Экзосомы и их применение

Экзосомы и их применение
 Экзосомальные исследования;
 Очищение экзосом и
микровезикул;
 Продажа наборов и реагентов для
исследования экзосом;
 Создание наборов по индивидуальному
заказу;
 Контрактные исследования и
сотрудничество в научных проектах
1. Экзосомы и
микровезикулы
1. Микровезикулы. Общая информация.
(Hugel et al. (2005), Membrane Microparticles: Two Sides of the Coin, Physiology 20, 22-27)
• Микровезикулы – представляют собой пузырьки
от 100 до 1000 нм в диаметре, образующиеся
путем выпячивания плазматической мембраны
из клетки наружу с последующим отделением
образовавшегося пузырька от мембраны клетки.
• Экзосомы – это небольшие мембранные
везикулы от 50 до 100 нм в диаметре,
образующиеся из эндосомальных
мультивезикулярных телец, и секретируемые
путём экзоцитоза большинством клеток
организма.
Разные пути биогенеза приводят к разным типам образующихся ЭВ. Эти
везикулы включают в себя экзосомы, микровезикулы и апоптозные тельца.
Биогенез и
высвобождение экзосом
Физико-химические характеристики разных типов
секретируемых везикул:
(Thery et al. (2009), Membrane vesicles as conveyors of immune responses, Nature Reviews 9,
581-593)
Фото экзосом под электронным микроскопом
(http://vectorblog.org/2012/11/its-not-the-stem-cells-but-whats-inside-them-that-matters-forbabies-with-lung-disease/)
История экзосом
• 1981 год – впервые используется термин «экзосомы»
для описания микровезикул, содержащих
5´ нуклеотидазную активность.
•
1983 год – описание экзосом при дифференцировке ретикулоцитов.
•
1985 год – было показано, что в процессе созревания ретикулоцитов
экзосомы принимают участие в изменении структуры мембран
путём выведения рецепторов трансферрина.
•
Конец 90-х – показано, что экзосомы принимают участие в регуляции
иммунных реакций организма.
•
2007 год – были описаны многочисленные мРНК и микроРНК ,
которые экзосомы переносят в клетки-мишени.
•
2013 год – Нобелевская премия по физиологии и медицине:
везикулярный транспорт.
Состав экзосом:
Frontiers in Genetics published: 20 April 2012
Функции экзосом:
•
Регуляция иммунного ответа;
•
Представление антигена;
•
Передача РНК и белков;
•
Передача инфекционных
частиц (например, вирусов и прионов);
•
Передача сигналов от клеток к клеткам;
•
Участие в модулировании иммунного ответа;
•
Экзосомы, секретируемые опухолевыми клетками играют
активную роль в онкогенезе, метастазах;
•
Участвуют в неврологических болезнях
2. Методы исследования
экзосом
2.1. Получение экзосом
Методы:
• Ультрацентрифугирование;
• Эксклюзионная хроматография;
• Иммуноаффинность;
• Осаждение с помощью химического реагента
Ультрацентрифугирование
• Экзосомы осаждаются при скорости 100 000 g.
Преимущества
Недостатки
Высокая степень чистоты экзосом
Трудоёмкость
Полученные экзосомы легко растворяются
Затратность по времени
Подходит для больших объёмов жидкости
(например, клеточный супернатант)
Необходимость дорогого оборудования
(ультрацентрифуга)
Доступные стандарты экзосом:
Стандарты экзосом из человеческих
биологических жидкостей и супернатанта
клеток, находящихся в постоянном
культивировании
Стандарты экзосом, доступные по
запросу
ХансаБиоМед предоставляет стандарты
экзосом из более, чем 100 клеточных линий
Лиофилизированные стандарты экзосом
 Применение:
- Калибровочные графики,
- Контроль для количественного подсчёта экзосом,
- Анализ белковых маркеров с помощью
Калибровочная кривая, полученная после
разбавления PES-100 экзосом, пойманных на
HBM-POS иммунопланшет.
различных техник,
- Экстракция и анализ экзосомальных
нуклеиновых кислот,
- Положительный контроль для учёных,
работающих в сфере исследования экзосом.
Характерные экзосомальные маркеры в стандартах экзосом, извлечённых
из мочи (HBM-PEU-30), проанализарованные с помощью FACS.
