Вирус краснухи IgG Авидность (Avidity anti

Avidity Anti-Rubella virus (IgG) ELISA, EUROIMMUN AG
1
_____________________________________________________________________________________________________
Регистрационное удостоверение ФС №2009/04988 от 31.08.2009 г.
Вирус краснухи IgG Авидность
(Avidity anti-Rubella virus IgG ELISA)
Иммуноферментный набор для определения авидности антител класса IgG к вирусу краснухи в сыворотке
или плазме крови человека.
Номер по каталогу: ЕI 2590-9601-1G
Набор рассчитан на 96 определений
ПРИНЦИП МЕТОДА
Определение различий между недавней инфекцией и инфекциями, которые протекают уже какое-то время
– одна из важнейших проблем, с которой сталкивается серология. До настоящего времени наиболее
распространенным методом дифференциации было исследование специфических антител класса IgM,
которые обычно появляются в начальной фазе инфекции и определение которых часто бывает
ненадежным и проблематичным. Оказывающими влияние факторами являются длительный IgM ответ,
слишком низкий уровень или задержка образования IgM-антител, а также неспецифическое образование
IgM-антител при поликлональной стимуляции В-клеток.
Для надежного определения недавней первичной инфекции в последние несколько лет принято определять
авидность антител класса IgG. Первой реакцией иммунной системы после инфицирования является
образование низкоавидных антител. По мере развития инфекции образуются IgG, более адаптированные к
антигену, и авидность антител возрастает. Если в сыворотке крови обнаруживаются высокоавидные
антитела класса IgG, можно предполагать, что инфекционный процесс вышел за пределы ранней стадии.
МАТЕРИАЛЫ И РЕАГЕНТЫ
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Компонент
Цвет
Количеств
о
Обозначение
Набор Anti-Rubella ELISA
(IgG, кат. № EI 2590-9601 G)
Положительный контроль НА
Высокоавидные антитела к вирусу краснухи (IgG, человека),
готовы к использованию
Положительный контроль LA
Низкоавидные антитела к вирусу краснухи (IgG, человека),
готовы к использованию
Раствор мочевины
для набора Anti-Rubella ELISA, готов к использованию
Фосфатный буфер
готов к использованию
Инструкция по применению
–
красный
1 × 1,3 мл
POS CONTROL
синий
1 × 1,3 мл
POS CONTROL
желтый
1 х 12 мл
UREA
голубой
1 × 12 мл
PBS BUFFER
–
1 буклет
Хранение и стабильность набора: Набор следует хранить при температуре от +2 °С до +8 °С. Не
замораживать. Невскрытые компоненты набора сохраняют стабильность в течение всего указанного срока
годности набора.
Утилизация отходов: Образцы пациентов, калибраторы, контроли и стрипы после инкубации следует
рассматривать как инфицированные отходы и обращаться с ними соответствующим образом. Все реагенты
следует утилизировать в соответствии с действующими официальными инструкциями.
ПОДГОТОВКА И СТАБИЛЬНОСТЬ РЕАГЕНТОВ
Примечание: Перед использованием все реагенты необходимо прогреть до комнатной температуры (от
+18 °С до +25 °С) в течение 30 минут. После первого использования реагенты сохраняют стабильность в
течение указанного срока годности, если они хранятся при температуре от +2 °С до +8 °С и защищены от
микробного загрязнения. Прочие сведения о стабильности отдельных реагентов указаны ниже.
- Контроли: Готовы к использованию. Необходимо тщательно перемешать перед использованием.
- Раствор мочевины: Готов к использованию.
- Фофатный буфер: Готов к использованию.
Предостережение: Используемые контрольные сыворотки были проверены на антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 и
вирусу гепатита С, а также на наличие HBsAg методами иммуноферментного анализа и
иммунофлуоресценции и показали отрицательные результаты. Тем не менее, все используемые
материалы следует считать потенциально опасными и обращаться с ними, соблюдая необходимые меры
предосторожности. Некоторые реагенты содержат токсичный азид натрия. Избегайте его попадания на
кожу.
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2010
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: [email protected]
Avidity Anti-Rubella virus (IgG) ELISA, EUROIMMUN AG
2
_____________________________________________________________________________________________________
ПОДГОТОВКА И СТАБИЛЬНОСТЬ ОБРАЗЦОВ ПАЦИЕНТОВ
Материал образцов: Сыворотка или плазма (ЭДТА, гепарин или цитрат) крови человека.
Стабильность: Образцы пациентов, предназначенные для исследования этим методом, можно хранить до
14 дней при температуре от +2 оС до +8 оС. Разведенные образцы необходимо использовать в течение
одного рабочего дня.
