удк 619:616.155.392:636.2 тестирование рекомбинантного

УДК 619:616.155.392:636.2
ТЕСТИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО АНТИГЕНА Р24 ВИРУСА ЛЕЙКОЗА
КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА МЕТОДАМИ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО
АНАЛИЗА
Тургимбаева А.М.
Евразийский Национальный Университет им. Л.Н. Гумилева, г. Астана, Казахстан.
[email protected]
Научный руководитель – к.б.н., доцент кафедры биотехнологии и микробиологии
Евразийского Национального Университета им. Л.Н.Гумилева, Сегизбаева Г.Ж.
Научный консультант – д.б.н., заведующий лаборатории иммунохимии и
иммубиотехнологии НЦБ РК, Мукантаев К.Н.
Лейкоз крупного рогатого скота (ЛКРС) имеет вирусное происхождение. Вирус
ЛКРС относится к семейству ретровирусов (Retroviridae), к подсемейству онкорнавирусы
(Oncornaviridae). Ретровирусы часто вызывают разнообразные неопластические
заболевания и широко распространены среди позвоночных. Они отличаются характерной
морфологией, структурой РНК-генома и наличием РНК-зависимой ДНК-полимеразы
(обратной транскриптазы, ревертазы). Эта форма заболевания редко встречается у
животных моложе 2 лет и в основном распространена у КРС в возрасте 4-8 лет [5]. Лейкоз
встречается почти во всех странах мира. Заболевание имеет неодинаковую
распространенность не только в разных странах, но и в различных климатогеографических районах. Тесный физический контакт и обмен зараженными
биоматериалами являются необходимыми условиями для передачи и инфекции. Вирус
присутствует в основном в лимфоцитах, но может также быть обнаружен в крови, молоке
и опухолях [3].
Актуальность проблемы. Лейкоз крупного рогатого скота (ЛКРС) относится к числу
наиболее распространенных инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных
во многих странах мира, в том числе и на территории Республики Казахстан [4]. Согласно
современным взглядам исследователей различных стран, лейкоз крупного рогатого скота
– злокачественное хроническое заболевание органов кроветворения, вызываемое вирусом
лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), характеризуется прогрессивным увеличением
в крови лейкоцитов с последующим развитием опухоли лейкоза [2].
Широкое
распространение
болезни
причиняет
значительные
убытки
животноводческим хозяйствам, но главный ущерб наносится селекции и выращиванию
ценных чистопородных высокопродуктивных животных [1]. По результатам последних
исследований установлено, что годовой надой молока у серопозитивных коров на 10-14%
ниже, чем у серонегативных, а содержание жира на 0,09%. Общий экономический ущерб
от лейкоза в племенном хозяйстве достигает свыше 50 млн. тенге в год.
На данный момент в Казахстане данная болезнь регистрируется во всех областях
республики, наибольшее распространение лейкоза в Северном Казахстане, а наименьшее в Западном и Восточном Казахстане. На долю Северного Казахстана приходится 39,4%
неблагополучных пунктов, 53,6% заболевших и 81,5% павших от ЛКРС.
Целью работы является разработка иммуноферментной тест-системы на основе
использования рекомбинантного антигена р24 вируса лейкоза крупного рогатого скота.
Задачи:
- тестирование эффективности иммобилизации рекомбинантного р24 антигена ВЛКРС
при различных режимах с последующим проведением иммуноферментного анализа;
- определение оптимального рабочего разведения моноклональных антител (МКА).
Научная новизна и практическая ценность:
В Казахстане получен рекомбинантный р24 антиген вируса лейкоза крупного рогатого
скота. Установлены оптимальные условия постановки иммуноферментного анализа на
основе использования рекомбинантного антигена р24.
Материалы и методы.
Работа выполнена в РГП «Национальном центре биотехнологии Республики
Казахстан», в лаборатории иммунохимии и иммунобиотехнологии.
Объектами исследования являлись сыворотки крупного рогатого скота, больного
лейкозом, неблагополучных по лейкозу хозяйств.
Экспериментальная часть исследовательской работы заключается в постановке
непрямого варианта иммуноферментного анализа с использованием рекомбинантного
антигена р24 для определения наиболее оптимальных условий для диагностики
заболевания. В ходе эксперимента тестировались режимы инкубации антигена: в
планшете 1 - при +370 С в течение 2 часов, а также в планшете 2 - при +40 С в течение 12
часов. Путем окрашивания реактивом Брэдфорда отобранной надосадочной жидкости из
лунок планшетов 1 и 2 определяли количественное содержание белка (антигена р24) с
целью выявления кинетики осаждения рекомбинантного антигена р24 на поверхность
лунки.
