Российский биотерапевтический журнал №2

ISSN 1726-9784
РОССИЙСКИЙ
БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ
ЖУРНАЛ
ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ И НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
№2 Том 14 2015 г.
УДК 616-085.2/.3
Учредители
ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина»; НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей
Главный редактор
А.Ю. Барышников, д-р мед. наук, проф.
Заместители главного редактора
А.В. Караулов, чл.-коpр. РАН, д-р мед. наук, проф.; Н.А. Оборотова, д-р фарм. наук, проф.
Редколлегия
И.А. Балдуева, д-р мед. наук (Санкт-Петербург),
М.А. Барышникова, канд. фарм. наук, отв. секретарь (Москва),
О.А. Бочарова, д-р биол. наук, проф. (Москва),
А.К. Голенков, д-р мед. наук, проф. (Москва), М.И. Давыдов, д-р мед. наук, проф., академик РАН (Москва),
Л.В. Демидов, д-р мед. наук, проф. (Москва),
И.В. Евсегнеева, д-р. мед. наук, проф. (Москва), П.К. Иванов, д-р мед. наук (Москва),
З.Г. Кадагидзе, д-р мед. наук, проф. (Москва), И.Ю. Кубасова, канд. мед. наук (Москва),
В.В. Новиков, д-р биол. наук, проф. (Нижний Новгород), В.В. Решетникова, канд. тех. наук (Москва),
Н.С. Сергеева, д-р мед. наук, проф. (Москва), Е.В. Степанова, д-р мед. наук (Москва),
Н.Н. Тупицын, д-р мед. наук, проф. (Москва), Е.Г. Турнянская, канд. мед. наук (Москва),
Ю.В. Шишкин, д-р мед. наук, проф. (Москва), З.С. Шпрах, канд. фарм. наук (Москва),
И.Ж. Шубина, д-р биол. наук (Москва), Р.И. Якубовская, д-р мед. наук, проф. (Москва)
«Российский биотерапевтический журнал» является рецензируемым изданием
Зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи,
информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор)
Регистрационный номер:
ПИ №77-11695 от 21.01.2002 г.; ПИ № ФС77-53039 от 04.03.2013 г.
Подписной индекс 81679
Объем 7 усл.-печ. листов,
подписано в печать 05.05.2015
Тираж 1000 экз.
Издательская группа РОНЦ:
115478 Москва, Каширское шоссе, д. 24.
Тел. +7 (499) 324 24 70; [email protected]
Координаторы: Е.Г. Турнянская, Б.Б. Крюков (макет)
Почтовый адрес:
115478 Москва, Каширское ш., 24
ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина»
НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей
Принт-менеджмент:
Тел.: +7 (499) 323 57 00, +7 (499) 324 10 65; факс: +7 (499) 324 22 74;
Печатный центр "Удача"
E-mail: [email protected]
115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 23
Интернет-версия: http://www.ronc.ru/main/zhurnaly/rossijskij-bioterapevticheskij-zhurnal.html
СОДЕРЖАНИЕ №2 2015
Памяти А.Ю. Барышникова
ОБЗОРЫ ЛИТЕРАТУРЫ
А.А. Вартанян, М.В. Оборотова
ОСНОВНЫЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ СТВОЛОВОЙ КЛЕТКИ МЕЛАНОМЫ....................................................... 7
М.А. Барышникова, Д.А. Афанасьева, И.В. Уласов, А.Ю. Барышников
МЕХАНИЗМЫ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ МЕЛАНОМЫ ......................................................... 17
В.А. Мисюрин
СТРУКТУРА И СВОЙСТВА ОСНОВНЫХ РЕЦЕПТОРОВ
И ЛИГАНДОВ ВНЕШНЕГО ПУТИ АПОПТОЗА ................................................................................................. 23
П.В. Голышко, К.А. Барышников, А.Ю.Барышников
ИММУНОГЕННЫЕ РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫЕ АНТИГЕНЫ
И ИХ ГЕНЫ ПРИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЯХ............................................................... 31
М.В. Родионова, И.К. Воротников, В.В. Родионов, Н.В. Чхиквадзе, Е.А. Дудко,
Д.А. Рябчиков, Е.В. Ошкина , Т.А. Богуш
ЭСТРОГЕНОВЫЕ РЕЦЕПТОРЫ БЕТА КАК МАРКЕРЫ ЭФФЕКТИВНОСТИ
ГОРМОНАЛЬНОЙ ТЕРАПИИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ........................................................................ 39
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
А.И. Черткова, Е.Г. Славина, Л.Г. Жукова, И.П. Ганьшина, М.А. Окружнова, Э.К. Шоуа,
В.А. Нуртдинова, А.А. Борунова, З.Г. Кадагидзе
СУБПОПУЛЯЦИОННЫЙ СОСТАВ ЛИМФОЦИТОВ ПРИ HER2+
И ТРИЖДЫ-НЕГАТИВНОМ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ........................................................................... 47
И.В. Уласов, Н.В. Каверина, З.Г. Кадагидзе, А.Ю. Барышников
ПОДАВЛЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ КЛЕТОЧНОЙ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ ТИП 14
УСИЛИВАЕТ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЙ ЭФФЕКТ ТЕМОЗОЛОМИДА
И ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ В КЛЕТКАХ ГЛИОБЛАСТОМ ЧЕЛОВЕКА....................................... 53
В.В. Синайко, Н.А. Артемова, Т.Л. Юркштович, П.М. Бычковский, К.А. Фроленков
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРЕПАРАТОВ ТЕМОБЕЛ И ТЕМОДАЛ
В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ ВЫСОКОЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ (GRADE III – IV)
ГЛИАЛЬНЫХ ОПУХОЛЕЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА ............................................................................................ 59
И.В. Уласов, Н.В. Каверина, З.Г. Кадагидзе, А.Ю. Барышников
ИНГИБИРОВАНИЕ АКТИВНОСТИ КЛЕТОЧНЫХ ТРАНСПОРТЕРОВ ГЛИОБЛАСТОМ
СЕНСИБИЛИЗИРУЕТ КЛЕТКИ-МИШЕНИ К ИНФЕКЦИИ ОНКОЛИТИЧЕСКИМ ВЕКТОРОМ
В ПРИСУТСТВИИ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ ........................................................................................ 65
М.П. Киселева, З.С. Шпрах, Л.М. Борисова, И.Ю. Кубасова, А.В. Ланцова, Е.В. Санарова,
Н.А. Оборотова, З.С. Смирнова, А.Ю. Барышников
ДОКЛИНИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ
ПРОИЗВОДНОГО N-ГЛИКОЗИДА ИНДОЛОКАРБАЗОЛА ЛХС-1208. СООБЩЕНИЕ I........................... 71
А.В. Ланцова, Е.А. Котова, Е.В Санарова, А.П. Полозкова, М.А. Барышникова, Н.А. Оборотова
РАЗРАБОТКА ЛИОФИЛИЗИРОВАННОЙ
ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ЦИФЕЛИНА.................................................................. 79
Е.В. Бочаров, Р.В. Карпова, А.А. Вершинская, В.Г. Кучеряну, О.А. Бочарова
ЛИМФОЦИТАРНАЯ ИНФИЛЬТРАЦИЯ ГЕПАТОКАРЦИНОМ МЫШЕЙ
ВЫСОКОРАКОВОЙ ЛИНИИ СВА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ МУЛЬТИАДАПТОГЕНА
В РАННЕМ ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ ................................................................................................ 85
А.Ю. Журавская, А.В. Комельков, Е.М. Чевкина
МАЛАЯ ГТФаза ARF6 АКТИВИРУЕТ MTORC1-ЗАВИСИМЫЙ СИГНАЛЬНЫЙ ПУТЬ
И СТИМУЛИРУЕТ РОСТ КЛЕТОК ГЛИОБЛАСТОМЫ................................................................................... 91
Н.В. Голубцова, O.C. Бурова, К.А. Барышников, М.В. Оборотова, В.И. Карасева, Л.Т. Мамедова,
К.И. Жорданиа, М.А. Барышникова, А.С. Гриневич, П.К. Иванов, А.Ю. Барышников
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ICO-406 ПРОТИВ АНТИГЕНА CD117 ................................................. 99
В.С. Косоруков, Е.Н. Кособокова, М.В. Пинюгина, М.А. Севостьянова, А.И. Щербаков,
Н.В. Андоронова, Э.Ш. Соломко, Е.В. Шешукова, Е.М. Трещалина, Ю.Л. Дорохов
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ
ПРОТИВ РЕЦЕПТОРА HER2, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО ИСТОЧНИКА .......................... 105
План научных мероприятий ФГБНУ "РОНЦ им. Н.Н. Блохина" на 2015 год..........................................................78
Список используемых сокращений............................................................................................................................. 113
БАРЫШНИКОВ Анатолий Юрьевич
21.09.1944 – 31.05.2015
Российская наука понесла трагическую потерю.
На 71 году жизни скоропостижно скончался видный ученый, один из
ведущих отечественных специалистов в области иммунологии, директор
Научно-исследовательского института экспериментальной диагностики и
терапии опухолей, доктор медицинских наук, профессор Анатолий Юрьевич Барышников.
Анатолий Юрьевич родился в селе Шаранга Шарангского района Кировской области в семье служащих. В 1969 году окончил Витебский медицинский институт по специальности «Лечебное дело», с 1971 года по 1974
год проходил обучение в аспирантуре ИЭиКО АМН СССР.
Он начал трудовую деятельность в Онкологическом Центре в 1974 году в должности младшего научного сотрудника лаборатории вирусологии
опухолей, с 1978 года – младший научный сотрудник лаборатории экспериментальной иммунотерапии, с 1981 года – старший научный сотрудник
той же лаборатории, с 1987 года – ведущий научный сотрудник лаборатории клинической радиоиммунологии, с 1988 года – главный научный сотрудник той же лаборатории, с 1992 года – заведующий лабораторией экспериментальной диагностики, с 1998 года заместитель директора РОНЦ по
научной работе – директор НИИ ЭД и ТО.
В 1975 году Анатолий Юрьевич защитил кандидатскую диссертацию
"Экспериментальные материалы по изучению вирусной терапии опухолей
в условиях нагрузки РЭС и дозированной гипертермии", в 1985 г. – докторскую диссертацию "Моноклональные антитела и ксеногенные сыворотки в иммунодиагностике лейкоза человека.
А.Ю.Барышникову принадлежит приоритет крупных разработок в области иммунодиагностики лейкозов и лимфом человека.
С учениками и сотрудниками лаборатории он создавал оригинальные иммунологические диагностикумы для определения дифференцировочных и лейкозоассоциированных антигенов, на основе теоретических положений по дифференцировке гемопоэтических клеток принимал активное участие в разработке
критериев диагностики иммунологических подвариантов лейкозов и лимфом.
Теоретические положения и разработка диагностикумов, а также организация их производства вели к внедрению в практику здравоохранения нового
метода – иммунодиагностики гемобластозов. А.Ю. Барышников внес значительный вклад в развитие гибридомной технологии и клеточной инженерии.
Благодаря его усилиям в РФ созданы и производятся моноклональные антитела, создана уникальная коллекция гибридом-продуцентов моноклональных антител против дифференцировочных антигенов клеток крови человека и
опухоле-ассоциированных антигенов. А.Ю. Барышников разрабатывал новое
направление в лечении злокачественных новообразований – биотерапию.
По его инициативе созданы противоопухолевые вакцины, которые с
успехом проходят клинические испытания.
Он руководил разработкой терапевтических гуманизированных моноклональных антител, созданием новых средств доставки противоопухолевых препаратов и изучением новых противоопухолевых препаратов.
А.Ю. Барышников – автор 460 статей в рецензируемых журналах, 14
монографий, 54 патентов. Анатолий Юрьевич проводил большую научнопедагогическую работу, являлся профессором кафедры клинической иммунологии и аллергологии Первого МГМУ им. И.М.Сеченова.
Под его руководством выполнено и защищено 18 докторских и 70
кандидатских диссертаций, он был создателем и бессменным главным редактором «Российского биотерапевтического журнала», членом редколлегии 4 научных журналов, заместителем председателя Объединенного Ученого Совета ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина», председателем Ученого Совета НИИ ЭДиТО ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина», членом специализированного Ученого Совета.
Анатолий Юрьевич был талантливым руководителем, пользовался заслуженным авторитетом и уважением .
Светлая память о нем надолго сохранится в наших сердцах.
Друзья, ученики и коллеги
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ОСНОВНЫЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ СТВОЛОВОЙ КЛЕТКИ МЕЛАНОМЫ…
7
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
УДК 616-006.81-018.29:576.3.017.22
А.А. Вартанян, М.В. Оборотова
ОСНОВНЫЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ СТВОЛОВОЙ КЛЕТКИ МЕЛАНОМЫ
ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина», Москва
Контактная информация
Вартанян Амалия Арташевна, д.б.н., старший научный сотрудник лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДиТО
адрес: 115478 Москва, Каширское шоссе, 24; тел. +7(499)324-10-65
e-mail: [email protected]
Статья поступила 10.03.2015, принята к печати 27.04.2015
Резюме
Меланома – чрезвычайно злокачественная опухоль. До недавнего времени предполагалось, что все клетки меланомы обладают одинаковой способностью инициировать опухоль и формировать метастазы. Сегодня
достоверно показано, что такими свойствами обладает немногочисленная субпопуляция особых самообновляющихся клеток, называемых стволовыми. Эти клетки ответственны за все проявления процесса формирования опухоли, включая неоангиогенез и образование стромы. В обзоре будут обсуждены основные антигенные
детерминанты стволовой клетки меланомы, а также подходы к терапевтическому воздействию на СКМ.
Ключевые слова: меланома, стволовая клетка опухоли, CD20, CD133, CD271, ABC B5, васкулогенная мимикрия.
А.A. Vartanian, M.V. Oborotova
BASIC DETERMINANTS OF MELANOMA STEM CELL
FSBSI «N.N. Blokhin RCRC», Moscow
Abstract
Melanoma is considered to be the deadliest form of skin cancer. For years it has been accepted that all melanoma
cells in tumor are capable of tumor formation and each of them has the ability to initiate the metastasis. At present a
stem cell theory of cancer has been developed, which purports that a subpopulation of self-renewing tumor cells is responsible for tumorogenesis, neoangiogenesis and stroma building. In this review we will discuss the basic determinants
of melanoma stem cell and melanoma stem cell targeting implications.
Key words: melanoma, cancer stem cell, CD20, CD133, CD271, ABC B5, vasculogenic mimicry.
Введение
В последние десятилетия предприняты настойчивые попытки выявить наиболее типичные изменения
наследственного аппарата клетки, которые приводят к
злокачественному опухолевому перерождению и развитию различных видов рака. Основной целью при этом
был поиск потенциальных мишеней, воздействуя на
которые можно было бы добиваться подавления роста
опухоли. Однако по мере получения и анализа этих результатов становилось ясно, что подобный подход к
успеху не приведет. Оказалось, что набор генетических
поломок индивидуален не только для каждой опухоли,
но и для различных популяций клеток внутри одной
опухоли. Более того, многие свойства и особенности
злокачественных новообразований не поддаются объяснению одними только генетическими факторами. Фун№ 2/том 14/2015
даментальной проблемой в исследовании рака продолжала оставаться идентификация клеток, способных инициировать и поддерживать рост опухоли.
Для объяснения разнородного состава опухоли предложены две модели. Согласно первой,
любая клетка злокачественной опухоли может инициировать новую опухоль или участвовать в формировании метастазов, а функциональная гетерогенность ассоциируется со случайными воздействиями: внутренними (связанными с транскрипционной активностью генома) или внешними (микроокружение клетки, иммунная система организма
[40]). Согласно второй модели, опухоли формируются лишь из специальных опухолевых клеток. Эти
клетки, по-видимому, появляются из нормальных
стволовых клеток в результате злокачественной
трансформации СК или их прямых потомков [9].
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
8
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ОСНОВНЫЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ СТВОЛОВОЙ КЛЕТКИ МЕЛАНОМЫ…
Возникновение мутаций в СК, их наследование
клетками-родоначальницами, а также неадекватный
ответ СК на внешние сигналы могут приводить к
превращению здоровых СК в опухолевые. Клетки
этого типа получили название «стволовые клетки
опухоли» (СКО). Концепция СКО сводится к следующему: СКО – специфическая опухолевая клетка
– долгоживущая и медленно пролиферирующая,
способная при трансплантации иммунодефицитным животным инициировать рост опухоли, идентичной исходной, в то время как другие короткоживущие и более дифференцированные клетки
опухоли этой способностью не обладают [7; 17; 28].
Именно с этих клеток начинается формирование
злокачественной опухоли.
В отличие от более дифференцированных
клеток основной опухолевой массы, которые относительно неплохо уничтожают существующие
средства цитотоксической противоопухолевой терапии, СКО характеризует чрезвычайной терапевтической устойчивостью, которая в ответ на лечение только возрастает. Многие вопросы, на которые не было ответов, находят в рамках этой модели
объяснение. Например, почему некоторые опухолевые клетки в одной и той же опухоли агрессивнее
остальных? Почему некоторые клетки не восприимчивы ни к облучению, ни к химиотерапии? Модель СКО, то есть функциональной гетерогенности
клеток опухоли, объясняет также процессы метастазирования. Сегодня уже достоверно известно,
что предрасположенность опухоли к метастазированию заложена в геноме конкретной опухолевой
клетки [54].
Многие из нас еще лет пять назад считали:
если в процессе терапии удалось добиться значительного уменьшения размеров опухоли, это большой успех. Теперь мы знаем, что снижение размеров опухоли в результате лечения не столь уж и
важно, гораздо важнее судьба СКО. Ибо, если они
уцелели, то опухоль в ближайшее время "вернется".
В обзоре будут обсуждены основные антигенные детерминанты СКМ и возможности терапевтической интервенции, направленной на эту
популяцию клеток.
Что такое стволовая клетка опухоли?
Как известно, в организме непрерывно идёт
процесс отмирания клеток и их замещения новыми.
В одних видах тканей продолжительность жизни
клеток исчисляется месяцами, в других – днями.
Источником новых клеток самых различных тканей
служат СК. Основные биологические свойства СК:
1. СК образуют самоподдерживающуюся популяцию. Это означает, что при делении
одни их потомки остаются стволовыми, а
другие дифференцируются;
2. эти клетки могут неограниченное количество раз делиться и давать любое число поколений потомков в течение жизни данного организма;
3. потомки таких клеток могут дифференцироваться в разных направлениях [45].
№ 2/том 14/2015
В настоящее время различают три типа СК:
эмбриональные, тканеспецифичные и СКО. Уникальной особенностью всех типов СК является самоподдержание, вместе с тем, они сильно различаются по своей способности давать разные типы
клеток-потомков. Эмбриональные СК, их также
называют тотипотентными, обнаруживаются на
самом раннем этапе эмбриогенеза во внутренней
клеточной массе эмбриобласта [35; 59]. Эмбриобласт состоит из нескольких сотен клеток, способных образовывать клетки любого из эмбриональных зародышевых слоев трех типов – эктодермы,
мезодермы и эндодермы. Начало собственно телу
плода дает эмбриобласт. Эмбриональная СК находится на вершине иерархии, производя клетки всех
типов, которые образует конкретный организм.
Тканеспецифические или региональные
СК отличаются от эмбриональных тем, что их
дифференцировка во многом ограничена конкретными органами. Тканеспецифичные СК представлены в органах небольшой фракцией и характеризуются:
 способностью к самообновлению, то
есть воспроизведению других СК с такой же способностью к пролиферации и
дифференцировке, что обеспечивает сохранение пула СК;
 способностью к ассиметричному делению, приводящему к воспроизведению
СК и образованию коммитированных к
дифференцировке в нужном направлении дочерних клеток с ограниченной
продолжительностью существования;
 способностью к регулированию соотношения процессов обновления СК и образования более дифференцированных
клеток-потомков, восполняющих ткань в
соответствии с конкретной ситуацией в
ткани, например, в случае ее повреждения [31].
Строение и клеточная масса различных органов в норме поддерживаются присутствием тканевых СК, которые обеспечивают процессы постепенного обновления тканей и их регенерацию в
случае повреждения. Следует отметить, что сегодня СК рассматривается как клетка, обладающая
гораздо большей пластичностью, чем предполагалось ранее. Прежде всего, это положение относится
к СК костного мозга. Гемопоэтические СК костного мозга, например, способны дифференцироваться
не только в различные клетки крови, но и в клетки
некоторых других типов – нервные клетки, клетки
печени, поджелудочной железы, миокарда, эпителия, кожи и др. [3].
Стволовая клетка опухоли относится к
третьему типу CK, именно такая клетка дает рост
опухолевому клону. К этому выводу привели исследования последних лет [5; 16]. Выяснилось, что:
 в каждой опухоли присутствует лишь
очень небольшая доля клеток, способных инициировать опухоль (0,01-1 %
клеток опухоли);
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ОСНОВНЫЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ СТВОЛОВОЙ КЛЕТКИ МЕЛАНОМЫ…
СКО каждой опухоли несет на своей поверхности определенные маркеры, характерные только для опухоли этого типа;
 опухоли, развивающиеся из СКО, содержат смешанную популяцию опухольинициирующих и не инициирующих клеток, соответствующую гетерогенному
клеточному составу исходной опухоли.
Феномен существования СКО в опухоли
сводится к следующему: СКО – это небольшая популяция клеток с неопределенно длительным пролиферативным потенциалом, которая отвечает за
образование и рост опухоли. Вновь появившиеся
опухолевые клетки могут утилизировать машину
самоподдержания нормальных СК. И если нормальные СК обладают способностью точно изменять свое поведение в зависимости от сигналов окружения, СКО утрачивает чувствительность к
внешним сигналам, регулирующим самоподдержание. И нормальная СК, и СКО обладают способностью к дифференцировке. В результате дифференцировки СК образуется нормальная зрелая клетка,
СКО часто показывает ненормальную дифференцировку. Например, тератокарцинома содержит
хрящевые и костные клетки, медуллобластома –
клетки, напоминающие и нервные клетки, и глиальные клетки. Таким образом, для СКО характерно нарушение клеточного старения и дифференцировки. Так, СКО, практически никому неизвестная
ещё каких-нибудь пятнадцать лет назад, сегодня
оказалась в центре внимания. Оказалось, что буквально все проблемы клинической онкологии, начиная от возникновения МЛУ до появления рецидивов спустя десятилетия после кажущегося исцеления, связаны именно с ними.
Что это за клетки и откуда они берутся?
Анализ литературы последних 10 лет указывает на
три возможных пути появления СКО [53]:
1. Первый путь подразумевает образование
СКО из тканевых СК в результате накопления мутаций.
2. Второй вариант допускает, что в прогениторной, или даже в дифференцированной клетке могут возникнуть онкогенные мутации, в результате которых
клетка вновь приобретает способность к
самообновлению.
3. Третий механизм связан с возможностью
возникновения СКО в результате слияния СК с дифференцированной клеткой,
с образованием гибридных клеток со
свойствами СКО или способных становиться СКО в дальнейшем.
Последняя версия появилась совсем недавно
[42]. Понятно, что мутации с одинаковой вероятностью могут возникнуть в стволовой, дифференцированной или гибридной клетке.
Далее объективно встают два вопроса, какие
механизмы и какие особенности СКО позволяют
им выживать, оставаясь невосприимчивыми к химиотерапии? Современная цитотоксическая химиотерапия направлена на гибель пролиферирующей
№ 2/том 14/2015
9
клетки, ДНК которой «открыта» и легко уязвима.
СКО же делится крайне редко [22]. В СКО, также
как и в нормальной СК, наблюдается конститутивная активация экспрессии сурвивина – анти- апоптотического белка – предохраняющая клетку от
апоптоза [15]. Было также показано, что в СКО гиперактивирована система АВС-транспортеров, основная задача которых сводится к быстрому выведению из клетки различных опасных для неё веществ [1]. Это может частично объяснить резистентность таких клеток к классической химиотерапии, что вполне естественно, так как препарат
просто не успевает подействовать. Есть основания
полагать, что СКО, как и нормальные СК, обладают
гораздо более совершенным механизмом репарации ДНК и намного эффективнее и быстрее восстанавливают свой наследственный материал [56]. Для
СКО характерен также высокий уровень экспрессии антиоксидантных ферментов [68]. И когда мы
говорим о бессмертии опухолевых клеток, то имеем
в виду бессмертие этих самых СКО, потому что все
другие клетки опухоли смертны. Становится понятно, почему даже видимое уменьшение размеров
опухоли при лечении, как правило, не приводит к
значительному увеличению продолжительности
жизни пациента.
Концепция СКО объясняет также, почему
стволовая клетка рака молочной железы ни при
каких обстоятельствах не станет стволовой клеткой
рака почки, а стволовая клетка рака простаты не
станет таковой рака легкого и т.д. Наоборот, для
опухоли характерна прогрессия с потерей степени
специализации, но не переход одного злокачественного новообразования в другое.
Глубокий интерес вызывает другая особенность СКО. Известно, что разные виды рака имеют
разную вероятность возникновения: рак молочной
железы по статистике встречается в сотни раз чаще,
чем опухоли системы кроветворения. Вплоть до
самых последних лет подобное поведение опухолей
объясняли влиянием образа жизни, экологии или
же плохой наследственностью. То есть рак лёгких
может чаще возникать из-за курения или, например, из-за того, что связанные с ним генетические
аномалии лучше закрепляются в поколениях, чем в
случае гемобластозов. Такая аргументация не объясняет до конца, почему в разных тканях злокачественные опухоли встречаются с разной вероятностью. Исследователи из Университета Джона Хопкинса (США) пришли к выводу, что, по-видимому,
главный фактор, определяющий вероятность возникновения рака – это число делений тканевых СК
[60]. Так, к двум известным факторам риска онкогенеза (компонентам внешней среды и врожденным
мутациям) был добавлен третий – ошибки, возникающие в результате репликации генома СК. Важно отметить, что он может быть главным и при существенном влиянии первых двух факторов риска.
Большинство обычных, дифференцированных клеток, составляющих основную массу ткани или органа, живут не слишком долго. Поэтому, даже если
они накопят много потенциально онкогенных муРОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
10
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ОСНОВНЫЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ СТВОЛОВОЙ КЛЕТКИ МЕЛАНОМЫ…
таций, клетки погибнут раньше, чем успеют спровоцировать рак. СК, напротив, живут долго, много
раз делятся и могут дать начало опухоли. Ткани
организма постоянно обновляются благодаря резерву собственных СК: у крови они одни, у кишечного эпителия – другие, у кожи – третьи и т.д. Скорость деления у них отличается, отличается и число
делений, которые СК претерпевает за свою жизнь.
Чем больше клеточных делений осуществилось в
популяции СК, тем больше вероятность того, что
онкогенная мутация сработает в её потомках. Так,
самые редкие опухоли возникают в костях головы,
таза и предплечья – действительно, СК здесь самые
неактивные. Чаще всего они делятся в базальном
слое эпителия (за счёт базального слоя происходит
обновление кожи), а также в слизистой толстой и
прямой кишки – и опухоли в этих тканях относятся
к самым распространённым. C. Tomaset и В.
Vogelstein отмечают, что 65 % отличий между разными тканями относительно вероятности возникновения рака связаны с тем, что в одних тканях СК
делятся чаще, чем в других, в оставшиеся 35 %
входит наследственность (наследственность практически не влияет на 2/3 форм рака), и, конечно же,
плохая экология и нездоровый образ жизни [61]. В
2006 году AACR ввела определение СКО, которая
определяется как клетка, способная к самообновлению и поддерживающая гетерогенные популяции в
опухоли («Cancer stem cell is a cell within a tumor
that possesses the capacity of self-renew and to cause
the heterogenous lineages of cancer cells that comprise
the tumor») [6].
Ниша стволовой клетки опухоли
Для нормального функционирования СК абсолютно необходимы сигналы из ближайшего окружения, в первую очередь, для определения идентичности клетки и ее судьбы. In vivo СК остается
стволовой только в соответствующем микроокружении (клетки-соседи, внеклеточный матрикс,
лимфа, кровь) или, что мы называем нишей – совокупность клеточных и молекулярных событий в
месте локализации СК [49]. Ниши СК создают
микроокружение и контролируют локальные процессы пролиферации и дифференцировки СК путем
интеграции сигналов, поступающих от соседних
клеток стромы, от организма и внешней среды.
Ниши создают систему сигналов и направляют
специфичность дифференцировки СК в участке повреждения или естественной убыли клеток. Именно
сюда мигрируют СК, здесь они активируются, пролиферируют и дифференцируются в клетки данной
ткани. За редким исключением СК не покидают своей ниши и иногда бывают физически связаны с ней
при участии молекул адгезии. СК, выделенные из
самых разных источников, в условиях культивирования in vitro легко пролиферируют и дифференцируются. Складывается впечатление, что именно так
они и запрограммированы, и только внешние сигналы, поступающие от ниши, держат их в «дремлющем» состоянии. По крайней мере, не исключена
возможность, что СКО может возникать из тканевых
№ 2/том 14/2015
СК, в случае если ниша за ними «не уследила» [23],
имея в виду ту роль, которую играет микроокружение для обычных СК в поддержании их в недифференцированном состоянии и в активации в ответ на
поступление сигнала о необходимости появления
новых клеток, предполагается, что подобного рода
локальные внешние сигналы распоряжаются и судьбой СКО [43].
Ведь именно общие свойства СК и ряда опухолевых клеток позволили сформулировать концепцию СКО. Подтверждением контроля нишей судьбы
СКО служат следующие эксперименты. Когда СКО
помещали в новую нишу, они не всегда инициировали опухоль. И напротив, если нормальные СК
трансплантировать в предварительно облученную
ткань, опухоль будет развиваться [18]. СКО будет
находиться под строгим контролем, осуществляемым нишей, до тех пор, пока не произойдут изменения в нише или возникнут мутации в СКО, вследствие которых утрачивается над ними контроль. Такие
клетки не могут более адаптироваться к нише и покидают ее, покидают для формирования отдаленных
метастазов. Становится понятным, что метастаз
инициирует не СКО - «родоначальница», а ее мутированный аналог [32; 39]. В 2009 C. Кlеin предложил
гипотезу параллельной прогрессии, когда процесс
метастазирования начинается на самых ранних стадиях возникновения опухоли, а не в результате длительного накопления онкогенных мутаций отдельными клеточными клонами в первичной опухоли
[27]. Показано, что злокачественная эпителиальная
клетка сразу после фазы инициации опухоли способна активировать «молчащие» эмбриональные
программы эпителиально-мезенхимального перехода, приобретать веретенообразную форму, дающую
ей преимущество в подвижности, повышать инвазивный потенциал, проникать в системный кровоток, достигать пре-метастатической ниши в тканях
отдаленного органа и формировать метастаз. Концепция ранней диссеминации позволяет объяснить
наличие метастазов в опухоли без выявленной первичной локализации и отдаленных метастазов при
ранних клинических стадиях рака (T 1-2 N 0 M 1 ).
Молекулярные детерминанты
стволовой клетки меланомы
Меланома, симптомы которой проявляются
у пациентов в любом возрасте – чрезвычайно злокачественная опухоль. Это уникальная опухоль,
поскольку ее можно легко обнаружить на поверхности кожи, но вместе с тем весьма коварная. Отличают две фазы роста меланомы: горизонтальную
и вертикальную [19; 47; 55].
 Горизонтальная фаза развития поверхностно-распространяющейся меланомы
может длиться до 7 лет. В горизонтальной стадии рост опухоли происходит за
счет проникновения клеток меланомы в
нижние слои эпидермиса (базальный и
шиповатый), где впоследствии они распространяются в горизонтальном направлении.
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ОСНОВНЫЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ СТВОЛОВОЙ КЛЕТКИ МЕЛАНОМЫ…
Вертикальная фаза роста проявляется
возвышением опухоли над поверхностью кожи и образованием в ней узлов.
Вертикальную фазу роста характеризует
проникновение клеток меланомы в поверхностные слои эпидермиса и инвазия
через базальную мембрану в дерму и
подкожную жировую клетчатку. Эту фазу развития характеризуют быстрый
рост и склонность к метастазированию.
Легко поддающаяся лечению на ранних стадиях заболевания, меланома становится резистентной к противоопухолевой терапии при переходе в
вертикальную фазу роста. Так, 5-летняя выживаемость отмечается в 97,9 % случаев, если толщина
опухоли <0,76 мм, и снижается до 57,5 %, когда
размеры опухоли >3 мм [2], и, хотя корреляция между толщиной опухоли и прогнозом течения болезни достаточно хорошо охарактеризована, фенотипическая характеристика клеток меланомы, участвующих в инициации опухоли, инвазии и формирования метастазов, еще только начинается.