Профиль характерных экзосомальных маркеров в стандартах
экзосом из плазмы. HBM-PEP-30 был использован для
определения каждого экзосомального маркера.
Амплификация транскрипта β-Actin из всей РНК, извлечённой
из стандартов экзосом COLO-100, MM1-100, BLCL-100
Эксклюзионная хроматография
• Обычно используется колонна Sephadex™ G200.
Преимущества
Недостатки
Высокая степень чистоты экзосом
Высокая стоимость сефадекса
Быстрый и простой метод
Затратность по времени, чтобы промыть
колонну
Иммуноаффинность
- Иммуногранулы
Преимущества
Простой и быстрый метод
Подходит для маленьких объёмов проб
- Иммунопланшеты
Недостатки
Небольшое количество полученных
экзосом
Иммунопланшеты
• Обзор
Иммунопланшеты фирмы HansaBioMed являются 96-луночными
планшетами, ковалентно покрытыми антителами, специфичными для
экзосом и позволяющие захватить и изолировать экзосомы из различных
клеточных супернатантов и биологических жидкостей (человеческая
плазма, серум, моча, слюна).
Это уникальный продукт фирмы HansaBioMed, АНАЛОГОВ НЕТ!
Предлагаемые иммунопланшеты
Преимущества иммунопланшетов:
•
Готовы к использованию;
•
Долгий срок хранения (до 2-ух лет);
•
Возможность изолировать специфические субпопуляций экзосом
без необходимости предварительного очищения экзосом;
•
Маленький объём проб для проведения анализа (100 µл пробы на
лунку);
•
Открытая платформа для создания кастомных иммунопланшетов,
благодаря возможности использовать разные первичные антитела
(можно выбрать любое из длинного списка антител, предлагаемых
фирмой ХансаБиоМед или любых других коммерческих антител).
Иммуногранулы
Латексные иммуногранулы, предназначенные для захвата и изоляции экзосом
ковалентно связаны с антителами против экзосомальных маркеров,
расположенных на поверхности экзосом и позволяют захватывать экзосомы из
биологических жидкостей человека (протестировано на плазме, серуме и моче)
и супернатанта клеточных культур без необходимости предварительной
очистки (ультрацентрифугация или другие методы очистки экзосом).
Иммуногранулы HBM
подходят для захвата всей
популяции экзосом
(Immunobeads for Overall
Exosome capture) или для
обогащения субпопуляции
экзосом, полученных из
раковых клеток (Tumoralderived exosome capture
and enrichment).
Предлагаемые иммуногранулы
Набор с иммуногранулами включает в себя также буфер для элюции
экзосом – буфер, позволяющий отсоединять экзосомы от иммуногранул, и
буфер для восстановления иммуногранул, позволяющий использовать
иммуногранулы по меньшей мере ещё один раз.
Применение иммуногранул
-
Изоляция всех популяций экзосом из
супернатанта клеточных культур и
биологических жидкостей человека
(протестировано на плазме, серуме, моче);
-
Изоляция и обогащение субпопуляций
экзосом (ракового происхождения);
-
Профилирование экзосомальных маркеров;
-
Экстракция нуклеиновых кислот;
-
Элюция экзосом с иммуногранул
Преимущества иммуногранул:
• Позволяют получать как все экзосомы, содержащиеся в
образце, так и обогатить специфические субпопуляции
экзосом ракового происхождения;
• Готовы к использованию;
• Простой, быстрый и эффективный протокол;
• Подходит для образцов биологических жидкостей или
клеточного супернатанта малого объёма ;
• Не требует предварительных методов очистки экзосом;
• В набор входит буфер для элюции экзосом с
иммуногранул;
• Иммуногранулы могут быть восстановлены с помощью
Буфера для Восстановления Иммуногранул и
использоваться вновь;
•
Срок хранения 8 месяцев.
Осаждение с помощью химического
реагента
Соли (SO42-/CH3COO-/Cl-…)
неэффективны для выделения
экстрацеллюлярных везикул.
Традиционное
высаливание
Модифицированное
высаливание
Использование инертных матриц,
чтобы стерически исключить
везикулы из растворителя.
