МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ федеральное государственное бюджетное учреждение «НАУЧНЫЙ ЦЕНТР АКУШЕРСТВА, ГИНЕКОЛОГИИ
advertisement
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ федеральное государственное бюджетное учреждение «НАУЧНЫЙ ЦЕНТР АКУШЕРСТВА, ГИНЕКОЛОГИИ И ПЕРИНАТОЛОГИИ ИМЕНИ АКАДЕМИКА В.И. КУЛАКОВА» На правах рукописи ЗИГАНШИНА Марина Михайловна АУТОАНТИТЕЛА И МОЛЕКУЛЫ КЛЕТОЧНОЙ АДГЕЗИИ ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ, ОСЛОЖНЕННОЙ ПРЕЭКЛАМПСИЕЙ 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: академик РАН, доктор медицинских наук, профессор Сухих Г.Т. Москва – 2016 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ……………………………….….…….………4 ВВЕДЕНИЕ………………………………………………….….….……….6 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………………………….….….…… 15 1.1. Развитие системного воспалительного ответа при беременности…………………………………….……..……...15 1.2. Преэклампсия – как проявление избыточного СВО….……….…...20 1.3. Эндотелий: роль в гомеостазе и при патологии……….…….……..24 1.4. Гуморальный аутоиммунный ответ против эндотелия…….……...31 1.5. Методы обнаружения антител………………………….…….…….…44 Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ…….….……....49 2.1. Организация работы и объем исследования……………….……….49 2.2.Сбор и хранение образцов……………………………………………52 2.3.Клинико-лабораторное обследование……………………………….52 2.4. Специальные методы исследования……………………………...…53 2.5. Статистические методы……………………………………...………69 Глава 3. АДАПТАЦИЯ МЕТОДА ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫМ КЛЕТКАМ В НОРМЕ И ПРИ ПРЕЭКЛАМПСИИ…………………………………………..…….………71 3.1.Выявление антиэндотелиальных антител………………….………..72 3.2.Определение зоны эквивалентности концентраций антигенов и антител ……………………………..…………………………………….………74 3.3.Влияние температуры на результаты выявления антиэндотелиальных антител………………………………………….………..77 Глава 4. АКТИВАЦИИ ВЫЯВЛЕНИЕ ПРИ МАРКЕРОВ НОРМАЛЬНОЙ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ И ОСЛОЖНЕННОЙ ПРЕЭКЛАМПСИЕЙ БЕРЕМЕННОСТИ………………………………………81 4.1. Выявление антител к эндотелиальным клеткам (АЭАТ) при физиологической беременности и беременности, осложненной преэклампсией……………………………………...……………………………81 2 4.2. Изменение содержания растворимых форм МКА в различные периоды гестационного срока…………………………………………………..88 4.3. Изучение взаимосвязей между АЭАТ и растворимыми формами МКА в крови……………………………………………………………………..98 Глава 5. ПЛАЦЕНТЫ ИЗУЧЕНИЕ ПРИ ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЯ НОРМАЛЬНОЙ И В СТРУКТУРАХ ОСЛОЖНЕННОЙ ПРЕЭКЛАМПСИЕЙ БЕРЕМЕННОСТИ…………………..…………………106 Глава 6. НОРМАЛЬНОЙ КОМПЛЕКСНОЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ ОСЛОЖНЕННОЙ АНТИТЕЛ ПРИ ПРЕЭКЛАМПСИЕЙ БЕРЕМЕННОСТИ ……………………………………………………………..117 6.1. Определение иммуноглобулинов классов М и G в периферической крови пациенток в норме и при преэклампсии………………………………118 6.2. Определение антифосфолипидных антител в периферической крови пациенток в норме и при преэклампсии……………………………….118 6.3. Определение антиэндотелиальных антител в периферической крови пациенток в норме и при преэклампсии……………………………….119 6.4. Влияние гуморальных факторов периферической крови здоровых и больных пациенток на жизнеспособность клеток……………………………120 6.5. Определение антигликановых антител в периферической крови пациенток в норме и при преэклампсии……………………………...………123 6.6. Изучение взаимосвязей между комплексом гуморальных факторов иммунитета, исследованных у пациенток в III триместре беременности… 155 ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………...……………………………………..169 ВЫВОДЫ………………………………………………………………...176 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………….179 3 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ BCR антигенраспознающий рецептор В-лимфоцитов CXCR1/2 рецепторы хемокинов Con A Сoncanavalin A (ConA) агглютинин из тканей мечевидной канавалии DMEM (Dulbecco modified Eagle's medium) модифицированная по способу Дульбекко среда Игла EA.hy 926 иммортализованная клеточная линия, полученая путем слияния клеток эндотелия пупочного вены человека (HUVEC) и клеток линии А549 –карциномы легкого человека ECL Erythrina Cristagalli Lectin агглютинин из семян эритрины петушиный гребень eNO (eNOS) endothelial nitric oxide syntase эндотелиальная NO-синтаза Fas (рецептор смерти) белок клеточной поверхности, способный запускать в клетке апоптоз, после взаимодействия со своим лигандом FasL или агонистическими моноклональными антителами. FcγRIIa/FcγRIIIb Fc-рецепторы (молекулы, распознающие Fc-участок молекул иммуноглобулинов) GTF-связанные белки регуляторные белки, связывающие при активации ГТФ Gal – D-галактоза GalNAc - D-N-ацетилгалактозамин Glc – D-глюкоза GlcA – D-глюкуроновая кислота GlcNAc – D-N-ацетилглюкозамин GMDP – глюкозаминилмурамилдипептид H2O2 пероксид водорода HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) или 4-(2оксиэтил)1-пиперазинэтансульфоновая кислота. Hsp60 белок теплового шока HLA лейкоцитарный антиген человека HUVEC (Human umbilical vein endothelial cells) эндотелиальные клетки пупочной вены человека HAS2- hyaluronan synthase 2 гиалуронат-синтаза 2 IL- интерлейкин IFN интерферон Ig иммуноглобулин ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif) ингибирующий тирозинсодержащий мотив иммунорецепторов ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif) активационный тирозинсодержащий мотив иммунорецепторов NO оксид азота NFkB (nuclear factor kB) ядерный фактор каппа-би MAL II Maackia Amurensis Lectin II лектин из семян маакии амурской 4 MUC-1 (CD227) Муцин-1 — мембранный белок, протеогликан из группы муцинов. PBS (Phosphate buffered saline) фосфатный буферный раствор PBA фосфатный буферный раствор с добавлением бычьего сывороточного альбумина sICAM-1 растворимая форма молекулы межклеточной адгезии 1 типа sVCAM-1 растворимая форма молекулы адгезии сосудистого эндотелия 1 типа sL-селектин растворимая форма L (лимфоцитарного) селектина sE-селектин растворимая форма Е (эндотелиального) селектина sialylLeX антиген Lewis X сиалированный SAMP (self-associated molecular patterns) собственные молекулярные образы SNA Sambucus nigra lectin агглютинин из ягод бузины черной Th- T-хелперы TNF фактор некроза опухоли TIM (T cell immunoglobulin mucin) иммуноглобулин-подобный муцин Т-клеток UEA I Ulex Europaeus Agglutinin I агглютинин из семян утесника европейского VVL Vicia Villosa Lectin агглютинин из семян вики мохнатой АЭАТ антиэндотелиальные антитела αGal еАТ естественные анти-αGal антитела АФА анти-фосфолипидные антитела АГАТ антигликановые антитела АФС антифосфолипидный синдром СВО системный воспалительный ответ ВМВ-ГК фракции гиалуроновой кислоты высокого молекулярного веса ГК гиалуроновыя кислота ДАМП (danger associated molecular pattern) образы опасности ДАД диастолическое артериальное давление МКА молекулы клеточной адгезии МКБ-10 международная классификация болезней 10-го пересмотра НМВ-ГК фракции гиалуроновой кислоты низкого молекулярного веса ПАМП (patogen associated molecular pattern) образы патогенности ПЦМ проточная цитометрия ПЦМ% процент клеток, покрытых антителами, выявляемых методом ПЦМ ПЭ преэклампсия ПМЛ полиморфонуклеарные лейкоциты САД систолическое артериальное давление СКВ системная красная волчанка УЕФ – относительные флуоресцентные единицы ФИТС флуоресцеинизотиоцианат 5 ВВЕДЕНИЕ АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ Наиболее ярким проявлением иммунорегуляции беременности является формирование толерантности к аллоантигенам плода. Нарушение этого процесса приводит к различным осложнениям беременности вплоть до ее потери. Одним из самых тяжелых осложнений является преэклампсия (ПЭ), занимающая третье место в структуре причин материнской смертности и являющаяся новорожденных основной [1]. причиной Согласно заболеваемости современным и смертности представлениям, ПЭ – мультисистемное патологическое состояние, клинически проявляющееся после 20-й недели беременности, характеризующееся артериальной гипертензией в сочетании с протеинурией (≥ 0,3 г/л в суточной моче), нередко, отеками, и проявлениями полиорганной/полисистемной недостаточности [2, 3]. Ключевым патогенетическим звеном в развитии ПЭ является плацентарная ишемия, которая развивается вследствие неполноценной гестационной перестройки материнских спиральных артерий, из-за нарушенных процессов инвазии трофобласта; а также вследствие блокады спиральных артерий, причиной которой являются врожденные и приобретенные тромбофилии. К приобретенным тромбофилиям относят антифосфолипидный синдром (АФС-синдром), связанный с продукцией аутоантител к фосфолипидам клеточных мембран. Одним из важнейших механизмов патогенетического влияния антифосфолипидных антител (АФА) является нарушение функций эндотелия, связанных с антиаггрегационной и прокоагулянтной активностью. Эндотелиальной дисфункции отводят ведущую роль в патогенезе ПЭ, поскольку эндотелий является уникальным монослоем клеток, присутствующих в сосудах основных органов-мишеней (печени, почках, матке, плаценте, ЦНС), изменения в которых предопределяют исходы для матери и плода. эндотелиальной Одним дисфункции из факторов, является определяющим генерация развитие аутоантител к 6 эндотелиальным клеткам (антиэндотелиальные антитела АЭАТ), эпитопная специфичность которых неизвестна, а антигены-мишени охарактеризованы лишь частично [4, 5, 6]. Существует также взгляд на ПЭ как на проявление чрезмерного системного воспалительного ответа [7, 8, 9]. При этом происходит активация иммунных клеток, системы комплемента, свертывающей системы крови, синтез провоспалительных цитокинов, и, как следствие, развивается эндотелиальная дисфункция. Известно, что Th1 клетки и продуцируемые ими цитокины (IL-2, IFNγ, TNFα) обеспечивают и осуществляют цитотоксический иммунный ответ и воспалительный ответ, ассоциированный с активированными макрофагами. Провоспалительные цитокины регулируют, в том числе, и активацию эндотелиальных клеток [10, 11, 12]. Так, при действии IFNγ и TNFα на эндотелий наблюдается повышенная, по сравнению с физиологической беременностью, экспрессия маркеров эндотелиальной активации – молекул клеточной адгезии (МКА) клетками эндотелия, а также возрастание содержания растворимых форм МКА в крови при ПЭ [13, 14, 15, 16]. Th2 клетки и спектр продуцируемых ими цитокинов (IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-6 и IL-13) напротив, способствуют противовоспалительному гуморальному ответу, протективному в отношении плода, но, в то же время, и развитию аллергического воспалительного ответа, ассоциированного с эозинофилами и тучными клетками [17]. Так, показано, что при беременности, с одной стороны происходит продукция протективных “блокирующих” антител, защищающих фетальные клетки от иммунного надзора материнской иммунной системы [18, 19]. С другой стороны, есть множество сообщений, что при патологии беременности наблюдается повышенный синтез антител, участвующих в иммунопатологических реакциях [20, 21, 22, 23, 24]. Провоспалительные воздействия на эндотелиальные клетки с неизбежностью должны затронуть молекулярную архитектуру гликокаликса, что проявляется в синтезе гипогликозилированных углеводных структур и 7 изменении представленности функциональных углеводных остатков гликокаликса, шеддинге его компонентов, и появлению их в крови [25]. Вследствие этого возникают структурные изменения гликокаликса, что ведет к формированию DAMP [26, 27, 28] (Danger Associated Molecular Patterns), то есть неоантигенов, к которым могут появиться аутоантитела, что сдвигает гомеостатический баланс в пуле естественных антител, существующий в норме [29]. Значительная часть естественных антител человека направлена к гликанам поверхности клетки, при патологиях репертуар этих антител меняется, что справедливо и по отношению к антителам, мишенями которых являются гликаны гликокаликса [30]. Известно, что мишенями антиэндотелиальных антител, которые, могут выполнять как регуляторную функцию [6], так и выступать в качестве ключевого звена в гуморальном аутоиммунном углеводные ответе молекулы, против а эндотелия также при патологиях, являются β2- гликопротеин I – кофактор для взаимодействия АФА с фосфолипидами клеточных мембран [31, 32, 33]. Несмотря на многочисленные исследования последних лет, в литературе отсутствуют однозначные данные об участии АФА и АЭАТ в патогенезе ПЭ; профиль антигликановых (анти-углеводных) антител при физиологической и осложненной беременности остается неизученным; несмотря на идентификацию общих антигенов, взаимосвязь между АФА, АЭАТ и антигликановыми антителами (АГАТ) остается не выясненной; существующие на сегодняшний день данные о растворимых формах МКА и возможностях их использования для диагностики и прогноза ПЭ весьма противоречивы. Гуморальные факторы иммунитета являются перспективными биомаркерами для малоинвазивной диагностики и прогноза развития патологии беременности. Кроме этого, их уровень в крови может быть параметром, косвенно отражающим активацию/супрессию иммунного ответа, что также является значимым для изучения механизмов развития болезни. Актуальным представляется также идентификация патогенетически 8 значимых аутоантител, специфичность которых позволит иметь представление о детерминантах развития заболевания. ЦЕЛЬ РАБОТЫ: определить особенности спектра аутоантител и растворимых форм молекул клеточной адгезии при преэклампсии и их роль в развитии заболевания. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Адаптировать методику выявления АЭАТ в сыворотке периферической крови к антигенам эндотелиальных клеток линии EA.hy 926 с помощью проточной цитометрии. Определить активность связывания АЭАТ с эндотелиальными клетками у пациенток с физиологической беременностью и беременностью, осложненной преэклампсией. 2. Провести мониторинг содержания растворимых форм молекул клеточной адгезии (sICAM-1, sVCAM-1, sL-селектина и sEселектина) в течение физиологической беременности и беременности, осложненной преэклампсией на разных сроках гестации. 3. Охарактеризовать углеводный фенотип структур плаценты у пациенток с физиологической беременностью и осложненной преэклампсией разной степени тяжести. 4. Выявить антитела к фосфолипидам фосфолипидсвязывающим белкам мембран и (кардиолипину, фосфатидилсерину, аннексину V, протромбину и кофакторному белку β2-гликопротеину І) у пациенток III триместра беременности в норме и при преэклампсии. 5. Выявить антитела к гликанам и охарактеризовать их углеводную специфичность у пациенток III триместра при физиологической беременности и осложненной развитием преэклампсии. 6. Исследовать взаимосвязь между изученными показателями гуморального звена иммунитета. 9 Научная новизна исследования Впервые проведено изучение АЭАТ на разных сроках беременности в норме и при ПЭ. Выявленные различия по активности связывания АЭАТ с эндотелиальными клетками могут быть отражением патогенетического механизма действия АЭАТ на эндотелий. Впервые изучены маркеры эндотелиальной активации у пациенток с физиологической беременностью и ПЭ в динамике беременности. Исследование растворимых форм МКА в крови пациенток подтвердило развитие черезмерного воспалительного ответа при ПЭ, превосходящего гомеостатический. В данной работе впервые проведен анализ взаимосвязей между маркерами эндотелиальной активации: растворимыми формами МКА в крови пациенток и активностью связывания АЭАТ с эндотелиальными клетками линии EA.hy 926. Установлено, что имеются как общие для изучаемых групп пациенток связи, отражающие необходимый уровень активации клеток, так и характерные только для нормы или только для патологии корреляционные связи, что свидетельствует о разном состоянии гуморальных систем, связанных с воспалительным ответом и активацией эндотелия при ПЭ. В ходе работы впервые установлено, что паттерн гликозилирования структур плаценты различен при ПЭ тяжелой и умеренной степени, что может быть причиной срыва механизмов формирования толерантности к плоду. Впервые проведено исследование широкого спектра антигликановых антител при физиологической беременности и ПЭ и охарактеризована их углеводная специфичность, что позволяет сделать заключение об углеводных детерминантах определяющих формирование антител при ПЭ. Впервые проведено комплексное исследование аутоантител (АФА, АЭАТ, АГАТ) специфичных к широкому спектру антигенов, а также выявлены взаимосвязи между исследованными антителами. 10 Представленная работа является комплексным исследованием аутоиммунитета при беременности и позволяет более глубоко понять патогенез заболевания. особенности Полученные функционирования данные позволили гуморального установить иммунитета при физиологической беременности и осложненной ПЭ. Практическая значимость В представленном исследовании проведена адаптация метода проточной цитометрии для выявления антител к эндотелиальным клеткам в норме и при ПЭ, подобраны условия для проведения анализа. Адаптированный метод может быть использован для выявления АЭАТ при различных патологических состояниях, сопровождающихся эндотелиальной активацией, и открывает перспективы для изучения клинической и диагностической значимости АЭАТ. С помощью микрочипового метода выявлен спектр аутоантител к гликанам, что открывает перспективы для использования данного метода в научных и клинических исследованиях. Полученные результаты могут стать основой для выявления диагностической сигнатуры антител и разработки микрочиповых тест-систем для диагностики ПЭ, а также оценки степени ее тяжести. Внедрение результатов исследования в практику Результаты диссертационной работы внедрены в программу лекций кафедры акушерства, гинекологии, перинатологии и репродуктологии института профессионального образования ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России и в практическую работу акушерского обсервационного отделения ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава России. Результаты исследования изложены в трех обзорных статьях и двух оригинальных статьях, опубликованных в журналах «Акушерство и гинекология» (импакт-фактор 0,621), «Бюллетень экспериментальной 11 биологии и медицины» (импакт-фактор 0,565), «Иммунология» (импактфактор 0,429). Положения, выносимые на защиту 1. При преэклампсии в периферической крови матери обнаруживается комплекс гуморальных факторов, связанных с реализацией чрезмерного воспалительного ответа (растворимые формы МКА) и свидетельствующий об аутоиммунном ответе против эндотелия (АЭАТ). Высокая активность связывания АЭАТ(IgM) c антигенами эндотелиальных клеток наблюдается при физиологической беременности и преэклампсии, что демонстрирует функциональную гетерогенность антител. Активность связывания АЭАТ(IgG) при преэклампсии повышена в третьем триместре, что указывает на их роль в патогенезе заболевания. Изменения содержания растворимых форм МКА взаимосвязаны между собой как в норме, так и при патологии и зависят от активности связывания аутоантител в определенные периоды беременности. 2. Физиологическое формированием развитие детерминированного плаценты углеводного сопровождается кода – нормального паттерна гликозилирования структур плаценты, для которого характерно определенное количество функциональных углеводых остатков, служащих лигандами для ингибиторных рецепторов клеток иммунной системы. Паттерн гликозилирования структур плаценты при преэклампсии, напротив, характезизуется сниженным количеством терминальных остатков сиаловых кислот (лигандов для ингибиторных рецепторов) и повышенным количеством терминальных остатков маннозы, которые служат лигандами для эндогенных гликозилирования лектинов структур С-типа. плаценты Выраженность зависит от изменений степени тяжести преэклампсии: наиболее выраженные изменения выявлены при тяжелом течении заболевания. 3. Беременность, осложненная преэклампсией, характеризуется интенсивным гуморальным ответом на углеводные антигены и антигены 12 эндотелиальных клеток, превосходящим наблюдаемый при физиологической беременности. Повышенное содержание антител к гликанам – рецепторам эндогенных лектинов и гликанам гликокаликса может явиться фактором, свидетельствующим о нарушении иммунорегуляции гестационного периода. Личный вклад автора Автор непосредственно исследований, формулировке участвовал цели и в задач выборе направления исследования. Автором предложены оптимальные методы для проведения научного исследования, разработаны протоколы исследований, сформированы электронные базы данных на пациентов. Основной объем лабораторных исследований выполнен автором лично, или при непосредственном участии автора. Также автором выполнена статистическая обработка данных, анализ и обобщение материала. Соответствие диссертации паспорту полученной специальности Научные положения и результаты диссертации соответствуют формуле и области исследований специальности 14.03.09 -«клиническая иммунология, аллергология». Апробация работы Материалы диссертационной работы были представлены на 11, 15 и 16 Всероссийском научном форуме «Мать и Дитя» (Москва, 2010, 2014, 2015 г.г.); VIII региональном научном форуме «Мать и Дитя» (Сочи, 2015); V и VII международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2011, 2013 г.г.); XII международном конгрессе «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (Москва, 2013); 27th European Congress of Pathology (Лондон, 2014); VII Всероссийской научной конференции «Иммунология репродукции: теоретические и клинические аспекты» (Ростов-на-Дону, 2015). Диссертационная работа обсуждена на заседании межотделенческой апробационной комиссии ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России (25.06.2015, протокол №5). 13 Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, шести глав, выводов, списка литературы. Работа изложена на 215 страницах компьютерного текста, содержит 30 таблиц и 37 рисунков. Библиография содержит 369 литературных источника, в том числе 35 на русском, и 334 на иностранном языках. 14 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. Развитие системного воспалительного ответа при беременности Существует множество экспериментальных подтверждений, что при беременности развивается так называемый “физиологический”, контролируемый, системный воспалительный ответ (СВО). Аналогично классическому воспалительному ответу, физиологический воспалительный ответ при беременности развивается в ответ на локальное повреждение (при ремоделировании матрикса, сопровождающее имплантацию, плацентацию и процессы ангиогегеза плаценты) [34, 35] и проникновение чужеродных агентов (клеток, микрочастиц и растворимых факторов плацентарного происхождения) [36, 37]. Гуморальные факторы, клеточный дебрис и субклеточные частицы трофобласта считаются как триггером развития СВО, так и могут нести функцию адъювантов [37, 38]. Клетки-эффекторы врожденного иммунитета матери распознают фетальные продукты как образы патогенности/опасности, реализуя клеточные и молекулярные механизмы защиты от чужеродного генетического материала [39]. При этом экзогенными образами можно считать продукты генов наследуемых от отца, а эндогенными – образованные в результате травмы, ишемии, некроза или оксидативного стресса [39]. Также есть отдельные сообщения о генерации при воспалительном ответе различных антигенов, которые являются вариантами “измененного своего”; “неоантигенов”, образующихся в результате посттрансляционных модификаций белков [40]; антигенов, мобилизованных на мембрану вследствие перемещения из цитоплазмы и внутренних клеточных компартментов, вступающих во взаимодействия с белками или фосфолипидами мембран и являющихся образами опасности [23]. Центральным событием воспалительного ответа является контакт между лейкоцитами и эндотелием, с последующей миграцией иммунных клеток в очаг воспаления. На ранних стадиях воспалительной реакции эндотелиальные селектины (Е-селектин и Р-селектин) и лимфоцитарный Lселектин, экспрессирующиеся под действием провоспалительных цитокинов, 15 образуют обратимые связи с углеводными лигандами на поверхности клеткипартнера, обеспечивающие хоминг лимфоцитов в лимфоидные органы и контакт и так называемый “роллинг” лейкоцитов вдоль сосудистой стенки (рисунок 1). Рисунок 1. Схематичное изображение основных стадий трансэндотелиальной миграции лейкоцитов в субэндотелиальное пространство. Ключевые лиганды и рецепторы, опосредующие каждую стадию, показаны в рамках. Selectins: L-селектин, Р-селектин, Е-селектин; PSGL1- гликопротеиновый лиганд 1 типа Р-селектина; VCAM1- молекула адгезии сосудистого эндотелия 1 типа; ICAM1- молекула межклеточной адгезии 1 типа; MADCAM1- молекула адгезии “адрессин” слизистых оболочек 1 типа (адаптировано из [41]) Лигандами для селектинов являются концевые остатки фукозы и маннозы в составе гликоконъюгатов и полисахаридов внеклеточного матрикса [42]. эндотелиальными Лейкоцитарный муцинами, L-селектин эндотелиальные взаимодействует Е- и с Р-селектины - с сиаломуцином PSGL-1 и CLA-антигеном, являющимся фукозилированным производным PSGL-1 [43], а также с Sia-LeX содержащими структурами лимфоцитов. Эпитоп sialyl Lex является общим рецептором для Е-, Р-, и Lселектинов [44]. Исследователями было также обнаружено, что Е- и Рселектины опосредуют рекрутинг Th1-клеток в места воспаления, поскольку способны избирательно связываться с Th1-, но не с Th2 клетками [45]. Углевод-белковое взаимодействие на ранних этапах воспалительного процесса является основным в обеспечении контакта иммунных клеток с 16 эндотелием [46]. Следующие стадии межклеточного контакта, предшествующие трансэндотелиальной миграции, проходят с участием других классов МКА и других типов контактных взаимодействий и свидетельствуют о состоявшемся воспалительном ответе [47]. Благодаря углевод-белковому взаимодействию опосредуются не только начальные стадии воспалительного множество межклеточных адаптивный иммунный процесса, контактов, ответ. но и регулирующих Основными осуществляется врожденный и гликан-связывающими рецепторами являются лектины и антитела [48]. Основные три класса лектиновых рецепторов, широко представленные на клетках иммунной системы и экспрессирующиеся как в мембрансвязанной, так и в растворимой форме и участвующие в реализации воспалительного ответа: 1.Лектины С-типа: (специфичные к маннозо (Man-) и/или фукозо (Fuc-) терминированным гликанам; и специфичные к галактозе (Gal-) или Nацетилгалактозамину (GalNAc-)/N-ацетилглюкозамину (GlcNAc-), широко представленные на макрофагах, дендритных клетках, естественных киллерах. Осуществляют функции паттернраспознающих рецепторов (ПРР), сигналлинга и адгезии [49]. Образами патогенности/опасности для них являются гликоконъюгаты – бактериальные липо-олигосахариды, пептидогликаны, а также молекулы образованные в результате повреждения ткани – фрагменты гиалуронана или гликозаминогликаны протеогликанов матрикса [50]. Наиболее изученные молекулы, относящиеся к лектинам Стипа: рецепторы клеток миелоидного ряда (маннозосвязывающие рецепторы DEC-205 и маннозный рецептор CD206); дектин-1 и дектин-2, DC-SIGN (CD209), лангерин (CD207), а также ранний маркер пролиферации лимфоцитов CD69. Примечательным является факт, что CD209+ CD206+ макрофаги принадлежат к толлерогенному фенотипу М2-макрофагов [51]. 2.Сиглеки – семейство лектинов, специфически связывающие структуры гликанов с терминальной сиаловой кислотой. Общим лигандом всех членов данного семейства является Sialyl Tn (Neu5Acα2,6-GalNAcα-). 17 Члены этого семейства являются ингибиторными рецепторами, экспрессированными главным образом на иммунных клетках [52]. Сиглеки участвуют в регуляции/ограничении черезмерного активационного ответа при воспалительной реакции, инициируемой распознаванием патогенассоциированных молекулярных паттернов (ПАМП) и паттернов опасности (ДАМП) с последующим фагоцитозом клеток их несущих [50, 52, 53]. Кроме фагоцитоза, некоторые сиглеки, благодаря наличию в их структуре иммунорецепторного тирозинового ингибиторного мотива (ITIM) способны, при взаимодействии с углеводными лигандами, генерировать ингибирующие сигналы, которые подавляют активацию клеток. Тот же механизм задействован в ограничении активности ЕК-клеток при взаимодействии их с терминальными остатками сиаловой кислоты на муцинах и ганглиозидах [52]. Сиглеки осуществляют регуляцию клеточной пролиферации, дифференциации, апоптоза, адгезии, синтеза цитокинов, негативную регуляцию В-клеточного сигналинга [56]. 3.Галектины – семейство лектинов, специфичных в отношении бетагалактозы (β-Gal) и N-ацетиллактозамина (LacNAc-) в составе гликопротеинов и гликолипидов клеточной поверхности и ВКМ [57]. Основные лиганды Galβ1-3GlcNAc- или Galβ1-4GlcNAc- [58]. Галектины вовлечены в многочисленные процессы жизнедеятельности клеток – регуляцию клеточного цикла, миграцию, передачу межклеточных сигналов, выполнение эффекторных функций, апоптоз, иммунорегуляцию [59, 60]. Некоторые лектиновые рецепторы способны, подобно аутоантителам, взаимодействовать с собственными, не измененными антигенами (гликанами) организма, так называемыми собственными образами (SAMPself-associated molecular patterns) [61]. Предполагается, что в качестве собственных образов чаще всего выступают молекулярные паттерны, содержащие сиаловую кислоту и гепарин/гепаран сульфат [50]. Также высказываются предположения, что взаимодействие лектиновых рецепторов, распознающие собственные паттерны (сиглеков и фактора комплемента Н) с 18 лигандами, оказывает ингибирующее действие на иммунный ответ и предотвращает черезмерную активацию в ответ на чужеродные/опасные воздействия [50, 61]. Как известно, наличие терминальной сиаловой кислоты несет огромный биологический смысл для организма (формирование общего отрицательного заряда клеточной поверхности, стабилизация конформации гликоконъюгатов, участие в передаче информации, защита гликоконъюгатов и клеток от узнавания и деградации) [62]. Защитные свойства сиалирования проявляются не только во взаимодействии сиалированных структур с ингибиторными рецепторами, но и в маскировании остатков сахаров, являющихся антигенными детерминантами [63]. Так, при десиалировании открываются остатки Galβ-, GalNAc-, маннозы, осуществляя взаимодействия с лектинами семейства галектинов и лектинами С-типа [61], значимые при метастазировании и развитии СВО. Однако обнаружено, что воспалительная реакция, прогрессирующая при десиалировании гликоконъюгатов клеток, может быть ограничена взаимодействием экспонированных углеводных остатков с галектинами. Так, показано, что экзогенный галектин-1 вызывает апоптоз зрелых и активированных Т-клеток, ингибирует адгезию Т-клеток к ВКМ и секрецию TNFα и IFNγ активированными Т-клетками [58]. Растворимая форма галектина-9 ингибирует связывание опухолевых клеток с ВКМ, сокращая адгезию, инвазию и миграцию опухолевых клеток [57]. Галектин-9 осуществляет также негативную регуляцию адаптивного иммунного ответа взаимодействием с углеводными лигандами Т-клеток – иммуноглобулинподобными муцинами Т-клеток (TIM). Молекула TIM-3 экспрессируется субпопуляциями Th1, Th17 и цитотоксических Т - клеток, ЕК-клетками, моноцитами, макрофагами и дендритными клетками. Показано, что связывание галектина-9 с TIM-3 ингибирует Th17-поляризацию, индуцирует апоптоз провоспалительных субпопуляций Т-клеток и способствует экспансии Т-регуляторных клеток [60]. Кроме этого установлено, что 19 взаимодействие TIM-1 с галектином-9 ингибирует дифференцировку Th1 клеток [65], способствуя толерантности иммунной системы к опухоли [60]. В противоположность галектинам, обладающим выраженными ингибирующими эффектами на процессы воспаления (галектин-1, галектин9), галектин-3 проявляет провоспалительные эффекты, способствует синтезу IL-1, является хемоаттрактантом для моноцитов и стимулирует клеточную адгезию и миграцию [66]. Таким образом, при беременности наблюдается активация клеток врожденного иммунитета образами патогенности и образами опасности, формирование которых происходит при контакте фетальных и материнских клеток. Существующие взаимодействии, механизмы, способные как основанные усугубить, так на и углевод-белковом ограничить СВО, недостаточно изучены. В частности, это касается гуморальных факторов, которые могут выступать в качестве иммунорегуляторных молекул и являться одной из причин срыва механизмов обеспечивающих толерантность при беременности и развития патологии. Чрезмерный или избыточный СВО, развивающийся при патологии беременности характеризуется истощением компенсаторных реакций и развитию дисфункций различного рода, реализующихся в органной или полиорганной недостаточности [9, 67]. 1.2. Преэклампсия – как проявление избыточного СВО Преэклампсия – мультисистемное патологическое состояние, клинически проявляющееся после 20-й недели беременности. Частота встречаемости в популяции по данным ряда авторов колеблется от 2-9% [68, 69]. Клиническими признаками ПЭ являются: повышение систолического артериального давления крови (САД) ≥ 140 мм.рт.ст, диастолического артериального давления (ДАД) ≥ 90 мм.рт.ст., впервые выявленное при беременности; протеинурия ≥ 0,3 г/л в суточной моче, часто наличием отеков, проявлением полиорганной/полисистемной дисфункции/недостаточности [2]. 20 В тяжелых случаях ПЭ сопровождается острой почечной недостаточностью, эклампсией, отеком легких, HELLP-синдромом [68]. Этиологические причины развития ПЭ разнообразны. Предполагается влияние генетических, иммунологических и факторов микроокружения на возникновение заболевания [26, 70, 71, 72, 73, 74]. В настоящее фенотипических клинических время варианта симптомов принято считать, проявления (до ПЭ: 34 недели что существуют ранняя два манифестация беременности) и поздняя манифестация (после 34 недели беременности) [67]. В соответствии с этим выделяют два пути развития ПЭ [1]. Первый - фетальный – характеризуется неадекватной или мелкоклеточной инвазией клеток трофобласта в маточные спиральные артерии и отсутствием или незавершенностью фазы замещения гладкомышечных эластичных волокон фибриноидом [75, 76, 77]. В данном варианте ремоделирования и трансформации спиральных артерий не происходит, что отражается на качестве маточно-плацентарного кровотока [78, 79, 80]. Фетальный вариант развития ПЭ имеет раннюю манифестацию и тяжелое течение, а также большую частоту развития осложнений у матери и ребенка. Второй путь – материнский, при котором дефицит маточноплацентарного кровотока возникает в результате блокады спиральных артерий вследствие экстагенитальной патологии матери, особенно тромбофилий (генетических или приобретенных). Исследование плаценты в этом случае часто свидетельствует об адекватной гестационной перестройке спиральных артерий. Материнский путь чаще всего имеет позднюю манифестацию и более легкое течение. Выделяют также смешанный путь, при котором наряду с нарушением перестройки артерий наблюдается их блокада [1]. Нарушение процессов инвазии трофобласта инициирует ишемические и гипоксические повреждения клеток и тканей плаценты, что приводит к увеличению содержания клеточного дебриса и микрочастиц фетального происхождения в крови матери. Результатом этих процессов является 21 активация материнских иммунных клеток и индукция синтеза провоспалительных цитокинов [81], что ведет к развитию генерализованной эндотелиальной активации/дисфункции с развитием полиорганной недостаточности в тяжелых случаях [82] (рисунок 2.). Рисунок 2. Современные представления о патогенезе преэклампсии, в сравнении с физиологической беременностью В контексте этого в исследовании Чамлея и соавт. было показано, что частицы трофобластного дебриса ранжируются от многоядерных агрегатов ядер клеток синцития до субклеточных частиц представляющих собой микро- и нано-частицы. При исследовании трофобластного дебриса при физиологической беременности было показано, что сокультивирование дебриса с макрофагами и эндотелиальными клетками ведет к формированию толлерогенного М2-фенотипа макрофагов. При добавлении в in vitro систему антифосфолипидных антител или IL-6 наблюдались некротические 22 изменения дебриса. При фагоцитозе некротизированного дебриса наблюдалась активация эндотелиальных клеток [83]. В результате многочисленных исследований было показано, что при ПЭ наблюдаются проявления чрезмерного СВО, в результате потери контроля над балансом продукции про/противо-воспалительных цитокинов [81, 84, 85], что ведет к дизрегуляции синтеза и экспрессии ключевых молекул, опосредующих межклеточные контакты между лейкоцитами и эндотелием. Так, развитие СВО при физиологической беременности вызывает заметное увеличение экспрессии МКА клетками эндотелия (VCAM-1, ICAM1, E - селектина) по сравнению с небеременными пациентками. Одновременно в циркуляции появляются растворимые формы этих молекул, что свидетельствует об активации лейкоцитов (по уровню L-селектина) и эндотелиальных клеток (по уровню Е-селектина, VCAM-1, ICAM-1) [86, 87]. Е-селектин является основным фактором, свидетельствующим об активации эндотелия [88]. В контексте этого показано, что уровень растворимых форм Е-селектина, VCAM-1 и ICAM-1 значительно повышен в крови при ПЭ [86, 89, 90, 91], а культивирование эндотелиальных клеток в присутствии сыворотки женщин с ПЭ вызывает повышенную по сравнению с нормой экспрессию ICAM-1 клетками эндотелия [92]. При сокультивировании эндотелия с клетками трофобласта, выделенными из ткани плаценты при нормальной и осложненной ПЭ беременности обнаружено, что экспрессия Еселектина и Р-селектина эндотелием была значимо выше при ПЭ [93]. В проспективном продольном исследовании при анализе прогностической ценности определения растворимых форм ICAM-1 и VCAM-1, измеренных в периферической крови на сроке от 22 до 29 недель гестации, показано, что их совместное определение имеет высокую прогностическую ценность, и способно выявить до 55% женщин, у которых развивается патология беременности [94]. Повышенное содержание растворимых форм ICAM-1 и VCAM-1 в крови при ПЭ значимо коррелирует с реактантами острой фазы 23 воспаления и клиническими проявлениями ПЭ (давление, протеинурия, повышение печеночных ферментов) [95]. Отмечается также, что высокий сывороточный уровень VCAM-1 и E-селектина у матери с ПЭ может быть маркером неблагоприятных перинатальных исходов и эндотелиальной дисфункции у плода, поскольку обнаружены отрицательные корреляционные связи между sVCAM-1 и синтезом эндогенного NO клетками HUVEC новорожденного [96]. Данные молекулы рассматриваются в качестве перспективных маркеров для оценки прогноза развития и степени тяжести ПЭ [91, 97]. Однако эти маркеры отражают проявления СВО и эндотелиальную активацию и не являются специфичными для ПЭ, в частности, их повышение отмечается при задержке внутриутробного развития плода [98] и остром коронарном синдроме [99]. Следует отметить, что в литературе имеются противоречивые данные о проявлении СВО при ПЭ. Так, есть сообщения об отсутствии генерализованного СВО и эндотелиальной активации при ПЭ [100]. Также это касается и различия в результатах отражающих уровень растворимых форм МКА в крови, например, М. Чаваррия в 2008 году сообщила об значимо более низком уровне растворимой формы VCAM-1 в крови при ПЭ [101]. Это, предположительно, связывается с разными методами анализа биологического материала, а также клиническими особенностями анализируемых когорт пациентов [100, 102]. Тем не менее, чрезмерной активации СВО отводится одна из ключевых ролей в патогенезе ПЭ, поскольку именно СВО является триггером системной эндотелиальной дисфункции, которая является началом системных клинических проявлений этой патологии. 1.3 Эндотелий: роль в гомеостазе и при патологии Согласно современным представлениям, сосудистый эндотелий, представляющий собой слой клеток, выстилающих внутреннюю поверхность 24 сосудистой стенки, является метаболически активным нейроэндокринным органом, распределенным во всех тканях организма. Основными функциями эндотелия в организме является контроль сосудистого тонуса, регуляция проницаемости сосудов и образования новых сосудов, транспорта клеток крови и растворимых факторов, поддержания гемостатического баланса, участия в реакциях врожденного и адаптивного иммунитета [10, 103] (рисунок 3). Рисунок 3. Синтетические и регуляторные функции эндотелиальных клеток из [104] Осуществляя поддержание гомеостаза в организме, эндотелий является также объектом, на который активно воздействуют повреждающие факторы, приводящие к развитию патологии эндотелия. Полиорганная дисфункция, возникающая вследствие этого, приводит к тяжелым последствиям для организма. 1.3.1. Эндотелиальный гликокаликс 25 В исследованиях последних лет большое значение в осуществлении эндотелием своих функций отводится эндотелиальному гликокаликсу, представляющему собой слой гликопротеинов, протеогликанов и гликозаминогликанов, связанных с мембранными белками эндотелиальной клетки и осуществляющему васкулопротективных множество функций in vivo. важных регуляторных Компоненты, и формирующие гликокаликс, при физиологических условиях препятствуют адгезии клеток крови на эндотелии, регулируют процессы коагуляции и механотрансдукции [105, 106, 107]. Так, дезорганизация или шеддинг компонентов гликокаликса ведет к увеличению адгезии лейкоцитов к эндотелию [108, 109]. Причем, фрагменты гликанов, образующиеся при повреждении проявляют про-воспалительные влияя свойства, на гликокаликса, статус зрелости дендритных клеток и стимулируя синтез ими провоспалительных цитокинов [110]. Компоненты гликокаликса являются важным фактором в чувствительности клетки к механическим воздействиям и способны регулировать тонус сосудов, влияя на синтез эндогенного NO клетками эндотелия [111]. Показано, что обработка клеток эндотелия гликозидазами ведет к удалению таких компонентов гликокаликса как гиалуроновая кислота, гепаран сульфат и сиаловая кислота, что проявляется в снижении величины физиологического напряжения сдвига на эндотелиоциты и гладкомышечные клетки сосудов и уменьшению как индуцибельной, так и эндотелиальной NO-синтазы [112]. Отмечается также ключевая роль гликокаликса в физиологическом гемостазе, поскольку тромбомодулин, антитромбин III и ингибитор пути тканевого фактора являются белками, ассоциированными с гликокаликсом [113] Гликозаминогликаны гликокаликса могут связывать растворимые молекулы, такие как альбумин, орозомукоид и люмикан [114]. При физиологических условиях, структура гликокаликса стабильна, и его молекулярный состав находится в динамическом балансе между процессами шеддинга отдельных структур под влиянием напряжения сдвига и биосинтеза новых гликанов [115, 116]. 26 По разным данным, в физиологических условиях 50-90% от доли всех гликозаминогликанов гликокаликса имеет гепаран сульфат [117, 118]. При наличии воспалительных стимулов и воздействии их на эндотелий гликокаликс значительно меняется. Это касается как углеводного состава цепей, так и структуры молекул протео- и гликозаминогликанов. Например, под действием TGFβ возрастает количество цепей хондроитин сульфата в клетках эпителия молочной железы мыши [115]. При тяжелой протеинурии отмечается повреждение, а также возможно отсутствие гликокаликса на отдельных участках эндотелия капилляров, вследствие чего появляется возможность адгезии лейкоцитов и трансэндотелиальной миграции, поскольку формируются контакты между молекулами селектинов и углеводными лигандами гепаран сульфата. Эти процессы реализуются, в том числе, и нарушением проницаемости гломерулярного барьера, появлению белка в моче и развитию гломерулярного воспаления [114, 119]. Также при ПЭ отмечаются структурные альтерации гликозаминогликанов плаценты, отсутствующие при физиологической беременности. Предполагается, что ремоделирование способствовать углеводных увеличению цепей жесткости гликозаминогликанов и/или резистентности может мелких периферических артерий, наблюдаемой при преэклампсии [120]. При физиологической беременности исследовалось содержание компонентов гликокаликса (гепаран сульфата, синдекана-1 и гиалуроновой кислоты) в крови. Мониторинг концентрации синдекана-1 показал повышение в 159 раз перед родами по сравнению с I триместом. Концентрация гепаран сульфата оставалась стабильной в течение беременности, а гиалуроновой кислоты – была достоверно выше только по сравнению с небеременными пациентками. У пациенток с HELLP-синдромом перед родоразрешением наблюдалось значимое повышение концентрации всех исследуемых гликозаминогликанов в крови по сравнению со здоровыми беременными [121]. При иммуногистохимическом исследовании срезов плаценты здоровых беременных и пациенток с HELLP-синдромом 27 установлено, что гликокаликс синцитиотрофобласта представлен в основном протеогликаном синдеканом-1, гиалуроновая кислота и гепаран сульфат обнаруживались в незначительных количествах. На фетальном эндотелии ворсинок все исследуемые гликозаминогликаны отсутствовали. Причем не обнаружено различий в составе и толщине слоя гликокаликса между здоровыми и больными пациентками, отличия касаются только состава глизозаминогликанов эндотелиального материнского, гликокаликса. фетального и Предполагается, плацентарного что источником массированного слущивания гликозаминогликанов в кровотоке является материнский эндотелий [122]. Основными повреждающими факторами, воздействующими на гликокаликс in vivo, являются: воспаление, гипергликемия, эндотоксемия, септический шок, окисленные липопротеины низкой плотности, цитокины, натрийуретический пептид, аномальное напряжение сдвига, а также повреждение вследствие ишемии-реперфузии [115]. Слущивание компонентов гликокаликса в ответ на цитокины и хемоаттрактанты наблюдается во всех отделах микроваскулатуры: артериолах [123], капиллярах [123, 124] и венулах [108, 124, 125]. Таким образом, гликокаликс является лабильной структурой, состав которой меняется в зависимости от микроокружения, что определяет функции, выполняемые гликокаликсом при физиологических условиях и при патологии. 