Первое сообщение о существовании популяции СКМ появилось в 2005 году [12]. Авторы характеризовали такие клетки как не прикрепляющиеся к пластику и образующие сфероиды в процессе культивирования. После клонирования такие
клетки способны к самообновлению и дифференцировались в адипоциты, хондроциты, остеобласты
или меланоциты. Адгезивная фракция клеток из
той же культуры клеток меланомы представляла
собой веретено-подобный морфофенотип. Формирующие сфероиды клетки меланомы характеризовались высокой экспрессией СD20, известного как
маркер В-лимфоцитов, и именно эта популяция
клеток меланомы формировала опухоль у иммунодефицитных мышей.
Спустя два года появилось сообщение о получении из биопсийного материала больных меланомой популяции клеток меланомы СD133+ (маркер предшественников нейронов [37]). CD133 экспрессировали менее 1 % клеток меланомы, именно
они отличались большим онкогенным потенциалом
и при трансплантации NOD-SCID мышам инициировали опухоль. СD133+ клетки меланомы при длительном культивировании сохраняли экспрессию
этого маркера и проявляли способность к дифференцировке в клетки мезенхимального и нейронального ряда. СD133+ клетки также формировали
сфероиды in vitro и экспрессировали ангиогенные и
лимфангиогенные маркеры. Несколько позже были
получены статистически достоверные данные о
положительной корреляции экспрессии CD133 в
опухоли и прогрессии меланомы [46]. Совсем недавно появилась информация, что даун-регуляция
CD133 в таких клетках малыми интерферирующими РНК заметно снижалa рост ксенографта и способность к метастазированию [8].
В 2010 г. исследователи Стэнфордского университета из опухолевого материала больных диссеминированной меланомой получили популяцию
CD271+клеток меланомы, (рецептор NGF [4]). Да№ 2/том 14/2015
11
лее авторы трансплантировали CD271+ клетки меланомы иммунодефицитным мышам. Из пересаженных CD271+ клеток формировались полноценные меланомы, быстро растущие и быстро метастазирующие. Выделенные из экспериментальной
опухоли CD271+ клетки сохраняли свои свойства и
при трансплантации бестимусным мышам давали
начало другим меланомам. Интересно отметить,
что в CD271+ клетках меланомы была резко снижена экспрессия дифференцировочных антигенов
TYR, MART1 и MAGEC1/MAGEC2 (на 86; 69 и 68 %
соответственно [4]).
Несомненный интерес вызывают результаты
об участии АВС-транспортеров в функционировании СКМ. Белки семейства АТФ-зависимых АВСтранспортеров в норме защищают клетку от экзогенных и эндогенных токсинов, участвуют в транспорте АТФ, стероидов, полипептидов. Высокая
экспрессия АВС транспортеров в опухолевых клетках приводит к множественной лекарственной устойчивости, которая проявляется выбросом противоопухолевых лекарств из клетки, в результате чего
происходит уменьшение уровня лекарства в клетке,
необходимого для успешной терапии [24]. В лаборатории М. Frank из Бостона впервые показали, что
в культуре клеток, полученных из образцов опухолевого материала больных меланомой, часть клеток
несет на своей поверхности молекулы белка ABC
B5 [13]. Высокий уровень экспрессии АВС В5 был
характерен для клеток меланомы, полученных из
"толстой" опухоли. Аналогичная корреляция наблюдается в поведении клеток, полученных из метастазов, а не из первичной опухоли. Подтверждение способности АВС В5+ клеток инициировать
опухоль у бестимусных мышей было также получено в лаборатории М. Frank. Рост ксенографта
заметно уменьшался, если мышам с меланомой
вводили МКА к АВС В5 [13]. Таким образом, экспрессия АВС В5 на клетках меланомы служит еще
одним свидетельством их принадлежности к СКМ.
В обзорах об СКМ, опубликованных в последние 2-3 года, высказано предположение, что
популяция СКМ может быть гетерогенной и совсем
не обязательно, чтобы все клетки популяции СКМ
экспрессировали CD20, CD133, CD271 и АВС В5.
Может наблюдаться разное сочетание экспрессии
CD20, CD133, CD271 с экспрессией АВС В5 [29; 44].
Этот вывод наделяет популяцию СКМ уникальной
пластичностью и отличает СКМ от СК других опухолей. Так, все клетки популяции стволовой клетки
рака молочной железы экспрессируют CD44+/CD24–
или популяция стволовой клетки ММ состоит из
клеток, экспрессирующих CD34+/CD38–, и т.д.
«Золотым стандартом» СКО продолжает оставаться их способность инициировать опухоль
значительно меньшим количеством опухолевых
клеток. Предполагается, что в культуре клеток, полученной из опухолевого материала больных раком, свойствами СКО обладает менее 1 % клеток
новообразования. Это верно и для меланомы. Однако в последние годы появляются публикации о
том, что опухоль инициировали 10 или даже 25 %
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
12
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ОСНОВНЫЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ СТВОЛОВОЙ КЛЕТКИ МЕЛАНОМЫ…
клеток меланомы, полученных из опухолевого материала [25]. Согласно определению AACR, СКО –
популяция клеток, способных к самообновлению и
дифференцировке. В определении не указано, что
такой способностью во всех злокачественных новообразованиях должна обладать небольшая часть
клеток. Высокий процент клеток, инициирующих
экспериментальную меланому, говорит, скорее, о
чрезвычайной злокачественности этой опухоли,
чем представляет исключение из правила.
Васкулогенная мимикрия –
другая функция СК меланомы?
Образование васкулярных каналов, ограниченных базальной мембраной, агрессивными опухолевыми клетками в отсутствие эндотелиальных клеток и фибробластов получило название ВМ. Рисунок
васкулярной сети, сформулированной опухолевыми
клетками, имитирует примитивную микроциркуляцию (honey-comb-like network) эмбриона [34].
На гистологических срезах ВМ представлена
каналами между опухолевыми клетками, содержащими эритроциты и плазму. Эти каналы окрашиваются реактивом Шиффа – Periodic acid Schiff –в
малиновый цвет (PAS+ структуры) и представляют
собой микроциркуляторное русло в опухоли. Предполагается, что опухоль для выживания и прогрессии может индуцировать частичную трансдифференцировку опухолевых клеток в эндотелийподобный фенотип, позволяющий формировать
васкулярные каналы, необходимые для доставки
питания и, возможно, метастазирования. Формирование сети каналов внутри опухоли может поддерживать гомеостаз и предотвратить ранний некроз
внутри опухоли. ВМ присутствует практически во
всех злокачественных новообразованиях. Ее наличие коррелирует с риском метастазирования и плохим клиническим прогнозом [41]. Интересно отметить, что, хотя опухолевые клетки, способные формировать каналы ВМ, экспрессируют гены, участвующие в ангиогенезе опухоли, ингибиторы ангиогенеза не блокируют формирование васкулярных
каналов в опухоли [63].
Два независимых наблюдения привели нас к
обсуждению вопроса об участии СКМ в ВМ.
Первое. Окраска гистологических срезов
пимонидазолом (маркер гипоксии), показала, что
микроокружение каналов ВМ в опухоли характеризуется глубокой гипоксией [57]. Гипоксия, как известно, – один из важных параметров, необходимых для поддержания недифференцированного
статуса СК.
Второе. Анализ экспрессии генов с использованием ДНК-микрочипов показал, что клетки
агрессивной меланомы, способные формировать
васкулярные каналы, экспрессируют гены, характерные для поддержания полипотентного, эмбриональноподобного фенотипа, например, Nodal, Notch
и Wnt [20].
С другой стороны, экспрессия меланоцитспецифических антигенов, таких как Melan-A,
MIFT, TYR и TYRP1, снижена в 22; 34; 37 и 100 раз
№ 2/том 14/2015
в клетках меланомы, способных формировать васкулярные каналы [58]. Таким образом, сходство
между СКМ и клетками меланомы, способными к
вовлечению в ВМ по маркерам и сигнальным путям, позволяет предположить, что СКМ должна
участвовать в формировании васкулярных каналов.
На сегодняшний день мы смогли найти только одну
публикацию об участии АВС В5+ клеток меланомы
в формировании васкулярных каналов в меланоме
[38]. Если эта гипотеза будет подтверждена и в
других работах, можно будет говорить о новом пути терапии диссеминированной меланомы.
ВМ представлена неодинаково в разных типах опухолей. Так, в меланоме 60-62 % кровоснабжения осуществляется через каналы ВМ; при тройном негативном раке молочной железы – 50 %, при
раке почки – 38-40 %, при саркоме мягких тканей –
35-37 %; при раке яичника 15-18 %; при раке толстой кишки – 10-12 % (наши неопубликованные
данные). На фоне крайнего несовершенства циркуляции крови в опухоли каналы ВМ в количестве 1012 % вряд ли что-то изменят, однако 60-62 % явно
могут иметь существенное значение. В 2013 году
FDA одобрила использование бевацизумаба для
лечения метастатической меланомы и HER-2/Neu–
метастатического РМЖ. Привлекает внимание тот
факт, что именно бевацизумаб – МКА к VEGF –
был рекомендован в качестве антиангиогенного
препарата, а не низкомолекулярные ингибиторы
тирозинкиназного домена VEGFR2, число которых
в клинике приближается к ста. Хотя в рекомендации не упоминается о возможном влиянии бевацизумаба на ВМ, мы предполагаем, что положительная динамика, наблюдаемая в процессе лечения
бевацизумабом метастатической меланомы и HER2/Neu– метастатического РМЖ – опухолей, 50-60 %
васкуляризации которых осуществляется через каналы ВМ – по крайней мере, частично связана с
блокированием ВМ: ВМ также как и ангиогенез
опухоли, находится под контролем VEGF [65], но
не зависит от низкомолекулярных ингибиторов
ангиогенеза.
Отсутствие тенденции к снижению смертности от онкологических заболеваний требует разработки новых высокоэффективных мишеней в опухолевых клетках. Интересным представляется подход, при котором, используя метод блокирования
ВМ, можно будет уменьшить рост опухоли и формирование отдаленных метастазов.
Как СК меланомы уходит
от иммунного надзора?
В клетках организма постоянно накапливаются мутации, которые отслеживаются системами
контроля. Накопление в клетке некоторого критического количества мутаций, затрагивающих гены
«стабильности», может привести к возникновению
опухолевой клетки. В большинстве случаев иммунная система выявляет и уничтожает такие клетки,
но злокачественные новообразования, тем не менее, появляются и, появившись, не регрессируют
под действием иммунной системы.
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ОСНОВНЫЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ СТВОЛОВОЙ КЛЕТКИ МЕЛАНОМЫ…
Одной из главных причин ускользания опухоли от иммунологического надзора является отсутствие распознавания Т-лимфоцитами опухолевых клеток [30]. Данные о коммуникации СКМ с
клетками иммунной системы появились совсем
недавно. Показано, что одним из механизмов ухода
СКМ от иммунного надзора может служить низкая
экспрессия MART-1 – меланоцит-специфического
антигена, который и узнают Т-клетки [51]. Аналогичная корреляция наблюдается и с экспрессией
генов NY-ESO-1, MAGE-1 в клетках меланомы, положительных по АВС В5 [4]. В образцах опухоли,
положительных по CD271, снижена экспрессия
TYR, MART-1 и MAGE (С1-С2) [12]. Эти данные
могут частично объяснить неэффективность CD8+
опухоль-реактивных Т-лимфоцитов в противоопухолевом ответе.
Другим механизмом, посредством которого
СКМ уходит от надзора иммунной системы, являются изменения в экспрессии белков MHC Class 1.
В норме эти белки присутствуют на поверхности
всех клеток и представляют антигены CD8+ Тлимфоцитам для активации адоптивного иммунного ответа [26]. Недавно показано, что в АВС В5+
клетках меланомы резко снижена экспрессия MHC
Class 1 [64]. Понятно, что в отсутствие MHC Class 1
адоптивная иммунная система не может быть активирована, и опухоль будет прогрессировать.
Третьим возможным вариантом ухода от
иммунного ответа может служить ингибирование в
СКМ продукции IL-2, который является необходимым цитокином для активации и пролиферации Тклеток [52]. Эффективность использования цитокинов при лечении злокачественной меланомы сегодня не вызывает сомнений. Становится очевидным, что прогрессирующая опухоль вызывает серьезные изменения в иммунном ответе, с которыми
самостоятельно иммунная система справляться не
может. Накопившиеся сведения о взаимоотношении СКМ и иммунной системы указываю: при разработке подходов к иммунотерапии меланомы
коммуникация СКМ с иммунной системой должна
учитываться.
Терапия, направленная
на СК меланомы
Исследования последних лет привели нас к
осознанию факта, что за развитие злокачественного
процесса отвечает лишь крайне небольшое число
СКО, способных давать начало опухолевому процессу, непрерывно пополняя популяцию клеток
опухоли и регенерируя ее после удаления или разрушения большинства ее клеток. И хотя СКО в
опухоли крайне мало, они представляют собой основную проблему с клинической точки зрения. В
отличие от более дифференцированных клеток основной опухолевой массы, СКО характеризуются
чрезвычайной терапевтической устойчивостью,
которая в ответ на лечение только возрастает. Не
уничтожив эту самую важную часть опухолевых
клеток, мы не можем обсуждать возможности регрессии опухоли. Несмотря на то, что терапия, на№ 2/том 14/2015
13
правленная на СКО, только начинает развиваться,
опубликован уже ряд работ с обнадеживающими
результатами. Так было показано, что использование МКА к АВС В5 или нокдаун этого гена посредством малых интерферирующих РНК приводит к
ингибированию роста опухоли в экспериментальной модели меланомы [10]. Более того, оба варианта лечения восстанавливали чувствительность опухоли к доксорубицину и 5-фторурацилу, siRNAнокдаун CD133 в экспериментальной опухоли также заметно снижал рост опухоли и способность к
метастазированию [8].
На сегодняшний день мы слишком мало знаем о сигнальных путях, которые поддерживают
жизнеспособность СКМ. Для СКО характерна активная экспрессия таких сигнальных молекул, которые участвуют в поддержании и дифференцировке эмбриональных СК, например, Nodal, Notch и
Wnt [36; 62]. Известно, что высокая экспрессия
Nodal необходима для поддержания дедифференцированного статуса клетки, в то время как низкий
уровень этой сигнальной молекулы ассоциируется
с активацией дифференцировки. Недавно было показано, что экспрессия Nodal повышена в клетках
метастатической меланомы [33]. Ингибирование
Nodal приводило к реверсии клеток меланомы в
меланоциты.
Другой сигнальной системой, конститутивно
активной в СК, является TGFβ/activin–путь. Активация ВМР-4 – белка, участвующего в дифференцировке эмбриона на ранних стадиях – гаструляции
и формирования мезодермы – находится под контролем TGFβ/activin–сигнального пути [69]. Об
участии этого белка в прогрессии опухоли заговорили совсем недавно, когда ВМР-4 был идентифицирован как важный медиатор инвазии и метастазирования [21]. Недавно показано, что экспрессия
ВМР-4 в клетках меланомы, положительных по
CD133, значительно активирована по сравнению с
клетками меланомы, отрицательными по этому
маркеру [50]. Вызывает интерес тот факт, что и
Nodal, и ВМР-4 не только поддерживают полипотентность СК, но и участвуют в формировании васкулярных каналов опухолевыми клетками [11; 48].
На сегодняшний день не известно ни одного физиологического процесса – аналога ВМ – у взрослых или детей. Единственным примером ВМ,
встречающимся у человека, является формирование
цитотрофобластами васкулярных каналов в ходе
эмбриогенеза в плаценте. Этот факт открывает новые возможности блокирования роста опухоли с
минимальным эффектом на нормальные физиологические процессы. Как отмечено ранее, ингибиторы ангиогенеза не влияют ни на формирование, ни
на разборку васкулярных каналов, сформированных опухолевыми клетками, и сегодня нечувствительность опухолей многих типов к антиангиогенной терапии объясняют появлением в опухоли васкулярной сети, сформированной ОК [67]. Обнадеживающей звучит идея достижения стабильного
ответа на лечение больных метастатической меланомой посредством блокирования ВМ.
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
14
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ОСНОВНЫЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ СТВОЛОВОЙ КЛЕТКИ МЕЛАНОМЫ…
Воздействовать на ВМ можно тремя путями:
1. снизить пластичность ОК;
2. воздействовать ни микроокружение ОК;
3. блокировать сигнальные пути, вовлекаемые в этот процесс.
В пользу жизнеспособности такого подхода
косвенно указывают данные, опубликованные недавно. В АВС В5+ клетках меланомы экспрессия
VEGFR1 была активирована значительно [14].
Недавно нами показано, что нокдаун гена
VEGFR1 приводил к снижению роста экспериментальной опухоли и уменьшению числа метастазов в
легкие [66].
Заключение
Меланома считается самой агрессивной опухолью кожи. Она быстро растет и быстро метастазирует. Теперь, когда мы приблизились к пониманию
истинного происхождения меланомы, борьба с ней
представляется крайне труднореализуемой. Эффективность существующей терапии оценивается способностью уменьшить размер опухоли. Но даже если
мы отмечаем полную регрессию опухоли, всегда
остается возможность ее повторного роста, потому
что лечение было направлено на удаление основной
популяции опухолевых клеток, а не СКМ.
Оптимистично звучит идея изменения диалога между СКМ и ее микроокружением. Таким
путем СКМ лишатся условий, обеспечивающих их
неуязвимость. Но мы не знаем, как устроены тканевые ниши для СКМ, и отличаются ли они от ниш
нормальных СК.
Как блокировать пролиферацию СКМ, не
вовлекая в пролиферацию нормальную СК? Возможно, удастся создать препараты, которые заставят СКМ интенсивно дифференцироваться и тем
самым лишат их способности к самообновлению?
Но мы по-прежнему не знаем самого главного, распределена ли популяция СКМ равномерно в
опухоли или локализована в каком-то определенном участке?
Одно из основных и кардинальных отличий
меланомы от других типов злокачественных опухолей состоит в ее высокой иммуногенности. Но иммуногена ли СКМ? Как обучить клетки иммунной
системы, чтобы они распознавали и уничтожали
именно СКМ?
Имеющиеся на сегодняшний день знания не
позволяют идентифицировать иммуногенные опухолевые антигены СКМ, отличные от антигенов
нормальной СК. Почему иммунная система позволяет, чтобы меланома появлялась и развивалась до
размеров, угрожающих жизни больного?
Литература
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
Abdullah L.N., Chow E.K. Mechanisms of chemoresistance in cancer stem cells // Clin. Transl. Med. – 2013. –
17. – P. 3–14.
Barnhill R.L., Fine J.A., Roush GC. et al. Predicting five-year outcome for patients with cutaneous melanoma
in a population-based study // Cancer. – 1996. – 78. – P. 427–32.
Becker M.W., Jordan C.T. Leukemia stem cells in 2010: current understanding and future directions // Blood
Rev. – 2011. – 25(2). – P. 75–81.
Boiko A.D., Razorenova O.V., van de Rijn M. et al. Human melanoma-initiating cells express neural crest
nerve growth factor receptor CD271 // Nature. – 2010. – 466. – P. 133–7.
Bu Y., Cao D. The origin of cancer stem cells // Front Biosci. – 2012. – 4. – P. 819–30.
Clarke M.F., Dick J.E., Dirks P.B. et al. Cancer stem cells – perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells // Cancer Res. – 2006. – 66. – P. 9339–44.
Dirks P. Cancer stem cells: invitation to a second round // Nature. – 2010. – 466. – P. 40–1.
Dou J., He X., Liu Y. et al. Effect of downregulation of ZEB1 on vimentin expression, tumour migration and
tumourigenicity of melanoma B16F10 cells and CSCs // Cell Biol. Int. – 2014. – 38(4). – P. 452–61.
Eaves C.J. Cancer stem cells: here, there, everywhere? // Nature. – 2008. – 456. – P. 581–3.
Elliott A.M., Al-Hajj M.A. ABCB8 mediates doxorubicin resistance in melanoma cells by protecting the mitochondrial genome // Mol. Cancer Res. – 2009. – 7. – P. 79–87.
Fan T.Z., Sun W. Molecular regulation of vasculogenic mimicry in tumors and potential tumor-target therapy //
World J. Gastrointest. Surg. – 2010. – 2. – P. 117–27.
Fang D., Nguyen T.K., Leishear K. et al. A tumorigenic subpopulation with stem cell properties in melanomas
// Cancer Res. – 2005. – 65. – P. 9328–37.
Frank N.Y., Margaryan A., Huang Y. et al. ABCB5-mediated doxorubicin transport and chemoresistance in
human malignant melanoma // Cancer Res. – 2005. – 65. – P. 4320–33.
Frank N.Y., Schatton T., Kim S. et al. VEGFR-1 expressed by malignant melanoma initiating cells is required
for tumor growth // Cancer Res. – 2011. – 71. – P. 1474–85.
Fukuda S., Pelus L.M. Survivin, a cancer target with an emerging role in normal adult tissues // Mol. Cancer
Ther. – 2006. – 5(5). – P. 1087–98.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ОСНОВНЫЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ СТВОЛОВОЙ КЛЕТКИ МЕЛАНОМЫ…
15
16. Fulawka L., Donizy P., Halon A. Cancer stem cells – the current status of an old concept: literature review and
clinical approaches // Biol. Res. – 2014. – 47(1). – P. 66–75.
17. Greene J.M., Levy D., Fung K.L. et al. Modeling intrinsic heterogeneity and growth of cancer cells //J. Theor.
Biol. – 2015. – 367. – P. 262–77.
18. Gupta T., Nair V., Jalali R. Stem cell niche irradiation in glioblastoma: providing a ray of hope? // CNS Oncol.
– 2014. – 3(5). – P. 367–76.
19. Hsu M.Y., Meier F., Herlyn M. Melanoma development and progression: a conspiracy between tumor and host
// Differentiation. – 2002. – 70. – P. 522–36.
20. http://www.nhgri.nih.gov/DIR/microarray/MelanomaSupplement/index.html.
21. Kallioniemi A. Bone morphogenetic protein 4-a fascinating regulator of cancer cell behavior // Cancer Genet. –
2012. – 205(6). – P. 267–77.
22. Kartal-Yandim M., Adan-Gokbulut A., Baran Y. Molecular mechanisms of drug resistance and its reversal in
cancer // Cri.t Rev. Biotechnol. – 2015. – 1. – P. 11–8.
23. Kasai T., Chen L., Mizutani A. et al. Cancer stem cells converted from pluripotent stem cells and the cancerous
niche // J Stem Cells Regen Med. – 2014. – 10(1). – P. 2–7.
24. Kathawala R.J., Gupta P., Ashby C.R. et al. The modulation of ABC transporter-mediated multidrug resistance
in cancer: a review of the past decade // Drug Resist Updat. – 2015. – 18. – P. 1–17.
25. Kelly P.N., Dakic A., Adams J.M. et al. Tumor growth need not be driven by rare cancer stem cells // Science.
– 2007. – 317. – P. 337–45.
26. Khong H.T., Wang Q.J., Rosenberg S.A. Identification of multiple antigens recognized by tumor-infiltrating
lymphocytes from a single patient: tumor escape by antigen loss and loss of MHC expression //J. Immunother.
– 2004. – 27. – P. 184–90.
27. Klein C.A. Parallel progression of primary tumours and metastases //Nat. Rev. Cancer. – 2009 – 9(4). – P. 302–12.
28. Kreso A., Dick J.E. Evolution of the cancer stem cell model //Cell Stem Cell. – 2014. – 14(3). – P. 275–91.
29. Lang D., Mascarenhas J.B., Shea C.R. Melanocytes, melanocyte stem cells, and melanoma stem cells // Clin.
Dermatol. – 2013. – 31(2). – P. 166–78.
30. Lee P.P., Yee C., Savage P.A. et al. Characterization of circulating T cells specific for tumor-associated antigens in melanoma patients//Nat. Med. – 1999. – 5. – P. 677–85.
31. Li A. The biology of melanocyte and melanocyte stem cell // Acta Biochim. Biophys. Sin. – 2014. – 46(4). – P.
255–60.
32. Liao W.T., Ye Y.P., Deng Y.J. et al. Metastatic cancer stem cells: from the concept to therapeutics // Am. J.
Stem. Cells. – 2014. – 3(2). – P. 46–62.
33. Lucero O.M., Dawson D.W., Moon R.T. et al. Are-evaluation of the "oncogenic" nature of Wnt/beta-catenin
signaling in melanoma and other cancers//Curr. Oncol. Rep. – 2010. – 12(5). – P. 314–8.
34. Maniotis A.J., Folberg R., Hess A. et al. Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in
vitro: vasculogenic mimicry // Am. J. Pathol. – 1999. – 155(3). – P. 739–52.
35. Martello G., Smith A. The nature of embryonic stem cells // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. – 2014. – 30. – P. 647–75.
36. McAllister J.C., Zhan Q., Weishaupt C. et al. The embryonic morphogen, Nodal, is associated with channellike structures in human malignant melanoma xenografts //J. Cutan. Pathol. – 2010. – 37(Suppl 1). – P. 19–25.
37. Monzani E., Facchetti F., Galmozzi E. et al. Melanoma contains CD133 and ABCG2 positive cells with enhanced tumourigenic potential // Eur. J. Cancer. – 2007. – 43. – P. 935–46.
38. Monzani E., La Porta C.A. Targeting cancer stem cells to modulate alternative vascularization mechanism //
Stem. Cell Rev. – 2008. – 4. – P. 51–6.
39. Nguyen D.X., Bos P.D., Massagué J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization //Nat. Rev.
Cancer. – 2009. – 9(4). – P. 274–84.
40. Nowel P.C. The clonal evolution of tumor cell population // Science. – 1976. – 194. – P. 23–8.
41. Paulis Y.W., Soetekouw P.M., Verheul H.M. et al. Signalling pathways in vasculogenic mimicry // Biochim
Biophys Acta. – 2010. – 1806(1). – P. 18–28.
42. Pawelek J.M. Fusion of bone marrow-derived cells with cancer cells: metastasis as a secondary disease in cancer // Chin. J. Cancer. – 2014. – 33(3). – P. 133–9.
43. Plaks V., Kong N., Werb Z. The Cancer Stem Cell Niche: How Essential Is the Niche in Regulating Stemness
of Tumor Cells? // Cell Stem Cell. – 2015. – 16(3). – P. 225–38.
44. Quintana E., Shackleton M., Foster H.R. et al. Phenotypic heterogeneity among tumorigenic melanoma cells
from patients that is reversible and not hierarchically organized //Cancer Cell. – 2010. – 18. – P. 510–23.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
16
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ОСНОВНЫЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ СТВОЛОВОЙ КЛЕТКИ МЕЛАНОМЫ…
45. Ramalho-Santos M., Willenbring H. On the origin of the term ‘stem cell’//Cell Stem Cell. – 2007. – 1. – P. 35–8.
46. Rappa G., Fodstad O., Lorico A. The stem cell-associated antigen CD133 (Prominin-1) is a molecular therapeutic target for metastatic melanoma //Stem Cells. – 2008. – 26. – P. 3008–17.
47. Regad T. Molecular and cellular pathogenesis of melanoma initiation and progression //Cell Mol Life Sci. –
2013. – 70(21). – P. 4055–65.
48. Rothhammer T., Bataille F., Spruss T. et al. Functional implication of BMP4 expression on angiogenesis in
malignant melanoma //Oncogene. – 2007. – 26. – P. 4158–70.
49. Scadden D.T. Nice neighborhood: emerging concepts of the stem cell niche // Cell. – 2014. – 157(1). – P. 41
50. Schatton T., Murphy G.F., Frank N.Y. et al. Identification of cells initiating human melanomas //Nature. –
2008. – 451. – P. 345–9.
51. Schatton T., Frank M.H. Antitumor immunity and cancer stem cells // Ann NY Acad Sci. – 2009. – 1176. – P.
154–69.
52. Schatton T., Schutte U., Frank N.Y. et al. Modulation of T-cell activation by malignant melanoma initiating
cells //Cancer Res. – 2010. – 70. – P. 697–708.
53. Sebastian C. Tracking down the origin of cancer: metabolic reprogramming as a driver of stemness and tumorigenesis // Crit. Rev. Oncog. – 2014. – 19(5). – P. 363–82.
54. Shiozawa Y., Nie B., Pienta K.J. et al. Cancer stem cells and their role in metastasis // Pharmacol Ther. – 2013.
– 138(2). – P. 285–93.
55. Situm M., Buljan M., Kolić M. et al. Melanoma--clinical, dermatoscopical, and histopathological morphological characteristics //Acta Dermatovenerol Croat. – 2014. – 1. – P. 1–12.
56. Skvortsov S., Debbage P, Lukas P, Skvortsova I. Crosstalk between DNA repair and cancer stem cell (CSC)
associated intracellular pathways // Semin. Cancer Biol. – 2015. – 31. – P. 36–42.
57. Sun B., Zhang D., Zhan S. et al. Hypoxia influences vasculogenic mimicry channel formation and tumor invasion-related protein expression in melanoma // Cancer. – 2007. – 249. – P. 188–97.
58. Takeuchi H., Kuo C., Morton D.L. et al. Expression of differentiation melanoma-associated antigen genes is
associated with favorable disease outcome in advanced-stage melanomas // Cancer Res. – 2003. – 63. – P.
441–48.
59. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S. et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts
// Science. – 1998. – 282. – P. 1145–7.
60. Tomasetti C., Vogelstein B., Parmigiani G. Half or more of the somatic mutations in cancers of self-renewing
tissues originate prior to tumor initiation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2013. – 110(6). – P. 1999–2004.
61. Tomasetti C., Vogelstein B. Cancer etiology. Variation in cancer risk among tissues can be explained by the
number of stem cell divisions // Science. –2015. – 347(6217). – P. 78–81.
62. Topczewska J.M., Postovit L.M., Margaryan N.V. et al. Embryonic and tumorigenic pathways converge via
Nodal signaling: role in melanoma aggressiveness // Nat. Med. – 2006. – 12. – P. 925–32.
63. Van der Schaft D.W., Seftor, R., Seftor E.A. et al. Effect of angiogenesis inhibitors on vascular network formation by human endothelial and melanoma cells // J. Natl. Cancer Inst. – 2004. – 96. – P. 1473–77.
64. van Houdt I.S., Sluijter B.J., Moesbergen L.M. et al. Favorable outcome in clinically stage II melanoma patients is associated with the presence of activated tumor infiltrating T-lymphocytes and preserved MHC class I
antigen expression // Int. J. Cancer. – 2008. – 123. – P. 609–15.
65. Vartanian A.A., Burova O.S., Stepanova E.V. et al. The involvement of apoptosis in melanoma vasculogenic
mimicry//Melanoma Res. – 2007. – 1. – P. 1–8.
66. Vartanian A., Stepanova E., Grigorieva I. et al. VEGFR1 and PKCα signaling control melanoma vasculogenic
mimicry in a VEGFR2 kinase-independent manner // Melanoma Res. – 2011. – 21(2). – P. 91–8.
67. Vartanian A., Gatsina G., Grigorieva I. et al. The involvement of Notch signaling in melanoma vasculogenic
mimicry // Clin. Exp. Med. – 2013. – 13(3). – P. 201–9.
68. Wang K., Zhang T., Dong Q. et al. Redox homeostasis: the linchpin in stem cell self-renewal and differentiation // Cell Death Dis. – 2013. – 4. – e537-e346.
69. Watabe T., Miyazono K. Roles of TGF-beta family signaling in stem cell renewal and differentiation // Cell
Res. – 2009. – 19(1). – 103–15.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
МЕХАНИЗМЫ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ МЕЛАНОМЫ
17
УДК 616-006.81-033.2:615.2/.3.03:616-091.818
М.А. Барышникова, Д.А. Афанасьева, И.В. Уласов, А.Ю. Барышников
МЕХАНИЗМЫ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ МЕЛАНОМЫ
ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина», Москва
Контактная информация
Афанасьева Дарья Андреевна, аспирант лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей
НИИ ЭДиТО
адрес: 115478, Москва, Каширское ш., 24; тел. +7(499)324-10-65
e-mail: [email protected]
Статья поступила 12.03.2015, принята к печати 27.04.2015.
Резюме
Метастатическая меланома – агрессивная форма рака кожи, плохо поддающаяся химиотерапии из-за быстрого развития устойчивости к противоопухолевым химиопрепаратам. В обзоре рассмотрены разные механизмы развития резистентности меланомы и существующие подходы к ее преодолению.
Ключевые слова: меланома, лекарственная устойчивость, АВС-транспортеры, клеточная гибель.
M.A. Baryshnikova, D.A. Afanasieva, I.V. Ulasov, A.Yu. Baryshnikov
MECHANISMS OF MELANOMA DRUG RESISTANCE
FSBSI «N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center», Moscow
Abstract
Metastatic melanoma is an aggressive skin cancer, which resistant to antitumor drugs. This review describes the
different mechanisms of melanoma resistance and approaches to overcoming it.