Химическое осаждение:
EXO-Prep
-Схожий принцип работы;
Total Exosome Isolation
ExoQuick
- Разный состав инертных матриц;
- Разная концентрация солевых
буферов
Изоляция ЭВ, основанная на неионных
полимерах
Механизм осаждения везикул:
Полимер действует как инертная губка, которая стерически
исключает везикулы из раствора.
Осаждение с помощью химического реагента
EXO-Prep
EXO-Prep – реагент для
быстрого и удобного
осаждения экзосом из
биологических жидкостей и
клеточного супернатанта.
Экономит время и деньги.
 Не требует
ультрацентрифугирования.
 Полученные везикулы
подходят для большого
количества анализов.
EXO-Prep
Доступные наборы:
EXO-Prep
Применение
Полученные везикулы подходят для:
- Профилирование белков (ELISA или WB);
- Экстракция и профилирование РНК;
- Анализ траектории наночастиц (NTA);
- FACS
Количество экзосом, полученных с помощью
EXO-Prep посчитано с помощью анализа
ELISA с использованием HBM
иммунопланшета для изоляции всех экзосом
из человеческой плазмы (HBM-POF)
Выявление
экзосомального
маркера Alix с
помощью WB.
В качестве контроля
использовались
экзосомы, полученные
с помощью УЦ (30µг)
Профилирование миРНК, полученной из экзосом,
изолированных из 100 µл и 500 µл плазмы
Сравнение
разных способов
химического
осаждения ЭВ
Очищение всей популяции ЭВ с помощью химического осаждения.
Анализ траектории наночастиц (NTA) выполнен в человеческой плазме.
Преимущества и недостатки химического
осаждения ЭВ
Преимущества
-Быстрота по времени
- Низкая стоимость
- Простота процедуры
- Работает с малыми объёмами
проб
- Большой выход экзосом и ЭВ
- Подходит для множества
анализов
Недостатки
- Низкая чистота полученных
экзосом
- Циркулирующие белки
осаждаются вместе с ЭВ
- Растворить осадок ЭВ очень
трудно (используя
большинство коммерческих
реагентов)
- Неизбирателен для
осаждения конкретных
субпопуляций ЭВ
Сравнение разных методов получения экзосом
EXO-Prep
Итоги
-
Химическое осаждение – это эффективный метод для изоляции
экзосом и микровезикул из супернатанта клеточных культур и
биологических жидкостей.
-
Процедура простая, быстрая и недорогая.
-
Пользователи:
-
Учёные, желающие исследовать образцы малых объёмов;
-
Учёные, которые не работают с ЭВ ежедневно;
-
Лаборатории, которые не снабжены оборудованием для
изоляции ЭВ.
2.2. Качественный и количественный
анализ экзосом
• Иммуно-ферментный анализ ELISA (ExoTEST);
• Проточная цитометрия (Exo-FACS);
• Экстракция экзосомальной РНК
Иммуно-ферментный анализ (ExoTEST)
•
ExoTESTTM - это платформа на базе иммуноферментного анализа
sandwich ELISA для количественного и качественного анализа экзосом.
Наборы ExoTESTTM
• Доступные наборы:
Доступны наборы с прозрачными, белыми или чёрными
иммунопланшетами для колориметрического, люминометрического или
флуорометрического анализов соответственно.
ExoTESTTM наборы для количественного подсчёта
экзосом
• Применение:
- Захват и количественный подчёт экзосом из биологических жидкостей человека и клеточного
супернатанта;
- Полное профилирование экзосомальных биомаркеров;
- Преклиническое исследование неинвазивных биомаркеров для обнаружения и наблюдения многих
патологических состояний (воспаление, рак, нейродегенеративные заболевания и проч.)
ExoTESTTM наборы для количественного
подсчёта экзосом
• Преимущества:
-
Готов к использованию;
-
Долгий срок хранения (до 2 лет);
-
Высоко эффективное обогащение субпопуляций экзосом;
-
Подходит для образцов малого объёма (100 µл пробы в лунку);
- Открытая платформа для оптимизации под определённые проекты
благодаря возможности использования разных антител
Проточная цитометрия (Exo-FACS)
• Обзор:
Exo-FACS ̶ набор для качественного анализа экзосом с помощью FACS.