1.3.2. Эндотелиальная активация и эндотелиальная дисфункция В исследованиях, посвященных роли эндотелия в различных патологиях, как правило, используются термины “эндотелиальная активация” и “эндотелиальная дисфункция” [126]. Активация является процессом отличным от активности, поскольку покоящийся эндотелий является метаболически активным органом с антикоагулянтным, антиадгезивным и вазодилятаторным фенотипом. В эндотелиальной активации выделяют две стадии: эндотелиальная стимуляция (ранние события) и эндотелиальная активация (поздние 28 события). Последняя, в свою очередь, подразделяется на эндотелиальную активацию 1 и II типа [127, 128]. Эндотелиальная активация 1 типа следует за стадией стимуляции и проявляется в шеддинге с поверхности эндотелиоцитов молекул адгезии и молекул с антитромботическими свойствами, таких как Р-селектин, тромбин, гепарин, антитромбин ІII и тромбомодулин. При этом клетки эндотелия венул и малых вен уменьшаются в объеме, нарушаются межклеточные контакты с развитием геморрагий, отеков и увеличением проницаемости сосудов [128]. Эндотелиальная активация II типа является несколько отложенным во времени процессом, зависящим от активации транскрипции генов и синтеза белка de novo. В результате этого активируются гены, кодирующие молекулы адгезии, хемокины и прокоагулянтные факторы: Е-селектин, фактор фон Виллебранта, IL-8, и фактор активирующий тромбоциты [129]. Также происходит секреция оксида азота и простациклина. Морфологические изменения проявляются в протрузии эндотелиоцитов в просвет сосуда, гипертрофии клеток, увеличении проницаемости. Результатом этой стадии является контакт моноцитов и лимфоцитов с активированным эндотелием посредством лектин-углеводных взаимодействий, экстравазация, трансэндотелиальная миграция, возможно, также их связывание с Fcрецепторами (FcR) эндотелиальных клеток с депозицией иммунных комплексов [128]. подразумевают Таким образом, под изменение фенотипа эндотелиальной эндотелиоцитов под активацией действием активирующих факторов (цитокинов, эндотоксинов и др.) путем экспрессии активационных антигенов на поверхности клетки. Это коррелирует с проявлением про-адгезивных, антигенпрезинтирующих и прокоагулянтных свойств эндотелиальных клеток. Активация отражает способность эндотелиальных клеток выполнять новые функции, однако этот статус не предполагает повреждения клеток или их неконтролируемого деления. Активация эндотелия является обратимым процессом с возможностью возврата в состояние активных покоящихся клеток [128]. 29 Под эндотелиальной дисфункцией понимают стадию, следующую за активацией эндотелия и проявляющуюся в изменении функциональной активности клеток, что ведет к изменению/потере способности эндотелия как органа выполнять свою функцию и дисбалансу факторов, обеспечивающих нормальное функционирование всех эндотелием опосредованных процессов [10, 126, 128]. Эндотелиальная дисфункция является следствием хронической, перманентной эндотелиальной активации и может вести к необратимому поражению эндотелиальных клеток, апоптозу, некрозу. Кроме различного статуса эндотелиальных клеток отмечается также их структурная и функциональная гетерогенность, обусловленная разным типом межклеточных контактов, различной морфологией, особенностями фенотипа, синтеза медиаторов, возможностями презентации антигена и ответа на различные стимулы. Фенотип эндотелиальных клеток различен не только между органами, но и между последовательными образцами при диссекции образцов ткани [103]. Гетерогенность клеток обуславливает разные функции, выполняемые эндотелиоцитами артерий, вен и микроваскулатуры в различных физиологических и патологических процессах в организме [104]. Таким образом, активация эндотелиальных клеток, развивающаяся вследствие СВО, является одним из факторов, способствующих сдвигу гомеостаза и развитию патологии. Изменение фенотипа, сопровождающее активацию эндотелиоцитов, проявляется также в изменении углеводного состава молекул, формирующих гликокаликс эндотелия. На сегодняшний день существуют лишь общие представления о гликанах, формирующих гликокаликс клетки. Это связано с трудностями визуализации и изучения гликокаликса, а также с разнообразием гликанов, составляющих гликом клетки. Еще меньше известно о гуморальных факторах, регулирующих углевод-белковое взаимодействие в иммунной системе, и на клетках фетоплацентарной системы, в частности. Следует также учитывать, что воспалительный ответ неспецифичен и является процессом, который при 30 дисбалансе компенсаторных реакций и генерализации способен быть триггером развития адаптивного ответа. 1.4. Гуморальный аутоиммунный ответ против эндотелия Гуморальный аутоиммунный ответ, направленный против эндотелия, может развиваться вследствие внутренней перестройки репертуара антител или являться результатом иммунного ответа на экспонированные нео- или аллоантигены, поскольку аллоиммунизация провоцирует синтез аутоантител [130]. При этом мишенями аутоантител могут быть структурные антигены клетки или антигенные комплексы. 1.4.1. Антифосфолипидные антитела (АФА) Антитела к фосфолипидам клеточных мембран (АФА) – аутоантитела, направленные против анионных фосфолипидов или фосфолипидно-белковых комплексов, являющиеся серологическими маркерами антифосфолипидного синдрома (АФС) [23, 131] – мультифакторного симптомокомплекса, характеризующегося развитием тромбозов артерий и вен или тромбозов мелких сосудов различной локализации, в том числе и в сосудах фетоплацентарной системы [33, 132]. Клиническими критериями проявления АФС при патологии беременности являются: привычное невынашивание, преждевременные роды, ПЭ, фетоплацентарная недостаточность [133, 134, 135, 136]. Кроме этого, поражения при АФС синдроме могут происходить в сосудах любого органа [24]. Основными мишенями для АФА являются кардиолипин, β2-гликопротеин1 (β2GP-1) и фосфатидилсерин [137, 138]. Показано также их взаимодействие с различными (аннексином V, фосфолипид-связывающими протеином С, белками протеином S, и фосфолипидами протромбином, а также фосфатидил-холином, -этаноламином, -глицеролом, -инозитолом). Наиболее изученной мишенью для АФА является β2GP-1 – положительно заряженная молекула, способная связываться с отрицательно заряженными структурами, такими как анионные фосфолипиды, гепарин или молекулы ДНК. В циркуляции β2GP-1 обнаруживается в высокой концентрации (200μg/dl) и 31 характеризуется высоким тропизмом к эндотелиальным клеткам [139]. Гепаран сульфат - основной протеогликан эндотелия образует большинство анионных сайтов мембраны. Установлено, что при обработке клеток HUVEC гепариназой-1, способной специфически расщеплять связь между остатками αD-глюкозамина и О-сульфатированной L-индуроновой кислоты, связывание АФА с β2GP-1 значительно сокращается [140]. Кардиолипин, аннексин II, аполипопротеин Е рецептор 2 (ApoER2) также являются сайтами связывания β2GP-1 с эндотелием [139, 140]. Считается, что одним из диагностических критериев АФС является наличие АФА к комплексу β2GP-1 с кардиолипином [88]. Еще одной мишенью АФА является моноацилглицерофосфат – компонент внутренней мембраны поздней эндосомы клеток эндотелия. Показано что при инкубации АФА с эндотелиальными клетками происходит интернализация и аккумуляция АФА в поздней эндосоме эндотелиоцитов [141]. Как известно в кровотоке молекула β2GP-1 находится в замкнутой (циркулярной) конформации. При взаимодействии с мишенями на мембране, происходят конформационные изменения молекулы, разворачивание замкнутой молекулы в промежуточную S-образную форму (S-shape) и открытую конформацию рыболовного крючка (fish-hook) с экспозицией скрытых эпитопов. В открытой конформации fish-hook экспонируются скрытые эпитопы главного домена (D1) β2GP-1, которые являются основной мишенью АФА. При изучении взаимосвязи между уровнем АФА и клиническими проявлениями болезни (тромбозом и перинатальными осложнениями) было показано, что высокий уровень антител против главного домена β2GP-1 (анти- β2GP-1 - D1 антитела) имеет более высокий коэффициент корреляции, чем антитела против всех доменов β2GP-1. При выделении моноклональных антител из крови пациентов обнаружено, что антитела узнают разные эпитопы главного домена (D1) β2GP-1 [142]. Таким образом, адгезия β2GP-1 на мембране эндотелиальных клеток создает конформационные эпитопы для связывания АФА [143], инициируя активацию эндотелиоцитов через запуск внутриклеточного сигнального пути с 32 перемещением транскрипционного фактора NFkB из цитоплазмы в ядро. При этом активируются гены, кодирующие синтез молекул адгезии, провоспалительные цитокины, тканевой фактор [139, 140]. Этот процесс является также триггером экспрессии толл-подобных рецепторов [130]. В контексте этого Ж-И Алардом и соавт. было показано, что толл-подобный рецептор-2 (TLR2) является одним из рецепторов для β2GP-1 на эндотелии [144]. Механизм патогенетического действия и клиническая значимость АФА в настоящее время изучаются [138, 145]. Описаны случаи серонегативного АФС [146, 147] с отсутствием общепринятых маркеров, при котором выявляются антитела на комплекс виментин/кардиолипин [148], который, как предполагается, может выступать в качестве еще одной антигенной мишени при АФС. Патофизиологические механизмы осложнений беременности включают не только тромбоз и ишемию, а также воспаление и нарушение функций клеток, их жизнеспособности [138]. Экспериментально установлено, что АФА (антиβ2GP-1) антитела связываются с мембранами клеток цитотрофобласта, уменьшая их инвазивную способность и формируя иммунные комплексы, активирующие свертывающую систему крови [145]. Обнаружено, что связывание АФА с β2GP-1 и фосфатидилсерином снижает синтез и секрецию хорионического гонадотропина трофобластными клетками, что негативно влияет на инвазивный потенциал клеток и плацентацию [149, 150]. Показано увеличение экспрессии тканевого фактора и молекул адгезии клетками эндотелия в присутствии анти-β2GP-1 антител, выделенных из крови больных с АФС, что свидетельствует о прокоагуляционном статусе, устанавливающемся под действием этих антител. Клиническими проявлениями АФС являются тромбозы и наблюдаемые инфаркты при плаценты, потерях васкулопатии беременности, спиральных преждевременных артерий, родах, плацентарной недостаточности и гестационной гипертензии [24]. Наличие АФА у пациенток с преэклампсией и HELLP-синдромом приводит к более 33 ранней манифестации клинических симптомов по сравнению с серонегативными по АФА пациентками [151]. Описан механизм отторжения плода с участием АФА, основанный на активации АФА-индуцированного коагуляционного каскада с экспрессией нейтрофилами тканевого фактора [152], кислородного взрыва с повреждением децидуальной ткани и гибелью плода [153]. Установлено, что при наличии первичного АФС, увеличивается риск развития преэклампсии, преждевременных родов и инфекций мочеполовой системы [154]. Исследование спектра АФА у пациенток, перенесших ПЭ тяжелой степени с развитием кардиомиопатии после родов, до, и после трансплантации сердца показало, что у некоторых пациенток выявляются АФА новых специфичностей после трансплантации и факт наличия АФА связывается с развитием осложнений [155]. Объяснением этому может служить генерация аутоантител на неоантигены апоптотических клеток [156]. Кроме этого было показано, что АФА, выделенные из крови пациентов с АФС, способны в эксперименте связываться с клетками эндотелия, вызывая их апоптоз и протромботические изменения мембраны, нарушая при этом механизм удаления апоптотических клеток профессиональными фагоцитами [21]. В то же время было показано, что АФА не связываются с “покоящимися” эндотелиальными клетками. Для осуществления взаимодействия необходима активация эндотелиоцитов. продемонстрировано, что В исследовании некротизированные Чен К. и частицы соавт. было трофобласта активируют эндотелиальные клетки. Этот эффект был доказан in vitro по возрастанию экспрессии ICAM-1, Е-селектина и адгезии моноцитов к эндотелиальному слою. Добавление АФА к культуре необработанных эндотелиальных клеток не вызывало их активации, но внесение АФА после удаления некротизированного дебриса пролонгировало активацию эндотелия. Авторами был сделан вывод о синергическом воздействии АФА и фетального дебриса на эндотелий при патологии беременности, а также были высказаны 34 предположения о причинах высокой частоты акушерских и перинатальных осложнений у женщин с АФА [157]. Тем не менее, данные о патогенетической роли, механизмах действия, выявляемости АФА при беременности противоречивы. Авторами описываются как случаи высокой частоты выявления АФА при ПЭ, так и низкой [158]. Следовательно, изучение выявляемости АФА при патологии беременности, и ПЭ, в частности, является актуальным и на сегодняшний день. 1.4.2. Антиэндотелиальные антитела (АЭАТ) У пациентов с АФС часто выявляются также антитела к эндотелиальным клеткам - антиэндотелиальные циркулирующих антител, антитела выявляемая (АЭАТ) - гетерогенная при васкулитах, группа различных аутоиммунных и воспалительных заболеваниях [159, 160]. Как известно, причинами васкулопатии может быть как воспаление, так и тромбоз [161]. Эти же факторы лежат в основе патогенеза ПЭ. Как предполагается, АЭАТ, подобно АФА взаимодействуют с антигенными мишенями на эндотелиоцитах, причем взаимодействие возможно тремя способами: непосредственно с антигеном – классическим способом, с лиганд-рецепторным комплексом, и антигеном, мобилизованным на поверхность клетки из кровотока [4]. АЭАТ неспецифичны для эндотелия. Установлено, что АЭАТ связываются также с фибробластами, тромбоцитами и мононуклеарными клетками. Антигены – мишени для АЭАТ на эндотелиоцитах до конца охарактеризованы, однако показано взаимодействие АЭАТ с не β2GP-1, фибронектином, виментином, ICAM-1 [162], молекулами ДНК, гистонами, комплексами ДНК-гистон и тромбоцитарным фактором- 4 [130, 161, 163], пероксиредоксинами [164]. Установлено также, что протеогликаны и гликозаминогликаны ВКМ связываются с АЭАТ. Антитела к гепарину являются составной частью пула АЭАТ и детектируются у человека и мыши. Экспериментально показано наличие двух популяций АЭАТ: для одной популяции наблюдалось дозозависимое ингибирование гепарином связывания АЭАТ с эндотелиальными клетками линии EA.hy 926 [161]; связывание антител 35 второй популяции не ингибировалось при добавлении гепарина [165]. Предполагается, что одним из возможных механизмов действия АЭАТ является ингибирование образования комплекса тромбин-антитромбин III, что приводит к увеличению прокоагулянтного статуса в организме [4]. В литературе описаны АЭАТ трех классов: IgM, IgG и IgA [161]. Предполагается, что большой пул АЭАТ IgM класса относится к низкоаффинным полиреактивным естественным антителам и оказывает протективный эффект на клетки эндотелия, а АЭАТ IgG класса – имеют значение в патогенезе различных заболеваний [166]. Установлено, что у пациентов с трансплантацией печени, имеющих высокий риск отторжения преобладающими в общем пуле IgG являются IgG2 и IgG4 подклассы АЭАТ [167]. Однако есть сообщения об естественных антиэндотелиальных антителах (ЕАЭАТ) относящихся к IgG классу [5]. ЕАЭАТ обнаруживаются у здоровых индивидуумов. Предполагается, что АЭАТ могут выступать в качестве факторов, ингибирующих пролиферацию эндотелиальных клеток у здоровых людей [168]. С помощью протеомного анализа, при изучении антигенных мишеней АЭАТ у здоровых людей были идентифицированы высококонсервативные белки, имеющие ключевое значение в гомеостазе: белки цитоскелета (β-актин, α-тубулин, виментин), гликолитические ферменты (αенолаза, глюкоза-3-фосфат-дегидрогеназа), член семейства дисульфид-изомераз (β-субъединица пролил-4-гидроксилазы). АЭАТ к этим структурам были обнаружены у всех исследуемых пациентов. Предполагается, что у человека существует консервативный репертуар ЕАЭАТ, представленный спектром антител к ограниченному числу молекул. Эти ЕАЭАТ выполняют регуляторную функцию, контролируют активацию эндотелиальных клеток и оказывают противовоспалительный и противотромботический эффект [6]. Кроме этого, у некоторых пациентов данной выборки (n=12) был идентифицирован ряд белков, относящихся к разным семействам биологически активных молекул – белкам аденозинтрифосфатсинтазам, теплового o-GlcNAc шока, трансферазам пируваткиназам, [5]. Эти данные 36 свидетельствуют об индивидуальных различиях репертуара ЕАЭАТ у человека и подтверждают гетерогенность пула АЭАТ. Под гетерогенностью АЭАТ подразумевают не только связывание с разными антигенными мишенями, но и функциональную гетерогенность. При исследовании АЭАТ-позитивных образцов от пациентов с аутоиммунными васкулитами были выявлены четыре функциональные профиля АЭАТ: первый характеризовался как активацией, так и апоптозом эндотелиальных клеток; второй - только активацией; третий - только апоптозом; четвертый – отсутствием апоптоза и изменения фенотипа, несмотря на связывание АЭАТ с клетками [169]. На сегодняшний день существует множество предположений о возможных механизмах патогенетического действия АЭАТ на клетки. На in vivo моделях было показано, что при введении мышам линии BALB/с очищенной фракции АЭАТ от пациентов с гранулематозом и полиангиитом, наблюдается эндогенная продукция АЭАТ и признаки воспалительной инфильтрации тканей легких и почек и прилежащих артериол и венул [162]. В экспериментальных моделях in vitro показано, что АЭАТ(IgG)-поликлональная фракция, выделенная от пациентов с различными типами васкулитов, при инкубации с комплементом, или в присутствии человеческих мононуклеарных клеток периферической крови, вызывает лизис эндотелиальных клеток по механизму антителозависимой активность клеточной усиливается цитотоксичности. при предварительной Причем литическая активации клеток эндотелиального монослоя цитокинами [130]. Однако цитотоксический эффект АЭАТ детектируется не во всех АЭАТ - положительных образцах, а также при иммуногистологическом анализе эндотелиальных клеток показано, что при большинстве васкулитов не наблюдается депозиции комплемента и иммуноглобулинов в стенке сосудов, что позволяет предполагать, что патогенетический эффект АЭАТ реализуется через другие иммунные механизмы [130]. Так, существуют экспериментальные доказательства, что АЭАТ могут вызывать гибель эндотелиальных клеток по механизму апоптоза 37 через Fas/Fas-лиганд путь: при воздействии инактивированной сыворотки на эндотелий отмечается возрастание экспрессии CD95(Fas), апоптоз эндотелиоцитов ингибируется антителами против Fas-лиганда [130]. Апоптоз инициируется как при непосредственном воздействии АЕСА, так и совместно с ЕК – антителозависимая клеточно - опосредованная цитотоксичность через Fasпуть. Клетки, вступившие в цикл апоптоза, влияют на формирование прокоагулянтного эндотелиального фенотипа, экспонируя таргетные для АЭАТ антигены. Этот механизм описан в основном при системном склерозе, а также при АФС-синдроме, который является одним из возможных этиологических факторов отторжения плода при невынашивании беременности [170]. Показано, что связывание АЭАТ с белком теплового шока Hsp60 на поверхности эндотелиальных клеток, вызывает экспозицию фосфатидилсерина на мембрану эндотелиоцитов и индукцию апоптоза [171]. Было установлено, что АЭАТ препятствуют клиренсу апоптотических клеток, повышая протромботический статус у пациентов имеющих также АФА [21]. Активация механизмов коагуляции при воздействии АЭАТ происходит и при экспрессии тканевого фактора, индуцируемой этими антителами [31, 162]. К настоящему времени накоплено достаточно много доказательств в пользу идеи, что взаимодействие аутоантител с рецепторами клеточной поверхности осуществляется в рамках модели лиганд-рецепторной системы, инициирующей клеточный сигналинг и фенотипические и функциональные изменения эндотелиальных клеток, которые ведут к эндотелиальной дисфункции и экспрессии прокоагулянтных и тканевых факторов [161]. Было показано, что АЭАТ-позитивная фракция (IgG) от больных СКВ и гранулематозом Венегера вызывает в эксперименте изменения эндотелиальных клеток, проявляющиеся в увеличении: экспрессии МКА, адгезии лейкоцитов, синтеза и секреции провоспалительных цитокинов [130, 172, 173]. В исследовании О.Флорея и соавт. было продемонстрировано, что при моделировании условий физиологического кровотока в камере, добавление АЭАТ (IgG) выделенных от больных СКВ, значимо увеличивало адгезию 38 полиморфонуклеарных лейкоцитов (ПМЛ) к эндотелию, предварительно активированному цитокинами. При этом установлено, что связывание АЭАТ(IgG) с эндотелием зависит от экспрессии Е-селектина, рецепторов хемокинов CXCR1/2 и β2-интегринов. Установлено также, что взаимодействие ПМЛ с эндотелиальными клетками, на поверхности которых присутствует иммунный комплекс антигена c АЭАТ, осуществляется через FcγRIIa рецептор и требует костимуляции через CXCR1 и/или CXCR2 [174]. Этот механизм отличен от FcγRIIIb-опосредованной адгезии и может быть основным в АЭАТ зависимом повреждении эндотелия при васкулитах. Необходимо отметить, что данные об исследованиях АЭАТ при беременности весьма ограничены. При беременности отмечается повышение уровней ЕАЭАТ (IgM и IgG) в циркуляции при физиологической беременности по сравнению со здоровыми небеременными женщинами. Однако, уровень ЕАЭАТ IgM при беременности, осложненной СКВ, был значимо ниже по сравнению со здоровыми беременными пациентками, но не отличался от здоровых небеременных женщин. Предполагается, что ЕАЭАТ IgM могут оказывать протективный эффект на плацентарные сосуды, поскольку самый низкий уровень антител был обнаружен при беременности, осложненной СКВ в ассоциации с ПЭ [175]. С этим согласуются данные о регуляции ЕАЭАТ секреции клетками эндотелия тромбоксана и эндотелина1, а также ингибирование секреции металлопротеиназы-9 при активации в ответ на TNF-α [176]. Причем, возрастание уровня ЕАЭАТ связывают с беременностью, поскольку не обнаружено различий в уровне ЕАЭАТ между мужчинами и женщинами вне беременности. Предполагается, что мишенями ЕАЭАТ при беременности могут быть молекулы HLA І класса, экспрессированные на клетках инвазивного трофобласта [175]. Также было показано, что фракция IgM, выделенная из сыворотки многорожавших женщин, ингибирует реактивность аутологичных IgG, направленных против молекул HLA І класса, показывает через возможность идиотипические регуляции взаимодействия, экспрессии что репертуара 39 иммуноглобулинов класса G аутологичными иммуноглобулинами M [170, 175, 177]. В исследовании Yamamoto T.,1998 показано, что при акушерских патологиях АЭАТ обнаруживаются чаще в случае ПЭ тяжелой степени (29,7%), по сравнению с умеренной (20%). Установлена взаимосвязь уровня АЭАТ с тяжелой протеинурией (более чем 200 мг/мл), причем уровень АЭАТ в меньшей степени зависит от гипертензии и от задержки внутриутробного развития плода. Показан цитотоксический эффект на культивируемые эндотелиальные клетки сыворотки, содержащей АЭАТ, пациенток с ПЭ [178]. При инкубации АЭАТ-позитивной фракции (IgG), выделенной у больных ПЭ, с культивируемыми эндотелиальными клетками вены пупочного канатика человека (HUVEC) происходит значимое увеличение синтеза эндотелина-1, по сравнению со здоровыми беременными пациентками [179]. Анализ сывороток пациенток после самопроизвольного аборта показал, что 24% пациенток были серопозитивны по АЭАТ, а также инкубация эндотелиальных клеток пупочного канатика с этими сыворотками ведет к изменению фенотипа эндотелиоцитов на прокаогулянтный, что предполагает участие АЭАТ в активации системы гемостаза и фибринолиза [180]. Повышенный уровень АЭАТ детектируется у пациентов с маскированной гипертензией [181]. Таким образом, понятие “АЭАТ” объединяет большую гетерогенную группу антител, связывающихся с эндотелиальными клетками посредством различных антигенных мишеней, и, в зависимости от различных факторов, оказывающих регуляторное, протективное или цитотоксическое действие на клетки. Однако АЭАТ остаются малоизученными при беременности. Остается также неясным вопрос об их значении в патогенезе акушерских и перинатальных осложнений и возможности использования в диагностике. Отчасти эти вопросы порождаются методическими трудностями в определении АЭАТ, поскольку на сегодняшний день нет диагностического теста для количественного определения этих антител в лабораторной диагностике. 1.4.3. Антитела к гликанам (антигликановые антитела) 40 Антигликановые антитела – значительная часть естественных и адаптивных иммуноглобулинов крови, специфически связывающиеся с углеводными антигенами-гликанами (причем их эпитопная специфичность может ограничиваться как короткими мономерными молекулами сахаров, так и разветвленными углеводными цепями). Они играют важную роль в иммунных процессах (иммунном и воспалительном ответе, аутоиммунитете, противоопухолевом, трансплантационном иммунитете и др.). Наиболее исследованными антигликановыми антителами являются изоагглютинины к Аи В-группоспецифическим антигенам [182], к ксеноантигену Galα1-3Galβ14GlcNAc [183, 184], опухолеассоциированным антигенам, например антигену Томсена-Фриденрейха (Galβ1-3GalNAcα), группоспецифическому антигену Tn (GalNAcα) [185, 186, 187]. В настоящее время интенсивно изучаются естественные антигликановые антитела, присутствующие в общем пуле иммуноглобулинов крови здоровых людей [188, 189]. Установлено, что большую группу ЕАГАТ составляют так называемые “консервативные” антитела, причем их количество и эпитопная специфичность одинакова у всех людей. Значительная часть этих антител направлена к малодоступной коровой части (внутренней углеводной цепи, к которой присоединяются дополнительные углеводные цепи, формирующие разветвленную молекулу гликана) молекулы, связанной с белком или липидом мембраны [30]. К консервативным ЕАГАТ относят и антитела к антигенам бактерий и паразитов. Отдельную группу ЕАГАТ формируют антитела к антигенам групп крови углеводной природы (антигены систем АВН, Lewis, Pp, Ii, Forssman) – естественные антигликановые аллоантитела – присутствующие в крови при условии отсутствия соответствующего антигена на мембране эритроцита [30]. Эта группа обуславливает гетерогенность профилей антител, полученных от разных людей, даже имеющих одну группу крови [190]. Следует отдельно рассматривать особую группу ЕАГАТ, включающую антитела из двух вышеописанных групп, уровень которых изменяется при возникновении особых условий, влияющих на иммунологическую реактивность организма 41 (беременность, различные патологии). Эти антитела следует относить к так называемым “пластичным” антителам, имеющим потенциальную прогностическую и диагностическую ценность [30]. Идентифицированы также АГАТ, отсутствующие, как правило, у здоровых людей, их появление в циркуляции связывается с развитием патологии [189, 190]. Такие, условно “патологические антитела” связываются, как правило, с широко распространенными в тканях структурами ганглиозидов [191], а также структурами гликанов с кором типа 2, представленными на эндотелиальных клетках [30]. К настоящему времени показано, что антигликановые антитела имеют потенциальное клиническое и диагностическое значение при воспалительных заболеваниях кишечника [192] – болезни Крона [193], язвенном колите [194]; муковисцидозе [195]. Активно исследуются антигликановые антитела при различных нейродегенеративных заболеваниях: аутоантитела против ганглиозидов и сульфатированных гликосфинголипидов обнаружены при рассеянном склерозе, болезни двигательного нейрона, синдроме ГийенаБарре [196,197]. В контексте вышесказанного было установлено, что высокий сывороточный уровень антител против Glcα1-4-Glcα (IgM) свидетельствует о скором рецидиве рассеянного склероза, и может быть использован в дифференциальной диагностике рецидивирующего рассеянного склероза с другими неврологическими заболеваниями [198]. При заболеваниях, связанных с неполным или аберрантным гликозилированием белков (рак и аутоиммунные заболевания) обнаружен повышенный уровень антигликановых антител [199], который в случае опухолей молочной железы говорит о хорошем прогнозе, а в случае IgA-нефропатии – об участии в патогенезе заболевания [200]. Антигликановые антитела являются также перспективными маркерами коллоидного рака яичников [201]. В репродукции антигликановые антитела практически не исследованы. Есть сообщения об ингибировании взаимодействия бластоцисты с эндометрием у мышей моноклональными антителами против гликана Lewis Y (Ley) (Fucα1- 42 2Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc) [202]. Было также показано, что антитела к ламинину, обнаруженные в циркуляции у 27% пациенток с ПЭ, способны связываться с гломерулярной базальной мембраной и базальной мембраной клеток трофобласта и фиксировать комплемент. Предполагается, что эти антитела влияют на межклеточные контакты, способствуя слущиванию клеток трофобласта, и появлению их в циркуляции матери [203]. В контексте этого предполагается ключевое значение гликановых цепей ламинина (особенно Galα- и GalNAcα- терминированных взаимодействиях [204]. Как гликанов) известно, эпитоп в межклеточных Galα1-3Galβ-4GlcNAc- отсутствует на клетках человека, однако обнаруживается на опухолевых клетках. В циркуляции здоровых людей, напротив, присутствуют естественные антитела к этому эпитопу, составляющие около 1% от всех циркулирующих антител IgG класса [205]. Предполагается, что антитела могут ингибировать адгезию опухолевых клеток к ламинину и выполнять протективную функцию [204]. Эпитоп Galα1-3Gal- обнаруживается и на клетках эндоваскулярного трофобласта иммуногистохимической техникой при физиологической беременности, при этом отмечается повышенная плотность гликана на клетках высокоинвазивного трофобласта при хориокарциноме и молярной беременности, и, напротив, сниженная плотность на низкоинвазивных клетках от пациенток с самопроизвольным выкидышем и ХО-моносомией. При ПЭ было показано, что в некоторых сегментах спиральных артерий эпитоп Galα13Gal- полностью отсутствовал. Высокий титр анти Galα1-3Gal- антител наблюдается в первом триместре физиологической беременности и в циркуляции пациенток с преэклампсией и эклампсией. Предполагается, что антигликановые антитела со специфичностью к эпитопу Galα1-3Gal- способны ограничивать инвазию клеток трофобласта в спиральные артерии [206]. У пациентов с АФС в дополнении к АФА детектируется значимо повышенный по сравнению со здоровыми пациентами уровень антител к GlcNAcβ-, GalNAcα-, GalNAcβ- и β4GlcNAc-β- гликанам [207]. При 43 дальнейших исследованиях показано, что повышенный уровень антигликановых антител против GalNAcβ-(IgG), обнаруженый у пациентов с АФС, ассоциирован с привычным выкидышем. В экспериментальных моделях in vivo введение очищенных анти- GalNAcβ- антител беременным мышам, вызывало самопроизвольный выкидыш. Установлено, что анти- GalNAcβантитела ограничивают инвазию клеток линии хориокарциномы человека в матригеле и снижают секрецию матриксных металлопротеиназ (MMP-2 и MMP-9) клетками [208]. Следует отметить, что благодаря структурному и пространственному (конформационному) разнообразию гликанов, изучение углеводной специфичности АГАТ является не простой задачей. При интерпретации результатов для адекватной оценки встречаемости необходимо учитывать метод, с помощью которого получены результаты, а также вероятность присутствия конкурирующих антител [30]. 1.5. Методы обнаружения антител 1.5.1. Методы обнаружения АФА Для исследования АФА в крови используется в основном иммуноферментный анализ (ИФА) на коммерческих диагностических наборах. Спектр исследуемых антител включает: обязательные исследования – в соответствии с клиническими рекомендациями, принятыми в Саппоро и уточненными в Сиднее (антитела к кардиолипину, β2GP-1); дополнительные наиболее часто детектируемые (антитела к протромбину, фосфатидилсерину, аннексину V); более редко используемые (антитела к протеину С, протеину S, аннексину II, и др.) [88, 209, 210]. Для исследовательских целей часто используют так называемые “домашние” (in house) тест-системы, преимущество которых заключается в возможности использования новых фосфолипидных мишеней или фосфолипид-белковых комплексов, что расширяет возможности диагностики, особенно в случаях серонегативного по общепринятым маркерам синдрома [211,212]. Однако в настоящее время имеется множество противоречивых сообщений о патогенетической и 44 диагностической значимости АФА, связанные как с методическими различиями при детекции АФА, отсутствием международной единицы измерения, отсутствием четких представлений о спектре антигенов, связанных с патогенезом заболевания, так и с особенностями выборки пациентов, включенных в исследование. Существующие на сегодняшний день методы не позволяют предсказывать риск рецидивов заболевания [143, 213]. С целью совершенствования диагностики, основанной на определении АФА, в последнее время апробируются новые диагностические наборы и методы, основанные на хемилюминесцентном иммунном анализе, иммунофлюоресцентном анализе и мультиплексном анализе [214]. Кроме этого, остро ощущается необходимость в расширении и уточнении панели лигандов для диагностики АФС, поскольку случаи серонегативного АФС встречаются часто. 1.5.2. Методы обнаружения АЭАТ Лабораторные тесты, используемые для детекции АЭАТ, основаны на определении антител в образцах сыворотки или плазмы крови к поверхностным антигенам эндотелиальных клеток. В качестве источника эндотелиальных клеток используют первичные культуры клеток эндотелия пупочного канатика человека (HUVEC) или иммортализованные клеточные линии. Однако оба источника имеют как свои преимущества, так и недостатки. При использовании HUVEC в исследование включается пул клеток, который по фенотипическим и функциональным характеристикам максимально приближен к условиям in vivo. Однако первичные культуры имеют ограниченный срок жизни, характеризуются гетерогенностью, поскольку выделены от различных доноров, фенотип клеток зависит от числа пассажей и состояния культуры [162]. Кроме этого, эндотелиоциты, выделенные из микро – и макрососудов, по разному связываются с АЭАТ [4, 215]. Это позволяет предполагать что АЭАТ, выделенные от пациентов с различными заболеваниями узнают разные антигенные мишени на эндотелиальных клетках, что коррелирует с природой болезни [159, 215]. Перевиваемые клеточные линии, напротив, гомогенны по 45 фенотипическим маркерам, генетически стабильны, воспроизводят морфологические, функциональные, биохимические характеристики эндотелия сосудов, из которого они были получены. Наиболее изученной и охарактеризованной перевиваемой линией является EA.hy 926, полученная слиянием клеток HUVEC и клеток линии А549 – карциномы легкого человека [216]. Линия EA.hy 926 воспроизводит основные характеристики эндотелия макрососудов человека, однако, при протеомном профилировании клеток HUVEC и клеток EA.hy 926, было показано, что в обоих типах клеток есть как уникальные, так и гомологичные белки. Также было обнаружено, что на клетках EA.hy 926 снижена экспрессия рецепторов интегринового суперсемейства, а молекулы ICAM-1, VCAM-1 и E-селектин экспрессированы в том же количестве, что и на клетках HUVEC [217]. Тем не менее, в настоящее время для детекции АЭАТ используются оба типа клеток. Основными методами детекции АЭАТ являются: непрямая иммунофлуоресценция [218, 219], иммуноферментный анализ (ELISA) [220, 221], иммунопреципитация и вестерн-блот [222, 223, 224], радиоиммуноанализ, цитотоксический анализ с использованием эндотелиальных клеток-мишеней, меченных Cr51 [5]. Наиболее широко применяется “клеточная ELISA” основанная на детекции АЭАТ, связывающихся с фиксированными клетками HUVEC или EA.hy 926 [220, 221]. Также описана модификация “клеточной ELISA”, основанной на определении АЭАТ, связывающихся с антигенами клеточного лизата (стандартизованного антигенного препарата, полученного после лизиса эндотелиальных клеток), применяемого с целью минимизации перекрестных реакций с ревматоидным фактором и антинуклеарными антителами [221]. В литературе описаны также методические подходы, используемые с целью снижения перекрестных реакций между АЭАТ и гетерофильными антителами, присутствующими в крови человека [225]. В некоторых лабораториях используется метод определения АЭАТ с помощью проточной цитометрии. Проточная цитометрия применяется как для выявления АЭАТ, так и для идентификации антигенных мишеней АЭАТ на 46 эндотелиоцитах [162]. Так, проточная цитометрия использовалась для детекции АЭАТ у пациентов с гранулематозом Вегенера [226], привычным невынашиванием беременности [180], при болезнях соединительной ткани [227]. В качестве объекта в этих исследованиях использовались клетки HUVEC и клетки микрососудов почки. В связи с тем, что в настоящее время отсутствует стандартный количественный метод детекции АЭАТ, результаты, полученные в разных лабораториях с использованием разных техник детекции АЭАТ часто противоречивы, с целью повышения достоверности, рекомендуется использовать два метода детекции АЭАТ [5]. Относительно недавно был предложен коммерческий набор для качественного или полуколичественного определения человеческих антител к эндотелиальным клеткам фирмы Euroimmun. Детекция АЭАТ с помощью этого набора проводилась у пациентов с заболеваниями периферических артерий [160] и системным склерозом [218], а также при изучении динамики АЭАТ у женщин в разные периоды онтогенеза [228]. Однако он не обеспечивает объективную количественную оценку наличия АЭАТ в образце крови пациента. 1.5.3. Методы обнаружения АГАТ В настоящее время основным методом исследования АГАТ в крови является ELISA [229, 230]. Однако, в связи с рядом ограничений этого метода, главными из которых является невозможность одновременной детекции антител на множество мишеней и достаточно высокий уровень неспецифического связывания с исследуемым объектом, существует проблема поиска новых методов для исследования АГАТ. В качестве одного из многообещающих подходов для характеристики углевод-белкового взаимодействия рассматривается высокочувствительный микрочиповый метод [231]. Микрочиповый метод позволяет получать быстрые, воспроизводимые результаты с одновременной детекцией до нескольких сотен антител против различных гликанов (природных и синтетических), нанесенных на матрицу [230, 231]. Этот метод позволяет характеризовать специфичность и получать 47 индивидуальный профиль белков (антител, лектинов млекопитающих: лектинов С-типа, сиглеков, галектинов; растительных лектинов; лектинов вирусов и бактерий, интактных вирусов), используя минимальное количество биологического материала [231, 232], что делает его привлекательным инструментом персонифицированного подхода в медицине. 1.6.Заключение по обзору литературы Таким образом, необходимо отметить, что в существующих на сегодняшний день исследованиях, посвященных гуморальным факторам иммунитета при беременности, основное значение отводится системе цитокинов, как основной системе факторов регулирующих воспалительный и иммунный ответ. Существуют противоречивые факты о МКА – как факторах, отражающих активацию эндотелия при беременности. Изучение аутоиммунитета при беременности ограничивается исследованием спектра АФА, сведения о которых также противоречивы. АЭАТ малоизучены, а АГАТ не изучены при беременности и ПЭ, в частности. Руководствуясь доказанным фактом гиперактивации иммунной системы при ПЭ, мы предполагаем, что гиперактивация затрагивает и аутоиммунный ответ, в частности против эндотелиальных клеток, а также против гликанов, к которым существуют как естественные, так и патологические антитела, изменение уровня которых является свидетельством развития патологии. Поэтому комплексное изучение гуморальных факторов иммунитета при ПЭ может не только способствовать получению новых знаний о патогенезе заболевания, но и иметь ключевое значение для совершенствования диагностики и прогноза болезни. 48 Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Организация работы и объем исследования Работа выполнена на базе лаборатории клинической иммунологии (руководитель лаборатории – к.м.н. Кречетова Л.В.) ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И.Кулакова» Миндзрава России, директор академик РАН, д.м.н., профессор Сухих Г.Т. Исследования проводились также в лаборатории углеводов (руководитель лаборатории д.х.н., биоорганической профессор химии имени Бовин Н.В.) академиков ФГБУН «Институт М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова» Российской академии наук, директор академик РАН, д.х.н., профессор Иванов В.Т. В соответствии с поставленными задачами (задачи 2-3) в исследование были включены 135 проспективно обследованных пациенток в различные сроки гестационного периода. В основную группу включались пациентки с диагнозом: вызванные беременностью гипертензия с протеинурией. Диагноз ПЭ и оценка степени тяжести производились в соответствии с МКБ-10. По МКБ-10 ПЭ – это полисистемный синдром у беременных, который обычно проявляется повышением АД и протеинурией[233]. Пациентки наблюдались с ранних сроков беременности до родов. Кровь для анализа растворимых форм МКА забирали несколько раз в течение беременности в интервалах 813, 14-20, 21-26, 27-31, 32-36, 37-41 неделя. Количество обследованных пациенток в указанных интервалах представлено на рисунке 4 А, Б. Группу сравнения составили 74 беременные с физиологическим течением беременности и родов. В основную группу включены 61 пациентка с 8 по 41 неделю беременности с осложненной беременностью. Из них 9 беременных І триместра со сроком беременности 8-13 недель с клиническими проявлениями токсикоза І триместра и угрозой прерывания. У двух произошел выкидыш на сроке 13-14 недель, у трех в дальнейшем развилась преэклампсия тяжелой степени. У остальных беременных основной группы II и III триместров в различные гестационные сроки также 49 был поставлен диагноз преэклампсии умеренной и тяжелой степени. По возрасту, числу беременностей и родов в анамнезе пациентки основной группы и группы сравнения были сопоставимы. Рисунок 4. Дизайн исследования к задачам 3-4 Для решения задач 5-7 были отобраны здоровые беременные пациентки III триместра беременности – группа сравнения (n=30) и беременные 50 пациентки с ПЭ ІIІ триместра беременности – основная группа (n=28). Дизайн исследования представлен на рисунке 5. Рисунок 5. Дизайн исследования к задачам 5-7 Критерии включения в исследование общие: Для группы сравнения: Неосложненное течение данной беременности; Одноплодная беременность, наступившая в естественном цикле. Информированное согласие на включение в исследование Для основной группы: Одноплодная беременность, наступившая в естественном цикле, осложненная преэклампсией Информированное согласие на участие в исследовании Критерии исключения общие: резус конфликт в настоящей беременности многоплодная беременность 51 острые и хронические воспалительные заболевания тяжелая экстрагенитальная патология аутоиммунные заболевания прием препаратов, влияющих на выработку аутоиммунных антител гемотрансфузия в анамнезе применение препаратов человеческих иммуноглобулинов 2.2.Сбор и хранение образцов Забор крови у пациенток производили из локтевой вены в стерильную пробирку в плановом порядке при обследовании. После ретракции сгустка и центрифугирования отбирали сыворотку. Аликвоты сыворотки замораживали и хранили при -80оС до исследования. Исследования были одобрены этическим комитетом ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И.Кулакова» Миндзрава России. 2.3.Клинико-лабораторное обследование 2.3.1.Сбор анамнестических данных. В анкету были внесены данные по наследственному анамнезу: тромбозы, инсульты, инфаркты, гипертоническая болезнь, онкологические заболевания у родственников до 45 лет, течение беременности у близких родственников. При анкетировании отмечался возраст воспалительные менархе, заболевания в гинекологический мочеполовой системы, анамнез вносили: гинекологические заболевания и проводимую терапию, операции; акушерский анамнез включал: число, течение и исход беременностей (роды, аборты, выкидыши). 2.3.2.Определение антител к фосфолипидам (кардиолипину, β2гликопротеину-I, протромбину, аннексину V, фосфатидилсерину) в сыворотке периферической крови проводили методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа с помощью коммерческих наборов фирмы ORGENTEC (Германия), разработанных для 52 количественного определения аутоантител классов G и M к вышеназванным антигенам (таблица 1). Таблица 1 Характеристика ИФА наборов для количественного определения антител к фосфолипидам и фосфолипид-связывающим белкам, использованных при проведении исследования Лиганд IgМ Предел чувствительности набора, Ед/мл 0,5 IgG 1,0 <10 IgМ 0,5 <5 IgG 0,5 <5 IgМ 1,0 <5 IgG 1,0 IgМ 1,0 <5 <10 IgG 1,0 <10 IgМ 0,5 <10 IgG 1,0 <10 Класс антител кардиолипин β2-гликопротеин I Аннексин V протромбин фосфатидилсерин Нормативные значения, Ед/мл <7 2.3.3.