Key words: melanoma, drug resistance, ABC-transporters, cell death.
Введение
Метастатическая меланома – наиболее агрессивная форма рака кожи, рост заболеваемости
которым отмечается в последние десятилетия. Для
лечения первичной локализованной меланомы без
признаков метастазирования обычно применяют
хирургическое удаление опухоли, и в этом случае
прогноз благоприятный. Однако, к сожалению, метастатическая меланома высокорезистентна к традиционным лучевой и химиотерапии и обладает
плохим прогнозом с медианой выживаемости 7–9
мес и 5-летней выживаемостью 5,5%.
Для лечения метастатической меланомы используют химиотерапевтические препараты, относящиеся к группе алкилирующих агентов: производные триазина (дакарбазин и темозоломид); производные нитрозомочевины (фотемустин); комплексные соединения платины (цисплатин), применяемые как по отдельности, так и в комбинациях.
Однако все они имеют ограниченную активность со
сравнительно низким уровнем ответа (<25% для
каждого препарата), слабо влияют на ОВ вследствие развития устойчивости к ним. Даже в случае
применения новых многообещающих таргетных
препаратов, таких как вемурафениб, меланома приобретает к ним резистентность [37].
В опухолевых клетках в ответ на действие
№ 2/том 14/2015
даже одного цитостатического агента может развиваться МЛУ к большому количеству других препаратов, еще не воздействовавших на опухоль, различающихся по структуре и механизмам действия [1].
МЛУ, главным образом, обусловлена работой
АВС-транспортеров, которые являются помповыми
белками, осуществляющим выброс цитостатических препаратов из опухолевой клетки.
Белки-транспортеры семейства ABC
Семейство белков АВС-транспортеров весьма многочисленное, включает в себя 7 подсемейств: ABCA, ABCB, ABCC, ABCD, ABCE, ABCF
и ABCG. АВС-транспортеры обладают функцией
насосов и выбрасывают из клеток с затратой энергии АТФ разнообразные вещества.
Наиболее хорошо изученные белки этого семейства, ассоциированные с МЛУ: ABCB1 (также
называется MDR-1, pgp-170, CD243), ABCC1
(MRP-1), ABCG2 (BCRP) [2; 21].
Вовлечение АВС-транспортеров в развитие
МЛУ меланомы активно изучалось долгие годы,
длительно продолжались дискуссии относительно
преобладания в развитии резистентности того или
иного белка. В исследовании W. Berger et al. [8]
мРНК MRP-1 и экспрессии этого белка на 40 клеточных линиях меланомы показали, что чувствительность к большому числу химиопрепаратов обРОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
18
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
МЕХАНИЗМЫ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ МЕЛАНОМЫ
ратно коррелирует с экспрессией MPR-1. Анализ
экспрессии мРНК MRP-1 и MDR-1 в 18 образцах
опухолей, полученных от пациентов с меланомой,
показал в большинстве опухолей до лечения экспрессию MRP-1, которая возрастала после химиотерапии. Однако мРНК MDR-1 не удалось детектировать ни в одном из образцов. Похожие результаты получили D. Schadendorf et al.: 43 % первичных
и метастатических меланом экспрессировали MRP1, тогда как MDR-1 детектировали только в одной
первичной опухоли [31]. Авторы предположили,
что природа МЛУ клеток меланомы вряд ли связана с MDR-1/Pgp. В противоположность этим результатам, A. Molinari et al. при изучении культуры
клеток меланомы человека М14 обнаружили наличие MDR-1, а не MRP-1 [28]. В дальнейшем этой
же группой ученых было проведено сравнение субклонов меланомы М14 (устойчивой к химиотерапии (MDR1+) и чувствительной (MDR1–). Показано,
что MDR1/Pgp связан с МАРК-сигнальным путем и
вовлечен в миграцию и метастазирование меланомы [12]. N. Walsh et al. провели ретроспективное
исследование экспрессии белков-транспортеров
MDR-1 и MRP-1 у 134 больных меланомой, включая 92 пациентов с первичной опухолью и 42 – с
метастатической, и обнаружили, что чаще при меланоме эксперссирован MRP-1, но, в отличие от
результатов D. Schadendorf et al., эта группа исследователей обнаружила значительно более высокий
процент MRP-1 при метастатической меланоме по
сравнению с первичными опухолями [38]. Также
экспрессия MDR-1/Pgp была обнаружена более,
чем в половине исследованных образцов.
Таким образом, экспрессия MDR-1 и MRP-1
часто встречается при меланоме, особенно метастатической, и участвует в развитии лекарственной
устойчивости и неизлечимости меланомы. Соответственно, ингибирование этих белков-транспортеров может быть важным этапом в преодолении
МЛУ меланомы.
Большой интерес вызывает субпопуляция
опухолевых клеток меланомы, экспрессирующая
белок-транспортер АВСВ5. Эти клетки обладают
повышенной туморогенностью и свойствами стволовости [32]. Белок АВСВ5 на 73% гомологичен
АВСВ1 (MDR1), впервые был детектирован в тканях нейроэктодермального происхождения, в частности, в предшественниках меланоцитов, в клеточных линиях меланомы и образцах опухолей, полученных от пациентов. Экспрессия АВСВ5 также
обнаружена в ограниченных субпопуляциях клеток
гепатокарциномы и колоректального рака. АВСВ5+
клетки меланомы обладают свойствами самообновления и дифференцировки. Увеличение их количества в образцах опухолей больных меланомой положительно коррелирует с прогрессией новообразования, подтверждая, что экспрессия АВСВ5 связана с агрессивностью заболевания. Более того, в
исследовании, проведенном T. Schatton et al., лечили мышей с ксенографтами меланомы моноклональными антителами АВСВ5, и рост опухоли приостанавливался [32]. Как член семейства АВС№ 2/том 14/2015
транспортеров, АВСВ5 принимает участие в развитии резистентности за счет повышенного выброса
лекарственных препаратов [15]. Это было показано
в экспериментах при измерении внутриклеточного
накопления родамина 123 и доксорубицина в клетках меланомы [18; 19].
M. Chartrain et al. исследовали влияние препаратов, применяемых для лечения меланомы, на
АВСВ5-экспрессирующие клетки [9]. На модели
ксенографта меланомы WM266-4 in vivo они показали, что после терапии темозоломидом происходила значительная регрессия опухоли, однако выжившие клетки оказались АВСВ5+. Эти результаты
далее были подтверждены в исследовании, проведенном на образцах опухолей пациентов, получавших дакарбазин – эталонный препарат для лечения
метастатической меланомы. Аналогичные результаты были получены при лечении вемурафенибом,
ингибитором мутированной киназы V600E BRAF, и
рядом
других
химиопрепаратов.
АВСВ5положительные клетки оставались живы при цитотоксических для других популяций клеток концентрациях лекарств. Доказано, что антимеланомная
терапия способствует приобретению химиорезистентности путем отбора субпопуляций опухолевых клеток, экспрессирующих АВСВ5. Эти данные
важны для понимания природы рецидивов меланомы, наблюдаемых после лечения. Мониторинг
АВСВ5 можно использовать для оценки эффективности терапии. Также АВСВ5 может быть потенциальной мишенью при лечении меланомы [9].
Y. Luo et al. описали побочную популяцию
клеток меланомы, которая гиперэкспрессировала
АВСВ1 и АВСВ5, а также выбрасывала флуоресцентный краситель Хёхст и противоопухолевые
препараты [26]. Подобные побочные популяции
встречаются в гемопоэтических СК и химиорезистентных клетках некоторых сóлидных опухолей,
однако впервые были выделены из клеток меланомы человека [22]. Обнаружили, что побочная популяция клеток меланомы, полученная из клинических образцов, была резистентна к паклитакселу,
субстрату АВСВ1, in vitro и in vivo. Однако эти
клетки были также устойчивы к темозоломиду, который не является субстратом АВС-транспортеров.
Резистентность к темозоломиду обеспечивалась
через усиление способности к восстановлению
ДНК и повышение экспрессии IL-8 [26]. Генетические исследования идентифицировали 3 сигнальных пути (NFκB, α6-β4-интегрин и IL-1), которые
были активны в побочной популяции клеток меланомы. Y. Luo et al. полагают, что эта АВСВ1– и
АВСВ5+ побочная популяция является источником
резистентных клеток в меланомах, и что обнаруженные гены активных сигнальных путей могут
быть потенциальной мишенью для эффективной
терапии меланомы [26].
Меланосомы
Помимо общих для разных видов рака механизмов лекарственной устойчивости, меланома
имеет свои специфические механизмы. Клетки меРОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
МЕХАНИЗМЫ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ МЕЛАНОМЫ
ланомы имеют везикулы, образующие меланин –
меланосомы, которые вовлечены в захват и выброс
клеткой лекарственных препаратов. К развитию
МЛУ меланомы может приводить внутриклеточная
секвестрация цитотоксических препаратов. Chen
K.G. et al. показали, что цисплатин секвестрируется
в меланосомах 1 , и это значительно снижает уровень его попадания в ядро [10]. Chen K.G. et al. обнаружили, что цисплатин в меланосомах значительно изменяет меланогенез через выраженное
усиление тирозиназной активности. Нарушение
меланогенеза проявлялось 8-кратным увеличением
внутриклеточной пигментации и внеклеточного
транспорта меланосом, содержащих цисплатин.
Этот эксперимент доказал, что меланосомы обеспечивают защитные свойства меланомных клеток,
секвестрируя цитотоксичные лекарства и увеличивая меланосома-опосредованный выброс препаратов из клетки. Ингибирование активности меланосом может быть потенциальным подходом к улучшению химиотерапии меланом.
Глутатион S-трансферазы
GST – ферменты, играющие важную роль в
детоксикации ксенобиотиков, включая противоопухолевые препараты, посредством присоединения их к глутатиону и выбросу этих комплексов
через АВС-транспортеры из клетки. Известно 6
классов глутатион-S-трансфераз у человека (α, μ, π,
θ, ω и ξ). Конъюгация с глутатионом делает токсичные вещества менее химически активными и,
таким образом, менее токсичными. Во многих случаях, в частности в клетках метастатической меланомы, глутатион-трансферазы коэксперссируются с
MRP, чаще – с MRP1 и MRP2 [5]. Depeille P. et al.
показали 3–4-кратное увеличение резистентности к
винкристину и алкилирующему агенту хлорамбуцилу в GSTM1-транс-фецированных клетках меланомы CAL1. Причем ингибиторы MRP-1 снижали
устойчивость к винкристину, что доказывает необходимость транспортной функции MRP-1 в обеспечении GSTM1-обусловенной устойчивости к винкристину. Однако ингибиторы MRP-1 не снижали
резистентности к хлормабуцилу, это показало, что
в ее развитие вовлечен только GSTM1 [14].
Данные об активности GST так же, как и
MRP, важны для прогнозирования клинического
ответа пациентов, в лечении которых используют
алкилирующие агенты или винкаалкалоиды.
Повышенная
активность протоновых помп
Одним из важных регуляторов поступления
большинства химиопрепаратов в клетку является
градиент рН снаружи и внутри клетки. Хорошо
известный механизм приобретения резистентности
и маркер злокачественной опухоли – изменение
градиента рН [34]. «Эффект Варбурга» объясняет
1
Меланосомы – уникальные мембраносвязанные клеточные органеллы, имеющиеся в пигментных клетках, которые обладают
также защитной функцией, предохраняя меланоциты от токсинов,
образующихся во время синтеза меланина (прим. авторов).
№ 2/том 14/2015
19
запуск механизма, приводящего к повышению внеклеточной кислотности, вызванной накоплением во
внеклеточном матриксе лактата. Предположительно, к этому приводит отбор клеток с повышенной
активностью протоновых помп, что с одной стороны повышает кислотность внеклеточного пространства и внутриклеточных везикул, а с другой –
приводит к алкализации цитозоля. Исследования
[29; 30] доказывают роль кислых везикул в развитии резистентности к цитотоксическим препаратам
через секвестрацию и нейтрализацию слабощелочных лекарств в полости кислых органелл и элиминацию лекарств из клетки через везикулоопосредованный путь выведения. V-АТФаза – протонная помпа, ответственная за кислотность лизосом и регуляцию везикулярного транспорта. В опухолевых клетках она вовлечена в регуляцию цитозольного рН, и ее экспрессия ассоциирована со
способностью клетки к метастазированию и МЛУ.
C. Federici et al. изучали влияние внеклеточного
ацидоза и высвобождения из нановезикул (экзосом)
препарата на развитие резистентности меланомных
клеток к цисплатину, параллельно изучали способность ингибиторов протонной помпы снижать резистентность, связанную с указанными механизмами. Эти исследователи показали, что захват цисплатина человеческими опухолевыми клетками
значительно ухудшался при низком рН [17]. Опухолевые клетки ксенографтов меланомы мышей,
леченных цисплатином совместно с ингибитором
протонной помпы, содержали большее количество
цисплатина по сравнению с клетками контрольной
группы, которую лечили одним цисплатином. Ингибиторы протонной помпы индуцировали явное
сокращение количества эндосом, которые также
содержали меньше цисплатина. Эти данные подтверждают двойной механизм, используемый клетками меланомы человека для приобретения устойчивости к токсичным противоопухолевым препаратам, включающий в себя зависимую от низкого рН
внеклеточную секвестрацию и экзосомальное выведение лекарства из клетки. Этот механизм нарушается при использовании ингибиторов протонной
помпы, которые приводят к увеличению цисплатин-зависимой цитотоксичности [13].
Активность
антиапоптотических
белков семейства BCL2
Индукция апоптоза – одна из основных целей противоопухолевой терапии, а приобретение
резистентности к апоптозу приводит к лекарственной устойчивости.
Традиционная противоопухолевая химиотерапия индуцирует апоптоз, в развитии которого
участвуют белки семейства BCL2. Последние делятся на анти-апоптотические (A1, BCL-2, BCL-w,
BCL-xL, MCL-1), обеспечивающие выживание
клетки, и проапоптотические белки (BID, BIM,
BAK, BAX, BAD, BIK, BMF, Noxa PUMA), обеспечивающие клеточную гибель. BID/BIM являются
активаторами BAD и BAX – эффекторных белков,
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
20
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
МЕХАНИЗМЫ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ МЕЛАНОМЫ
способствующих высвобождению цитохрома С из
митохондрий и запуску апоптоза. Динамическое
взаимодействие между анти- и проапоптотическими белками определяет судьбу клетки: активность
BID/BIM приводит к апоптозу, тогда как их блокировка – к выживанию клетки и приобретению лекарственной резистентности.
Дакарбазин, традиционно применяемый для
лечения меланомы, вызывает повреждение ДНК
опухолевой клетки и индуцирует апоптоз через
р53-сигнальный путь. Дакарбазин изучали в эксперименте на множестве образцов меланомы и обнаружили, что он вызывает сравнительно слабый
апоптотический ответ, как отдельно, так и в комбинации с цисплатином и винбластином [24].
R.A. Anvekar et al. обнаружили, что на усиление апоптоза влияет применение совместно с традиционной химиотерапией фармакологического ингибитора антиапоптотических белков АВТ-737. Результаты их исследования подтверждают, что дакарбазин и комбинация его с цисплатином и винбластином индуцировали BIM-опосредованный проапоптотический сигнал, который, однако, был недостаточным из-за подавления антиапоптотическими белками семейства BCL2. Добавление в схему лечения
ABT-737 привело к усилению апоптоза [3].
Y. Liu et al. показали, что препарат из группы миметиков BH3 эффективно индуцировал апоптоз в меланомных клетках, связываясь с антиапоптотическими белками, включая фосфорилированный MCL-1, обычно гиперэкспрессированный в
меланомах и также обеспечивающий их лекарственную устойчивость [25].
Таким образом, применение совместно с
традиционными химиопрепаратами ингибиторов
антиапоптотических белков улучшает эффективность химиотерапии и потенциально снижает развитие резистентности, а также уменьшает токсические побочные эффекты химиотерапии.
Активация ядерного фактора NFκB
В опухолях многих типов, включая меланому,
обнаружено повышение активности NFκB, который
регулирует воспалительный процесс, апоптоз, ангиогенез, инвазцию опухолевых клеток и лекарственную
устойчивость [36]. В активации NFκB играет роль
МАРК, которая также участвует в активации транскрипционного фактора белка АР-1, способствующего
как выживанию клетки, так и ее апоптотической гибели, также как JNK и ERK. Активация NFκB индуцируется разными стимулами, в том числе ростовыми
факторами, цитокинами, УФ и фармакологическими
препаратами, в частности цисплатином.
Цисплатин, применяемый для лечения диссеминированной меланомы, при монотерапии вызывает ответ на лечение не более 10%, при комбинированной – достигается незначительное повышение уровня противоопухолевого ответа. Цисплатин
вызывает активацию МАРК, NFκB, p53 и апоптоза
через повреждение ДНК.
Цитоплазматический линкерный белок αкатулин (CTNNAL1) тоже играет важную роль при
№ 2/том 14/2015
воспалении, апоптозе и реорганизации цитоскелета.
Недавно исследователи обнаружили повышенную
активность α-катулина в клетках злокачественной
меланомы по сравнению с таковой в клетках нормальных меланоцитов. Эктопическая экспрессия αкатулина содействует прогрессии, инвазии и метастазированию меланомы и происходит совместно со
снижением экспрессии Е-кадхерина и повышением
экспрессии мезензимальных генов, таких как Nкадхерин, Snail/Slug и матриксные металлопротеиназы 2 и 9. В исследовании, проведенном B. Kreiseder
et al., было показано, что повышение экспрессии αкатулина играет критическую роль в резистентности
меланомы к цисплатину, а нокдаун α-катулина делает клетки меланомы чувствительными к химиотерапевтическим препаратам. Обработка цисплатином
меланомных линий с нокадуном α-катулина приводила к снижению фосфорилирования ERK, JNK и
Jun, что сопровождалось усилением апоптоза в сравнении с контрольными клетками. Таргетное ингибирование α-катулина также может быть использовано
в качестве возможной стратегии преодоления резистентности меланомных клеток к цисплатину и другим алкилирующим препаратам через снижение активности NFκB и МАРК-сигнального пути [23].
р53 и р63
Генетический анализ идентифицировал некоторые мутации, связанные с развитием и прогрессированием меланомы, приводящие к лекарственной
резистентности и обеспечивающие выживание опухолевых клеток. Хотя мутации опухолевого супрессора – гена р53 – редки при меланоме (5–10 %), активность белка р53 может быть снижена из-за посттранскрипционных механизмов, которые недостаточно хорошо изучены на сегодняшний день [7]. Проведенные геномные исследования меланомных клеток
показали, что белок р53 инактивирован и не участвует
в регуляции таргетных генов, вовлеченных в клеточный цикл и апоптоз. Исследование, проведенное K.A.
Avery-Kiejda et al., доказывает, что аберрантное
функционирование р53-сигнального пути приводит к
прогрессии меланомы [6]. Нарушения функционирования р53-сигнального пути могут происходить и в
результате повреждений некоторых членов семейства
ТР53, в частности, гомолога ТР53 – ТР63. Экспрессия
р63 так же, как и р53, не очень часто встречается при
меланомах и выявлена по разным данным в 3,4–8%
меланом. Существуют две изоформы р63 (ТА и
ΔNp63). R.N. Matin et al. обнаружили мРНК и белок
р63 в меланомных клеточных линиях и образцах опухолей, полученных от больных меланомой [27]. р63
обладает двойным механизмом негативной регуляции
апоптоза: транслокация р63 в митохондрии влияет на
экспрессию белков семейства BCL-2 и таким образом
подавляет р53 в ядре. В клетках меланомы в ответ на
действие повреждающих ДНК агентов р63 перемещается в митохондрии. Делеция р63 делает меланомные
клетки способными к митохондриальному пути апоптоза. Активность р63 при первичных меланомах, также как и при метастатических, является маркером
плохого прогноза заболевания и лекарственной устойчивости [27].
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
МЕХАНИЗМЫ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ МЕЛАНОМЫ
Мутации NRAS/BRAF
Огромное значение в развитии и прогрессировании меланомы имеют нарушения Ras/Raf сигнального пути. Мутации NRAS найдены в 15–20 %
меланом, очень часто мутации находят в кодоне 61,
с заменой глутамина на лизин (Q61K) – 48% NRASмутаций и с заменой глутамина на аргинин (Q61R)
– 36%. Однако еще чаще активированы мутации в
BRAF, который кодирует B-Raf-серин/треонин проMAPK/ERKтеинкиназу,
регулирующую
сигнальный путь: они представлены на 70% меланом. Наиболее частая мутация связана с заменой
тимидина на аденин в нуклеотиде 1799, что приводит к замене валина в позиции 600 на глутаминовую кислоту, эта мутация называется V600E и составляет 90% всех BRAF-мутаций, вызывает постоянную активацию киназ [4].
NRAS/BRAF мутации приводят к конститутивной активации МАРК-сигнального пути, предоставляя возможность нерегулируемой пролиферации меланоцитов через G1/S чекпойнт клеточного
цикла без нормальной клеточной адгезии и необходимых ростовых факторов, увеличивая, таким образом, неопластический потенциал. Хотя присутствие NRAS/BRAF-мутаций не влияет на общую
смертность, пациенты с меланомой, имеющие одну
из этих мутаций, наиболее часто имеют региональные метастазы. Ингибирование конститутивно активированного MAPK-сигнального пути специфическими ингибиторами BRAFV600E и новым поколением МЕК-ингибиторов находится в фокусе современного лечения NRAS/BRAF-мутантных меланом. Однако к этим препаратам также развивается
резистентность, следовательно, клинический прогноз остается плохим. [4; 9; 33].
Повышенная способность
к репарации ДНК
О6-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза
(MGMT) – фермент, участвующий в восстановлении ДНК, играет роль в развитии лекарственной
устойчивости к алкилирующим агентам, к которым
относится большинство препаратов, применяемых
для лечения меланомы [20].
MGMT распознает поврежденное алкилирующими агентами основание О6-метилгуанан и
заменяет метильную группу в активном участке на
остаток цистеина. Таким образом, основание гуанин восстанавливается и может поддерживать регулярную репликацию и транскрипцию, после чего
молекула MGMT аутоинактивируется и разрушается. Любое дополнительное повреждение ДНК требует синтеза этого фермента de novo. MGMT мож-
21
но использовать в качестве мишени для устранения
резистентности меланомных клеток к алкилирующим препаратам, для быстрой инактивации MGMT
используют псевдосубстраты, например, О6бензилгуанин или ломегуатриб, которые приводят
к ее быстрой деградации [35].
В качестве альтернативы комбинации темозоломида с ингибиторами MGMT провели исследования нового аналога темозоломида с повышенной
активностью против MGMT+ меланомы. Исследования in vitro и in vivo показали, что новое соединение гораздо лучше, чем темозоломид, индуцирует
повреждения ДНК и вызывает клеточную гибель,
но при этом довольно хорошо переносимо [11].
O. Erice et al. обнаружили, что MGMTопосредованная резистентность меланомы связана
с ДНК-восстанавливающим ферментом PARP. В
экспериментах in vitro и in vivo показали, что
MGMT+ клетки хорошо отвечали на комбинацию
темозоломида и ингибитора PARP, темозоломид
вызывал антипролиферативный эффект, который
значительно усиливался ингибитором PARP, в отличие от MGMT– клеток [16]. Определение MGMTстатуса у больных меланомой важно для грамотного подбора терапии.
Заключение
Таким образом, лекарственная устойчивость
меланомы может быть обусловлена различными
механизмами. Часто она связана с нарушением доступа препарата к внутриклеточной мишени, что
обеспечивается секвестрацией и выводом лекарства
из клетки меланосомами или эндосомами, выбросом с помощью белков-транспортеров семейства
АВС, связыванием с глутатион-трансферазой и
дальнейшим удалением из клетки. Если эти механизмы не работают, и лекарственное вещество достигает цели, включатся другие механизмы защиты
клетки от гибели, например, повышается способность к восстановлению ДНК после повреждения
алкилирующими препаратами, или активируются
анти-апоптотические сигнальные пути.
Комплексная оценка маркеров лекарственной устойчивости меланомы может быть важна для
более точного прогноза и выбора подходящей схемы химиотерапии.
Знание механизма или механизмов лекарственной резистентности, активных у каждого конкретного больного, необходимо для персонализации терапии меланомы и снижения осложнений от
неэффективных препаратов. осложнений от неэффективных препаратов.
Литература
1.
2.
3.
Ставровская А.А. Клеточные механизмы множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток // Биохимия. – 2000.
– Т. 65, вып. 1. – С. 112–26.
Ставровская А.А., Стромская Т.П. Транспортные белки семейства АВС и множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток // Биохимия. – 2008. – Т. 73, Вып. 5. – С. 735–50.
Anvekar R.A., Asciolla J.J., Lopez-Rivera E. et al. Sensitization to the mitochondrial pathway of apoptosis augments melanoma tumor
cell responses to conventional chemotherapeutic regimens // Cell Death and Disease. – 2012. – 3. – e420.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
22
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
МЕХАНИЗМЫ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ МЕЛАНОМЫ
Arkenau H.T., Kefford R., Long G.V. Targeting BRAF for patients with melanoma // Br J Cancer. – 2011. – 104. – P. 392–8.
Attaoua C., Vincent L.A., Abdel Jaoued A. et al. Differential involvement of glutathione S-transferase mu 1 and multidrug resistance
protein 1 in melanoma acquired resistance to vinca alkaloids //Fundam Clin Pharmacol. – 2015. – 29(1). – P. 62 – 71.
Avery-Kiejda K.A., Bowden N.A., Croft A.J. et al. P53 in human melanoma fails to regulate target genes associated with apoptosis and
the cell cycle and may contribute to proliferation // BMC Cancer. – 2011. – 11. P. 203.
Benjamin C.L., Melnikova V.O., Ananthaswamy H.N. P53 protein and patho-genesis of melanoma and nonmelanoma skin cancer // Adv
Exp Med Biol. – 2008. – 624. – P. 265–82.
Berger W., Hauptmann E., Elbling L. et al. Possible role of the multidrug resistance-associated protein (MRP) in chemoresistance of
human melanoma cells // Int J Cancer. – 1997. – 71. – P. 108–15.
Chartrain M., Riond J., Stennevin A.Melanoma chemotherapy leads to selection ABCB5-expressing cells // PloS ONE. – 2012. – 7(5). –
e36762.
Chen K.G., Valencia J.C., Lai B. et al. Melanosomal sequestration of cytotoxic drugs contributes to the intractability of malignant
melanomas // Proc Natl Acad Sci USA. – 2006. – 103. – P. 9903–7.
Chen T.C., Cho H.-Y., Wang W. et al. A novel temozolomide analog, NEO212, with enhanced activity against MGMT-positive melanoma in vitro and in vivo // Cancer Letters. – 2015. – 358. – P. 144–51.
Colone M., Calcabrini A., Toccacieli L. et al . The multidrug transporter P-glycoprotein: a mediator of melanoma invasion // J Invest
Dermatol. – 2008. – 128. – P. 957–71.
De Milito A., Canese R., Marino M.L. et al. pHdependent antitumour activity of proton pump inhibitors against human melanoma is
mediated by inhibition of tumour acidity // Int J Cancer. – 2010. – 127. – P. 207–19.
Depeille P., Cuq P., Mary S. et al. Glutathione S-transferase M1 and multidrug resistance protein 1 act in synergy to protect melanoma
cells from vincristine effects // Mol Pharmacol. – 2004. – 65(4). – P. 897–905.
de Waard N.E., Kolovou P.E., McGuire S.P. et al. Expression of Multidrug Resistance Transporter ABCB5 in a Murine Model of Human Conjunctival Melanoma // Ocul Oncol Pathol. – 2015. – 1(3). – P. 182–9.
Erice O., Smith M.P., White R. et al. MGMT Expression Predicts PARP-Mediated Resistance to Temozolomide // Mol Cancer Ther. –
2015. – 14(5). – 1236–46.
Federici C., Petrucci F., Caimi S. et al. Exosome Release and Low pH Belong to a Framework of Resistance of HumanMelanoma Cells
to Cisplatin // PLoS ONE. – 2014. – 9(2). – e88193.
Frank N.Y., Pendse S.S., Lapchak P.H. et al. Regulation of progenitor cell fusion by ABCB5 P-glycoprotein, a novel human ATPbinding cassette transporter // J Biol Chem. – 2003. – 278. – P. 47156–65.
Frank N.Y., Margaryan A., Huang Y. et al. ABCB5-mediated doxorubicin transport and chemoresistance in human malignant melanoma // Cancer Res .– 2005. – 65. – P. 4320–33.
Gerson S.L. MGMT: its role in cancer aetiology and cancer therapeutics // Nat Rev Cancer. – 2004. – 4(4). – P. 296–307.
Glavinas H., Krajcsi P., Cserepes J., Sarkadi B The Role of ABC Transporters in Drug Resistance, Metabolism, and Toxicity // Current
Drug Delivery. – 2004. – 1(1). – 1–16.
Grichnik J.M., Burch J.A., Schulteis R.D. et al. Melanoma, a tumor based on a mutant stem cell? // J Invest Dermatol. – 2006. – 126. –
P. 142–53.
Kreiseder B., Holper-Schichl Y.M., Muellauer B. et al. Alpha-Catulin Contributes to Drug-Resistanceof Melanoma by Activating NFκB and AP-1 // PLoS ONE. – 2015. – 10(3). – e0119402.
Legha S.S., Ring S., Bedikian A. et al. Treatment of metastatic melanoma with combined chemotherapy containing cisplatin, vinblastine
and dacarbazine (CVD) and biotherapy using interleukin-2 and interferon-alpha // Ann Oncol. – 1996. – 7. – P. 827–35.
Liu Y., Xie M., Song T. et al. A novel BH3 mimetic efficiently induces apoptosis in melanoma cells through direct binding to antiapoptotic Bcl-2 family proteins, including phosphorylated Mcl-1 // Pigment Cell Melanoma Res. – 2014. – 28. – P. 161–70.
Luo Y., Ellis L.Z., Dallaglio K. et al. Side Population Cells from Human Melanoma Tumors Reveal Diverse Mechanisms for Chemoresistance // J Invest Dermatol. – 2012. – 132(10). – P. 2440–50.
Matin R.N., Chikh A., Chong S. L.P. et al. p63 is an alternative p53 repressor in melanoma that confers chemoresistance and a poor
prognosis // J. Exp. Med. – 2013. – 210(3). – P. 581–603.
Molinari A., Toccacieli L., Calcabrini A. et al. Induction of P-glycoprotein expression on the plasma membrane of human melanoma
cells // Anticancer Res. – 2000. – 20. – P. 2691–6.
Ouar Z., Lacave R., Bens M., Vandewalle A. Mechanisms of altered sequestration and efflux of chemotherapeutic drugs by multidrugresistant cells // Cell Biol Toxicol. – 1999. – 15. – P. 91–100.
Raghunand N., Martı´nez-Zaguila´n R., Wright S.H., Gillies R.J. pH and drug resistance. II. Turnover of acidic vesicles and resistance
to weakly basic chemotherapeutic drugs // Biochem Pharmacol. – 1999. – 57. – P. 1047–58.
Schadendorf D., Makki A., Stahr C. et al. Membrane transport proteins associated with drug resistance expressed in human melanoma //
Am J Pathol. – 1995. – 147. – P. 1545–52.
Schatton T., Murphy G.F., Frank N.Y. et al. Identification of cells initiating human melanomas // Nature. – 2008. – 451. – P. 345–9.
Shao Y., Aplin A.E. BH3-only protein silencing contributes to acquired resis-tance to PLX4720 in human melanoma // Cell Death Differ. – 2012. – 19. – P. 2029–39.
Simon S., Roy D., Schindler M. Intracellular pH and the control of multidrug resistance // Proc Natl Acad Sci USA. – 1994. – 91. – P.
1128–32.
Tawbi H.A., Villaruz L., Tarhini A. et al. Inhibition of DNA repair with MGMT pseudosubstrates: phase I study of lomeguatrib in combination with dacarbazine in patients with advanced melanoma and other solid tumours // British Journal of Cancer. – 2011. – 105. – P.
773–7.
Ueda Y., Richmond A. NF-κB activation in melanoma // Pigment Cell Res. – 2006. – 19. – Р. 112–24.
Wagle N., Emery C., Berger M.F. et al. Dissecting Therapeutic Resistance to RAF Inhibition in Melanoma by Tumor Genomic Profiling // J. Clin. Oncol. – 2011. – 29. – P. 3085–96.