Разведение образцов: Образцы пациентов разводят 1:101 буфером для образцов. Например: разведите
10 мкл сыворотки в 1,0 мл буфера для образцов и тщательно перемешайте на вортексе (пипетки для этого
не подходят).
ПРИМЕЧАНИЕ: Калибраторы и контроли готовы к использованию, их разводить не надо.
ПРОЦЕДУРА ИССЛЕДОВАНИЯ
Инкубация с образцом (1 стадия)
Внесите по 100 мкл контролей или разведенных образцов пациентов в отдельные лунки микропланшета в
соответствии со схемой размещения (каждый образец и контроль в две лунки). Инкубируйте планшет при
комнатной температуре (от +18 °С до + 25 °С) в течение 30 минут.
Промывка
Ручная: Удалите жидкость из лунок и затем промойте 1 раз, используя 300 мкл рабочего промывочного
буфера на лунку.
Автоматическая: проводите в режиме с переполнением (установите в программе автоматического вошера
параметр “Overflow”), с 1-м циклом промывки и внесением в лунки по 450 мкл рабочего промывочного
буфера.
При каждом цикле промывки после заполнения лунок буфером оставляйте планшет с жидкостью на 30-60
секунд. По окончании промывки (ручной или автоматической) тщательно удалите остатки жидкости из
лунок, энергично постукивая перевернутым планшетом по впитывающей бумаге.
Инкубация с мочевиной (2 стадия)
Внесите в каждую лунку первого, третьего, пятого и т.д. стрипа по 200 мкл раствора мочевины и по 200 мкл
фосфатного буфера в каждую лунку второго, четвертого, шестого и т.д. стрипа (см.ниже схему размещения
образцов). Инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре (от +18 °С до + 25 °С).
Промывка
Удалите жидкость из лунок. Промойте, как описано ранее, но проведите 3 цикла промывки. Используйте
для этого разведенный промывочный буфер.
Примечание: Остаточная жидкость (больше 10 мкл), остающаяся в лунках после промывки, может
помешать действию субстрата и снизить оптическую плотность (ОП) раствора в лунках. Недостаточно
полная промывка (например, менее 3 раз, или при маленьком объеме добавляемого промывочного
буфера, или при коротком времени выдерживания буфера в лунках) может в результате привести к
завышенным величинам ОП в лунках.
Инкубация с конъюгатом (3 стадия)
Внесите в каждую лунку по 100 мкл ферментного конъюгата (меченные пероксидазой антитела к IgG
человека). Инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре (от +18 °С до + 25 °С).
Промывка
Удалите жидкость из лунок. Промойте, как описано ранее, но проведите 3 цикла промывки. Используйте
для этого разведенный промывочный буфер.
Инкубация с субстратом (4 стадия)
Внесите в каждую лунку по 100 мкл раствора хромогена/субстрата. Инкубируйте планшет в течение 15
минут при комнатной температуре (от +18 °С до +25 °С) в защищенном от прямого солнечного света месте.
Остановка реакции
Добавьте в каждую лунку по 100 мкл стоп-реагента (в той же последовательности и с такой же скоростью,
как вносился раствор хромогена/субстрата).
Измерение
Фотометрическое измерение интенсивности окрашивания раствора в лунках проводят при основной
длине волны 450 нм и при длине волны сравнения между 620 нм и 650 нм в течение 30 минут после
добавления стоп-реагента. Перед измерением слегка покачайте планшет, чтобы добиться гомогенного
распределения раствора.
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2010
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: [email protected]
Avidity Anti-Rubella virus (IgG) ELISA, EUROIMMUN AG
3
_____________________________________________________________________________________________________
СХЕМА РАЗМЕЩЕНИЯ НА ПЛАНШЕТЕ ОБРАЗЦОВ И КОНТРОЛЕЙ
A
B
1
2
Пол.
HA
Пол.
LA
Пол.
HA
Пол.
LA
3
P7
4
P7
5
Р 15
6
Р 15
P8
P8
Р 16
Р 16
7
8
9
10
11
12
C
Р1
P1
P9
P9
P 17
P 17
D
P2
P2
P 10 Р 10 P 18
P 18
E
P3
P3
P 11 Р 11
F
P4
P4
P 12 Р 12
G
P5
P5
P 13 Р 13
H
P6
P6
P 14 Р 14
Представленная выше схема представляет собой пример размещения на планшете 18 образцов сыворотки
крови пациентов (от Р 1 до Р 18).
