Document 2672877

Последнее десятилетие XX века характеризуется значительным ростом заболеваемости сифилисом [13].
Особенности течения сифилиса обусловлены взаимодействием бледной трепонемы и макроорганизма человека,
при этом основная роль по защите организма отводится иммунной системе [2, 10, 14, 15]. Исследование Т-Вклеточного звена иммунной системы при сифилисе дает порой разноречивые результаты [5, 8, 10, 14]. Вместе с тем
все авторы отмечают некоторое снижение количества Т-клеток при увеличении уровня В-лимфоцитов [15].
Развивающееся у части больных после проведенной терапии состояние серологической резистентности также
большинство исследователей связывают с изменениями в иммунном статусе ввиду присутствия бледной трепонемы
[10,14].
В последние годы возник интерес к изучению состояния клеточных мембран иммунокомпетентных клеток при
заболеваниях, связанных с изменением иммунных реакций [2, 3, 4]. В реализации иммунного ответа организма на
внедрение бледной трепонемы участвуют три звена: макрофаги, Т-лимфоциты и В-лимфоциты. При этом, есть
прямые основания предполагать взаимосвязь функциональной недостаточности иммунной системы с
особенностями структуры мембран иммунокомпетентных клеток [7]. Вышесказанное определяет актуальность
изучения вопроса патогенетической роли изменений, происходящих на уровне мембран лимфоцитов, при
различных клинических вариантах сифилиса.
Цель настоящей работы - выявить структурно-функциональные изменения в мембранах иммунокомпетентных
клеток в группах больных с вторичным сифилисом в стадии манифестации клинических проявлений, ранним
скрытым сифилисом и у пациентов с серологической резистентностью после лечения.
Учитывая роль иммунных изменений в патогенезе стадийности сифилиса, может обсуждаться нестабильность
морфо-функционального состояния области белок-липидного взаимодействия мембраны, что может приводить к
преждевременной деструкции рецепторного аппарата и элиминации клеток из сосудистого русла [3,7].
Для экспериментального исследования клеточной мембраны мы использовали чувствительный и
высокоинформативный метод флуоресцентных зондов. Моделью для изучения указанных характеристик мы выбрали
мембрану лимфоцита как основную клетку адаптивного иммунитета.
Исследованы лимфоцитарные мембраны в трех группах: 1-я группа состояла из 15 пациентов вторичным сифилисом с клиническими проявлениями (МС) - папулезными сифилидами и розеолой в возрасте от 20 до 41 года (9
мужчин и 6 женщин). 2-я группа состояла из 15 пациентов ранним скрытым сифилисом (СС) от 18 до 39 лет (10
мужчин и 5 женщин). В обеих группах исследование проводилось до лечения. 3-я группа состояла из 18 пациентов с
серологической резистентностью (СР) после лечения сифилиса в возрасте от 22 до 45 лет (9 мужчин и 9 женщин).
Группа подбиралась с учётом отсутствия соматической патологии и перенесённых в анамнезе заболеваний (вирусного
гепатита, туберкулеза, коллагенозов). Больные были консультированы невропатологом и окулистом, патологии не
было обнаружено. Диагноз серологической резистентности устанавливался на основании стойкого отсутствия
негативации клинико-серологических реакций (КСР) от 1 до 1,5 года. Контрольную группу составляли 15 здоровых
лиц от 19 до 26 лет.
Мононуклеары выделяли из гепаринизированной крови с помощью центрофугирования в ступенчатом градиенте плотности фиколлвераграфин [6]. Биофизические характеристики выделенных клеток исследовали методами флуоресцентного зондирования [4] на спектрофлуориметре MPF-4 («Hitachi») при комнатной температуре.
Измерение проводилось в круглых кварцевых кюветах с длиной оптического пути 5 мм.