Определение иммуноглобулинов классов M и G проводилось фотометрическим турбидиметрическим методом на коммерческих реагентах фирмы HUMAN (Германия) в соответствии с инструкцией, на биохимическом фотометрическом кинетическом анализаторе АБхФК-02“НПП-ТМ”. 2.4. Специальные методы исследования 2.4.1. Твердофазный иммуноферментный анализ - определение растворимых форм МКА (sE-селектина, sL-селектина, sICAM-1 и sVCAM-1) в сыворотке крови осуществляли иммуноферментным анализом (ELISA) с использованием стандартных тест-систем фирмы Bender MedSystems GmbH (Австрия) (таблица 2). Измерение оптической плотности производили с помощью планшетного ридера BioTek (США) при длине волны 450 нм. Построение калибровочного графика и расчет концентраций 53 sE-селектина, sL-селектина, sICAM-1 и sVCAM-1 производили по уравнениям линейной регрессии в логарифмических координатах. Таблица 2 Характеристика ИФА наборов для количественного определения растворимых форм МКА, использованных при проведении исследования Лиганд sICAM-1 sVCAM-1 sL-селектин sE-селектин 2.4.2. Предел чувствительности набора, нг/мл 2,2 0,6 0,3 0,3 Культуральный эндотелиальных Ожидаемые значения диапазон, значение, стандартное нг/мл нг/мл отклонение,нг/мл 302-1115 504 171 400,6-1340,8 772,4 207,2 487,3-1096,3 842 168,9 21-186 66,5 34,8 метод – получение клеток - клетки линии клеточных образцов ЕА.hy 926 – полученные гибридизацией клеток HUVEC и клеток линии А549 – карциномы легкого человека - культивировали в среде DMEM с 25 мМ HEPES (ПанЭко, Россия) содержащей 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone,США), 2 мМ L-глютамина (ПанЭко, Россия), 25 Ед/мл пенициллина, 25 мг/мл стрептамицина (Invitrogen,США) и НАТ (гипоксантин, аминоптерин и тимидин) (ПанЭко, Россия) при 37оС во влажной атмосфере с 5% СО2. При достижении субконфлюэнтного монослоя, клетки дезинтегрировали добавлением раствора Версена (ПанЭко, Россия) в течение 8-10 минут. Пассаж клеток производили 1 раз в 3-4 дня. Жизнеспособность клеток оценивалась по окрашиванию с 0,4% раствором трипанового синего на физиологическом растворе и составляла не менее 96% в каждом эксперименте. 2.4.3. Метод проточной цитометрии - выявление антител, связывающихся с эндотелиальными клетками Клетки линии ЕА.hy 926 снимали с флакона, отмывали два раза фосфатным буферным раствором (PBS, Sigma, США) c добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA, ПанЭко, Россия) и подсчитывали концентрацию клеток на счетчике клеток TC-10 (Automated cell counter, 54 BioRad, США). Далее клетки в концентрации 2х104 помещали в микропробирки (Медполимер, Санкт-Петербург). Исследуемые сыворотки размораживали при комнатной температуре, центрифугировали в течение 3 минут при 5000g (центрифуга MiniSpin, Eppendorf), нагревали на водяной бане при 56оС в течение 30 минут для инактивации комплемента и добавляли к суспензии клеток (в разведении 1:2). В контрольный образец добавляли пулированную сыворотку, полученную от здоровых доноров с IV группой крови (Sigma,США). В качестве негативного контроля использовали PBSBSA. Образцы инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. в темноте, отмывали три раза PBS-BSA и к осадку добавляли ФИТЦ - меченые козьи антитела, специфичные к Fc-фрагменту IgG человека (Sigma,США); или ФИТЦ - меченые козьи антитела, специфичные к μ-цепи IgМ человека (Sigma,США) в разведении 1:100 и инкубировали 30 минут при 4 оС. Затем образцы отмывали, добавляли иодид пропидия (конечная концентрация 2 мкг/мл) и проводили учет интенсивности флуоресценции на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США). 2.4.4. Анализ суспензии клеток с помощью проточной цитофлуориметрии Цитофлуориметрический анализ проводился на основании определения параметров прямого светорассеяния (FSC), бокового светорассеяния (SSC) и зеленой флуоресценции (FL1). Окно дискриминации устанавливалось в режиме «dot plot» в логарифмических координатах, который позволяет откладывать по оси Х значения интенсивности прямого светорассеяния, а по оси У – интенсивности углового светорассеяния. Настройку усилителя проводили таким образом, чтобы в окне «dot plot» FSC/SSC четко выделялось облако эндотелиальных клеток. Окрашивание клеток йодидом пропидия и использование окна дискриминации позволило исключить из анализа мертвые клетки, клеточные агрегаты и дебрис. В каждой пробе было проанализировано 5000 клеток. 55 Активность связывания АЭАТ (параметр, отражающий афинность антител и их количество) с поверхностными антигенами характеризовали, оценивая процент живых эндотелиальных клеток, покрытых антителами (ПЦМ%) и количество антител, связанных с клеткой. Для характеристики количества АЭАТ, связанных с клеткой, учитывали: среднюю интенсивность зеленой флуоресценции АЭАТ-позитивных эндотелиальных клеток (СИФ); медиану и моду – величины, характеризующие значение распределения клеток по интенсивности флуоресценции, выраженные в условных единицах флуоресценции (уеф). Использование иодида пропидия позволило определить количество мертвых клеток в образце, которые образуются после инкубации сыворотки с клетками линии EA.hy 926 (МК%). 2.4.5. Метод лектиновой гистохимии – изучение паттерна экспрессии углеводных остатков в тканях плаценты Морфологическое исследование было выполнено на образцах тканей плаценты пациенток основной группы и группы сравнения, полученных после оперативных или самопроизвольных родов. Небольшие фрагменты тканей плаценты были вырезаны из центральной и парацентральной зон (включающих хориальную, базальную пластинки и ворсинчатый хорион). Полученные кусочки были фиксированы в 10%-ном растворе забуференного нейтрального формалина (Biovitrum, Россия) в течение 24 часов, затем заключались в парафин. Микроскопическое исследование включало обзорный анализ препаратов тканей плаценты, окрашенных гематоксилином и эозином. Лектиновая гистохимия была выполнена на парафиновых срезах, толщиной 4 мкм, расположенных на стёклах Superfrost plus (Menzel, Braunschweig, Germany) (схема лектиновой гистохимии представлена на рисунке 6). Для определения углеводного фенотипа были использованы биотинилированные лектины растительного происхождения: Maackia Amurensis Lectin II (MAL II), Sambucus nigra lectin (SNA), Erythrina Cristagalli Lectin (ECL) и Ulex Europaeus Agglutinin I (UEA I), Сoncanavalin A (ConA), Vicia Villosa Lectin (VVL) (Vector Labs, USA) в концентрации (10 мкг/мл) в 56 фосфатном 4% бычьего буфферном растворе сывороточного (PBS, альбумина Sigma,США) (BSA, c добавлением ПанЭко, Россия). Характеристика специфичности лектинов представлена в таблице 3 [234]. Рисунок 6. Принцип детекции углеводных остатков методом лектиновой гистохимии 57 Таблица 3 Фукозосвязывающий лектин Лектины, связывающие сиаловую кислоту Характеристика специфичности лектинов, используемых в анализе Лектин Моносахаридная специфичность Олигосахаридная специфичность Комментарии по специфичности 1 2 3 4 Лектин из семян маакии амурской Maackia Amurensis (MAL II), Агглютинин из ягод бузины черной Sambucus nigra (SNA, EBL) α2-3-связанная Neu5Acα2-3Gal 3’-сиалозиды в составе N-гликанов комплексного типа сиаловая кислота (Neu5Aсα2-3) α2-6-связанная Neu5Acα2-6Gal Neu5Acα2-6GalNAc сиаловая кислота (Neu5Acα2-6) 6’-сиалозиды в составе N-гликанов комплексного типа Fuc α1-2 Агглютинин из семян утесника европейского Ulex Europaeus (UEA I) фукоза (Fucα) фукозилированные фрагменты гликанов 58 1 2 Агглютинин из семян вики мохнатой Vicia Villosa (VVL, VVA) α-Nацетилгалактозамин (GalNAcα) Агглютинин из семян эритрины петушиный гребень Erythrina Cristagalli (ECL, ECA) терминальная β1галактоза (Galβ) 3 4 Галактозо/Nацетилгалактозаминсвязывающие лектины GalNAcα остатки N-ацетилгалактозамина в составе гликанов Galβ1-4GlcNAc N-гликаны комплексного типа с терминальными олиго-N-ацетиллактозаминовыми фрагментами Остатки Manα или Glcα Маннозосвязывающий лектин N-гликаны олигоманнозного типа Агглютинин из тканей мечевидной канавалии Canavalia ensiforme, Concanavalin A (Con A) α-Манноза (Manα), αглюкоза (Glcα) N-гликаны гибридного типа Двухантенные N-гликаны комплексного типа (слабое связывание) 59 Примечания: R – остаток гликана, Asn – остаток аспарагиновой кислоты 60 Демаскировка антигенов для гистохимического исследования проводилась в микроволновой печи с использованием цитратного буфера (Spring Bioscience, USA, рН 6,0), при мощности 600 Вт. Для подавления активности эндогенной пероксидазы срезы были инкубированы 3%-м растворе Н2О2 (ready-to use, Spring Bioscience, USA) в течение 10 минут. Отмывание срезов производилось трижды фосфатно-солевым буферным раствором (PBS, рH=7,6), по 5 минут каждое. Неспецифические сайты связывания лектинов блокировали раствором Block Solution (Spring Bioscience, USA). Затем срезы однократно промывались и инкубировались с рабочими растворами лектинов в течение ночи при температуре +4С о. Далее срезы промывали 3 раза и инкубировали с коньюгатом стрептавидинпероксидазы (Amercham, USA) в разведении 1:100 в PBA в течение 30 минут при комнатной температуре. После инкубации срезы промывали трижды. Визуализацию участков связывания лектина проводили в системе: 0,02%ный раствор 3,3’-диаминобензидина (ДАБ) (Spring Bioscience, USA) в течение 3 минут. Для улучшения визуализации структурных элементов плаценты срезы докрашивали водным раствором гематоксилина Майера в течение 20 секунд. Выраженность экспрессии гликоконъюгатов оценивали по интенсивности окрашивания продукта реакции в структурных элементах терминальных ворсин (синцитиотрофобласте и эндотелии капилляров) центральной и парацентральной зон плаценты при помощи системы анализа изображения на базе микроскопа Nikon ECLIPSE с применением программного приложения. Негативным контролем служили срезы ткани плаценты, окрашенные по той же методике, но без инкубации с лектинами. Позитивным контролем служила ткань почки, подвергнутая гистохимическому окрашиванию в условиях, описанных выше. 61 2.4.5. Микрочиповый метод – изучение спектра антител к гликанам. Гликочипы были произведены как описанной ранее [190 ,231] с использованием N-гидроксисукцинимид-активированной поверхности (Schott, Nexterion, Германия), на которую в процессе печати ковалентно привязывались аминоспейсерированные гликаны (схема микрочипового анализа представлена на рисунке 7). А. Подготовка образцов сыворотки для анализа - сыворотку размораживали при комнатной температуре, разводили в объемном соотношении 1:15 фосфатным буфером (phosphate buffered saline (PBS), Sigma-Aldrich, США), содержащем 1% БСА, 0.01% NaN3, 1% Tween 20 (ICN, USA). Разведенную сыворотку термостатировали при 37оС в течение 5 минут, затем центрифугировали в течение 3 минут при 12000 об/мин (центрифуга MiniSpin, Eppendorf). Рисунок 7. Схема проведения микрочипового анализа для детекции антител (Glyc - гликан) Б. Выявление антигликановых антител в образцах сыворотки гликочипы, содержащие 233 гликана, были проинкубированы в течение 62 15 минут в фосфатном буфере, содержащем 0,1 % Tween-20 и промыты двукратно буфером того же состава. Затем наносилась подготовленная разведенная сыворотка крови и инкубировалась в течение 90 минут при 37оС, относительной влажности около 80% и непрерывном перемешивании (3234 об.мин), (термошейкер Inkubator 1000, Heidolph, Германия). По истечении 90 минут гликочипы были двукратно промыты фосфатным буфером, содержащим 0,1 % Tween-20. Затем наносилась смесь вторичных антител в разведении 1:250 в фосфатном буфере, содержащем 1% БСА, 0.01% NaN3, 0.1% Tween 20, меченных флюорофором: антитела козы, направленные к человеческому IgG, меченные Alexa555 (Invitrogen, США); антитела козы, направленные к человеческому IgM, меченные Alexa647 (Invitrogen, США), инкубировалась в течение 60 минут в тех же условиях, что и сыворотка крови. Затем гликочипы промывались фосфатным буфером, содержащим 0.001 % Tween 20 и бидистиллированной водой, высушивались воздухом. Для расчета межслайдовой корреляции (необходимой для подтверждения воспроизводимости результатов и корректности сравнения исследуемых групп) проводилась инкубация гликочипа с коммерческим комплексным иммуноглобулиновым препаратом (КИП). В. Анализ результатов - интенсивность флуоресценции, выраженную в относительных единицах (уеф) измеряли с помощью конфокального флуоресцентного сканера ProScanArray Gx (PerkinElmer, США) с разрешением 10 мкм. Полученные данные обрабатывали с помощью программного обеспечения ScanArrayExpress 4.0, используя метод фиксированных колец диаметром 70 мкм, а также Microsoft Excel. Значимыми считались сигналы, интенсивность флуоресценции которых превышала фоновое значение (т.е. сигналы в зонах, не содержащих гликанов) более чем в 5 раз. Уровень антигликановых антител (отражающий аффинность антител и их количество) характеризовали с помощью медианы интенсивностей флуоресценции повторов лигандов гликочипа. Список гликанов, присутствующих на чипе представлен в таблице 4. 63 Таблица 4 Список гликанов, присутствующих на гликочипе Химическая структура гликана Общее название Короткое название 1 2 3 Fuc-sp* L-a-Fuc aF Gal-sp* a-Gal aA Gal-sp* b-Gal bA GalNAc1-OSer TnSer TnSer GalNAc-sp* Tn Tn GalNAc-sp* b-GalNAc bAN Glc-sp* a-D-glucose aG Glc-sp* b-Glc bG-C2 Glc-sp* b-D-glucose bG GlcNAc-sp* GN GN GlcNAc-sp* HOCH2(HOCH)4CH2NH2 GN GN-C2 aminoglucitol glucitol Man-sp* -Man a-Man aM-Gly Rha-sp* L-a-Rha aR a-GlcNAc GNa 3,6-Me2Glc 3,6-Me2Glc 3-O-Su-b-Gal bA3Su 3-O-Su-GalNAc-sp* 3-O-Su-b-GalNAc bAN3Su 6-O-Su-GlcNAc-sp* 6-O-Su-GN GN6Su glucuronic acid bGU a-Man6P M6P Neu5Ac-sp* a-Neu5Ac Sia Neu5Gc-sp* Neu5Gc aNeu5Gc Man-sp* GlcNAc-sp* 3,6-Me2Glc 3-O-Su-Gal-sp* GlcA-sp* 6-H2PO3Man-sp* aM GN3Su 3-O-Su-GlcNAc-sp* Hdi Hdi Fuc1-3GlcNAc-sp* Fuca3GN Fa3GN Fuc1-4GlcNAc-sp* Le Le Fuc1-3GlcNAc-sp* Fucb3GN Fb3GN Gal1-2Gal-sp* Gala2Gal Aa2A Gal1-3Gal-sp* Bdi Bdi Gal1-3GalNAc-sp* Tab Tab Gal1-3GalNAc-sp* Taa Taa Gal1-4GlcNAc-sp* a-LN aLN Gal1-6Glc-sp* melibiose Aa6G Gal1-2Gal-sp* Galb2Gal Ab2A Le c LeC Le c LeC-C2 Galb3Gal Ab3A Tbb Tbb Fuc1-2Gal-sp* Gal1-3GlcNAc-sp* Gal1-3GlcNAc-sp* Gal1-3Gal-sp* Gal1-3GalNAc-sp* 64 1 2 3 TF TF Lac Lac-C2 n.c. n.c. Gal1-4GlcNAc-sp* LacNAc LN-C2 Gal1-4GlcNAc-sp* LN LN Fs-2 Fs-2 Adi Adi GalNAc1-3GalNAc-sp* core 5 core5 GalNAc-3GalNAc-sp* para-Fs para-Fs GalNAc1-4GlcNAc-sp* LacdiNAc LacdiNAc GalNAc1-4GlcNAc-sp* LacdiNAc LacdiNAc-C2 GalNAc(f)bGN-C2 AN(f)b4GN-C2 maltose Malt2 GlcNAc1-3GalNAc-sp* core 3 core3 GlcNAc1-4GlcNAc-Asn chitobiose-Asn Ch2-Asn GlcNAc1-6GalNAc-sp* core 6 core6 Gal1-4Glc-sp4-Ile Lac Lac-Ile Gal1-4Glc-sp4-Nle Lac Lac-Nle Gal1-4Glc-sp4-Val Lac Lac-Val Tab(f) Tab(f) chitobiose Ch2-C3 Gal1-3GalNAc-sp* Gal1-4Glc-sp2* negative control GalNAc1-3GalNAc-sp* GalNAc1-3Gal-sp* GalNAc(fur)1-4GlcNAc-sp* Glc1-4Glc-sp* Gal1-3GalNAc(fur)-sp* GlcNAc1-4GlcNAc-sp* GNa3AN GNa3AN Gal1-3(6-O-Su)GlcNAc-sp* 6-O-Su-Lec LeC6Su-C2 Gal1-3(6-O-Su)GlcNAc-sp* 6-O-Su-Lec LeC6Su Gal1-4(6-O-Su)Glc-sp* 6-O-Su-Lac Lac6Su Gal1-4(6-O-Su)GlcNAc-sp* 6-O-Su-LN LN6Su GalNAc1-4(6-O-Su)GlcNAc-sp* 6-O-Su-LacdiNAc LacdiNAc6Su GlсNAc1-4(6-O-Su)GlcNAc-sp* 6-O-Su-chitobiose Ch2-6Su 3-O-Su-Gal-3GalNAc-sp* 3'-O-Su-TF TF3'Su 6-O-Su-Gal-3GalNAc-sp* 6'-O-Su-TF TF6'Su 3-O-Su-Gal1-4Glc-sp* SM3 Lac3'Su 6-O-Su-Gal1-4Glc-sp* 6'-O-Su-Lac Lac6'Su c LeC3'Su 3-O-Su-Gal1-3GlcNAc-sp* c 3'-O-Su-Le - Sp2 LeC3'Su-C2 3-O-Su-Gal1-4GlcNAc-sp* 3'-O-Su-LN LN3'Su-C2 3-O-Su-Gal1-4GlcNAc-sp* 3'-O-Su-LN LN3'Su 4-O-Su-Gal1-4GlcNAc-sp* 4'-O-Su-LN LN4'Su-C2 4-O-Su-Gal1-4GlcNAc-sp* 4'-O-Su-LN LN4'Su 6-O-Su-Gal1-3GlcNAc-sp* 6'-O-Su-Le c LeC6'Su-C2 6-O-Su-Gal1-3GlcNAc-sp* 6'-O-Su-Le c LeC6'Su 6-O-Su-Gal1-4GlcNAc-sp* 6'-O-Su-LN LN6'Su-C2 6'-O-Su-Gal1-4GlcNAc-sp* 6'-O-Su-LN LN6'Su GlcA3GN GUb3GN GlcAb3Galb GUb3A GN-Mur GN-Mur GlcNAc1-3GalNAc-sp* 3-O-Su-Gal1-3GlcNAc-sp* GlcA1-3GlcNAc-sp* GlcA1-3Gal-sp* GlcNAc-4-[HOOC(CH3)CH]-3-O-GlcNAc-sp* 3'-O-Su-Le - Sp3 65 1 2 3 GMDP-Lys GMDPLys Neu5Ac2-3Gal-sp* GM4 GM4 Neu5Ac2-6Gal-sp* Neu5Ac6Gal Sia6A GlcNAc1-4Mur-L-Ala-D-i-Gln-Lys Neu5Ac2-6GalNAc-sp* SiaTn SiaTn Neu5Gc2-6GalNAc-sp* Neu5Gc-Tn Neu5GcTn 3-O-Su-Gal1-4(6-O-Su)Glc-sp* 3',6-di-O-Su-Lac Lac3',6Su2 3-O-Su-Gal1-4(6-O-Su)GlcNAc-sp* 3',6-di-O-Su-LN LN3'6Su2 6-O-Su-Gal1-4(6-O-Su)Glc-sp* 6,6'-di-O-Su-Lac Lac6,6'Su2 6-O-Su-Gal1-3(6-O-Su)GlcNAc-sp* 6,6'-di-O-Su-Le c LeC6,6'Su2 6-O-Su-Gal1-4(6-O-Su)GlcNAc-sp* 6,6'-di-O-Su-LN LN66'Su2 3,4-O-Su2-Gal1-4GlcNAc-sp* 3',4'-di-O-Su-LN LN3'4'Su2 3,6-O-Su2-Gal1-4GlcNAc-sp* 3',6'-di-O-Su-LN LN3'6'Su2 (Sia)2 (Sia)2 (Sia)2bBn (Na Salt) (Sia)2-bBn 3',6,6'-tri-O-Su-LN LN3'66'Su3 Neu5Ac2-8Neu5Ac2-sp* Neu5Ac2-8Neu5Ac-sp* 3,6-O-Su2-Gal1-4(6-O-Su)GlcNAc-sp* LN6'P 6-P-Gal1-4GlcNAc-sp* GalNAc1-4(6-O-Su)GlcNAc-sp* LacdiNAc6Su 3-O-Su-GalNAc1-4GlcNAc-sp* LacdiNAc3'Su 6-O-Su-GalNAc1-4GlcNAc-sp* LacdiNAc6'Su 3-O-Su-GalNAc1-4(3-O-Su)-GlcNAc-sp* LacdiNAc3,3'Su2 3,6-O-Su2-GalNAc1-4-GlcNAc-sp* LacdiNAc3',6'Su2 3Ac-LacdiNAc4',6'Su2 4,6-O-Su2-GalNAc1-4-(3-O-Ac)GlcNAc-sp* LacdiNAc4'Su 4-O-Su-GalNAc1-4GlcNAc-sp* LacdiNAc3',4'Su2 3,4-O-Su2-GalNAc1-4-GlcNAc-sp* 6-O-Su-GalNAc1-4(6-O-Su)GlcNAc-sp* Gal1-4(6-O-Su)GlcNAc-sp* 4-O-Su-GalNAc1-4GlcNAc-sp* 6,6'-Su2-LacdiNAc LacdiNAc6,6'Su2 6-O-Su-LacNAc LN6Su 4'-O-su-LacdiNAc LacdiNAc4'Su-C2 6SiaANb Neu5Ac2-6GalNAc-sp* Neu5Gca3Gal Neu5Gc2-3Gal-sp* Neu5Gc3A d Fuc1-2Gal1-3GlcNAc-sp* Le , H (type 1) LeD Fuc1-2Gal1-4GlcNAc-sp* H (type 2) Htype2 Fuc1-2Gal1-3GalNAc-sp* H (type 3) Htype3 Gal1-3Gal1-4Glc-sp* Aa3'Lac-C2 Aa3'Lac-C2 Gal1-3Gal1-4Glc-sp* Aa3'Lac-Gly Aa3'Lac-Gly Galili (tri) Galili3 k P , Gb3, GbOse3 Pk-C2 k P , Gb3, GbOse3 Pk P1 P1 Gal1-3(Fuc1-2)Gal-sp* Btri Btri Gal1-3(Fuc1-2)Gal-sp* Btri-C8 Btri-C8 Ab2Aa3GN Ab2Aa3GN Gal1-4GlcNAc1-3GalNAcsp* 3-LN-Tn LN3Tn Gal1-4GlcNAc-6GalNAcsp* 6-LN-Tn LN6Tn a LeA Gal1-3Gal1-4GlcNAc-sp* Gal1-4Gal1-4Glc-sp* Gal1-4Gal1-4Glc-sp* Gal1-4Gal1-4GlcNAc-sp* Gal1-2Gal1-3GlcNAc-sp* Le Gal1-3(Fuc1-4)GlcNAc-sp* Gal1-4(Fuc1-3)GlcNAc-sp* Le x LeX 66 1 2 3 Atri Atri GA2, GgOse3 GA2 Fa2(GalNb3)Gal Fa2(ANb3)A GlcNAc1-3Gal1-4GlcNAc-sp* GNa3’LN GNa3'LN-C2 GlcNAc1-2Gal1-3GalNAc-sp* GN1-2'TF GN2'TF GlcNAc1-3Gal1-3GalNAc-sp* GN3’TF GN3'TF GlcNAc1-3Gal1-4Glc-sp* GN3`Lac GN3'Lac GlcNAc1-3Gal1-4GlcNAc-sp* GN3`LN GN3'LN-C2 GlcNAc1-3Gal1-4GlcNAc-sp* GN3`LN GN3'LN GlcNAc1-4Gal1-4GlcNAc-sp* GN4’LN GN4'LN GlcNAc1-6Gal1-4GlcNAc-sp* GN6’LN GN6'LN core 2 core2 GalNAc1-3(Fuc1-2)Gal-sp* GalNAc1-4Gal1-4Glc-sp* GalNAc1-3(Fuc1-2)Gal-sp* GlcNAc1-6(Gal1-3)GalNAc-sp* GlcNAc1-6(GlcNAc1-3)GalNAc-sp* core 4 core4 GlcNAc1-6(GlcNAc1-4)GalNAc-sp* (GN)24,-6-,Tn GN2-4,6Tn Tbb-Gal Tbb-A Gal1-3GalNAc1-3Gal-sp* (GalNAc-PEG2)3--DD (ANb-PEG2)3 Gal1-4Gal1-4GlcNAc-sp* Ab4'LN Gal1-3Gal1-4GlcNAc-sp* Ab3'LN P1 P1 GlcNAc3'Le c GlcNAc3'Lec Su-Le a 3'SuLeA x 3'SuLeX Neu5Ac2-6(Gal1-3)GalNAc-sp* 6-SiaTF 6SiaTF Neu5Ac2-6(Gal1-3)GalNAc-sp3 6-SiabTF b6SiaTF Neu5Ac2-3Gal1-3GalNAc-sp* 3'-Sia-TF Sia3'TF Neu5Ac2-3Gal1-4Glc-sp* 3'SL 3'SL Neu5Ac2-3Gal1-4Glc-sp* 3'SL-Gly 3'SL-Gly Neu5Ac2-6Gal1-4Glc-sp* 6'SL 6'SL-C2 Neu5Ac2-3Gal1-4GlcNAc-sp* 3'SLN 3'SLN Neu5Ac2-3Gal1-3GlcNAc-sp* 3'SiaLeC 3'SiaLeC Neu5Ac2-6Gal1-4GlcNAc-sp* 6'SLN 6'SLN Neu5Gc2-3Gal1-4GlcNAc-sp* 3'SLN(Gc) 3'SLN(Gc) Gal1-4Gal1-4GlcNAc-sp* GlcNAc1-3Gal1-3GlcNAc-sp* Fa6Ch2 GlсNAc1-4(Fuc1-6)GlcNAc-sp* 3-O-Su-Gal1-3(Fuca1-4)GlcNAc-sp* 3-O-Su-Gal1-4(Fuc1-3)GlcNAc-sp* Su-Le 6'SLN(Gc) 6'SLN(Gc) Neu5Ac2-3Gal1-4-(6-O-Su)GlcNAc-sp* 6-Su-3'SLN 3'SLN6Su Neu5Ac2-3Gal1-3-(6-O-Su)GalNAc-sp* 6-Su-3'SiaTF 3'SiaTF6Su Neu5Ac2-6Gal1-4-(6-O-Su)GlcNAc-sp* 6-Su-6'SLN 6'SLN6Su Neu5Ac2-3-(6-O-Su)Gal1-4GlcNAc-sp* 6'-Su-3'SLN 3'SLN6'Su (Sia)3 (Sia)3 6'-SiaLe c 6'SiaLeC 6Su-6'-SiaLe c 6'SiaLeC6Su 3'SL 3'SL-Nle Neu5Gc2-6Gal1-4GlcNAc-sp* (Neu5Ac2-8)3-sp* Neu5Ac2-6Gal1-3GlcNAc-sp* Neu5Ac2-6Gal1-3(6-O-Su)GlcNAc-sp* Neu5Ac2-3Gal1-4Glc-sp4-Nle C 3'SiaLe (Gc) 3'SiaLeC(Gc) Neu5Gcα2-3Galβ1-3-(6-O-Su)GlcNAcβ-sp* 6Su-3'-SiaLec(Gc) 3'SiaLeC(Gc)6Su Neu5Gcα2-3Galβ1-4-(6-O-Su)GlcNAcβ-sp* 6Su-3'-SLN(Gc) Neu5Gc2-3Gal1-3GlcNAc-sp* 3'SLN(Gc)6Su 67 1 2 3 Neu5Acα2-3Galβ1-3-(6-O-Su)GlcNAcβ-sp* 6Su-3'-SiaLeC 3'SiaLeC6Su Gal1-3(Fuc1-2)Gal1-3GlcNAc-sp* B (type 1) -C3 Btype1 Gal1-3(Fuc1-2)Gal1-4GlcNAc-sp* B (type 2) - C3 Btype2 Gal1-3(Fuc1-2)Gal1-4GlcNAc-sp* B (type 2) -C2 Btype2-C2 Gal1-3(Fuc1-2)Gal1-3GalNAc-sp* B (type 3) -C3 Btype3 Gal1-3(Fuc1-2)Gal1-3GalNAc-sp* B (type 4) -C3 Btype4 Gal1-3Gal1-4(Fuc1-3)GlcNAc-sp* x aGalLeX GalNAc1-3(Fuc1-2)Gal1-3GlcNAc-sp* A (type 1) -C3 Atype1 GalNAc1-3(Fuc1-2)Gal1-4GlcNAc-sp* A (type 2) -C2 Atype2-C2 GalNAc1-3(Fuc1-2)Gal1-4GlcNAc-sp* A (type 2) Atype2 Le b LeB Le y LeY Galili (tetra) Galili4 aLN3'LN aLN3'LN Le a3'LN -C3 LeCa3'LN aGalLe Fuc1-2Gal1-3(Fuc1-4)GlcNAc-sp* Fuc1-2Gal1-4(Fuc1-3)GlcNAc-sp* Gal1-3Gal1-4GlcNAc1-3Gal-sp* Gal1-4GlcNAc1-3Gal1-4GlcNAc-sp* Gal1-3GlcNAc1-3Gal1-4GlcNAc-sp* Gal1-3GlcNAc1-3Gal1-4GlcNAc-sp* C C Le 3'LN -C3 C LeCb3'LN Le 6'LN LeCb6'LN GA1, asialo-GM1 aGM1 Gal1-4GlcNAc1-3Gal1-4GlcNAc-sp* LN3LN-C2; i LNb3'LN-C2 Gal1-4GlcNAc1-3Gal1-4GlcNAc-sp* LN3LN-C3; i LNb3'LN Gal1-3GlcNAc1-6Gal1-4GlcNAc-sp* Gal1-3GalNAc1-4Gal1-4Glc-sp* LN6'LN LNb6'LN 6-LN-TF LNb6TF Gb4, P Gb4 A (type 3) A(type 3) Tk Tk (GN)3-3,4,6Tn GN3-3,4,6Tn Gal1-4GlcNAc1-6Gal1-4GlcNAc-sp* Gal1-4GlcNAc1-6(Gal1-3)GalNAc-sp* GalNAc1-3Gal1-4Gal1-4Glc-sp* GalNAc1-3(Fuc1-2)Gal1-3GalNAc-sp* GlcNAc1-6(GlcNAc1-3)Gal1-4GlcNAc-sp* (GlcNAc1)3-3,4,6-GalNAc-sp* Gal1-3GlcN(Fm)1-3Gal1-3GlcNAc-sp* C formylLe 3'Le LeC(Fm)3'LeC LeCa3LeC-C2 Gal1-3GlcNAc1-3Gal1-3GlcNAc-sp* Le a3Le C Gal1-3GlcNAc1-3Gal1-3GlcNAc-sp* C C LeC3LeC Atria1-4GlcNAc Atria4GN GalNAc1-3(Fuc1-2)Gal1-4GlcNAc-sp* C C Le 3Le LeC3'LN Gal1-3GlcNAc1-3Gal1-4GlcNAc-sp* 3-O-SuGal1-4GlcNAc1-3Gal1-4GlcNAc-sp* (3'SuLN)3'LN (3'SuLN)3'LN 4-O-SuGal1-4GlcNAc1-3Gal1-4GlcNAc-sp* (4'SuLN)3'LN (4'SuLN)3'LN GM2 GM2 3'SLNb3Gal 3'SLNb3A Neu5Ac2-3Gal1-4(Fuc1-3)GlcNAc-sp* SiaLex SiaLeX Neu5Ac2-3Gal1-3(Fuc1-4)GlcNAc-sp* a SiaLeA x SiaLeX6Su 6(Gal)-su-SiaLex SiaLeX6'Su Sia2-TF Sia2-3',6TF GalNAc1-4(Neu5Ac2-3)Gal1-4Glc-sp* Neu5Ac2-3Gal1-4GlcNAc1-3Gal-sp* Neu5Ac2-3Gal1-4(Fuc1-3)(6-O-Su-)GlcNAcsp* Neu5Ac2-3(6-O-Su)Gal1-4(Fuc1-3)GlcNAc-sp* SiaLe 6 (GN) -su-SLe Neu5Ac2-6(Neu5Ac2-3Gal1-3)GalNAc-sp* Gal1-3(Fuc1-2)Gal1-4(Fuc1-3)GlcNAc-sp* GalNAc1-3(Fuc1-2)Gal1-3GalNAc-sp* Fuc1-2Gal1-3GlcNAc1-3Gal1-4GlcNAc-sp* BLe y BLeY A(type 4) A(type 4) H(type 1) penta Htype1LN 68 1 2 (LN)2-3,6Tn LN2-3,6Tn LN3'(GN6')LN LN3'(GN6')LN LN6'(GN3')LN LN6'(GN3')LN (LN)3 (LNb3')3 I, (LN)2-3,6LN LN2-3',6'LN Araf6 Araf6 3'SLN-LN 3'SLN-LN SiaLex-3Gal SiaLeX3A GD2 GD2 6'SLN-LacNAc 6'SLN-LN hyaluronic acid HyalU(11-12)-ol 11-OS (aminoalditol) 11-OS-ol Gal1-4GlcNAc1-6(Gal1-4GlcNAc13)GalNAc-sp* Gal1-4GlcNAc1-3(GlcNAc1-6)Gal1-4GlcNAcsp* Gal1-4GlcNAc1-6(GlcNAc1-3)Gal1-4GlcNAcsp* Gal1-4GlcNAc1-3Gal1-4GlcNAc1-3Gal14GlcNAc-sp* Gal1-4GlcNAc1-6(Gal1-4GlcNAc1-3)Gal14GlcNAc-sp* Araf6 Neu5Ac2-3Gal1-4GlcNAc1-3Gal1-4GlcNAcsp* Neu5Ac2-3Gal1-4(Fuc1-3)GlcNAc1-3Gal-sp* Neu5Ac2-8Neu5Ac2-3(GalNAc1-4)Gal14Glc-sp* Neu5Ac2-3Gal1-4GlcNAc1-3Gal1-4GlcNAcsp* (GlcA1-4GlcNAc1-3)11-12-NH2-ol (Sia2-6A-GN-M)2-3,6-M-GN-GN-NH2-ol 3 GNa4GN GlcNAc1-4GlcNAc-sp* biot-CMG2-NH2 Trehalose-ethanolamine Gal1-3GalNAc(fur)-sp* biot-CMG2 biot-CMG2 Trehalose Treh Tbb(f) Tbb(f) Примечание: sp* –аминоэтильный, аминопропильный или глициламинный спейсер. 2.5. Статистические методы Статистическая обработка полученных данных производилась с помощью электронных таблиц Microsoft Office Excel, и пакета прикладных программ IBM SPSS Statistics Standard for Windows. Все полученные количественные данные обработаны методом вариационной статистики. Нормальность распределения (оценка возможности использования параметрических или непараметрических критериев для сравнения групп) производилась согласно критерию Шапиро – Уилка. Достоверность различия значений в рассматриваемых группах оценивалась по двухвыборочному t-критерию Стьюдента (t-тест) - при нормальном распределении; и непараметрического теста Уилкоксона-МаннаУитни (WMW-тест) для несвязанных совокупностей. 69 Наличие связи между изучаемыми показателями рассчитывалась с использованием: коэффициента корреляции Пирсона – R - (для переменных значений, которые коэффициента подчиняются корреляции подчиняющихся нормальному Спирмена – rho - (для нормальному распределению), распределению); показателей, с не последующим установлением уровня значимости. При коэффициенте корреляции менее 0,3 связь считалась не значимой, если коэффициент был равен 0,3 - 0,49 – корреляционная связь считалась умеренной, от 0,5 до 0,79 – средней, от 0,8 и выше – сильной. Средние значения показателей, имеющих нормальное распределение, представлены в виде M±s.d., где М-среднее значение, а s.d. – стандартное отклонение. При характеристике показателей, не удовлетворяющих критериям нормального распределения, данные представляли как Ме±MAD, где Ме – медиана, а MAD – абсолютное отклонение для медианы. Cтатистически достоверными считали различия при p<0,05 (с уровнем значимости 95%) и р<0,01 (с высоким уровнем значимости 99%). 70 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Глава 3. АДАПТАЦИЯ МЕТОДА ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫМ КЛЕТКАМ В НОРМЕ И ПРИ ПРЕЭКЛАМПСИИ Несмотря на то, что исследования АЭАТ при различных патологиях проводятся многие годы (первые работы были опубликованы в 70-е годы XX века), клиническое значение их до настоящего времени не доказано. Это объясняется, как методическими трудностями в определении АЭАТ, так и гетерогенностью самих антител, связывающих различные антигенные детерминанты на поверхности эндотелиальных клеток. Поскольку отсутствует стандартный метод для детекции АЭАТ, результаты, получаемые в разных лабораториях трудносопоставимы. В связи с этим в последние годы появляются различные варианты методов, основанных на иммуноферментном анализе, непрямой иммунофлюоресценции, проточной цитометрии, позволяющие определять АЭАТ разных классов. Метод проточной цитометрии (ПЦМ) является объективным количественным методом, позволяющим исследовать несколько параметров одновременно: процент клеток, покрытых антителами; количество антител на клеточной поверхности, а также использовать описательные характеристики вариационного ряда: средний элемент вариационного ряда (медиана); величина, наиболее часто встречающаяся в данном ряду (мода). В опубликованных на сегодняшний день работах определение АЭАТ методом ПЦМ проводят, используя, в основном, клетки HUVEC или эндотелиальные прогениторные клетки. Клетки линии EA.hy 926 используют для клеточного варианта ИФА. В настоящей работе для стандартизации результатов в качестве объекта были выбраны клетки линии EA.hy 926. За основу была взята методика, с помощью которой в трансплантологии определяют присутствие антител в сыворотке реципиента к HLA-антигенам донора [235]. 71 1.1. Выявление антиэндотелиальных антител Для выявления АЭАТ эндотелиальные клетки линии EA.hy 926 инкубировали с образцами сыворотки, а затем с ФИТЦ-меченными вторичными антителами козы против иммуноглобулинов человека, как описано в разделе «Методы». Выявление АЭАТ на клетках проводили при регистрации прямого светорассеяния (Forward Scatter, FSС), бокового светорассеяния (Side Skatter, SSС) зеленой флуоресценции (FL1) с помощью выбора окна дискриминации на двухпараметрической цитограмме в логарифмических координатах (рисунок 8). Использование пропидия иодида позволило разделить живые и мертвые клетки. Характеризовали: активность связывания АЭАТ с поверхностными антигенами (ПЦМ%) и количество АЭАТ, связанных с клеткой (СИФ; модальный канал (мода); медиана, выраженные в уеф). Также рассчитывалось количество мертвых клеток (МК%). Характеристика варьирования параметров метода представлена в таблице 5. Рисунок 8. Распределение клеток линии EA hy.926 при оптимальной настройке каналов светорассеяния и выделении окна дискриминации 72 Таблица 5 Характеристика варьирования параметров при выявлении АЭАТ на поверхности клеток линии EA.hy 926 параметр ошибка измерения,% ошибка метода,% ПЦМ,% средняя интенсивность флуоресценции, УЕФ (плотность антител на поверхности клетки) медиана мода <1 <2 <2 <5 <1 <1 <4 <9 На рисунке 9 представлены результаты выявления количества АЭАТ на поверхности клеток линии EA.hy 926 после их инкубации с образцами сыворотки крови. Рисунок 10 иллюстрирует результаты выявления мертвых клеток. Рисунок 9. Результаты выявления IgG (А) и IgM (Б) АЭАТ на поверхности клеток линии EA.hy 926 после их инкубации с сыворотками пациентов: отрицательный контроль-буфер PBS-BSA (─), пулированная сыворотка здоровых доноров IV группы крови (─) , сыворотка пациентки с физиологической беременностью (─), сыворотка пациентки с преэклампсией (─). Курсор М1 разделяет позитивные и негативные клетки 73 Рисунок 10. Результаты выявления мертвых клеток линии EA.hy 926 после инкубации с сывороткой. Отрицательный контроль-буфер PBS-BSA (─), пулированная сыворотка здоровых доноров IV группы крови (─) , сыворотка пациентки с физиологической беременностью (─), сыворотка пациентки с преэклампсией (─). Курсор М1 разделяет живые и мертвые клетки 1.2. Определение зоны эквивалентности концентраций антигенов и антител Использование различных методов для детекции АЭАТ не позволяет производить сравнения результатов, полученных в разных лабораториях. Исследователями рекомендуется проводить определение АЭАТ двумя разными методами: положительными по АЭАТ образцами рекомендуется считать образцы, в которых дважды было подтверждено наличие АЭАТ. Однако и такой подход не лишен недостатков, поскольку не учитывает влияние количества антител и антигена на результаты анализа и может приводить как к ложнопозитивным, так и ложнонегативным результатам. Существование зон эквивалентности концентраций иммунореактантов было отмечено во многих исследованиях. Так, выявление АЭАТ было возможно при количественном соответствии антигенного препарата из лизата клеток линии EA.hy 926, нормализованного по количеству белка, определенному титру тестируемой сыворотки [221]. При иммуноприципитации или вестернблотт анализе отмечается тот же эффект [222]. Использование в анализе 74 живых клеток имеет преимущество перед клеточным лизатом, поскольку исключает возможность детекции антинуклеарных антител и неспецифического связывания с антигенами мертвых клеток. С целью оптимизации выявления АЭАТ было проведено определение минимального титра сыворотки, при котором наблюдается максимальная активность связывания антител с антигенами клеток линии EA.hy 926. На рисунке 11 представлены результаты выявления АЭАТ на поверхности клеток линии EA.hy 926 после их инкубации с сывороткой крови в разведениях от 1:2 до 1:32. Рисунок 11. Зависимость доли клеток линии EA.hy 926 покрытых АЭАТ от разведения сыворотки Полученные данные свидетельствуют о выявлении в стандартной пулированной сыворотке здоровых доноров IV группы крови высокого показателя ПЦМ % IgM класса, сопоставимых по значению с ПЦМ% IgM класса, выявляемых у больных и здоровых беременных 75 пациенток. Этот факт может свидетельствовать, что этим методом мы способны выявлять естественные АЭАТ. Это согласуется с данными о присутствии естественных АЭАТ в крови здоровых пациентов, полученными другими исследователями [5, 6, 176]. Напротив, показатель ПЦМ% для антител IgG класса в пулированной сыворотке здоровых доноров имеет низкие значения при сравнении с позитивной сывороткой пациентки с преэклампсией, что может свидетельствовать о возможности детекции этим методом антител IgG класса, имеющих патогенетическое значение. Представленные результаты свидетельствуют, что разведения сыворотки 1:2 является оптимальным для исследования. Рисунок 12. Зависимость доли клеток линии EA.hy 926 покрытых АЭАТ от концентрации клеток в образце Исследование зависимости выявления АЭАТ от числа клеток в пробе показало, что оптимальной концентрацией клеток в образце является 20000 клеток, поскольку при данной концентрации наблюдается не только максимальное выявление АЭАТ (рисунок 12), но и минимальный процент 76 мертвых клеток, выявляемый после инкубации с контрольной сывороткой здоровых доноров (сыворотка АВ) (рисунок 13). Рисунок 13. Зависимость выявления мертвых клеток линии EA.hy 926 покрытых АЭАТ от концентрации клеток в образце Приведенные количественных данные свидетельствуют соотношений клеточных о выборе антигенов и оптимальных сывороточных антител, в которых выявляется максимальное количество АЭАТ. 1.3. Влияние температуры на результаты выявления антиэндотелиальных антител Ранее было показано, что при выявлении антител возможно получение ложнопозитивных и ложнонегативных результатов вследствие влияния различных факторов. Основными факторами, влияющими на выявление антител, являются: изменение антигенов при сшивке связывающими антителами с образованием кластеров - дискретных структур неправильной формы (пэтчей); перемещением и объединением пэтчей (кэппинг); агрегация иммунных комплексов вследствие связывания комплекса антиген-антитело 77 на клеточной поверхности поливалентными вторичными антителами; слущивание антигенов и агрегатов с поверхности клеток (шеддинг) [236]. Интенсивность этих процессов зависит от условий проведения анализа: температуры Существенно присутствие реакции, повышает концентрации процент гетерофильных клеток и антител ложно-позитивных антител и в образце. результатов ревматоидного фактора и в исследуемых образцах. Выявление антител разного типа: тепловых, детекция которых осуществляется при 37оС, и холодовых, детектируемых при 4оС описывается в многочисленных исследованиях. [236, 237, 238, 239, 240]. Эти антитела характеризуются разной кинетикой ассоциации/диссоциации комплекса антиген-антитело, и, следовательно, разной аффинностью и авидностью [236]. Температура инкубации влияет также на процессы образования агрегатов Аг-Ат на клеточной поверхности и шеддинг, что может существенно менять результаты определения антител. Поэтому выбор и соблюдение температурного режима при выявлении антител может иметь решающее значение как для выявления АЭАТ, так и для снижения ложнопозитивных/негативных результатов. С целью выбора оптимального температурного режима для выявления АЭАТ было проведено исследование зависимости выявления АЭАТ от температуры инкубации реакции. Для этого измеряли количество АЭАТ (АЭАТ-позитивная сыворотка пациентки с ПЭ), связывающихся с мембраной эндотелиальных клеток линии EA.hy 926 при 4оС, 23оС и 37оС методом ПЦМ (рисунок 14). Анализ температурных кривых показал, что при всех температурных режимах возможно выявление АЭАТ, при этом наблюдается нелинейный характер зависимости параметров ПЦМ% и времени. При исследовании влияния продолжительности инкубации АЭАТ-позитивной сыворотки на результаты выявления АЭАТ при 4оС и 37оС были обнаружены резкие флуктуации количества АЭАТ IgM и IgG классов. При этом если при 4оС 78 наблюдался высокий показатель ПЦМ%, то при 37оС этот показатель был значительно ниже (рисунок 14). Как известно, понижение температуры препятствует агрегации и шеддингу комплексов антиген-антитело на поверхности плазматической мембраны клетки [236]. Этим может объясняться низкий показатель ПЦМ% обнаруженный при 37оС. Нельзя также исключить, что при 37оС клетки более чувствительны к экспериментальным манипуляциям (отмыванию от сыворотки и вторичных антител), что способствует шеддингу поверхностных иммунных комплексов. Рисунок 14. Влияние продолжительности инкубации клеток линии EA.hy 926 с позитивной сывороткой на результаты выявления АЭАТ при разных температурных режимах (при 4оС, 23оС и 37оС). На графике представлены типичные результаты анализа сыворотки Также оценивался процент мертвых клеток после связывания АЭАТ с клетками линии EA.hy 926 при разных температурных режимах. Обнаружен высокий процент мертвых клеток при температуре инкубации 37оС (рисунок 15). 79 Рисунок 15. Влияние продолжительности инкубации АЭАТ-позитивной сыворотки на выявление мертвых клеток линии EA.hy 926 при разных температурных режимах (при 4оС, 23оС и 37оС). На графике представлены типичные результаты анализа сыворотки Резюме Полученные результаты свидетельствуют о значительных флуктуациях количества АЭАТ, выявляемых на клетках линии EA.hy 926 при разных температурных режимах инкубационной смеси. При этом максимальное значение ПЦМ% и минимальные флуктуации наблюдаются при 23оС, что позволяет выбрать данный режим как оптимальный. При 4оС наблюдались резкие временные флуктуации количества холодовых АЭАТ. Минимальное значение ПЦМ% выявлено при 37оС, что предположительно связано с усилением процессов шеддинга и агрегации комплексов Аг-Ат на клеточной поверхности. 80 ГЛАВА АКТИВАЦИИ 4. ВЫЯВЛЕНИЕ ПРИ МАРКЕРОВ НОРМАЛЬНОЙ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ И ОСЛОЖНЕННОЙ ПРЕЭКЛАМПСИЕЙ БЕРЕМЕННОСТИ Известно, что активация/дисфункция эндотелия, являющаяся следствием СВО, сопровождается появлением в крови комплекса гуморальных факторов, отражающих активацию механизмов врожденного и адаптивного иммунного ответа. Наиболее перспективными маркерами, которые свидетельствуют об активационном статусе эндотелиальных клеток, являются растворимые формы МКА, циркулирующие в крови длительное время, не зависящие, в отличие от цитокинов, от суточных и циркадных ритмов, и успешно используемые в диагностике и прогнозе воспалительных, сердечнососудистых и онкологических заболеваний [44, 241, 242]. Потенциальное клиническое и диагностическое значение имеют АЭАТ, которые могут проявлять целый спектр воздействий на эндотелиальные клетки [130, 243]. Однако на сегодняшний день существуют противоречивые данные о значении МКА и АЭАТ при беременности и ПЭ, в частности. Мы предполагаем, что эти противоречия связаны с различными временными интервалами беременности, на которых анализировались данные показатели, а также клиническими особенностями когорт, анализируемых в исследованиях. Поэтому на данном этапе целью исследования явилось изучение содержания гуморальных факторов на разных интервалах беременности, а также их взаимосвязи. 4.1. Выявление антител к эндотелиальным клеткам (АЭАТ) при физиологической беременности и беременности, осложненной ПЭ Выявление АЭАТ осуществлялось по методике, описанной в разделе “Материалы и методы”. Исследование АЭАТ проводилось у пациенток в I, II и III триместрах беременности, а также на сроках: 8-13; 14-20; 21-26; 27-31; 32-36; 37-41 неделя беременности, в соответствии с дизайном исследования. 81 На рисунке 16 представлены результаты выявления АЭАТ. При физиологической беременности для АЭАТ представленных иммуноглобулинами класса М (АЭАТ IgM) обнаружено значимое снижение активности связывания антител (ПЦМ%) после инкубации с сыворотками пациенток І-го (87,1±8,1%) и II-го (52,1±34,1%) триместров беременности р=0,032. К ІІІ триместру показатель связывания повышается до 75,2±17,4%, не достигая статистически значимых различий р=0,125. В основной группе не обнаружено значимых отличий в активности связывания АЭАТ IgM у пациентов в разных триместрах беременности. Межгрупповое сравнение показало значимые различия в активности связывания АЭАТ IgM во ІІ триместре беременности (91,2±4,5% в основной группе и 52,1±34,1% в группе сравнения, р=0,015) (рисунок 16 А). Для АЭАТ, представленных Ig класса G (АЭАТ IgG) не выявлено достоверно значимых различий при анализе активности связывания антител, после инкубации эндотелия с сыворотками пациенток с ПЭ и условно здоровых беременных (рисунок 16 Б). Рисунок 16. Процент клеток линии EA.hy 926 связывающих АЭАТ IgМ (А) и АЭАТ IgG (Б) у пациенток с физиологическим течением беременности и пациенток с преэклампсией на разных сроках беременности синие столбцы - группа сравнения; красные столбцы - основная группа. * отличия от значений I триместра; ● - отличия между основной группой и группой сравнения (р<0,05) 82 При анализе результатов учитывался также процент мертвых клеток (МК%), детектируемых после взаимодействия с сывороткой крови здоровых пациенток и пациенток с ПЭ. При сравнении между группами, была выявлена значимая разница для МК% у пациенток ІІ триместра: в основной группе значение показателя составило 5,5±2,7%,в группе сравнения 1,7±1,7%; р=0,004) (рисунок 17 А). Анализ МК%, определяемого на разных сроках беременности после инкубации клеток с сывороткой не показал значимых различий в обеих группах между сроками, так и между группами (рисунок 17 Б). Рисунок 17. Мертвые клетки, детектируемые после инкубации сыворотки периферической крови с клетками линии EA.hy 926 у пациенток с физиологическим течением беременности и пациенток с преэклампсией на разных сроках беременности синие столбцы - группа сравнения; красные столбцы - основная группа. ● - отличия между основной группой и группой сравнения, (р<0,05) При исследовании активности связывания АЭАТ IgМ в динамике на разных сроках беременности, в обеих группах, обращает на себя внимание разная направленность изменения активности связывания со второй точки исследования (рисунок 18А.). Так, в группе сравнения наблюдается снижение значений от 87,1±8,1% до 48,5±34,9% в первой и третьей точке соответственно, с повышением к конечному сроку наблюдения 74,4±18,2%, 83 р>0,05. В основной группе значения активности связывания растут, достигая максимума в срок 21-26 недель (93,6±2,1%) против первой точки (80,0±15,4%, р>0,05); далее значения показателя падают, значимо различаясь с максимумом на сроках 27-31 неделя (74,8±13,6%, р=0,01), 32-36 недель (57,1±26,6, р=0,01) и 36-41 неделя (69,6±10,9%, р<0,0001). При межгрупповом сравнении значимо повышенные значения активности связывания АЭАТ IgM отмечены в основной группе на сроке 21-26 недель р=0,005). Рисунок 18. Динамика активности связывания АЭАТ с клетками линии EA.hy 926 у пациенток с физиологическим течением беременности и пациенток с преэклампсией в разные интервалы беременности ▲- группа сравнения; ■ –основная группа. А – АЭАТ IgM; Б – АЭАТ IgG. ■ – отличия от значений на сроке 21-26 недель; ● – отличия от значений на сроке 32-36 недель; ● - отличия между основной группой и группой сравнения на соответствующие сроки беременности. (р<0,05). Аналогично, изучение динамики активности связывания АЭАТ(IgG) показало отсутствие значимых отличий в активности связывания в группе сравнения. В основной группе обнаружены значимые отличия в последней точке исследования (значение составило 8,2±4,2%) против срока 21-26 неделя (3,6±2,9%, р=0,048), и 32-36 недель (4,5±3,6%, р=0,043). Значимых различий между группами на одинаковых сроках беременности в активности связывания АЭАТ(IgG) обнаружено не было (рисунок 18 Б). Для более детальной характеристики различия между группами был проведен анализ количества антител связанных с клеткой в разные сроки 84 физиологической и осложненной беременности. Обнаружено, что количество антител АЭАТ(IgM), связанных с клеткой, в обеих группах имеет одинаковые тенденции изменения как по триместрам, так и по срокам, значимо снижаясь к концу беременности (рисунок 19). Так, в III триместре у пациенток обеих групп обнаружено уменьшение количества антител АЭАТ IgM, связанных с клеткой, по сравнению с I триместром: 58,7 ±24,72 уеф против 64,4±20,7 уеф 111,6±58,0 уеф, против р=0,016 115,6±49,9 уеф, в р=0,024 группе в сравнения основной и группе соответственно (рисунок 19 А ). При этом значимых межгрупповых различий обнаружено не было (р>0,05). Рисунок 19. А- Средняя интенсивность флуоресценции клеток линии EA.hy 926, связанных с АЭАТ IgM меченых флуоресцеин изотиоцианатом, измеренная у пациенток в разные триместры беременности; Б- динамика средней интенсивности флуоресценции клеток линии EA hy.926, связанных с АЭАТ IgM меченых флуоресцеин изотиоцианатом, измеренная у пациенток в разные интервалы беременности синий цвет - группа сравнения; красный цвет - основная группа. *- отличия от значений I триместра; *,* - отличия от срока 8-13 недель в соответствующей группе; ■ – отличия от значений на сроке 21-26 недель (р<0,05) Анализ количества антител АЭАТ IgM, связанных с клеткой, на разных сроках беременности подтвердил вышеописанные наблюдения: значимые различия наблюдались в основной группе на сроках 32-36 недель 85 (57,1±15,2 уеф) против первой точки наблюдения (115,6±49,9 уеф, р=0,003) и срока 21-26 недель (105,1±35,1 уеф, р=0,003). Значения показателя в последней точке исследования (70,2±24,5 уеф) были отличны от интервала 21-26 недель, р=0,041. В группе сравнения количество антител АЭАТ IgM связанных с клеткой также было ниже в конце беременности: 56,3±8,9 уеф, р=0,007 в 32-36 недель и 58,7±26,5 уеф, р=0,028 в 37-41 недель против первого срока 111,6±58,0 уеф (рисунок 19 Б). Рисунок 20. А- Средняя интенсивность флуоресценции клеток линии EA.hy 926, связанных с АЭАТ IgG меченых флуоресцеин изотиоцианатом, измеренная у пациенток в разные триместры беременности; Б- динамика средней интенсивности флуоресценции клеток линии EA hy.926, связанных с АЭАТ IgG меченых флуоресцеин изотиоцианатом, измеренная у пациенток в разные интервалы беременности синий цвет - группа сравнения; красный цвет - основная группа. (А)* - отличия от значений I триместра; * - отличия от значений II триместра (Б) ○ - отличия от значений на сроке 14-20 недель; ■■ – отличия от значений на сроке 21-26 недель в соответствующей группе. (А, Б) ●- отличия между основной группой и группой сравнения на соответствующие сроки беременности. (р<0,05). Анализ изменения количества антител АЭАТ IgG связанных с клеткой показал разные тенденции в группах: в группе сравнения значения показателя значимо снижались к III триместру до 15,6±5,5 уеф против I триместра 32,6±15,4 уеф; р=0,004 и II триместра 30,2±17,8 уеф; р=0,012. Значимые отличия между группами были выявлены в III триместре 86 беременности: 15,6±5,5 уеф в группе сравнения против 25,2±11,6 уеф в основной группе; р=0,004 (рисунок 20 А). Сравнение между сроками выявило значимое снижение количества антител АЭАТ IgG связанных с клеткой более чем в два раза против всех сроков до 31 недели (р≤ 0,021) к последней точке исследования. В основной группе не было выявлено значимых различий в значениях количества антител АЭАТ IgG связанных с клеткой между триместрами. Более выраженными оказались различия между сроками: наблюдалось снижение количества антител АЭАТ IgG связанных с клеткой с 27,3±8,6 уеф на первом сроке до 16,1±3,9 уеф, р=0,027 к 21-26 неделям и далее повышение к 37-41 неделе 27,5±6,5 уеф, р=0,017. Межгрупповые различия выявлены в 21-26 недель (34,2±21,3 уеф в группе сравнения против 16,1±3,9 уеф в основной группе, р=0,027) и в 37-41 недель (12,7±2,4 уеф и 27,5±6,5 уеф соответственно, р=0,001), причем в первом случае значение количества антител АЭАТ IgG связанных с клеткой в основной группе было меньше, чем в группе сравнения, во втором – наоборот (рисунок 20 Б). Изучение активности связывания АЭАТ с клетками линии ЕА.hy 926 на разных сроках и триместрах физиологической и осложненной беременности позволило выявить различия в результатах определения АЭАТ. Установлено, что во II триместре беременности наблюдаются значимо повышенные показатели активности связывания АЭАТ IgM и процента мертвых клеток при ПЭ, по сравнению с физиологической беременностью. При анализе данных показателей в разные сроки беременности установлено, что значимые различия, а также максимальное значение активности связывания АЭАТ IgM с клетками наблюдается в срок 21-26 недель беременности, что соответствует появлению клинических симптомов развития ранней ПЭ. Дополнительный анализ данных количества антител АЭАТ IgG связанных с клеткой дал неожиданные результаты. В срок 21-26 недель беременности обнаружено значимое повышение количества антител АЭАТ IgG связанных с клеткой в 2 раза у здоровых пациенток над больными, 87 однако общие данные по II триместру беременности, несмотря на наличие такой же тенденции не показали значимых различий. Напротив, количество антител АЭАТ IgG связанных с клеткой, измеренных в III триместре беременности было значимо выше у пациенток с ПЭ; аналогичный результат был получен в срок 37-41 неделя беременности, при том, что на двух предшествующих сроках, относящиеся также к III триместру не было выявлено значимых отличий. Однако, несмотря на наличие значимых отличий в показателях, характеризующих связывание АЭАТ обоих классов между исследуемыми группами, сделать вывод о характере изменения показателей в течение беременности достаточно сложно. Значительные флуктуации в связывании АЭАТ клетками выявляют определенные тенденции, которые могут не найти подтверждения на более репрезентативных выборках. В целом, анализируя данные, можно предположить, что снижение активности связывания АЭАТ(IgM) клетками, наряду с увеличением количества антител АЭАТ IgG связанных с клеткой, и значимо низком проценте мертвых клеток у пациенток с физиологической беременностью во II триместре может быть защитным механизмом, поскольку в литературе описаны примеры протективного действия естественных АЭАТ на эндотелиальные клетки [6, 175, 176]. Полученные результаты позволяют предполагать участие АЭАТ в патогенезе ПЭ, а также их потенциальную диагностическую ценность в клинической практике. 