Walsh N., Kennedy S., Larkin A.M. et al. Membrane transport proteins in human melanoma: associations with tumor aggressiveness and
metastasis // Br. J. Cancer. – 2010. – 102. – P. 1157–62.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
СТРУКТУРА И СВОЙСТВА ОСНОВНЫХ РЕЦЕПТОРОВ...
23
УДК 576.36.08:616-091.818
В.А. Мисюрин
СТРУКТУРА И СВОЙСТВА ОСНОВНЫХ РЕЦЕПТОРОВ
И ЛИГАНДОВ ВНЕШНЕГО ПУТИ АПОПТОЗА
ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина», Москва
Контактная информация
Всеволод Андреевич Мисюрин, к.б.н., младший научный сотрудник лаборатории экспериментальной химиотерапии НИИ ЭДиТО
адрес: 115478 Москва, Каширское ш., 24; тел. +7(499)324-02-00
e-mail: [email protected]
Статья поступила 21.04.2015, принята к печати 27.04.2015.
Резюме
Апоптоз может начаться как по внутренним причинам, так и может быть запущен извне. Передачу апоптотического сигнала внутрь клетки осуществляют несколько гомологичных друг другу рецепторов. Для активации
сигнала эти рецепторы должны связаться со своими лигандами. Так, рецептор FAS связывается с FAS-лигандом,
рецептор TNFR1 – с TNFα, рецепторы TRAIL-R1 и TRAIL-R2 – с лигандом TRAIL и наконец, DR3 – с лигандом
TL1A. Чаще всего, чтобы осуществить апоптоз, лиганды должны находиться в мембраносвязанной форме. Рецепторы FAS и TNFR1 запускают апоптоз только в том случае, если интернализуются в цитоплазму клетки-мишени.
Если FAS и TNFR1 не интернализуются, то запускают антиапоптотическую программу. Рецепторы TRAIL-R1,
TRAIL-R2 и DR3 не подвергаются интернализации при запуске апоптоза. Известны также рецепторы TNFR2,
TRAIL-R3 и TRAIL-R4, которые активируют антиапоптотическую программу. Апоптотический сигнал начинается со сборки комплекса DISC на внутренней стороне цитоплазматической мембраны. В состав DISC обязательно
входят белки FADD и прокаспаза-8, которые связываются с внутриклеточным доменом апоптотического рецептора. Если комплекс DISC не формируется, сигнал передаётся на NFκB-путь через каскад MAP-киназы, и запускается антиапоптотическая программа. Многообразие рецепторов и лигандов позволяет осуществлять множество
функций, в том числе устранение заражённых или трансформированных клеток, начинать и завершать воспаление, модулировать процессы онтогенеза, кроветворения и выработки антител.
Ключевые слова: FAS, TNFα, TRAIL, TL1A, апоптоз.
V.A. Misyurin
STRUCTURE AND FUNCTIONS
OF MAIN APOPTOSIS RECEPTORS AND LIGANDS
FSBSI «N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center», Moscow
Abstract
Apoptosis can be triggered from external signals. Several homologous receptors transmit apoptotic signals from
outside into the cell. For successful activation of apoptosis receptors should interact with their ligands. For example,
FAS receptor must bind with FAS-ligand, TNFR1 with TNFα, TRAIL-R1 and TRAIL-R2 with TRAIL, DR3 – with
TL1A, respectively. In majority of cases ligands should be anchoring in the cell membrane to perform their functions.
FAS and TNFR1 receptors trigger apoptosis only when they are internalized into the cell’s cytoplasm. If FAS and
TNFR1 are not internalized, then anti-apoptotic program won’t start. In contrast, TRAIL-R1, TRAIL-R2 and DR3
aren’t internalized during apoptotic signal transduction. Other receptors, TNFR2, TRAIL-R3 and TRAIL-R4 start an
anti-apoptotic program. The apoptotic signal starts when DISC complex is formed on the inner side of the cell membrane. FADD, procaspase-8 and intracellular domain of receptor form together DISC complex. If the DISC complex
wasn’t formed, signal is transmitted by the NFκB-way via MAP-kinase cascade. In such conditions anti-apoptotic program starts. A variety of receptors and ligands provides for multiple biological functions. For example, receptormediated apoptosis takes a part in elimination of infected or transformed cells, regulation of inflammation, modulation
of ontogenesis, hematopoiesis and antibody production.
Key words: FAS, TNFα, TRAIL, TL1A, apoptosis.
Введение
Рецепторы и лиганды семейства FAS – мембраносвязанные белки, экспонированные на внеш№ 2/том 14/2015
нюю сторону клеточной мембраны. В ряде случаев
эти белки находятся в растворимой форме. Первый
открытый рецептор этого семейства получил название FAS. Структура остальных представителей
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
24
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
СТРУКТУРА И СВОЙСТВА ОСНОВНЫХ РЕЦЕПТОРОВ...
во многом гомологична FAS, и функции этих белков очень сходны. Связывая свой лиганд, рецепторы передают сигнал внутрь клетки [2]. Разные рецепторы могут активировать различные регуляторные каскады. Например, при передаче сигнала от
рецептора FAS активируется каспаза-3, после чего
запускается необратимый апоптоз [1; 3; 11; 44].
Опосредованно каспазу-3 может также активировать и TNFR1. Но в отличие от FAS, TNFR1 имеет
связи с более широким спектром сигнальных молекул. При определённых условиях TNFR1 передаёт
сигнал не к каспазе-3, а стимулирует активацию
сигнального пути NFκB. Передача сигнала от других рецепторов семейства FAS также имеет некоторые отличия от FAS-зависимого пути.
Каждый лиганд, представленный в данном
семействе, может связываться с одним или с несколькими рецепторами, и не взаимодействует с
другими. Многообразие рецепторов и лигандов
семейства FAS позволяет реализовать различные
программы действия. В числе этих программ есть
как инициация клеточной гибели, так и преодоление апоптоза. В настоящий момент достаточно хорошо известно, при каких условиях произойдёт тот
или иной ответ на стимуляцию рецепторов клеточной гибели. С другой стороны, ориентируясь на
состояние тех или иных эффекторов, программу
действия можно предсказать заранее. Целью данного обзора является анализ механизма работы рецепторов и лигандов клеточной гибели.
Открытие
Одним из этапов, сопровождавших открытие
рецепторов и лигандов семейства FAS, были разработки хирурга-онколога Вильяма Коли, который
увидел чёткую связь между перенесённой инфекцией и регрессией опухоли у больного [34]. От разработок Вильяма Коли, связанных с применением
компонентов патогенных организмов для стимуляции противоопухолевого иммунного ответа, исследователи перешли к экспериментам по введению
мышам вакцины БЦЖ (bacillus Calmette–Guerin) и
эндотоксинов (липолисахаридов, полученных от
грамотрицательных бактерий). Сыворотка крови
мышей, получивших данные агенты, обладала выраженным цитотоксическим действием, что было
показано на некоторых клеточных линиях. Было
высказано предположение, что в лизисе трансформированных клеток участвует неизвестный компонент, выработанный иммунными клетками в ответ
на проведённую стимуляцию БЦЖ и эндотоксинами. В 1984 году был выделен и описан этот компонент, названный фактором некроза опухоли (ФНО,
или TNF, tumor necrosis factor, позднее – ФНОα и
TNFα) [40]. Дальше, в 1989 году, две исследовательские группы независимо друг от друга получили мышиные моноклональные антитела, обладающие цитолитической активностью против различных линий клеток человека. Белок клеточной поверхности, опознаваемый этими антителами, был
назван FAS и APO-1, соответственно [59; 67]. С
этого момента началось исследование биологиче№ 2/том 14/2015
ской роли рецептора FAS, функция которого известна как «рецептора клеточной смерти». Вскоре
был открыт FAS-лиганд – белок, связывающийся с
рецептором FAS [53]. В 1990-е гг. и чуть позже было описано множество новых белков, по своему
строению очень похожих на FAS, и новых лигандов, сходных с лигандом рецептора FAS. Таким
сходством обладает лиганд TRAIL, который был
открыт в 1995 году при поиске белков, имеющих
консервативный регион белков семейства TNF [64].
При скрининге библиотеки кДНК, экспрессируемой клетками эндотелия, в 2002 г. был обнаружен
лиганд TL1A [37]. Группа лигандов, гомологичных
TNFα, получила название семейство белков TNF, а
их рецепторы названы соответственно TNFрецепторами.
Кроме структурного сходства эти белки обладают практически одинаковым механизмом
функционирования. Очень удобно рассмотреть сначала сигнальный путь, контролируемый системой
FAS-FAS-лиганд, и далее сравнить с ним сигнальные пути, ассоциированные с другими представителями семейства TNF и их рецепторов.
Структура рецептора FAS
и FAS-лиганда и их сигнальные пути
Рецептор FAS в некоторых литературных
источниках сохранил наименование APO-1. В современной номенклатуре дифференцировочных
антигенов, или кластеров дифференцировки, этому
рецептору присвоен номинал CD95. В научных
статьях встречаются все три обозначения, но тексте
этого обзора рецептор будет упоминаться как FAS,
а его лиганд – FAS-лиганд.
В клетках человека белок FAS кодируется
одноимённым геном, расположенном в локусе
10q24.1 [17]. В составе гена присутствует 9 экзонов, и возможно до 18 вариантов сплайсинга мРНК
гена FAS. Только три мРНК транслируются, формируя длинный (335 aa (аминокислотных остатков)), средний (в составе которого отсутствует
трансмембранный домен), и короткий (220 aa) белок. Экспрессия гена наблюдается практически во
всех клетках человеческого организма [18; 32].
Зрелый белок FAS, сформированный из полипептидной цепочки наибольшей длины, локализован в клеточной мембране. В составе полипептида выделяют N-концевой участок, формирующий
внеклеточные домены, трансмембранный участок и
цитоплазматический C-концевой участок, образующий после рефолдинга внутриклеточные домены. Три внеклеточных домена FAS обогащёны остатками цистеина, и названы CRD1-3 (от cysteinerich domain). За счёт заряда домена CRD2 и верхней
части CRD3, FAS прочно ассоциируются с FASлигандом [50]. Домен CRD1, также известный как
PLAD (pre-ligand assembly domain), не связывается
с FAS-лигандом, но выполняет другие функции. Он
присоединяется к CRD1 других субъединиц FAS,
посредством чего три субъединицы удерживаются
вместе и рецептор представляет собой гомотример
[21]. В толще клеточной мембраны FAS удерживаРОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
СТРУКТУРА И СВОЙСТВА ОСНОВНЫХ РЕЦЕПТОРОВ...
ется за счёт небольшого трансмембранного домена.
В цитоплазму клетки погружён так называемый
«домен смерти» DD (death domain), структура которого состоит из шести антипараллельных αспиралей, расположенных по принципу «греческий
ключ». DD предназначен для инициации апоптотического сигнала [23].
Кроме того, вблизи DD FAS имеет специальный интернализационный мотив, позволяющий
клетке осуществлять интернализацию рецептора
актин- и клатрин-зависимым способом [42]. Наконец, цитоплазматический конец белка имеет «домен спасения», который ингибирует цитотоксическую функцию FAS при связывании с фосфатазой
FAP1 (FAS-associated phosphatase 1) [65].
Единственный известный лиганд рецептора
FAS также является трансмембранным белком, но
может существовать и в растворимой форме. Белок
кодируется геном FASL, расположенным на хромосоме 1q23 [54]. Зрелый белок тримеризуется и в
таком виде пронизывает клеточную мембрану насквозь [25]. Внеклеточный участок FAS-лиганда
состоит из 179 aa и содержит консервативный домен гомологии TNF. Внеклеточный домен может
расщепляться мембранными металлопротеазами -3
и -7, после чего секретируется, сохраняя при этом
тримерную структуру мембранного белка [38; 45].
Интересно, что секреторная форма является очень
нестабильной и в значительной степени инертной
как апоптоз-индуцирующая молекула. В форме
мембраносвязанного белка, экспонированного на
внешней поверхности клетки, FAS-лиганд является
наиболее мощным стимулятором апоптоза.
В длинном цитоплазматическом домене
FAS-лиганда имеется несколько мотивов, предназначенных для взаимодействия с транспортными
молекулами, и участок фосфорилирования [13].
Инициация проведения апоптотического сигнала осуществляется при связывании мембранной
формы FAS-лиганда с FAS, расположенным на
мембране другой клетки. Согласно большинству
авторов, как FAS-лиганд, так и FAS представляют
собой тримеры [50], однако есть данные, что при
инициации апоптоза FAS формирует структуру из 5
и даже 7 субъединиц [62].
В любом случае, домен DD рецептора FAS
связывается с цитоплазматическим белком FADD
(FAS-распознающий белок с «доменом смерти», от
FAS-associated protein with death domain). В структуре самого FADD имеется как домен DD, так и
домен DED (death effector domain), который позволяет FADD ассоциироваться с каспазой-8 [43]. Связанные между собой белки FAS/FADD/каспаза-8
называют также комплексом DISC (death-inducing
signaling complex) [28].
После сборки DISC на внутриклеточной стороне клеточной мембраны возможно два пути развития событий. В клетках типа I (например – лимфоидные клетки) ассоциация FAS и FAS-лиганда со
сборкой DISC сопровождается интернализацией,
или эндоцитозом рецептора со всеми связанными
факторами [42].
№ 2/том 14/2015
25
После интернализации комплекс DISC очень
быстро проводит циклы расщепления прокаспазы8. В результате в цитоплазму высвобождается
очень много молекул активной каспазы-8 в виде
гетеротетрамеров из двух малых (p10) и двух
больших (p20) субъединиц. Каспаза-8 взаимодействует с прокаспазой-3, конвертируя её в активную
каспазу-3. Каспаза-3 сразу же начинает расщеплять
различные белковые субстраты, в том числе ферменты репарации ДНК, цитоплазматические и
ядерные структурные белки, белки веретена деления и эндонуклеазы [47]. Более того, каспаза-3 активирует прокаспазы -6 и -7, которые ускоряют
осуществление апоптоза [49].
В клетках типа II (гепатоциты) сборка DISC
и последующая активация прокаспазы-8 затруднена
регуляторными молекулами FAP1, c-FLIP (FLICElike-inhibitory-protein) и PED-PEA15 [18; 24; 48].
Из-за наличия регуляторов, в цитоплазме клеток
типа II формируется небольшое число молекул каспазы-8, которых не достаточно для запуска апоптоза по пути, характерному для клеток типа I. Основной эффект достигается за счёт фактора tBID, который образуется при расщеплении каспазой-8 белка
BID. tBID стимулирует встраивание белка BAX в
митохондриальную мембрану, через которую освобождается цитохром C [4; 66]. В цитоплазме из
Apaf-1 (apoptosis protease-activating factor), прокаспазы-9 и цитохрома C, формируется апоптосома,
которая освобождает каспазу-9. Осуществлению
апоптоза может препятствовать фактор XIAP (Xlinked inhibitor of apoptosis protein), однако вместе с
цитохромом C из митохондрии освобождается
SMAC (second mitochondria-derived activator of
caspases), ингибирующий XIAP. Если работа XIAP
связана молекулой SMAC, то каспаза-9 успешно
активирует прокаспазу-3, и, как было сказано выше, апоптоз уже необратим.
Белок FADD – не единственный активатор
FAS-индуцируемого апоптоза. FAS взаимодействует с другим белком – RIP1 (receptor interacting
protein 1), в структуре которого, также, как и в
структуре FADD, найден DD. Комплекс FAS-RIP1
привлекает белок RAIDD (RIP-associated ICH1/CED-3-homologous protein with a DD) и прокаспазу-2 [27].
Во многих типах клеток рецептором FAS
также активируется киназа JNK (c-Jun N-terminal
kinase) [39]. Сигнальный путь от FAS до JNK имеет
следующих посредников: Daxx (Death Domain
associated protein), Ask1 и MKK5. Активная JNK
противодействует NFκB-зависимой экспрессии антиапоптотических белков, в том числе XIAP, что
способствует осуществлению апоптоза [55]. Кроме
того, JNK способствует протеосомной деградации
белка c-FLIP, который, как было указано выше,
блокирует активацию прокаспазы-8. Описан и антиапопточеский сигнальный путь, индуцированный
системой FAS-FAS-лиганд. В случае если интернализация рецептора не происходит, сборка комплекса DISC осуществляется очень медленно, и активирующий сигнал получают каскад MAPK и NFκBРОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
26
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
СТРУКТУРА И СВОЙСТВА ОСНОВНЫХ РЕЦЕПТОРОВ...
путь. Эти эффекторы способствуют выживанию
клетки. Следует отметить, что активация MAPK и
NFκB рецептором FAS происходит и при его интернализации, однако их антиапоптотический эффект в таких условиях незначителен [16].
Структура TNFR1, TNFR2
и TNFα, и их сигнальные пути
Ген TNFRSF1A расположен на хромосоме
12p13.31 и кодирует белок, состоящий из 455 аа
[19]. Структура рецептора очень похожа на FAS,
однако во внеклеточном домене локализованы не
три, а четыре CRD. Подобно FAS, TNFR1 тримеризуется за счёт CRD1, а со своим лигандом связывается при помощи участков CRD2 и CRD3 [60]. Во
внутриклеточном домене TNFR1, непосредственно
под плазматической мембраной, расположен мотив
для сборки комплекса на клеточной мембране [51].
Имеется мотив DD, позволяющий формировать комплекс DISC. Кроме этого, TNFR1 имеет
мотив для связывания адаптерного белка FAN
(factor associated with neutral sphingomyelinase
activation), который в дальнейшем связывается и
активирует NSMase (membrane-bound neutral
sphingomyelinase) [9].
Рецептор
TNFR2
кодируется
геном
TNFRSF1B, локализованным в хромосоме 1p36.22.
Зрелый белок состоит из 461 аа. Он структурно
сходен с TNFR1 и FAS, однако не имеет DD в
трансмембранном домене и не связывается с DDсодержащими адаптерами [10].
Ген TNFα расположен на хромосоме 6p21.3.
Длина полипептидной цепи составляет 233 aa. Подобно FAS-лиганду, TNFα содержит консервативный домен гомологии TNF. TNFα в основном существует в форме гомотримерного трансмембранного белка [56]. Под действием TACE (TNFαconverting enzyme) мембраносвязанный TNFα расщепляется и секретируется [12]. Секреторная форма стабильна и способна индуцировать апоптоз, что
не характерно для родственного ему FAS-лиганда.
TNFα практически с одинаковым сродством распознаётся как TNFR1, так и TNFR2.
Подобно системе FAS-FAS-лиганд, TNFR1
при ассоциации с TNFα способен запускать апоптотический сигнальный путь. Принципиальных отличий между FAS- и TNFR1-опосредованной активации апоптоза нет, за исключением того, что в состав DISC при TNFR1 входит фактор TRADD
(TNFR-associated death domain) [51]. При интернализации TNFR1 комплекс DISC формируется с
наибольшей интенсивностью. Однако в физиологических условиях наиболее часто интернализация не
происходит, а TNFR1 стимулирует провоспалительные эффекты. В течение нескольких минут после связывания TNFR1 с TNFα к цитоплазматическому домену TNFR1 присоединяются белки RIP1,
TRAF2 (TNF receptor-associated factor 2) и cIAP1/2
(inhibitor of apoptosis protein 1/2), образуя комплекс
I [36]. В составе комплекса I белки подвергаются
модификации. В частности, происходит убиквитинирование RIP1. Убиквитинированный RIP1 при№ 2/том 14/2015
влекает TAK1 (transforming growth factor-β-activated
kinase 1) и IKK (Inhibitor of nuclear factor κ-B kinase)
в комплекс I, что приводит к активации сигнального пути NFκB [20; 31]. С другой стороны, взаимодействие TRAF2-RIP1 индуцирует передачу сигнала по MEKK1-каскаду (MAPK/ERK kinase 1) к киназе JNK, которая способствует каспазо-8зависимому апоптозу. Активация апоптоза происходит в основном тогда, когда сигнальные пути,
контролирующие TNFR1-опосредованное выживание клетки, не активны.
Авидность связи мембранного TNFα с
TNFR2 выше, чем у растворимой формы TNFα.
При ассоциации этих беков цитоплазматический
домен TNFR2 связывается с TRAF2. Как в случае с
TNFR1, комплекс TNFR2-TRAF2 активирует
cIAP1/2 [46]. В физиологических условиях сигнал
передаётся к промоторам гена AP-1 (activator
protein 1), который запускает антиапоптотическую
программу, и незначительно активируется NFκB
[26]. В случае гиперэкспрессии TNFR2 активность
NFκB также возрастает, но несопоставимо меньше,
чем при стимуляции TNFR1.
Структура TRAIL,
его рецепторов, и их сигнальные пути
Ген, кодирующий TRAIL, расположен на
хромосоме 3q26. Как мембранно-связанная, так и
растворимая форма белка вызывают апоптоз.
Известно пять рецепторов, с которыми может связываться TRAIL. Два рецептора активируют
апоптотический сигнал – это TRAIL-рецептор-1
(TRAIL-R1, DR4 или TNFRSF10A) и TRAIL-R2
(DR5 или TNFRSF10B). Три других рецептора,
TRAIL-R3 (DcR1), TRAIL-R4 (DcR2) и OPG (от
osteoprotegerin), связывают TRAIL, но не передают
апоптотический сигнал, так как не имеют цитоплазматического домена вообще (TRAIL-R3), либо
имеют дефектный DD-мотив (TRAIL-R4), либо связываются с низкой (OPG) аффинностью [30]. Гены
TRAIL-R1 и TRAIL-R2 расположены в локусе
8p21.3, и кодируют очень сходные структурно и
функционально рецепторы. Внеклеточные домены
обоих белков имеют мотивы CRD, типичные для
рецепторов семейства FAS [41; 61]. Внутриклеточные домены TRAIL-R1 и TRAIL-R2 имеют мотивы
DD. мРНК всех пяти рецепторов экспрессируется в
клетках человека, однако её количество в основном
не коррелирует количеством молекул рецепторов
на плазматической мембране [22].
При связывании с TRAIL рецепторы TRAILR1 и TRAIL-R2 передают как апоптотический, так
и антиапоптотические сигналы. При передаче
апоптотического сигнала TRAIL-R1 и TRAIL-R2
формируют комплекс DISC. В отличие от FAS и
TNFR1, эти рецепторы не интернализуются, и конвертируют значительное число молекул прокаспазы-8, не покидая плазматическую мембрану [29].
Рецептор TRAIL-R4 передаёт только антиапоптотический сигнал, а TRAIL-R3 не передаёт никакого
сигнала. Пока неизвестно, что происходит при связывании OPG и TRAIL.
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
СТРУКТУРА И СВОЙСТВА ОСНОВНЫХ РЕЦЕПТОРОВ...
Структура и сигнальные пути TL1A и DR3
Рецептор DR3 (также известный, как Apo-3,
LARD и TRAMP) был открыт при исследовании
свойств белков, имеющих DD-мотив [14; 33]. Ген
расположен в локусе 1p36.2, имеет 9 экзонов [52].
За счёт альтернативного сплайсинга возможно образование 11 форм белка DR3, среди которых есть
и секреторные. Мембраносвязанная форма DR3
образуется из полипептидной цепи длиной 417 aa.
Внеклеточный домен имеет четыре мотива CRD.
Подобно другим рецептором семейства FAS, DR3
тримеризуется в плазматической мембране. Мотивы CRD2 и CRD3 осуществляют связь DR3 с его
единственным лигандом TL1A.
TL1A в своей структуре не имеет принципиальных отличий от других лигандов семейства
TNF. Его ген расположен на хромосоме 9p32 [37].
Система TL1A-DR3 контролирует как апоптотические, так и антиапоптотические сигнальные
пути. Инициация апоптоза проходит с формированием комплекса FADD-TRADD-TRAF2-прокаспазы8 на мембране и последующей активацией каспазы-3
в цитоплазме клетки. Антиапоптотический сигнальный путь запускается при связывании цитоплазматическим доменом DR3 белков TRADD, TRAF2,
RIP1. FADD и прокаспаза-8 в комплекс в данном
пути не участвуют [63]. Нижестоящими эффекторами являются ERK, JNK и NFκB, причём инактивация
NFκB является обязательным условием индукции
DR3-зависимого апоптоза [35].
Физиологическая
и патофизиологическая роль
Осуществление апоптоза очень важно при
развитии человеческого организма. Так, в процессе
формирования нервной и иммунной системы происходит значительное перепроизводство клеток. В
приведённых системах апоптоз позволяет устранить клетки, не сформировавшие функциональные
синаптические связи или не сумевшие произвести
высокоаффинный антиген-специфичный рецептор,
соответственно. Аутореактивные лимфоциты получают апоптотический сигнал и быстро обезвреживаются. Кроме того, посредством апоптоза в организме устраняются клетки, поражённые патогенами, он способствует заживлению ран при устранении иммунных клеток.
В организме взрослого человека имеется несколько иммунопривелегированных зон, в которые
посредством проапоптотических сигналов не допускаются клетки иммунной системы. Наконец,
взаимодействие апоптотический рецептор-лиганд
играет роль в противоопухолевом иммунном надзоре [10; 15; 30]. Строгий надзор возможен по той
причине, что все (за некоторыми исключениями)
клетки человека имеют на своей поверхности апоптотические рецепторы, однако комплиментарные
им лиганды экспрессируются либо секретируются
иммунными клетками. В случае дисбаланса в системах регуляции экспрессии апоптотических рецепторов и лигандов происходят различные дегенеративные процессы [5–8].
№ 2/том 14/2015
27
FAS экспрессируется на поверхности практически всех клеток человека, за исключением активированных T-цитотоксических лимфоцитов и
NK-клеток, а также клеток иммунопривелегированных зон [32]. FAS-лиганд экспрессируется иммунными клетками при принятии решения о ликвидации заражённой или опухолевой клетки.
При успешном запуске апоптотической гибели клетки, экспрессия FAS-лиганда Tлимфоцитом прекращается, чтобы не разрушить
соседние клетки. Если FAS-лиганд экспрессируется
неиммунными клетками (например, клетками Сертоли в семенных канальцах), то его синтез происходит постоянно. Это допустимо, так как окружающие клетки нечувствительны к FAS-FASлиганд опосредованному апоптозу, а клетки иммунитета никогда не допускаются туда.
Основная роль TNFα заключается в регуляции активности клеток иммунной системе при непосредственном участии в противоопухолевом и
противоинфекционном иммунном ответе [10]. Активированные макрофаги, нейтрофилы, тучные
клетки, натуральные киллеры, эозинофилы и CD4+
лимфоциты ответственны за выработку этого цитокина в ответ на сигналы в начале воспаления. Связываясь с TNFR1 и TNFR2 иммунных клеток, TNFα
активирует транскрипцию генов, ответственных,
прежде всего, за острую фазу воспаления. Этот цитокин стимулирует пролиферацию и созревание
клонов, эффективно распознавших презентированные антигены. По окончании иммунного ответа,
TNFα активирует апоптоз иммунных клеток в очаге
воспаления, чтобы прекратить их разрушительное
воздействие на близлежащие ткани. TNFR1 экспрессируется всеми без исключения клетками лимфоидной системы и практически всеми остальными
клетками человека.
TNFR2 в основном присутствует на поверхности клеток центральной нервной системы и иммунных клеток, таких как CD4+ и CD9+ лимфоциты [57; 58]. Обычно TNFR2 коэкспрессируется с
TNFR1. Поскольку TNFR1 и TNFR2 при связывании с TNFα активируют разные сигнальные пути,
преобладание одного из них на поверхности клетки
определяет ответ на стимуляцию. Так, доминирование TNFR2 позволяет клетке выживать. При избыточной продукции TNFα оказывает цитотоксическое воздействие на все клетки организма. Это
выражается в виде развития болезни Альцгеймера,
сердечной недостаточности, и многих других заболеваний, непосредственно связанных с истощением
клеточного пула внутри ткани [15].
TRAIL конститутивно экспрессируется во
многих тканях человека в контексте мРНК. В виде
белка TRAIL экспрессируется преимущественно
клетками иммунной системы, в особенности натуральными киллерами, T-цитотоксическими лимфоцитами, дендритными клетками и макрофагами.
Находясь в состоянии покоя, иммунные клетки сохраняют молекулы TRAIL в цитоплазме [30].
Рецептор TRAIL-R1 экспрессируется в клетках большинства тканей человеческого организма,
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
28
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
СТРУКТУРА И СВОЙСТВА ОСНОВНЫХ РЕЦЕПТОРОВ...
включая селезёнку, тимус, печень, а также в лейкоцитах периферической крови, активированных Tлимфоцитах и клетках тонкого кишечника. Экспрессия TRAIL-R2 обнаруживается во всех типах
клеток нормальных тканей, а также во всех опухолевых клеточных линиях; выше всего уровни его
экспрессии в клетках селезёнки, лейкоцитах периферической крови и активированных лимфоцитах.
Основной эффект, достигаемый работой системы
TRAIL-рецепторы TRAIL, это осуществление противоопухолевого и противовирусного иммунного
надзора цитотоксическими клетками. T-клетки, в
ответ на их стимуляцию через молекулу CD59, секретируют микровезикулы, мембраны которых обогащены молекулами TRAIL [30].
Экспрессия TLA1 в основном наблюдается в
эндотелиальных клетках пупочной вены и синовинальных клетках, клетках желудочно-кишечного
тракта. В ответ стимуляцию такими цитокинами,
как TNFα и IL-1 T-клетки различных популяций
также экспрессируют TLA1. В остальных клетках
человека ген TLA1 неактивен.
Рецептор DR3 экспрессируется у практически всех клеток иммунной системы. TL1A-DR3 в
основном управляет взаимодействием эффекторных и регуляторных T-клеток с другими иммунными клетками, а также играет роль в аллергических
реакциях, происходящих на слизистых оболочках
лёгких и желудочно-кишечного тракта.
Гиперэкспрессия TL1A провоцирует развитие
аутоиммунных заболеваний, прежде всего тяжёлых
форм ревматоидного артрита и болезни Крона [35].
Заключение
Самым простым и действенным способом
осуществления апоптоза является контакт между
NK или T-цитотоксической клеткой, имеющей
FAS-лиганд, и клеткой-мишенью, обладающей FAS
и системой, позволяющей осуществить его интернализацию.
Апоптоз, запущенный в трансформированной или заражённой вирусом клетке, не приводит к
разрушению других клеток или выбросу ядовитых
веществ во внутреннюю среду организма. Однако
множество тканей в организме находятся в так называемом квазистационароном состоянии, и клетки
этих тканей после катастрофических событий не
восстанавливаются до своего исходного числа. Таким образом, просто необходимо наличие систем,
ограничивать
развитие
FASспособных
опосредованного апоптоза.
Вероятно, именно этой причине развилось
несколько систем рецепторов и лигандов. Их многообразие открывает возможность осуществлять
либо клеточную гибель, либо продолжать проведение защитных реакций, модулировать процессы
кроветворения и секреции антител.
Литература
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
Барышников А.Ю. Программируемая клеточная смерть (апоптоз) // Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика. – 2001. – С. 36.
Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В. FAS/APO-1 антиген – молекула, опосредующая апоптоз // Гематология и
трансфузиология. – 1995. – № 6. – С. 35.
Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В. Программированная клеточная смерть (апоптоз) // Российский онкологический журнал. – 1996. – № 1. – С. 58.
Карапетян В.Л., Степанова Е.В., Барышников А.Ю., Никогосян С.О., Кузнецов В.В. Экспрессия маркеров апоптоза (Р53, BCL-2, BAX) и их прогностическое значение при эпителиальных новообразованиях яичников ранних
стадий // Российский биотерапевтический журнал. – 2011. – Т. 10, № 2. – С. 45–9.
Короленкова Л.И., Степанова Е.В., Барышников А.Ю. Молекулярно-биологические маркеры пролиферации и
апоптоза, как факторы прогрессии цервикальных интраэпителиальных неоплазий и рака шейки матки // Российский биотерапевтический журнал. – 2010. – Т. 9, № 4. – С. 11–6.
Кохно А.В., Савченко В.Г., Паровичникова Е.Н. и др. Апоптоз и пролиферативная активность клеток костного
мозга у больных апластическими синдромами по данным трепанобиопсии // Терапевтический архив. – 2001. –
№ 7. – С. 51.
Тагиров О.Т., Кравченко Г.А., Козлов А.Ю. и др. Растворимый FAS(CD95) белок, ингибирующий апоптоз как
прогностический биомаркер течения рака молочной железы // Вестник Нижегородского университета им. Н.И.
Лобачевского. Серия: Биология. – 2001. – № 1. С. – 21–5.
Уткин О.В., Сахарнов Н.А., Преснякова Н.Б. и др. Экспрессия СD95/Fas в клетках крови при раке толстой кишки // Российский биотерапевтический журнал. – 2013. – Т. 12, № 1. – С. 23–9.