Определялись следующие параметры:
1. Излучение собственной беззондовой флуоресценции триптофановых остатков белков при длине волны
возбуждения 284 нм и волны флуоресценции 334 нм - в единицах флуоресценции (ЕФ);
2. Исследование флуоресценции гидрофобного зонда пирена с определением текучести по отношению флуоресценция эксимеров/флуоресценция мономеров - в относительных единицах (ОЕ);
3. Погруженность мембранных белков в липидный бислой по коэффициенту индуктивно-резонансного переноса энергии в системе триптофанилы-пирен - в (ОЕ);
4. Оценка уровня восстановленных пиридиннуклеотидов (ВП) была основана на интенсивности их
флуоресценции при 460-480 нм, а окисленных флавопротеинов (ОФ) - при 520-540 нм - в ЕФ. Вычислялось
отношение ВП/ОФ.
Статистическую обработку данных проводили с использованием прикладной программы «Statistica-5». Для
оценки статистической значимости различий в группах использован критерий Манна-Уитни.
Результаты флуоресцентного зондирования представлены в таблице 1.
Среди выявленных нами параметров изменений структурно-функционального состояния мембран лимфоцитов
можно выделить два направления изменений.
Первая группа параметров отражает наличие однонаправленных изменений в мембранах лимфоцитов у больных
сифилисом во всех группах по отношению к контрольной. Согласно нашим исследованиям, к этим изменениям
относится достоверное повышение текучести (снижение микровязкости) в глубоких слоях липидного бислоя
мембраны. Одновременно в основных группах была достоверно снижена флуоресценция триптофановых остатков
мембранных белков по сравнению с контролем (табл. 1). Интересным представляется анализ соотношения
липидной (определенной по флуоресценции пирена) и белковой (определенной по флуоресценции
триптофанилов) составляющих мембран. Мы выявили достоверное повышение (р < 0,05) отношения как мономеров,
так и эксимеров пирена к триптофанилам у больных сифилисом в группах с МС и СС по сравнению с контролем. В
группе с СР прослеживается тенденция к повышению указанных параметров (таблица 1).
Вторая группа параметров отражает определённые различия в структуре мембран лимфоцитов между группами
скрытого и манифестного течения сифилиса.
Результаты нашего исследования выявили значительные различия в степени погруженности мембранных белков в
липидный бислой. Этот показатель был достоверно ниже (р < 0,01) у больных СР по сравнению с контролем, а также
значительно ниже в группах МС и СС. Его снижение свидетельствует о более поверхностном расположении
мембранных белков (рецепторных детерминант), что может делать их недоступными для связывания с антигеном.
Это в свою очередь отражается в низкой функциональной активности лимфоцита, в снижении уровня
межклеточной кооперации в целом и, вероятно, может играть значительную роль в сохранении персистирующей
формы бледной трепонемы.
Указанные взаимоотношения подтверждаются при анализе энергетического потенциала лимфоцитов, прямо
отражающего их функциональную активность. По нашим данным, у больных СР и СС достоверно снижена флуоресценция окисленных флавопротеидов (р < 0,05) при незначительном изменении у больных МС и в контрольной
группе. Одновременно показатель энергетической активности клетки (отношение окисленных и восстановленных
форм флавопротеинов и пиридиннуклеотидов) оказался достоверно ниже у больных СР (р < 0,05), а в группе
больных МС - достоверно выше (р < 0,05) по отношению к контролю (рис. 2). В группе больных СС выявлена
тенденция к снижению этого показателя (р > 0,05).
Энергетический обмен в мембране лимфоцита соответствует той функциональной нагрузке, которую она
выполняет. Вероятно, при вторичном МС повышенный энергетический обмен клетки обусловлен более
интенсивной антигенной стимуляцией, чем при СС и СР. Полученные результаты согласуются и с показателями
фагоцитарного звена иммунитета [12]. Показатели низкой функциональной активности лимфоцитов в группах СС
и СР со снижением микровязкости в глубоких слоях липидного слоя и изменениями белковой части мембраны
говорят о схожести изменений на мембранном уровне у таких больных.