Положительные контроли (Пол. HA и Пол. LA), а также образцы пациентов инкубируют в дубликатах в
соответствующих лунках различных стрипов. Лунки в стрипах 1, 3, 5 и т. д. после инкубации с образцами
сыворотки крови пациентов обрабатывают раствором мочевины. Лунки в стрипах 2, 4, 6 и т. д.
обрабатывают фосфатным буфером.
Лунки можно отламывать от стрипов по одной. Это позволяет привести в соответствие используемое
количество лунок и количество исследуемых образцов и, таким образом, минимизировать расход
реагентов.
Положительные контроли антител с низкой и высокой авидностью выполняют роль внутренних контролей
для проверки правильности процедуры тестирования. Их следует использовать при каждой постановке
анализа.
РАСЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ
Присутствие в сыворотке крови пациента антител с низкой авидностью считается установленным, если
величина ОП в значительной степени снижается после обработки раствором мочевины. Для получения
объективных результатов рассчитывают индекс относительной авидности (RAI), который выражают в
процентах, используя величины ОП образца после и без обработки мочевиной:
ОП образца, обработанн ого мочевиной х 100
= индекс относительной авидности (RAI)
ОП образца, не обработанн ого мочевиной
Верхняя граница интервала антител с низкой авидностью (уровень отсечения, cut-off), рекомендованная
фирмой EUROIMMUN, соответствует RAI, равному 40%. Меньшие значения RAI рассматриваются как
указание на присутствие антител с низкой авидностью. Значения RAI между 40% и 60% рассматриваются
как пограничные. Значения, превышающие 60% указывают на присутствие антител с высокой авидностью.
Если полученный результат классифицируется как пограничный, рекомендуется не ранее, чем через 7
дней, взять второй образец и протестировать его одновременно с первым образцом.
RAI < 40%:
RAI 40-60%:
RAI > 60%:
Указание на присутствие низкоавидных антител
Пограничный результат
Указание на присутствие высокоавидных антител
Достоверные результаты измерения авидности IgG антител могут быть получены только в том случае, если
в образце пациента содержится диагностически значимое количество специфических антител. Как правило,
определение индекса относительной авидности в образцах, ОП которых без обработки мочевиной < 0,140,
нецелесообразно.
Для установления диагноза, кроме результатов серологических исследований, всегда необходимо
учитывать клинические симптомы пациента.
ВНИМАНИЕ: У некоторых пациентов с острой инфекцией обнаруживаются очень высокие титры IgG
антител. Даже если популяция антител класса IgG находится на разных стадиях созревания (т.е.
присутствуют и высокоавидные, и низкоавидные антитела), свободные эпитопы антигенов в сыворотках с
высоким титром антител будут реагировать преимущественно с высокоавидными антителами.
Определение авидности для всей популяции антител класса IgG в таких образцах может привести к
получению ложно высоких значений индекса RAI. Это наблюдается в некоторых случаях при исследовании
образцов больных с острой инфекцией, для которых ОП в лунках, не обработанных мочевиной, больше
1,200. Для таких образцов рекомендуется повторить исследование на авидность, исследуя их в разведении
1:401. Если низкоавидные антитела нормально определяются при ОП>1,200, то в исследовании с большим
разведением нет необходимости.
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2010
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: [email protected]
Avidity Anti-Rubella virus (IgG) ELISA, EUROIMMUN AG
4
_____________________________________________________________________________________________________
КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
1. В исследовании, проведенном фирмой EUROIMMUN, было проанализировано 10 сывороток пациентов с
недавней инфекцией (RAI от 5% до 18%, среднее значение 9%), а также 10 сывороток крови доноров с
недавно проведенной иммунизацией (RAI от 6% до 43%, среднее значение 22,9%), было показано, что
индекс относительной авидности был ниже 50%. В каждом из 10 образцов сыворотки крови пациентов с
устойчивым уровнем IgM-антител (от 48% до 83%, среднее значение 73,6%), а также в 50 образцах
сыворотки пациентов с предшествующей инфекцией (от 55% до 95%, среднее значение 75,4%) индекс
RAI был существенно выше.
(В оригинале инструкции на английском языке на стр. 5 приведен график, анализирующий
распределение индекса относительной авидности среди пациентов с недавней первичной инфекцией,
среди недавно иммунизированных доноров, среди пациентов с устойчивым уровнем IgM-антител и
среди пациентов с предшествующей инфекцией.)