Adam D., Wiegmann K., Adam-Klages S. et al. A novel cytoplasmic domain of the p55 tumor necrosis factor receptor
initiates the neutral sphingomyelinase pathway // J. Biol. Chem. – 1996. – 271. – P. 14617–22.
Aggarwal B.B. Signalling pathways of the TNF superfamily: a double-edged sword // Nature Reviews Immunology. –
2003. – 3(9). – P. 745–56.
Baryshnikov A.Y., Zabotina T.N., Sedyakhina N.P. et al. The coexpression of cd34-antigen of early hemopoietic precursors and FAS/APO-1 (CD95)-antigen mediating apoptosis // Experimental Oncology. – 1994. – 16. – P. 343.
Black R.A., Rauch C.T., Kozlosky C.J. et al. A metalloproteinase disintegrin that releases tumour-necrosis factor-alpha
from cells // Nature. – 1997. – 385. – P. 729–33.
Blott E.J., Bossi G., Clark R. et al. Fas ligand is targeted to secretory lysosomes via a proline-rich domain in its cytoplasmic tail // J. Cell Sci. – 2001. – 114. – P. 2405–16.
Bodmer J.L., Burns K., Schneider P. et al. TRAMP, a novel apoptosis-mediating receptor with sequence homology to
tumor necrosis factor receptor 1 and Fas(Apo-1/CD95) // Immunity. – 1997. – 6. – P. 79–88.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
СТРУКТУРА И СВОЙСТВА ОСНОВНЫХ РЕЦЕПТОРОВ...
29
15. Bradley J.R. TNF-mediated inflammatory disease // J Pathol. – 2008. – 214(2). – P. 149–60.
16. Chakrabandhu K., Huault S., Garmy N. et al. The extracellular glycosphingolipid-binding motif of Fas defines its internalization route, mode and outcome of signals upon activation by ligand // Cell Death Differ. – 2008. – 15. – P. 1824–
37.
17. Cheng J., Liu C., Koopman W.J., Mountz J.D. Characterization of human Fas gene. Exon/intron organization and promoter region // J. Immunol. – 1995. – 154. – P. 1239–45.
18. Condorelli G., Vigliotta G., Cafieri A. PED/PEA-15: an anti-apoptotic molecule that regulates FAS/TNFR1-induced
apoptosis // Oncogene. – 1999. – 18(31). – P. 4409–15.
19. Dembic Z., Loetscher H., Gubler U. et al Two human TNF receptors have similar extracellular, but distinct intracellular,
domain sequences // Cytokine. – 1990. – 2. – P. 231–7.
20. Ea C.K., Deng L., Xia Z.P., Pineda G., Chen Z.J. Activation of IKK by TNFalpha requires site-specific ubiquitination of
RIP1 and polyubiquitin binding by NEMO // Mol. Cell. – 2006. – 22. – P. 245–57.
21. Edmond V., Dufour F., Poiroux G. et al. Downregulation of ceramide synthase-6 during epithelial-to-mesenchymal transition reduces plasma membrane fluidity and cancer cell motility // Oncogene. – 2014 doi: 10.1038/onc.2014.55. [Epub
ahead of print]
22. Falschlehner C., Ganten T.M., Koschny R. et al. TRAIL and other TRAIL receptor agonists as novel cancer therapeutics
// Adv. Exp. Med. Biol. – 2009. – 647. – P. 195–206.
23. Huang B., Eberstadt M., Olejniczak E.T. NMR structure and mutagenesis of the Fas (APO-1/CD95) death domain // Nature. – 1996. – 384(6610). – P. 638–41.
24. Irmler M., Thome M., Hahne M. Inhibition of death receptor signals by cellular FLIP // Nature. – 1997. – 388(6638). –
P. 190–5.
25. Janssen O., Qian J., Linkermann A., Kabelitz D. CD95 ligand - Death factor and costimulatory molecule? // Cell Death
Differ. – 2003. – 10. – P. 1215–25.
26. Ji W., Li Y., Wan T. et al. Both internalization and AIP1 association are required for tumor necrosis factor receptor 2mediated JNK signaling // Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. – 2012. – 32(9). – P. 2271–9.
27. Kelliher M.A., Grimm S., Ishida Y. The death domain kinase RIP mediates the TNF-induced NF-kappaB signal // Immunity. – 1998. – 8(3). – P. 297–303.
28. Kischkel F.C., Hellbardt S., Behrmann I. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a deathinducing signaling complex (DISC) with the receptor // EMBO J. – 1995. – 14(22). – P. 5579–88.
29. Kohlhaas S.L., Craxton A., Sun X.M. et al. Receptor-mediated endocytosis is not required for tumor necrosis factorrelated apoptosis-inducing ligand (TRAIL)-induced apoptosis // J. Biol. Chem. – 2007. – 282. – P. 12831–41.
30. LeBlanc H.N., Ashkenazi A. Apo2L/TRAIL and its death and decoy receptors // Cell Death Differ. – 2003. – 10(1). – P.
66–75.
31. Li H., Kobayashi M., Blonska M., You Y., Lin X. Ubiquitination of RIP is required for tumor necrosis factor alphainduced NF-kappaB activation // J. Biol. Chem. – 2006. – 281. – P. 13636–43.
32. Malleter M., Tauzin S., Bessede A. CD95L cell surface cleavage triggers a prometastatic signaling pathway in triplenegative breast cancer // Cancer Res. – 2013. – 73(22). – P. 6711–21.
33. Marsters S.A., Sheridan J.P., Donahue C.J. et al. Apo-3, a new member of the tumor necrosis factor receptor family,
contains a death domain and activates apoptosis and NF-kappa B // Curr. Biol. – 1996. – 6. – P. 1669–76.
34. McCarthy E.F. The Toxins of William B. Coley and the Treatment of Bone and Soft-Tissue Sarcomas // Iowa Orthop J.
– 2006. – 26. – P. 154–8.
35. Meylan F., Richard A.C., Siegel R.M. TL1A and DR3, a TNF family ligand-receptor pair that promotes lymphocyte
costimulation, mucosal hyperplasia, and autoimmune inflammation // Immunol Rev. – 2011. – 244(1). – P. 188–96.
36. Micheau O., Tschopp J. Induction of TNF receptor I-mediated apoptosis via two sequential signaling complexes. Cell. –
2003. – 114. – P. 181–90.
37. Migone T.S., Zhang J., Luo X. et al. TL1A is a TNF-like ligand for DR3 and TR6/DcR3 and functions as a T cell
costimulator // Immunity. – 2002. – 16. – P. 479–92.
38. Mitsiades N., Yu W.H., Poulaki V. et al. Matrix metalloproteinase-7-mediated cleavage of Fas ligand protects tumor
cells from chemotherapeutic drug cytotoxicity // Cancer Res. – 2001. – 61. – P. 577–81.
39. Moreno E., Yan M., Basler K. Evolution of TNF signaling mechanisms: JNK-dependent apoptosis triggered by Eiger,
the Drosophila homolog of the TNF superfamily // Curr Biol. – 2002. – 12(14). – P. 1263–8.
40. Old L.J. Tumor necrosis factor (TNF) // Science. – 1985. – 230(4726). – P. 630–2.
41. Pan G., O’Rourke K., Chinnaiyan A.M. et al. The receptor for the cytotoxic ligand TRAIL // Science. – 1997. – 276. –
P. 111–3.
42. Parlato S., Giammarioli A.M., Logozzi M. et al. CD95 (APO-1/Fas) linkage to the actin cytoskeleton through ezrin in
human T lymphocytes: A novel regulatory mechanism of the CD95 apoptotic pathway // EMBO J. – 2000. – 19. – P.
5123–34.
43. Peter M.E., Krammer P.H. The CD95(APO-1/Fas) DISC and beyond // Cell Death Differ. – 2003. – 10. – P. 26–35.
44. Polosukhina E.R., Baryshnikov A.Yu., Shishkin Yu.V. et al. Expression of antigen CD95(FAS/APO-1) mediating apoptosis in hemoblastoses using monoclonal antibodies ICO-160 // Гематология и трансфузиология. – 2000. – 45(4). – P.
3–6.
45. Ptisyna Y.S., Bornyakova L.A., Baryshnikov A.Y. et al. A soluble form of FAS/APO-1 (CD95) antigen in the serum of
viral hepatitis patients // International Journal on Immunorehabilitation. – 1999. – 14. – P. 110.
46. Rothe M., Sarma V., Dixit V.M., Goeddel D.V. TRAF2-Mediated activation of NFκB by TNF receptor 2 and CD40 //
Science. – 1995. – 269(5229). – P. 1424–7.
47. Sakahira H., Enari M., Nagata S. Cleavage of CAD inhibitor in CAD activation and DNA degradation during apoptosis
// Nature. – 1998. – 391(6662). – P. 96–9.
48. Sato T., Irie S., Kitada S., Reed J.C. FAP-1: a protein tyrosine phosphatase that associates with Fas // Science. – 1995. –
268(5209). – P. 411–5.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
30
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
СТРУКТУРА И СВОЙСТВА ОСНОВНЫХ РЕЦЕПТОРОВ...
49. Scaffidi C., Fulda S., Srinivasan A. Two CD95 (APO-1/Fas) signaling pathways // EMBO J. – 1998. – 17(6). – P. 1675–
87.
50. Schneider P., Bodmer J.L., Holler N. et al. Characterization of Fas (Apo-1, CD95)-Fas ligand interaction // J Biol Chem.
– 1997. – 272(30). – P. 18827–33.
51. Schneider-Brachert W., Tchikov V., Neumeyer J. et al. Compartmentalization of TNF receptor 1 signaling: Internalized
TNF receptosomes as death signaling vesicles // Immunity. – 2004. – 21. – P. 415–28.
52. Screaton G.R., Xu X.N., Olsen A.L. et al. LARD: A new lymphoid-specific death domain containing receptor regulated
by alternative pre-mRNA splicing // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1997. – 94. – P. 4615–9.
53. Suda T., Takahashi T., Golstein P., Nagata S. Molecular cloning and expression of the Fas ligand, a novel member of
the tumor necrosis factor family // Cell. – 1993. – 75(6). – P. 1169–78.
54. Takahashi T., Tanaka M., Inazawa J. et al. Human Fas ligand: Gene structure, chromosomal location and species specificity // Int. Immunol. – 1994. – 6. – P. 1567–74.
55. Tang G., Minemoto Y., Dibling B. et al. Inhibition of JNK activation through NF-kappaB target genes // Nature. – 2001.
– 414. – P. 313–7.
56. Tang P., Hung M.C., Klostergaard J. Human pro-tumor necrosis factor is a homotrimer // Biochemistry. – 1996. – 35. –
P. 8216–25.
57. Tartaglia L.A., Goeddel D.V., Reynolds C. et al. Stimulation of human T-cell proliferation by specific activation of the
75-kDa tumor necrosis factor receptor // Journal of Immunology. – 1993. – 151(9). – P. 4637–41.
58. Tartaglia L.A., Weber R.F., Figari I.S. et al. The two different receptors for tumor necrosis factor mediate distinct cellular responses // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. – 1991. – 88(20). –
P. 9292–6.
59. Trauth B.C., Klas C., Peters A.M. et al. Monoclonal antibody-mediated tumor regression by induction of apoptosis //
Science. – 1989. – 245(4915). – P. 301–5.
60. Wajant H., Pfizenmaier K., Scheurich P. Tumor necrosis factor signaling // Cell Death Differ. – 2003. – 10. – P. 45–65.
61. Walczak H., Degli-Esposti M.A., Johnson R.S. et al. TRAIL-R2: A novel apoptosis-mediating receptor for TRAIL //
EMBO J. – 1997. – 16. – P. 5386–97.
62. Wang L., Yang J.K., Kabaleeswaran V. et al. The Fas-FADD death domain complex structure reveals the basis of DISC
assembly and disease mutations // Nat Struct Mol Biol. – 2010. – 17(11). – P. 1324–9.
63. Wen L., Zhuang L., Luo X., Wei P. TL1A-induced NF-kappaB activation and c-IAP2 production prevent DR3-mediated
apoptosis in TF-1 cells // J. Biol. Chem. – 2003. – 278. – P. 39251–8.
64. Wiley S.R., Schooley K., Smolak P.J. et al. Identification and characterization of a new member of the TNF family that
induces apoptosis // Immunity. – 1995. – 3. – P. 673–82.
65. Yanagisawa J., Takahashi M., Kanki H. The molecular interaction of Fas and FAP-1. A tripeptide blocker of human Fas
interaction with FAP-1 promotes Fas-induced apoptosis // J Biol Chem. – 1997. – 272(13). – P. 8539–45.
66. Yin X.M. Signal transduction mediated by Bid, a pro-death Bcl-2 family proteins, connects the death receptor and mitochondria apoptosis pathways // Cell Res. – 2000. – 10(3). – P. 161–7.
67. Yonehara S., Ishii A., Yonehara M. A cell-killing monoclonal antibody (anti-Fas) to a cell surface antigen codownregulated with the receptor of tumor necrosis factor // J Exp Med. – 1989. – 169(5). – P. 1747–56.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ИММУНОГЕННЫЕ РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫЕ АНТИГЕНЫ…
П.В. Голышко1; 2, К.А. Барышников1, А.Ю.Барышников1
ИММУНОГЕННЫЕ РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫЕ АНТИГЕНЫ
И ИХ ГЕНЫ ПРИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЯХ
1
ФГБНУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина», Москва
2
ГКБ № 57, Москва
31
УДК 616-006.04-097:575.117.2
Контактная информация
Павел Викторович Голышко, заведующий 6 онкологическим отделением ГКБ № 57
адрес: 105077 Москва, 11-я Парковая ул. 32; тел. +7(495)305-23-05
e-mail: [email protected]
Статья поступила 18.03.2015, принята к печати 27.04.2015.
Резюме
Проведенный в обзоре литературы анализ экспрессии РТГ и РТА при злокачественных новообразованиях показал, что различные типы опухолей значительно отличаются друг от друга по частоте экспрессии мРНК
РТА. Меланома, рак яичников и рак легкого имеют очень высокую частоту экспрессии РТА. Лимфомы, рак
почки, рак поджелудочной железы имеют низкую частоту экспрессии РТА. Рак молочной железы, рак мочевого
пузыря, рак простаты демонстрируют промежуточный уровень экспрессии РТА. Опухоли с высокой степенью
злокачественности, поздней клинической стадией и наличием метастазов демонстрируют большую частоту
экспрессии генов РТА. Гены РТА экспрессируются в опухоли совместно. Если опухоль положительна по одному гену РТА, то не исключена экспрессия еще нескольких генов. Иммуногенные РТА являются хорошим объектом для создания противоопухолевых вакцин.
Ключевые слова: раково-тестикулярные антигены, раково-тестикулярные гены, злокачественные новообразования.
P.V. Golyshko1,2, K.A. Baryshnikov1, A.Yu. Baryshnikov1
IMMUNOGENIC CANCER-TESTIS ANTIGENS
AND THEIR GENES IN MALIGNANT TUMORS
1
FSBSI N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Moscow
2
Municipal Hospital № 57, Moscow
Abstract
The analysis of CTG and CTA expression in malignant tumors described in this review has been showed that
different types of tumors are significantly different from each other according to the frequency of CTA mRNA expression. Melanoma, ovarian cancer and lung cancer have a very high frequency of CTA expression. Lymphoma, kidney
cancer, pancreatic cancer have a low frequency of CTA expression. Breast cancer, bladder cancer, prostate cancer
demonstrate an intermediate level of CTA expression. High degree malignant tumors in late clinical stage with metastases showed a greater incidence of CTA -gene expression. CTA-genes are expressed together in tumor. If the tumor is
positive for one CTA-gene then the expression of several genes is possible. Immunogenic CTA-s are a well object for
anti-tumor vaccines creating.
Key words: cancer-testis antigens, cancer-testis genes, malignant tumors.
Введение
Одним из многообещающих методов лечения злокачественных новообразований является
иммунотерапия [3-10; 13-15; 17-19; 23; 25-33]. В
последние годы открыли большое количество опухолеспецифических антигенов, которые можно
разделить на 6 основных категорий:
1. РТА;
2. Дифференцировочные антигены;
3. Мутационные антигены;
4. Гиперэкспрессированные или амплифи№ 2/том 14/2015
цированные продукты генов;
5. Сплайсинговые варианты антигенов;
6. Вирусные антигены.
Среди них меланоцитов наиболее изучены и
используются при создании вакцин РТА и дифференцировочные антигены. РТА или, как их часто
называют cancer/testis antigen, кодируемые уникальными генами, преимущественно экспрессированы в человеческих герминальных клетках и отсутствуют в соматических тканях взрослого человека [19; 20]. Они становятся ненормально экспрессированы в различных опухолевых тканях. Белки
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
32
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ИММУНОГЕННЫЕ РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫЕ АНТИГЕНЫ…
РТА процессируются в пептиды с помощью протеосом и презентируются на клеточную поверхность
молекулами HLA и распознаются аутологичными
Т-лимфоцитами. РТА рассматриваются как потенциальные кандидаты для иммунотерапии рака, т.к.
они характеризуются высокой иммуногенностью.
К настоящему времени каталог РТГ содержит около 50 семейств, некоторые из которых
имеют несколько членов.
В литературе сообщалось о более чем 150
генах, кодирующих РТА [36]. Согласно особенностям локализации этих генов в человеческих хромосомах, выделяют группу Х-хромосомных и не-Ххромосомных или аутосомных РТГ [19; 20]. Примерно 30 членов семейства этих генов локализованы в Х-хромосоме. Гены, локализованные в Ххромосоме, называются СТ-Х генами. В отличие от
Х-хромосомных РТГ, аутосомные РТГ представлены в виде единственной копии и не образуют кластеров [20]. Аутосомные РТА являются менее иммуногенными по сравнению с Х-хромосомными
РТА. В связи с этим при вакцинотерапии рака основное внимание уделяется Х-хромосомным РТА.
Однако, несмотря на 20-летний период интенсивного изучения РТА, их биологическая функция остается до конца не ясной. В последнее время
появились доказательства того, что они могут обладать анти-апоптотическими свойствами, регулировать клеточную пролиферацию и адгезию в опухоли [38-40; 65; 66; 71; 93]. Гены РТА описаны в
обзорах В.А. Мисюрина [19; 20].
Среди всех РТА 19 индуцируют клеточный и
гуморальный иммунные ответы [55; 76-78]. Продукты РТА генов являются многообещающими
антигенами для развития Т-клеточного иммунного
ответа [22; 33; 37; 43].
Экспрессия РТА и РТГ при меланоме
Меланома является высоко иммуногенной
опухолью, на нее развивается спонтанный иммунный ответ и описаны случаи регрессии опухоли.
Одним из объяснений иммуногенности меланомы
является экспрессия в меланомных клетках большого спектра РТА и некоторых других антигенов,
таких как тирозиназа, Mart, gp100, SSX [16; 24; 64].
NY-ESO-1 и MAGE-A4 экспрессированы в 32-45 %
и 28 % меланом соответственно [54]. На меланомных клетках экспрессированы гены MAGE-1 и
MAGE-3. И.Н. Михайлова и соавт. изучали мРНК
13 генов РТА, 4 дифференцировочных гена меланоцитов и 14 генов маркеров меланомы в 26 образцах первичной меланомы человека [24]. Было показано, что экспрессия 13 РТГ позволяет разделить
всех пациентов на 3 группы: с низкой и высокой 5летней выживаемостью при высокой доле пациентов с метастазами и пациентов без признаков заболевания. Экспрессия выбранных для исследования
генов может использоваться как независимый фактор прогнозирования продолжительности жизни
пациента после хирургической операции и склонности к метастазированию с высокой специфичностью и чувствительностью.
№ 2/том 14/2015
РТГ экспрессированы в клеточных линиях
меланомы кожи человека [22]. Методом количественного ПЦР в реальном времени определяли экспрессию генов GAGE-1, MY-ESO-1, MAGE-A1,
PASD, SCP1, SEMG1, SPANXA, SSX1 и PRAME в
клеточных линиях mel P, mel Si, mel MTP, mel Il,
mel Hn, mel Kor, mel Ibr, полученных из образцов
опухолевого материала пациентов с метастатической меланомой.
Наиболее высокий уровень экспрессии в
большинстве исследованных клеточных линий обнаружен у генов GAGE-1, MY-ESO-1, MAGE-A1,
SCP1, SPANXA, SSX1 и PRAME. Таким образом,
продукты трансляции этих мРНК можно рассматривать в качестве перспективных кандидатов на
роль мишени для иммунотерапии.
Было проведено большое количество клинических протоколов по вакцинации больных меланомой, показавших развитие клеточного и гуморального иммунных ответов. Было убедительно
доказано, что вакцинотерапия больных меланомой
индуцирует CD4+ и CD8+ Т-клеточный иммунный
ответ [8; 13; 14; 23; 45; 56; 60; 70; 87].
Недавно L.von Boehmer и соавт. показали, что
при рецидиве меланомы у вакцинированных больных
исчезает NY-ESO-1 РТА с поверхности опухолевых
клеток [89]. В этом исследовании первичная опухоль
экспрессировала NY-ESO-1, MAGE-C1, Melan A.
Больных вакцинировали рекомбинантным пептидом
NY-ESO-1 c хорошими клиническими ответами. После иммунизации у больных развился гуморальный Ig
G ответ на пептид. Через несколько лет у некоторых
пациентов появились рецидивы. В образцах меланомы, полученных из метастазов, были экспрессироваы
MAGE-C1, Melan A, но не NS-ESO-1 антигены. У
умерших больных в меланоме также не обнаружили
NY-ESO-1. Авторы считают, что NY-ESO-1 исчез из
опухолевых клеток под действием иммунной системы, как следствие ухода опухоли от иммунологического надзора.
Это феномен ухода от иммунологического
надзора был продемонстрирован на ксентрансплантатах ММ. В трансплантированных опухолевых
клетках РТА NY-ESO-1 сохранился, точно так же,
как и β2-микроглобулин, но исчез HLA-A2 антиген,
которым были рестриктированы адоптивно введенные Т- клетки [61]. На эти опухоли Т-лимфоциты
не оказывали цитотоксическое действие, т.к. антиген представляется в комплексе с антигенами HLA.
Увеальная меланома и меланома конъюнктивы отличаются от меланомы кожи. Было проведено исследование экспрессии РТА при увеальной
меланоме и меланомы конъюнктивы [49].
Обнаружили, что увеальная и конъюнктиальная меланомы экспрессировали высокий уровень дифференцировочных антигенов, таких как
gp100, Melan A/MART1 и тирозиназу.
Однако по сравнению с другими опухолями, в частности – с меланомой кожи, они имели
очень низкий уровень СТА. Это должно настораживать при выборе иммунотерапии при увеальной меланоме.
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ИММУНОГЕННЫЕ РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫЕ АНТИГЕНЫ…
Колоректальный рак
Экспрессия РТА хорошо изучена при меланоме кожи у человека. Однако их экспрессия на
клетках КРР плохо охарактеризована [12; 34; 37; 73;
74]. Первое исследование РТГ при КРР появилось в
1996 г. M. Mon et al. изучали экспрессию мРНК
MAGE-1; -2; -3 у 54 больных КРР. Экспрессия
MAGE-1 была в 30 % случаев, MAGE-2 – в 28 % ,
MAGE-3 – в 20 % . Экспрессия мРНК РТГ была чаще у больных КРР с метастазами.
P. Alves et al. изучали экспрессию РТА у 41
больного первичным КРР и 14 пациентов с метастатическими поражениями печени [37]. Авторы определяли MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A10, NY-ESO1, SSX2. Эти РТА хорошо представляются HLA-A2
рестриктированными эпитопами. Не обнаружили
повышения экспрессии РТА в метастатических поражениях по сравнению с первичной опухолью. Гистологический анализ КРР показал высокую гетерогенность экспрессии РТА. Была продемонстрировано доказательство существования приобретенного
CD8+ Т-клеточного ответа на РТА у этих больных.
Результаты показали, что РТА реально индуцируют
иммунный ответ у больных КРР.
В другом исследовании D. Perez et al. изучали
корреляцию РТА с прогнозом заболевания у 35
больных КРР [73]. Ретроспективный анализ экспрессии РТА проводили иммуногистохимическим методом с помощью моноклональных антител
MA454/MAFGE-A1, M3H67/MAGE-A3, 57B/MAGEA4, CT7-33/MAGE-C1, E978/NY-ESО-1. В 14 (40 % )
опухолей обнаружили от 1 до 5 тестированных СТА,
14 % (5 из 35) были положительны по MAGE-A1,
MAGE-A3 или MAGE-A4, 26 % (9 из 35) положительно окрашивались антителами к MAGE-C1 и 20
% (7 из 35) были положительны для NY-ESO-1. Высокая статистически значимая корреляция была между экспрессией РТА и риском рецидива заболевания (71 % против 29 %; р=0, 027). В этом исследовании GIST высокого риска более часто экспрессировали РТА по сравнению с GIST низкого риска. В
GIST высокого риска антитела реагировали, по
крайней мере, с 1 РТА. Рецидивы в этих случаях
были положительны у всех 25 (100 %) больных. Это
было первое исследование РТА при GIST с оценкой
прогностической значимости экспрессии РТА. Авторы рекомендуют использовать окраску моноклональными антителами для индивидуальной оценки
прогноза заболевания.
H.M. Shamtha Kumara et al. исследовали экспрессию мРНК MAGE-A3, PLAC1, GAGE, CTAG2
у 82 больных КРР [81]. Кроме того, определяли в
крови антитела против РТА и иммуногистохимически тестировали РТА в образцах опухоли. Экспрессия MAGE-A3 была у 28 % больных и CTAG2 – у
17 %. PLAC1 был повышен у 12,8 % пациентов.
Гуморальные реакции против MAGE-A3 и PLAC1
обнаружили у 2,4 и 2,6 % больных соответственно.
Z. Chen et al. исследовали экспрессию 25
РТА в 288 образцах КРР и метастазах в печень [44].
Логическая регрессионная модель для предсказа№ 2/том 14/2015
33
ния метастазов в печень была основана на экспрессии PAGE4, вовлечении лимфатических узлов и
отсутствии эмболии в сосудах опухоли. Уровень
предсказания метастазирования в печень на основании этих маркеров был 86,9 % , что на 20 % превосходит предсказание классического метода, основанного только на вовлечении лимфатических
узлов и эмболии сосудов.
A. Dakshinamurthy и соавт. изучали частоту и
уровень экспрессии 16 РТГ Х-хромосомы у 34
больных КРР [47]. 12 РТГ в образцах опухолей не
определялись. Другие 4 РТГ показали низкую и
вариабельную экспрессию. Результаты подтвердили генетическую и этническую неоднородность
африканской популяции.
M. Li et al. изучали профиль экспрессии РТГ
у 121 больного КРР [63]. Результаты показал экспрессию мРНК РТГ, особенно NY-ESO-1 и LAGE-1
раке. Более 50 % больных экспрессировали по
крайней мере один РТГ. Частота экспрессии SCP-1
была 1,7 % , SSX-2 – 2,5 % , SSX-4 – 2,5 % , SSX-1
– 5,0 % , CT10 – 6,6 % , NY-ESO-1 – 9,9 % , MAGE1 – 11,6 % , LAGE-1 – 15,7 % , MAGE-4 – 22,3 % ,
MAGE-3 – 27,3 % . Окружающие опухоль ткани не
экспрессировали РТГ. Частота экспрессии MAGE-4
была выше в образцах опухоли с эмболией сосудов.
Предполагают, что экспрессия NY-ESO-1 может
быть маркером локального метастазирования и
прогрессирования заболевания.
П.В. Голышко и соавт. определяли мРНК 20
наименований РТА в образцах опухоли и периферической крови 98 больных КРР [12]. Среди них мРНК
6 наименований генов семейства MAGEA – MAGEA1, MAGE-A2, MAGE-A3 MAGE-A4, MAGE-A5,
MAGE-A6, определяемых одновременно с помощью
метода, позволяющего выявлять общую для всех
шести генов нуклеотидную последовательность
мРНК; мРНК восьми генов семейства GAGE
(GAGE1-8), также одновременно определяемых по
общей для всех нуклеотидной последовательности,
мРНК трех генов семейства SSX (SSX1, SSX2,
SSX4), мРНК генов XAGE1, NY-ESO-1 и мРНК гена
MAGE-C1. Обнаружено, что выявление мРНК раково-тестикулярных генов можно использовать в качестве мониторинговых тестов. Наличие в крови больного КРР мРНК генов MAGE-C1 и XAGE1 может
быть потенциальным маркером более благоприятного течения заболевания. В то же время мРНК
MAGE-A1-6 и SSX1; 2; 4 генов могут свидетельствовать о неблагоприятном прогнозе.
Немелкоклеточный рак легкого
НМКРЛ составляет 85 % всех опухолей легкого и быстро приводит к смерти больных. РТА
встречаются в 10–50 % НМКРЛ [57; 78; 82; 83].
Экспрессия РТГ ассоциирует с плохим прогнозом и
прогрессированием заболевания [57; 78; 90; 91].
Экспрессия NY-ESO-1 и, в меньшей степени,
MAGE-A3, ассоциируют с химиорезистентностью
НМКРЛ [57]. Ассоциация экспрессии РТА с химиорезистентностью наблюдается и при некоторых
других опухолях. Это объясняют тем, что РТА явРОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
34
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ИММУНОГЕННЫЕ РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫЕ АНТИГЕНЫ…
ляются маркерами более примитивных, «стволовоподобных» клеток [52; 57; 83; 85]. Экспрессия NYESO-1 предсказывает хороший ответ на неоадъювантную химиотерапию [57].
M. Gjerstorm et al. провели системное исследование экспрессии РТА у больных НМКРЛ [53].
Определяли экспрессию GAGE, NY-ESO-1 и SP17 в
ранней стадии НМКРЛ. SP17 – это аутосомальный
PТГ. Он характеризуется низкой экспрессией в
яичках и экспрессирован только на последних стадиях сперматогенеза. Авторы показали, что GAGE
и NY-ESO-1 не экспрессированы в нормальной
ткани легкого, хотя SP17 был найден в легочном
эпителии. Частота экспрессии GAGE, NY-ESO-1 и
SP17 была 26 % (44 из 169); 11,8 % (20 из 169); 4,7
% (8 из 169) соответственно. 33,1 % опухолей экспрессировал хотя бы один РТА. Экспрессия этих
РТА не различалась в различных гистологических
типах опухолей (аденокарцинома или плоскоклеточный рак). Однако GАGE более сильно экспрессирован при плоскоклеточной карциноме. Более
того, частота экспрессии GAGE была более высокой при II и III стадиях по сравнению с I.
Исследование прогностической значимости
РТГ у 523 больных НМКРЛ показало, что экспрессия NY-ESO-1и MEGE-A3 ассоциировала с плохим
прогнозом [46].
Вакцинация больных НМКРЛ показала многообещающие результаты [75]. Адоптивное введение больным НМКРЛ аллогенных лимфоцитов,
экспрессирующих рекомбинантные Т-клеточные
рецепторы, распознающее РТА NY-ESO-1 и
MAGE-A3, эффективно убивало опухолевые клетки
НМКРЛ [75]. Это показывает, что иммунотерапия
может быть эффективной для НМКРЛ. Другими
авторами также убедительно доказано, что вакцинотерапия НМКРЛ индуцирует CD4+ и CD8+ Тклеточный иммунный ответ [45; 56; 70; 79; 80; 87].
На ESMO 2014 было представлено двойное
слепое, рандомизированное, плацебо-контролируемое
изучение в рамках III фазы исследования рекомбинантной вакцины recMAGE-A3 у больных с удаленным НМКРЛ. Из 13 849 больных НМКРЛ 4 210 были
положительны по MAGE-A3 в опухолевых образцах.
2 272 пациента были включены в рандомизированное
исследование. Результаты показали, что адъювантная
терапия НМКРЛ вакциной recMAGE-A3 не превосходит результаты плацебо, т.е. она не эффективна.
Рак молочной железы
На клетках РМЖ экспрессированы РТА NYESO-1, MAGE-1, MAG-3 и др. NY-ESO-1 является
наиболее перспективным кандидатом для иммунотерапии в связи с его высокой иммуногенностью. У
РТА-положительных больных появляется гуморальный и клеточный иммунные ответы на NYESO-1. F. Ademuyiwa et al изучали экспрессию этого РТА в образцах опухолей от триждынегативного РМЖ [35]. Экспрессию РТА определяли иммуногистохимическим методом с помощью
моноклональных антител. Было исследовано 168
образцов ТНР и 47 ER+/HER2– первичного РМЖ.
№ 2/том 14/2015
Также определяли корреляцию между экспрессией
РТА и CD8+ Т-лимфоцитами. РTA NY-ESO-1 был
экспрессирован в 16 % случаев ТНР по сравнению
с 2 % ER+/HER2–. Высокая экспрессия РТА коррелировала с молодым возрастом пациенток. В сыворотке крови 73 % больных ТНР обнаружили антитела против РТА NY-ESO-1. У негативных больных
было высокое содержание CD8+ Т-лимфоцитов.