Таким образом, по совокупности вышеотмеченных данных у больных сифилисом имеет место повышение
текучести (снижение микровязкости) липидов в глубоких областях липидного бислоя со снижением относительного содержания мембранных белков, что может индуцировать генерацию лейкотриенов и простогландинов [17],
подавляющих, в свою очередь, продукцию интерлейки-на-1, являющегося неспецифическим маркером
персистенции бледной трепонемы [10, 16]. Комплексная сравнительная оценка изменений в мембранах
лимфоцитов с помощью флуоресцентных зондов при различных формах сифилиса выявила
однонаправленность нарушений в их структурно-функциональном состоянии.
Одновременно нами выявлено уменьшение степени W погруженности рецепторно-белкового комплекса в липидный бислой мембраны лимфоцита у больных СР на фоне снижения функциональной энергетической
активности клетки, что может приводить к созданию условий для персистенции бледной трепонемы в организме
больного. В качестве одного из возможных механизмов формирования СР предложена гипотеза о патологии
мембранно-рецепторного комплекса, в частности пространственно-ориентационного положения рецепторных
белков.
Таблица1. Показатели структурно-функционального состояния мембран лимфоцитов у больных
сифилисом
№
1.
2.
з.
Анализируемый показатель
Флуоресценция
восстановленных
пиридиннуклеотидов
(ЕФ) флавопротеинов
—
Флуоресценция окисленных
(ЕФ) - ОФ
Отношение ОФ/ВП (ОЕ)
Контроль
п=15(1)
44 ± 7,6
Манифестный Ранний
сифилис (МС) скрытый
сифилис (СС)
п = 15 (2)
п=15(3)
28,1 ± 3,9
39Д ± 2,4
Серорезистентный
Достоверность
различий
п=18(4)
43,9 ± 7,8
Рг-4 < 0,05
29,5 ± 3,8
24,6 ±2,5
14,8 ±1,3
17,7 ± 1,2
ри,4<0,05
0,88 ± 0,14
1,0 ±0,12
0,76 ± 0,4
0,50 ± 0,06
Pi-2,4<0,05
4.
5.
Флуоресценция триптофановых остатков в
белках мембран (ЕФ)
Степень погруженности белков в липиды (ОЕ)
94,5 ± 10,8
41,5 ±4,7
59,6 ±4,8
57,2 ± 4,2
рн34< 0,001
0,36 ±0,5
0,22 ±0,05
0,19 ± 0,04
0,13 ±0,05
Рм<0,05
6.
Текучесть в глубоких слоях мембраны по
флуоресценции пирена (ОЕ)
0,714 ± 0,058
0,903 ±0,033
0,884 ± 0,044
0,864 ± 0,032
Pi-2.3,4 <0,05
7.
Отношение флуоресценции эксимеров
пирена к триптофанилам (ОЕ)
0,728 + 0,116
1,853 ± 0,401
1,64 ± 0,36
1,17 ±0,21
pi-2,3 <0,05
8.
Отношение флуоресценции мономеров
пирена к триптофанилам (ОЕ)
0,84 ± 0,17
2,1 ± 0,44
1,95 ± 0,25
1,31 ±0,21
pi-2,3 < 0,05
Рис. 1. Отношение флуоресценции эксимеров пирена к мономерам РЭ/РМ (глубокая микровязкость липидного бислоя лимфоцита): 1 —
контроль, 2 — вторичный манифестный, 3 — ранний скрытый, 4 — серорезистентный. - достоверные (р < 0,05) различия между контролем и
больными.
Рис. 2. Отношение флуоресценции окисленных флавопротеинов восстановленных к коферментам ОФ/ВК (функциональная активность клетки):
1 — контроль, 2 — вторичный манифестный, 3 — ранний скрытый, 4 — серорезистентный. *- достоверные (р < 0,05) различия между контролем
и больными.
1
2
3
4
Рис. 3. Степень погруженности мембранных белков лимфоцита у больных сифилисом (T1-T2/T1): 1 — контроль, 2 — вторичный манифестный, 3
— ранний скрытый, 4 — серорезистентный. * — достоверные (р < 0,05) различия между контролем и больными.