2. В стороннем исследовании, проведенном Департаментом Медицинской Микробиологии и Инфекционных
болезней Университета Манитобы и Виннипега а также Национальной Микробиологической
Лабораторией Агенства общественного здравоохранения Канады, сравнили результаты определения
авидности антител к вирусу краснухи, полученные с помощью ИФА набора фирмы EUROIMMUN, 4
других коммерчески доступных наборов и внутренних референсных тест-систем с твердо
установленными значениями. Исследование проводилось на панели из 66 предварительно
охарактеризованных образцов сывороток. Набор Avidity anti-Rubella virus IgG ELISA показал отличную
корреляцию с референсными тестами и лучшие результаты по сравнению с наборами других
производителей.
Возбудителем краснухи является широко распространенный во всем мире вирус Rubella. Этот
оболочечный вирус принадлежит к роду Rubivirus семейства тогавирусов (Togaviridae). Генетический
материал представлен одноцепочечной +-молекулой РНК. Этот вирус был впервые выделен в 1962 году
Паркманом, Уэллером и Нева. Существует два генотипа вируса, которые в свою очередь подразделяются
на подгенотипы. В западном полушарии распространен генотип I вируса краснухи (RGI), тогда как в Азии –
генотип II (RGII).
Заболевание передается воздушно-капельным путем. Больные краснухой считаются заразными уже на
2-3 неделе инкубационного периода. Типичными симптомами заболевания считаются головные боли,
характерное увеличение лимфатических узлов (генерализованный лимфаденит), особенно в области шеи
(заднешейные и затылочные лимфатические узлы) и типичная пятнисто-папулезная сыпь, сохраняющаяся,
как правило, в течение 3 дней. Элементы сыпи представляют собой пятна бледно-розового или красного
цвета, круглые с ровными краями, не склонные к слиянию, распространяющиеся от лица к телу и
конечностям. Наиболее частыми осложнениями являются артриты – воспаления суставов
(преимущественно пальцев, рук, локтевого и голеностопного суставов), которые у взрослых могут длиться
до трех недель, особенно у женщин. Характерными осложнениями также считаются миокардиты, невриты,
отиты, бронхиты и очень редко краснушный энцефалит с хорошим прогнозом. Чаще всего краснухой
болеют дети в возрасте от 5 до 14 лет, после выздоровления формируется пожизненный иммунитет.
Предположительно заболеваемость среди взрослого населения Центральной Европы составляет 80-90%,
на Ближнем Востоке, в странах Аравийского полуострова и в США – около 91-93%. Это означает, что 1020% женщин детородного периода не имеют иммунитета к краснухе.
Трансплацентарная передача вируса краснухи, особенно в первом триместре, ведет к возникновению
тяжелых врожденных аномалий. Тяжелые формы краснушной эмбриопатии встречаются в 80% случаев. В
первую очередь это наиболее распространенная триада Грега (впервые описана в 1941 году
австралийским офтальмологом Норманном Грегом): поражения сердца, глаз и слухового аппарата, такие
как врожденный порок сердца – около 48% случаев, ретинопатия – около 39%, катаракта/миопия – около
29%, глаукома – около 3%, глухота – около 67% всех случаев. Также встречаются и другие аномалии:
задержка мышечного и умственного развития (частично совместно с микроцефалией) – около 45%,
неонатальная пурпура с гепатоспленомегалией и сахарный диабет – около 23%, иногда поражения
настолько велики, что приводят к гибели плода (включая самопроизвольные аборты) – около 16% случаев.
Во многих странах острая форма краснухи рассматривается как медицинское показание для прерывания
беременности.
При выявлении инфицирования вирусом краснухи, в дополнение к анамнезу и клиническим
исследованиям, очень важно провести качественные лабораторно-диагностические исследования. При
серологическом исследовании иммунного статуса беременных женщин с подозрением на краснушную
эмбриопатию эти исследования носят обязательный характер. Дифференциация между острой формой и
инфекцией, перенесенной в прошлом, – одна из наиболее сложных проблем, с которой сталкивается
серология. Антитела (в основном IgG) к структурным белкам вируса краснухи появляются, как правило, на
второй-третий день с момента появления сыпи. Анитела к полноразмерному, исходному вирусу появляются
в период времени от 3 месяцев до 1 года. Определение авидности специфических IgG антител
способствует выявлению острой формы вирусной инфекции, особенно у IgM-отрицательных пациентов с
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2010
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: [email protected]
Avidity Anti-Rubella virus (IgG) ELISA, EUROIMMUN AG
5
_____________________________________________________________________________________________________
недавней инфекцией и тех, у кого обнаруживают персистирующие IgM антитела. ИФА тест на авидность
антител в основном рекомендуется благодаря его доказанной высокой информативности и достоверности.
Прямое определение вируса краснухи методом ПЦР (полимеразной цепной реакции), например в крови
эмбриона, проводится лишь в специальных лабораториях.