Таким образом, NY-ESO-1 является высоко иммуногенным у трижды негативных больных раком
молочной железы и на РТА вырабатывается гуморальный и Т-клеточный иммунный ответ.
Рак предстательной железы
РТА SPANX ассоциирован с раком предстательной железы. Он встречается в 40 % случаев в
нормальной и опухолевой ткани простаты. Однако
в нормальной ткани он локализован в ядре, а в опухолевой – в ядре и цитоплазме [76]. Экспрессия
NY-ESO-1 обнаружена в 10 % случаев рака предстательной железы [67]. Этот РТА отсутствует при
доброкачественной гиперплазии предстательной
железы. Экспрессия NY-ESO-1 появляется на поздних стадиях рака предстательной железы [50]. I
фаза клинических испытаний вакцинации NY-ESP1 при гормоно-резистентном раке предстательной
железы показала индукцию антител против NYESO-1 и CD4+ и CD8+ Т-клеточный ответ [51; 60;
87]. Похожие результаты были получены при вакцинации больных метастатическим раком простаты
рекомбинантным NY-ESO-1 смешанным с адъювантом C [59].
Высокая экспрессия NY-ESO-1 является
маркером при гормонозависимым раком предстательной железы, хотя значимость этого маркера
небольшая и не зависит от гистологических вариантов. Однако сообщалось, что экспрессия некоторых РТА ассоциирована с кастрата-резистентным
раком простаты [84].
Рак мочевого пузыря
У больных раком мочевого пузыря РТА NYESO-1 и MAGE-A4 экспрессированы в 18–35 и 33
% случаев соответственно [41; 54]. Dyrskiat L. et al.
изучали экспрессию РТГ MAGE-A3, NY-ESO-1
(CTAG1B) [48], LAGE-1 (CTAG2) и PRAME в опухоли от 350 больных раком мочевого пузыря. Обнаружили, что MAGE-A3 был экспрессирован гораздо чаще, чем другие РТГ. Экспрессия РТГ ассоциировалась с высокой стадией заболевания. Экспрессия LAGE-1 коррелировала с плохим прогнозом у больных с не мышечным инвазивным раком
мочевого пузыря. Экспрессия PRAME указывала на
плохой ответ на химиотерапию. Похожие результаты получили другие авторы, показавшие что
MAGE-A4 и MAGE-A9 ассоциированы с коротким
безрецидивным периодом [42].
Синовиальная саркома
Иммуногистохимическим методом исследовали экспрессию РТА NY-ESO-1 (CTAG 1B) в образцах от 50 больных синовиальной саркомой, 155
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ИММУНОГЕННЫЕ РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫЕ АНТИГЕНЫ…
GIST, 135 других веретеноклеточных сарком и 77
иных сарком [62]. 76 % синовиальных сарком экспрессировали NY-ESO-1. В противоположность,
только в редких случаях другие веретеноклеточные
мезенхимальные опухоли экспрессировали этот
РРТ (2 из 155 GIST). При лейомиосаркоме и шваноме экспрессия антигена отсутствовала. Предполагают, что экспрессия NY-ESO-1 может быть использована для дифференциальной диагностики
синовиальной саркомы от других веретеноклеточных сарком, а также для отбора пациентов для таргетной терапии.
Имеется еще сообщение об экспрессии NYESO-1 в GIST. Perez et al. обнаружили экспрессию в
7 (20 % ) из 35 опухолей [73]. Позже эта группа
авторов сообщила о прогрессии NY-ESO-1+, несмотря на лечение иматинибом [74].
Глиома
Идентификация хорошо охарактеризованных
глиома-специфичных антигенов является необходимым шагом для иммунотерапии мультиформной
глиобластомы. В этой опухоли обнаружили экспрессию MAGE-3 в 22 %; MAGЕ-1 в 16 %; CT7 в
11 %; gp100 в 40 %; TRP-2 – в 29 % случаев [86].
Среди первичных клеточных линий глиомы обнаружили экспрессию СТ10 в 38 %; gp100 в 40 %;
TRP-2 в 31 %; NY-ESO-1 в 12 %. TRP-2 и gp100 в
менингиоме в 65 и 38 % случаев соответственно.
Предполагают, что MAGE1, MAGE-3 и gp100 могут быть мишенями для иммунотерапии.
Множественная миелома
Множественная миелома является излюбленной мишенью для изучения РТГ и РТА. Экспрессию РТА обнаружили во многих клеточных
линиях и образцах опухолей от больных прогрессирующей ММ [1; 2; 11; 38; 39; 58; 80; 88]. Y.
Zhang et al. изучали экспрессию 4 РТА у больных
ММ. MAGE-C1/CT7, MAGE-A3, MAGE-C2/CT10,
SSX-2 наиболее часто экспрессировались у больных ММ [92]. Позитивная экспрессия РТА, количество коэкспрессирующих РТА, уровень экспрессии
ассоциировали с клиническим течением заболевания. РТА могут служить для диагностики ММ и
мониторинга заболевания.
Т-клеточный острый
лимфобластый лейкоз взрослых
Т-клеточный острый лимфобластый лейкоз
взрослых – гематологическое злокачественное заболевание,
вызываемое
человеческим
Тлимфотропным вирусом 1 типа, которым инфицировано около 20 миллионов людей во всем мире.
H.Nishikawa et al. исследовали экспрессию мРНК
РТГ у 57 больных ОЛЛВ. РТГ были экспрессиро-
35
ваны в 87,8 % случаев [69]. мРНК NY-ESO-1 был
экспрессирован в 61,4 % случаев, MAGE-A3 – в
31,6 % , MAGE-A4 – в 61,4 % . Экспрессия РТА
была подтверждена иммуногистохимическим методом. Эти результаты контрастируют с экспрессией РТГ при лейкозах и лимфомах, при которых
экспрессия РТГ гораздо реже. Гуморальный иммунный ответ против NY-ESO-1 был обнаружен у
11,6 % больных ОЛЛВ. Т-клеточный CD8+ иммунный ответ против NY-ESO-1 был обнаружен у 5
(55,6 % ) из 9 больных ОЛЛВ. Авторы предположили, что больных ОЛЛВ можно вакцинировать
вакцинами на основе РТА.
Лимфоидные лейкозы и лимфомы
РТА экспрессированы на лейкозных клетках
при острых и хронических лейкозах, лимфоме
Ходжкина и неходжкинских лимфомах, а также на
клеточных линиях, происшедших из этих клеток
[21]. F. Neumann et al. исследовали экспрессию
мРНК 12 РТГ на 20 клеточных линиях и обнаружили, что мРНК SSX4 была в 50 % линий, GAGE – в
45 % , SSX1 – 40 % , MAGE-A3 и SSX2 в 25 % б
SCP1, HOMTES-85, MAGE-C1, MAGE-C2 – 15 % .
NY-ESO-1 и MAGE-A4 были найдены в 1 из 20
линий. мРНК BORIS отсутствовали во всех линиях.
15 из 20 линий экспрессировали мРНК одного РТА,
9 линий – 2 РТА и 7 линий – больше 4 РТА [68].
Экспрессия мРНК РТГ не коррелировала с культуральными характеристиками клеточных линий,
анеуплоидией, теламеразной активностью и пролиферативным статусом [68].
Заключение
Приведенный выше анализ экспрессии РТГ и
РТА в опухолях различных типов показал, что:
 Они значительно отличаются друг от
друга по частоте экспрессии мРНК РТА.
Меланома, рак яичников, рак легкого
имеют очень высокую частоту экспрессии РТА. Лимфомы, рак почки, рак поджелудочной железы имеют низкую частоту экспрессии РТА. Рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак простаты
демонстрируют промежуточный уровень
экспрессии РТА.
 Опухоли с высокой степенью злокачественности, поздней клинической стадией
и наличием метастазов демонстрируют
большую частоту экспрессии генов РТА.
 Гены РТА экспрессируются в опухоли
совместно. Если опухоль положительна
по одному гену РТА, то не исключена
экспрессия еще нескольких генов.
Литература
1.
2.
Абраменко И.В., Белоус Н.И., Крячок И.А. и др. Экспрессия гена PRAME при множественной миеломе // Терапевтический архив. – 2004. – 76. – С. 77–81.
Абраменко И.В., Белоус Н.И., Мисюрин А.В. и др. Экспрессия гена PRAME при миеломной болезни // Терапевтический
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
36
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ИММУНОГЕННЫЕ РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫЕ АНТИГЕНЫ…
архив. – 2004. – 7. – С. 35.
Афанасьева Д.А., Барышникова М.А., Щербаков А.И. и др. Разработка модели противоопухолевой липосомальной вакцины // Иммунология. – 2014. – №6. – 317–21.
Афанасьева Д.А., Барышникова М.А., Соколова З.А., Косоруков В.С. Разработка липосомальной конструкции, содержащей лизат опухолевых клеток // Российский биотерапевтический журнал. – 2013. – Т. 12, № 2. – С. 5.
Барышников А.Ю. Взаимодействие опухоли и иммунной системы организма // Практическая онкология. – 2003. – Т. 4,
№3. – С. 127–30.
Барышников А.Ю. Принципы и практика вакцинотерапии рака // Бюллетень Сибирского отделения РАМН. – 2004. – №
2. – С. 59–63.
Барышников А.Ю., Барышникова М.А. Иммунолипосомы и мишени их действия // Российский химический журнал.
Журнал Российского химического общества им. Д.И.Менделеева. – 2012. – Т.LVI, № 3-4. – C. 60–7.
Барышников А.Ю., Голубцова Н.В., Бурова О.С. и др. Экспрессия антигена CD44 у больных метастатической меланомой кожи // Российский биотерапевтический журнал. – 2013. – T. 12, № 4. – С. 17–20.
Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Михайлова И.Н., Петенко Н.Н. Современные проблемы биотерапии опухолей //
Вестник Московского Онкологического Общества. – 2008. – № 1. – С. 6–10.
Бережной А.Е., Сапрыкина Н.С., Козлов А.М. и др. Изучение противоопухолевой активности вакцин на основе генетически модифицированных опухолевых клеток, секретирующих ГМ-КСФ // Российский биотерапевтический журнал. –
2006. – Т. 5, № 4. – С. 47–53.
Гапонова Т.В., Менделеева Н.П., Мисюрин А.В. и др. Экспрессия опухолеассоциированных генов PRAME/ WT1 и XIAP
у больных множественной миеломой // Онкогематология. – 2009. – № 2. – С. 59–63.
Голышко П.В., Новиков Д.В., Ананьев С.В. и др. Раково-тестикулярные гены в крови и опухоли больных колоректальным раком // Российский биотерапевтический журнал. – 2015. – Т. 14, №1. – С. 19–24.
Голубцова Н.В., Михайлова И.Н., Новиков В.В. и др. Изменение сывороточного содержания растворимых молекул HLA
I класса, антигена CD8 и растворимых комплексов HLA-1/CD8 у больных диссеминированной меланомой в процессе
вакцинотерапии // Российский биотерапевтический журнал. – 2010. – Т. 9, № 3. – С. 41–5.
Голубцова Н.В., Степанова Е.В., Бармашов А.В. и др. Определение специфических противоопухолевых антител у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии // Российский биотерапевтический журнал. – 2012. – Т.
11, № 3. – С. 25–28.
Дюкалова М.Б. Противоопухолевые вакцины на основе опухолевых клеток и их производных // Российский биотерапевтический журнал. – 2012. – Т. 11. – № 4. – С. 3–8.
Ковалевский Д.А., Михайлова И.Н., Вишневская Я.В и др. Экспрессия генов раково-тестикулярных антигенов в первичной меланоме кожи человека // Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. – 2011. – Т. 21, № 2. – С. 52–65.
Манина И.В., Перетолчина Н.М., Сапрыкина Н.С. и др. Доклинические исследования иммунотерапии меланомы кожи с
помощью цельноклеточных противоопухолевых вакцин, секретирующих GM-CSF // Российский биотерапевтический
журнал. – 2010. – Т. 9, № 3. – С. 47–50.
Манина И.В., Сапрыкина Н.М., Козлов А. М. и др. Повышение эффективности цельноклеточной GM-CSF секретирующей противоопухолевой вакцины путем преинкубации с цитокинами // Российский биотерапевтический журнал. –
2011. – Т. 10, № 3. – С. 61–6.
Мисюрин В.А. Х-хромосомные раково-тестикулярные гены // Российский биотерапевтический журнал. – 2014. – Т. 13,
№ 2. – С. 3–9.
Мисюрин В.А. Аутосомные раково-тестикулярные гены // Российский биотехнологический журнал. – 2014. – Т. 13, № 3.
– С. 77–82.
Мисюрин В.А., Лукина А.Е., Мисюрин А.В. и др. Особенности соотношения уровней экспрессии генов PRAME и
PML/RARA в дебюте острого промиелоцитарного лейкоза // Российский биотерапевтический журнал. – 2014. – Т. 13,
№1. – С. 9–16.
Мисюрин В.А., Мисюрин А.В., Лукина А.А. и др. Профили экспрессии раково-тестикулярных антигенов в клеточных
линиях меланомы // Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии. – 2014. – Т. 31, № 2. – С.
104.
Михайлова И.Н., Барышников К.А., Бурова О.С. и др. Первая фаза клинических испытаний противоопухолевой генномодифицированной вакцины. Оценка иммунного статуса // Российский биотерапевтический журнал. – 2006. – Т. 5, №3.
– С. 51–4.
Михайлова И.Н., Ковалевский Д.А., Бурова О.С. и др. Экспрессия раково-тестируемых антигенов в клетках меланомы
человека // Сибирский онкологический журнал. – 2010. – Т. 37, № 1. – С. 29–39.
Михайлова И.Н., Лукашина М.И., Барышников А.Ю. и др. Клеточные линии меланомы – основа для создания противоопухолевых вакцин // Вестник РАМН. – 2005. – № 7. – С. 37–40.
Михайлова И.Н., Петенко Н.Н., Чкадуа Г.З. и др. Вакцинотерапия метастатической меланомы с использованием дендритных клеток: клиническое исследование I/II фазы // Российский биотерапевтический журнал. – 2007. – Т. 6, № 2. – С.
39–45.
Михайлова И.Н., Петенко Н.Н., Шубина И.Ж., и др. Иммунорегуляторные CD4+CD25+ Т-клетки у больных диссеминированной меланомой на фоне химиотерапии // Иммунология. – 2010. – Т. 31, № 3. – С. 143–6.
Михайлова Т.В, Барышникова М.А., Клименко О.В. и др. Разработка липосомальной формы противоопухолевой вакцины // Российский биотерапевтический журнал. – 2011. – Т. 10, № 4. – С. 62–6.
Михайлова Т.В., Барышникова М.А., Багирова Н.С. и др. Стерилизация многослойных протеолипосом // Российский
биотерапевтический журнал. – 2012. – Т. 11, № 1. – С. 13–8.
Михайлова Т.В., Барышникова М.А., Бурова О.С. и др. Сравнение уровня экспрессии HSP70 на клеточных линиях меланомы // Российский биотерапевтический журнал. – 2010. – Т. 9, № 1. – С. 43–8.
Никитин К.Д., Рубцова М.А., Утяшев И.А., Барышников А.Ю. Противоопухолевые вакцины на основе дендридом //
Российский онкологический журнал. – 2010. – №2. – С. 48–53.
Никитин К.Д., Барышников А.Ю. Противоопухолевые вакцины на основе белков теплового шока // Российский биоте№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ИММУНОГЕННЫЕ РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫЕ АНТИГЕНЫ…
37
рапевтический журнал. – 2007. – Т. 6, № 2. – С. 3–12.
33. Чкадуа Г.З., Заботина Т.Н., Буркова А.А. и др. Адаптирование методики культивирования дендритных клеток человека
из моноцитов периферической крови для клинического применения // Российский биотерапевтический журнал. – 2002.
– Т. 1, № 3. – С. 55–61.
34. Шумилова С.В., Перенков А.Д., Сахарнов Н.А. и др. Особенности экспрессии генов дифференцировочных молекул в
клеточных линиях, полученных от больных раком толстого кишечника // Вестник Нижегородского Университета им.
Н.И. Лобачевского. – 2012. – № 2-3. – С. 241–5.
35. Ademuyiwa F.O., Bshara W., Attwood K. et al. NY-ESO-1 cancer testis antigen demonstrates high immunogenity in triple negative breast cancer // PLoS One. – 2012. – 7(6). – e38783.
36. Almeida L.G., Sakade N.J., deOliveira A.R. et al. CTdatabase: a knowledge-base of high-through pup and curated data on cancer-testis antigens// Nucleic Acids Res. – 2009. – 37. – D81609.
37. Alves P.M.S., Levy N., Bouzourene H. et al. Molecular and immunological evaluation of the expression of cancer/testis gene
products in human colorectal cancer // Cancer Immunology, Immunotherapy. – 2007. – 56(6). – P. 839–47.
38. Atanackovick D., Luetrens T., Hildebrand Y. et al. Longituding analysis and prognostic effect of cancer-testis antigen expression
in multiple myeloma // Clin Cancer Res. – 2009. – 15. – P. 1343–52.
39. Atanackovick D., Hildebrand Y., Jadczak A. et al. Cancer-testis antigen MAGE-C1/CT7 and MAGE-A3 promote the survival of
mulpiple myeloma cells // Haematologica. – 2010. – 95(5). – P.785–9.
40. Bai S., He B., Wiston E.M. Melanoma antigen gene protein MAGE-11 regulates androgen receptor function by modulating the
intrerdomain interaction // Mol Cel Biol. – 2005. – 25. – P. 1238–57.
41. Barrow C., Browning J., MacGregor D. et al. Tumor antigen expression in melanoma varies according to antigen and stage //
Clin Cancer Res. – 2006. – 12(3). – P. 764–71.
42. Bergeron A., Picard V., LaRue H. et al. High frequency of MAGE-A4 and MAGE-A9 expression in high-risk bladder cancer //
Int J Cancer. – 2009. – 125(6). – P. 1365–71.
43. Cabalero O.L., Chen Y.T. Cancer/tests (CT) antigens: potential targets for immunotherapy // Cancer Sci. – 2009. – 100(11). – P.
2014–21.
44. Сhen Z., Yuan Y., Wang Q. et al. Cancer/testis antigens and clinical risk factors for liver metastasis of colorectal cancer: a predictive panel // J Colon Rectum. – 2010. – 53(1). – P. 31–8.
45. Coulie P.G., Karanikas V., Lurquin C. et al. b T-cell responses of cancer patients vaccinated with a MAGE antigen // Immunol.
Rev. – 2002. – 188. – P. 33–42.
46. Cure A.Q., Chua R., Williamson B. et al. Cancer-testis antigen are coordinately expressed and are markets of poor outcome in
non-small cell lung cancer // Clin. Cancer Res. – 2005. – 11(22). – P. 8055–62.
47. Dakshinamurthy A.G., Ramesar R., Goldberg P., Blackburm J.M. Infrequent and low expression of cancer-testis antigens located on the X chromosome in colorectal cancer: implications for immunotherapy in South African populations // Biotechnol J.
– 2008. – 3(11). – P. 1417–23.
48. Dyrskjat L., Zeiger K., Lildal T.K. et al. Expression of MAGE-A3, NY-ESO-1, LAGE-1 and PRAME in urotheelial carcinoma
// Brit L Cancer. – 2012. – 107. – P. 116–22.
49. Emington J.A., Conway R.M., Wash-Conwey N. et al. Expression of cancer-testis antigens (MAGE-A1, MAGE-A3/6, MAGEA4, MAGE-C1 and NY-ESO-1) in primary human uveal and conjunctiveal melanoma // Brit J Ophtalmologi. – 2012. – 96. – P.
451.
50. Fossa A., Berner A., Fossa S.D. et al. NY-ESO-1 expression and humoral immune responses in prostate cancer // Prostate. –
2004. – 59(4). – P. 440–7.
51. Gatti A., Lajmi N., Derouche A. et al. NY-ESO-1 espression and immunogenicty in prostata cancer patiebts // Turus Med. –
2011. – 89(10). – P. 779–83.
52. Gedye C., Quirk J., Browning J. et al. Cancer/testis antigen can be immunological targets in clonogenic CD133+ melanoma
cells // Cancer Immunol Immunother. – 2009. – 58. – P. 163–164.
53. Gjerstorff M.F., Pohi M., Olsen K., Ditzel H. Analysis of GAGE, Y-ESO-1 and SP17 cancer/testis antigen expression in early
stage non-small cell lung carcinoma // BMC Cancer. – 2013. – 13. – P. 466.
54. Gnjatic S., Nishikawa H., Jungbluth A.A. et al. NY-ESO-1: review of an immunogenic tumor antigen // Adv Cancer Res. –
2008. – 95. – P. 1–30.
55. Hofmann O., Cabalero O.L., Stevenson B.J. et al. Year 2008: Genome-wide analysis of cancer/testis gene expression // Proc
Natl Acad Sci USA. – 2008. – 105. – P. 20422 – 20427.
56. Jager E., Gnjatic S., Nagata Y. et al. Induction of primary NY-ESO-1 immunity: CD8+ T-lymphocyte and antibody responses
in peptide-vaccinated patients with NY-ESO-1 + cancers // PNAS. – 2000. – 97. – P. 4760.
57. John T., Caballero O.L., Svobodova S.J. et al. ECSA/DPP2 is an embrio-cancer antigen tat is coexpressed with cancer-testis
antigens in non-small cell lung cancer // Clin Cancer Res. – 2008. – 14. – P. 3291–8.
58. Jungbluth A.A., Ely S., DiLiberto M. et al. The cancer/testis antigens CT7 (MAGE-C1) and MAGE-A3/6 are commonly expressed in multiple myeloma and correlate with plasma-cell proliferation // Blood. – 2005. – 106. – P. 167–74.
59. Karbach L., Neumann A., Atmaka A. et al. Efficient in vivo priming by vaccination with recombinant NY-ESO-1 protein and
CpG in antigen naïve prostate cancer patients // Clin Cancer Res. – 2011. – 17(4). – P. 861–70.
60. Kawabata R., Wada H., Isobe M. et al. Antibody response against NY-ESO-1 in CHP-NY-ESO-1 vaccinated patients // Int J
Cancer. – 2007. – 120. – P. 2178–80.
61. Klippel Z.K., Chou J., Towlerton A.M. et al. Immune escape from NY-ESO-1-specific T-cell therapy via loss of heterozygosity
in the MHC // Gene Therapy. – 2014. – 21. – P. 337–42.
62. Lai J.P., Robbins P.F., Raffeld M. et al. NY-ESO-1 expression in synovival sarco,a and other mesenchymal tumors: significance
for NY-ESO-1based target therapy and differential diagnosis // Modern Pathol. – 2012. – 25. – P. 854–8.
63. Li M., Yuan Y.H., Han Y. et al. Expression profile of cancer-testis genes in 121 human colorectal cancer tissue and adjacent
normal tissue // Clin Cancer Res. – 2005. -11(5). – P. 1809–14.
64. Michailova I.N., Morozova L.Ph., Golubeva V.A. et al. Cancer/testis genes expression in human melanoma cell lines // Melanoma Research. – 2008. – № 5. – Р. 303–13.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
38
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ИММУНОГЕННЫЕ РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫЕ АНТИГЕНЫ…
65. Monte M., Simonatto M., Peche L.Y. et al. MAGE-A tumor antigens target p53 transactivation function through histone deacetylase
recruitment and confer resistance to chemotherapeutic agents // Pro Natl Acad Sci USA. – 2006. – 193. – P. 11160–5.
66. Nagao T., Higashitsuji H., Nogiochi K. et al MAGE-A4 interacts with the liver oncoprotein gakyrin and suppressed its tumorogenity activity // J Biol Chem. – 2003. – 278. – P. 10668–73.
67. Nakada T., Noguchi Y., Satoh S. et al NY-ESO-1 mRNA expression and immunogenicity in advanced prostate cancer // Cancer
Immun. – 2003. – 3. – P. 10.
68. Neuman F., Kaddu-Milindwa D., Widmann T. et al. EBV-transformed lymphoblastoid cell lines as vaccines against cancer testis
antigen-positive tumors // Cancer Immunol Immunother.- 2013. – 62(7). – P. 1211–22.
69. Nishikawa H., Maeda Y., Ishida T. et al. Cancer/testis antigens are novel targets of immunotherapy for adult T-cell leukemia/lymphoma // Blood. – 2012. – 119(13). – P. 3097–104.
70. Odusi K.,Qian F., Matsuzuki J. et al. Vaccination with an NY-ESO-1 peptide of HLA class I/II specofocaties induces integrated
humoral and T cell responses in ovarian cancer // Proc Batl Acad Sci USA. – 2007. – 194. – P. 12837–42.
71. Peikert T., Specks U., Farver C. et al. Melanoma antigen A4 is expressed in non-small cell lung cancers and promotes apoptosis
// Cancer Res. – 2006. – 66. – P. 693–700.
72. Peled N., Oton A.B., Hirsch F.R, Bunn P. MAGE-A3 antigen-specific cancer immunotherapeutic // Immunother. – 2009. – 1(1).
– P. 19–25.
73. Perez D., Hermann T., Jungbluth A.A. et al. Cancer testis antigen expression in gastrointestinal stromal tumors: new markers for
early recurrence // Int J Cancer. – 2008. – 123(7). – P. 1551–5.
74. Perez D., Hauswirth F., Jager D. et al. Protein expression of cancer testis antigens predicts tumor recurrence and treatment
response to imatinib in gastrointestinal stroma tumors // Int J Cancer. – 2011. – 128(12). – P. 2947–52.
75. Rao M., Chinnsanny N., Hong J.A. et al. Inhibition of histone lysine methylation enhances cancer testis antigen expression in
lung cancer cell: implication for adoptive immunotherapy of cancer // Cancer Res. – 2009. – 2011. – 71(12). – P. 4192–204.
76. Salemi M., Calogero A.E., Zaccarelo G. et al. Expression of SPANX proteins in normal prostate tissue and in prostate cancer //
Eur. J. Histochem. – 2010. – 54. – e41.
77. Scanlan M.J., Gure A.O., Jungbluth A.A. et al. Cancer/testis antigens: an expanding family of targets for cancer immunotherapy
// Immunol Rev. – 2002. – 188. – P. 22–32.
78. Scanlan M.J., Sipson A.J. Old L.J. The cancer/testis antigen: review, standartization and commentary // Cancer Immunol. –
2004. – 4. – P.1.
79. Scanlan M.J., Altorki N.K., Gure A.O. et al. Expression of cancer/testis antigens in lung cancer: definition of bromodominant
testis-specific gene IBRDT as new CT gene, CT9 // Cancer Let. – 2000. – 150. – P. 155–64.
80. Schubert P.C., Jakka G., Jennsen S.M. et al. Effector memory and central memory NY0ESO-1-specific re-directed T cells for
treatment of multiple myeloma // Gene Therapy. – 2013. – 20. – P. 386–95.
81. Shantha Kumara H.M., Grieco M.J., Caballero O.L. et al. MAGE-A3 is highly expressed in a subset of colorectal cancer patients // Cancer immun. – 2012. – 12. – P. 16.
82. Shigematsu Y., Hanagiri T., Shiota H. et al. Clinical significance of cancer/testis antigens expression in patients with non-small
cell lung cancer // Lung Cancer. – 2010. – 68. – P. 105–10.
83. Simpson A.J., Cabollero O.L., Jungdluth A. et al. Cancer/testis antigen, gametogenesis and cancer // Nat Rev Cancer. – 2005. –
5. – P. 616–25.
84. Suyama T., Shirashi T., Zeng Y. et al. Expression of cancer/testis antigen in prostate cancer is associated with disease progression // Prostate. – 2010. – 70(17). – P. 1778–87.
85. Suzuki T., Yoshida K., Wada Y. et al Melanoma-associated antigen-A1 expression predicts resistance to docetaxel and paclitaxel
in advanced and recurrent gastric cancer // Oncol Rep. – 2007. – 18. – P. 329–36.
86. Syed O.N., Mandigo C.E., Killory B.D. et al. Cancer-testis and melanocyte-differntiation antigen expression in malignant glioma
and meningioma // J Clin Neuroscience. – 2012. – 19. – P. 1016–21.
87. Uenaka A., Wada H., Isobe M. et al. T cell immunomonitoring and tumor responses in patients immunized with a complex of
cholesterol-bearing hydrophobized pollulan (CHP) and NY-ESO-1 protein // Cancer Immunol. – 2007. – 7. – P. 9.
88. van Duin, Broil A., de Knegt Y. et al. Cancer testis antigens in newly diagnosed and relapse multiple myeloma: prognostic
markers and potential targets for immunotherapy // Heamatologica. – 2011. – 96. – P. 1662–9.
89. von Boehmer L., Mattle M., Bode P. et al. NY-ESO-1-specific immunological pressure are escape in a patient with metastatic
melanoma // Cancer Immunol. – 2013. – 13. – P. 12.
90. Whitehurst A.W.,Bodeman B.O., Cardenas J. et al. Synthetic lethal screen identification of chemosebsitixer loci in cancer cells //
Nature. – 2007. – 446. – P. 815–9.
91. Yoshida N., Abe H., Ohkun NT. et al. Expression of the MAGE-A4 and NY-ESO-1 cancer/testis antigens and T-cell infiltration
in non-small cell lung carcinoma and their prognostic significance // Int J Oncol. – 2006. – 28. – P. 1089–98.
92. Zhang Y., Bao L., Lu j. et al. The clinical value of the quantitative detection of four cancer/testis antigen genes in multiple myeloma // Molecular Cancer. – 2014. – 13. – P. 25.
93. Zhu X., Asa S.L., Ezzat S. Fibroblast growth factor 2 and estrogen control the balance of histone 3 modifications targeting
MADE-A3 9n pipuitare neoplasia // Clin Cancer Res. – 2008. – 14. – P. 1984–96.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ЭСТРОГЕНОВЫЕ РЕЦЕПТОРЫ БЕТА…
39
УДК 618.19-006.6-08:615.256.51:577.1.088
М.В. Родионова1, И.К. Воротников1, В.В. Родионов2, Н.В. Чхиквадзе1,
Е.А. Дудко1, Д.А. Рябчиков1, Е.В. Ошкина1, Т.А. Богуш1
ЭСТРОГЕНОВЫЕ РЕЦЕПТОРЫ БЕТА
КАК МАРКЕРЫ ЭФФЕКТИВНОСТИ ГОРМОНАЛЬНОЙ ТЕРАПИИ
РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
1
ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина», Москва
2
Ульяновский государственный университет, Ульяновск
Контактная информация
Родионова Мария Валерьевна, аспирант хирургического отделения опухолей молочных желез НИИ клинической
онкологии
адрес: 115478, Каширское шоссе, 24; тел. +7(499)324-90-10;
e-mail: [email protected]
Статья поступила 03.02.2015, принята к печати 27.04.2015
Резюме
Рецепторы эстрогенов являются важнейшей клеточной мишенью, воздействуя на которую, можно не
только контролировать процессы канцерогенеза, но и подавлять рост опухолевых клеток. Блестящим подтверждением этого стали результаты многолетнего применения первого таргетного препарата антиэстрогена тамоксифена у больных раком молочной железы с положительным рецепторным статусом опухоли. Открытие в
1990-х годах эстрогенового рецептора бета расширило понимание механизмов эстроген-опосредованного сигнального пути и межрецепторных взаимодействий. В обзоре литературы представлены данные о строении и
функциональной активности эстрогеновых рецепторов бета, а также результаты клинических исследований,
показавших предиктивную роль маркера при лечении рака молочной железы.
Ключевые слова: рак молочной железы, эстрогеновые рецепторы, тамоксифен, предиктивный маркер.
M.V. Rodionova1, I.K. Vorotnikov1, T.A. Bogush, V.V. Rodionov, N.V. Chkhivadze1,
E.A. Dudko1, D.A. Ryabchikov, E.V. Oshkina1
ROLE OF ESTROGEN RECEPTOR BETA
IN THE DEVELOPMENT AND TREATMENT
OF BREAST CANCER
1.
FSBSI «N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center», Moscow
2
Ulyanovsk State University, Ulyanovsk
Abstract
Estrogen receptors are one of the major targets in cancer cells, acting on which it is possible not only to control
the processes of carcinogenesis, but also to inhibit tumor cells growth. Brilliant confirmation of this is the results of
long-term application of the first targeted therapy – antiestrogen tamoxifen – in breast cancer patients with positive
hormonal status of the tumor. Being discovered in the 90s, estrogen receptor beta enhanced the understanding of estrogen-mediated signaling pathway and receptor-related interactions. This review of the literature presents data on the history of the discovery, structure and functional activity of selective estrogen receptor beta, and the results of existing
clinical trials which have shown the predictive role of this marker.