Далее провели ИФА с целью тестирования оптимальных разведений моноклональных
антител (1:2000, 1:4000, 1:8000, 1:1600). Титровали рекомбинантный антиген р24 попарно
в 2 ряда (1-2, 3-4, 5-6, 7-8). Инкубировали планшет в течение часа при +370 С, промыли
планшет 3 раза PBS+TW20. Затем внесли 1% BSA для забивки лунок, инкубировали в тех
же условиях, так же промыли планшет. Далее внесли МКА в различных разведениях. Для
получения разведения МКА 1:2000 в 4 мл фосфатно-солевого буфера рН-7,2 с 0,5%
Твином-20 (PBS+TW20) внесли 2 мкл МКА, для разведения 1:4000 – к 8 мл PBS+TW20
внесли 2 мкл МКА, 1:8000 – 1,6 мл PBS+TW20 и 2 мкл МКА, а также 1:1600 – 3,2
PBS+TW20 и 2 мкл МКА. В ряды 1-2 планшета добавили по 100 мкл МКА 1:2000, в ряды
3-4 – 1:4000, в ряды 5-6 – 1:8000, в ряды 7-8 – 1:1600. Инкубация, промывка. Добавили
антивидовой конъюгат anti- mouse в разведении 1:5000. Инкубировали, промыли 3 раза
PBS+TW20, 3 раза дистиллированной водой. Внесли по 100 мкл субстратной смеси на
лунку, затем наблюдали ход реакции окрашивания. Остановили реакцию 100 мкл стоп реагентом (1н H2 SO4 ).
Результаты реакции учитывали на спектрофотометре при длине волны 595 нм или
визуально.
Результаты.
Результаты исследований показали, что наиболее эффективным условием для
инкубирования антигена является температурный режим при +37 0С в течение 2 часов.
При проведении реакции Брэдфорда наименее интенсивное окрашивание наблюдалось по
истечении 2 часов в надосадочной жидкости, которая находилась в лунках планшета,
инкубируемого при +370 С. Того же результата добились и при инкубировании в условиях
при +40 С в течение 12 часов и более. Следовательно, по временным параметрам
инкубирование при +370 С в течение 2 часов наиболее эффективно, чем при +4 0 С в течение
12 часов.
После документирования данных с помощью спектрофотометра были получены
следующие результаты:
Табл. 1 Сорбция рекомбинантного антигена на поверхность твердой фазы при +370 С.
Концентрация, Контроль
30
60
90
120
мкг/лун.
(BSA)
мин.
мин.
мин.
мин.
12
0,771
0,342
0,405
0,359
0,391
6
0,473
0,37
0,327
0,263
0,272
3
0,375
0,257
0,299
0,108
0,149
1,5
0,231
0,129
0,120
0,115
0,093
0,75
0,38
0,19
0,09
0,19
0,035
0,023
0,012
0,184
0,056
0,016
0,007
0,119
0,072
0,024
0,006
0,098
0,074
0,036
0,009
0,117
0,06
0,013
0,007
Табл. 2 Сорбция рекомбинантного антигена на поверхность твердой фазы при +4 0 С.
Концентрация, Контроль
мкг/лун.
(BSA)
2 ч.
4 ч.
6 ч.
12 ч.
26 ч.
12
0,908
0,202 0,433 0,426 0,205 0,497
6
0,727
0,278 0,411 0,602 0,296 0,449
3
0,521
0,265 0,295 0,294 0,548 0,332
1,5
0,215
0,151 0,219 0,327 0,272 0,209
0,75
0,116
0,045
0,07
0,134 0,128 0,102
0,38
0,087
0,02
0,068
0,05
0,076 0,088
0,19
0,036
-0,017 0,028 0,016 0,024 0,037
0,09
-0,002
-0,051 -0,026 -0,011 -0,018 -0,03
При установлении оптимального разведения раствора моноклональных антител (МКА)
выяснилось, что разведение МКА 1:8000 позволяет добиться оптимальных оптических
показателей по сравнению с другими. Результаты документировались с помощью
спектрофотометра при длине волне 595 нм.
Табл. 1. Учет результатов тестирования оптимальных разведений МКА:
Ряд 1 – МКА 1:2000; Ряд 2 – МКА 1:4000; Ряд 3 – МКА 1:8000; Ряд 4 – МКА 1:1600.
При разведении МКА 1:2000 при концентрации антигена 1,5 мгк на лунку OD составляет
1,706, при МКА 1:4000 при той же концентрации антигена OD-1,602, при МКА 1:8000 1,403, а также при МКА 1:1600 – 1,117. Таким образом, при увеличении разведении МКА,
снижается показатель оптической плотности.
Выводы.
1. В результате проведения исследовательской работы была разработана
иммуноферментная тест-система на основе использования рекомбинантного антигена р24
вируса лейкоза крупного рогатого скота.
2. Для диагностики заболевания. лейкозом наиболее эффективным условием для
инкубирования рекомбинантного р24 антигена является температурный режим при +37 0С.
3. Оптимальным рабочим разведением моноклональных антител является разведение
МКА 1:8000.
Список использованной литературы:
1. Джурина С.И. Методы эпизоотического исследования и теория эпизоотического
процесса. – Новосибирск: «Наука» Сибирское отделение, 1991 г.
2. Инфекционные болезни животных./Под ред. Д.Ф.Осидзе – М.: Агропроиздат, 1987.
3. Лейкоз крупного рогатого скота. – М.: Россельхозиздат, 1986 г.
4. Нахмансон В.М., Бурба Л.Г. Дифференциальная диагностика инфекционных
болезней сельскохозяйственных животных. – М.: Росагропроиздат, 1990 г.
5. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В.//Ветеринарная вирусология/М.:
«Агропромиздат», 1991 г.