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА, HIT test, HAH test, HAI test) проводится на ранних стадиях
беременности для определения иммунного статуса женщины. Для выявления недавней инфекции проводят
анализ двух образцов крови: первый отбирают при появлении симптомов заболевания, второй – спустя 2-3
недели после первого. Если инфекция свежая, титр антител увеличится в 2-4 раза. В случае получения
пограничных или отрицательных результатов, антитела к вирусу краснухи дополнительно определяют ИФА
методом. Необходимо отметить, что высокий титр антител в реакции ингибирования гемагглютинации при
отсутствии симптомов заболевания свидетельствует об иммунитете к вирусу краснухи, в то время как
низкий титр рассматривается в качестве индикатора несостоятельности иммунитета и возможной
реинфекции в случае повторного контакта с вирусом. Такая интерпретация результатов недостаточно
надежна, поскольку любой титр антител в HIT тесте может свидетельствовать о свежей краснушной
инфекции (нет дифференцирования антител класса IgG от IgM), а высокий титр состоять только из антител
класса IgM.
В качестве альтернативы для оценки иммунитета можно использовать наборы Anti-Rubella virus IgG
ELISA и Anti-Rubella virus IIFT. Увеличение титра антител в течение 10 дней или выявление IgM антител
свидетельствует об острой форме инфекции. Необходимо также принимать во внимание, что IgM антитела
к вирусу краснухи могут обнаруживаться в крови и спустя месяцы после инфекции.
Определение авидности специфических IgG антител, например при помощи наборов Anti-Rubella virus
ELISA (IgG, авидность) или Anti-Rubella virus IIFT (IgG, авидность), позволяет получить более достоверную
информацию о периоде инфекционного процесса. Выявление высокоавидных антител исключает
возможность протекания острого инфекционного процесса в последние 4-6 недель. В наборе Anti-Rubella
Glycoprotein ELISA в качестве целевых антигенов используются гликопротеины вируса краснухи
(структурные белки вируса). Имеющиеся в положительных образцах специфичные антитела классов IgM
(IgA, IgG) связываются с соответствующими антигенами, таким образом вирус краснухи может быть
выявлен уже через 2-3 дня после появления сыпи.
Для выявления случаев энцефалита, вызванного вирусом краснухи, определяют специфические
антитела к вирусу в спинномозговой жидкости (СМЖ). Для проведения этого терапевтически значимого
теста используют набор Anti-Rubella virus ELISA (IgG, в СМЖ), специально разработанный для диагностики
антител в СМЖ. В случае вызванного вирусом краснухи энцефалита в СМЖ обнаруживаются агентспецифические антитела класса IgG. Величина интратекальной продукции специфичных к патогену антител
определяется по относительному коэффициенту СМЖ/сыворотка CSQотн. (синоним: индекс специфичности
антител). Эта величина равна частному от деления доли антител к патогену обнаруженному в СМЖ (в
суммарной фракции IgG СМЖ) на долю антител к патогену обнаруженному в сыворотке крови (в суммарной
фракции IgG сыворотки).
При помощи набора Anti-Rubella virus Westernblot выявляются антитела класса IgG к компонентам
вируса краснухи и уточняются неоднозначные IgM результаты. Для подтверждения результатов теста
дополнительно проводится определение авидности. Специфические по своей конформации IgG антитела к
антигену Е2 вируса краснухи появляются не ранее, чем через 3 месяца после вакцинации или
выздоровления. Таким образом если проявилась полоса Е2 антигена, то наличие острой инфекции за
последние 3 месяца расценивается как маловероятное.
Для профилактики краснушной инфекции во всем мире используют различные схемы вакцинаций. Так
как активная иммунизация против краснухи хорошо переносится, для защиты всех детей до наступления
половой зрелости используют двухстадийную вакцинацию. В случае отрицательного результата,
неизвестного статуса или при обнаружении IgM-антител на ранних стадиях беременности возможна
пассивная иммунизация, но только в течение 7 дней после контакта или 2-3 дней с момента появления
сыпи.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Список литературы приведен в оригинале инструкции на английском языке.
Внимание! Перевод сделан с английского оригинала инструкции. Перед постановкой исследования
сверьте номер и дату издания вложенного в набор оригинала с указанными в настоящем переводе (см.
внизу справа). При несовпадении номеров или дат обратитесь в «Аналитику» за новым переводом, либо
руководствуйтесь оригиналом инструкции.
Anti-Rubella Virus_Avidity_ELISA_EI_2590-9601-1G_rus.doc
1/25/2010
Оригинал EI_2590-1G_A_UK_C08.doc – 18.08.2009 08:33
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2010
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: [email protected]