Key words: breast cancer, estrogen receptors, tamoxifen, predictive biomarker.
Введение
РМЖ занимает 1 место в структуре онкологической заболеваемости женского населения. В
2012 г. в России зарегистрированы 59538 новых
больных РМЖ. По сравнению с 2007 г. прирост
составил 13,8 %. [5].
Этиология РМЖ до сих пор изучается, но
многочисленные исследования показали, что именно эстрогены играют ведущую роль в возникновении этого заболевания, реализуя свое действие че№ 2/том 14/2015
рез лиганд-зависимые транскрипционные факторы,
называемые ЭР.
В 1962 году Jensen E. и Jacobsen H., обнаружив специфическое взаимодействие 17-β эстрадиола с белками в ткани матки, пришли к заключению,
что биологическое действие эстрогенов реализуется при участии рецепторного белка [27]. В дальнейшем этот белок изучался в различных лабораториях, и в 1986 Г. две исследовательские группы
сделали заявление о том, что ЭР клонирован [19;
20]. До 1995 г. считалось, что существует только
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
40
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
один тип ЭР, и что именно он ответственен за реализацию всех физиологических и фармакологических эффектов естественных и синтетических эстрогенов и антиэстрогенов. Однако в 1995 г. был
клонирован второй эстрогеновый рецептор из библиотеки к-ДНК простаты крысы [31]. Уже известный эстрогеновый рецептор был назван ЭРα, а новый рецептор – ЭРβ. Этот тип рецепторов экспрессируется в опухолях разных локализаций [1], а в
ткани первичного и метастатического рака легкого,
в отличие от ЭРα, является главной клеточной мишенью эстрогенов [2; 3; 6].
Сравнительная характеристика
эстрогеновых рецепторов:
строение, функциональная активность
ЭРα и ЭРβ принадлежат к суперсемейству
стероидных ядерных рецепторов и имеют сходную
структурную архитектуру [17; 18; 21; 28; 36; 62].
Ген ЭРα находится в длинном плече хромосомы 6
(локус q24–27), тогда как ген ЭРβ расположен в
локусе q21—22 хромосомы 14. Оба рецептора состоят из трех основных доменов, выполняющих
специфические функции: N-концевой (А/B), ДНКсвязывающий (C) и лиганд-связывающий домены
(E) [43].
На N-концевом участке рецептора находится
домен транскрипционной активаторной функции
AF1 – участок рецептора, ответственный за белокбелковые взаимодействия и транскрипционную
активацию гена-мишени независимо от связывания
с лигандом [10; 29; 39]. Сравнительный анализ AF1
доменов эстрогеновых рецепторов в различных
клеточных линиях показал, что в ЭРα этот домен
высоко эффективен в стимуляции репортерных
генов различных эстроген-чувствительных элементов (ERE), в то время как подобная активность AF1
ЭРβ низкая [15]. ДНК связывающий домен (DBD),
как следует из названия, отвечает за присоединение
к специфическим последовательностям ДНК [56].
Гомологичность DBD ЭРα и ЭРβ высока и составляет около 96 % [22].
Лиганд-связывающий домен (LBD) ответственен за связывание лиганда с рецептором, димеризацию рецептора, ядерную транслокацию и трансактивацию экспрессии генов-мишеней. Этот домен содержит участок с активационной функцией
(AF-2), ответственный за конформационные изменения ЭР в присутствии лигандов и последующее
связывание димеров ЭР с коактиваторами и корепрессорами [17; 18; 62].
Лиганд-связывающие LBD домены ЭРα и
ЭРβ обладают высокой гомологичностью и имеют
сходную третичную структуру аминокислотной
последовательности [18; 33]. Поэтому не удивительно, что ЭРα и ЭРβ имеют сходную афинность к
эстрогенам и антиэстрогенам [32].
Присоединение лиганда к ЭР через цепь последующих событий приводит к изменению уровня
транскрипции эстроген-регуляторных генов. Эти
события и порядок, в котором они происходят, до
конца не понятны, но известно, что они включают в
№ 2/том 14/2015
ЭСТРОГЕНОВЫЕ РЕЦЕПТОРЫ БЕТА…
себя димеризацию рецептора, взаимодействие рецептора с ДНК, коактиваторами, корепрессорами
или другими транскрипционными факторами, и
формирование преинициаторного комплекса [8; 9;
28–30; 58].
Накапливаются данные о негеномных эффектах эстрогенов, которые происходят слишком
быстро, чтобы быть обусловленными активацией
синтеза РНК и белка. Негеномные эффекты являются общим свойством стероидных гормонов и
часто связаны с активацией различных протеинкиназных каскадов [35]. Описанные негеномные эффекты 17β-эстрадиола включают мобилизацию
внутриклеточного кальция, стимулирование активности аденилатциклазы, и синтез цАМФ [7; 26; 54].
В культуре клеток РМЖ была отмечена способность 17β-эстрадиола активировать МАРК и PI3K
сигнальные пути [13; 40].
На сегодняшний день изучено 5 изоформ
ЭРβ [42]. Ген ESR2, с которого происходит трансляция ЭРβ, имеет 8 экзонов. В процессе альтернативного сплайсинга мРНК последнего экзона образуются белковые продукты с различной функциональной активностью – изоформы ЭРβ 1 – ЭРβ 5 . Все
изоформы отличаются по длине С-концевых последовательностей, и имеют различную молекулярную
массу. При этом ЭРβ1 является единственным полноразмерным белком, способным связываться с
лигандом. Функциональные исследования показали, что гиперэкспрессия ЭРβ1имеет проапоптотический и антипролиферативные эффекты [34; 50].
Активность изоформ ЭРβ 2 – ЭРβ 5 изучена недостаточно. ЭРβ3 специфично экспрессируется преимущественно в ткани яичка [42], а ЭРβ4 в ткани молочной железы найден не был [53]. Несмотря на то,
что ЭРβ2 и ЭРβ5 не связываются с лигандом, исследования транзиторной трансфекции показали,
что ЭРβ2 и ЭРβ5 могут выступать как антагонисты
ЭРα, путем образования гетеродимеров [52; 67].
Имеются сообщения, что высокий уровень
экспрессии ЭРβ 2 ассоциирован с резистентностью к
тамоксифену и более агрессивным течением РМЖ
[23; 65]. Рассмотренные в следующем разделе обзора данные касаются предиктивной роли в терапии больных РМЖ только полноразмерной изоформы эстрогеновых рецепторов.
Для определения уровня экспрессии ЭР наиболее часто применяется полуколичественный метод иммуногистохимии. Использование селективных моноклональных антител позволяет с высокой
точностью установить наличие ЭР в исследуемой
ткани. Однако, осуществляемая визуально оценка
доли клеток, содержащих рецепторы, а тем более
интенсивности их экспрессии в клетке, является
субъективной и полуколичественной. В отдельных
работах в качестве альтернативы иммуногистохимии для определения ЭР применяют метод ПЦР.
Но уровень мРНК, обнаруживаемый таким способом, не всегда соответствует уровню рецептора в
клетке, так как на формирование белка из мРНК
оказывают влияние различные трансляционные
факторы, постсинтетическая модификация и белкоРОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
вая деградация. Недостаточно информативными
являются радиолигандный метод и вестернблоттинг. Первый сводится к определению уровня
ЭР в неочищенном цитозоле гомогената клеток на
основании связывания рецепторов и продуктов их
деградации с лигандом, а второй – к детекции ЭР
по связыванию со специфическими антителами в
тотальной белковой фракции, полученной из анализируемых клеток.
Безусловным шагом вперёд явился разработанный в РОНЦ им. Н.Н. Блохина и запатентованный метод иммунофлуоресцентного анализа с привлечением проточной цитофлуориметрии. Метод
позволяет строго количественно оценивать не
только уровень экспрессии разных типов ЭР, то
есть количество клеток, экспрессирующих маркер в
исследуемой опухоли, но и интенсивность экспрессии ЭР в каждой клетке [4].
Эстрогеновые рецепторы β
и их корреляция
с клинико-морфологическими
параметрами
Экспрессия ЭРβ 1 коррелирует с экспрессией
ЭРα, небольшим размером опухолевого узла, низкой степенью злокачественности, отсутствием поражения регионарных лимфоузлов [24; 38; 46; 61] и
отсутствием экспрессии Her2 [38; 45; 46] (табл. 1).
Самым крупным явилось ретроспективное исследование, включавшее 2170 больных РМЖ, проведенное Marotti J. et al. (2010). ЭРβ+ опухоли были
представлены в 68 % случаев всех инвазивных карцином. Экспрессия ЭРβ статистически достоверно
коррелировала с экспрессией ЭРα (P<0,0001), рецепторов прогестерона (ПР) (P<0,0001), Her2– статусом опухоли (P=0,004). ЭРβ+/– статус опухоли
значимо отличается в различных молекулярногенетических подтипах РМЖ (P<0,0001), встречаясь более чем в 72 % случаев люминального А подтипа, 68 % – люминального В подтипа. Интересным является тот факт, что 55 % опухолей Her2+
подтипа и 60 % случаев базалоидного рака, являющихся ЭРα–, экспрессируют ЭРβ. Последняя была
представлена в опухолях всех гистологических вариантов РМЖ: в 63 % случаях инвазивных протоковых карцином, 87 % – инвазивных дольковых
карцином, 83 % – муцинозных карцином, 100 % –
тубулярных карцином. Отсутствие экспрессии ЭРβ 1
ассоциировалось с большим размером опухоли
(P=0,0008), высокой степенью злокачественности
(P<0,0001), метастатическим поражением регионарных лимфоузлов (P=0,06) [38]. Однако имеются и
результаты другого исследования, не показавшего
и
клиниковзаимосвязи
экспрессии
ЭРβ 1
патологических параметров [57]. Такие различия в
полученных результатах могут быть обусловлены
различной концентрацией используемых антител, а
также – отсутствием единой шкалы определения
уровня экспрессии. Однако, исходя из частой комбинации изучаемого рецептора с благоприятными клинико-морфологическими параметрами, ЭРβ1+ опухоли представляются группой хорошего прогноза.
№ 2/том 14/2015
ЭСТРОГЕНОВЫЕ РЕЦЕПТОРЫ БЕТА…
41
Рядом авторов изучали уровень экспрессии
ЭРβ2 (табл. 1). В двух крупных исследованиях,
включавших 757 и 150 больных РМЖ соответственно, была отмечена прямая корреляция экспрессии ЭРβ2 с экспрессией ЭРα [57; 61], ПР [57], низкой степенью злокачественности [61] и лимфоваскулярной инвазией [12]. Тем не менее, Vinayagam
R. et al. в работе, включавшей данные о 141 больной, взаимосвязи между экспрессией опухолью
ЭРβ2 и клинико-морфологическими параметрами
выявить не смогли [63].
Эстрогеновые рецепторы β
и их предиктивная роль
в терапии больных
раком молочной железы
После открытия ЭРβ представления о сигнальных путях эстрогенов значительно изменились.
Теперь известно, что 17β-эстрадиол, главный эндогенный активатор ЭР, неселективен по отношению
к разным типам рецепторов – α и β. ЭРα присутствуют в 80 % случаев РМЖ и являются основным
иммуногистохимическим параметром для назначения антиэстрогенотерапии. Поскольку большинство пациенток, получающих тамоксифен, имеют
ЭРα+ опухоли, затруднительно определить прогностическую и предиктивную значимость экспрессии
ЭРβ, несмотря на тот факт, что 5–10 % ЭРα– опухолей чувствительны к терапии тамоксифеном [60;
64]. Анализ, проведенный EBCTCG (1998), показал
незначительное снижение смертности (6 %) в группе пациентов с низкой экспрессией ЭРα (0-2 балла
по системе Allred Scoring Guideline), получавших
тамоксифен [14]. Однако эти данные не подтвердились в последующем метаанализе, включавшем
бóльшее количество исследований [16].
Имеются данные 9 ретроспективных исследований, в которых сравнивался уровень экспрессии ЭРβ (изолированно и в сочетании с экспрессией ЭРα) в первичной опухоли c показателями выживаемости больных первично-операбельным
РМЖ (табл. 2) [24; 25; 45–47; 57; 60;]. Данные исследования отличаются по количеству включенных
больных, виду адъювантной терапии, пороговому
значению в оценке ЭРβ и медиане наблюдения. В
шести исследованиях с общим количеством 1227
пациенток получена достоверная взаимосвязь высокого уровня экспрессии ЭРβ и безрецидивной
выживаемости, как в группе пациенток, получавших комбинированное лечение, так и антиэстрогенотерапию в монорежиме. Также достоверно значимое увеличение общей выживаемости в случае
высокой экспрессии ЭРβ было показано в работах
Sugiura et al. (2007), Nakopoulou et al. (2004), Honma
et al. (2008), Mann et al/ (2001). В трех других исследованиях статистически достоверной корреляции уровня экспрессии ЭРβ и показателей выживаемости получено не было [47; 48; 57].
Говоря об экспрессии ЭРβ в ткани РМЖ,
можно выделить две группы случаев – когда ЭРβ
ко-экспрессируются с ЭРα (ЭРβ+/ЭРα+) и экспрессируются изолированно (ЭРβ+/ЭРα−).
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
42
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ЭСТРОГЕНОВЫЕ РЕЦЕПТОРЫ БЕТА…
Таблица 1
Результаты ретроспективных исследований по оценке уровня экспрессии ЭРβ1 и ЭРβ2 и клиникоморфологических параметров
ЭР,
n паАвтор
изоГистологический вариант
циенКлинико-морфологические параметры
форма
тов
Корреляция экспрессии ЭРβ1 с небольшим разИнвазивная карцинома
[61]
150
мером опухоли, N0, низкой степенью злокачестмолочной железы
венности
Инвазивная карцинома
Корреляция экспрессии ЭРβ1 с экспрессией ЭРα,
[46]
181
молочной железы
отсутствием экспрессии HER2
Инвазивная карцинома
Корреляция экспрессии ЭРβ1 с отсутствием экс[45]
150
молочной железы
прессии HER2
Инвазивная карцинома
Отсутствие корреляции с клиникоЭРβ1
[57]
757
молочной железы
морфологическими параметрами
Инвазивная карцинома молочКорреляция экспрессии ЭРβ1 с экспрессией ЭРα,
ной железы с выделением молеотсутствием экспрессии HER2, небольшим раз[38]
2170
кулярно-биологических подтимером опухолевого узла, N0, низкой степенью
пов
злокачественности
Корреляция экспрессии ЭРβ1 с небольшим раз[24]
Апокриновая карцинома
150
мером опухолевого узла, низкой степенью злокачественности
Инвазивная карцинома
Корреляция экспрессии ЭРβ2 с экспрессией ЭРα,
[57]
757
молочной железы
отсутствием метастазов и сосудистой инвазии
Инвазивная карцинома
Корреляция экспрессии ЭРβ2 с экспрессией ЭРα
[61]
150
молочной железы
и низкой степенью злокачественности
Инвазивная карцинома
Отсутствие корреляции с клиникоЭРβ2
[63]
141
молочной железы
морфологическими параметрами
Инвазивная карцинома
Корреляция экспрессии ЭРβ2 с наличием лим[12]
44
молочной железы
фоваскулярной инвазии
Отсутствие корреляции с клинико[12]
Протоковый рак in situ
26
морфологическими параметрами
Первая группа (ЭРβ+/ЭРα+) составляет более половины случаев первичного РМЖ, в то время как изо‐
лированная экспрессия ЭРβ (ЭР/ЭР) встречается менее
чем в 20% случаев [44; 55]. Опухоли, которые традиционно на основании иммуногистохимического анализа классифицируют как ЭР– и характеризуется более
агрессивным течением и низкой частотой ответа на
гормонотерапию [49], включают вторую группу ЭРβэкспрессирующих новообразований. Эта группа опухолей составляет 50–80 % ЭР– опухолей (фенотип
ЭРβ+/ЭРα−) [24; 51]. До открытия в 1996 г. ЭРβ предполагалось, что часть пациентов так называемой «классической» ЭР– группы отвечают на гормонотерапию в
силу методических погрешностей и неправильного
определения статуса ЭР в опухоли (ложноотрицательные иммуногистохимические результаты), а также в
случае реализации эффектов антиэстрогенов, не ассоциированных с эстрогеновыми рецепторами [11]. До
настоящего времени ЭРβ+/ЭРα– группа опухолей, изучена недостаточно, однако в свете современных знаний
о существовании разных типов эстрогеновых рецепторов, которые являются мишенью для эстрогенов и антиэстрогенов, противоопухолевый эффект последних в
опухолях с фенотипом ЭРβ+/ЭРα− кажется очевидным.
Особый интерес представляет исследование
Honma N. et al. (2008), в которое вошли 442 пациентки с первично-операбельным инвазивным РМЖ,
получившие хирургическое лечение с последую№ 2/том 14/2015
щей адъювантной терапией тамоксифеном вне зависимости от рецепторного статуса опухоли [24].
Медиана наблюдения составила 11,1 лет. Оказалось, что высокая экспрессия опухолевыми клетками ЭРβ (в данном исследовании пороговое значение принималось как наличие 10% и более интенсивно окрашенных клеток) является благоприятным прогностическим маркером вне зависимости
от уровня экспрессии ЭРα (р<0,001).
Из 442 пациенток, включенных в исследование, 60 имели ЭРα–/ПР– статус опухоли, однако у
50 пациенток (83 %) данной группы определялась
экспрессия ЭРβ. Разница БРВ ЭРα–/ЭРβ– и ЭРα–
/ЭРβ+ пациенток оказалась разительной. Только у
11 (22 %) из 50 ЭРβ+ пациенток развился рецидив
заболевания за весь период наблюдения, в то время
как у 8 (80 %) из 10 ЭРβ– пациенток развился рецидив в течение 5 лет. Проведенный многофакторный
анализ показал, что низкий уровень экспрессии ЭРβ
является независимым показателем повышенной
смертности (р=0,021) и рецидивирования (р=0,004)
у больных РМЖ, получающих адъювантную гормонтерапию тамоксифеном. В группе пациенток с
трижды-негативным фенотипом, ОВ и БРВ также
отличалиь в зависимости от экспрессии ЭРβ
(p<0,001).
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ЭСТРОГЕНОВЫЕ РЕЦЕПТОРЫ БЕТА…
43
Таблица 2
Результаты ретроспективных исследований по оценке уровня экспрессии ЭРβ и выживаемости больных раком
молочной железы
n
Пороговое знаМедиана
Период исСистемная терапия (n
Показатели выжиАвтор больчение в оценке
наблюдеследования
больных,%)
ваемости
ных
ЭРβ статуса
ния
ГТ без уточнения –
37%
ХТ – 15%
↑ БРВ (р=0,001)
[61]
150
1993-2000
Allred ≥3
58 мес.
ХТ+ГТ – 20%
↑ОВ (р=0,002)
Системная терапия не
проводилась – 28%
ХТ + ТАМ
Нет
10% окрашенТАМ (независимо от
↑ БРВ (р=0,0002)
[46]
181
76 мес.
данных
ных клеток
гормонального стату↑ОВ (р=0,0002)
са опухоли)
↑ БРВ (р=0,0008)
[45]
150
1996-2002
Allred ≥3
ХТ+ТАМ
27 мес.
ОВ не оценивалась
[24]
442
1983-1993
[25]
186
N+
[37]
118
Нет
данных
Нет
данных
[48]
138
[47]
728
1993-1999
2001-2005
10% окрашенных клеток
Allred ≥3
11,1 лет
ТАМ
20% окрашенных клеток
20% окрашенных клеток
20% окрашенных клеток
65 мес
↑ БРВ (р<0,01)
↑ОВ (р<0,01)
↑ БРВ (р=0,0063)
↑ОВ (р=0,03)
Нет
данных
Нет
данных
ГТ (без уточнения)
ХТ+ГТ (без уточнения)
50 мес.
↑ОВ (р=0,03)
↔ ОВ и БРВ
↔ ОВ и БРВ
↑ БРВ только в группе люминальных А,
N0 опухолей
(р=0,02)
Нет данных о провоНет
димой ХТ
↔ ОВ и БРВ
данных
ТАМ – 32%
N+ метастазы в регионарные лимфоузлы: ↑ – увеличение показателя выживаемости; ↔ – отсутствие увеличения показателей выживаемости.
[56]
757
1986-1998
20% окрашенных клеток
Учеными была предпринята попытка оценить
предиктивную роль экспрессии ЭРβ на модели неоадъювантной гормонотерапии. В исследование
Miller W. et al. (2006) вошли 33 пациентки в постменопаузе с морфологически верифицированным диагнозом РМЖ, с размером опухолевого узла >3см и
высокой экспрессией ЭРα (Allred > 5), ежедневно получавших тамоксифен 20 мг/сут в течение 3 месяцев
до операции [41]. Опухоли всех пациенток были высоко положительными по экспрессии ЭРβ (Allred 5–
8). Клинический ответ был зарегистрирован у 70 %
пациенток, патоморфологический – у 48 %.
Однако статистических достоверных различий
уровней экспрессии эстрогеновых рецепторов в группах ответивших и не ответивших на гормонотерапию
получено не было. На фоне трехмесячного приема
тамоксифена отмечалось снижение экспрессии ЭРα (у
81 % больных) и повышение экспрессии ЭРβ (в 51 %
случаев) по сравнению с исходными показателями. В
2013 году в Annals of Clinical Oncology опубликованы
результаты проспективного анализа экспрессии ЭРβ-1
и его регулятора SRAP в рамках исследования NCIC-
№ 2/том 14/2015
CTG-MA12 1 [66]. В исследование вошли 672 пациентки; период наблюдения составил 9,7 года. ЭРβ-1 и
SRAP были оценены у 457 из 462 больных, соответственно, в связи с отсутствием материала или невозможностью интерпретации иммуногистохимических
результатов. Медиана уровня экспрессии ЭРβ составила 5,0 баллов (0–205); 54,9 % пациенток были отнесены в группу высокой ЭРβ экспрессии, а 45,1 % –
низкой. Поскольку в исследование были включены
пациентки как с положительным, так и с отрицательным ЭРα статусом опухоли, был выполнен анализ
внутри группы в соответствии с стратификацией
ЭРα+/–. В группе ЭРα+ опухолей высокие уровни экспрессии ЭРβ-1 и SRAP, как изолированно, так и в
сочетании, не показали преимущества терапии тамоксифеном. В то время как в группе ЭРα– опухолей с
высокой экспрессией ЭРβ-1 при назначении тамоксифена отмечалось увеличение общей (р=0,007) и безрецидивной выживаемости (р=0,0009) по сравнению с
группой плацебо.
1
рандомизированное плацебо-контролируемое исследование
тамоксифена после адъювантной химиотерапии у пременопаузальных больных ранним РМЖ
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
44
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
При низкой экспрессии ЭРβ-1 и SRAP не
было получено статистических различий в показателях выживаемости между группами тамоксифена
и плацебо. Авторами сделан вывод о возможной
предиктивной роли ЭРβ-1 в группе пациенток с
ЭРα– РМЖ. Иными словами, в работе получено
реальное доказательство того, что, по крайней мере, в половине случаев, позитивный эффект тамоксифена при лечении РМЖ с отрицательным статусом ЭРα связан с экспрессией в опухолевых клетках другой мишени – эстрогеновых рецепторов β.
Важным параметром, определяющим биологические особенности опухоли, является уровень
каждого из маркеров при их коэкспрессии. В некоторых случаях высокий уровень экспрессии в опухоли ЭРβ может влиять на эффекты, опосредуемые
ЭРα. Например, пролиферативный ответ при воздействии на культуру клеток РМЖ человека эстрогенов в случае коэкспрессии рецепторов наблюдается только при низком уровне экспрессии ЭРβ
[59]. Полученные на культурах клеток данные о
влиянии соотношения разных типов рецепторов на
пролиферативное действие эстрогенов ещё не подтверждены в клинических условиях при изучении
действия блокаторов рецепторов. Поэтому информация о количественном соотношении экспрессии
ЭРα и ЭРβ может быть очень важной при оценке
предиктивной значимости каждого из типов рецепторов при их коэкспрессии.
Заключение
В последние годы стало очевидно, что, помимо классических ЭРα, в биологии РМЖ важную
роль играют рецепторы другого типа – ЭРβ, которые также являются мишенью для эстрогенов и
ЭСТРОГЕНОВЫЕ РЕЦЕПТОРЫ БЕТА…
антиэстрогенов, прогностическими и предиктивными маркерами РМЖ.
Рассматривая экспрессию ЭРβ, следует выделять два типа опухолей, поскольку механизмы
канцерогенеза и биологические свойства РМЖ различны при изолированной экспрессии ЭРβ и коэкспрессии ЭРβ с ЭРα. Более того, эффект эстрогенов
зависит от соотношения в клетке разных типов рецепторов, при этом ЭРβ могут подавлять функцию
ЭРα. Существование различных изоформ ЭРβ может лежать в основе не только повышенной чувствительности, но и резистентности опухоли к антиэстрогенотерапии, а коэкспрессия ЭРβ с ЭРα и рецепторами прогестерона наиболее надежно прогнозирует лучший исход болезни.
Роль изолированной экспрессии ЭРβ в реализации биологических особенностей опухоли не
только представляет научный интерес, но и требует
дальнейших исследований по изучению эффективности антиэстрогенотерапии в данной группе пациентов. По нашему мнению, столь же важно проведение подобных оценок в группе больных с высоким уровнем ЭРβ на фоне низкой экспрессии ЭРα.
В дальнейшем необходимы проспективные
исследования с целью определения клинически
значимых показателей экспрессии ЭРβ в ткани
РМЖ, используя для этого строго количественные
методы оценки уровня и интенсивности экспрессии
белка, в частности, с использованием современной
проточной цитофлуориметрии.
Исследования поддержаны грантами РФФИ
(№№ 13-04-01004-a, 15-04-06991-a и 14-04-31734–
мол-a), а также грантом по программе РАН
(ФИМТ-2014-205) и стипендией Президента РФ
(376.2012.4).
Литература
1.
Богуш Т.А., Дудко Е.А., Бёме A.A. и др. Экспрессия эстрогеновых рецепторов в опухолях, отличных от рака
молочной железы // Антибиотики и химиотер. – 2009. – Т. 54, № 7–8. – С. 41–9.
2. Богуш Т.А., Дудко Е.А., Бёме А.А. и др. Эстрогеновые рецепторы, антиэстрогены и немелкоклеточный рак
лёгкого // Биохимия. – 2010. – Т. 75, № 12. – С. 1633–41.
3. Богуш Т.А., Шатурова А.С., Дудко Е.А. и др. Сравнительная оценка экспрессии эстрогеновых рецепторов
бета в ткани немелкоклеточного рака легкого и метастазов в легком опухолей других первичных локализаций // ДАН. – 2014. – Т. 454, № 6. – С. 720–4.
4. Богуш Т.А., Шатурова А.С., Дудко Е.А. и др. Количественная иммунофлуоресцентная оценка с использованием проточной цитофлуориметрии экспрессии эстрогеновых рецепторов β в солидных опухолях человека
// Вестн. Моск. ун-та Сер. 2, Химия. – 2011. – Т. 52, № 4. – С. 305–12.
5. Давыдов М.И., Аксель Е.М. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2012
году. М.: Издательская группа РОНЦ, 2014. – С. 46.
6. Шатурова А.С., Богуш Т.А., Дудко Е.А. и др. Экспрессия эстрогеновых рецепторов β и β1 в ткани немелкоклеточного рака легкого человека // Антибиотики и химиотер. – 2012. – Т. 57, № 5–6. – С. 11–7.
7. Aronica S.M., Kraus W.L., Katzenellenbogen B.S. Estrogen action via the cAMP signaling pathway: stimulation of
adenylate cyclase and cAMP-regulated gene transcription // Proc Natl Acad Sci USA. – 1994. – 91. – P. 8517–21.
8. Beato M. Gene regulation by steroid hormones // Cell. – 1989. – 56. – P. 335–44.
9. Beekman J.M., Allan G.F., Tsai S.Y. et al. Transcriptional activation by the estrogen receptor requires a conformational change in the ligand binding domain // Mol Endocrinol. – 1993. – 7. – P. 1266–74.
10. Berry M., Metzger D., Chambon P. Role of the two activating domains of the oestrogen receptor in the cell-type
and promotercontext dependent agonistic activity of the anti-oestrogen 4-hydroxytamoxifen // EMBO J. – 1990. –
9. – P. 2811–8.
11. Bogush T., Dudko E., Bogush E. et al. Tamoxifen non-estrogen receptor mediated molecular targets // Oncology
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ЭСТРОГЕНОВЫЕ РЕЦЕПТОРЫ БЕТА…
45
reviews. – 2012. – 6:e15. – P. 122–9.
12. Bozkurt K., Kapucuoglu N. Investigation of immunohistochemical ERalpha, ERbeta and ERbetacx expressions in
normal and neoplastic breast tissues // Pathol. Res. Pract. – 2012. – 208. – P. 133–9.
13. Castoria G., Migliaccio A., Bilancio A. et al. PI3-kinase in concert with Src promotes the S-phase entry of oestradiol-stimulated MCF-7 cells // EMBO J. – 2001. – 20. – P. 6050–9.
14. Collins R., Davies C.. Early Breast Cancer Trialists’ Collaborative Group. Tamoxifen for early breast cancer: an
overview of the randomised trials // Lancet. – 1998. – 351. – P. 1451–67.
15. Cowley S.M., Parker M.G. A comparison of transcriptional activation by ER alpha and ER beta // J Steroid Biochem Mol Biol. – 1999. – 69. – P. 165–75.
16. Davies C., Godwin J., Gray R. et al. Relevance of breast cancer hormone receptors and other factors to the efficacy
of adjuvant tamoxifen: patient-level meta-analysis of randomised trials // Lancet. – 2011. – 378. – P. 771–84.
17. Evans R.M. The steroid and thyroid hormone superfamily // Science. – 1988. – 240. – P. 889–95.
18. Giguere V., Yang N., Segui P., Evans R.M. Identification of a new class of steroid hormone receptors // Nature. –
1988. – 331. – P. 91–4.
19. Green G.L., Gilna P., Waterfield M. et al. Sequence and expression of human estrogen receptor complementary
DNA // Science. – 1986. – 231. – P. 1150–4.
20. Green S., Walter P., Kumar V. et al. Human oestrogen receptor cDNA: sequence, expression and homology to verb-A // Nature. – 1986. – 320. – P. 134–9.
21. Gronemryer H., Laudet V. Transcription factors 3: nuclear receptors // Protein Profile. – 1995. – 2. – P. 1167–322.
22. Hanstein B., Liu H., Yancisin M., Brown M. Functional analysis of a novel estrogen receptor-b isoform // Mol Endocrinol. – 1999. – 13. – P. 129–37.
23. Hartman J., Lindberg K., Morani A. Estrogen receptor beta inhibits angiogenesis and growth of T47D breast cancer
xenografts // Cancer Res. – 2006. – 66. – P. 11207–13.
24. Honma N., Saji S., Kurabayashi R. et al. Oestrogen receptor-beta1 but not oestrogen receptor-betacx is of prognostic value in apocrine carcinoma of the breast // Apmis. – 2008. – 116. – P. 923–30.
25. Hopp T., Weiss H., Parra I. et al. Low levels of estrogen receptor beta protein predict resistance to tamoxifen therapy in breast cancer // Clinical Cancer Research. – 2004. – 10. – P. 7490–9.
26. Improta-Brears T., Whorton A.R., Codazzi F. et al. Estrogen-induced activation of mitogen-activated protein kinase
requires mobilization of intracellular calcium // Proc Natl Acad Sci USA. – 1999. – 96. –P. 4686–91.
27. Jensen E.V., Jacobsen H.I. Basic guides to the mechanism of estrogen action // Rec Prog Horm Res. – 1962. – 18. –
P. 387–414.
28. Katzenellenbogen J.A., Katzenellenbogen B.S. Nuclear hormone receptors: ligand-activated regulators of transcription and diverse cell responses // Chem Biol. – 1996. – 3. – P. 529–36.
29. Kraus W.L. McInerney E.M., Katzellenbogen B.S. Ligand-dependent transcriptionally productive association of the
amino- and carboxy-terminal regions of a steroid hormone nuclear receptor // Proc Natl Acad Sci USA. – 1995. –
92. – P. 12314–8.
30. Kraus W.L., Kadonaga J.T. P300 and estrogen receptor cooperatively activate transcription via differential enhancement of initiation and reinitiation // Genes Dev. – 1998. – 12. – P. 331–42.
31. Kuiper G.G., Enmar E., Pelto-Huikko M. et al. Cloning of a novel receptor expressed in rat prostate and ovary //
Proc Natl Acad Sci USA. – 1996. – 93. – P. 5925–30.
