забора крови на активацию
базофилов?
Согласно
инструкции,
возможно
собирать кровь в вакутейнер с ЭДТА (с
использованием
активационного
раствора) либо с гепарином.
Спасибо за внимание
Лаборатория клинической иммунологии ФГБУ ВЦЭРМ им.А.М. Никифоров
8-931-307-10-12
BNV19692007@yandex.ru
Schneider E. et al, 2010