4.2. Изменение содержания растворимых форм МКА в различные сроки гестационного периода Известно, следствием что экспрессия активации, взаимодействия с МКА развивающейся АЭАТ и клетками при характеризует эндотелия СВО, или является результатом провоспалительный и “проадгезивный” фенотип эндотелиальных клеток [161, 243]. Одним из 88 признаков эндотелиальной активации является появление в циркуляции растворимых форм МКА [95, 128]. Данный раздел исследования посвящен изучению растворимых форм МКА в крови пациенток при физиологической беременности и осложненной ПЭ в те же сроки гестационного периода, в которые проводилось выявление АЭАТ. Результаты изменения содержания МКА (sE-селектина, sL-селектина, sICAM-1 и sVCAM-1) в крови пациенток с физиологической и осложненной ПЭ беременностью в разные триместры представлены на рисунке 21. Рисунок 21. Содержание МКА семейства селектинов в сыворотке крови пациенток с физиологическим течением беременности и пациенток с беременностью, осложненной преэклампсией в разные триместры беременности. А – sE-селектин; Б – sL-селектин синие столбцы - группа сравнения; красные столбцы - основная группа. * - отличия от значений I триместра (р<0,045); * - отличия от значений II триместра (р≤ 0,041);● - отличия между основной группой и группой сравнения (р≤ 0,02) Обнаружено, что содержание sE-селектина (рисунок 21 А) на протяжении беременности не имеет значимо достоверных различий при сравнении как между основной группой и группой сравнения, так и внутри групп. Характер изменений для sL-селектина имеет другие закономерности (рисунок 21 Б). Так, при физиологической беременности наблюдается значимое снижение содержания к третьему триместру до 875,2±153,3 нг/мл по сравнению с первым 1079,5±244,0 нг/мл, р=0,03 и вторым 1054,1±261,0 89 нг/мл, р=0,006. Похожий характер наблюдается и при ПЭ: максимальное значение в первом триместре 1137,0±345,6 нг/мл значимо снижается до 781,2±139,1 нг/мл, р=0,02 ко второму, и 670,7±180,0 нг/мл р=0,002 к третьему триместрам беременности. Межгрупповое сравнение выявило значимые различия во втором (р=0,002) и третьем (р=0,001) триместрах. Неожиданным результатом оказались сниженные значения показателя в основной группе при сопоставлении с группой сравнения во втором и третьем триместрах беременности. Рисунок 22. Содержание МКА иммуноглобулинового суперсемейства в сыворотке крови пациенток с физиологическим течением беременности и пациенток с беременностью, осложненной преэклампсией в разные триместры беременности. А - sVCAM-1; Б - sICAM-1 синие столбцы - группа сравнения; красные столбцы основная группа. * - отличия от значений I триместра достоверны (р<0,045); * - отличия от значений II триместра (р≤ 0,041);● - отличия между основной группой и группой сравнения (р≤ 0,02) Напротив, содержание sICAM-1 и sVCAM-1 значимо возрастает в третьем триместре физиологической беременности до 463,5±99,6 нг/мл и 172,2±42,5 нг/мл, по сравнению со вторым триместром 319,3±100,6 нг/мл (р=0,002) и 134,8±30,3 нг/мл (р=0,003) соответственно (рисунок 22). Внутригрупповое сравнение у пациенток с ПЭ показало, что к третьему триместру значимо снижается содержание sICAM-1 до 448,4±129,1 нг/мл по 90 сравнению с первым (671,3±221,0 нг/мл, р=0,041) и вторым (563,9±147,3 нг/мл, р=0,028) триместрами беременности. При анализе изменений sICAM-1 и sVCAM-1 обнаруживаются значимые различия между основной группой и группой сравнения в первом (р=0,009) и втором (р=0,001) триместрах для sICAM-1 и втором (р=0,003) и третьем (р=0,016) триместрах беременности для sVCAM- (рисунок 22 А и Б). При изучении динамики растворимых форм МКА на сроках: 8-13, 14-20, 21-26, 27-31, 32-36 и 37-41 неделя беременности отмечаются следующие закономерности (рисунки 23 и 24). При физиологической беременности содержание sE-селектина варьирует незначительно, повышаясь к концу беременности. Значимые отличия в содержании показателя отмечаются на сроке 37-41 неделя по сравнению с сроком 32-36 недель (р=0,026). При ПЭ, напротив, отмечаются резкие колебания содержания sE-селектина, с минимальным падением к последнему сроку (р≤ 0,02). Достоверно значимые различия между основной группой и группой сравнения наблюдаются на последнем сроке (6,3±0,5 нг/мл и 17,7±8,3 нг/мл) соответственно, р=0,003 (рисунок 23 А). Динамика изменения sL-селектина в исследуемых группах имеет значительные различия (рисунок 23 Б). При физиологической беременности максимальные значения отмечены на сроке 14-20 недель (1155,8±322,0 нг/мл) с постепенным снижением к сроку 32-36 недель (845,6±113,5 нг/мл, р=0,049) и 37-41 неделя (875,2±104,3 нг/мл, р=0,007). При ПЭ, напротив, с максимальных значений в 8-13 недель (1079,5±244,0 нг/мл) показатель значимо падает (760,7±114,5 нг/мл) в 14-20 недель, р=0,037, достигая минимума в срок 32-36 недель (611,4±143,1 нг/мл, р=0,002) с повышением к концу беременности. Межгрупповые различия значимо выражены в 14-20 недель (р=0,042), 21-26 недель (р=0,012) и 27-31 неделя (р=0,039). При этом обращает на себя внимание более высокая концентрация изучаемой молекулы в группе сравнения (рисунок 23 Б). 91 Рисунок 23. Динамика содержания МКА семейства селектинов в сыворотке крови пациенток с физиологическим течением беременности и пациенток с беременностью, осложненной преэклампсией. А – sE-селектин; Б – sL-селектин ▲- МКА при физиологической беременности (группа сравнения); ■ – МКА при преэклампсии (основная группа). * - отличия от значений на сроке 8-13 недель; ■ – отличия от значений на сроке 21-26 недель; # - отличия от значений на сроке 27-31 неделя; ●● – отличия от значений на сроке 32-36 недель в соответствующей группе; ●- отличия между основной группой и группой сравнения на соответствующие сроки беременности. (р< 0,05). Для МКА иммуноглобулинового суперсемейства наблюдается следующая картина. При физиологической беременности достоверно значимые отличия в содержании sVCAM-1 отмечены на сроках 32-36 недель (142,5±45,1 нг/мл), 37-41 неделя (173,4±36,8 нг/мл) при сравнении с 8-13 неделями (123,5±23,2 нг/мл) и 21-26 неделями (129,4±24,9 нг\мл), р<0,05). Динамика содержания sVCAM-1 при ПЭ, в целом, совпадает с тенденциями, выявленными при физиологической беременности, не различаясь статистически между отдельными сроками. Различия между группами сравнения и основной были значимы на сроке 21-26 недель и составили 129,4±24,9 нг/мл и 165,6±20,0 нг/мл, р=0,005, соответственно (рисунок 24 А). 92 Рисунок 24. Динамика содержания МКА иммуноглобулинового суперсемейства в сыворотке крови пациенток с физиологическим течением беременности и пациенток с беременностью, осложненной преэклампсией. А – sVCAM-1; Б – sICAM-1 ▲- МКА при физиологической беременности (группа сравнения); ■ – МКА при преэклампсии (основная группа). ** - отличия от значений на сроке 8-13 недель; ○○ - отличия от значений на сроке 14-20 недель; ■■ – отличия от значений на сроке 21-26 недель; # - отличия от значений на сроке 27-31 неделя достоверны; ●– отличия от значений на сроке 32-36 недель; ● - отличия между основной группой и группой сравнения на соответствующие сроки беременности. (р< 0,05). Содержание sICAM-1 после 26 недели физиологической беременности значимо повышается, составляя в 27-31 неделю 546,8±61,5 нг/мл, что достоверно выше при сравнении с 8-13 неделями (392,3±115,7 нг/мл, р=0,03), 14-20 неделями (291,7±160,9 нг/мл, р=0,009) и 21-27 неделями (320,2±95,6 нг/мл, р=0,001). Значимые различия сохраняются также на всех сроках до родов по сравнению с 14-20 неделями (р≤0,04). При сравнении групп между собой обнаруживаются значимо повышенные показатели для sVCAM-1 в основной группе на сроке 21-26 недель (р=0,005). Содержание sICAM-1 также значимо выше в основной группе против группы сравнения на сроках 8-13 (р=0,009), 14-20 (р=0,013), 21-26 (р=0,024). Напротив, на сроке 37-41 неделя значение в группе сравнения значимо превышают содержание sICAM-1 в основной группе (р=0,02) (рисунок 24 Б). 93 Результаты проведенного исследования согласуются с данными, полученными ранее другими исследователями, о том, что при ПЭ в материнской циркуляции наблюдается повышенное содержание растворимых форм МКА, отражающих эндотелиальную активацию и являющихся свидетельством осуществления адгезионного каскада, необходимого для развития иммунного ответа [44]. Как известно, гомеостатический воспалительный ответ, реализуемый организмом в виде защитно-рецептивного отклика на повреждение любого рода, характеризуется определенной динамикой гуморальных и клеточных гомеостатических систем, отражающей начало, пик и разрешение ответа. В идеализированной модели гомеостатического воспалительного ответа, происходит постепенное нарастание, а затем спад экспрессии МКА на клеточной поверхности. При этом появление растворимых форм МКА в биологических жидкостях значительно отложено по времени, по сравнению с экспрессией мембраносвязанных форм, но, в периоде разрешения воспалительного ответа, наблюдается одновременное снижение экспрессии и шеддинга МКА. закономерности Чрезмерный динамики воспалительный экспрессии и ответ имеет те же шеддинга МКА, однако характеризуется большей амплитудой изменения средних величин, что отличает его от гомеостатического ответа. Хроническое воспаление характеризуется перманентной экспрессией МКА клетками и, абберантным (сниженным) шеддингом молекул [244]. При изучении содержания растворимых форм МКА в разные периоды беременности установлено, что интерпретация результатов зависит от временного промежутка, в который проводился анализ содержания МКА. Наиболее ярким примером является сопоставление результатов анализа содержания sE-селектина: содержание молекулы в крови пациенток в норме и при патологии не имело значимых различий как внутри группы, так и между группами во всех триместрах беременности. Анализ результатов изменения содержания этой молекулы на разных сроках беременности показал наличие значимых отличий: как внутригрупповых, так и 94 межгрупповых, а также позволил выявить различия в динамике этой МКА при нормальной и осложненной ПЭ беременности. Подобный подход позволил также выявить принципиально различную динамику sL-селектина и sICAM-1 при беременности в норме и при патологии. У пациенток с ПЭ отмечается выраженный дисбаланс в продукции этих молекул, причем как в сторону повышения (sICAM-1), так и понижения (sL-селектин) по сравнению с нормой. На сегодняшний день накоплено большое количество противоречивых данных о МКА в крови при ПЭ. Так, несмотря на черезмерную активацию СВО и развитие эндотелиальной дисфункции, рядом исследователей отмечается отсутствие значимых отличий в содержании sICAM-1 и sVCAM-1 в крови, измеренных на сроке 11-14 недель [245], 34-38 недель и через 24 часа после родов [246]. Существуют также сообщения: с одной стороны, о наличии значимых различий в содержании МКА между пациентками с тяжелой ПЭ и физиологической беременностью в третьем триместре, но отсутствие таковых при сравнении обеих групп с ПЭ умеренной степени [91]. С другой стороны, в исследовании S-Y Kim и соавт. показано, что sVCAM-1, sICAM-1 и sE-селектин значимо выше при ПЭ, а уровень sVCAM-1 может также быть маркером степени тяжести ПЭ [97]. M.E. Chavarria и соавт. сообщили о значимо сниженном содержании sVICAM-1 и sL-селектина при ПЭ в 20 недель гестации [101]. Основными ограничениями исследований МКА в крови являются небольшие выборки пациентов [89, 90, 245, 246], разные гестационные сроки, в которые производилось определение МКА, ограниченное количество проспективных наблюдений. продольных Проведенные исследований проспективные с большим продольные количеством исследования продемонстрировали эффективность определения sICAM-1 и sVCAM-1 в крови пациенток на сроке 22-29 недель гестации [94, 247] и sE-селектина в 12-14 недель [248] для прогноза развития тяжелой ПЭ. 95 Как было сказано выше, полученные в настоящей работе результаты исследования изменений концентрации растворимых МКА в крови женщин при физиологической беременности не противоречат литературным данным [94, 97]. При физиологической беременности не выявляется драматических изменений в содержании МКА. Достоверные изменения в третьем триместре обусловлены закономерной активизацией процессов свертывания крови, активацией комплемента, ренин-ангиотензиновой системы, системной воспалительной реакции и изменением гормонального фона материнского организма, который готовится к родам. Декомпенсация систем, регулирующих вышеназванные процессы, может приводить к развитию ПЭ и других патологических состояний матери и плода в третьем триместре. Однако уже на ранних сроках беременности может наблюдаться развитие реакций, отклоняющихся от нормальных [87]. Подтверждением этому может служить обнаруженная в настоящем исследовании иная динамика растворимых форм МКА при ПЭ. Так, нами отмечено достоверно повышенное содержание в крови sICAM-1 уже на ранних сроках гестации (пациентки I триместра беременности, у которых далее развилась ПЭ). Уровень sICAM-1 в крови в І и ІІ триместрах беременности максимален, затем постепенно снижается до минимальных концентраций перед родами. По данным Соколова Д.И. [249], определение уровня sICAM-1 в І триместре может являться прогностическим для развития патологии беременности, что также согласуется с нашими данными. Содержание sVCAM-1 увеличивается до максимальных значений к началу ІІІ триместра, затем снижается к родам, как и содержание sE-селектина. Обнаруженные низкие значения sLселектина у пациенток с ПЭ свидетельствуют об абберантном шеддинге этой молекулы и хроническом воспалении. По литературным данным, присутствие sL-селектина в крови имеет протективный эффект, поскольку оказывает ингибирующее действие на контакт нейтрофилов с эндотелием [250]. Также, повышенный уровень sL-селектина в крови пациентов с сепсисом и сердечно-сосудистыми заболеваниями свидетельствует о хорошем прогнозе [244, 250, 251]. 96 Отличия в динамике содержания МКА при ПЭ, по сравнению с нормально протекающей беременностью, очевидно, связаны не только с высокой степенью эндотелиальной активации. Как известно, повышенный уровень sVCAM-1 в циркуляции первично отражает эндотелиальную активацию [252]. Однако, VCAM-1, также как и ICAM-1 экспрессируется на дендритных клетках, лимфоцитах и макрофагах и растворимые формы этих молекул появляются в циркуляции при активации иммунных эффекторных клеток [128]. Наблюдающиеся в ранние сроки беременности высокие концентрации МКА в крови, могут быть связаны с активацией иммунокомпетентных клеток в ответ на развитие полуаллогенного плода [253]. Однако при нормальной имплантации и инвазии трофобласта выраженные признаки воспалительной реакции подавляются с сохранением определенного “воспалительного” фона, не нарушающего иммунный гомеостаз в целом. Так, например, повышение sVCAM-1 в крови может быть следствием интенсивной васкуляризации плаценты, поскольку имеются данные о появлении sVCAM-1 в супернатантах культур эндотелиальных клеток после стимуляции ангиогенеза цитокинами TNF-α, IL-1 и IL-13 [11]. Кроме этого, на мышиной модели спонтанных абортов было продемонстрировано, что определенные паттерны экспрессии МКА являются необходимыми для адекватных взаимодействий в фето-плацентарной системе для ограничения неконтролируемого рекрутинга активированных эффекторных клеток [254]. Поскольку в І триместре происходит интенсивная “сборка” и пространственная организация всех тканей, органов и систем плода, появление в кровотоке избыточного количества растворимых факторов может отражать как изменение фенотипа клеточной поверхности и интенсивное слущивание молекул, так и дезадаптацию систем, регулирующих эти процессы. Поэтому отклонения в содержании МКА, являющихся морфорегуляторными молекулами, могут сигнализировать о вероятности неблагополучного развития беременности [255]. Резюме 97 Полученные в данном исследовании результаты подтверждают развитие черезмерного воспалительного ответа при ПЭ, превосходящего гомеостатический. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о существенно ином функционировании гуморальных систем, связанных с воспалительным ответом и активацией эндотелия при ПЭ. 4.3. Изучение взаимосвязей между АЭАТ и растворимыми формами МКА в крови Существуют экспериментальные подтверждения того, что связывание АЭАТ с эндотелиальными клетками ведет к активации [159, 243], экспрессии МКА [161] и повышенной адгезии лейкоцитов к эндотелиальному монослою, предварительно обработанному цитокинами [174]. В последние годы появляются также данные об идентификации новых аутоантигенов – мишеней для АЭАТ, в списке которых, в частности, присутствует и молекула ICAM-1 [162], что позволяет нам высказать предположение о возможной взаимосвязи между появлением в циркуляции АЭАТ и растворимых форм МКА. Также было показано, что молекула ICAM-1 принимает участие во взаимодействии АПК с Т-клетками (формировании иммунологического синапса) [256]. Поэтому следующим этапом исследования явилось изучение наличия взаимосвязей между содержанием МКА и АЭАТ в крови у пациенток исследуемых групп в I, II и III триместрах беременности. 4.3.1.Корреляционные зависимости между изучаемыми показателями в I триместре Было установлено, что содержание в периферической крови беременных пациенток в I триместре молекулы sICAM-1 положительно коррелирует с содержанием sE - селектина (таблицы 6 и 7). То есть чем выше содержание в крови молекул sICAM-1, тем выше содержание sE-селектина в 98 крови пациенток в обеих групп. Обнаруженная коррелятивная взаимосвязь, вероятно, отражает необходимый уровень эндотелиальной активации, развивающейся вследствие провоспалительного фона, характерного для I триместра беременности и может свидетельствовать о возможном участии этих молекул в интенсивных межклеточных коммуникациях, значимых для беременности, но не связанных с развитием ПЭ. Таблица 6 Корреляционная зависимость между изучаемыми показателями у пациенток группы сравнения в I триместре беременности Корреляционные пары rs (по Спирмену) р-уровень СИФ АЭАТ(IgG) & МК% СИФ АЭАТ(IgG)& sE-селектин МК% & sE-селектин sICAM-1 & sE-селектин 0,867 0,782 0,829 0,622 0,002 0,008 0,042 0,031 У пациенток группы сравнения выявлена прямая высокая значимая корреляционная связь между содержанием sE-селектина и количеством антител АЭАТ IgG связанных с клеткой (СИФ АЭАТ IgG) – показателем, который может являться косвенным признаком количества рецепторов на поверхности клетки, взаимодействующих с антителами. Кроме этого, прямая значимая связь обнаружена также между содержанием sE-селектина и процентом мертвых клеток, выявляемых при инкубации сыворотки пациентов с эндотелиальными клетками. То есть, чем выше содержание sEселектина в крови пациентки с физиологической беременностью, тем большее количество АЭАТ класса IgG связывается с антигенами клеток линии ЕА.hy 926 и тем больше процент мертвых клеток, выявляемых при определении этих антител. Анализ этих корреляционных зависимостей позволяет предполагать, что, несмотря на отсутствие значимых различий в содержании sE-селектина в ранней беременности, как при межгрупповом, так и внутригрупповом сравнении, его концентрация в крови, вероятно, связана с 99 одной стороны, со способностью аутоантител взаимодействовать с клетками, с другой – с процессами гибели клеток. На основании полученных данных, однако, невозможно точно сказать, связаны ли эти процессы с цитотоксическими реакциями, или имеет место гибель клеток по механизму апоптоза. Нельзя также исключить возможность так называемого “физиологического клиренса” поврежденных клеток, поскольку в литературе описаны естественные АЭАТ, способные осуществлять эти функции. Подтверждением такого предположения является прямая корреляционная связь между количеством АЭАТ IgG связанных с клеткой и процентом мертвых клеток, выявляемых при контакте клеток с сывороткой пациенток высокая значимая корреляция. Таблица 7 Корреляционная зависимость между изучаемыми показателями у пациенток основной группы в I триместре беременности Корреляционные пары МК% & sVCAM-1 sICAM-1 & sE-селектин sICAM-1 & sVCAM-1 Выявленные в основной rs (по Спирмену) 0,821 0,833 0,714 группе р-уровень 0,023 0,010 0,047 корреляционные связи свидетельствуют о повышенном провоспалительном фоне, наблюдаемом с ранних сроков беременности у пациенток с ПЭ. Так, прямая корреляционная связь выявлена между содержанием sVCAM-1 и sICAM-1, что является вполне логичным для состояний, отличающихся от нормы, поскольку при черезмерном системном воспалительном ответе, наблюдается повышение экспрессии обеих молекул клетками эндотелия [128], и этот факт может свидетельствовать о развитии патологии. Сильная прямая корреляционная связь выявлена между содержанием sVCAM-1 и процентом мертвых клеток, что также может являться свидетельством значимости растворимых форм МКА в формировании патологии. 100 4.3.2.Корреляционные зависимости между изучаемыми показателями во II триместре У пациенток во II триместре в группе сравнения выявлена прямая корреляционная связь между содержанием sE-селектина и процентом мертвых клеток, детектируемых при взаимодействии клеток с сывороткой пациенток. То есть, чем выше содержание sE-селектина в циркуляции здоровых пациенток, тем выше процент мертвых клеток, образующихся при инкубации с сывороткой пациенток. Интересно отметить, что данная корреляционная связь была выявлена и в I триместре у пациенток с физиологической беременностью. Следует также отметить, что во II триместре у пациенток группы сравнения сохраняется взаимосвязь между количеством АЭАТ IgG, связанных с клеткой, и процентом мертвых клеток, выявляемых после воздействия сыворотки пациенток на эндотелиальные клетки, однако характер связи меняется на противоположный (таблица 8). Обращает на себя внимание также выявленная реципроктная взаимосвязь между содержанием sL-селектина и: sE-селектина в основной группе - средняя; и молекулы sVCAM-1 – в группе сравнения – умеренная (таблица 8,9). Таблица 8 Корреляционная зависимость между изучаемыми показателями у пациенток группы сравнения во II триместре беременности Корреляционные пары СИФ АЭАТ(IgM) & sICAM-1 СИФ АЭАТ(IgG) & МК% МК% & sE-селектин sVCAM-1 & sL-селектин rs (по Спирмену) 0,439 -0,650 0,615 -0,469 р-уровень 0,047 0,006 0,025 0,009 Умеренная прямая связь обнаружена между количеством АЭАТ IgМ, связанных с клеткой, и содержанием sICAM-1. Поскольку молекула sICAM-1 идентифицирована в качестве одной из антигенных мишеней для АЭАТ, в 101 частности при ревматоидном артрите [162], и ее присутствие в циркуляции отражает экспрессию на поверхности клетки [128], то, обнаруженная связь в данном случае может, вероятно, свидетельствовать о значимости этой молекулы и при физиологических состояниях. Таблица 9 Корреляционная зависимость между изучаемыми показателями у пациенток основной группы во II триместре беременности Корреляционные пары sE-селектин & sL-селектин 4.3.3.Корреляционные rs (по Спирмену) -0,669 зависимости между р-уровень 0,009 изучаемыми показателями в III триместре При анализе корреляционных взаимосвязей между изучаемыми показателями обращает на себя внимание факт наличия умеренной прямой связи между количеством АЭАТ IgМ и АЭАТ IgG связанных с клеткой у пациенток основной группы (высокая значимая корреляция) и группы сравнения (значимая корреляция) (таблица 10, 11). То есть в обеих группах показатели, характеризующие количество связавшихся с клетками антител обоих классов, находятся во взаимосвязи друг с другом. Интерпретация результатов взаимосвязи показателей значительно затрудняется из-за гетерогенного пула АЭАТ, которые могут быть представлены как регуляторными, так и патогенетически значимыми антителами. Таблица 10 Корреляционная зависимость между изучаемыми показателями у пациенток группы сравнения в III триместре беременности Корреляционные пары СИФ АЭАТ(IgM) & СИФ АЭАТ(IgG) sVCAM-1 & sL-селектин rs (по Спирмену) 0,345 0,350 р-уровень 0,045 0,018 Кроме общих закономерностей выявлены и частные: так, показана обратная коррелятивная связь между содержанием sE-селектина и количеством АЭАТ IgМ связанных с клеткой – средняя связь и количеством 102 АЭАТ IgG связанных с клеткой – сильная связь у пациенток основной группы. То есть чем выше содержание sE-селектина в циркуляции пациенток основной группы, тем меньше количество АЭАТ IgM и IgG классов, связывающихся с антигенами клеток линии ЕА.hy 926 (таблица 11). У пациенток группы сравнения обнаружена прямая умеренная связь между содержанием в циркуляции молекулы sL-cелектина и sVCAM-1 (таблица 10). Таблица 11 Корреляционная зависимость между изучаемыми показателями у пациенток основной группы в III триместре беременности Корреляционные пары СИФ АЭАТ(IgG) & sЕ-селектин СИФ АЭАТ(IgМ)& СИФ АЭАТ(IgG) СИФ АЭАТ(IgG) & sE-селектин rs (по Спирмену) -0,555 0,450 -0,703 р-уровень 0,039 0,004 0,005 Анализ корреляционных связей между исследуемыми показателями, характеризующими активацию эндотелиальных клеток, в интервалы, соответствующие трем триместрам беременности, выявил наличие как общих взаимосвязей в обеих группах, так и наличие связей, присущих либо физиологически протекающей беременности, либо осложненной ПЭ. Установлено, что в I триместре беременности наблюдаются прямые корреляционные связи между МКА у пациенток обеих групп, что, вероятно, отражает необходимый уровень активации клеток, соответствующий провоспалительному фону, необходимому для адекватных межклеточных контактов в ранней беременности. Выявлено, что высокий уровень sVCAM-1 в сыворотке пациенток основной группы может быть одним из факторов, связанных с цитотоксическим действием аутоантител на клетки, поскольку установлена его связь с процентом мертвых клеток, детектируемых после взаимодействия с антителами. Интересным фактом явилось наличие обратных корреляционных связей между содержанием растворимых форм МКА в обеих группах во 103 II триместре беременности. Объяснением этому может быть активация противовоспалительных механизмов в середине беременности в норме. Нами было установлено, что при физиологической беременности уровень sLселектина был значимо выше, чем при осложненной ПЭ. Как известно, экспрессия L-селектина отражает активацию лейкоцитов, а растворимая форма L-селектина в крови может быть как ингибитором лейкоцитарноэндотелиального взаимодействия, так и отражать степень лейкоцитарной активации [244, 250]. Подтверждением положительного эффекта sLселектина в циркуляции является его ингибирующее влияние на адгезию лейкоцитов к эндотелию в экспериментальных моделях [244], а также благоприятный прогноз при высоких концентрациях этой МКА у больных с сепсисом [250]. Высокий, по сравнению с патологией, уровень sL-селектина может быть связан со снижением уровня sVCAM-1 в крови при физиологической беременности, что, вероятно благоприятно сказывается на межклеточных коммуникациях. В основной группе реципроктная связь между sL-селектином и sЕ-селектином, может быть свидетельством зависимости низких значений концентрации sL-селектина при ПЭ, что имеет негативный прогноз при воспалительных состояниях, сопровождающихся эндотелиальной активацией, от высоких концентраций sЕ-селектина – маркера активации эндотелия. Выявленная в III триместре у пациенток обеих групп умеренная прямая связь между показателями, характеризующими количество антител обоих классов (АЭАТ IgM и IgG), связанных с клетками, указывает на значимость определения этих показателей в этом временном интервале, поскольку при сравнительном межгрупповом анализе также были выявлены достоверные различия в эти сроки. При анализе определенные взаимосвязей закономерности. В между показателями обнаружены группе сравнения III триместре в сохраняется взаимосвязь между содержанием sVCAM-1 и sL-селектина, однако характер связи меняется на обратный, что может указывать на 104 определенную роль этих молекул в гуморальной регуляции при физиологической беременности. Можно также отметить, что, несмотря на отсутствие значимых различий при межгрупповом сравнении для содержания sE-селектина, отмечается наличие взаимосвязи этой МКА с различными показателями гуморального иммунитета во всех триместрах у пациенток основной группы, что может являться свидетельством ее вовлечения в патологический процесс. Таким образом, выявленные взаимосвязи между содержанием растворимых форм МКА в крови и аутоантителами могут отражать значимость данного комплекса гуморальных факторов при нормальной беременности и развитии патологии. Резюме Однако выявленные в данном исследовании изменения гуморальных факторов при ПЭ не являются специфичными для этой патологии, поскольку исследуемые факторы отражают активацию эндотелиальных клеток, и их наличие свидетельствует о проявлении СВО, сопровождающего множество заболеваний. Поэтому следующим этапом исследования явился поиск детерминант, специфичных для развития ПЭ. 105 ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЯ В СТРУКТУРАХ ПЛАЦЕНТЫ ПРИ НОРМАЛЬНОЙ И ОСЛОЖНЕННОЙ ПРЕЭКЛАМПСИЕЙ БЕРЕМЕННОСТИ Поскольку ведущий патогенетический фактор развития ПЭ - плацентарная ишемия, которая является следствием нарушенных процессов инвазии клеток трофобласта в спиральные артерии и врожденных и приобретенных тромбофилий [257, 258], то изучение фенотипических особенностей структур плаценты в норме и при патологии может быть ключом для понимания молекулярных механизмов развития болезни. На сегодняшний день представлено несколько моделей, описывающих взаимодействие материнских и фетальных клеток, из которых наиболее распространенной является модель эндотелиальной мимикрии [259]. Альтернативой является модель лектин-углеводного взаимодействия [260, 261], которую подтверждают появившиеся в последнее время данные о гликозилировании α5β1 интегрина – ключевой молекулы, участвующей в межклеточных взаимодействиях [262, 263]. Показано также, что в основе процессов тромбообразования лежат адгезионные взаимодействия между эндотелием/субэндотелиальными структурами и клетками крови, с вовлечением, в дальнейшем, факторов свертывания и фибринолиза, которые обуславливают прогрессирование процесса. Адгезионные взаимодействия опосредуются не только белковыми, но и углеводными молекулами, чему существует множество подтверждений [44, 264]. Фактом, отражающим важную роль лектин-углеводных взаимодействий в процессах плацентации и ангиогенеза, является обнаружение разнообразных углеводсвязывающих белков и углеводных лигандов на клетках фетоплацентарной системы [265, 266, 267]. При исследовании углеводного профиля плаценты у пациенток с физиологической беременностью было показано, что все структуры плаценты (цито-, синцитиотрофобласт, строма, эндотелиальные клетки, клетки КащенкоХофбауэра, а также базальная мембрана эндотелиоцитов и клеток 106 трофобласта) несут разнообразные углеводные остатки в своем составе [268]. Изучение распределения гликанов в клетках плаценты у пациенток с гипертензивными расстройствами во время беременности, в том числе и при ПЭ, обнаружило, что патология характеризуется измененным профилем экспрессии углеводных фрагментов, обусловленным морфофункциональными нарушениями в тканевых структурах плаценты [269]. Однако, несмотря на имеющиеся исследования в этой области, на сегодняшний день отсутствуют данные о характеристике углеводного профиля плаценты при ПЭ в зависимости от степени тяжести заболевания. Поэтому следующим этапом исследования явилось изучение особенностей профиля гликозилирования в структурных элементах плаценты у пациенток с ПЭ разной степени тяжести. Материалом для изучения явились образцы ткани плаценты, а также анамнестические и клинические данные 24 женщин, поступивших в ФГБУ «НЦАГиП им В.И.Кулакова». Пациентки с ПЭ (n=16) составили основную группу исследования. В соответствии с клиническими данными основная группа была разделена на две подгруппы. Группу ПЭ-1 (n=10) были включены пациентки с умеренной ПЭ. Группу ПЭ-2 (n=6) составили пациентки с ПЭ тяжелой степени. Пациентки с физиологической беременностью составили группу сравнения (n=8). В ходе исследования углеводного профиля плаценты с помощью панели биотинилированных лектинов было отмечено, что во всех исследуемых группах окрашенный продукт реакции визуализировался в клетках эндотелия капилляров и синцитиотрофобласте терминальных ворсин, но с разной интенсивностью. При этом во всех исследованных группах интенсивность окрашивания в клетках эндотелия была выше, чем в синцитиотрофобласте (рисунок 25). Для более полной характеристики изменения углеводного фенотипа эндотелиоцитов и синцитиотрофобласта при тяжелой и умеренной ПЭ, нами были проведены внутригрупповые и межгрупповые сравнения. 107 Рисунок 25. Интенсивность окрашивания гликоконъюгатов в структурах плаценты у пациенток группы сравнения (А), группы ПЭ-1 (Б) и группы ПЭ-2 (В) *- отличия от значений оптической плотности в клетках эндотелия (Р< 0,05) При внутригрупповом анализе у пациенток группы сравнения было выявлено значимое увеличение окрашивания лектинами ECL, SNA, MAL II, VVL и UEA I клеток эндотелия капилляров по сравнению с синцитием (р<0,02) (рисунок 25 А). В образцах плаценты пациенток группы ПЭ-1 108 аналогичный результат наблюдался при окрашивании лектинами ECL, SNA, MAL II и UEA I (р<0,03). В группе ПЭ-2 эта закономерность была подтверждена только при окрашивании лектинами ECL и UEA I (р<0,035) (рисунок 25 В). В ткани плаценты пациенток группы ПЭ-2 имелась тенденция к повышению среднего значения уровня окрашивания лектином SNA в клетках эндотелия по сравнению с синцитием (36,4±1,9 усл. ед. и 32,4±3,3 усл. ед. соответственно, р=0,09). Следует также отметить, что при использовании лектина ConA не было выявлено значимых различий в интенсивности окрашивания клеток ни в одной из исследуемых групп (р > 0,6) (рисунок 25). Обнаружена также тенденция, свидетельствующая о повышении интенсивности окрашивания синцитиотрофобласта лектином ECL – 16,1±4,5 усл. ед. в группе ПЭ-2 и 8,3±1,5 усл. ед. в группе сравнения, р=0,061 (рисунок 25). При межгрупповом сравнении, было выявлено, что интенсивность окрашивания гликоконъюгатов, взаимодействующих с лектином SNA в клетках эндотелия ворсин была значимо выше в группе сравнения (37,9±1,8 усл. ед.) относительно группы ПЭ-1 (30,3±3,0 усл.ед), (р=0,036) (рисунок 26). Наряду с этим интенсивность окрашивания синцитиотрофобласта для SNA во всех исследуемых группах не имела значимых отличий (р ≥ 0,29) (рисунок 25). 109 Рисунок 26. Результаты окрашивания гликоконъюгатов в структурах плаценты лектином SNA. Микрофотографии гистохимического определения в ткани плаценты гликоконъюгатов. Окраска лектином с последующим докрашиванием препаратов гематоксилином (х 200). А – группа сравнения; Б – преэклампсия умеренной степени (ПЭ-1), В – преэклампсия тяжелой степени (ПЭ-2). Синцитиотрофобласт терминальных ворсин плаценты (1), эндотелий сосудов ворсин (2). Д – Гистограмма оптической плотности продукта гистохимического окрашивания в эндотелии сосудов ворсин у пациенток исследуемых групп. *- сравнение ПЭ-1 и группы сравнения; различия значимы при р< 0,05 Также, межгрупповое сравнение показало, что при окрашивании углеводных остатков в эндотелии ворсин плаценты лектином ConA значимые различия выявлялись в группе ПЭ-2 относительно группы сравнения (23,3 ±2,4 усл. ед. и 15,0±2,9 усл. ед. соответственно, р=0,037) (рисунок 27). Аналогичная тенденция прослеживается и при окрашивании лектином ConA синцитиотрофобласта (интенсивность окрашивания в группе ПЭ-2 составила 26,2±4,1 усл. ед. против 16,5±3,9 в группе сравнения, р=0,059)(рисунок 25). 110 Рисунок 27. Результаты окрашивания гликоконъюгатов в структурах плаценты лектином ConA. Микрофотографии гистохимического определения в ткани плаценты гликоконъюгатов. Окраска лектином с последующим докрашиванием препаратов гематоксилином (х 200). А – группа сравнения; Б – преэклампсия умеренной степени (ПЭ-1), В – преэклампсия тяжелой степени (ПЭ-2). Синцитиотрофобласт терминальных ворсин плаценты (1), эндотелий сосудов ворсин (2). Д – Гистограмма оптической плотности продукта гистохимического окрашивания в эндотелии сосудов ворсин у пациенток исследуемых групп. *- сравнение ПЭ-2 и группы сравнения; различия значимы при р< 0,05 Межгрупповое сравнение окрашивания лектином MAL II показало, что имеются значимые различия в интенсивности окрашенного продукта, визуализируемого в клетках эндотелия образцов ворсин плаценты у пациенток основной лектинсвязывающих группы. Так, гликоконъюгатов интенсивность в группе окрашивания ПЭ-2 составила 17,9±2,8 усл.ед, против образцов группы ПЭ-1 29,8±4,8 усл.ед.; р=0,042. В 111 группе сравнения значения составили 24,6±2,6 усл.ед., что не имело значимых отличий от значений в группах пациенток с ПЭ; р ≥ 0,25 (рисунок 28). Рисунок 28. Результаты окрашивания гликоконъюгатов в структурах плаценты лектином MAL II. Микрофотографии гистохимического определения в ткани плаценты гликоконъюгатов. Окраска лектином с последующим докрашиванием препаратов гематоксилином (х 200). А – группа сравнения; Б – преэклампсия умеренной степени (ПЭ-1), В – преэклампсия тяжелой степени (ПЭ-2). Синцитиотрофобласт терминальных ворсин плаценты (1), эндотелий сосудов ворсин (2). Д – Гистограмма оптической плотности продукта гистохимического окрашивания в эндотелии сосудов ворсин у пациенток исследуемых групп. *- сравнение ПЭ-2 и ПЭ-1; различия значимы при р< 0,05 Наиболее подробным исследованием углеводного профиля клеток плаценты у пациенток с физиологической беременностью была работа 112 Tatsuzuki A. и соавт., в которой было показано, что синцитиотрофобласт высокогликозилирован и углеводная часть представлена ацетилглюкозамин-содержащими гликоконъюгатами; окрашивались ConA. также лектином Клетки частично эндотелия N- клетки при этом окрашивались на фукозосодержащие гликаны и гликаны, содержащие сиаловую кислоту; в меньшей степени было отмечено присутствие маннозосодержащих гликанов [268]. Фукозосодержащие и маннозосодержащие гликаны были также идентифицированы в синцитии и эндотелии образцов нормальной плаценты в исследовании Marini M., 2011 и соавт. Те же исследователи идентифицировали 3’-сиалозиды в синцитиотрофобласте пациенток с физиологической беременностью [269]. Наши данные свидетельствуют об окрашивании эндотелиальных клеток и синцитиотрофобласта всеми использованными лектинами, но с различной интенсивностью, и позволяют предполагать, что гликокаликс синцитиотрофобласта и эндотелия близок по составу. Гликанами, преимущественно представленными в синцитиотрофобласте терминальных ворсин плаценты при физиологической беременности оказались 6’- и 3’ – сиалозиды, а окрашивание на фукозо-терминированные гликаны было выражено незначительно. Результаты, полученные для клеток эндотелия, практически совпадали с исследованием Tatsuzuki A., 2009: преимущественно углеводные цепи были представлены 6’-сиалозидами и фукозосодержащими структурными гликанами. компонентами Несмотря на эндотелиального то, что гликокаликса основными являются молекулы гиалуроновой кислоты, гепаран сульфата и сиаловой кислоты [270], обнаруженные фукозосодержащие гликаны могут быть экспонированы при воздействии провоспалительных цитокинов на клетки эндотелия при физиологическом системном воспалительном ответе, наблюдаемом при нормальной беременности [115]. Кроме этого, гликозилированными является большинство мембранных белков, в том числе рецептор трансферрина (CD71), экспрессируемый всеми делящимися клетками, в состав которого 113 входят цепи N-гликанов [271] и белков, ассоциированных с гликокаликсом (тромбомодулин, антитромбин III и ингибитор пути тканевого фактора) [113]. Эти факты подтверждают возможность детекции различных гликоконъюгатов в синцитиотрофобласте и эндотелии терминальных ворсин плаценты. Также, нами были отмечены значимо повышенные уровни окрашивания гликоконъюгатов всеми исследованными лектинами, исключая ConA, клеток эндотелия по сравнению с синцитиотрофобластом у всех пациенток с физиологической беременностью. Таким образом, полученные данные свидетельствуют синцитиотрофобласта о по сниженном сравнению уровне с гликозилирования эндотелиоцитами при физиологической беременности, а также преимущественной экспрессии углеводных остатков, несущих терминальную сиаловую кислоту, что при минимальном присутствии фукозосодержащих структур может являться одним из механизмов формирования иммунологической толерантности к плоду. Следует также отметить, что углеводный профиль структурных элементов плаценты изменяется в зависимости от степени тяжести заболевания. Так, было обнаружено, что при тяжелой ПЭ значимые различия в окрашивании синцития и эндотелия сохранялись только для лектинов ECL и UEA I, детектирующих терминальные остатки фукозы и бета-галактозы. ПЭ умеренной степени отличалась от группы сравнения отсутствием значимых различий в распределении остатков N-ацетилгалактозамина при сравнении клеток эндотелия и синцитиотрофобласта терминальных ворсин плаценты. Из представленных результатов видно, что менее выраженные различия в экспрессии гликанов клетками плаценты при тяжелой ПЭ обуславливаются снижением 3’-сиалозидов в клетках эндотелия; повышением 6’-сиалозидов в синцитии; а также повышением экспрессии фрагментов N-ацетилгалактозамина в составе гликанов как в синцитии так и в эндотелии по сравнению с физиологической беременностью. Поскольку эти 114 гликаны способны взаимодействовать с лектиновыми рецепторами, в частности лектинами С-типа, сиглеками и галектинами, которые широко распространены на клетках врожденного и адаптивного иммунитета, то возможно высказать предположение о потенциальной возможности для запуска эффекторных механизмов иммунной системы при ПЭ. Изучение различий в паттерне экспрессии гликоконъюгатов в плаценте в норме и при патологии показало, что при ПЭ установлено значимое снижение по сравнению с физиологической беременностью окрашивания гликоконъюгатов в клетках эндотелия ворсин плаценты лектинами SNA и MAL II при умеренной и тяжелой степени соответственно. Данные лектины окрашивают остатки терминальной сиаловой кислоты в составе N-гликанов комплексного типа. Как известно, рецепторами, взаимодействующими с терминальной сиаловой кислотой являются члены семейства сиглеков – белков, широко распространенных на лейкоцитах крови. Так, сиглек-1 (Sn) экспрессирован преимущественно на макрофагах, сиглек-2 (CD22) – на Вклетках. Сиглек-3(CD33) и СD-33-родственные сиглеки (сиглек-9 – селективно экспрессируемый миелоидными дендритными клетками и сиглек – 5 – экспрессируемый плазмоцитоидными клетками) являются ингибиторными рецепторами, поскольку внутриклеточный участок белка включает два ингибиторных мотива ITIM, вовлекаемые в клеточный сигналлинг и ингибирование клеточной активности [272]. В частности, наличие 6’-сиалозидов в составе мембранных гликопротеинов защищает Th2лимфоциты от апоптоза [273]. Кроме этого терминальная сиаловая кислота (в большей степени α2,6 сиаловая кислота) может выполнять функции маскирования антигенных детерминант; при десиалировании молекулы возможно механизмы экспонирование иммунной эпитопов, системы [264]. стимулирующих эффекторные Предполагается, что степень сиалирования играет решающую роль в регуляции процессов, связанных с иммунологической толерантностью и воспалением [273]. Поскольку при преэклампсии зафиксировано снижение содержания сиалозидов в клетках 115 эндотелия, то это может быть фактором, способствующим чрезмерной активации и апоптозу клеток. Также нами было показано, что ПЭ тяжелой степени характеризуется значимым повышением содержания (в 1,6 раз выше физиологической нормы) маннозосодержащих остатков в клетках эндотелия. Аналогичная тенденция отмечена также при детекции маннозосодержащих фрагментов и терминальных олиголактозаминовых фрагментов в составе N-гликанов комплексного типа в синцитиотрофобласте. Избыточная экспрессия маннозосодержащих гликанов может негативно сказываться на клетках, поскольку маннозосвязывающие рецепторы - CD207, CD209 и маннозный рецептор, способны распознавать остатки маннозы как патоген- ассоциированные молекулярные паттерны (ПАМП) [264]. Повышение экспрессии высокоманнозных и Galβ1- терминированных структур отмечается в экспериментах in vitro после обработки культуры клеток пупочной вены человека (HUVEC) цитокинами [274]. Энзиматическое отщепление или маскирование остатков маннозы лектинами ведет к значительному снижению адгезии моноцитов к монослою эндотелиальных клеток, что может свидетельствовать об участии этих структур в трансэндотелиальной миграции при воспалительном процессе [275]. Резюме Таким образом, углеводный профиль структурных элементов плаценты различен в норме и при ПЭ: наиболее выраженные различия выявлены при тяжелом течении заболевания. Полученные данные раскрывают возможную роль гликокаликса эндотелия и синцитиотрофобласта ворсин плаценты в патогенезе ПЭ и позволяют предполагать, что выявленные изменения углеводного фенотипа плаценты могут иметь отражение в гуморальном ответе - синтезе специфических антигликановых антител. 