Оценка иммунного статуса организма человека: цель, принципы

Методические указания по самостоятельной подготовке студентов к практическому занятию по
теме «Оценка иммунного статуса организма человека: цель, принципы, методы. Принципы
функционирования иммунной системы»
Теоретические вопросы
1. Иммунный статус организма: определение, принципы и показания для исследования.
2. Иммунодефициты: определение, классификация.
3. Двухэтапный принцип оценки иммунного статуса.
Тесты первого уровня (ориентировочные):
• клинический анализ периферической крови. Относительная и абсолютное количество лимфоцитов в
крови
• определение количества Т- и В-лимфоцитов в крови;
• определение концентрации основных классов иммуноглобулинов (M, G, A) в сыворотке крови;
• определение фагоцитарной активности лейкоцитов.
Тесты второго (аналитического) уровня:
• определение субпопуляций регуляторных Т-лимфоцитов (Т-хелперов, супрессорных клеток)
• определение спонтанной миграции лейкоцитов и тест торможения миграции лейкоцитов с
использованием ФГА ;
• постановка кожных тестов гиперчувствительности замедленного типа на туберкулин и другие
аллергены, к которым существует сенсибилизация у большинства населения;
• исследование пролиферативной активности Т-лимфоцитов в реакции бласттрансформации на
митогены, антигены;
• определение динамики главных цитокинов, регулирующих клеточный и гуморальный иммунный
ответ (ИНФγ, ФНПα, ИЛ-2 и Ил-4, 5, 6, 10), а также модулируют воспаление.
4. Принципы функционирования иммунной системы.
Перечень практических заданий, которые должен выполнить студент на занятии:
Задание 1. Оценка Т-системы иммунитета.
1.1.
Определить общее количество Т-лимфоцитов в окрашенных препаратах периферической
крови человека методом спонтанного розеткообразования.
Принцип метода: Наиболее дешевым и в то же время достаточно точным методом определения
численности популяции Т-лимфоцитов является метод розеткообразования. Метод основан на
наличии сродства между рецептором CD3 и гликопротеинами мембраны эритроцита барана. При
смешивании лимфоцитов с эритроцитами барана образуются фигуры, получившие название розеток.
Количество таких розеткообразующих клеток (Е-РОК) соответствует количеству Т-лимфоцитов,
для которых характерна экспрессия на поверхности CD3-aнтигена.
1.2.
Учет результатов реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ).
Известны вещества, оказывающие на лимфоциты млекопитающих митогенное действие (табл. 1).
Чаще для оценки функционального состояния Т-лимфоцитов в клинической лабораторной практике
используют фитогемагглютинин (ФГА) — растительный лектин, получаемый из семян фасоли.
Обычно мононуклеарные лейкоциты, выделенные из периферической крови методом градиентного
центрифугирования, культивируют в присутствии ФГА в течение 72 ч. Результаты реакции можно
учитывать либо морфологическим методом, либо по включению радиоактивной метки.
В первом случае из клеточной культуры готовят мазки, фиксируют их в метаноле и окрашивают по
Романовскому—Гимзе так же, как мазки крови. В световом микроскопе с иммерсионной системой
определяют процент бластов по отношению к общему количеству лимфоцитов. Результат может
быть выражен также в виде индекса стимуляции (ИС), представляющего собой отношение процента
трансформированных клеток в опыте (культура с ФГА) к проценту трансформированных клеток в
контроле (культура без ФГА).
Т а б л и ц а 1. Некоторые неспецифические митогены лимфоцитов
1.3.
Провести оценку реакции торможения (ингибирования) миграции лейкоцитов (РТМЛ).
Для оценки клеточного иммунитета воспалительного типа используют реакцию торможения
миграции лейкоцитов (РТМЛ), которая по своей сути является пробирочным аналогом клеточных
иммунных реакций воспаления. В качестве веществ, модулирующих (тормозящих или активирующих)
спонтанную миграционную активность лейкоцитов, применяют те же митогены, что и при РБТЛ.
Кроме того, могут быть использованы тканевые и микробные антигены, стандартные аллергены.
Последние применяют при диагностике саркоидоза, туберкулеза, альвеолитов и других заболеваний,
протекающих с образованием эпителиоидно-клеточных гранулем (тканевое выражение ГЗТ).
Анализируемые клетки помещают в стеклянные капилляры, которые инкубируют в чашках Петри с
культуральной средой с добавлением или без добавления (спонтанный уровень миграции) митогена либо
анти-гена. Сравнение интенсивности миграции в опытной и контрольной чашках позволяет
вычислить индекс миграции.
Задание 2. Оценка В-системы иммунитета.
2.1. Определение общего количества В-лимфоцитов (СДУ) в окрашенных
периферической крови человека методом ЕАС-РОК.
препаратах
Принцип метода: Другая модификация метода розеткообразования (ЕАС-розетки) используется для
идентификации В-клеток. Известно, что на поверхности В-лимфоцитов имеется рецептор для C3компонента комплемента. Для выявления этого рецептора лимфоциты смешивают с эритроцитами
быка, последовательно обработанными антиэритроцитарными антителами в субагглютинирующей
концентрации и комплементом (свежезамороженной сывороткой крови мыши). Использование
такого источника комплемента гарантирует защиту эритроцитов от комплементзависимого
лизиса. После совместной инкубации В-клетки образуют фигуры розеток.
2.2. Определить общее количество иммуноглобулинов основных классов методом радиальной
иммунодиффузии в геле (реакция Манчини).