Набор Exo-FACS для охарактеризовывания экзосом состоит из:
- 4 μм гранул, используемых для прямого захвата предварительно
очищенных экзосом,
- стандартов экзосом на выбор;
- антител против общих экзосомальных маркеров CD9 или CD63.
- и буферов
Вскоре мы дополним набор Exo-FACS реагентом EXO-Prep, который позволит
также изолировать экзосомы из биологических жидкостей или клеточного
супернатанта.
Нынешний набор предлагает:
Новый набор предлагает:
- Анализ FACS предварительно
очищенных экзосом
-Изоляцию экзосом из биологических
жидкостей человека или супернатанта
клеточных культур;
- Анализ FACS изолированных экзосом,
которые можно сравнить со стандартами,
присутствующимися в наборе.
Проточная цитометрия (Exo-FACS)
Профилирование FACS экзосомальных
маркеров CD9, CD63, TM9SF4 в очищенных
экзосомах из MM1, SH-SY5Y и U87 клеточных
линий.
2.3. Нуклеиновые кислоты в экзосомах
Экстрацеллюлярные везикулы (ЭВ) переносят нуклеиновые кислоты, которые играют
потенциальную роль в здоровье и болезни, а также становятся новой основой в области
исследований биомаркеров и в терапии.
Наборы для экстракции РНК
ХансаБиоМед предлагает три разных набора для экстракции всей РНК из экзосом:
Полный набор для
экстракции РНК из экзосом с
иммуногранулами (Total
Exosome RNA Extraction Kit
with immunobeads) : набор
включает в себя
иммуногранулы для захвата
либо всей популяции
экзосом, либо экзосом,
специфичных для опухолей, а
также реагенты и материалы
для извлечения всей
экзосомной РНК.
Полный набор для
экстракции РНК из экзосом с
иммунопланшетом (Total
Exosome RNA Extraction Kit
with immuniplate) : набор
включает в себя 96-ти
луночный планшет для
захвата либо всей популяции
экзосом, либо экзосом,
специфичных для опухолей, а
также реагенты и материалы
для извлечения всей
экзосомной РНК.
Базовый набор для
экстракции
экзосомальной РНК
(Exosome RNA Basic Kit):
набор включает в себя
реагенты для экстракции
всей экзосомной РНК из
предварительно
изолированных экзосом.
Схема экстракции РНК из экзосом
Описание:
•
Большой выход всей РНК (включая
малые РНК);
•
Одновременное извлечение мРНК и
миРНК подходит для
транскрипционного
профилирования (RT-PCR, qRT-PCR,
microarray);
•
Получение экзосом и экстракция
РНК из биологических жидкостей
или клеточного супернатанта без
затратного по времени
предварительного очищения проб;
•
Обогащение субпопуляции
экзосом ракового происхождения
для изучения сопряжённых с раком
маркеров миРНК
Стратегия HBM для селективного получения экзомиРНК из опухолей (из 100 µл плазмы)
7,00
miR-16
6,00
5,00
4,00
CD9
BOLF
BTLF
TM9SF4
3,00
2,00
1,00
Fold Change (normalized to miR-451)
Fold Change (normalized to miR-451)
BOLF= Иммуногранулы для захвата всех экзосом
BTLF = Иммуногранулы для захвата экзосом ракового происхождения
6,00
5,00
4,00
CD9
BOLF
3,00
Здоровый
Опухоль
BTLF
TM9SF4
2,00
1,00
0,00
0,00
miR-21
Здоровый
Опухоль
Экзосомальная РНК была получена из100µл плазмы здоровых доноров (Здоровый) или пациентов с диагностированной
раковой опухолью (Опухоль) с последующим захватом экзосом иммуногранулами BOLF или BTLF. Вся РНК была
ретротранскрибирована с помощью miScript II RT kit (Qiagen) и уровень экспрессии miR-21 и miR-16 были измерены по
отношению к контролю (miR-451) с помощью qPCR.
Наборы для экстракции РНК
• Преимущества:
-
Большое количество полученной тотальной РНК (включая
маленькие РНК);
-
Нуклеиновые кислоты извлекаются из маленького начального
объёма пробы;
-
Единственный набор на рынке, который позволяет изолировать
экзосомы методом иммуноаффинности;
-
Единственный набор на рынке, содержащий стандарты экзосом в
качестве контроля;
-
Единственный набор на рынке, позволяющий обогатить
субпопуляцию экзосом ракового происхождения.