116 ГЛАВА 6. КОМПЛЕКСНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИТЕЛ ПРИ НОРМАЛЬНОЙ И ОСЛОЖНЕННОЙ ПРЕЭКЛАМПСИЕЙ БЕРЕМЕННОСТИ Межклеточные взаимодействия – формообразующие информационные – реализуются посредством: и формирования специализированных межклеточных контактов; воздействия растворимых молекул на соответствующие рецепторы по механизму сигнал-ответ; а также через взаимодействие макромолекул внеклеточного матрикса. В настоящее время доказано, что наряду с белок-белковым взаимодействием, углеводбелковое и углевод-углеводное взаимодействия лежат в основе и опосредует оба типа межклеточных взаимодействий. Примером этому служат адгезионные контакты, основанные на взаимном узнавании и прикреплении клеток при воспалении, метастазировании, микробной инвазии, эмбриогенезе, процессах рециркуляции клеток и так называемом феномене “хоминга”. Сигналинг, осуществляемый посредством углеводных лигандов, оказывает регуляторное воздействие на врожденный и адаптивный иммунитет, активируя, или ингибируя иммунные процессы. Ввиду межклеточных значительной сложности, взаимодействий in vivo, возникающей большинство при изучении исследований проводятся с использованием моделирования изучаемых процессов на животных, или на клеточных культурах in vitro. Более перспективным направлением является изучение дистантной (гуморальной) регуляции межклеточных взаимодействий, осуществляемой молекулами, которые находятся в биологических жидкостях организма, в том числе и в крови. При этом, в случае углевод-белкового взаимодействия, в пуле гуморальных факторов, возможно обнаружение как углеводов, так и углевод-связывающих белков (лектинов и антител). Возможности применения такого подхода существуют и в репродукции. В многочисленных исследованиях показано, что углеводные 117 лиганды (гликаны), а также их контр-рецепторы (лектины различных классов) широко распространены на клетках репродуктивной системы. В пуле гуморальных факторов биологических жидкостей организма показано присутствие углеводов, лектинов и антигликановых антител, функции которых в репродукции пока остаются не известными. Исходя из вышесказанного, актуальной задачей является исследование гуморальных факторов, в частности паттерна антител, генерация которых, как предполагается, связывается с сосудистым воспалением и тромбозами (антифосфолипидные антитела и антиэндотелиальные антитела), а также антигликановых антител, которые благодаря известной роли гликанбелкового взаимодействия в процессах межклеточного взаимодействия, могут быть значимы в патологии беременности, и ПЭ, в частности. 6.1. Определение иммуноглобулинов классов М и G в периферической крови пациенток в норме и при преэклампсии Уровень иммуноглобулинов в периферической крови пациенток определяли в соответствии с методом, описанным в разделе “Материалы и методы”. Было установлено, что обе исследуемые группы не имели значимых различий в содержании иммуноглобулинов классов М и G в периферической крови (таблица 12). Таблица 12 Содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови пациенток III триместра беременности в норме и при преэклампсии Класс антител Основная группа Группа сравнения р -уровень IgM (мг/л) 2,4±1,1 2,2±0,8 0,498 IgG (мг/л) 10,9±2,9 11,1±2,9 0,763 данные представлены как Me±MAD 6.2. Определение антифосфолипидных антител в периферической крови пациенток в норме и при преэклампсии 118 Антифосфолипидные антитела (АФА) определяли, как описано в разделе “Методы”. Были выявлены значимые различия между основной группой и группой сравнения по антителам к протромбину(IgM) и антителам к β2-гликопротеину-1(IgM) (таблица 13). Несмотря на наличие значимых различий между группами, установлено, что уровень АФА, измеренный в основной группе и группе сравнения не превышал нормативных значений, т.е. серонегативными по АФА были не только пациентки с физиологической беременностью, но и пациентки с ПЭ (таблица 13, 14). Таблица 13 Содержание антифосфолипидных антител класса М в сыворотке крови у пациенток III триместра беременности в норме и при преэклампсии Параметр Антитела к протромбину Антитела к β2гликопротеину-1 Антитела к аннексину V Антитела к кардиолипину Антитела к фосфатидилсерину Основная группа Группа сравнения р-уровень 0,9±0,5* 1,2±0,7 0,008 0,9±0,9* 1,6±1,1 0,003 2,0±1,3 1,8±0,8 0,596 0,9±0,5 1,1±0,7 0,378 0,9±0,4 1,4±0,8 0,224 данные представлены как Me±MAD Таблица 14 Содержание антифосфолипидных антител класса G в сыворотке крови у пациенток III триместра беременности в норме и при преэклампсии Параметр Антитела к протромбину Антитела к β2гликопротеину-1 Антитела к аннексину V Антитела к кардиолипину Антитела к фосфатидилсерину Основная группа Группа сравнения р-уровень 1,7±0,6 2,3±0,8 0,095 1,2±0,5 1,2±0,4 0,925 1,7±0,8 2,0±0,5 0,064 1,6±0,6 1,4±1,0 0,137 1,7±1,3 2,2±0,7 0,215 данные представлены как Me±MAD 119 6.3. Определение антиэндотелиальных антител в периферической крови пациенток в норме и при преэклампсии В исследуемых группах проводилось определение АЭАТ, поскольку наши предыдущие исследования (описанные в главе IV) позволили высказать предположение о возможном участии АЭАТ в патогенезе ПЭ. По данным литературы, известно, что у пациентов с АФС кроме АФА выявляются и АЭАТ, [159, 160] а также для этих групп аутоантител идентифицированы общие антигены (β2-гликопротеин-1 и аннексин II) [130, 224]. Комплексное исследование аутоантител при ПЭ позволит получить новые знания о функционировании гуморального иммунитета при беременности. Определение АЭАТ проводилось в соответствии с методом, описанным в разделе “Методы”. Для детальной характеристики каждого класса антител учитывались показатели: ПЦМ%; СИФ,уеф, медиана,уеф; мода,уеф (таблица 15). Таблица 15 Количественная характеристика АЭАТ, связывающихся с эндотелиальными клетками линии EA.hy 926 ПЦМ% класс антител IgM основная группа 89,4±12,9 группа сравнения 93,8±5,6 СИФ,уеф IgM 74,4±43,1 86,2±32,0 0,799 Медиана,уеф IgM 55,8±26,6 57,0±13,6 0,559 Мода,уеф IgM 52,0±26,7 57,0±16,3 0,387 ПЦМ% IgG 6,9±3,3 6,1±2,7 0,178 СИФ,уеф IgG 26,4±9,1 22,2±6,8 0,018 Медиана,уеф IgG 14,3±3,9 12,0±2,0 0,011 Мода,уеф IgG 14,5±5,2 11,0±1,5 0,022 параметр р-уровень 0,341 данные представлены как Me±MAD 6.4. Влияние гуморальных факторов периферической крови здоровых и больных пациенток на жизнеспособность клеток С целью выявления влияния гуморальных факторов периферической крови пациенток III триместра беременности на жизнеспособность эндотелиальных 120 клеток, было оценено количество мертвых клеток, после инкубации сыворотки пациенток с клетками линии EA.hy 926 (число мертвых клеток,%). Число мертвых клеток,% отражает процентное содержание клеток, меченных иодидом пропидия (рисунок 29). Рисунок 29. Количественная оценка числа мертвых клеток, выявляемых после инкубации сыворотки с клетками линии EA.hy 926 в норме и при преэклампсии *отличия между основной группой и группой сравнения; р=0,0001 Комплексное исследование аутоантител выявило ряд особенностей функционирования гуморального иммунитета при физиологической беременности и при беременности осложненной ПЭ. Во-первых, у пациенток обеих групп не было выявлено значимых различий по содержанию иммуноглобулинов классов M и G в периферической крови. Во- вторых, обнаружено, что все пациентки были серонегативны по АФА. В-третьих, у пациенток, включенных в исследование были выявлены антитела, связывающиеся с эндотелиальными клетками, а также выявлен значимо повышенный процент мертвых эндотелиальных клеток (МК%), определяемый после воздействия гуморальных факторов сыворотки крови 121 больных пациенток на клетки, что свидетельствует о наличии у больных пациенток факторов, оказывающих цитотоксическое действие на клетки эндотелия. Обнаруженная в данном исследовании повышенная, по сравнению с нормой, активность связывания АЭАТ(IgG) с эндотелиальными клетками, являются, вероятно, результатом эндотелиальной активации, наблюдаемой при ПЭ. Как свидетельствуют полученные результаты, у здоровых и больных пациенток выявлена высокая активность связывания АЭАТ(IgM) с клетками, однако значимые различия между группами выявлены только для АЭАТ(IgG) при относительно невысоких (по сравнению с АЭАТ(IgM); p<0,01) характеристиках активности связывания антител. Это, вероятно, объясняется гетерогенностью АЭАТ, поскольку антигенные детерминанты для связывания с антителами на эндотелии до конца не охарактеризованы, список антигенов, взаимодействующих с АЭАТ, постоянно пополняется [224, 276]. Под гетерогенностью АЭАТ подразумевают не только связывание с разными антигенными мишенями, но и функциональную гетерогенность. Например, при исследовании АЭАТ-позитивных образцов от пациентов с аутоиммунными васкулитами были выявлены четыре функциональные профиля АЭАТ: первый-характеризовался как активацией, так и апоптозом эндотелиальных клеток; второй-только активацией; третий-только апоптозом; четвертый – несмотря на связывание АЭАТ с клетками не наблюдалось апоптоза и изменения фенотипа [169]. В связи с этим, мы предполагаем, что АЭАТ выполняют разные функции у больных и здоровых пациентов. Резюме Таким образом, обнаружено, что у пациенток с ПЭ, при отсутствии значимых различий по ряду маркеров, различия по которым были установлены ранее в других исследованиях, выявлены АЭАТ, а также показано цитотоксическое действие факторов крови на эндотелиальные клетки. 122 Следующим этапом исследования явилось выявление антигликановых антител у пациенток при нормальной и осложненной ПЭ беременности. 6.5. Определение антигликановых антител в периферической крови пациенток в норме и при преэклампсии Для определения антигликановых антител (АГАТ) в периферической крови пациенток гликочипы инкубировали с исследуемыми сыворотками как описано в разделе “Методы”, после чего проявляли связавшиеся с гликанами антитела флуоресцентно меченными вторичными антителами. Для каждого пациента рассчитывались значения медианы интенсивности флуоресценции – отражающей уровень антител в крови, выраженный в относительных единицах (уеф). 6.5.1. Определение разнообразия гликанов узнаваемых антителами у пациенток в норме и при преэклампсии По результатам проведенных тестов оказалось, что в случае здоровых беременных около трети всех гликанов чипа достоверно связываются с сывороточными Ig (как IgG, так и IgM). В случае беременных с ПЭ репертуар антигликановых антител шире: около половины всех исследуемых гликанов связываются с Ig (оба класса) (рисунок 30). Таким образом, у пациенток с ПЭ наблюдается более интенсивный гуморальный ответ на углеводные антигены, чем у пациенток с Количество гликанов, связывающихся с иммуноглобулинами физиологической беременностью. 250 200 150 100 50 0 IgG здоровые IgM здоровые IgG преэклампсия IgM преэклампсия Рисунок 30. Количество гликанов, связывающихся с иммуноглобулинами G и M у здоровых беременных и больных преэклампсией 123 6.5.2. Спектр антител к гликанам у пациенток с физиологической беременностью и преэклампсией Анализ первичных данных, полученных после инкубации гликочипов с исследуемыми сыворотками, показал, что из 233 гликанов, нанесенных на гликочип, были выбраны гликаны, с которыми связывание АГАТ (IgG) было значимым, при сравнении здоровых пациенток и пациенток с ПЭ. Структуры гликанов были сгруппированы по признакам структурного/функционального родства и представлены далее. 6.5.2.1. Антитела к гиалуроновой кислотe Гиалуроновая кислота (ГК) по химическому строению относится к линейным, несульфатированным гликозаминогликанам, и является одним из основных компонентов ВКМ, в том числе и эндотелиального гликокаликса. Структурной единицей ГК являются повторяющиеся мономеры, состоящие из остатков D-глюкуроновой кислоты и N-ацетилглюкозамина (рисунок 31). Число мономерных звеньев, формирующих молекулу, обуславливает молекулярную массу полисахарида. Рисунок 31. Химическое строение гиалуроновой кислоты 124 Как известно, ГК обнаруживается во внутриклеточных компартментах, а также локализуется на поверхности клеток, перицеллюлярном и экстрацеллюлярном матриксе, Значительные ее количества обнаруживаются в тканях с высоким пролиферативным потенциалом и инвазирующей способностью [277]. Полученные результаты свидетельствуют, что у пациенток основной группы наблюдается значимо высокий уровень АГАТ, связывающих как ГК – медианы интенсивностей сигалов составляли 6213±4520 уеф; р=0,0027, так и ее структурный дисахаридный компонент (3196±2494 уеф); р=0,0022. В группе сравнения значения медианы составляли 2937±2256 уеф и 1524±1010 уеф соответственно (рисунок 32). Рисунок 32. Специфическое связывание АГАТ (IgG) с гликанами внеклеточного матрикса, иммобилизованными на чипе синие столбцы - группа сравнения; красные столбцы - основная группа, * - отличия от группы сравнения; р<0,01 GlcAβ1-3GlcNAcβ - структурный дисахаридный компонент гиалуроновой кислоты [GlcAβ1-3GlcNAβ1-4]n – гиалуроновая кислота Несмотря на то, что ГК и ее рецепторы достаточно изучены как в норме, так и при различных патологических состояниях в организме [115, 116, 278, 279], об антителах к ГК существуют единичные сообщения [30, 125 280]. Как известно, у здоровых людей ГК присутствует в лимфе (40-55 мкг/мл) и крови (10-100 мкг/л) [281, 282, 283], при патологии отмечается повышение ГК в биологических жидкостях [279, 284, 285, 286]. Имеются данные о повышенном содержании ГК в крови пациенток с ПЭ [287, 288] и HELLP-синдромом [121]. Повышение ГК в циркуляции предполагает поступление ее в лимфатические узлы, контакт с антигенпрезентирующими клетками и, соответственно, возможность осуществления гуморального ответа на аутоантиген [289]. Интенсивность гуморального ответа при ПЭ может быть значительно повышена, т.к. в условиях черезмерного СВО происходит слущивание клеток синцитиотрофобласта и поступление клеточного дебриса в кровь матери, что является фактором усиления СВО, а также провокации аутоиммунного ответа, поскольку клеточный дебрис и субклеточные частицы трофобласта могут выступать в качестве адъювата для аутоантигенов матери [290, 291]. Источник ГК в крови при ПЭ не ясен предполагается, что ГК в крови появляется как в результате дисфункции эндотелия матери [121], так и источником ГК может быть плацента [287, 292]. При воспалительном образованием продуктов ответе разного ГК подвергается молекулярного деградации веса с [293]. Высокополимерные фрагменты ГК и короткие полисахариды-фрагменты ГК имеют различный высокополимерные иммуносупрессивное, биологический фрагменты эффект ГК анти-ангиогенное в организме. (ВМВ-ГК), действие, Большие проявляют препятствуют дифференцировке клеток; вероятно, также их участие в ингибировании межклеточных контактов и лиганд-рецепторного взаимодействия. Появление мелких фрагментов ГК (НМВ-ГК) служит эндогенными “сигналами опасности” для организма и оказывают про-воспалительный, иммуностимулирующий, ангиогенный эффекты и позитивно регулируют миграционные свойства клеток [293, 294, 295, 296]. При физиологических 126 условиях преобладающей фракцией является ВМВ-ГК, при воспалительном ответе и тканевом повреждении – НМВ-ГК [296]. Экспрессия ГК и ее рецепторов показана в различных структурах плаценты, а также клетках фетального и материнского происхождения. Так, на децидуальных клетках, лимфоцитах, локализованных в области децидуа базалис, клеточных элементах стромы эндометрия при физиологической беременности обнаружена экспрессия рецептора CD44 [297]. Клетки инвазивного вневорсинчатого трофобласта экспрессируют CD44 в первой половине беременности. Увеличение экспрессии CD44 позитивно влияет на инвазивные свойства клеток трофобласта в матригеле, причем ВМВ-ГК ингибирует CD44-опосредованную инвазию, в НМВ-ГК, напротив, усиливает [298]. В исследованиях R,Zhu et al, было показано, что экспрессия ГК и HAS2-гиалуронатсинтазы клетками трофобласта при физиологической беременности были выше, по сравнению с выкидышами ранних сроков, что подтверждает участие ГК в морфогенезе плаценты. Однако существуют исследования, свидетельствующие об обратном эффекте. Так, анализ влияния ГК разного молекулярного веса на инвазию клеток трофобласта в матригеле показал, что ВМВ-ГК усиливает пролиферацию и инвазивные свойства трофобласта, ингибирует апоптоз и активирует PI3K/AKT и MAPK/ERK1/2 сигнальные пути в клетках трофобласта, а НМВ-ГК не оказывает такого эффекта. Блокирование PI3K/AKT или MAPK/ERK1/2 сигналлинга ингибирует ГК-зависимую пролиферацию и инвазивные свойства клеток трофобласта [299]. Аналогичные результаты были получены для децидуальных стромальных клеток в ранней беременности: при выкидышах ранних сроков экспрессия ГК, HAS2 и CD44 были ниже, чем при физиологической беременности; ВМВ-ГК позитивно регулировал пролиферацию, апоптоз и PI3K/AKT и MAPK/ERK1/2 сигналлинг в децидуальных стромальных клетках [296]. Выраженный гуморальный ответ против ГК и ее структурного дисахарида при ПЭ может быть свидетельством: во-первых, функциональных 127 изменений гликокаликса эндотелиальных клеток – комплексной структуры, состоящей из заякоренных в мембране протеогликанов и гликопротеинов, а также включенных секретируемых молекул. Молекулы ГК присутствуют в слое, который находится в постоянном динамическом взаимодействии с кровью и образован секретируемыми и циркулирующими молекулами (ГК, альбумин и орозомукоид (α-1-кислый гликопротеин) [300, 301]. За счет связей с малыми протеогликанами ГК стабилизирует структуру гликокаликса, обеспечивая выполнение его основных функций: регуляцию физиологических и патофизиологических процессов в сосудистом русле (проницаемости, тонуса, свертываемости крови, воспалительного процесса) [302]. В настоящее время признана ключевая роль интактного гликокаликса эндотелия в регуляции механочувствительных клеточных структур и молекул клетки, воздействие на которые активирует сигнальные пути, включенные в процесс механотрансдукции [107]. Основным итогом является постоянная продукция эндотелиальной NO-синтазы (eNO-синтаза), регулирующей образование эндогенного оксида азота, который является основным регулятором, поддерживающим физиологические значения артериального давления в системе кровообращения. Функция гликокаликса, в этой связи, заключается в преобразовании биомеханических и биохимических сигналов, исходящих из кровотока в эндотелиальную клетку [303], и эффективность ее выполнения определяется интактностью эндотелиального поверхностного слоя, который дестабилизируется при развитии СВО. Антитела к полимерной ГК и ее олигосахаридным фрагментам могут выступать в качестве ингибиторов биосинтеза и регенерации гликокаликса, блокируя наращивание углеводной цепи ГК, что увеличивает жесткость и резистентность периферических артерий [120]. Отсутствие или сниженная регенерация эндотелиального гликокаликса может быть одним из факторов дестабилизации системной гемодинамики при ПЭ. 128 Во-вторых, высокий уровень антител к ГК при ПЭ может быть также свидетельством нарушенных процессов организации ВКМ, поскольку стабилизация трехмерной структуры ВКМ происходит за счет нековалентных взаимодействий ГК с малыми протеогликанами: формируется трехмерная решетчатая структура, окружающая клетки [304], которая выполняет функции фильтра и является первой линией для межклеточного взаимодействия: адгезии, миграции и, последующего проявления функциональной активности. ГК в составе ВКМ является фактором регулирующим трансформации, процессы морфогенеза, опухолевого эпителиально-мезенхимальной метастазирования и тканевого ремоделирования [289, 305]. Предполагается, что ГК может иметь ключевое значение в опухолевой инвазии, поскольку существует прямая связь между увеличением экспрессии ГК и erbB2 (HER-2/neu) опухолевыми клетками, что способствует активации соответствующего сигналлинга и свидетельствует о значении ГК для манифестации инвазивного клеточного фенотипа [306, 307]. Также, связывание ГК с CD44 активирует белок Rac1 – член семейства малых GTР-связывающих белков, что ведет к реорганизации цитоскелета клетки и способствует опухолевой инвазии [308, 309, 301, 311]. В-третьих, наличие антител к ГК и ее структурному дисахариду очевидно влияет на биологический эффект циркулирующих фракций ГК различного молекулярного веса, оказывая влияние на их регуляторную функцию. Как свидетельствуют полученные результаты, антитела к ГК и ее структурному дисахариду, выявлены не только при ПЭ, но и у пациенток с физиологической беременностью. ГК, иммобилизованная на микрочипе и использованная в качестве антигена, является небольшим полисахаридом с молекулярной массой около 5 кДа, т.е. ее можно отнести к НМВ-ГК. Следовательно, присутствие антител против этой структуры является скорее свидетельством ограничения инвазии клеток. Как известно, клетки трофобласта, с одной стороны обладают свойствами опухолевых клеток, с другой их инвазия строго детерминирована сроками гестации и допустимой 129 глубиной инвазии. Т.е. вероятно, что у здоровых пациенток антитела выполняют регуляторную функцию, а у больных – двухкратное превышение титра свидетельствует о патологическом действии на морфогенез ФПС. 6.5.2.2. Антитела к гликанам, содержащим терминальный остаток αGal Анализ полученных данных показал, что среди антител, направленных к гликанам с терминальным остатком α-Gal-, можно выделить несколько групп антител. Во-первых, это антитела к гликанам, которые имеют в составе дисахарид Galα1-3Galβ- (таблица 16, строки 2-6). Как видно из полученных результатов, из антител к ксеноантигенам: Bdi, и “антигенам Galili” значимые различия между исследуемыми группами наблюдались только по тетрасахариду Галили (медиана интенсивности сигналов в группе больных составила 2671±1550 уеф, в группе здоровых 1860±1312 уеф). Также значимые различия были выявлены для антител к трисахариду Galα1-3Galβ14Glcβ- (таблица 16, строка 6), фрагментом которого является ксеноантиген Bdi (у больных 7844±7694 уеф, у здоровых 2595±2483 уеф). Рисунок 33. Специфическое связывание АГАТ с гликанами, содержащими терминальный остаток α-Gal, иммобилизованными на чипе синие столбцы - группа сравнения; красные столбцы - основная группа, Полные структуры гликанов приведены в таблице 16 * - отличия от группы сравнения р<0,05 130 Таблица 16 Химическая структура гликанов, содержащих терминальный остаток αGal, использованных для анализа № п/п 1 3 4 5 ксеноантигены 2 Структура гликана 6 8 11 12 13 14 15 16 Galα1-4терминированные гликаны 9 10 Galα-sp* aA Galα1-3Galβ-sp* Bdi Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ-sp* Galili3 Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ-sp* Galili4 Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ-sp* Galili5 Galα1-3Galβ1-4Glcβ-sp* 7 Короткое название Aa3'Lac-Gly Galα1-2Galβ-sp* Aa2A Galα1-6Glcβ-sp* Aa6G Galα1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-sp* Galα1-4GlcNAcβ-sp* Galα1-4(Fucα1-2)Galβ1-4GlcNAcβ-sp* aLN3'LN aLN Aa4'(Fa2')LN Galα1-4Galβ1-4GlcNAcβ-sp* P1 Galα1-4Galβ1-4Glcβ-sp* Pk Galα1-3GalNAcβ-sp* Tab Galα1-3GalNAcα-sp* Taa Aa3GN Gala1-3GlcNAcb-sp* р-уровень 0,0578 0,0593 0,0800 0,0183 0,2976 0,0168 0,0121 0,2486 0,0018 0,0139 0,0003 0,0060 0,0105 0,4525 0,0362 0,0709 sp*- спейсер, представляющий собой аминоэтильный, аминопропилльный или глициламинный остаток Во-вторых, в группе антител к олигосахаридам, терминированным в 4 положении α-галактозой обнаружено, что наблюдается высокий уровень антител, как в основной группе, так и в группе сравнения, направленных к структурам, в которых α-галактоза связана с N-ацетилглюкозамином: значения медианы интенсивнсти сигналов антител к дисахариду Galα14GlcNAcβ- (таблица 16, строка 10) (15732±15996 уеф и 5637±4875 уеф) и тетрасахариду Galα1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ- (таблица 16, строка 9) (17912±15788 уеф и 7279±8203 уеф), соответственно. В то же время, антитела 131 к терминальным олигосахаридам группоспецифических антигенов системы Р1-Рk и фукозилированному производному лактозамина Galα1-4(Fucα12)Galβ1-4GlcNAcβ- (таблица 16, строки 12,13 и 11 соответственно) имеют более низкий уровень в обеих группах. При этом все антитела против олигосахаридов, терминированных в 4 положении α-галактозой имели значимые отличия между группами исследования. В-третьих, у пациенток основной группы выявлен значимо высокий уровень антител к дисахариду Galα1-2Galβ- (таблица 16, строка 7) медиана составила 6600±8209 уеф и 2152±2002 уеф; р=0,0121 у больных и здоровых соответственно, в то же время различия по антителам к мелибиозе Galα16Glcβ- (таблица 16, строка 8) были не значимы. Наиболее известными анти- α-Gal-антителами являются естественные ксено- анти- α-Gal-антитела (α-Gal еАТ), выделенные и идентифицированные в 1984 году U,Galili [205]. Было установлено, что антигенный эпитоп – трисахарид Галили входит в состав гликоконъюгатов, экспрессированных на клетках млекопитающих не приматов, лемуров и обезьян Нового Света и его присутствие связано с активностью продукта гена α-1- 3галактозилтрансферазы (α1,3GT). У человека и обезьян Старого Света антиген отсутствует вследствие инактивации гена α1,3GT в процессе эволюции. Первоначально предполагалось, что α-Gal еАТ составляют около 1-2% от общего количества иммуноглобулинов крови [312]. Однако дальнейшие исследования показали, что свойства и специфичность поликлональных антител, относимых к группе анти- α-Gal-антител более широкая, чем предполагалось сначала [313]. Установлено, что анти- α-Galантитела связываются с более низкой авидностью с дисахаридом мелибиозой (Galα1-6Glcβ-) [314], который входит в состав гликома растений, а также диглицеридов Staphylococcus epidermidis [315]. Антитела к Bdi из крови индивидуумов I(0) и II(А) групп крови связываются также с групповым Btriантигеном [316]. Показано, что при детекции анти-Galα-антител класса G, присутствующих в сыворотке здорового донора методом прямого ИФА с 132 использованием в качестве антигена-мишени ксеноантиген Galα1-3Glcβ-, специфических антител выявляется в 5 раз выше, чем при клеточном варианте ИФА с эндотелиальными клетками аорты свиньи [317]. Т.е. ксенореактивные анти-Galα-антитела у человека являются небольшой частью общего пула анти-Galα-антител имеющих специфичность к ксеноантигену. Полученные в данном исследовании результаты подтверждают данные о широком репертуаре специфичностей анти-Galα-антител у человека. Подавляющее большинство анти-Galα-антител, выявленных как у больных, так и у здоровых пациенток имели средний уровень (значения медианы интенсивностей сигналов до 5000 уеф). Среди гликанов, к которым выявлялся высокий уровень антител (значения медианы интенсивностей сигналов более 5000 уеф), выделяются антитела к мелибиозе и дисахариду Galα1-3GlcNAcβ- (таблица 16, строки 8, 16), уровень которых был выше среднего в обеих группах пациентов при отсутствии значимых различий между группами. Однако особого внимания заслуживают антитела, уровень которых был ниже (антитела к трисахариду Galα1-3Galβ1-4Glcβ-) (таблица 16, строка 6) или близок к среднему (антитела к дисахариду Galα14GlcNAcβ- и тетрасахариду Galα1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-) (таблица 16, строки 10 и 9) в группе здоровых пациенток. В группе пациенток с ПЭ уровень антител к этим структурам был выше среднего и значимо превышал уровень, выявленный у пациенток с физиологической беременностью. Интересно отметить, что трисахарид Galα1-3Galβ1-4Glcβимеет в составе минимальный фрагмент ксеноантигена Галили. В то же время, среди антител, связывающихся со структурами антигенов Галили и Bdi-антигеном, значимые отличия между группами были выявлены только для антител против тетрасахарида Галили. Как известно, гликаны отличаются как структурным, так и конформационным разнообразием, что может отражаться и на специфичности антител: среди ксенореактивных анти-Galα13Gal (IgM) обнаружены как минимум две различные субпопуляции – одна, связывается с терминальным остатком Galα-, другая – с терминальным и 133 субтерминальным остатком галактозы [314]. Поскольку рассматриваемые антитела имеют близкородственную структуру, вероятно, что структурный/конформационный эпитоп антител значимых для данной патологии лежит в субтерминальной области молекулы гликана. Важным итогом данного исследования можно также считать выявленную широкую специфичность антител к Galα1-4-терминированным гликанам. Как известно, анти-Galα-антитела Галили не связываются с Galα14Galβ-терминальными олигосахаридами к которым относят Р1 и Рk групповые антигены [318, 319], т.е. антитела к этим структурам составляют независимую от классических естественных антител Галили часть в пуле анти-Galα-антител. Как обнаружено в данном исследовании антитела против Р1 и Рk антигенов, а также фукозилированного производного Р1 антигена имели значимые отличия между группами при уровне значительно ниже среднего. В то же время, у больных ПЭ выявлен значимо высокий уровень антител против Galα1-4GlcNAc-терминированных гликанов (таблица 16, строки 9,10), которые, как известно, перекрестно связываются с Bdiэпитопом, но не являются ксенореактивными [320]. Эпитоп Galα1-4GlcNAc не был идентифицирован бактериальных в полисахаридов, составе но гликанов млекопитающих анти-Galα1-4GlcNAc- антитела и в количестве, сопоставимом или превышающем уровень естественных антител Галили и анти-В-изоагглютининов были обнаружены в крови здоровых доноров в исследовании Обуховой П, и соавт. [320]. Аналогичные результаты в отношении здоровых беременных получены и нами. Уровень антител к Galα1-4GlcNAc-терминированным гликанам при ПЭ имел максимальные значения из всех исследованных на чипе антител (рисунок 33), что свидетельствует об интенсивном гуморальном ответе, вероятно, значимом в патогенезе заболевания. Среди антител, детектируемых на гликочипе, также можно отметить антитела к Galα1-2Gal-терминированным гликанам, поскольку значимые различия уровня антител у больных превышали в более чем 2 раза уровень у 134 здоровых пациенток. Анти- Galα1-2Gal-антитела выявляются здоровых людей высоких доказано в титрах [313]; у всех отсутствие ксенореактивности этих антител. Возможность генерации антител “необычной” специфичности при ПЭ, вероятно существует вследствие повреждения гликокаликса клеток, в том числе и клеток эндотелия при активации СВО. Частицы трофобластического дебриса, могут являться адъювантом для олигосахаридов и выступать в качестве суррогатной вакцины, провоцирующей иммунный ответ. В последние годы в онкологии появился подход, основанный на использовании Galα-вакцин с эпитопом Галили в составе, которые модифицируют фенотип опухоли, способствуя направленному таргетингу анти-Galα-антител вследствие чего, злокачественные клетки подвергаются цитолизу [321, 322]. В связи с этим можно предполагать, что повышение анти-Galα-антител похожей специфичности, выявленное нами, а также в исследовании [206] оказывает негативный эффект на клетки фетоплацентарной системы, поскольку может свидетельствовать об экспрессии антигенов, обладающих высокой иммуногенностью. Как отмечалось во многих исследованиях, анти-Galα-антитела являются гетерогенными, и ксенореактивными является лишь часть этих антител. Тонкая углеводная специфичность анти-Galα-антител не определялась ранее. Полученный в данном исследовании спектр антител против гликанов, имеющих в составе фрагменты ксеноантигена может свидетельствовать о вероятном присутствии этого антигена в составе иммуногеного эпитопа при ПЭ. Однако существование реальных мишеней в тканях предстоит еще доказать, поскольку существует множество примеров различной специфичности антител в экспериментах in vitro и in vivo [30]. Резюме Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что при ПЭ наблюдается выраженный гуморальный ответ на антигены, которые по иммунологической природе являются ксеноантигенами или могут быть 135 отнесены к таковым, и антитела к которым, составляют значительную часть пула естественных антигликановых антител у человека. Функции этих предсуществующих антител неизвестны, за исключением ксенореактивных свойств анти-Galα1-3Gal –антител, которые выполняют функцию защиты от гликозилированных вирусов при их передаче от животных человеку [323]. Но, поскольку, существует гипотеза о регуляции естественными анти-Galαантителами специфического иммунного ответа у птиц, которая основана на фактах, свидетельствующих о подавлении специфического гуморального ответа на Galα-терминированные антигены у иммунизированных особей, имеющих естественные антитела [324], то можно предположить, что функциональные свойства предсуществующих антител у больных и здоровых пациенток различны, вследствие чего у больных отсутствует подавление специфического ответа на данные антигены. Другим возможным объяснением повышенной генерации антител к Galα-терминированным гликанам является экспрессия последних клетками фетоплацентарной системы, что частично подтверждается другими исследователями [203, 204, 206]. 6.5.2.3. Антитела к гликанам, которые являются функциональными рецепторами эндогенных лектинов 6.5.2.3.1. Антитела к гликанам, содержащим терминальный остаток βGal Углеводные структуры, содержащие терминальный остаток бетагалактозы в своем составе, относятся к рецепторам эндогенных лектинов специфичных к галактозе. Среди гликанов, мобилизованных на гликочипе, содержащих терминальный остаток βGal можно выделить несколько основных групп на основе структурного подобия: 136 гликаны, в которых терминальная β-галактоза имеет заместитель в положении С3 - N-ацетилгалактозамин (GalNAc): например, дисахаридный антиген Томсена-Фриденрайха (TF) (Galβ1- 3GalNAcα) (таблица 17, строка 15) или дисахарид Tββ (Galβ13GalNAcβ) (таблица 17, строка 17); - N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), например, дисахарид LeC (Galβ1-3GlсNAcβ) (таблица 17, строка 1), а также их производные (таблица 17, строки 2-11); гликаны, в которых терминальный остаток βGal связан в 3 или 4 положении с β-галактозой: трисахариды (Galβ1-3Galβ1- 4GlcNAcβ) (таблица 17, строка 18) и Galβ1-4Galβ1-4GlcNAcβ (таблица 17, строка 20) гликаны, в структуре которых терминальный остаток βGal связан в 4 положении с глюкозой - аминокислотные производные лактозы (таблица 17, строки 22-30) или N-ацетилглюкозамином (линейные и разветвленные производные лактозамина – олиголактозамины) (таблица 17, строка 31) гликаны, в которых терминальный βGal связан во 2 положении с α- или β-галактозой (таблица 17, строка 32, 33) Анализ антител к гликанам, мобилизованным на гликочипе, показал, подавляющее большинство антител против гликанов этой группы имело значения медианы интенсивностей сигналов до 2000 уеф, причем как у здоровых, так и у больных пациенток. Примечательным оказался высокий уровень антител к аминокислотным производным лактозы (таблица 17, строки 22-30) в обеих группах исследования, к некоторым из них сигналы были более 15000 уеф; однако при этом отсутствовали значимые различия уровня антител ко всем исследованным производным (рисунок 34). 137 Рисунок 34. Специфическое связывание АГАТ с гликанами, содержащими терминальный остаток βGal, иммобилизованными на чипе синие столбцы – группа сравнения; красные столбцы - основная группа, Полные структуры гликанов приведены в таблице 17. * - отличия от группы сравнения Следует отметить, что уровень антител к коровым дисахаридам: онкофетальному антигену TF и изолактозамину (антигену LeC) и его производным был значимо выше у больных пациенток. Так, значения медианы интенсивностей сигналов антител к антигену TF составил 1977±1122 уеф у больных и 800±415 уеф у здоровых пациенток; р=0,002. К антигену LeC и его производным значения медианы составили 6213±4420 уеф у больных, и 1879±1601 уеф у здоровых беременных; р=0,0075. Аналогично, повышенный уровень антител отмечался для его сульфатированного производного LeC6’Su; р=0,0005, сиалированного в третьем и шестом положении дисахарида (3’Sia LeC); p=0,0140 и (6’Sia LeC); р=0,0002, а также димерной молекуле LeC (LeC3’LeC), связанной в третьем положении; р=0,0027 и ряду гликанов, с заместителями в различных положениях (рисунок 35). 138 Рисунок 35. Специфическое связывание АГАТ с гликанами, содержащими фрагмент дисахарида LeC (Galβ1-3GlcNAcβ), иммобилизованными на чипе синие столбцы – группа сравнения; красные столбцы - основная группа, Полные структуры гликанов приведены в таблице 17.* - отличия от группы сравнения достоверны; р<0,05 Значимо высокий уровень антител был выявлен в основной группе к дисахариду Galβ1-4GlcNAcα (α-лактозамин) (таблица 17, строка 21), медиана составила 8221±6640 уеф у больных и 3192±3058 уеф у здоровых; р=0,025 и трисахаридам Galβ1-4Galβ1-4GlcNAcβ (таблица 17, строка 20) 9267±6087 уеф и 4663,5±3592 уеф; р=0,002 и Galβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ, (таблица 17, строка 13) 3991±1955 уеф и 1493,5±768 уеф; р=0,0002, соответственно. Причем для первых двух структур, уровень антител у здоровых пациенток был значимо выше фонового - значения медианы интенсивностей сигналов превышали 2000 RFU. Низкий уровень антител, к трисахариду Galβ1-3GalNAcβ1-3Gal (таблица 17, строка 17) был выявлен у здоровых пациенток (значения медианы интенсивностей сигналов 1302,5±813 уеф; у больных – 2240±1546 уеф; р=0,015). Для антител к олигосахаридам, терминированным во 2-положении βгалактозой: Galβ1-2Gal значение медианы составило 4939±4292 уеф в основной группе и 1786±1348 уеф в группе сравнения; р=0,0045, к трисахариду Galβ1-2Galβ1-3GlcNAc 4570±4389 уеф и 2106±1364 уеф соответственно; р=0,011. 