Принцип метода: Этот метод отличается более высокой чувствительностью,
так как
антисыворотка входит в состав агара, в который из лунки диффундирует антиген. По мере удаления
от лунки концентрация антигена постепенно падает, пока не становится эквивалентной
концентрации антител в агаре. При этом образуется хорошо различимое кольцо преципитации. Чем
выше концентрация внесенного антигена, тем больше диаметр кольца. Если в реакции используется
несколько стандартов с известной концентрацией антигена, то путем сравнения или постройки
калибровочной кривой можно проводить количественное определение антигена в образцах.
Метод широко используется для определения концентрации иммуноглобулинов, C3-комплемента компонента, С-реактивного белка, а-фетопротеина, трансферрина.
Задание 3. Изучить образцы иммунограммы и сделать выводы:
Пример 1. Определить наличие врожденного иммунодефицита у мужчины 55 лет, которому в
течение двух лет трижды исследовали содержание главных иммуноглобулинов в периферической
крови:
Пример 1
Мужчина 55 лет
а
б
в
Ig (г/л)
М
2,7
1,9
2,1
А
0
0
0
G
30,3
39,0
28,5
Пример 2. Определить наличие вторичного иммунодефицита и возможность возникновения
воспалительного осложнения после оперативного вмешательства у мужчины в возрасте 60 лет с
полипозом прямой кишки:
L
Э
М
П
С
Л
Т
В
О
Тх
Тц
Фа
СОЕ
До операции
4,3
3
1
2
71
23
71
13
16
61
10
21
11
2- сутки
после
операции
4,8
4
2
3
63
28
68
6
26
64
4
36
12
6-е сутки
после
операции
4,0
2
1
1
68
27
54
6
40
50
4
30
11
Пример 2
Мужчина 6
лет
Примечание: L - лейкоциты; Э-эозинофилы; М - моноциты; П - палочкоядерные; С сегментоядерные; Л - лимфоциты; Т - лимфоциты; В - лимфоциты; О - лимфоциты, в
которых рецепторы заблокированы токсинами; Тх - Т-хелперы; Тц – Т-цитотоксические; Фа фаза адгезии (фагоцитоз); СОЭ - скорость оседания эритроцитов
Лаборатория иммунологии
Карта иммунологического обследования
Ф.И.О. больного________________________________________________________________
Возраст___________________Пол___________________Дата обследования___________________
Диагноз _____________________________________________________________________________
Норма *
Количество лейкоцитов _______________ х109 /л
(4,5 - 8,0) х109 /л
Базофилы __________ % ____________ х106/л
(0 -1) % (20 -100) х106/л
6
Эозинофилы _______ % _____________ х10 /л
(2 - 5 ) % (100 - 300) х106/л
Палочкоядерные нейтрофилы__________% _____________х 106/л
(2-4)% (100 - 300) х106/л
Сегментоядерные нейтрофилы _________% _____________х10% (45 - 60)% (2200 -4200) х106/л
Лимфоциты__________% ______________х106/л
(25 - 45 )% (1200-2800) х106/л
Моноциты ___________% _____________ х106/л
(4-8) % (200-600) х106/л
Фенотипический состав лимфоцитов периферической крови:
Зрелые Т-лимфоциты (СD3+) ________________% _________х106/л (45 - 70 ) % (540 -1960) х106/л
Хелперы-индукторы (СD4+)__________________% ________х106/л (33 - 50 ) % (396 -1400) х106/л
Супрессоры-киллеры (CD8+)__________________% ________х106/л (16 - 39) % (192 -1092) х106/л
СD4+/ СD8+
__________________
1,5-2,0
Натуральные киллеры (СD56+,16+) _____________% ________х106/л
(5 - 25 ) % (60 -700) х106/л
В-лимфоциты (CD19+,20+,22+)_________________% _________х106/л (6 - 23 ) % (72 - 644) х106/л
Активированные T/B лимфоциты (СD25+)_______%_________х106/л
(8-18)% (84-504) х106/л
+
6
Активированные T/B лимфоциты (СD95 Fas)______%_______х10 /л
(3-18) % (36 - 504) х106/л
Функциональная активность нейтрофилов периферической крови в НСТ-тесте:
Спонтанный вариант: ___________________% положительных клеток
Стимулированный вариант (ЛПС, зимозан)____________% положительных клеток
Фагоцитарная активность____________________%
10-15%
20-80%
75-80%
Активность системы комплемента по СН 50 ___________ гем.ед.
(40 - 80) гем.ед.
Сывороточные иммунглобулины:
IgM _____________ г/л
IgG______________ г/л
IgA ______________ г/л
(0,8 -2,5) г/л
(8,0-16,0) г/л
(0,7 - 3,0) г/л
Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) ____________ усл.ед.
(40 -100) усл.ед.
Заключение: ___________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
Подпись врача – лаборанта _________________________________
* А.А Тотолен и соав. Стандартизация методов иммунофенотипирования клеток крови и костного
мозга человека. Клиническая лабораторная диагностика, 2002, №1, с.44-50.
При подготовке к занятию используйте следующие литературные источники:
1. Ярилин А.А. Основы иммунологии: Учебник. – М.: Медицина, 1999. – С. 382 – 403.
2. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: Учебник/ под ред. А.А.
Воробьева. – М.: МИА, 2004. – С. 265 – 269, 258, 261-262.
3. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. – М.: МИА, 2001. С.
322 – 325.
4. Поздеев О.К. Медицинская микробиология. / Под ред. Акад. РАМН В.И. Покровского. – М.:
ГОЭТАР-МЕД, 2001. – С. 232 – 236, 220.