2.4. Антитела для экзосомальных
исследований
Антитела для экзосомальных
исследований
Все антитела протестированы и утверждены на свою реактивность
против экзосомальных антигенов.
2.5. Ожидаются вскоре…
 EXO-DNA: набор для захвата и экстракции геномной ДНК
из экзосом;
 Новые инструменты для изучения мышиных экзосом:
 Мышиный ExoTEST;
 Лиофилизированные стандарты экзосом из мышиных
клеточных линий;
 Анти-мышиный CD9 (моноклональное антитело);
 Иммуногранулы для захвата мышиных экзосом
EXO-DNA концепция
•
2011 год – обнаружено, что экзосомы содержат молекулы ДНК, в
частности одноцепочечные геномные ДНК из клетки-хозяина (Tumour
microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences. Balai et al
2011).
•
2014 год – большая часть ДНК, содержащаяся в экзосомах ракового
происхождения является двухцепочечной и содержит в себе мутации,
идентичные тем, что есть в раковых клетках-хозяевах.
(Double-stranded DNA
in exosomes: a novel biomarker in cancer detection; Thakur et al. 2014. Identification of Doublestranded Genomic DNA Spanning All Chromosomes with Mutated KRAS and p53 DNA in the
Serum Exosomes of Patients with Pancreatic Cancer; Kahlert et al 2014).
Поскольку экзосомы могут стать мощным диагностическим инструментом, основанным
на ДНК , а также сыграть роль в выявлении и прогнозе раковых опухолей, ХансаБиоМед
разработал наборы для экстракции и очищения геномной ДНК из экзосом.
EXO-DNA
- Изоляция всех экзосом с помощью EXO-Prep;
- Лизис экстрацеллюлярных везикул и очищение ДНК в колоннах
EXO-DNA
• Предварительные результаты прототипа набора:
Везикулы изолированы с помощью реагента для химического осаждения
экзосом – EXO-Prep и обработаны или не обработаны ДНКазой 1 (для
удаления циркулирующих ДНК). После обработки, ДНК была извлечена с
помощью набора EXO-DNA.
- ДНКаза
– ДНКаза: захват и
очищение как
циркулирующих ДНК,
так и ДНК, полученных
из ЭВ
+ ДНКаза
+ДНКаза: захват и
очищение только ДНК,
полученной из ЭВ
EXO-DNA
На сегодняшний день не существует ни одного набора на
рынке, который позволял бы изолировать геномную ДНК из
экстрацеллюлярных везикул.
Потенциальное использование EXO-DNA:
 Обнаружение нового класса биомаркеров;
 Обнаружение новых маркеров, связанных с развитием
раковых опухолей;
 Применение в диагностике (жидкая биопсия) и
персонализированной медицине
Новые инструменты для изучения
мышиных экзосом
• Концепция
На сегодняшний день на рынке отсутствуют продукты для изучения
мышиных экзосом.
Поскольку спрос на такие наборы и реагенты имеется, то ХансаБиоМед
начал разрабатывать следующие продукты:
 Мышиный ExoTEST: набор для количественного подсчёта мышиных
экзосом;
 Иммуногранулы для захвата мышиных экзосом;
 Анти-мышиное моноклональное CD9 антитело;
Мышиные стандарты экзосом (из клеточной линии меланомы B16)
Мышиный набор ExoTEST
•
Обзор
Набор для количественного подсчёта мышиных экзосом.
Стандарты экзосом: Из мышиной клеточной линии меланомы B16.
Захват экзосом: тот же планшет, что используется для захвата человеческих экзосом,
покрытое собственническим антителом фирмы ХансаБиоМед, которое реагирует как с
человеческими, так и с мышиными экзосомами.
Детекция: анти-мышиное CD9 антитело.
Иммуногранулы для захвата мышиных
экзосом
•
Обзор
Иммуногранулы, покрытые мышиным CD9
антителом для захвата всех популяций экзосом.
- Снабжены также буфером для элюции экзосом.
Мышиные стандарты экзосом (лиофилизированные)
•
Обзор
Лиофилизированные стандарты экзосом из мышиной
клеточной линии меланомы B16.
www.hansabiomed.eu