139 Таблица 17 Гликаны, содержащие терминальный остаток βGal, использованные для анализа №п/ п 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 2 Galβ1-3GlcNAcβ-sp* Neu5Acα2-3Galβ1-3GlcNAcβ-sp* Neu5Acα2-6Galβ1-3GlcNAc-sp* Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAcβ-sp* Galβ1-3(6-O-Su)GlcNAcβ-sp* 3-O-Su-Galβ1-3GlcNAcβ-sp* Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAcβ-sp* Galβ1-3GlcNAcα1-3Galβ1-4GlcNAcβ-sp* Galβ1-3GlcNAcα1-6Galβ1-4GlcNAcβ-sp* 6-O-Su-Galβ1-3(6-O-Su)GlcNAcβ-sp* GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAcβ-sp* Galβ-sp* Galβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-sp* Galβ1-3Galβ-sp* Galβ1-3GalNAcα-sp* Galβ1-3GalNAcα-sp* 17 Galβ1-3GalNAcβ1-3Gal-sp* 18 Galβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-sp* 19 20 Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ-sp* Galβ1-4Galβ1-4GlcNAcβ-sp* 21 Galβ1-4Glcα-sp* 22 Galβ1-4Glcβ-sp* 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Galβ1-4Glcβ-sp4-Nle Galβ1-4Glcβ-sp4-Ile Galβ1-4Glcβ-sp4-Val Galβ1-4Glcβ-sp4-Arg Galβ1-4Glcβ-sp4-Ala Galβ1-4Glcβ-sp4-Phe Galβ1-4Glcβ-sp4-Asn Galβ1-4Glcβ-sp4-Trp Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ-sp* Galβ1-4GlcNAcβ1-3GalNAca-sp* 33 Galβ1-2Galβ-sp* 33 Galβ1-2Galα1-3GlcNAcβ-sp* Структура гликана sp*- спейсер, представляющий глициламинный остаток Короткое название р-уровень 3 LeC 3'SiaLeC 6'SiaLeC LeC3'LeC LeC6Su LeC3'Su LeCβ3'LeC LeCa3'LN LeCa6'LN LeC6,6'Su2 GlcNAc3'LeС βA-Gly Ab3'LN Ab3A TF 4 0,007 0,014 0,0002 0,003 0,003 0,060 0,060 0,418 0,755 0,001 0,005 0,009 1,726e-06 0,002 0,011 0,002 TF-‘8 0,0153 Tββ-A Ab3'LN-Gly LNT 0,025 0,755 Lac-Gly Lac-Nle Lac-Ile Lac-Val Lac-Arg Lac-Ala Lac-Phe Lac-Asn Lac-Trp LNnT 0,072 0,101 0,176 0,401 0,393 0,249 0,609 0,357 0,224 0,005 LN3Tn 0,005 Ab2A Ab2Aa3GN аминоэтильный, 0,158 0,002 Ab4'LN LNa собой 0,0002 0,011 аминопропильный или 140 6.5.2.3.2. Антитела к гликанам, содержащим терминальный остаток GalNAcСреди гликанов, мобилизованных на чипе также можно выделить структуры с терминальным остатком GalNAc (таблица 18). Они включают структуры: терминированные (таблица 18, GalNAcα, строка 5); в том числе минимальный дисахарид А этипоп антигена Форсмана - Fs (GalNAcα1-3GalNAcβ) (таблица 18, строка 6, 7); терминированные GalNAcβ, в том числе ди-N- ацетиллактозамин (таблица 18, строка 2) и его сульфатированное производное (таблица 18, Форссмана – para Fs строка 3) и антиген (GalNAcβ1-3GalNAcβ) “пара”- (таблица 18, строка 11) Анализ результатов показал, что у пациенток с ПЭ значимо повышен уровень антител ко всем исследованным гликанам (рисунок 36). Рисунок 36. Специфическое связывание АГАТ с гликанами, содержащими терминальный остаток GalNAc, иммобилизованными синие столбцы – группа сравнения; красные столбцы - основная группа, Полные структуры гликанов приведены в таблице 18. * - отличия от группы сравнения р<0,05 141 Наиболее выраженный иммунный ответ наблюдался против дисахарида GalNAcα1-3GalNAcβ (Fs-2), который является минимальным эпитопом антигена Форссмана, значения медианы интенсивностей сигналов составила 4298,5±4444 уеф и 9536±12047 уеф у здоровых и больных соответственно. Также следует отметить дисахарид GalNAcβ1-3GalNAcβ, который является терминальным углеводным остатком гликолипида пара-Форссмана, обнаруженного на эритроцитах человека [325]. Как видно из рисунка, уровень антител к дисахариду GalNAcβ1-3GalNAcβ у больных ПЭ пациенток был значимо выше, чем у здоровых беременных пациенток: медиана в группе составляла 2560±1558 уеф и 1349±877 уеф соответственно; р=0,002. К коровой структуре GalNAcα1-3GalNAcα гликопротеиновых значения медианы у О-цепей – дисахариду здоровых пациенток 2371,5±1701 уеф и 5665±3746 уеф у больных. Таблица 18 Гликаны, содержащие терминальный остаток GalNAc, использованные для aнализа №п/п Структура гликана Короткое название р-уровень 1 GalNAcβ-sp* βAN 0,0047 2 GalNAcβ1-4GlcNAcβ-sp* LacdiNAc 0,022 3 GalNAcβ1-4(6-O-Su)GlcNAcβ-sp* LacdiNAc6Su 0,0003 4 GalNAcβ1-4Galβ1-4Glcβ-sp* GA2 0,018 5 GalNAcα1-3Galβ-sp* Adi 0,036 6 GalNAcα1-3GalNAcβ-sp* Fs-2 0,012 7 GalNAcα1-3GalNAc(fur)β-sp* Fs(f)-2 0,031 8 GalNAcα1-3GalNAcα-sp* core5 0,001 9 GalNAcβ1-3(Fucα1-2)Galβ-sp* Fa2(ANβ3)A 0,004 10 GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glcβ-sp* Gβ4 0,003 11 GalNAcβ1-3GalNAcβ-sp* para-Fs 0,002 sp*- спейсер, представляющий собой аминоэтильный, аминопропильный или глициламинный остаток 6.5.2.3.3. Антитела к гликанам, содержащим терминальный остаток βGlcNAc Структуры гликанов, представленные на чипе включали: 142 β-N-ацетилглюкозамин (таблица 19, строка 1) и гликаны с терминальным β-N-ацетилглюкозамином в положениях С2, С3,С4 и С6 (таблица 19, строки 2-15, 20) коровые структуры с терминальным β-N-ацетилглюкозамином (таблица 19, строки 16-18) фрагмент пептидогликана GMDPLys (таблица 19, строка 19) Рисунок 37. Специфическое связывание АГАТ с гликанами, содержащими терминальный остаток β-GlcNAc, иммобилизованными на чипе синие столбцы - группа сравнения; красные столбцы - основная группа, Полные структуры гликанов приведены в таблице 19. * - отличия от группы сравнения достоверны; р<0,05 Как видно из представленных результатов, у больных пациенток наблюдается выраженный гуморальный ответ на все молекулы этой группы (рисунок 37). Наиболее высокие значения медианы интенсивностей сигналов у пациенток с ПЭ отмечалась к фрагментам пептидогликана GMDPLys (таблица 19, строка 19) и олигосахаридам GlcNAcβ1-2Galβ1-3GalNAcα (таблица 19, строка 2) и GlcNAcβ1-4(6-O-Su)GlcNAc (таблица 19, строка 9): 65537±0 уеф; 58818±9959 уеф; 31875±40727 уеф соответственно. У здоровых пациенток медианы тоже были высокими: 32660±33731 уеф; 143 33632±32978 уеф; 6710±7672 уеф, р=0,0015; р=0,0176 и р=0,0014 соответственно. Уровень антител к сахаридам GlcNAcβ-Mur (таблица 19, строка 20) и GlcNAcβ1-4Galβ1-4GlcNAcβ (таблица 19, строка 5) был меньше, однако различия между группами были значимы: р=0,0074 и р=0,0141 соответственно. Таблица 19 Гликаны, содержащие терминальный остаток βGlcNAc, использованные для aнализа №п/ п Структура гликана Короткое название р-уровень 1 GlcNAcβ-sp* GN 0,012 2 GlcNAcβ1-2Galβ1-3GalNAcα-sp* GN2'TF 0,018 3 GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ-sp* GN3'Lac 0,014 4 GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAcβ-sp* GlcNAc3'Lec 0,005 5 GlcNAcβ1-4Galβ1-4GlcNAcβ-sp* GN4'LN 0,014 6 GlбNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAcβ-sp* Fa6Ch2 0,070 7 GlcNAcβ1-4(GlcNAcβ1-3)Galβ1-4GlcNAcβ-sp* GN2-3',4'LN 0,510 8 GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-sp* Ch2-Gly 0,023 9 GlcNAcβ1-4(6-O-Su)GlcNAcβ-sp* Ch2-6Su 0,002 10 GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-sp* Ch3 0,007 11 (GlcNAcβ1-4)5β-sp* Ch5 0,022 12 (GlcNAcβ1-4)6-sp* Ch6 0,102 13 GlcNAcβ1-6Galβ1-4GlcNAcβ-sp* GN6'LN 0,005 14 GlcNAcβ1-6(GlcNAcβ1-4)GalNAcα-sp* GN2-4,6Tn 0,153 15 (GlcNAcβ1)3-3,4,6-GalNAcα-sp* GN3-3,4,6Tn 0,020 16 GlcNAcβ1-6(Galβ1-3)GalNAcα-sp* core2 0,001 17 GlcNAcβ1-3GalNAcα-sp* core3 0,0001 18 GlcNAcβ1-6GalNAcα-sp* core6 0,002 19 GlcNAcβ1-4Mur-L-Ala-D-i-Gln-Lys GMDPLys 0,002 20 GlcNAcβ1-4-[HOOC(CH3)CH]-3-O-GlcNAcβ-sp* GN-Mur 0,007 sp*- спейсер, представляющий собой аминоэтильный, аминопропильный или глициламинный остаток Исследованные антитела к гликанам, терминированным остатками βGal, GalNAc и GlcNAc показали, что при ПЭ наблюдается выраженный иммунный ответ на абсолютное большинство исследованных углеводных структур. Необходимо отметить, что на ряд гликанов был выявлен высокий уровень антител, как в норме, так и при патологии. Например, обнаружен 144 высокий уровень антител к аминокислотным производным лактозы (медиана составила>2000 уеф), а для некоторых антител >15000 уеф как у больных, так и у здоровых пациенток. В литературе описаны антитела к производным лактозы, в частности к структурам гликанов, имеющим лактозный фрагмент на восстанавливающем конце (R-Galβ1-4Glc-). Этот фрагмент входит в состав многих гликосфинголипидов и ганглиозидов и является коровой структурой, скрытой (маскированной) на мембране нормальной клетки [30]. Антитела к вариантам корового дисахарида (Galβ1-4Glc-R, где R- аминокислота), являются консервативными антикоровыми антителами, выполняющими надзорную функцию в организме; выявленный высокий уровень не является критичным и не вызывает аутоиммунной реакции, поскольку дисахарид является скрытым эпитопом в здоровой клетке. Наряду с антителами к производным лактозы были выявлены антикоровые антитела, различия по которым были значимы при ПЭ. Например, дисахарид Galβ1-3GalNAcα – антиген TF - Томсена-Фриденрайха, образуется в результате неполного (абберантного) синтеза олигосахаридов и является фрагментами корового участка О-цепи гликопротеинов и гликолипидов [326]. Антиген относится к онкофетальным антигенам; у здорового человека присутствует в ограниченном количестве в тканях иммунопривелигерованных зон [327]. В структурах нормальной плаценты показана экспрессия Galβ1-3GalNAcα в составе муцина MUC-1 [328]. Экспериментальное моделирование гипоксии на иммортализованных клетках трофобласта человека линии HTR-8/SVneo и клетках нормальной плаценты сопровождалось экспрессией дисахарида Galβ1-3GalNAcα в составе белка теплового шока HSP90α [329]. Повышенная экспрессия Galβ1-3GalNAcα выявлена в синцитии и вневорсинчатом трофобласте при ПЭ [330], а также показано, что моноклональные антитела против Galβ1-3GalNAcα дисахарида ингибируют пролиферацию клеток хориокарциномы человека линии ΒeWo [331]. У здорового человека присутствует значительное количество (приблизительно 0,5% и 0,05% от общего количества IgM и IgG, 145 соответственно) естественных антител к дисахариду Galβ1-3GalNAcα [326], выполняющих функцию надзора за появлением TF-экспрессирующих опухолевых клеток [332]. Предполагается, что анти-TF-антитела представляют собой гетерогенную популяцию антител с широким спектром эпитопной специфичности [326]. Также коровой изолактозамин структурой 1 типа (Galβ1-3GlcNAcβ), является В дисахарид норме LeC – дисахаридная последовательность LeC структурно и конформационно маскирована и экспонируется при патологии [333]. Антиген LeC выявляется при раке молочной железы [333, 334]. Предполагается, что детерминанта, подобная LeC, имеется в составе опухолеассоциированного муцина MUC-1 [335]. Однако естественные антитела к LeC присутствуют у всех здоровых доноров [190], а пул анти-LeС антител может истощаться при развитии онкопатологии [333]. Как видно из представленных результатов (рисунок 35) для антител против антигена LeC значение медианы в группе больных в два и более раз превосходило значение в группе здоровых, т.е. наблюдался интенсивный гуморальный ответ на данный антиген. В связи с этим было проанализировано связывание антител с гликанами, которые содержат фрагмент дисахарида LeC и имеют заместители в различных положениях (таблица 17, строки 2-11). Из общего массива данных выделен спектр антител к производным дисахарида LeC (Galβ1-3GlcNAcβ), который свидетельствует, что при ПЭ отмечен повышенный уровень антител ко всем исследованным структурам (рисунок 35). проведенных ранее, Однако, антитела, как известно специфически из исследований, связывающие 3’- замещенные LeC- структуры на чипе (таблица 17, строки 2-11), при выделении на аффинных колонках с использованием LeC- или 3’-O-SuLeCсефарозы в реальности специфически связывают внутреннюю часть дисахарида, дисахарид LeC т.е. являются встречается моноспецифичными [336]. только углеводных в составе В природе цепей 146 гликопротеинов, гликолипидов или олигосахаридов молока и реальные мишени этих антител in vivo пока не идентифицированы. Антитела к тетрасахаридам с α- и β-связью между сахарами (таблица 17, строки 8,9 и 7, соответственно) при высоком уровне для α-связанных сахаридов и низком для β-связанных не имели значимых различий как у больных, так и у здоровых пациенток. Аффинно выделенные антитела из сыворотки здоровых доноров также не связывали подобные структуры [336]. На чипе было исследовано связывание 6’- замещенных LeC- структур с антителами у больных и здоровых пациенток (таблица 17, строки 3,5,9,10). Антитела против абсолютного большинства структур, за исключением антител против дисахарида LeC, имеющего в 6’- положении лактозамин, имели значимые различия между больными и здоровыми (рисунок 35), что может свидетельствовать о гетерогенности и широкой эпитопной специфичности Биологические лиганды для этих антител пока также остаются загадкой. Значимыми оказались также различия уровня антител к коровым структурам с терминальными остатками GalNAc (таблица 18, строка 8) и GlcNAc (таблица 19, строка 16-18) в структуре кора. Таким образом, при ПЭ выявлен интенсивный гуморальный ответ на олигосахариды, относящиеся к коровым структурам. Поскольку известно, что естественные антитела с анти-βGal-специфичностью подавляют инвазивные свойства опухолевых клеток в культуре, а также высокий уровень анти-βGal-антител выявляется у онкологических пациентов с отсутствием метастазов [337], можно предположить, что высокий уровень выявленных антител при ПЭ может быть следствием их участия в ингибировании углевод-белковых взаимодействий между фетальными и материнскими клетками при плацентации. При этом мы предполагаем, что иммунный ответ на дисахариды LeC и TF отличен от описанного при онкотрансформациях, поскольку мы выявили повышение уровня антител при ПЭ, что предполагает принадлежность этих антител скорее к болезньассоциированным, чем к естественным антителам. Повышенный уровень 147 анти-коровых-антител, обнаруженный нами, может быть свидетельством ограничения инвазии клеток трофобласта в спиральные артерии матери, что является основным патогенетическим фактором развития “ранней ПЭ”. Несмотря на то, что антитела были выявлены в III триместре, когда фетоплацентарная система уже сформирована, принадлежность антител классу G может быть подтверждением этого предположения. Также, мы не исключаем возможность чрезмерного СВО при ПЭ, генерации этих поскольку антител в провоспалительные условиях стимулы способствуют синтезу гипогликозилированных структур, воспринимаемых иммунной системой как образы опасности. Кроме влияния антигликановых антител на межклеточные взаимодействия при плацентации, не менее важным аспектом их воздействия при беременности может быть блокирование функциональных углеводных рецепторов, взаимодействие с которыми регулирует активность иммунной системы. Многочисленные исследования последних лет показали, что развитие СВО ведет к образованию “неоантигенов” и демаскированию скрытых антигенов которые выступают в качестве чужеродных, активируя иммунную систему, прежде всего, врожденный иммунитет [40]. Аналогичный эффект оказывают фетальные ткани, однако, при физиологической беременности иммунные реакции направлены на формирование иммунологической толерантности к плоду, что обеспечивается действием толерогенных молекул и ингибиторных рецепторов экспрессия и секреция которых осуществляется клетками материнского и фетального происхождения [338, 339]. При ПЭ происходит срыв механизмов формирования толерантности с активацией эффекторных механизмов врожденного и адаптивного иммунитета. К факторам, регулирующим баланс между анергией и иммунным ответом относят эндогенные лектины, в частности лектины С-типа специфически взаимодействующие с Gal/GalNAc/GlcNAc-терминированными гликанами, которые обнаруживаются, главным образом, на антигенпрезентирующих клетках, и, в меньшей степени, на естественных киллерах и клетках 148 эндотелия [264]. Лектины С-типа являются трансмембранными белками и имеют в цитоплазматической части активационный ITAM или ингибиторный ITIM мотивы, что обусловливает их участие в сигналлинге, оказывающем негативное или позитивное влияние на иммунный ответ [340, 341, 342]. Другой группой эндогенных лектинов с β-галактозид-связывающей активностью, которые широко распространены на клетках иммунной системы, репродуктивного тракта и фетоплацентарной системы являются галектины [343]. галектинами Минимальным является фрагментом дисахарид для взаимодействия с лактозамин – Galβ1-4GlcNAc, представленный в составе N-цепей гликанов комплексного типа и О-цепей гликопротеинов и гликолипидов [344]. Некоторые галектины (галектин-1 и галектины тандемного типа) предпочтительно связываются с гликанами, в терминальном фрагменте которых имеется заместитель при С3 (Galβ13GalNAc и Galβ1-3GlcNAc). Исследование специфичности галектинов в бесклеточных тест-системах показало, что галектины специфически связывают βGal-терминированные гликаны, которые содержат также остатки Fucα или Galα/GalNAcα [345]. Однако паттерн лигандов различается для каждого галектина, а также зависит от используемого анализа (клеточные и бесклеточные методы дают существенные различия в специфичности галектинов) [345]. Аффинность связывания лектинов с углеводными рецепторами зависит от тонкой структуры гликанов, так, например, α-лактозамин (Gal14GlcNAc) связывается с галектином-1 слабее, а с галектином-3 сильнее, чем лактозамин [346]. Некоторые галектины (галектин-3) способны связывать не только терминальные остатки лактозамина, но и внутренние (коровые) фрагменты. Связывание галектинов с гликанами, несмотря на меньшую, по сравнению с типичным белок-белковым взаимодействием аффинность (около 10-6М против 10-8М), характеризуется высокой авидностью, вследствие мультивалентности взаимодействия [347]. 149 Рассматриваемые нами антитела к гликанам, которые по химической структуре являются потенциальными рецепторами лектинов С-типа и галектинов, а, следовательно, могут выступать в качестве ингибиторов взаимодействия активируемая лектин-гликан. при Системная физиологической воспалительная беременности, и еще реакция, более усугубляющаяся при ПЭ [257], способствует экспрессии и секреции эндогенных лектинов [342, 343], а также видоизменению функциональных углеводных рецепторов клеточной поверхности вследствие слущивания компонентов гликокаликса клетки под действием провоспалительных стимулов [115]. Вследствие способности к мультивалентному взаимодействию с углеводными рецепторами, образующиеся комплексы лектинов с гликоконъюгатами, в число которых входят Т-клеточные рецепторы (TCR), В-клеточные рецепторы (ΒCR) и рецепторы цитокинов, запускают сигнальные каскады, регулирующие иммунные реакции в организме [343]. Спектр клеток и варианты воздействия на них черезвычайно разнообразны, и зависят от типа конкретного лектина [348]. Так, например, углевод-белковое взаимодействие, опосредуемое галектином-1 вызывает апоптоз тимоцитов, активированных Тh1/Th17-клеток; снижает: продукцию провоспалительных цитокинов и IL-2, пролиферацию Т-клеток, адгезию клеток к внеклеточному матриксу, синтез индуцибельной NO-синтазы, NOпродукцию и высвобождение арахидоновой кислоты макрофагами [348]. Также галектин-1 регулирует: экспрессию HLA-G клетками трофобласта, дифференцировку цитотрофобласта в синцитиотрофобласт, пролиферацию и инвазию вневорсинчатого трофобласта, синтез толерогенных цитокинов и численность Т-регуляторных клеток [349]. Взаимодействие лектинов С-типа с углеводными лигандами может вести как к активации иммунной системы, инициируя провоспалительный ответ с дальнейшим формированием специфического иммунного ответа, так и к торможению иммунного ответа и развитию реакций противовоспалительной направленности [341]. Углеводбелковое взаимодействие может оказаться ключевым звеном в регуляции 150 толерантности и иммунного ответа при беременности. Поэтому, мы предполагаем, что спектр антител к углеводным лигандам эндогенных лектинов может отражать детерминанты развития болезни, а также свидетельствовать о преимущественной регуляции антителами против индивидуальных гликанов физиологических или патофизиологических процессов при беременности. Несмотря на отсутствие антител к лактозамину и его производным, спектр антител, различия по которым были значимы при ПЭ, составляли антитела против структурно родственных гликанов, основные различия между которыми обусловливались конформационными особенностями молекулы. Например, мы выявили значимо повышенный уровень антител против α-лактозамина (Gal1-4GlcNAc) – структурного изомера лактозамина. Также, при ПЭ выявлен повышенный уровень антител против антигена TF (Galβ1-3GаlNAcα), что обсуждалось выше, а также против антигена Tββ (Galβ1-3GalNAcβ), которые также являются структурными изомерами. Среди выявленных антител, необходимо отметить антитела к структурно близким гликанам: трисахариду Galβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ и Galβ1-4Galβ1-4GlcNAcβ (отличие заключается в разном положении связи между двумя молекулами галактозы). Также можно отметить антитела к структурам Galβ1-2Galβ и Galβ1-2Galα1-3GlcNAcβ, которые имеют необычную специфичность, поскольку структуры гликанов с заместителем при С2 в терминальном фрагменте не описаны еще как рецепторы галектинов у человека и млекопитающих. Исследованные антитела против GalNAc-терминированных гликанов (рисунок 36) показал, что значимые отличия в уровне антител были выявлены ко всем исследованным структурам (таблица 18, строки 1-11). Антитела против GalNAc-терминированных гликанов, в частности к ганглиозиду N-ацетилгалактозаминил GD1a (GalNAc-GD1a) являются диагностическими маркерами демиелинизации периферической нервной системы; высокий уровень антител показан при различных неврологических 151 заболеваниях [350], в том числе нейропатиях [351, 352]. При опухолях желудочно-кишечного тракта идентифицированы две субпопуляции антиуглеводных антител (IgG): специфичные к GalNAcβ и дисахариду GalNAcβ1-3GalNAcβ [325] и показано, что повышенный уровень антиGalNAcβ(IgG) антител позитивно коррелирует с выживаемостью пациентов [353]. В репродукции высокий уровень анти-GalNAcβ антител у пациенток с АФС выявлен при привычном выкидыше. Патогенетическое значение этих антител подтверждено также в экспериментальной модели выкидыша у мышей, и при экспериментальном исследовании влияния антител на инвазию клеток хориокарциномы в матригеле и down-регуляцию ферментов, деградирующих матрикс [208]. Предполагается, что действие анти-GalNAcβ антител основано на их способности связывать рецепторы эндогенных лектинов: лектинов С-типа и галектинов [208, 325]. Также в группе антител против GalNAc-терминированных гликанов, необходимо отметить значимо высокий уровень антител к минимальному эпитопу ксеноантигена Форссмана (Fs) – дисахариду GalNAcα1-3GalNAcβ [182]. У человека отсутствует этот антиген, но выявляются естественные анти-Fs антитела, титр которых снижается при онкотрансформациях, в частности опухолях молочной железы, легкого и желудочно-кишечного тракта. При этом снижение титра анти-Fs антител связывают с прогрессированием опухолевого процесса, а проведение радикальных операций, напротив, сопровождается возрастанием титра анти-Fs антител у пациентов [326]. Результаты, полученные в данном исследовании, являются первым сообщением о детекции анти-GalNAcβ антител при ПЭ. Повышенный уровень, выявленный у всех пациенток, может быть свидетельством патологии формирования фетоплацентарной системы при ПЭ и ограничения иммуномодулирующих свойств эндогенных лектинов при беременности. Анализ данных гликочипа показал, что наиболее интенсивный иммунный ответ выявлен на гликаны - фрагменты пептидогликана клеточной 152 стенки бактерий: GMDPLys и мурамоил-GlcNAc и близкие им по структуре гликаны, содержащие терминальный остаток β-GlcNAc. Как известно, эти гликаны формируют образы патогенности, узнаваемые пептидогликанраспознающими белками (peptidoglycan recognition proteins – PGRPs) – компонентами врожденного иммунитета, являющегося первой линией защиты от патогенов [354]. Пептидогликаны – гетерополимерные молекулы, представленные на клеточной стенке грамм-положительных и граммотрицательных бактерий, содержащие бета-ацетилглюкозамин (β-GlcNAc) и N-ацетилмураминовую кислоту (MurNAc) связанных с коротким пептидом, состоящим из L- и D-аминокислот и отличающиеся высокой консервативностью [354]. Также эти гликаны могут выступать в качестве лигандов лектинов С-типа, Причем высокий уровень антител против ряда гликанов (рисунок 37) был выявлен в обеих группах исследования. Резюме Полученные нами результаты свидетельствуют, что в крови беременных пациенток обнаруживается широкий репертуар антител против гликанов, которые определены как функциональные углеводные рецепторы эндогенных лектинов: лектинов С-типа и галектинов. Поскольку углеводбелковое взаимодействие гомеостатические процессы опосредует как физиологические – (межклеточные взаимодействия, адгезию, иммунный ответ и элиминацию чужеродных/опасных молекул), так и патофизиологические – процессы, связанные с инициацией и прогрессированием заболевания (аутоиммунные поражения, канцерогенез, воспаление) [49, 264], изучение антиуглеводных антител, их спектра и специфичности может быть характеристикой детерминант развития антигликановых антител, заболевания. Возможными механизмами действия идентифицированных при ПЭ в данном исследовании может быть: вопервых, негативное влияние на иммунорегуляцию осуществляемую эндогенными лектинами, поскольку присутствие антител, может являться 153 конкурирующим фактором за связь лектинов с углеводным лигандом. Присутствие антител с аналогичной специфичностью, может закрывать свободные валентности для связывания лектинов. Во-вторых, антигликановые антитела могут, вероятно, выступать в качестве ингибиторов межклеточных взаимодействий, т.е. влиять на структурную организацию фетоплацентарной системы и, соответственно, ее функциональные свойства. 154 6.6. Изучение взаимосвязей между комплексом гуморальных факторов иммунитета, исследованных у пациенток в III триместре беременности, Основной функцией гуморального иммунного ответа является продукция антител, участвующих в поддержании иммунного гомеостаза в организме, путем нейтрализации (блокады) соответствующего антигена, или с привлечением дополнительных факторов, обеспечивающих цитотоксический ответ [42]. При этом пул антител организма формируется из естественных антител, которые продуцируются без явной антигенной стимуляции, а также из адаптивных антител, образованных вследствие специфического иммунного организованы в регулирующую гуморальных сеть на антиген. Также, идиотип-антиидиотипических гуморальный средах ответа иммунный организма ответ. взаимодействий, Таким присутствует антитела образом, комплекс в антител, гетерогенных как по специфичности в отношении антигенов различной природы, так и по функциональной активности и эффектам на клеткимишени. До настоящего времени остается не выясненной взаимосвязь и взаимовлияние адаптивных и естественных антител, а также роль этих взаимосвязей в норме и при патологических состояниях. В данном разделе представлены данные по изучению взаимосвязей между уровнем АГАТ (против каждого из 252 гликанов, нанесенных на гликочип) и антителами, исследованными другими методами: содержанием иммуноглобулинов классов M и G в крови, АФА и активностью связывания АЭАТ. корреляционные Следует связи также между отметить, антителами что будут класса G, описаны поскольку корреляционных связей между антителами класса M обнаружено не было. 6.6.1. Корреляционные связи между уровнем антигликановых антител и содержанием иммуноглобулинов класса G в крови У здоровых пациенток были установлены прямые корреляционные связи между содержанием иммуноглобулинов G в крови и уровнем антител, направленных к группоспецифическим антигенам А и В (таблица 20 строка 155 3,4,5), что является вполне ожидаемым, поскольку присутствие естественных антител к группоспецифическим антигенам крови является нормой. Также у здоровых пациенток установлены прямые связи с антителами к Galβтерминированному дисахариду (таблица 20 строка 1) и производным дисахарида LeC (таблица 20, строка 6,7). Таблица 20 Оценка корреляционной связи между уровнем антигликановых антител известной специфичности и содержанием иммуноглобулинов класса G в периферической крови пациенток группы сравнения №п/п 1 2 3 4 5 6 7 Химическая структура олигосахарида Galβ1-4GlcNAcα-sp Galβ1-4Galβ1-4GlcNAcβ-sp Galα1-3(Fucα1-2)Galβ-sp Galα1-3(Fucα1-2)Galβ13GalNAcα-sp GalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ-sp (6-O-Bn-Galβ1)-3GlcNAcβ-sp Galβ1-3GlcN(Fm)β1-3Galβ14GlcNAcβ-sp Короткое название LNa Ab4'LN Btri Btype3 Коэффициент Спирмена, rs 0,5093 0,4242 0,4801 р-уровень 0,0040 0,0203 0,0073 Atri 6'BnLeC 0,4162 0,4839 0,4825 0,0230 0,0073 0,0075 LeC(Fm)b3'LN 0,3846 0,0359 sp*- спейсер, представляющий собой аминоэтильный, аминопропильный или глициламинный остаток В группе пациенток с ПЭ также установлены прямые корреляционные связи с уровнем антител к производным дисахарида LeC и самому дисахариду (таблица 21, строки 1-9). Причем среди производных можно отметить сиалированные и сульфатированные структуры. Также как и в группе сравнения у больных ПЭ пациенток отмечены корреляционные связи с уровнем антител к Galβ-терминированным гликанам (таблица 21, строка 10, 24-27), однако репертуар антител, с которыми были обнаружены связи шире и более разнообразна специфичность. Необходимо отметить, что у больных пациенток уровень иммуноглобулинов G коррелирует с уровнем антител к альфа-глюкозамин- (GlcNAcα-) и бета-глюкозамин- (GlcNAcβ-) терминированным олигосахаридам (таблица 21, строка 11-23), в том числе коровым структурам О-гликанов (таблица 21, строка 12-14, 28). Коровыми являются внутренние структуры углеводных цепей, которые обычно бывают 156 скрытыми и недоступными для распознавания специфическими молекулами. Оголение коровых структур обычно происходит вследствие воспалительных стимулов на клетки и ткани, при канцерогенезе, или первичной или вторичной недостаточности ферментных систем, отвечающих за синтез гликанов. Примечательным является также обнаруженные у больных связи с уровнем антител к фукозилированным структурам (таблица 21, строка 36, 37) и структурам с терминальной сиаловой кислотой (таблица 21, строка 31,32). Таким образом, можно отметить, что в обеих группах были отмечены прямые корреляционные связи между содержанием иммуноглобулинов класса G в крови и уровнем АГАГ определенной специфичности, однако у больных пациенток отмечен более широкий и разнообразный спектр антител, с которыми установлены корреляционные связи. Это заключение подтверждает вывод, сделанный в разделе 6.5.1. о том, что репертуар АГАТ у больных пациенток шире. 157 Таблица 21 Оценка корреляционной связи между уровнем антигликановых антител известной специфичности и содержанием иммуноглобулинов класса G в периферической крови пациенток основной группы №п/п 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 Химическая структура олигосахарида Galβ1-3GlcNAcβ-sp (6-O-Bn-Galβ1)-3GlcNAcβ-sp 3-O-Su-Galβ1-3GlcNAсβ-sp Neu5Acα2-3Galβ1-3GlcNAcβ-sp Neu5Acα2-6Galβ1-3GlcNAcβ-sp Neu5Gcα2-3Galβ1-3GlcNAcβ-sp Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAcβsp Galβ1-3GlcN(Fm)β1-3Galβ13GlcNAcβ-sp Galβ1-3GlcNAcβ1-6Galβ1-4GlcNAcβsp Galβ1-3GalNAcβ1-4Galβ1-4Glcβ-sp GlcNAcβ-sp GlcNAcβ1-3GalNAcα-sp GlcNAcβ1-6(GlcNAcβ1-3)GalNAcα-sp GlcNAcβ1-6GalNAca-sp GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-sp GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-sp GlcNAcβ1-6(GlcNAcβ1-4)GalNAca-sp GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAcβ-sp GlcNAcβ1-4Galβ1-4GlcNAcβ-sp GlсNAcβ1-4(Fuca1-6)GlcNAcβ-sp GlcNAcα-sp GlcNAcα1-4GlcNAcβ-sp GlcNAcα1-6Galβ1-4GlcNAcβ-sp Galβ1-6Galβ-sp Galβ1-4Galβ-sp Galβ1-3GalNAcβ-sp Galβ1-4GalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ14GlcNAcβ-sp GalNAca1-3GalNAcα-sp GalNAcβ1-4Galβ1-4Glcβ-sp (GalNAcβ-sp)3 Neu5Acα2-6GalNAcβ-sp (Neu5Acα2-8)3-sp 4-O-SuGalβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ14GlcNAcβ-sp 3-O-Su-GalNAcβ1-4GlcNAcβ-sp GlcAβ1-3GlcNAcβ-sp Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ-sp Fucβ1-3GlcNAcβ-sp Короткое название Коэффициент Спирмена, rs руровень LeC3'LeC 0,5047 0,0068 LeC(Fm)3'LeC 0,5725 0,0017 LeCb6'LN 0,4696 0,0125 aGM1 GN core3 core4 core6 Ch2 Ch3 GN2-4,6Tn GlcNAc3'Lec GN4'LN Fa6Ch2 GNa GNa4GN GNa6'LN Ab6A Ab4A Tbb 0,5818 0,6442 0,5835 0,4247 0,3979 0,5588 0,4154 0,3843 0,4570 0,4259 0,5156 0,3815 0,4641 0,4828 0,4789 0,4729 0,3968 0,0014 0,0003 0,0014 0,0252 0,0369 0,0023 0,0288 0,0435 0,0153 0,0238 0,0056 0,0460 0,0137 0,0100 0,0107 0,0118 0,0374 Ab4ANa3'(Fa2')LN 0,4696 0,0125 core5 GA2 6SiaANb (Sia)3 0,4220 0,5966 0,4893 0,4762 0,4689 0,0262 0,0010 0,0089 0,0112 0,0118 (4'SuLN)3'LN 0,4932 0,0084 LeC 6'BnLeC LeC3'Su 3'SiaLeC 6'SiaLeC 3'SiaLeC(Gc) 0,5391 0,4652 0,4236 0,4663 0,4707 0,5572 0,0035 0,0134 0,0256 0,0132 0,0123 0,0024 LacdiNAc3'Su 0,3930 0,0395 GUb3GN 0,4631 0,0139 LeD 0,4724 0,0119 Fb3GN 0,4215 0,0264 sp*- спейсер, представляющий собой аминоэтильный, аминопропильный или глициламинный остаток 34 35 36 37 158 6.6.2. Корреляционные связи между уровнем антигликановых антител и показателями, характеризующими взаимодействие АЭАТ с клетками линии EA.hy 926 При изучении корреляционных связей между уровнем АГАТ в крови и активностью связывания АЭАТ с эндотелиальными клетками, использовали показатели медианы интенсивности флуоресценции антител к гликанам и показатели ПЦМ%, СИФ, мода; медиана. У здоровых беременных пациенток группы сравнения были выявлены прямые умеренные корреляционные связи между уровнем АГАТ и модальным каналом - величиной, характеризующей значение распределения клеток по интенсивности флуоресценции. Корреляционные связи наблюдались с антителами к Galα-терминированным гликанам (таблица 22, строка 1-4), в том числе группоспецифическим антигенам В (таблица 22, строка 2-4). Таблица 22 Оценка корреляционной связи между уровнем антигликановых антител известной специфичности в периферической крови и модальным каналом, измеренном при выявлении АЭАТ, связывающихся с эндотелиальными клетками in vitro, у пациенток группы сравнения Химическая структура олигосахарида №п/п Короткое название Коэффициент Спирмена, rs р-уровень Galα1-3Galβ1-4Glcβ-sp Aa3'Lac 1 0,3556 0,0538 Galα1-3(Fucα1-2)Galβ1-3GalNAcα-sp Btype3 2 0,4194 0,0211 Galα1-3(Fucα1-2)Galβ1-3GalNAcβ-sp Btype4 3 0,3903 0,0330 Galα1-3(Fucα1-2)Galβ-sp Btri 4 0,3705 0,0439 GalNAcα1-3Galβ-sp Adi 5 0,4123 0,0236 GlcNAcβ1-4Galβ1-4GlcNAcβ-sp GN4'LN 6 0,3515 0,0568 sp*- спейсер, представляющий собой аминоэтильный, аминопропильный или глициламинный остаток У пациенток с ПЭ, напротив, были обнаружены обратные умеренные корреляционные связи между уровнем ряда АГАТ и процентом клеток, связывающих АЭАТ (ПЦМ%). При этом в таблице 23 видно, что выделяются антитела имеющие специфичность к коровым структурам О-цепей (таблица 23 строка 1,2), а также к гликанам, имеющим коровый GalNAc 159 (таблица 23, строка 1-4), сульфатированный ди-N-ацетиллактозамин (таблица 23, строка 6) и дисахарид с терминальной глюкуроновой кислотой (таблица 23, строка 5). Таблица 23 Оценка корреляционной связи между уровнем антигликановых антител известной специфичности в периферической крови и процентом эндотелиальных клеток, покрытых антителами класса G из сыворотки пациенток основной группы Химическая структура олигосахарида №п/п Короткое название Коэффициент Спирмена, rs р-уровень GlcNAcβ1-6(GlcNAcβ1-3)GalNAcα-sp 1 core4 -0,4351 0,0216 GlcNAcβ1-3GalNAcα-sp 2 core3 -0,4280 0,0240 GlcNAca1-3GalNAcβ-sp 3 GNa3AN -0,3938 0,0381 GalNAcα1-3GalNAc(fur)β-sp 4 Fs(f)-2 -0,4937 0,0083 GlcAβ1-3GlcNAcβ-sp 5 GUb3GN -0,4428 0,0192 3,4-O-Su2-GalNAcβ1-4-GlcNAcβ-sp 6 LacdiNAc3',4'Su2 -0,3924 0,0397 sp*- спейсер, представляющий собой аминоэтильный, аминопропильный или глициламинный остаток Коровые или сердцевинные структуры гликанов в норме являются скрытыми или маскированными разнообразными углеводными остатками и недоступны для распознавания специфическими молекулами. Оголение коровых структур обычно происходит вследствие воспалительных стимулов на клетки и ткани, при канцерогенезе, или первичной или вторичной недостаточности ферментных систем, отвечающих за синтез гликанов. Как известно, взаимодействие АЭАТ с антигенными мишенями на эндотелиоцитах, возможно тремя способами: непосредственно с антигеном – классическим способом, с лиганд-рецепторным комплексом, и антигеном, мобилизованным на поверхность клетки из кровотока [4]. Полученные в данном исследовании результаты корреляционного анализа могут свидетельствовать о возможной функции ГК и/или антител к ней направленных как белка-кофактора в связывании АЭАТ с клетками эндотелия. 6.6.3. Корреляционные связи между уровнем антигликановых антител и содержанием антител к β2-гликопротеину I класса G в крови 160 В группе здоровых пациенток были обнаружены прямые корреляционные связи между содержанием антител к β2-гликопротеину I и уровнем АГАТ. специфичностей Анализ АГАТ углеводных достаточно структур показал, разнообразный: что спектр аминокислотные производные лактозы (таблица 24, строка 1-6); Galα- (таблица 24, строка 711) и GlcNAcβ- терминированные гликаны (таблица 24, строка 12-14); олигосахариды, сульфатированные по 3- и 6- положению (таблица 24, строка 15-18) GlcNAc- или GalNAc-; α- и β-рамноза (таблица 24, строка 19,20). Таблица 24 Оценка корреляционной связи междууровнем антигликановых антител известной специфичности и содержанием антител к β2-гликопротеину I класса G в периферической крови у пациенток группы сравнения №п/п 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Химическая структура олигосахарида Galβ1-4Glcβ-sp-Nle Galβ1-4Glcβ-sp-Trp Galβ1-4Glcβ-sp-Phe Galβ1-4Glcβ-sp-Ile Galβ1-4Glcβ-sp-Val Galβ1-4Glcβ-sp-Ala Galα1-6Glcβ-sp Galα1-4GlcNAcβ-sp Galα1-3Galβ1-4Glcβ-sp Galα1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-sp 6-Bn-Galα1-4(6-Bn)GlcNAcβ-sp GlcNAcβ1-4Mur-L-Ala-D-i-Gln-Lys GlcNAcβ1-4-[HOOC(CH3)CH]-3-OGlcNAcb-sp GlcNAcβ1-2Galβ1-3GalNAcα-sp 3-O-Su-GlcNAcβ-sp GlсNAcβ1-4(6-O-Su)GlcNAcβ-sp 3,6-O-Su2-GalNAcβ1-4GlcNAcβ-sp 3-O-Su-GalNAcβ1-4GlcNAcβ-sp Rhaα-sp Rhaβ-sp Короткое название Коэффициент Спирмена, rs р-уровень 0,4090 0,3968 0,3953 0,3845 0,3659 0,3483 0,5103 0,3773 0,3871 0,3574 0,3626 0,4837 0,0248 0,0299 0,0306 0,0359 0,0467 0,0593 0,0040 0,0399 0,0346 0,0525 0,0489 0,0068 GN-Mur 0,3938 0,0313 Lac-Nle Lac-Trp Lac-Phe Lac-Ile Lac-Val Lac-Ala Aa6G aLN Aa3'Lac aLN3'LN Bn2-aLN GMDPLys 14 GN2'TF 0,3804 0,0381 15 GN3Su 0,5081 0,0041 16 Ch2-6Su 0,5454 0,0018 17 LacdiNAc3',6'Su2 0,3588 0,0515 18 LacdiNAc3'Su 0,4283 0,0182 19 aR 0,4358 0,0161 20 bR 0,3717 0,0431 sp*- спейсер, представляющий собой аминоэтильный, аминопропильный или глициламинный остаток В основной группе отмечены принципиально иные связи между исследуемыми антителами: обратная корреляционная связь установлена с 161 уровнем антител к производным сиалиллактозы (таблица 25, строка 1-4), прямая связь – с уровнем антител к дисахариду Le (таблица 25, строка 5). Таблица 25 Оценка корреляционной связи между уровнем антигликановых антител известной специфичности и содержанием антител к β2-гликопротеину I в периферической крови пациенток основной группы Химическая структура олигосахарида №п/п Короткое название Коэффициент Спирмена, rs руровень Neu5Acα2-3Galβ1-4Glcβ-sp-Trp 1 3'SL-Trp -0,4632 0,0131 Neu5Acα2-3Galβ1-4Glcβ-sp-Phe 2 3'SL-Phe -0,4031 0,0334 Neu5Acα2-3Galβ1-4Glcβ-sp-Val 3 3'SL-Val -0,3913 0,0395 Neu5Acα2-3Galβ1-4Glcβ-sp-Ile 4 3'SL-Ile -0,3844 0,0434 Fucα1-4GlcNAcβ-sp 5 Le 0,4499 0,0163 sp*- спейсер, представляющий собой аминоэтильный, аминопропильный или глициламинный остаток 6.6.4. Корреляционные связи между уровнем антигликановых антител и содержанием антител к аннексину V класса G Значимые корреляционные связи между уровнем АГАТ и содержанием антител к аннексину V были обнаружены только в группе здоровых пациенток. Углеводная специфичность антител представлена в таблице, по химической структуре гликанов можно выделить антитела направленные к олигосахаридам, сульфатированным по 3- и 6- положению глюкозамина (GlcNAc-) (таблица 26, строка 2,3); производным дисахарида LeC (таблица 26,строка 4-6) и дисахариду мелибиозе (таблица 26, строка 1). Таблица 26 Оценка корреляционной связи между уровнем антигликановых антител известной специфичности и содержанием антител к аннексину V класса G в периферической крови у пациенток группы сравнения №п/п Химическая структура олигосахарида Короткое название Коэффициент рСпирмена, rs уровень Galα1-6Glcβ-sp 1 Aa6G 0,5172 0,0034 GlсNAcβ1-4(6-O-Su)GlcNAcβ-sp 2 Ch2-6Su 0,4628 0,0100 3-O-Su-GlcNAcβ-sp 3 GN3Su 0,4514 0,0123 (6-O-Bn-Galβ1)-3GlcNAcβ-sp 4 6'BnLeC 0,4024 0,0275 Galβ1-3GlcNAcα1-6Galβ1-4GlcNAcβ-sp 5 LeCa6'LN 0,3539 0,0550 Galβ1-3GlcNAcα1-3Galβ1-3GlcNAcβ-sp 6 LeCa3'LeC-C3 0,3514 0,0569 sp*- спейсер, представляющий собой аминоэтильный, аминопропильный или глициламинный остаток 162 6.6.5. Корреляционные связи между уровнем антигликановых антител и содержанием антителк протромбину класса G Анализ корреляционных связей между уровнем АГАТ и содержанием антител к протромбину показал, что значимые связи были установлены только в группе сравнения. Специфичность АГАТ представлена в таблице: антитела к Galα-терминированным олигосахаридам (таблица 27, строка 1-3); антитела к GlcNAcβ-терминированным олигосахаридам (таблица 27, строка 7-9); антитела к производным дисахарида LeC (таблица 27, строка 4-6); антитела к арабиноолигосахариду (таблица 27, строка 10). Таблица 27 Оценка корреляционной связи между уровнем антигликановых антител известной специфичности и содержанием антител к протромбину класса G в периферической крови у пациенток группы сравнения №п/п Химическая структура олигосахарида Короткое название Коэффициент Спирмена, rs руровень Aa6G 0,5077 0,0042 aLN 0,3565 0,0531 aLN3'LN 0,3645 0,0476 LeCa6'LN 0,4406 0,0148 LeCa3'LeC 0,4244 0,0194 LeCa3'LN 0,3931 0,0317 GMDPLys 0,3499 0,0580 Ch2-6Su 0,3480 0,0595 GN2'TF 0,4228 0,0199 Araf6 0,3612 0,0499 sp*- спейсер, представляющий собой аминоэтильный, аминопропильный или глициламинный остаток 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Galα1-6Glcβ-sp Galα1-4GlcNAcβ-sp Galα1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-sp Galβ1-3GlcNAcα1-6Galβ1-4GlcNAcβ-sp Galβ1-3GlcNAcα1-3Galβ1-3GlcNAcβ-sp Galβ1-3GlcNAcα1-3Galβ1-4GlcNAcβ-sp GlcNAcβ1-4Mur-L-Ala-D-i-Gln-Lys GlсNAcβ1-4(6-O-Su)GlcNAcβ-sp GlcNAcβ1-2Galβ1-3GalNAcα-sp (Arafβ1-2Arafα)2-3,5-Arafα1-5Arafα-sp 6.6.6. Корреляционные связи между уровнем антигликановых антител и содержанием антител к кардиолипину класса G Значимые корреляционные связи между уровнем АГАТ и содержанием антител к кардиолипину также были установлены только в группе сравнения. Специфичность антител к гликанам показана в таблице: антитела к аминокислотным производным лактозы (таблица 28, строка 1-8); антитела к мелибиозе (таблица 28, строка 9); антитела к сульфатированной хитобиозе 163 (таблица 28, строка 10); антитела к ди-N-ацетиллактозамину (таблица 28, строка 11). Таблица 28 Оценка корреляционной связи между уровнем антигликановых антител известной специфичности и содержанием антител к кардиолипину класса G в периферической крови у пациенток группы сравнения №п/п Химическая структура олигосахарида Короткое название Коэффициент Спирмена, rs руровень Lac-Phe 0,4509 0,0124 Lac-Ile 0,4314 0,0173 Lac-Nle 0,4261 0,0189 Lac-Trp 0,4211 0,0205 Lac-Ala 0,4174 0,0217 Lac-Val 0,4136 0,0231 Lac-Gly 0,3815 0,0375 Lac-Arg 0,3577 0,0523 Aa6G 0,4926 0,0057 Ch2-6Su 0,4634 0,0099 LacdiNAc3',6'Su2 0,3496 0,0582 sp*- спейсер, представляющий собой аминоэтильный, аминопропильный или глициламинный остаток 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Galβ1-4Glcβ-sp-Phe Galβ1-4Glcβ-sp-Ile Galβ1-4Glcβ-sp-Nle Galβ1-4Glcβ-sp-Trp Galβ1-4Glcβ-sp-Ala Galβ1-4Glcβ-sp-Val Galβ1-4Glcβ-Gly Galβ1-4Glcβ-sp-Arg Galα1-6Glcβ-sp GlсNAcβ1-4(6-O-Su)GlcNAcβ-sp 3,6-O-Su2-GalNAcβ1-4-GlcNAcβ-sp 6.6.7. Корреляционные связи между уровнем антигликановых антител и содержанием антител к фосфатидилсерину класса G У здоровых пациенток значимые корреляционные связи были установлены между содержанием антител к фосфатидилсерину и уровнем антител: к GlсNAcβ-терминированным олигосахаридам (таблица 29, строка 1,2); к сиалированному производному дисахарида LeC (таблица 29, строка 3); к мелибиозе (таблица 29, строка 4) Таблица 29 Оценка корреляционной связи между уровнем антигликановых антител известной специфичности и содержанием антител к фосфатидилсерину класса G в периферической крови у пациенток группы сравнения №п/п Химическая структура олигосахарида Короткое название Коэффициент Спирмена, rs руровень GlcNAcβ1-4Mur-L-Ala-D-i-Gln-Lys 1 GMDPLys 0,4252 0,0192 GlсNAcβ1-4(6-O-Su)GlcNAcβ-sp 2 Ch2-6Su 0,3713 0,0434 Neu5Acα2-3Galβ1-3GlcNAcβ-sp 3 3'SiaLeC 0,3980 0,0294 Galα1-6Glcβ-sp 4 Aa6G 0,4165 0,0220 ManNAcβ-sp 5 bMN 0,3488 0,0589 sp*- спейсер, представляющий собой аминоэтильный, аминопропильный или глициламинный остаток 164 У пациенток с ПЭ значимые корреляционные связи установлены с уровнем антител, имеющими специфичность к аминокислотным производным лактозы (таблица 30, строка 1-4); к гликанам с лактозой в коре (таблица 30, строка 5-9). Таблица 30 Оценка корреляционной связи между уровнем антигликановых антител известной специфичности и содержанием антител к фосфатидилсерину в периферической крови пациенток основной группы Короткое Коэффициент рназвание Спирмена, rs уровень Galβ1-4Glcβ-sp-Ile 1 Lac-Ile 0,3827 0,0444 Galβ1-4Glcβ-sp-Val 2 Lac-Val 0,3807 0,0457 Galβ1-4Glcβ-sp-Nle 3 Lac-Nle 0,3804 0,0458 Galβ1-4Glcβ-sp-Phe 4 Lac-Phe 0,3779 0,0474 Galα1-3Galβ1-4Glcβ-sp 5 Aa3'Lac 0,4342 0,0210 Neu5Aα2-3Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ-sp 6 LSTa 0,3898 0,0403 Fucα1-2Galβ1-4Glcβ-sp 7 Htype6 0,4112 0,0297 GlcNAcα-sp 8 GNa 0,4386 0,0195 Ab4ANa3'(F Galβ1-4GalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ1-4GlcNAcβ-sp 9 -0,3934 0,0384 a2')LN sp*- спейсер, представляющий собой аминоэтильный, аминопропильный или глициламинный остаток №п/п Химическая структура олигосахарида Резюме Анализ корреляционных связей между уровнем АГАТ, содержанием Ig класса G и активностью связывания АЭАТ IgG в группе здоровых беременных и пациенток с ПЭ показал отсутствие общих связей с уровнем антител направленных к индивидуальным гликанам. При этом отмечалось наличие корреляционных связей с уровнем антител к углеводным структурам, которые по признакам структурного родства относятся к одной группе. Например, анализ корреляционных связей между уровнем АГАТ и содержанием Ig класса G показал, что у здоровых пациенток корреляционная группа более узкая: группоспецифическим антигенам являются корреляции антигенам выявлены (антитела естественными с к антителами, уровнем антител к группоспецифическим представленными у индивидуумов соответствующей группы крови) и уровнем антител к Galβтерминированным гликанам и производным дисахарида LeC. При этом 165 репертуар специфичностей антител к Galβ-терминированным гликанам и производным дисахарида LeC ограничен двумя структурами в каждой группе. У больных пациентов корреляционные связи с уровнем антител к группоспецифическим антигенам отсутствуют, а репертуар специфичностей антител к производным дисахарида LeC и Galβ-терминированным гликанам значительно более широкий:10 и 5 специфичностей соответственно. Также у больных пациенток выявлены корреляционные связи с уровнем антител к альфа- и бета- N-ацетилглюкозамин-терминированным гликанам, в том числе и структурам кора. Необходимо отметить, что выявленные корреляционные связи в обеих группах – прямые, т.е. чем выше содержание IgG в крови, тем выше уровень антител к гликану соответствующей специфичности. Таким образом, на основании корреляционного анализа можно предположить, что у пациенток обеих групп, несмотря на присутствие в крови АГАТ ко всем исследованным гликанам (в большем или меньшем количестве) и значимых отличиях по определенному спектру антител, существуют принципиально разные количественные взаимоотношения между молекулами иммуноглобулинов, которые, вероятно, находят отражение в изменении гомеостатического баланса при патологии. Изучение показателями, корреляционных отражающими связей между активность уровнем связывания АГАТ, и АЭАТ с эндотелиальными клетками показало, что в группе больных и здоровых были выявлены разные связи: эпитопная специфичность АГАТ в обеих группах пациентов была различной, направление корреляционной связи также было разным в обеих группах. То есть повышение активности связывания АЭАТ IgG с клетками связано с повышением уровня определенного спектра антигликановых антител в крови здоровых пациенток; и снижение активности связывания АЭАТ IgG с клетками связано с повышением уровня другого спектра антигликановых антител в крови больных пациенток. Поскольку нами были выявлены значимо повышенные показатели активности связывания АЭАТ IgG с клетками у больных пациенток, а у 166 здоровых значения активности связывания были низкими, то можно предположить, что выявленный спектр АГАТ, вероятно, регулирует активность связывания АЭАТ IgG с клетками. Особо следует отметить наличие прямой корреляции между уровнями антител к гиалуроновой кислоте [-4GlcAβ1-3GlcNAcβ1-]n и дисахаридному повторяющемуся звену GlcAβ1-3GlcNAcβ этого регулярного полисахарида, в когорте здоровых беременных rs =0,677, p=0,0006, а в когорте с ПЭ rs =0,784, p=0,00001, что позволяет нам считать антитела, связывающиеся с полимером и с его фрагментом, идентичными, или, по крайней мере, близкими по эпитопной специфичности. Неожиданным оказалось наличие значимо отрицательной корреляции между активностью связывания АЭАТ и уровнем анти-гиалуроновых антител. Мы предполагаем, что физиологическая роль анти-гиалуроновых антител состоит в down-регуляции способности гиалуроновой кислоты активировать аллоиммунитет [355], что особенно критично при беременности. Наличие обратной корреляционной связи между активностью связывания АЭАТ и уровнем анти-гиалуроновых антител может быть обусловлено наличием третьего фактора, предположительно – свободной гиалуроновой кислоты. Мы предполагаем, что повреждающее действие на эндотелиальные клетки оказывают АЭАТ(IgG), которые характеризуются повышенной активностью связывания с клетками эндотелия у больных пациенток. А АГАТ (IgG), по-видимому, препятствуют цитотоксическому действию АЭАТ, но, вследствие разрушения гликокаликса при воспалительном ответе и возрастании количества циркулирующей ГК, протективное действие антигликановых антител нивелируется. ГК не обязательно прочно связана с гликокаликсом, она встречается и в свободном виде: в лимфе ее концентрация достигает величины 55 мкг/мл, а в крови даже100 мкг/л [281, 282, 283]; при патологии отмечается повышение ее содержания [279, 284], в том числе при ПЭ [121, 287, 288]. Так как 167 циркулирующий полимер частично маскирует антитела; в действительности уровень антител при ПЭ должен быть повышен даже в более заметной степени, чем выявляется в наших экспериментах. Косвенно это подтверждается фактом, что только уровень IgG, но не IgM-антител (имеется в виду усредненный уровень для всей когорты) увеличивается при патологии; это можно объяснить предпочтительной нейтрализацией именно иммуноглобулинов M циркулирующей мультивалентной ГК. Неожиданными оказались также результаты анализа корреляционных связей между уровнем АГАТ и содержанием АФА в крови. У здоровых пациентов выявлены прямые корреляционные связи между содержанием АФА ко всем исследованным мишеням (β2-гликопротеину-I, аннексину V, протромбину, кардиолипину, фосфатидилсерину) и уровнем АГАТ определенного спектра. Причем были обнаружены связи между содержанием АФА к нескольким мишеням и уровнем АГАТ, специфически связывающие индивидуальные гликаны. Например, была выявлена связь между уровнем антител к дисахариду мелибиозе (Aa6G), сульфатированной хитобиозе (Ch26Su) и содержанием АФА всего исследованного спектра в группе здоровых пациентов. Также у здоровых пациенток выявлены корреляционные связи между уровнем антител к фрагментам пептидогликана клеточной стенки бактерий GMDPLys и содержанием антител к к β2-гликопротеину-I, фосфатидилсерину и аннексину. У пациенток с ПЭ были выявлены корреляционные связи только между содержанием антител к β2-гликопротеину-I, фосфатидилсерину и уровнем АГАТ определенной специфичности. Так, обнаружена обратная корреляционная связь между содержанием антител к β2-гликопротеину-I и уровнем антител к аминокислотным производным сиалиллактозы. Обращает на себя внимание, что прямые корреляционные связи между уровнем антител к аминокислотным производным лактозы и содержанием АФА выявлены как у здоровых беременных (с антителами к β2-гликопротеину-I, кардиолипину), так и у больных пациенток (с антителами к фосфатидилсерину). 168 Таким образом, показаны разные закономерности формирования связей между гуморальными факторами специфического иммунитета у здоровых и больных пациенток. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Основной функцией иммунной системы, основанной на способности отличать “свое” от “чужого”, является поддержание иммунного гомеостаза, что достигается путем осуществления комплекса клеточных и гуморальных иммунных реакций, направленных на элиминацию из организма генетически чужеродного материала. С позиции представлений классической иммунологии плод в организме матери представляет собой полуаллогенный трансплантат, несущий чужеродные отцовские антигены, которые должны быть отторгнуты иммунной системой матери. На сегодняшний день считается, что феномен “неотторжения плода” обеспечивается комплексом иммунологических механизмов, действие которых проявляется с момента оплодотворения [356]. Возникающая в период беременности “временная толлерантность”, потеря которой инициирует акт родов в норме, или разную степень проявления отторжения плода при патологии беременности, является ключевым звеном в этом феномене. Формирование иммунологической толерантности, в свою очередь является мультифакторным процессом, природа которого остается в стадии изучения [357]. Существует множество гипотез, которые пытаются объяснить феномен неотторжения плода и исследовать молекулярные механизмы, лежащие в его основе [358]. Одной из самых перспективных гипотез, является гипотеза “фето-эмбриональной защиты”, впервые опубликованная в 1996 году Гари Кларком [359]. К 2014 году была сформулирована теория “фето-эмбриональной защиты плацентарных” eutherian feto-embryonic defence system (eu-FEDS), основанная на доказательствах, что гликоконъюгаты участвуют в процессах распознавания 169 “свое” - “чужое”. Определенный паттерн гликозилирования клетки обеспечивает защиту от иммунного надзора. Также, гликоконъюгаты способны блокировать углевод-опосредованную адгезию, а определенные типы углевод-белкового активировать взаимодействия ингибирующие между клетками (регуляторные) способны сигналы [360]. Дополнительным аргументом, свидетельствующим в пользу теории, является открытие “углеводного кода” плаценты и установление его значения для плацентации у млекопитающих [361, 362]. Теория фето-эмбриональной защиты гармонично укладывается в интегральную модель иммунного ответа при беременности, согласно которой взаимоотношения в системе матьплацента-плод осуществляются на принципе иммуномодуляции и блокирования потенциально опасных для матери и плода иммунных реакций [363]. Преэклампсия является наиболее ярким примером гиперактивации иммунной системы и срыва механизмов формирования толерантности к полуаллогенному плоду. Поэтому мы предположили, что гуморальные факторы как “зеркало иммунной системы” отражают механизмы формирования патологии. Целью работы явилось изучение растворимых форм МКА и спектра аутоантител, и выявление взаимосвязи между исследуемыми молекулами. На первом этапе работы была дана характеристика гуморальных факторов в динамике беременности. Значимые отклонения от нормы были выявлены с ранних сроков беременности (sICAM-1, sL-селектин), что согласуется с литературными данными. Наиболее выраженные изменения выявлены во второй половине беременности и, особенно, в III триместре. Нами была показана разная динамика изменения растворимых форм МКА и аутоантител у здоровых и больных пациенток, а также выявлены значимые различия, свидетельствующие о наличии выраженной эндотелиальной активации у пациенток c ПЭ, признаки которой нарастают к III триместру. Изучение гуморального ответа против эндотелия подтвердило гетерогенность АЭАТ. 170 Высокая активность связывания АЭАТ(IgM), а также значимое повышение активности связывания АЭАТ(IgG) на сроке 21-26 недель у здоровых пациенток указывает на их гомеостатическую роль при физиологической беременности, что было отмечено также и другими исследователями [175]. Известно также, что естественные АЭАТ присутствуют в крови здоровых доноров и оказывают протективное действие на эндотелиальные клетки [6]. Напротив, активность связывания: АЭАТ(IgМ) на сроке 21-26 недель и АЭАТ(IgG) в III триместре – была значимо выше у больных пациенток, что предполагает их участие в патогенезе заболевания. Патогенетическое значение АЭАТ(IgG) было установлено в исследованиях Yamamoto T.,1998, где было показано, что у пациенток III триместра высокий уровень антител связан с протеинурией, а также выявлено цитотоксическое действие антител на культивируемые эндотелиальные клетки HUVEC [178]. Полученные результаты согласуются с данными, полученными другими исследователями, которые свидетельствуют об участии АЭАТ(IgМ) преимущественно в гомеостатических процессах, а АЭАТ(IgG) – патогенетически значимых процессах [166]. Исследование позволило выявить особенности иммунного ответа на антигены эндотелиальных клеток при беременности и установить взаимосвязь между аутоантителами. изученными факторами Показано растворимыми физиологической воспаления/активации наличие значимых формами беременности МКА. взаимосвязь эндотелия взаимосвязей Оказалось, между между что разными и при типами растворимых форм МКА существует во всех триместрах, при преэклампсии – только в I и II триместрах. При рассмотрении связей между МКА и аутоантителами отмечены следующие закономерности: при физиологической беременности взаимосвязи установлены в I и II триместрах, при преэклампсии - только в III триместре, причем для растворимой формы Eселектина и АЭАТ обоих классов (M и G), что указывает на возможность участия этих факторов в патологическом процессе. 171 Таким образом, на первом этапе исследования было показано, что полученные результаты подтверждают активацию гуморального звена иммунитета при ПЭ на исследуемой выборке пациенток, причем наиболее выраженные изменения наблюдаются в III триместре. Однако, спектр изученных факторов не является специфичным для ПЭ, а отражает воспаление и эндотелиальную активацию. Поэтому следующим этапом явился поиск факторов, значимых для механизмов формирования иммунологической толерантности к плоду. Теория о функциональном углеводном коде, который обусловливает возможность межвидового скрещивания у плацентарных млекопитающих, широко обсуждается в литературе [361, 362]. Мы предположили, что фенотип сруктур плаценты различен при нормальной беременности и осложненной ПЭ и это различие отражается на спектре аутоантител к углеводным молекулам. В литературе имеются немногочисленные работы, посвященные изучению углеводного фенотипа плаценты у здоровых пациенток [268] и пациенток с гипертензивными расстройствами при беременности, и ПЭ, в частности [269]. Полученные нами результаты исследования фенотипа плаценты при физиологической беременности практически полностью согласуются с результатами, полученными другими исследователями [268]. синцитиотрофобласта и Выявленные эндотелия различия в терминальных гликозилировании ворсин плаценты позволили сделать ряд заключений. Во-первых, установлено снижение функциональных углеводных остатков, детектируемых лектинами ECL, SNA, MAL II, VVL и UEA I в синцитии по сравнению с эндотелием терминальных ворсин при физиологической беременности. Данная закономерность сохраняется в группе с умеренной ПЭ при окраске лектинами ECL, SNA, MAL II и UEA I. При тяжелой ПЭ данные различия сохраняются только для лектинов ECL и UEA I. Во-вторых, в эндотелии терминальных ворсин плаценты при тяжелой ПЭ выявлено повышенное содержание функциональных остатков маннозы (детектируемых окрашиванием лектином 172 Con A), которые при связывании с лигандами -эндогенными лектинами Стипа, способны активировать эффекторные механизмы иммунитета. При этом нами было выявлено снижение 3’-сиалозидов (детектируемых лектином MAL II) и 6’-сиалозидов (детектируемых лектином SNA) в эндотелии терминальных ворсин плаценты при тяжелой и умеренной ПЭ, соответственно. Известно, что одним из механизмов, ограничивающих иммунный ответ матери на фетальные антигены является отсутствие экспрессии высокополиморфных молекул HLA синцитиотрофобластом, и, напротив, экспрессия малополиморфных или олигоморфных молекул – HLA-C, HLA-E, HLA-G [364, 365]. Избирательная экспрессия обуславливает отсутствие на фетальных клетках, имеющих непосредственный контакт с иммунными клетками матери, мишеней, взаимодействие с которыми активирует эффекторные механизмы, направленные на отторжение полуаллогенного плода [356, 366]. Не исключено, что механизм избирательной экспрессии не ограничивается только молекулами HLA-системы. Мы не обнаружили полного отсутствия изученных нами гликанов на синцитиотрофобласте, но выявленная закономерность указывает на наличие механизмов, ограничивающих представленность функциональных углеводных остатков в синцитии при физиологической беременности, что может быть значимым для формирования иммунологической толерантности при беременности. Выявленные изменения эндотелия терминальных ворсин плаценты при ПЭ указывают на повышенное содержание углеводных лигандов для активирующих рецепторов (терминальные остатки маннозы), и сниженное – для ингибирующих (терминальные остатки сиаловой кислоты). Поскольку остатки терминальной сиаловой кислоты маскируют потенциально “опасные” для организма молекулы, в частности, антигены опухолей и патогенных микроорганизмов, что делает их невидимыми для иммунной системы [272, 367, 368, 369], то их снижение при ПЭ может явиться патогенетическим механизмом заболевания. Напротив, при физиологической 173 беременности терминальная сиаловая кислота, которая является лигандом для сиглеков, представленных, в основном, ингибиторными рецепторами, может способствовать формированию толерантности. Полученные данные подтверждают формирование углеводного кода связанного с нормой и патологией, а также позволяют предполагать наличие изменений в пуле гуморальных факторов – антигликановых антител. Для проверки этой гипотезы мы изучили гуморальный ответ на широкую панель углеводных антигенов. Было установлено, что антитела к гликанам присутствуют в крови пациенток обеих исследуемых групп, но при ПЭ спектр антигликановых антител шире. Подробное обсуждение спектра значимых антител приводится в разделе “комплексное исследование антител при нормальной и осложненной преэклампсией беременности”. Основным итогом данного этапа исследования явилась: во-первых, идентификация спектра антител к гликанам, экспрессия которых показана при онкотрансформациях; во-вторых, ксеноантигенам; в-третьих, гликанам гликокаликса; в-четвертых, гликанам, которые являются лигандами эндогенных лектинов – биологически активных молекул, взаимодействие с которыми регулирует межклеточные контакты, передачу сигнала, функциональные свойства и численность клеток иммунной системы в организме. Последний пункт представляется нам наиболее значимым, поскольку указывает на участие идентифицированных антител в иммунорегуляции при беременности. Также значимым итогом является выявление взаимосвязей между антигликановыми антителами и антителами к фосфолипидам, фосфолипид-связывающим белкам, эндотелиальным клеткам, поскольку известно, что вышеописанные антитела имеют общие мишени. Установлено, что взаимосвязи, выявленные в группе здоровых и больных пациенток различны, у больных часто выявляются реципроктные связи, что демонстрирует разные закономерности в пуле аутоантител в норме и патологии. 174 Обобщая вышесказанное, полученные данные подтверждают теорию фетоэмбриональной защиты плацентарных, поскольку в исследованных когортах доказано различное гликозилирование структур плаценты; выявлен широкий спектр антигликановых антител, по которым показаны значимые различия между когортами. Проведено маштабное комплексное исследование аутоантител, дана паспортизация гуморального иммунного ответа при беременности. Полученные данные имеют большое научное и практическое значение и открывают перспективы для исследования диагностической значимости аутоантител, поиска их мишеней на клетках иммунной системы, репродуктивного тракта, фетоплацентарной системы в норме и при преэклампсии, их влияния на ангиогенез и инвазивные свойства клеток фетального происхождения. Исследование вышеназванных процессов и механизмов позволит получить новые знания о формировании иммунологической толерантности и патогенезе ПЭ. 175 ВЫВОДЫ 1. 2. 3. 4. В крови пациенток с физиологической беременностью и преэклампсией присутствуют антитела, взаимодействующие с антигенами эндотелиальных клеток линии EA.hy 926, выявляемые методом проточной цитометрии. При преэклампсии антигенсвязывающая активность антител IgM увеличена в 21-26 недель беременности, а антител IgG – в III триместре беременности, по сравнению с аналогичными показателями при физиологической беременности. При преэклампсии в периферической крови матери наблюдается повышенное содержание sICAM-1, sVCAM-1 и sE-селектина и сниженное - sL-селектина, что отражает эндотелиальную активацию и является свидетельством развития воспалительного каскада. Наиболее выраженные отклонения от параметров гуморального иммунитета, наблюдаемых в норме, выявлены при преэклампсии во II и III триместрах. Ткань плаценты при преэклампсии характеризуется измененным углеводным фенотипом по сравнению с тканями нормальной плаценты; выраженность изменений зависит от степени тяжести преэклампсии. У пациенток с тяжелой преэклампсией в эндотелии терминальных ворсин плаценты обнаружено максимальное содержание маннозных остатков, которые являются функциональными рецепторами эндогенных лектинов С-типа. Выявлено снижение количества терминальных остатков сиаловой кислоты: α2-6 связанной с галактозой при умеренной преэклампсии, и α2-3 связанной с лактозамином при тяжелой преэклампсии. При беременности выявляются антитела, взаимодействующие с широким спектром углеводных антигенов. Преэклампсия характеризуется более выраженным гуморальным ответом на углеводные антигены, чем при физиологической беременности, что проявляется в повышенном уровне антигликановых IgG к коровым структурам гликанов, структурам гликанов с 176 5. терминальными остатками GalNAc- и β-GlcNAc. При этом пациентки исследуемых групп не различаются по уровням общего IgM и IgG в крови, и серонегативны по антифосфолипидным антителам к кардиолипину, β2гликопротеину-I, протромбину, аннексину V и фосфатидилсерину. Выраженный дисбаланс гуморальных факторов иммунитета выявлен при преэклампсии в III триместре беременности. Зависимости между содержанием отдельных молекул клеточной адгезии в крови обнаружены у пациенток с физиологической беременностью на всех исследованных сроках; в I II триместрах они связаны с аутоантителами. У пациенток с преэклампсией связи между содержанием молекул клеточной адгезии выявлены только в I и II триместрах; в III триместре обнаружены обратные связи между уровнем sEселектина и активностью связывания IgM и IgG антител с клетками эндотелия. Обратная зависимость между уровнем антител G класса к структурному дисахариду гиалуроновой кислоты -GlcAβ1-3GlcNAcβ- и активностью связывания антиэндотелиальных (IgG) с клетками эндотелия выявлена при преэклампсии в III триместре беременности. 177 БЛАГОДАРНОСТИ Автор выражает благодарность д.м.н., профессору Л.В. Ванько, д.б.н. М.А. Николаевой, к.м.н. Л.В. Кречетовой, к.м.н. И.В. Менжинской, к.б.н. Н.С. Логиновой, к.б.н. Н.К. Матвеевой, м.н.с. Степановой Е.О., фельдшерулаборанту Н.Н. Курнаковой (лаборатория клинической иммунологии, ФГБУ НЦАГ и П им. В.И.Кулакова, Минздрава России, Москва) за помощь в работе и конструктивные обсуждения результатов, а также всему коллективу лаборатории клинической иммунологии; д.м.н., профессору А.И. Щеголеву, к.м.н. Н.В. Низяевой, к.б.н. Г.В. Куликовой, к.м.н. Ю.С. Волковой, а также всему коллективу 2-го патологоанатомического отделения ФГБУ НЦАГ и П им. В.И.Кулакова, Минздрава России, Москва за сотрудничество в исследовании углеводного профиля плаценты; д.м.н., доценту Кан Н.Е., д.м.н., доценту Тютюнику В.Л., к.м.н. Амиросланову Э.Ю., а также всему коллективу акушерского обсервационного отделения ФГБУ НЦАГ и П им. В.И.Кулакова, Минздрава России, Москва; д.м.н., профессору Ходжаевой З.С., врачу акушеру–гинекологу к.м.н. Николаевой А.В., врачу акушеру– гинекологу Вавиной О.В., а также всему коллективу 1-го акушерского отделения патологии беременности ФГБУ НЦАГ и П им. В.И.Кулакова, Минздрава России, Москва за предоставление клинической информации по пациентам и помощь в формировании групп исследования; д.х.н., профессору Н.В. Бовину, к.х.н. Н.В. Шиловой, к.х.н. М.Ю. Новаковскому, Н.Р. Хасбиуллиной, а также всему коллективу лаборатории углеводов, ФГБУН ИБХ РАН, Россия, Москва за печать гликочипов, обсуждение результатов и всестроннюю помощь; а также руководителю диссертационной работы академику РАН, профессору д.м.н. Г.Т. Сухих за постоянную поддержку. 178 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Преэклампсия : монография / Под ред. Г. Т. Сухих, Л. В. Мурашко. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2010. – 576 с. 2. Гипертензивные расстройства во время беременности, в родах и послеродовом периоде. Преэклампсия. Эклампсия [ Электронный ресурс ] : клинические рекомендации Министерства здравоохранения Российской Федерации / Г.Т. Сухих [и др.]. – М., 2013. – 85 с. – Режим доступа : http://www.ncagip.ru/upload/obrazovanie/4.pdf, свободный. – Загл. с экрана (10.12.13). 3. Diagnosis, evaluation, and management of the hypertensive disorders of pregnancy: executive summary / L. A. Magee [ et al. ] // J. Obstet. Gynaecol. Can. – 2014. – Vol. 36, № 5. – P. 416-441. 4. Youinou, P. New target antigens for antiendothelial cell antibodies / P. Youinou // Immunobiology. – 2005. – Vol. 210, № 10. – P. 789-797. 5. Identification of target antigens of anti-endothelial cell antibodies in healthy individuals : A proteomic approach / A. Servettaz [ et al. ] // Proteomics. – 2008. – Vol. 8, № 5. – P. 1000-1008. 6. Natural anti-endothelial cell antibodies / A. Servettaz [ et al. ] / Autoimmun. Rew. – 2008. – Vol. 7, № 6. – P. 426-430. 7. Van Aken, B. E. Interleukin 8 and venous thrombosis : evidence for a role of inflammation in thrombosis / B. E. van Aken, P. H. Reitsma, F. R. Rosendaal // Br. J. Haematol. – 2002. – Vol. 116, № 1. – P.173-177. 8. Estrogen, inflammation and cardiovascular risk in women: a critical appraisal / S. Störk [ et al. ] // Trends Endocrinol. Metab. – 2004. – Vol. 15, № 2. – P. 66-72. 9. Синдром системного воспалительного ответа в акушерстве : монография / Под ред. А. Д. Макацария, В. О. Бицадзе, С. В. Акиньшина. – М. : Медицинское информационное агентство, 2006. – 448 с. 179 10. Arid, W. C. Endothelium in health and disease / W.C. Arid // Pharmacol. Rep. – 2008. – Vol. 60, № 1. – P. 139-143. 11. The activity of soluble VCAM-1 in angiogenesis stimulated by IL-4 and IL-13 / J.-I. Fukushi [ et al. ] // J. Immunol. – 2000. – Vol. 165, № 5 – P. 28182823. 12. Expression of adhesion molecules during normal pregnancy / J. Pafilis [ et al. ] // Cell Tiss. Res. – 2007. – Vol. 329. – P. 1-11. 13. Nakao, S. Pathophysiology and treatment of a plastic anemia : useful markers for the diagnosis of immune pathophysiology / S. Nakao // Rinsho Ketsueki. – 2003. – Bd. 44, № 3. – S. 121-128. 14. Щербаковская, Э. А. Иммунологические прогрессирования гестоза / Э. А. механизмы Щербаковская // Тихоокеанский медицинский журнал. – 2006. – № 4. – С. 47-50. 15. Vascular endothelial growth factor synergistically enhances induction of E-selectin by tumor necrosis factor-alpha / A. K. Stannard [ et al. ] // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2007. – Vol. 27, № 3. – P. 494-502. 16. Inflammatory disturbances in preeclampsia : relationship between maternal and umbilical cord blood [ Electronic resource ] / C. Catarino [ et al. ] // J. Pregnancy. – 2012. – Mode of access : http:// www.ncbi.nlm.gov/pmc/articles/PMC3366239/pdf/JP2012-684384.pdf 17. Dealtry, G. B. The Th2 cytokine environment of the placenta / G. B. Dealtry, M. K. O'Farrell, N. Fernandez // Int. Arch. Allergy. Immunol. – 2000. – Vol. 123, № 2. – P. 107-119. 18. IgG asymmetric molecules with antipaternal activity isolated from sera and placenta of pregnant human / I. Malan Borel [ et al. ] // J. Reprod. Immunol. – 1991. – Vol. 20, № 2. – P. 129-140. 19. Low levels of serum asymmetric antibodies as a marker of threatened pregnancy / G. Barrientos [ et al. ] // J. Reprod. Immunol. – 2009. – Vol. 79, № 2. – P. 201-210. 180 20. Activating auto-antibodies against the AT1 receptor in preeclampsia / R. Dechend [ et al. ] // Autoimmun. Rev. – 2005. – Vol. 4, № 1. – P. 61-65. 21. Anti-endothelial cell antibodies interfere in apoptotic cell clearance and promote thrombosis in patients with antiphospholipid syndrome / A. Graham [ et al. ] // J. Immunol. – 2009. – Vol. 182, № 3. – P. 1756-1762. 22. Hanly, J. G. Antiphospholipid syndrome : an overview / J. G. Hanly // Can. Med. Assoc. J. – 2003. – Vol. 168, № 13. – P. 1675-1682. 23. Keswani, S. C. Antiphospholipid syndrome / S. C. Keswani, N. Chauhan // J. Royal Soc. Med. – 2002. – Vol. 95, № 7. – P. 336-342. 24. Rai, R. Obstetric management of antiphospholipid syndrome / R. Rai // J. Autoimmun. – 2000. – Vol. 15, № 2. – P. 203-207. 25. Scott, D. W. Endothelial heterogeneity and adhesion molecules N- glycosylation : implications in leukocyte trafficking in inflammation / D. W. Scott, R.P. Patel // Glycobiology. – 2013. – Vol. 23, № 6. – P. 622-633. 26. Laresgoiti-Servitje, E. A leading role for the immune system in the pathophysiology of preeclampsia / E. Laresgoiti-Servitje // J. Leukoc. Biol. – 2013. – Vol. 94, № 2. – P.247-257. 27. Heil, M. Danger signals - damaged-self recognition across the tree of life / M. Heil, W.G. Land // Front. Plant. Sci. – 2014. – Vol. 31, № 5. – P. 578. 28. Gaudet, A. D. Extracellular matrix regulation of inflammation in the healthy and injured spinal cord / A. D. Gaudet, P. G. Popovich // Exp. Neurol. – 2014. – Vol. 258. – P. 24-34. 29. Lutz, H. U. Naturally occurring auto-antibodies in homeostasis and disease / H. U. Lutz, C. J. Binder, S. Kaveri // Trends Immunol. – 2009. – Vol. 30, № 1. – P. 43-51. 30. Бовин, Н. В. Естественные антитела к гликанам / Н. В. Бовин // Биохимия. – 2013. – Т. 78, № 7. – С. 1008-1022. 31. Anti-beta2-glycoprotein I antibodies induce tissue factor in endothelial cells / A. Kornberg [et al.] // Israel Med. Assoc. J. – 2000. – Vol .2 (Suppl.). – P. 27-31. 181 32. Alchi, B. What nephrologists need to know about antiphospholipid syndrome / B. Alchi, M. Griffiths, D. Jayne // Nephrol. Dial. Transplant. – 2010. – Vol. 25, № 10. – P. 3147-3154. 33. Lim, W. Management of antiphospholipid antibody syndrome / W. Lim, M. A. Growther, J. W. Eikelboom // J. Am. Med. Assoc. – 2006. – Vol. 295, № 9. – P. 1050-1057. 34. Inflammation in pregnancy : its roles in reproductive physiology, obstetrical complications, and fetal injury / R. Romero [ et al. ] // Nutr. Rew. – 2007. – Vol. 65, № 12 (Pt. 2). – P. 194-202. 35. Inflammation and pregnancy / J. R. Challis [ et al. ] // Reprod. Sci. – 2009. – Vol. 16, № 2. – P. 206-215. 36. Inflammatory pathways in female reproductive health and disease / H. N. Jabbour [ et al. ] // Reproduction. – 2009. – Vol. 138, № 6. – P. 903-919. 37. Systemic inflammatory priming in normal pregnancy and preeclampsia : the role of circulating syncytiotrophoblast microparticles / S. J. Germain [ et al. ] // J. Immunol. – 2007. – Vol. 178, № 9 – P. 5949-5956. 38. Sacks, G. An innate view of human pregnancy / Sacks G., Sargent I., Redman C. // Immunol. Today. – 1999. – Vol. 20, № 3. – P. 114-118. 39. Redman, C. Preeclampsia and the systemic inflammatory response / C. Redman, I. L. Sargent // Semin.Nephrol. – 2004. – Vol. 24, № 6. – P. 565-570. 40. Eggleton, P. Consequence of neo-antigenicity of the 'altered self' / P. Eggleton, R. Haigh, P. G. Winyard // Rheumatology. – 2008. –Vol. 47, №5. – P. 567-571. 41. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated / K. Ley [ et al. ] // Nat. Rev. Immunol. – 2007. – Vol. 7, № 9. – P. 678689. 42. Иммунология / Под ред. А.А. Ярилина. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2010. – 752 с. 182 43. Vascular inflammation in central nervous system diseases: adhesion receptors controlling leukocyte-endothelial interactions / B. Rossi [ et al. ] // J. Leukocyt. Biol. – 2011. – Vol. 89. – P. 539-556. 44. Leukocyte and endothelial cell adhesion molecules in inflammation focusing on inflammatory heart disease / C. Golias [ et al. ] // In Vivo. – 2007. – Vol. 21, № 5. – P. 757-769. 45. P- and E-selectin mediate recruitment of T-helper-1 but not T-helper-2 cells into inflamed tissues / F. Austrup [ et al. ] // Nature. – 1997. – Vol. 385, № 6611. – P. 81-83. 46. Arid, W. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms / W. Arid // Circ. Res. – 2007. –Vol. 100, № 2. – P. 158173. 47. Fernandez-Borja, M. The regulation of leucocyte transendothelial migration by signaling events / M. Fernandez-Borja, J. D. van Buul, P. L. Hordijk // Cardiovasc. Res. - 2010. – Vol. 86, № 2. – P. 202-210. 48. Van Kooyk, Y. Protein-glycan interactions in the control of innate and adaptive immune responses / Y. Van Kooyk, G. A. Rabinovich // Nat. Immunol. – 2008. – Vol. 9, № 6. – P. 593-601. 49. Van Kooyk, Y. C-type lectins on dendritic cells: key modulators for the induction of immune responses / Y. Van Kooyk // Biochem. Soc. Trans. – 2008. – Vol. 36, № 6. – P. 1478-1481. 50. Varki, A. Since there are PAMPs and DAMPs, there must be SAMPs? Glycan “self-associated molecular patterns” dampen innate immunity, but pathogens can mimic them / A. Varki // Glycobiology. – 2011. – Vol. 21, № 9. – P. 1121-1124. 51. Erlebacher, A. Immunology of the Maternal-Fetal Interface / A. Erlebacher // Annu. Rev. Immunol. – 2013. – Vol. 31. – P. 387-411. 52. Siglecs and immune regulation / S. Pillai [ et al. ] // Annu. Rev. Immunol. – 2012. – Vol. 30. – P. 357-392. 183 53. Crocker, P. R. Siglecs in the immune system / P. R. Crocker, A. Varki // Immunology. – 2001. – Vol. 103, № 2. – P. 137-145. 54. Crocker, P. R. Siglecs, sialic acids and innate immunity / P.R. Crocker, A. Varki // Trends Immunol. – 2001. - Vol. 22, № 6. – P. 337-342. 55. Varki, A. Colloquium paper: uniquely human evolution of sialic acid genetics and biology / A. Varki // Proc. Natl. Acad. Sci. – 2010. – Vol. 107 (Suppl. 2). – P. 8939-8946. 56. Dam, T. K. Maintenance of cell surface glycan density by lectin- glycan interactions: a homeostatic and innate immune regulatory mechanism / T. K. Dam, C. F. Brewer // Glycobiology. – 2010. – Vol. 20, № 9. – P. 1061-1064. 57. Galectin-9 suppresses tumor metastasis by blocking adhesion to endothelium and extracellular matrices / A. Nobumoto [et al.] // Glycobiology. – 2008. – Vol. 18, № 9. – P. 735-744. 58. Norling, L. V. Endogenous galectins and the control of the host inflammatory response / L.V. Norling, M. Perretti, D. Cooper // J. Endocrinol. – 2009. – Vol. 201, № 2. – P. 169-184. 59. Якушина, В. Д. Роль галектина-1 в механизмах дисрегуляции апоптоза и дифференцировки CD4+ лимфоцитов : автореф. дис. … канд. мед. наук / В.Д. Якушина. – Томск, 2014. – 23 с. 60. Cedeno-Laurent, F. Galectins and their ligands: negative regulators of anti-tumor immunity / F. Cedeno-Laurent, C. J. Dimitroff // Glycoconj. J. – 2012. – Vol. 29, № 8-9. – P. 619-625. 61. Varki A. Multifarious roles of sialic acids in immunity / A. Varki, P. Gagneux // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2012. – Vol. 1253. – P. 16-36. 62. Сиаломика и атеросклероз / А. Н. Орехов [и др. ] // Фундаментальные науки и практика. – 2010. – Т. 1, № 4. – С. 59-65. 63. Роль сиаловой кислоты в проявлении атерогенных свойств липопротеидами низкой плотности / А. С. Феоктистов [ и др. ] // Биомедицинский журнал. – 2011. – Т. 12. – С. 1217-1226. 184 64. Cedeno-Laurent, F. Evidence of a novel galectin-9-binding membrane glycoprotein ligand on T helper cells / F. Cedeno-Laurent, C. J. Dimitroff // Clin. Immunol. – 2012. – Vol. 143, № 1. – P. 6-7. 65. The Tim-3 ligand galectin-9 negatively regulates T helper type 1 immunity / C. Zhu [ et al. ] // Nat. Immunol. – 2005. – Vol. 6, № 12. – P. 12451252. 66. Rabinovich, G. A. Role of galectins in inflammatory and immunomodulatory processes / G. A. Rabinovich, N. Rubinstein, M. A. Toscano // Biochim. Biophys. Acta. – 2002. – Vol. 1572, № 2-3. – P. 274-284. 67. Myatt, L. Vascular biology of preeclampsia / L. Myatt, R. P. Webster // J. Thromb. Haemost. – 2009. – Vol. 7, № 3 – P. 375-384. 68. Ramma, W. Is inflammation the cause of preeclampsia? / W. Ramma, A. Ahmed // Adv. Cell. Mol. Biol. Angioginesis. – 2011. – Vol. 39. – P. 16191627. 69. Risk factors for new-onset late postpartum preeclampsia in women without a history of preeclampsia / C.A. Bigelow [ et al. ] //Am. J. Obstet. Gynecol. -2014. – Vol. 210, № 4. – P. 338.e1-8. 70. Naljayan, M. V. New developments in the pathogenesis of preeclampsia / M.V. Naljayan, S.A. Karumanchi // Adv. Chronic. Kidney Dis. – 2013. – Vol. 20, № 3. – P. 265-270. 71. Ahmed, A. New insights into the etiology of preeclampsia: identification of key elusive factors for the vascular complications / A. Ahmed // Thromb. Res. – 2011. – Vol. 127 (Suppl. 3). – P. 72-75. 72. Karumanchi, S. A. Preeclampsia pathogenesis: "triple a rating"- autoantibodies and antiangiogenic factors / S. A. Karumanchi, M. D. Lindheimer // Hypertension. – 2008. – Vol. 51, № 4. – P. 991-992. 73. Immunology in hypertension, preeclampsia, and target-organ damage / S. Verlohren [ et al. ] // Hypertension. – 2009. – Vol. 54, № 3. – P. 439-443. 185 74. Assessment of L-arginine asymmetric 1 dimethyl (ADMA) in early- onset and late-onset (severe) preeclampsia / P. N. Alpoim [ et al. ] // Nitric Oxide. – 2013. – Vol. 33. – P. 81-82. 75. Воронина, Е. С. Морфология соскобов эндометрия и плодных оболочек при ранних самопроизвольных абортах : автореф. дис. … канд. мед. наук / Е. С. Воронина. – Саратов, 2009. 76. Late sporadic miscarriage is associated with abnormalities in spiral artery transformation and trophoblast invasion / E. Ball [ et al. ] // J. Pathol. – 2006. – Vol. 208, № 4. – P. 535-542. 77. Gun, B. D. The comparison of vessels in elective and spontaneous abortion decidua in first trimester pregnancies: importance of vascular changes in early pregnancy losses / B. D. Gun, G. Numanoglu, S. O. Ozdamar // Acta Obstet. Gynecol. Scand. – 2006. –Vol. 85, № 4. – P. 402-406. 78. Lyall, F. Priming and remodelling of human placental bed spiral arteries during pregnancy : a review / F. Lyall // Placenta. – 2005. – Vol. 26 (Suppl.). – P. S31-S36. 79. Normal and abnormal transformation of the spiral arteries during pregnancy / J. Espinoza [ et al. ] // J. Perinat. Med. – 2006. – Vol. 34, № 6. – P. 447-458. 80. Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy / G. J. Burton [ et al. ] // Placenta. – 2009. – Vol. 30, № 6. – P. 473-482. 81. Raghupathy, R. Cytokines as key players in the pathophysiology of preeclampsia / R. Raghupathy // Med. Princ. Pract. – 2013. – Vol. 22 (Suppl. 1). – P. 8-19. 82. Recent advances in the understanding of the pathophysiology of preeclampsia / J. P. Warrington [ et al. ] // Hypertension. – 2013. – Vol. 62, № 4. P. 666-673. 83. Review : where is the maternofetal interface? / L.W. Chamley [et al.] // Placenta. – 2014. – Vol. 35 (Suppl.) – P. 74-80. 186 84. Inflammatory cytokines in the pathophysiology of hypertension during pre-eclampsia / B. D. Lamarca [ et al. ] // Curr. Hypertens. Rep. – 2007. – Vol. 9. – P. 480-485. 85. Saito, S. Th1/Th2 balance in preeclampsia / S. Saito, M. Sakai // J. Reprod. Immunol. – 2003. – Vol. 59. – P. 161-173. 86. Lyall, F. The vascular endothelium in normal pregnancy and pre- eclampsia / F. Lyall, I. A. Greer // Rev. Reprod. – 1996. – Vol. 1. – P. 107-116. 87. Soluble adhesion molecule profile in normal pregnancy and pre- eclampsia / T. Chaiworapongsa [ et al. ] // J. Mater.-Fet. Neonat. Med. – 2002. – Vol. 12, № 1. – P. 19-27. 88. Horstman, L. L. Antiphospholipid antibodies : Paradigm in transition / L. L. Horstman // J. Neuroinflammation. – 2009. – Vol. 6, № 3. – P. 1-21. 89. Plasma soluble endothelial selectin is elevated in women with pre- eclampsia / Y. Daniel [ et al. ] // Hum.Reprod. – 1998. – Vol. 13, № 12. – P. 35373541. 90. Maternal plasma levels of endothelial dysfunction mediators including AM, CGRP, sICAM-1 and tHcy in pre-eclampsia / X. Fei [ et al. ] // Adv. Clin. Exp. Med. – 2012. – Vol. 21, № 5. – P. 573-579. 91. A comparative study of serum level of vascular cell adhesion molecule-1 (sVCAM-1), intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and high sensitive C –reactive protein (hs-CRP) in normal and pre-eclamptic pregnancies / M. Farzadnia [ et al. ] // Iran. J. Basic Med. Sci. – 2013. – Vol. 16, № 5. – P. 689693. 92. Endothelial adhesion molecules and leukocyte integrins in preeclamptic patients / H. Haller [ et al. ] // Hypertension. – 1997. – Vol. 29, № 1 (Pt. 2). – P. 291-296. 93. Protease chymotrypsin mediates the endothelial expression of P- and E-selectin, but not ICAM and VCAM, induced by placental trophoblasts from preeclamptic pregnancies / Y. Wang [ et al. ] // Placenta. – 2003. – Vol. 24, № 8-9. – P. 851-861. 187 94. Predictive value of routine circulating soluble endothelial cell adhesion molecule measurements during pregnancy / T. Krauss [ et al. ] // Clin.Chem. – 2002. – Vol. 48, № 9. – P. 1418-1425. 95. Circulating cytokines, chemokines and adhesion molecules in normal pregnancy and preeclampsia determined by multiplex suspension array / A. Szarka [ et al. ] // BMC Immunol. – 2010. – Vol. 11. – P. 59. 96. Fetal endothelium dysfunction is associated with circulating maternal levels of sE-selectin, sVCAM-1, and sFlt-1 during preeclampsia / C. О. Veas [et al.] // J. Mater.-Fet. Neonat. Med. – 2011. – Vol. 24, № 11. – P. 1371-1377. 97. Maternal serum levels of VCAM-1, ICAM-1 and E-selectin in preeclampsia / S-Y. Kim [ et al. ] // J. Korean Med. Sci. – 2004. – Vol. 19, № 5. - P. 688-692. 98. Soluble adhesion molecules : marker of pre-eclampsia and intrauterine growth restriction / G. Coata [ et al. ] // J. Mater.-Fet. Neonat. Med. – 2002. – Vol. 12, № 1. – P. 28-34. 99. Armstrong, E. J. Inflammatory biomarkers in acute coronary syndromes : part II : acute-phase reactants and biomarkers of endothelial cell activation / E. J. Armstrong, D. A. Morrow, M. S. Sabatine // Circulation. – 2006. – Vol. 113, № 7. – P. 152-155. 100. Absence of in vivo generalized pro-inflammatory endothelial activation in severe, early-onset preeclampsia / R. B. Donker [ et al. ] // J. Soc. Gynecol. Invest. – 2005. – Vol. 12, № 7. – P. 518-528. 101. Adhesion molecules changes at 20 gestation weeks in pregnancies complicated by preeclampsia / M. Chavarria [ et al. ] // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. – 2008. – Vol. 137, № 2. – P. 157-164. 102. Maternal serum cytokines at 30-33 weeks in the prediction of preeclampsia / B. Mosimann [ et al. ] // Prenat. Diagn. – 2013. – Vol. 33, № 9. – P. 823-830. 103. Pries, A. R. Normal endothelium / A. R. Pries, W. M. Kuebler // Handb. Exp. Pharmacol. – 2006. – Vol. 176 (Pt. 1). – P. 1-40. 188 104. Galley, H. F. Physiology of the endothelium / H. F. Galley, N. R. Webster // Br. J. Anaesth. – 2004. – Vol. 93, № 1. – P. 105-113. 105. The endothelial glycocalyx : a potential barrier between health and vascular disease / M. Nieuwdorp [ et al. ] // Curr. Opin. Lipidol. – 2005. – Vol. 16. – P. 507-511. 106. Glycocalyx and endothelial (dys)function : from mice to men / B. M. van den Berg [ et al. ] // Pharmacol. Rep. – 2006. – Vol. 58. – P. 75-80. 107. Markos, F. What is the mechanism of flow-mediated arterial dilatation / F. Markos, T. Ruane O'Hora, M. I. Noble // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. – 2013. – Vol. 40, № 8. – P. 489-494. 108. Mulivor, A. W. Inflammation- and ischemia-induced shedding of venular glycocalyx / A. W. Mulivor, H. H. Lipowsky // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. – 2004. – Vol. 286. – P.1672–1680. 109. Vink, H. Oxidized lipoproteins degrade the endothelial surface layer: implications for plateletendothelial cell adhesion / H. Vink, A. A. Constantinescu J. A. Spaan // Circulation. – 2000. – Vol. 101. – P. 1500-1502. 110. Oligosaccharides of hyaluronan are potent activators of dendritic cells / C. C. Termeer [ et al. ] // J. Immunol. – 2000. – Vol. 165, № 4. – P. 1863-1870. 111. Kumagai, R. Role of glycocalyx in flow-induced production of nitric oxide and reactive oxygen species / R. Kumagai, X. Lu, G. S. Kassab // Free Radic. Biol. Med. – 2009. – Vol. 47, № 5. – P. 600-607. 112. The role of endothelial glycocalyx components in mechanotransduction of fluid shear stress / M. Y. Pahakis [ et al. ] // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2007. – Vol. 355. – P. 228-233. 113. The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization / Reitsma S., [et al.] // Pflugers Arch. – 2007. – Vol. 454, № 3. – P. 345-359. 114. The role of heparanase and the endothelial glycocalyx in the development of proteinuria / M. Garsen [ et al. ] // Nephrol. Dial. Transplant. – 2014. – Vol. 29, № 1. – P. 49-55. 189 115. Lipowsky, H. H. The endothelial glycocalyx as a barrier to leukocyte adhesion and its mediation by extracellular proteases / H. H. Lipowsky // Ann. Biomed. Eng. – 2012. – Vol. 40, № 4. – P. 840-848. 116. Salmon, A. H. Endothelial glycocalyx dysfunction in disease: albuminuria and increased microvascular permeability / A. H. Salmon, S. C. Satchell // J. Pathol. – 2012. – Vol. 226, № 4. – P. 562-574. 117. Role of heparan sulfate in immune system–blood vessel interactions / N. S. Ihrcke [ et al. ] // Immunol. Today. – 1993. – Vol. 14. – P. 500-505. 118. Pries, A. R. The endothelial surface layer / A. R. Pries, T. W. Secomb, P. Gaehtgens // Pflugers Arch. – 2000. – Vol. 440. – P. 653-666. 119. Loss of the endothelial glycocalyx links albuminuria and vascular dysfunction / A. H. Salmon [ et al. ] // J. Am. Soc. Nephrol. – 2012. – Vol. 23, № 8. – P. 1339-1350. 120. Is human placenta proteoglycan remodeling involved in preeclampsia? / M. Warda [ et al. ] // Glycocon. J. – 2008. – Vol. 25, № 5. – P. 441-450. 121. Increased serum concentrations of circulating glycocalyx components in HELLP syndrome compared to healthy pregnancy : an observational study / K. F. Hofmann-Kiefer [ et al. ] // Reprod. Sci. – 2013. – Vol. 20, № 3. – P. 318325. 122. Placental suncytiotrophoblast maintains a specific type of glycocalyx at the fetomaternal border : the glycocalyx at the fetomaternal interface in healthy women and patients with HELLP syndrome / K. F. Hofmann-Kiefer [ et al. ] // reprod.Sci. – 2013. – Vol. 20, № 10. – P. 1237-1245. 123. Henry, C. B. TNF-alpha increases entry of macromolecules into luminal endothelial cell glycocalyx / C. B. Henry, B. R. Duling // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. – 2000. – Vol. 279, № 6. – P. 2815–2823. 124. Constantinescu, A. A. Elevated capillary tube hematocrit reflects degradation of endothelial cell glycocalyx by oxidized LDL / A. A. Constantinescu, H. Vink, J. A. Spaan // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. – 2001. – Vol. 280, № 3. – P. 1051-1057. 190 125. Lipowsky, H. H. Shedding of the endothelial glycocalyx in arterioles, capillaries, and venules and its effect on capillary hemodynamics during inflammation / H. H. Lipowsky, L. Gao, A. Lescanic // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. – 2011. –Vol. 301, № 6. - P. 2235-2245. 126. Aird, W. C. Spatial and temporal dynamics of the endothelium / W. C. Aird // J. Thromb. Haemost. – 2005. – Vol. 3, № 7. – P. 1392-1406. 127. Endothelial cell activation and thromboregulation during xenograft rejection / F. H. Bach [ et al. ] // Immunol. Rev. – 1994. –Vol. 141. – P. 5–30. 128. Biomarkers of endothelial cell activation serve as .potential surrogate markers for drug-induced vascular injury / J. Zhang [ et al. ] // Toxicol. Pathol. – 2010. – Vol. 38, № 6. – P. 856-871. 129. Hunt, B. J. Endothelial cell activation. A central pathophysiological process / B. J. Hunt, K. M. Jurd // Br. Med. J. – 1998. – Vol. 316. – P. 1328-1329. 130. Humoral autoimmunity against endothelium: theory or reality? / P. Meroni [ et al. ] // Trends Immunol. – 2005. – Vol. 26, № 5. – P. 275-281. 131. Антифосфолипидный синдром. Этиология, патогенез, диагностика, лечение и профилактика / В. И. Черний [ и др. ] // Мед. неотл. состояния. – 2007. – Т. 10, № 3. – С. 13-18. 132. Rand, J. H. Molecular pathogenesis of the antiphospholipid syndrome / J. H. Rand // Circ. Res. – 2002. – Vol. 90, № 1. – P. 29-37. 133. Аржанова, О. Н. Роль антифосфолипидных антител (АФА) в патогенезе невынашивания беременности / О. Н. Аржанова, Т. Н. Шляхтенко С. А. Сельков // Журнал акушерства и женских болезней. – 2002. – Т. L2, № 2. – С. 18. 134. Макацария, А. Д. Профилактика повторных репродуктивных потерь при антифосфолипидном синдроме / А. Д., Макацария, Е. Н. Шаховская // Врач. – 2008. – № 10. – С. 89-91. 135. Спектр антифосфолипидных антител у беременных с гестозом / Г. Т. Сухих [ и др. ] // Акушерство и гинекология. – 1998. – №5. – С. 22-26. 191 136. Антитела к фосфолипидам и β2-гликопротеину-I у беременных с плацентарной недостаточностью и задержкой внутриутробного развития плода / Г. Т. Сухих [ и др. ] // Проблемы беременности. – 2004. – № 9. – С. 37-40. 137. Cervera, R. European Forum On Antiphospholipid Antibodies : brief history report and governance document / R. Cervera // Lupus. – 2012. – Vol. 21, № 7. – P. 699-703. 138. Devreese, K. Challenges in the diagnosis of the antiphospholipid syndrome / K. Devreese, M. F. Hoylaerts // Clin. Chem. – 2010. – Vol. 56, № 6. – P. 930-940. 139. Endothelium as a target for antiphospholipid antibodies / P. Riboldi [ et al. ] // Immunobiol. – 2003. – Vol. 207, № 1. – P. 29-36. 140. Beta2-glycoprotein I as a 'cofactor' for anti-phospholipid reactivity with endothelial cells / P. L. Meroni [ et al. ] // Lupus. – 1998. – Vol. 7 (Suppl. 2). – P. 44-47. 141. Interaction of anti-phospholipid antibodies with late endosomes of human endothelial cells / B. Galve-de Rochemonteix [ et al. ] // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2000. – Vol. 20, № 2. – P. 563-574. 142. Chighizola, C. B. New tests to detect antiphospholipid antibodies: antidomain I beta-2-glycoprotein-I antibodies / C. B. Chighizola, M. Gerosa, P. L. Meroni // Curr. Rheumatol. Rep. – 2014. – Vol. 16, № 2. – P. 402. 143. Groot, P. G. The future of antiphospholipid antibody testing / P. G. Groot R. T. Urbanus // Sem. Thromb. Hemost. – 2012. – Vol. 38, № 4. – P. 412-418. 144. TLR2 is one of the endothelial receptors for β2-glycoprotein 1 / J-E. Alard [ et al. ] // J. Immunol. – 2010. – Vol. 185, № 3. – P. 1550-1557. 145. Nunes-Alvarez, C. A. Pathogenic mechanisms of anti- phospholipid antibodies / C.A. Nunes-Alvarez, J. Cabiedes // Rheumatol. Clin. – 2011. – Vol. 7, № 1. – P. 72-76. 146. Hughes, G. R. Seronegative antiphospholipid syndrome / G.R. Hughes, M.A. Khamashta // Ann. Rheum. Dis. – 2003. – Vol. 62, № 12. – P. 1127. 192 147. Antiphospholipid syndrome without antiphospholipid antibodies at the time of the thrombotic event: transient “seronegative” antiphospholipid syndrome / C. Miret [ et al. ] // Clin. Exp. Rheumatol. – 1997. – Vol. 15. – P. 541-544. 148. Vimentin/cardiolipin complex as a new antigenic target of the antiphospholipid syndrome / E. Ortona [ et al. ] // Blood. – 2010. – Vol. 116, № 16. – P. 2960-2967. 149. Pregnancy outcome in women with antiphospholipid syndrome and alloimmunity : a case report / S.A. Castaneda Ospina [ et al. ] // Sao. Paulo. Med. J. – 2003. – Vol. 121, № 6. – P. 248-250. 150. Sebring, E. S. Fetomaternal hemorrhage: incidence, risk factors, time of occurrence, and clinical effects / E.S. Sebring, H.F. Polesky // Transfusion. – 1990. – Vol. 30, № 4. – P. 344-357. 151. The HELLP syndrome in the antiphospholipid syndrome: retrospective study of 16 cases in 15 women / D. L. Thi Thuong [ et al. ] // Ann. Rteum. Dis. – 2005. – Vol. 64, № 2. – P. 273-278. 152. A novel C5a receptor-tissue factor cross-talk in neutrophilis links innate immunity to coagulation pathways / K. Ritis [ et al. ] // J. Immunol. – 2006. – Vol. 177. – P. 4794-4801. 153. Tissue factor : a link between C5a and neutrophil activation in antiphospholipid antibody – induced fetal injury / P. Redecha [ et al. ] // Blood. – 2007. – Vol. 110, № 7. – P. 2423-2431. 154. Outcomes of pregnancies in women with suspected antiphospholipid syndrome / F. Nili [ et al. ] // J. Neonat. Perinat. Med. – 2013. –Vol. 6, № 3. – P. 225230. 155. Risk of early renal allograft failure is increased for patients with antiphospholipid antibodies / D.R. Wagenknecht [ et al. ] // Transpl. Int. – 2000. – Vol. 13 (Suppl. 1). – P. 78-81. 156. Current concepts on the pathogenesis of the antiphospholipid syndrome / B. Giannakopoulos [ et al. ] // Blood. – 2007. – Vol. 109, № 2. – P. 422-430. 193 157. Antiphospholipid antibodies prolong the activation of endothelial cells induced by necrotic trophoblastic debris : Implications for the pathogenesis of preeclampsia / Q. Chen [ et al. ] // Placenta. – 2012. – Vol. 33, № 10. – P. 810-815. 158. Antiphospholipid antibodies among women experiencing fetal loss / Y. Ching [ et al. ] // Malays. J. Pathol. – 2013. – Vol. 35, № 2. – P. 147-151. 159. Anti-endothelial cell antibodies from patients with thrombotic thrombocytopenic purpura specifically activate small vessel endothelial cells / S. Praprotnik [ et al. ] // Intern. Immunol. – 2001. – Vol. 13, № 2. – P. 203-210. 160. Anti-endothelial cell antibodies are associated with peripheral arterial disease and markers of endothelial dysfunction and inflammation / C. Varela [ et al. ] // Interact. Cardiovasc. Thorac. Surg. – 2011. – Vol. 13, № 5. – P. 463-467. 161. Cieslik, P. Vasculopathy and vasculitis in systemic lupus erythematosus / P. Cieslik, A. Hrycek, P. Klucinski // Pol. Arch. Med. Wewn. – 2008. – Vol. 118, № 1-2. – P. 57-63. 162. An innovative method to identify autoantigens expressed on the cell surface: serological identification system for autoantigens using a retroviral vector and flow cytometry (SARF) / T. Shirai [ et al. ] // Clin. Devel. Immunol. – 2013. – P. 110. 163. Evidence for the expression of HLA-C class I mRNA and protein by human first trimester trophoblast / A. King [ et al. ] // J. Immunol. – 1996. – Vol. 156, № 6. – P. 2068-2076. 164. Validation of a new biomarker in patients with Kawasaki disease identified by proteomics / R. Karasawa [ et al. ] // J. Data Mining Genomics. Proteomics. – 2013. – Vol. 4. – P. 1-3. 165. Two populations of endothelial cell antibodies cross-react with heparin / Y. Renaudineau [ et al. ] // Lupus. – 1998. – Vol. 7, № 2. – P. 86-94. 166. Anti-endothelial cell antibodies in idiopathic and systemic sclerosis associated pulmonary arterial hypertension / M. Tamby [ et al. ] // Thorax. – 2005. – Vol. 60, № 9. – P. 765-772. 194 167. Clinical relevance and IgG subclass determination of non-HLA antibodies identified using endothelial cell precursors isolated from donor blood / A.M. Jackson [ et al. ] // Transplantation. – 2011. – Vol. 92. – P. 54-60. 168. Elevated serum anti-endothelial cell autoantibodies titer is associated with lupus nephritis in patients with systemic lupus erythematosus / J-C. Tseng [ et al. ] // J. Microbiol. Immun. Infect. – 2007. – Vol. 40, № 1. – P. 50-55. 169. Functional heterogeneity of anti-endothelial antibodies / A. Bordron [ et al. ] // Clin. Exp. Immunol. – 2001. – Vol. 124, № 3. – P. 492-501. 170. Гуморальное отторжение в генезе акушерской патологии / М. М. Зиганшина [ и др. ] // Акушерство и гинекология. – 2013. – № 6. – С. 3-10. 171. Dieude, M. Induction of endothelial cell apoptosis by heat-shock protein 60-reactive antibodies from anti-endothelial cell autoantibody – positive systemic lupus erythematosus patients / M. Dieude, J. L. Senecal, Y. Raymond // Arthrit. Rheumatism. – 2004. – Vol. 50, № 10. – P. 3221-3231. 172. IgG antiendothelial cell antibodies from patients with systemic lupus erythematosus or systemic vasculitis stimulate the release of two endothelial cellderived mediators, which enhance adhesion molecule expression and leukocyte adhesion in a autocrine manner / D. Carvalho [ et al. ] // Arthrit. Rheumatism. – 1999. – Vol. 42, № 4. – P. 631-640. 173. Anti-endothelial cell antibodies and soluble markers of endothelial cell dysfunction in systemic lupus erythematosus / J. Constans [ et al. ] // J. Rheumatol. – 2003. – Vol. 30, № 9. – P. 1963-1966. 174. Antiendothelial cell antibodies mediate enhanced leukocyte adhesion to cytokine-activated endothelial cells through a novel mechanism requiring cooperation between FcγRIIa and CXCR1/2 / O. J. Florey [ et al. ] // Blood. – 2007. – Vol. 109, № 9. – P. 3881-3889. 175. Natural immune response involving anti-endothelial cell antibodies in normal and lupus pregnancy / L. L. F. Mendonca [ et al. ] // Arthrit. Rheumatism. – 2000. – Vol. 43, № 7. – P. 1511-1515. 195 176. Normal human IgG prevents endothelial cell activation induced by TNFalpha and oxidized low-density lipoprotein atherogenic stimuli / N. Ronda [ et al. ] // Clin. Exp. Immunol. – 2003. – Vol. 133, № 2. – P. 219-226. 177. Urlacher, A. IgM anti-idiotypes that block anti-HLA antibodies: naturally occurring or immune antibodies? / A. Urlacher, M. M. Tongio, J. L. Pasquali // Clin. Exp. Immunol. – 1991. – Vol. 83, № 1. – P. 116-120. 178. Anti-endothelial cell antibody in preeclampsia: clinical findings and serum cytotoxity to endothelial cell / T. Yamamoto [ et al. ] // Nihon Rinsho Meneki gakkai Kaishi. – 1998. – Bd. 21, № 5. – S. 191-197. 179. Effects of anti-endothelial cell antibody in pre-eclampsia on endothelin-1 release from cultured endothelial cells / T. Yamamoto [ et al. ] // Immunol. Cell. Biol. – 1997. – Vol. 75, № 4. – P. 340-344. 180. Anti-endothelial cell antibodies : another cause for pregnancy loss? / R. Roussev [ et al. ] // Am. J. Reprod. Immunol. – 1998. – Vol. 39, № 2. – P. 89-95. 181. Antiendothelial cell antibody levels in healthy normotensives with high normal blood pressure / D. P. Papandopoulos [ et al. ] // Clin. Exper. Hypertens. – 2008. – Vol. 28, № 8. – P. 663-667. 182. Milland, J. ABO blood group and related antigens, natural antibodies and transplantation / J. Milland, M. S. Sandrin // Tissue Antigens. - 2006. - Vol. 68, № 6. – P. 459-466. 183. Lisowska, E. Diversity of natural anti-α-galactosyl antibodies in human serum / E. Lisowska, M. Duk // Adv. Exp. Med. Biol. – 2011. – Vol. 705. – P. 571-83. 184. Galili, U. The alpha-gal epitope and the anti-Gal antibody in xenotransplantation and in cancer immunotherapy / U. Galili // Immunol. Cell Biol. – 2005. – Vol. 83, № 6. – P. 674-686. 185. Springer, G. F. T and Tn, general carcinoma autoantigens / G. F. Springer // Science. – 1984. – Vol. 224, № 4654. – P. 1198-1206. 196 186. Schwartz-Albiez, R. Naturally occurring antibodies directed against carbohydrate tumor antigens / R. Schwartz-Albiez // Adv. Exp. Med. Biol. – 2012. – Vol. 750. – P. 27-43. 187. Tumor-associated glycans and their role in gynecological cancers: accelerating translational research by novel high-throughput approaches / T. Pochechueva [ et al. ] // Metabolites. – 2012. – Vol. 2, № 4. – P. 913-939. 188. A new kind of carbohydrate array, its use for profiling antiglycan antibodies, and the discovery of a novel human cellulose-binding antibody / M. Schwarz [ et al. ] // Glycobiology. – 2003. – Vol. 13, № 11. – P. 749-754. 189. Repertoire of human natural anti-glycan immunoglobulins. Do we have auto-antibodies? / N. Bovin [ et al. ] // Biochim. Biophys. Acta. – 2012. – Vol. 1820, № 9. – P. 1373-1382. 190. Anti-carbohydrate antibodies of normal sera: findings, surprises and challenges / M.E. Huflejt [ et al. ] // Mol. Immunol. – 2009. – Vol. 46, № 15. – P. 3037-3049. 191. Natural Antibodies Against Sialoglycans / N. Shilova [ et al. ] // Top. Curr. Chem. – 2013. Mode of access : http://link.springer.com/chapter/10.1007%2F128_2013_469#page-1 192. Anti-glycan antibodies as biomarkers for diagnosis and prognosis / N. Dotan [ et al. ] // Lupus. – 2006. – Vol. 15, № 7. – P. 442–450. 193. Serum anti-glycan antibodies predict complicated Crohn's disease behavior: a cohort study / F. Rieder [ et al. ] // Inflamm. Bowel Dis. – 2010. – Vol. 16, № 8. – P. 1367-1375. 194. Lakatos, P. L. Serologic antiglycan antibodies in inflammatory bowel disease / P. L. Lakatos, M. Papp, F. Rieder // Am. J. Gastroenterol. – 2011. – Vol. 106, № 3. – P. 406-412. 195. Increased levels of anti-glycan antibodies in patients with cystic fibrosis / T.O. Hirche [ et al. ] // Eur. J. Med. Res. – 2011. – Vol. 16, № 9. – P. 385-390. 197 196. Antibody responses against galactocerebroside are potential stagespecific biomarkers in multiple sclerosis / T. Menge [ et al. ] // Allergy. Clin. Immunol. – 2005. – Vol. 116, № 2. – P. 453–459. 197. Comparison of printed glycan array, suspension array and ELISA in the detection of human anti-glycan antibodies / T. Pochechueva [ et al. ] // Glycoconj. J. – 2011. – Vol. 28, № 8-9. – P. 507-517. 198. Anti-alpha-glucose-based glycan IgM antibodies predict relapse activity in multiple sclerosis after the first neurological event / M. S. Freedman [ et al. ] // Mult. Scler. – 2009. – Vol. 15, № 4. – P. 422-430. 199. IgA nephropathy: molecular mechanisms of the disease / J. Mestecky [ et al. ] // Annu. Rev. Pathol. – 2013. – Vol. 24, № 8. – P. 217-240. 200. Aberrant O-glycosylation and anti-glycan antibodies in an autoimmune disease IgA nephropathy and breast adenocarcinoma / M. Stuchlová Horynová [ et al. ] // Cell. Mol. Life. Sci. – 2013. – Vol. 70, № 5. – P. 829-839. 201. Serum antiglycan antibody detection of nonmucinous ovarian cancers by using a printed glycan array / F. Jacob [ et al. ] // Int. J. Cancer. – 2012. – Vol. 130, № 1. – P. 138-146. 202. Effects of monoclonal antibody directed to LeY on implantation in the mouse / X.Q. Wang [ et al. ] // Mol. Hum. Reprod. – 1998. – Vol. 4, № 3. – P. 295300. 203. Antibodies to laminin in preeclampsia / J. M. Foidart [ et al. ] // Kidney Int. – 1986. – Vol. 29, № 5. – P. 1050-1057. 204. Role of laminin carbohydrates on cellular interactions / M.L. Tanzer [ et al. ] // Kidney Int. – 1993. – Vol. 43, № 1. – P. 66-72. 205. A unique natural human IgG antibody with anti-α-galactosyl specificity / U. Galili [ et al. ] // J. Exp. Med. – 1984. – Vol. 160. – P. 1519-1531. 206. Galactose alpha 1-3 galactose and anti-alpha galactose antibody in normal and pathological pregnancies / Y. Christiane [ et al. ] // Placenta. – 1992. – Vol. 13, № 5. – P. 475-487. 198 207. Anti-glycans antibodies in the sera of antiphospholipid syndrome / M. Blanc [ et al. ] // Ann. Rheum. Dis. – 2007. – Vol. 66 (Suppl. 2). – P. 303. 208. Anti-GalNAcβ : a novel anti-glycan autoantibody associated with pregnancy loss in women with antiphospholipid syndrome and in a mouse experimental model / M. Blank [ et al. ] // J. Autoimmun. – 2012. – Vol. 39, №4. – P. 420-427. 209. Antiphospholipid antibody syndrome / R. Saigal [ et al. ] // J. Assoc. Physicians. India. – 2010. – Vol. 58. – P. 176-184. 210. Lim, W. Antiphospholipid syndrome / W. Lim // Hematol. Am. Soc. Hematol. Educ. Program. – 2013. – Vol. 2013. – P. 675-680. 211. Anti-prothrombin (aPT) and anti-phosphatidylserine/prothrombin (aPS/PT) antibodies and the risk of thrombosis in the antiphospholipid syndrome : A systematic review / S. Sciascia [ et al. ] // Thromb. Haemost. – 2014. – Vol. 111, № 2. – P. 354-364. 212. Distinct antibody profile: a clue to primary antiphospholipid syndrome evolving into systemic lupus erythematosus? / P. V. Freire [ et al. ] // Clin. Rheumatol. – 2014. – Vol. 33, № 3. – P. 349-353. 213. Cervera, R. New perspectives for refractory catastrophic antiphospholipid syndrome : 8-th International Congress on Autoimmunity / R. Cervera // Expert. Rev. Clin. Immunol. – 2012. – Vol. 8, № 7. – P. 617-619. 214. Evaluation of different immunoassays for the detection of antiphospholipid antibodies: Report of a wet workshop during the 13th International congress on antiphospholipid antibodies / R. Forasteriero [ et al. ] // Clin. Chim. Acta. – 2014. – Vol. 428. – P. 99-105. 215. Shoenfeld, Y. Classification of anti-endothelial cell antibodies into antibodies against microvascular and macrovascular endothelial cells: the pathogenic and diagnostic implications / Y. Shoenfeld // Clevl. Clin. J. Medic. – 2001. – Vol. 69. – P. 65-67. 199 216. Edgell, C. J. Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization / C.J. Edgell, , C.C. McDonald, J.B. Graham // Proc. Natl. Acad. Sci. – Vol. 80, № 12. – P. 3734-3737. 217. Expression of integrins and adhesive properties of human endothelial cell line EA.hy 926 / P. Baranska [ et al. ] // Cancer Genom. Proteom. – 2005. – Vol. 2, № 5. – P. 3-7. 218. Antiendothelial cell antibodies in patients with systemic sclerosis in relation to pulmonary hypertension and lung fibrosis / K. Lewandowska [ et al. ] // Adv. Exp. Med. Biol. – 2013. – Vol. 756. – P. 147-153. 219. AlMahri, A. Detection of complement-fixing and non-fixing antibodies specific for endothelial precursor cells and lymphocytes using flow cytometry / A. AlMahri, J. Holgersson, M. Alheim // Tissue Antigens. – 2012. – Vol. 80, № 5. – P. 404-415. 220. Endothelial dysfunction in systemic lupus patients with low disease activity: evaluation by quantification and characterization of circulating endothelial microparticles, role of anti-endothelial antibodies / A. Duval [ et al. ] // Rheumatology. – 2010. – Vol. 49, № 6. – P. 1049-1055. 221. Detection of antiendothelial cell antibodies by an enzyme-linked immunosorbent assay using antigens from cell lysate: minimal interference with antinuclear antibodies and rheumatoid factors / C. Drouet [ et al. ] // Clin. Diagn. Lab. Immunol. – 2003. – Vol. 10, № 5. – P. 934-939. 222. Prevalence of anti-endothelial cell antibodies in patients with pulmonary arterial hypertension associated with connective tissue diseases / M-T. Li [ et al. ] // Chin. Med. Sci. J. – 2010. – Vol. 25, № 1. – P. 27-31. 223. Susac syndrome: an organ-specific autoimmune endotheliopathy syndrome associated with anti-endothelial cell antibodies / C.M. Magro [ et al. ] // Am .J. Clin. Pathol. – 2011. – Vol. 136, № 6. – P. 903-912. 224. Identification of target antigens of naturally occurring autoantibodies in cerebrospinal fluid / A. Kimura [ et al. ] // J. Proteomics. – 2015. – Vol. 12. – Mode of access : http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S187439191530004X# 200 225. False positivity in a cyto-ELISA for anti-endothelial cell antibodies to bovine serum proteins / R. Revelen [ et al. ] // Clin. Chem. – 2000. – Vol. 46, № 2. – P. 273-278. 226. Anti-endothelial cell antibodies selectively activate SAPK/JNK signaling in Wegener’s granulomatosis / C. Holmen [ et al. ] // J. Amer. Soc. Nephrol. – 2007. – Vol. 18, № 9. – P. 2497-2508. 227. Horvathova, M. Detection of antiendothelial cell antibodies in patients with connective tissue diseases by flow cytometry and their relation to endothelial cell activation / M. Horvathova, E. Jahnova, S. Nyulassy // Physiol. Res. – 2002. – Vol. 51, № 6. – P. 613-617. 228. Изучение динамики гуморальных факторов иммунитета в плазме крови женщин в разные периоды онтогенеза / Л. А. Фролова [ и др. ] // Иммунопатология, аллергология, инфектология. – 2013. – Т. 2. – С. 20-24. 229. Antibodies to histo-blood group substances A and B: agglutination titers, Ig class, and IgG subclasses in healthy persons of different age categories / R. Rieben [ et al. ] // Transfusion. – 1991. – Vol. 31, № 7. – P. 607-615. 230. Printed glycan array: antibodies as probed in undiluted serum and effects of dilution / N. Shilova [et al.] // Glycoconj. J. – 2012. – Vol. 29, № 2-3. – P. 87-91. 231. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins / O. Blixt [ et al. ] // Proc. Natl. Acad. Sci. – 2004. – Vol. 101, №49. – P. 17033-17038. 232. Glycan arrays to decipher the specificity of plant lectins / E.J. Van Damme [ et al. ] // Adv. Exp. Med. Biol. – 2011. – Vol. 705. – P. 757-767. 233. Международная классификация болезней 10-го пересмотра (МКБ-10). – Режим доступа : www.mkb-10.com. 234. Essentials of Glycobiology : 2-nd ed. [ Electronic resource ] / Ed. A. Varki, R. D. Cummings, J. D. Esko, Н. Н. Freeze, P. Stanley, C. R. Bertozzi, G. W. Hart, M. E. Etzler. – Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2009. – P. 633-648. – Mode of access : http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1953/ 201 235. Flow cytometry : Practical approach / Ed. M.G. Omeroid. – Oxford University Press, 2000. – 276 p. 236. Николаева, М. А. Антитела к антигенам сперматозоидов человека в норме и при нарушениях репродуктивной функции : дис. … д-ра биол. наук / М.А. Николаева. – М., 2007. 237. Bass, G. F. Diagnosis and classification of autoimmune hemolytic anemia / G.F. Bass, E.T. Tuscano, J.M. Tuscano // Autoimmun. Rev. – 2014. – Vol. 13, № 4-5. – P. 560-564. 238. Staropoli, J. F. Membrane autoantibodies in systemic lupus erythematosus : a case of autoimmune hemolytic anemia, antiphospholipid antibodies, and transient acquired activated protein C resistance / J.F. Staropoli, E.M. van Cott, R.S. Makar // Transfusion. – 2008. – Vol. 48, № 11. – P. 24352441. 239. Arndt, P. A. Serologic findings in autoimmune hemolytic anemia associated with immunoglobulin M warm autoantibodies / P.A. Arndt, R.M. Leger, G. Garratty // Transfusion. – 2009. – Vol. 49, № 2. – P. 235-242. 240. Petz, L. D. Diagnostic complexities in autoimmune hemolytic anemias / L.D. Petz // Transfusion. – 2009. – Vol. 49, № 2. – P. 202-203. 241. Markers of endothelial dysfunction after cardiac surgery: soluble forms of vascular-1 and intercellular-1 adhesion molecules / M. Balciūnas [ et al. ] // Medicina (Kaunas). – 2009. – Bd. 45, № 6. – S. 434-439. 242. Giddings, J. C. Soluble adhesion molecules in inflammatory and vascular diseases / J. C. Giddings // Bichem. Soc. Trans. – 2005. – Vol. 33 (Pt. 2). – P. 406-408. 243. Guilpain, P. Antiendothelial cells autoantibodies in vasculitisassociated systemic diseases / P. Guilpain, L. Mouthon // Clin. Rev. Allergy. Immunol. – 2008. – Vol. 35, № 1-2. – P. 59-65. 244. Soluble adhesion molecules as markers for sepsis and the potential pathophysiological discrepancy in neonates, children and adults / R. Zonneveld [ et al. ] // Crit. Care. – 2014. – Vol. 18, № 1 – P. 204. 202 245. Maternal serum soluble adhesion molecule at 11 +0 – 13+6 weeks and subsequent development of pre-eclampsia / M. Parra-Cordero [ et al. ] // J .Mater. Fet. Neonat. Med. – 2007. – Vol. 20, № 11. – P. 793-796. 246. Maternal levels of prostacyclin, thromboxane, ICAM, and VCAM in normal and preeclamptic pregnancies / D.F. Lewis [ et al. ] // Am. J. Reprod. Immunol. – 2010. – Vol. 64, № 6. – P. 376-383. 247. Circulating endothelial cell adhesion molecules as diagnostic markers for the early identification of pregnant women at risk for development of preeclampsia / T. Krauss [ et al. ] // Am. J. Obstetr. Gynecol. – 1997. – Vol. 177, № 2. – P. 443-449. 248. Early pregnancy soluble E-selectin concentrations and risk of preeclampsia / D.M. Carty [ et al. ] // J. Hypertens. – 2012. – Vol. 30, № 5. – P. 954-959. 249. Соколов, Д. И. Роль гуморальных и клеточных факторов иммунной системы в контроле развития плаценты в норме и при гестозе : автореф. дис. … д-ра биол. наук / Д. И. Соколов. – Санкт-Петербург, 2009. 250. L-selectin shedding in sepsis limits leukocyte mediated microvascular injury at remote sited / L.E. Ferri [ et al. ] // Surgery. – 2009. – Vol. 145, № 4. – P. 384-391. 251. Plasma and serum L-selectin and clinical and subclinical cardiovascular disease : the multi-ethnic study of atherosclerosis (MESA) / C. Berardi [ et al. ] // Translat. Res. – 2014. – Vol. 163, № 6. – P. 585-592. 252. Circulating soluble adhesion molecules in ANCA-associated vasculitis / J. Ara [ et al. ] // Nephrol. Dial. Transplant. – 2001. – Vol. 16. – P. 276–285. 253. Tolerance of the fetus by the maternal immune system: role of inflammatory mediators at the feto-maternal interfase / C. Kanellopoulos-Langevin [ et al. ] // Reprod. Biol. Endocrinol. –2003. – Vol. 1. – P.1-9. 254. Selectin, platelet plays a critical role in granulocyte access to the pregnant mouse uterus under physiological and pathological conditions / U. Fernekorn [ et al. ] // Biol. Reprod. – 2007. – Vol. 76, № 4. – P. 645-653. 203 255. Harris, L. K. Adhesion molecules in human trophoblast – a review.II. Extravillous trophoblast / L. K. Harris, C. J. P. Jones, J. D. Aplin // Placenta. – 2009. – Vol. 30. – P. 299-304. 256. Lawson, C. ICAM-1 signaling in endothelial cells / Lawson C., Wolf S. // Pharmacol. Rep. – 2009. – Vol. 61, № 1. – P. 22-32. 257. Severe preeclampsia : are hemostatic and inflammatory parameters associated? / M.B. Pinheiro [ et al. ] // Clin. Chem. Acta. – 2014. – Vol. 427. – P. 65-70. 258. Early disturbed placental ischemia and hypoxia creates immune alteration and vascular disorder causing preeclampsia / A. Zarate [ et al. ] // Arch. Med. Res. – 2014. – Vol. 45, № 7. – P. 519-524. 259. Rai, A. Development of the hemochorial maternal vascular spaces in the placenta through endothelial and vasculogenic mimicry / A. Rai, J.C. Cross // Dev. Biol. – 2014. – Vol. 387, № 2. – P. 131-141. 260. Burrows, T. D. Expression of adhesion molecules by endovascular trophoblast and decidual endothelial cells: implications for vascular invasion during implantation / T. D. Burrows, A. King, Y. W. Loke // Placenta. – 1994. – Vol. 15, № 1. – P. 21-33. 261. Kaufmann, P. Endovascular trophoblast invasion: implications for the pathogenesis of intrauterine growth retardation and preeclampsia / P. Kaufmann, S. Black, B. Huppertz // Biol. Reprod. – 2003. – Vol. 69, № 1. – P. 1-7. 262. Importance of N-glycosylation on α5β1 integrin for its biological functions / J. Gu [ et al. ] // Biol. Pharm. Bull. – 2009. –Vol. 32, № 5. – P. 780785. 263. Gu, J. Potential of N-glycan in cell adhesion and migration as either a positive or negative regulator / J. Gu, N. Taniguchi // Cell Adh. Migr. – 2008. – Vol. 2, № 4. – P. 243-245. 264. Rabinovich, G. A. Regulatory circuits mediated by lectin-glycan interactions in autoimmunity and cancer / G. A. Rabinovich, D. O. Croci // Immunity. – 2012. – Vol. 36, № 3. – P. 322-335. 204 265. Blois, S. M. The impact of dendritic cells on angiogenic responses at the fetal-maternal interface / S. M. Blois // J. Reprod. Immunol. – 2009. – Vol. 83, № 1-2. – P. 85-94. 266. Merry, C. L. A sugar rush for developmental biology / C.L. Merry, C.M. Ward // Development. – 2008. – Vol. 135, № 8. – P. 1389-1393. 267. Severe preeclampsia-related changes in gene expression at the maternal-fetal interface include sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin-6 and pappalysin-2 / V.D. Winn [ et al. ] // Endocrinology. – 2009. – Vol. 150, № 1. – P. 452-462. 268. Characterization of the sugar chain expression of normal term human placental villi using lectin histochemistry combined with immunohistochemistry / A. Tatsuzuki [ et al. ] // Arch. Histol. Cytol. – 2009. – Vol. 72, № 1. – P. 35-49. 269. Distribution of sugar remains in human placentas from pregnancies complicated by hypertensive disorders / M. Marini [ et al. ] // Acta Histochem. – 2011. – Vol. 113, № 8. – P. 815-825. 270. Lennon, F.E. Hyaluronan regulation of vascular integrity / F.E. Lennon, P.A. Singleton // Am. J. Cardiovasc. Dis. – 2011. – Vol. 1, № 3. – P. 200213. 271. A beta-N-acetylglucosaminyl phosphate diester residue is attached to the glycosylphosphatidylinositol anchor of human placental alkaline phosphatase: a target of the channel-forming toxin aerolysin / K. Fukushima [ et al. ] // J. Biol. Chem. – 2003. – Vol. 278, № 38. – P. 36296-36303. 272. Chang, Y. C. The interplay between Siglecs and sialylated pathogens / Y.C. Chang, V. Nizet // Glycobiology. – 2014. – Vol. 24, № 9. – P. 818-825. 273. Differential glycosylation of TH1, TH2 and TH-17 effector cells selectively regulates susceptibility to cell death / M. A. Toscano [ et al. ] // Nat. Immunol. – 2007. – Vol. 8, № 8. – P. 825-834. 274. Role of endothelial N-glycan mannose remains in monocyte recruitment during atherogenesis / D. W. Scott [ et al. ] // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2012. – Vol. 32, № 8. – P. 51-59. 205 275. Sasaki, N. Glycoconjugates and related molecules in human vascular endothelial cells [ Electronic resource ] / N. Sasaki, Toyoda M. // Int. J. Vasc. Med. – 2013. Mode of access http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3793293/pdf/IJVM2013963596.pdf 276. Endothelial cell antibodies associated with novel targets and increased rejection / A. M. Jackson [ et al. ] // J. Am. Soc. Nephrol. – 2015. – Vol. 26, № 5. – P. 1161-1171. 277. Glycosaminoglycans : key players in cancer cell biology and treatment / N. Afratis [ et al. ] // FASEB J. – 2012. – Vol. 279, № 7. – P. 11771197. 278. Haserodt, S. A comparison of the sensitivity, specificity, and molecular weight accuracy of the three different commercially available hyaluronan ELISA-like assays / S. Haserodt, M. Aytekin, R. A. Dweik // Glycobiol. – 2011. – Vol. 21, № 2. - P. 175-183. 279. Perturbation of the endothelial glycocalyx in post cardiac arrest syndrome / S. Grundmann [ et al. ] // Resuscitation. – 2012. – Vol. 83, № 6. – P. 715-720. 280. An antibody profile of systemic lupus erythematosus detected by antigen microarray / I. Fattal [ et al. ] // Immunology. – 2010. – Vol. 130, № 3. – P. 337-343. 281. Engstrom-Laurent, A. Changes in hyaluronan concentration in tissues and body fluids in disease states / A. Engstrom-Laurent // Ciba Found. Symp. 1989. – Vol. 143. – P. 233-240. 282. Uptake and degradation of hyaluronan in lymphatic tissue / R. J. E. Fraser [ et al. ] // Biochem. J. – 1988. – Vol. 256, № 1. – P. 153-158. 283. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymphspecific receptor for hyaluronan / S. Banerji [ et al. ] // J. Cell Biol. – 1999. – Vol. 144, № 4. – P. 789-801. 284. Damage of the endothelial glycocalyx in chronic kidney disease / J.S. Padberg [ et al. ] // Atherosclerosis. – 2014. – Vol. 234, № 2. – P. 335-343. 206 285. High levels of hyaluronan in idiopathic pulmonary arterial hypertension / M. Aytekin [ et al. ] // Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. – 2008. – Vol. 295, № 5. – P. 789-799. 286. Gressner, O. A. Biomarkers of liver fibrosis : clinical translation of molecular pathogenesis or based on liver-dependent malfunction tests / O. A. Gressner, R. Weiskirchen, A. M. Gressner // Clin. Chim. Acta. – 2007. – Vol. 381, № 2. – P. 107-113. 287. Localization of hyaluronan with a hyaluronan-specific hyaluronic acid binding protein in the placenta in pre-eclampsia / D. Matejevic [ et al. ] // Gynecol. Obstet. Invest. – 2001. –Vol. 52, № 4. – P. 257-259. 288. Increased plasma hyaluronan in severe pre-eclampsia and eclampsia. / S. Berg [ et al. ] // Scand. J. Clin. Lab. Invest. – 2001. – Vol. 61, № 2. – P. 131137. 289. Jackson, D. G. Immunological functions of hyaluronan and its receptors in the lymphatics / D. G. Jackson // Immunol. Rev. – 2009. – Vol. 230, № 1. – P. 216-231. 290. Poston, L. Endothelial dysfunction in preeclampsia / L. Poston // Pharmacol. Rep. – 2006. – Vol. 58. – P. 69-74. 291. Inflammation, immunity, and hypertension / D. G. Harrison [ et al. ] // Hypertension. – 2011. – Vol. 57, № 2. – P. 132-140. 292. Increased maternal serum and cord blood fibronectin concentrations in preeclampsia are associated with higher placental hyaluronic acid and hydroxyproline content / H. Uzun [ et al. ] // Hypertens. Pregn. – 2010. – Vol. 29, № 2. – P. 153-162. 293. Taylor, K. R. Glycosaminoglycans and their proteoglycans : hostassociated molecular patterns for initiation and modulation of inflammation / K. R. Taylor, R. L. Gallo // FASEB J. – 2006. – Vol. 20, № 1. – P. 9-22. 294. Stern, R. Hyaluronan fragments : an information-rich system / R. Stern, A. A. Asari, K. N. Sugahara // Eur. J. Cell. Biol. – 2006. – Vol. 85, № 8. – P. 699-715. 207 295. Oligosaccharides of hyaluronan induce angiogenesis through distinct CD44 abd RHAMM-mediated signaling pathways involving Cdc2 and γ-adducin / S. Matou-Nasri [ et al. ] // Intern. J. Oncol. – 2009. – Vol. 35, № 4. – P. 761-773. 296. Hyaluronan-CD44 interaction promotes growth of decidual stromal cells in human first-trimester pregnancy / R. Zhu [ et al. ] // PLOS One. – 2013. – Vol. 8, № 9. – P. 1-10. 297. Hyaluronan, CD44 and its variant exons in human trophoblast invasion and placental angiogenesis / R. Goshen [ et al. ] // Mol. Hum. Reprod. – 1996. – Vol. 2, № 9. – P. 685-691. 298. Extravillous trophoblast cell invasion is promoted by the CD44hyaluronic acid interaction / H. Takahashi [ et al. ] // Placenta. – 2014. – Vol. 35, № 3. – P. 163-170. 299. Hyaluronan up-regulates growth and invasion of trophoblasts in an autocrine manner via PI3K/AKT and MAPK/ERK1/2 pathways in early human pregnancy / R. Zhu [ et al. ] // Placenta. – 2013. – Vol. 34, № 9. – P.784-791. 300. Satchell, S. The role of the glomerular endothelium in albumin handling / S. Satchell // Nat. Rev. Nephrol. – 2013. – Vol. 9, № 12. – P. 717-725. 301. Alphonsus, C. S. The endothelial glycocalyx: a review of the vascular barrier / C. S. Alphonsus, R. N. Rodseth // Anaesthesia. – 2014. – Vol. 69, № 7. – P. 777-784. 302. Modulation of endothelial glycocalyx structure under inflammatory conditions [ Electronic resource ] / H. Kolářová [ et al. ] // Mediators. Inflamm. – 2014. – Mode of access : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3997148/pdf/MI2014694312.pdf 303. Nanomechanics of vascular endothelium / J. Fels [ et al. ] // Cell Tissue Res. – 2014. – Vol. 355, № 3. – P. 727-737. 304. Karbownik, M. S. Hyaluronan: towards novel anti-cancer therapeutics / M. S. Karbownik, J. Z. Nowak // Pharmacol. Rep. - 2013. – Vol. 65, № 5. – P. 1056-1074. 208 305. Heldin, P. Importance of hyaluronan biosynthesis and degradation in cell differentiation and tumor formation / P. Heldin // Braz. J. Med. Biol. Res. – 2003. – Vol. 36, № 8. – P. 967-973. 306. Hommelgaard, A. M. Association with membrane protrusions makes ErbB2 an internalization-resistant receptor / A. M. Hommelgaard, M. Lerdrup, B. van Deurs // Mol. Biol. Cell. – 2004. – Vol. 15, № 4. – P. 1557-1567. 307. Hyaluronan synthesis induces microvillus-like cell surface protrusions / A. Kultti [ et al. ] // J. Biol. Chem. – 2006. – Vol. 281, № 23. – P. 15821-15828. 308. CD44 interaction with tiam1 promotes Rac1 signaling and hyaluronic acid-mediated breast tumor cell migration / L.Y. Bourguignon [et al.] // J. Biol. Chem. – 2000. – Vol. 275, № 3. – P. 1829-1838. 309. CD44 interaction with c-Src kinase promotes cortactin-mediated cytoskeleton function and hyaluronic acid-dependent ovarian tumor cell migration / L. Y. Bourguignon [ et al. ] // J. Biol. Chem. – 2001. – Vol. 276, № 10. – P. 73277336. 310. Ponta, H. CD44 : from adhesion molecules to signaling regulators / H. Ponta, L. Sherman, P. A. Herrlich // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. – 2003. – Vol. 4, № 1. – P. 33-45. 311. Spicer, A. P. Hyaluronan and morphogenesis / A.P. Spicer, J.Y. Tien // Birth. Defects. Res. C. Embryo. Today. – 2004. – Vol. 72, № 1. – P. 89-108. 312. One percent of human circulating B lymphocytes are capable of producing the natural anti-Gal antibody / U. Galili [ et al. ] // Blood. – 1993. – Vol. 82, № 8. – P. 2485-2493. 313. Specificity of human antibodies against Galα1–3Gαl carbohydrate epitope and distinction from natural antibodies reacting with Galα1–2Gal or Galα1–4Gal / J. Wieslander [ et al. ] // Glycoconj. J. – 1990. – Vol. 7. – P. 85–100. 314. Specificity of xenoreactive anti-Gal alpha 1-3Gal IgM for alphagalactosyl ligands / W. Parker [ et al. ] // Glycobiology. – 1996. – Vol. 6, № 5. – P. 499-506. 209 315. Bacterial species-characteristic profiles of molecular species, and the antigenicity of phospholipids and glycolipids in symbiotic Lactobacillus, Staphylococcus and Streptococcus species / M. Iwamori [ et al. ] // Glycoconj. J. – 2012. – Vol. 29, № 4. – P. 199-209. 316. The human natural anti-Gal IgG. III. The subtlety of immune tolerance in man as demonstrated by crossreactivity between natural anti-Gal and anti-B antibodies / U. Galili [ et al. ] // J. Exp. Med. – 1987. – Vol. 165, № 3. – P. 693-704. 317. Naturally occurring anti-alpha-galactosyl antibodies: relationship to xenoreactive anti-alpha-galactosyl antibodies / W. Parker [ et al. ] // Glycobiology. – 1999. –Vol. 9, № 9. – P. 865-873. 318. Human natural anti-alpha-galactosyl IgG. II. The specific recognition of alpha (1-3)-linked galactose residues / U. Galili [ et al. ] // J. Exp. Med. – 1985. – Vol. 162, № 2. – P. 573-582. 319. Anti-alpha-galactosyl antibodies recognizing epitopes terminating with alpha1,4-linked galactose : human natural and mouse monoclonal anti-NOR and anti-P1 antibodies / M. Duk [ et al. ] // Glycobiology. – 2005. – Vol. 15, № 2. – P. 109-118. 320. Obukhova, P. Normal human serum contains high levels of anti-Gal alpha 1-4GlcNAc antibodies / P. Obukhova, R. Rieben, N. Bovin // Xenotransplantation. – 2007. – Vol. 14, № 6. – P. 627-635. 321. Galili, U. In situ conversion of tumors into autologous tumorassociated antigen vaccines by intratumoral injection of α-gal glycolipids / U. Galili // Oncoimmunology. – 2013. – Vol. 2, № 1. – P. 22449. 322. Role of α-gal epitope/anti-Gal antibody reaction in immunotherapy and its clinical application in pancreatic cancer / M. Tanemura [ et al. ] // Cancer Sci. – 2013. – Vol. 104, № 3. – P. 282-290. 323. Increased immunogenicity of human immunodeficiency virus gp120 engineered to express Galalpha1-3Galbeta1-4GlcNAc-R epitopes / U. Abdel-Motal [ et al. ] // J. Virol. – 2006. – Vol. 80, № 14. – P. 6943-6951. 210 324. Parmentier, H. K. Decreased specific antibody responses to alpha-Galconjugated antigen in animals with preexisting high levels of natural antibodies binding alpha-Gal residues / H. K. Parmentier, G. de Vries Reilingh, A. Lammers // J. Poult. Sci. – 2008. – Vol. 87, № 5. – P. 918-926. 325. Smorodin, E. P. The level of anti-(GalNAc beta) and anti-paraForssman disaccharide IgG antibodies in patients with gastrointestinal cancer: relation to survival / E. P. Smorodin, O.A. Kurtenkov, B.L. Sergeyev // Exp. Oncol. – 2013. – Vol. 35, № 2. – P. 89-92. 326. Обухова, П. С. Специфичность естественных анти-углеводных антител человека в норме : дис. … канд. хим. наук / П. С. Обухова. – М., 2012 327. Thomsen-Friedenreich-related carbohydrate antigens in normal adult human tissues : a systematic and comparative study / Y. Cao [et al.] // Histochem. Cell Biol. – 1996. – Vol. 106, № 2. – P. 197-207. 328. Expression of the Thomsen-Friedenreich antigen and of its putative carrier protein mucin 1 in the human placenta and in trophoblast cells in vitro / U. Jeschke [ et al. ] // Histochem. Cell. Biol. – 2002. – Vol. 117, № 3. – P. 219-226. 329. Oxygen governs Galβ1-3GalNAc epitope in human placenta / L. Ermini [ et al. ] // Am. J. Physiol. Cell Physiol. – 2013. – Vol. 305, № 9. – P. 931940. 330. Expression of galectin-1, -3 (gal-1, gal-3) and the ThomsenFriedenreich (TF) antigen in normal, IUGR, preeclamptic and HELLP placentas / U. Jeschke [ et al. ] // Placenta. – 2007. – Vol. 28, № 11-12. – P. 1165-1173. 331. Binding of galectin-1 (gal-1) to the Thomsen-Friedenreich (TF) antigen on trophoblast cells and inhibition of proliferation of trophoblast tumor cells in vitro by gal-1 or an anti-TF antibody / U. Jeschke [ et al. ] // Histochem. Cell Biol. – 2006. – Vol. 126, № 4. – P. 437-444. 332. Butschak G., Karsten U. Isolation and characterization of thomsenfriedenreich-specific antibodies from human serum / G. Butschak, U. Karsten // Tumour Biol. – 2002. – Vol. 23, № 3. – P. 113-122. 211 333. Снижение уровня специфических антител к углеводному антигену LеC у больных раком молочной железы / Н. Н. Тупицын [и др.] // Иммунология. – 2008. – Т. 29, № 2. – С. 94-97. 334. Breast cancer-associated antibody LU BCRU G7 recognizes the terminal disaccharide Gal beta 1-3GlcNAc and can be used to isolate tumour cells from body fluids by an immunomagnetic bead procedure / P. D. Rye [ et al. ] // Biochem. Soc. Trans. – 1995. – Vol. 23, № 4. – P. 584. 335. The anti-MUC1 monoclonal antibody BCP8 can be used to isolate and identify putative major histocompatibility complex class I associated amino acid sequences / B. Agrawal [ et al. ] // Cancer Res. – 1998. - Vol. 58, № 22. – P. 51515156. 336. Profiling of serum antibodies with printed glycan array: room for data misinterpretation / P. Obukhova [ et al. ] // Glycoconj. J. – 2011. – Vol. 28, № 8-9. – P. 501-505. 337. Natural IgG antibody with anti-β-galactosyl specificity suppressed hepatoma cell invasion in culture / Y. Miura [ et al. ] // Cytotechnology. – 2013. – Vol. 65, № 6. – P. 909-913. 338. Pregnancy : tolerance and suppression of immune responses / A. Leber [ et al. ] // Meth. Molec. Biol. – 2011. – Vol. 677. – P. 397-417. 339. Tolerance to the foetal allograft? / G. Chaouat [ et al. ] // Am. J. Reprod. Immunol. – 2010. – Vol. 63, № 6. – P. 624-636. 340. Lepenies, B. Targeting C-type lectin receptors with multivalent carbohydrate ligands / B. Lepenies, J. Lee, S. Sonkaria // Adv. Drug Deliv. Rev. – 2013. – Vol. 65, № 9. – P. 1271-1281. 341. Yan, H. The role of C-type lectin receptors in immune homeostasis / H. Yan, N. Ohno, N.M. Tsuji // Int. Immunopharmacol. – 2013. – Vol. 16, № 3. – P. 353-357. 342. Dambuza, I. M. C-type lectins in immunity : recent developments / I. M. Dambuza, G. D. Brown // Curr. Opin. Immunol. – 2015. – Vol. 32. – P. 2127. 212 343. Blidner, A. G. 'Sweetening' pregnancy: galectins at the fetomaternal interface / A. G. Blidner, G. A. Rabinovich // Am. J. Reprod. Immunol. – 2013. – Vol. 69, № 4. – P. 369-382. 344. Expression and function of galectins in the endometrium and at the human feto-maternal interface / U. Jeschke [ et al. ] // Placenta. – 2013. – Vol. 34, № 10. – P. 863-872. 345. Вохмянина, О. А. Углеводная специфичность галектинов тандемного типа : автореф. дис. … канд. хим. наук / О. А. Вохмянина. – М., 2012. 346. Galectins in innate immunity : dual functions of host soluble betagalactoside-binding lectins as damage-associated molecular patterns (DAMPs) and as receptors for pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) / S. Sato [ et al. ] // Immunol. Rev. – 2009. – Vol. 230, № 1. – P. 172-187. 347. Oligosaccharide specificity of galectins : a search by frontal affinity chromatography / J. Hirabayashi [ et al. ] // Biochim. Biophys. Acta. – 2002. – Vol. 1572, № 2-3. – P. 232-254. 348. Galectins : guardians of eutherian pregnancy at the maternal-fetal interface / N.G. Than [ et al. ] // Trends Endocrinol. Metab. – 2012. – Vol. 23, № 1. – P. 23-31. 349. Involvement of galectin-1 in reproduction: past, present and future / G. Barrientos [ et al. ] // Hum. Reprod. Update. – 2014. – Vol. 20, № 2. – P. 175193. 350. Spectrum of neurological diseases associated with antibodies to minor gangliosides GM1b and GalNAc-GD1a / M. Tatsumoto [ et al. ] // J. Neuroimmunol. – 2006. – Vol. 177, № 1-2. – P. 201-208. 351. Subacute motor axonal neuropathy associated with the IgG antiGalNAc-GD1a antibody [ Electronic resource ] / H. Goto [ et al. ] // BMJ Case Reports. – 2011. – Vol. 29. – Mode of access : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3070378/pdf/bcr.11.2010.3507.pdf 213 352. Acute pure motor demyelinating neuropathy with hyperreflexia and anti-GalNAc-GD1a antibodies / J. K. Kim [ et al. ] // Clin. Neurol. Neurosurg. – 2012. – Vol. 114, № 10. – P. 1345-1347. 353. Smorodin, E. P. The characterization of IgG antibodies to GalNAc beta-terminated glycans of gastric cancer survivors / E. P. Smorodin, B. L. Sergeyev, O. A. Kurtenkov // Exp. Oncol. – 2014. – Vol. 36, № 1. – P. 38-43. 354. Multiligand specificity of pathogen-associated molecular patternbinding site in peptidoglycan recognition protein / P. Sharma [ et al. ] // J. Biol. Chem. – 2011. – Vol. 286, № 36. – P. 31723-31730. 355. The role of hyaluronan degradation products as innate alloimmune agonists / B.M Tesar [ et al. ] // Am. J. Transplant. – 2006. – Vol. 6. – P. 26222635. 356. Guleria, I. Maternal acceptance of the fetus: true human tolerance / I. Guleria, M.H. Sayegh // J. Immunol. – 2007. – Vol. 178, № 6. – P. 3345-3351. 357. Чистякова, Г. Н. Иммунные механизмы развития перинатальной патологии : автореф. дис. … д-ра мед. наук / Г. Н. Чистякова. – Екатеринбург, 2005. 358. Иммунные механизмы развития гестоза : монография / Л.В. Посисеева [ и др. ]. – Иваново : Издательство «Иваново», 2008. – 240 с. 359. A role for glycoconjugates in human development: the human fetoembryonic defense system hypothesis / G. F. Clark [ et al. ] // Hum. Reprod. – 1996. – Vol. 11, № 3. – P. 467-473. 360. Clark, G. F. The role of glycans in immune evasion : the human fetoembryonic defense system hypothesis revisited / G. F. Clark // Mol. Hum. Reprod. – 2014. – Vol. 20, № 3. – P. 185-199. 361. Aplin, J. D. Fucose, placental evolution and the glycocode / J. D. Aplin, C. J. Jones // Glycobiology. – 2012. – Vol. 22, № 4. – P. 470-478. 362. Jones, C. J. Reproductive glycogenetics – a critical factor in pregnancy success and species hybridization / C. J Jones, J. D. Aplin // Placenta. – 2009. – Vol.30, № 3. – P. 216-219. 214 363. Mor, G. The immune system in pregnancy: a unique complexity / G. Mor, I. Cardenas // Am. J. Reprod. Immunol. – 2010. – Vol. 63, № 6. – P. 425433. 364. Tolerance mechanisms in pregnancy: a reappraisal of the role of class I paternal MHC antigens / D.A. Clark [ et al. ] // Am. J. Reprod. Immunol. – 2010. – Vol. 63, № 2. – P. 93-103. 365. HLA-G : An Immune Checkpoint Molecule / E. D. Carosella [ et al. ] // Adv. Immunol. – 2015. – Vol. 127. – P. 133-144. 366. Mechanisms of Maternal Immune Tolerance During Pregnancy, Recent Advances in Research on the Human Placenta / J. E. Schjenken [ et al. ] – Dr. Jing Zheng, 2012. 367. Büll, C. Sweet escape: sialic acids in tumor immune evasion / C. Büll, M. H. den Brok, G. J. Adema // Biochim. Biophys. Acta. – 2014. – Vol. 1846, № 1. – P. 238-246. 368. Sialic acids sweeten a tumor's life / C. Büll [et al.] // Cancer Res. – 2014. – Vol. 74, № 12. – P. 3199-3204. 369. Glycans in immune recognition and response / R. Amon [ et al. ] // Carbohydr. Res. – 2014. – Vol. 389. – P. 115-122. 215