32. Kuiper G.G., Lemmen J.G., Lemmen J.G. et al. Interaction of estrogenic chemicals and phytoestrogens with estrogen receptor beta // Endocrinology. – 1998. – 139. – P. 4252–63.
33. Lagerkrantz J., Nordenskjo L.D., Gustafsson J.A. Human estrogen receptor b-gene structure, chromosomal localisation and expression pattern // J Clin Endocrinol Metab. – 1997. – 82. – P. 4258–65.
34. Lazennec G., Bresson D., Lucas A. et al. ERβ inhibits proliferation and invasion of breast cancer cells // Endocrinology. – 2001. – 142. – P. 4120–410.
35. Losel R., Wehling M. Nongenomic actions of steroid hormones // Nat Rev Mol Cell Biol. – 2003. – 4. – P. 46–56.
36. Mangelsdorf D.J., Thummel C., Beato M. et al. The nuclear receptor superfamily: the second decade // Cell. –
1998. – 83. – P. 835–9.
37. Mann S., Laucirica R., Carlson N. et al. Estrogen receptor beta expression in invasive breast cancer // Human Pathology. – 2001. – 32. – P. 113–8.
38. Marotti J., Collins L., Hu R., Tamimi R. Estrogen receptor-beta expression in invasive breast cancer in relation to
molecular phenotype: results from the Nurses’ Health Study // Mod. Pathol. – 2010. – 23. – P. 197–204.
39. McInerney E.M., Katzellenbogen B.S. Different regions in activation function-1 of the human estrogen receptor
required for antiestrogen- and estradiol-dependent transcription activation // J Biol Chem. – 1996. – 271. – P.
24172–8.
40. Migliaccio A., Di Domenico M., Castoria G. et al. Tyrosine kinase/p21ras/MAP-kinase pathway activation by estradiol-receptor complex in MCF-7 cells // EMBO J. – 1996. – 15. – P. 1292–300.
41. Miller W., Anderson T., Dixon J., Saunders P. Oestrogen receptor beta and neoadjuvant therapy with tamoxifen:
prediction of response and effects of treatment // Br. J. Cancer. – 2006. – 94. – P. 1333–8.
42. Moore J.T., McKee D.D., Slentz-Kesler K. et al. Cloning and characterisation of human estrogen receptor beta isoforms // Biochem Biophys Res Comm. – 1998. – 247. – P. 75–8.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
46
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ЭСТРОГЕНОВЫЕ РЕЦЕПТОРЫ БЕТА…
43. Murphy L., Watson P. Is oestrogen receptor-β a predictor of endocrine therapy responsiveness in human breast cancer? // Endocr Relat Cancer. – 2006. – 13. – P. 327–34.
44. Murphy L., Cherlet T., Lewis A. et al. New insights into estogen receptor function in human breast cancer // Annals
of Medicine. – 2003. – 35. – P. 614–31.
45. Myers E., Fleming F., Crotty T. et al. Inverse relationship between ER-beta and SRC-1 predicts outcome in endocrine-resistant breast cancer // Br. J. Cancer. – 2004. – 91. – P. 1687–93.
46. Nakopoulou L., Lazaris A., Panayotopoulou E. et al. The favourable prognostic value of oestrogen receptor beta
immunohistochemical expression in breast cancer // J. Clin. Pathol. – 2004. – 57. – P. 523–8.
47. Novelli F., Milella M., Melucci E. et al. A divergent role for estrogen receptor-beta in node-positive and nodenegative breast cancer classified according to molecular subtypes: an observational prospective study // Breast
Cancer Res. – 2008. – 10. – P. 74.
48. O’Neill P., Davies M., Shaaban A. et al. Wild-type oestrogen receptor beta (ERbeta1) mRNA and protein expression in Tamoxifen-treated post-menopausal breast cancers // British Journal of Cancer. – 2004. – 91 – P. 1694–702.
49. Osborne C. Steroid hormone receptors in breast cancer management // Breast Cancer Research Treatment. – 1998.
– 51. – P. 227–38.
50. Paruthiyil S., Parmar H., Kerekatte V. et al. Estrogen receptor β inhibits human breast cancer cell proliferation and
tumor formation by causing a G 2 cell cycle arrest // Cancer Res. – 2004. – 64. – P. 432–8.
51. Peng B., Lu B., Leygue E., Murphy L. Putative functional characteristics of human estrogen receptor-beta isoforms
// Journal of Molecular Endocrinology. – 2003. – 30. – P. 13–29.
52. Pettersson K., Delaunay F., Gustafsson J.A. Estrogen receptor β acts as a dominant regulator of estrogen signaling
// Oncogene. – 2000. – 19. – P. 4970–8.
53. Poola I., Abraham J., Baldwin K., et al. Estrogen receptors β4 and β5 are full-length functionally distinct ERβ isoforms: cloning from human ovary and functional characterization // Endocrine. – 2005. – 27. – P. 227–38.
54. Razandi M., Pedram A., Greene G.L., Levin E.R. Cell membrane and nuclear estrogen receptors (ERs) originate
from a single transcript: studies of ERα and ERβ expressed in Chinese hamster ovary cells // Mol Endocrinol. –
1999. – 13. – P. 307–19.
55. Saji S., Hirose M., Toi M. Clinical significance of estrogen receptor beta in breast cancer // Cancer Chemotherapy
and Pharmacology. – 2005. – 56. – P. 21–6.
56. Seol W., Choi H.S., Moore D.D. An orphan nuclear hormone receptor that lacks a DNA binding domain and heterodimerizes with other receptors // Science. – 1996. – 272. – P. 1336–9.
57. Shaaban A., Green A., Karthik S. et al. Nuclear and cytoplasmic expression of ERbeta1, ERbeta2, and ERbeta5
identifies distinct prognostic outcome for breast cancer patients // Clin. Cancer Res. – 2008. – 14. – P. 5228–35.
58. Shibata H., Spencer T.E., Onate S.A. et al. Role of co-activators and co-repressors in the mechanism of steroid/thyroid receptor action // Rec Prog Horm Res. – 1997. – 52. – P. 141–65.
59. Sotoca A.M., van den Berg H., Vervoort J. et al. Influence of cellular ERalpha/ERbeta ratio on the ERalpha-agonist
induced proliferation of human T47D breast cancer cells // Toxicol Sci. – 2008. – 105(2). – P. 303–11.
60. Stewart J., King R., Hayward J. et al. Estrogen and progesterone receptors: correlation of response rates, site and
timing of receptor analysis // Breast Cancer Res Treat. – 1982. – 2. – P. 243–50.
61. Sugiura H., Toyama T., Hara Y. et al. Expression of estrogen receptor beta wild-type and its variant ERbetacx/beta2 is correlated with better prognosis in breast cancer // Jpn. J. Clin. Oncol. – 2007 – 37. – P. 820–8.
62. Tsai M.G., O’Malley B.W. Molecular mechanisms of action of steroid/thyroid receptor superfamily members //
Annu Rev Biochem. – 1994. – 63. – P. 451–86.
63. Vinayagam R., Sibson D., Holcombe C. et al. Association of oestrogen receptor beta 2 (ER beta 2/ER beta cx) with
outcome of adjuvant endocrine treatment for primary breast cancer – a retrospective study // BMC Cancer. – 2007.
– 7. – P. 131.
64. Von Maillot K., Gentsch H.H., Gunselmann W. Steroid receptors and response to endocrine treatment and chemotherapy of advanced breast cancer // J Cancer Res Clin Oncol. – 1980. – 98. – P. 301–13.
65. Warner M., Gustafsson J. The role of estrogen receptor beta (ERbeta) in malignant diseases – a new potential target
for antiproliferative drugs in prevention and treatment of cancer // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2010. –
396. – P. 63–6.
66. Yan Y., Li X., Blanchard A. et al. Expression of both Estrogen Receptor-beta 1 (ER-β1) and its co-regulator Steroid
Receptor RNA Activator Protein (SRAP) are predictive for benefit from tamoxifen therapy in patients with Estrogen Receptor-alpha (ER-α)-Negative Early Breast Cancer (EBC) // Annals of Oncology. – 2013. – P. 1–8.
67. Zhao C., Matthews J., Tujague M., et al. Estrogen receptor β2 negatively regulates the transactivation of estrogen
receptor α in human breast cancer cells // Cancer Res. – 2007. – 67. – P. 3955–62.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
СУБПОПУЛЯЦИОННЫЙ СОСТАВ ЛИМФОЦИТОВ…
47
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 618.19-006.6-08:612.112.94:616-006-092.18
А.И. Черткова, Е.Г. Славина, Л.Г. Жукова, И.П. Ганьшина,
М.А. Окружнова, Э.К. Шоуа, В.А. Нуртдинова, А.А. Борунова, З.Г. Кадагидзе
СУБПОПУЛЯЦИОННЫЙ СОСТАВ ЛИМФОЦИТОВ
ПРИ HER2-ПОЛОЖИТЕЛЬНОМ
И ТРИЖДЫ-НЕГАТИВНОМ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
ФГБНУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина», Москва
Контактная информация
Славина Елена Григорьевна, ведущий научный сотрудник лаборатории кинической иммунологии опухолей НИИ КО
адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24; тел. +7(499)324-94-14
e-mail: [email protected]
Статья поступила 16.03.2015, принята к печати 27.04.2015.
Резюме
Целью настоящей работы было исследование связи между исходным количеством основных субпопуляций лимфоцитов периферической крови и результатами проведенной терапии у больных HER2+ РМЖ и Т-Н
РМЖ. До начала лечения проводилось иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови пациенток
методом проточной цитометрии с использованием панели моноклональных антител к поверхностным маркерам
лимфоцитов и внутриклеточному антигену FOXP3 и определение цитотоксической активности NK-клеток с
помощью полуавтоматического колориметрического МТТ-теста в отношении клеток К-562. Были выявлены
определенные различия в популяционном составе лимфоцитов и количестве регуляторных Т-клеток у больных
HER2+ РМЖ и Т-Н РМЖ. Обсуждается связь между количеством супрессорных клеток и степенью лечебного
патоморфоза опухоли.
Ключевые слова: HER2+ рак молочной железы, трижды негативный рак молочной железы, лечебный
патоморфоз опухоли, регуляторные Т-клетки.
A.I. Chertkova, E.G.Slavina, L.G. Zhukova, I.P. Ganshina,
M.F. Okruzhnova, E.K.Shoua, V.A. Nurtdinova, A.A.Borunova, Z.G. Kadagidze
LYMPHOCYTE SUBSETS
IN PERIPHERAL BLOOD OF HER2-POSITIVE
AND TRIPLE NEGATIVE BREAST CANCER PATIENTS
FSBSI «N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center», Moscow
Abstract
The aim of this study was to investigate the relationship between the original amount of basic lymphocyte subpopulations in peripheral blood and the results of therapy in patients with HER2+ and triple negative breast cancer. Before treatment was conducted immunophenotyping of peripheral blood lymphocytes by flow cytometry using a panel of
monoclonal antibodies to surface markers and intracellular lymphocyte antigen FOXP3 and determining the cytotoxic
activity of NK-cells. Cytotoxic activity was determined with MTT colorimetric test against K-562 cells. Revealed some
differences in the composition of the population of lymphocytes and the number of regulatory T cells in patients with
HER2+ and triple negative breast cancer (BC). Discuss the relationship between the number of suppressor cells and the
degree of therapeutic pathomorphosis of tumor.
Key words: HER2+ breast cancer, tripl negative breast cancer, pathomorphosis of tumor, regulatory T cells.
Введение
РМЖ является наиболее частым вариантом
злокачественных опухолей у женщин во всем мире.
Для РМЖ характерна клиническая и молекулярная
№ 2/том 14/2015
гетерогенность. У 20–30 % больных определяется
гиперэкспрессия рецептора эпидермального фактора роста 2 (HER2+ РМЖ). Приблизительно в 10–
20 % случаев диагностируется так называемый
трижды-негативный РМЖ (Т-Н РМЖ), который
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
48
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
СУБПОПУЛЯЦИОННЫЙ СОСТАВ ЛИМФОЦИТОВ…
характеризуется отсутствием рецепторов к эстрогенам и прогестерону, а также отсутствием гиперэкспрессии HER2 [7]. Эффективность различных методов лечения злокачественных опухолей и прогноз
заболевания в значительной степени зависят от состояния иммунной системы пациентки[16]. Опухоль активно защищается от иммунной атаки, используя различные механизмы иммуносупрессии,
приводящие к развитию толерантности к антигенам
опухолевых клеток [10]. В экспериментальных и
клинических исследованиях в последние десятилетия активно изучалась роль различных популяций
регуляторных клеток, препятствующих развитию
эффективного противоопухолевого иммунного ответа.
Значительное
внимание
уделялось
CD4+CD25+FOXP3+ (Трег) и CD8+CD28− Т-клеткам,
повышение количества которых в опухолевой ткани и периферической крови (ПК) в большинстве
случаев коррелирует с плохим прогнозом заболевания [2; 8]. В настоящей работе у больных HER2+
РМЖ и Т-Н РМЖ определяли связь между исходным количеством основных субпопуляций лимфоцитов периферической крови и результатами проведенной терапии. Особое внимание уделялось популяциям регуляторных Т-клеток с фенотипом
CD4+CD25+FOXP3+ и CD8+CD28−.
Материалы и методы
В исследование были включены пациентки с
HER2+ РМЖ с местно-распространенными первично-неоперабельными формами, с изолированными
метастазами в л/у и висцеральные органы (n = 24) и
Т-Н РМЖ с местно-распространенными первичнонеоперабельными формами (n = 31). Контролем
служили здоровые женщины (n = 28). Все включенные в исследование пациентки после соответствующей терапии (химиотерапия при Т-Н и химиотерапия и/или таргетная терапия при HER2+ РМЖ)
получали оперативное лечение и в операционном
материале определялась степень лечебного патоморфоза опухоли. Пациенток с каждой формой
РМЖ делили на 2 группы в соответствии со степенью лечебного патоморфоза: HER2+ РМЖ группа А
(n=13) – пациентки с признаками патоморфоза 0–II
степени и группа B (n=11) – пациентки с признаками патоморфоза III–IV степени; Т-Н РМЖ: группа
C (n=11) – пациентки с признаками патоморфоза 0–
2 степени и группа D (n=20) – пациентки с признаками патоморфоза III–IV степени. Иммунологическое обследование больных проводилось до начала
лечения. Оно заключалось в иммунофенотипировании лимфоцитов ПК и определении ЦТА естественных киллеров (NK-клеток). Иммунофенотипирование лимфоцитов ПК проводили методом проточной цитометрии с использованием панели моноклональных антител производства компаний
eBiocsience (USA) и «Сорбент» (Россия) к поверхностным маркерам лимфоцитов и внутриклеточному антигену FOXP3. ЦТА определялась полуавтоматическим колориметрическим МТТ-тестом в отношении клеток К-562 [14]. Для статистической
№ 2/том 14/2015
обработки результатов использовали пакет статистических программ «Статистика 7». Различия между средними значениями показателей определяли
с помощью U-критерия Манна-Уитни и t-критерия
Стьюдента. Для определения связи между изучаемыми признаками проводился непараметрический
корреляционный анализ Спирмена. Различия между показателями считали статистически значимыми
при Р < 0,05. Результаты представлены в виде
среднего арифметического значения показателя ±
стандартное отклонение (m±St.Dev).
Результаты и обсуждение
Как видно из представленных в табл. 1 данных, статистически значимые отклонения от нормы
субпопуляционного состава лимфоцитов у больных
с HER2+ РМЖ в большей степени были выражены
в группе В (патоморфоз III–IV степени), чем в
группе А (патоморфоз 0– II степени). Однако, статистической взаимосвязи между количеством CD3+,
СD3+CD8+ СD3+HLA-DR+, CD3-CD16+CD56+ и
СD3+CD38+ лимфоцитов и степенью лечебного патоморфоза опухоли выявлено не было. Повидимому, указанные выше незначительные нарушения субпопуляционного состава лимфоцитов
периферической крови, обнаруженные до лечения у
обследованных нами пациенток с HER2+РМЖ, не
имели большого значения для эффективности проводимого им лечения. Ранее мы обнаружили тенденцию к нормализации измененных показателей в
процессе химио-и/или таргетной (трастузумаб +
лапатиниб) терапии больных HER2+РМЖ [3]. Нарушения субпопуляционного состава лимфоцитов
ПК у пациенток с Т-Н РМЖ (табл. 2) были менее
выражены, чем у больных HER2+ РМЖ (табл. 1).
Основными клетками-эффекторами противоопухолевого иммунитета являются CD8+ Тлимфоциты. В то же время, описано несколько популяций CD8+ Т-клеток-супрессоров, способных
подавлять пролиферативную и цитотоксическую
активность Т-клеток-эффекторов. Особый интерес
представляют CD8+CD28− Т-клетки, повышение
количества которых в опухолевом микроокружении
и в периферической крови по данным различных
авторов ассоциируется с опухолевым ростом.
CD8+CD28−Т-клетки являются гетерогенной популяцией и включают в себя как клетки-супрессоры,
так и клетки-эффекторы. Это подтверждается продукцией ими и супрессорных (IL-10, IL-4, TGF-β)
и эффекторных (IFN-γ, TNF-α) цитокинов [8]. Во
многих экспериментальных и клинических исследованиях эта популяция характеризуется в основном как супрессорная [8; 9; 13; 18]. Filaci et al. [8]
продемонстрировали, что только CD8+CD28−, но
не CD8+CD28+ Т-клетки, выделенные из опухолевой ткани и метастатических лимфоузлов 42 больных с различными нозологическими формами
злокачественных опухолей, обладали супрессорной активностью. Клетки-супрессоры с фенотипом CD8+CD28− были обнаружены и в периферической крови этих пациентов.
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
СУБПОПУЛЯЦИОННЫЙ СОСТАВ ЛИМФОЦИТОВ…
Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови пациенток с HER2+ РМЖ
49
Таблица 1
HER2+ РМЖ
Маркер
CD3+
CD4+
CD3+CD4+
CD8+
CD3+CD8+
CD4/CD8
CD3+HLA-DR+
CD3+CD38+
CD16+CD56+
CD3+CD16+CD56+
CD3-CD16+CD56+
CD19+
CD8+CD28+
CD8+CD28+
CD8 CD28+/ CD8+CD28ЦТ активность ЕК-клеток
CD4+CD25+
CD4+CD25+FOXP3+
Патоморфоз
0-II степени
(группа А)
Патоморфоз
III–IV степени
(группа B)
Контроль
(m±St.Dev.) %
n = 13
1
69,4±13,5
38,2±12,2
37,2±12,3
20,9±10,8
16,7±10,8
2,1±0,85
8,3±4,9
6,4±4,1
36,2±22,8
16,2±18,4
19,8±13,7
5,7±3,8
9,5±6,0
14,0±5,0
0,76±0,57
42,3±11,3
5,6±3,3
0,23±0,26
(m±St.Dev.) %
n = 11
2
67,3±11,5
38,3±11,4
37,7±11,6
20,1±11,5
14,7±10,9
2,7±2,2
9,8±5,8
7,1±4,8
33,6±16,2
11,6±6,4
22,0±12,4
6,6±5,3
5,7±5,2
17,5±7,4
0,32±0,20
42,6±23,9
5,8±2,1
0,77±1,1
(m±St.Dev.) %
n = 28
3
74,9±6,3
44,5±10,4
44,2±10,5
26,0±8,9
20,4±7,8
1,96±0,95
6,6±2,7
16,4±13,2
24,8±10,7
9,8±5,6
15,0±7,7
8,0±5,7
11,8±5,2
15,0±9,1
1,15±0,88
44,6±12,4 ( n=19)
9,1±4,3 (n=14)
0,26±0,14 (n = 14)
P
Р 2;3 = 0,012
Р 2;3 = 0,041
Р 2;3 = 0,024
Р 1;3 = 0,024; Р 2;3 = 0,039
Р 2;3 = 0,039
Р 1;2 = 0,048; Р 2;3 = 0,0012
Р 1;2 = 0,007; Р 2;3 = 0,0004
Р 1;3 = 0,029; Р 2;3 = 0,035
Р 1;2 = 0,0026; Р 2;3 = 0,005
Таблица 2
Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови пациенток с Т-Н РМЖ.
Т-Н РМЖ
Маркер
Патоморфоз
0-IIстепени
(группа C)
Патоморфоз
III–IV степени
(группа D)
Контроль
CD3+
CD4+
CD3+CD4+
CD8+
CD3+CD8+
CD4/CD8
CD3+HLA-DR+
CD3+CD38+
CD16+CD56+
CD3+CD16+CD56+
CD3-CD16+CD56+
CD19+
CD8+CD28+
CD8+CD28+
CD8 CD28+/ CD8+CD28ЦТ активность ЕК-клеток
CD4+CD25+
(m±St.Dev.) %
n = 11
1
70,2±9,9
42,9±8,7
39,5±8,4
25,6±11,8
21,4±12,2
1,94±1,17
6,96±3,3
9,7±11,1
25,7±8,1
9,4±6,1
15,9±6,8
7,2±6,0
10,1±6,8
13,7±10,9
0,997±0,73
48,5±26,4
8,1±3,5
(m±St.Dev.) %
n = 20
2
73,3±8,3
44,1±7,5
45,7±6,0
24,1±12,3
18,4±12,8
2,44±1,53
11,1±6,98
5,4±2,9
25,9±7,6
10,4±6,3
13,1±6,4
7,2±3,9
7,7±4,5
15,9±8,7
0,52±0,27
57,3±20,8
7,4±8,8
(m±St.Dev.) %
n = 28
3
74,9±6,3
44,5±10,4
44,2±10,5
26,0±8,9
20,4±7,8
1,96±0,95
6,6±2,7
16,4±13,2
24,8±10,7
9,8±5,6
15,0±7,7
8,0±5,7
11,8±5,2
15,0±9,1
1,15±0,88
44,6±12,4 (n=19)
9,1±4,3
№ 2/том 14/2015
P
P 1;2 = 0,03
P 2;3 = 0,037
P 2;3 = 0,009
P 2;3 = 0,009
P 1;2 = 0,019; P 2;3 = 0,006
P 2;3 = 0,036
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
50
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
СУБПОПУЛЯЦИОННЫЙ СОСТАВ ЛИМФОЦИТОВ…
Ни у одного из обследованных здоровых доноров (> 50 человек) эти клетки супрессорную активность не проявляли. При различных патологических состояниях большое значение имеет баланс
между CD8+CD28+ и CD8+CD28− Т-клетками [6]. Мы
обнаружили у пациенток группы В статистически
значимое уменьшение величины соотношения
CD8+CD28+/CD8+CD28− по сравнению с контролем и
по сравнению с группой А, которое было главным
образом связано со снижением количества CD8 Тлимфоцитов, экспрессирующих костимуляторный
рецептор CD28 (CD8+CD28+). Среднее значение этого показателя в группе В было в 2 раза ниже, чем в
контрольной группе (табл. 1). Непараметрический
корреляционный анализ Спирмена выявил умеренную статистически значимую отрицательную связь
между степенью лечебного патоморфоза опухоли и
величиной соотношения CD8+28+/CD8+28− в периферической крови больных HER2+ РМЖ (коэффициент корреляции r=−0,480, Р=0,0018). Статистически
значимой взаимосвязи между величиной соотношения CD8+CD28+/CD8+CD28− Т-клеток и количеством
CD3+, СD3+CD8+, CD3−CD16+CD56+ и СD3+CD38+
лимфоцитов выявлено не было.
Следует отметить, что как и у больных HER2+
РМЖ (группа В), у пациенток с Т-Н РМЖ с высокой
степенью лечебного патоморфоза (группа D) было
снижено процентное содержание CD8+CD28+ клеток
по сравнению с контролем и величина соотношения
CD8+CD28+/CD8+CD28− по сравнению с контролем и
группой С (табл. 2). Однако корреляционный анализ
Спирмена не выявил в данном случае связи между
степенью лечебного патоморфоза опухоли и соотношением CD8+CD28+/CD8+CD28− или количеством
CD8+CD28+ Т-лимфоцитов.
Важную роль в обеспечении иммунологической аутотолерантности и негативном контроле как
патологических, так и физиологических иммунных
реакций играют регуляторные CD3+CD25+FOXP3+
Т-клетки. Они могут подавлять пролиферативную и
функциональную активность различных иммунокомпетентных клеток, включая CD4+ и CD8+ Тклетки, и наряду с другими иммуносупрессивными
факторами обеспечивать прогрессивный рост опухоли [17]. При многих вариантах злокачественных
опухолей, в том числе и при РМЖ, повышение количества регуляторных CD4+CD25+FOXP3+ Тклеток в опухолевом узле и периферической крови
коррелирует с плохим прогнозом заболевания [2].
Однако при раке толстой кишки [11], сквамозоклеточной карциноме головы и шеи [4] и при некоторых других формах опухолей было обнаружено,
что повышенное количество Трег в опухоли может
являться благоприятным признаком и ассоциироваться с увеличением выживаемости и продолжительности безрецидивного периода. В то же время,
имеются сообщения о корреляции повышенного
количества Трег в опухоли и периферической крови больных раком толстой кишки с прогрессивным
опухолевым ростом [12].
Проведенное нами исследование показало,
что до лечения у пациенток с HER2+ РМЖ с III–IV
№ 2/том 14/2015
степенью лечебного патоморфоза (группа B) среднее количество Трег в периферической крови было
в 3,34 раза выше, чем у пациенток с 0– II степенью
(группа А) (Р=0,0026), и в 2,96 выше, чем в контроле (Р=0,005; табл. 1, рис.).
*P < 0,05 по сравнению с контролем
** P < 0,05 по сравнению с группой А
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
Патоморфоз 0‐2
степени (гр А)
Патоморфоз 3‐4
степени (гр.В)
Контроль
Рис. Количество регуляторных CD4+CD25+FOXP3+
Т-клеток у пациенток с HER2+ РМЖ с различной
степенью лечебного патоморфоза опухоли.
Непараметрический корреляционный анализ
Спирмена выявил умеренную положительную
связь между степенью лечебного патоморфоза опухоли и процентным содержанием Трег в периферической крови больных HER2+ РМЖ (коэффециент
корреляции r=0,547 Р=0,0069). По мнению различных авторов, положительная роль Трег в определённых ситуациях может быть связана с их влиянием на воспаление, которое сопровождает опухолевый рост и является одним из важных факторов,
способствующих пролиферации опухолевых клеток, ангиогенезу и метастазированию [4; 5; 11]. С
другой стороны, повышение количества Трег может отражать реакцию клеток-супрессоров на эффективный противоопухолевый иммунный ответ,
существующий до лечения у пациенток с высоким
ответом на противоопухолевую терапию. У больных с различными вариантами злокачественных
опухолей, включая рак молочной железы, часто
обнаруживаются спонтанно возникшие активированные Т-клетки и антитела к различным опухолеассоциированным антигенам [15]. Ранее мы продемонстрировали значительно более выраженное
снижение количества Трег у эффективно леченных
больных HER2+ РМЖ (с высокой степенью лечебного патоморфоза опухоли), по сравнению с пациентками с низкой степенью, после 2–4 курсов химио-и/или таргетной (трастузумаб + лапатиниб)
терапии [3]. Можно предположить, что уменьшение опухолевой нагрузки под действием терапии и
эффективного иммунного ответа приводит к снижению активности последнего и соответственно
снижению количества регуляторных Т-клеток. Частично это подтверждается обнаруженной нами статистически значимой положительной корреляцией
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
СУБПОПУЛЯЦИОННЫЙ СОСТАВ ЛИМФОЦИТОВ…
между уровнем Трег в периферической крови у
больных HER2+ РМЖ и степенью лечебного патоморфоза опухоли. Полученные нами результаты и
данные других авторов позволяют сделать вывод о
том, что повышенное по сравнению с нормой количество регуляторных CD4+CD25+FOXP3+ Т-клеток
в опухолевом узле и периферической крови до лечения не во всех случаях следует рассматривать как
отрицательный фактор прогноза заболевания. Необходимо изучать динамику изменений этого показателя в процессе лечения и корреляцию этих изменений с выживаемостью и продолжительностью
безрецидивного периода.
В исследованиях нашей лаборатории у больных первично-операбельным РМЖ мы обнаружили, что количество регуляторных NKT и
CD8+CD28- лимфоцитов зависело от стадии заболевания: оно было выше нормы на ранних и снижалось до нормы на поздних стадиях заболевания [1].
Определение ЦТА NK-клеток у всех обследованных пациенток до лечения показало, что у
больных HER2+ РМЖ ЦТА NK-клеток была практически одинаковой у больных обеих групп (А и В)
и не отличались от контроля.
В то же время, при Т-Н РМЖ среднее значение показателя в группе пациенток с высокой степенью патоморфоза было выше, чем в контроле
(р=0,036) и в группе с низкой степенью патоморфоза, хотя в последнем случае различие не было статистически значимым (табл. 1 и 2).
51
Выводы
У больных HER2+ РМЖ с высокой степенью лечебного патоморфоза опухоли
до лечения выявляется повышение количества регуляторных CD4+CD25+FOXP3+
Т-клеток по сравнению с пациентками с
низкой степенью патоморфоза и с контролем.
2. У больных HER2+ РМЖ и Т-Н РМЖ с
высокой степенью лечебного патоморфоза опухоли до лечения определяется
уменьшение величины соотношения
CD8+CD28+/CD8+CD28− Т-клеток.
3. У больных Т-Н РМЖ с высокой степенью патоморфоза до лечения наблюдается повышение цитотоксической активности естественных киллеров.
4. Определение связи между состоянием
иммунной системы до лечения и эффективностью проводимой терапии, продолжительностью безрецидивного периода, развитием метастазов и общей
продолжительностью жизни пациентов
может помочь в разработке индивидуальных подходов к терапии больных
злокачественными новообразованиями.
Работа поддержана грантом РФФИ № 1404-00867.
1.
Литература
1.
Кадагидзе З.Г., Черткова А.И., Заботина Т.Н. и др. Основные субпопуляции регуляторных лимфоцитов у больных злокачественной меланомой и раком молочной железы // Иммунология. – 2014. –
35. – С. 64–67.
2.
Кадагидзе З.Г., Черткова А.И., Славина Е.Г. Регуляторные Т-клетки и их роль в противоопухолевом
иммунном ответе // Вопр. Онкол. – 2009. – 55 – С. 269 – 77.
3.
Черткова А.И., Славина Е.Г., Ганьшина И.П. и др. Популяционный состав лимфоцитов периферической крови больных РМЖ с гиперэкспрессией HER-2 в процессе таргетной терапии трастузумабом и
лапатинибом // Вестник «РОНЦ им. Н.Н. Блохина». – 2014. – 25. – C. 59–63.
4.
Badoual C., Hans S., Rodriguez J. et al. Prognostic value of tumorinfiltrating CD4(+) T-cell subpopulations
in head and neck cancers // Clin. Cancer Res. – 2006. – 12. – P. 465–72.
5.
Colotta F., Allavena P., Sica A. Cancer related inflammation, the seventh hallmark of cancer: links to genetic instability // Carcinogenesis. – 2009. – 30. – P. 1073–81.
6.
Dai S.X., Wu G., Zou Y. et al. Balance of CD8+ CD28+/CD8+ CD28- T lymphocytes is vital for patients with
ulcerative colitis // Dig. Dis. Sci. – 2013. – 58. – P. 88–96.
7.
de Ruijter T.C., Veeck J., de Hoon J. P. J., van Engeland M. Characteristics of triple-negative breast cancer
// J Cancer Res. Clin.Oncol. – 2011. – 137 – P. 183–92.
8.
Filaci G., Fenoglio D., Fravega M. CD8+CD28- T regulatory lymphocytes inhibiting T cell proliferative and
cytotoxic functions infiltrate human cancers // J. Immunol. – 2007. – 179. – P. 4323–34.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
52
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
9.
СУБПОПУЛЯЦИОННЫЙ СОСТАВ ЛИМФОЦИТОВ…
Karagöz B., Bilgi O., Gümüs M. et al .CD8+CD28- cells and CD4+CD25+ regulatory T cells in the peripheral
blood of advanced stage lung cancer patients // Med.Oncol.– 2010.– 27.– P. 29–33
10. Kim R., Emi M., Tanabe K. Cancer immunosuppression and autoimmune disease: beyond immunosuppressive networks for tumour immunity // Immunology.− 2006.− 119.−P. 254–64.
11. Ladoire S., Martin F., Ghiringhelli F. Prognostic role of FOXP3+ regulatory T cells infiltrating human carcinomas: the paradox of colorectal cancer // Cancer Immunol. Immunother. – 2011. – 60. – P. 909–18.
12. Liu Z., Huang Q., Liu G. et al. Presence of FOXP3+Treg cells is correlated with colorectal cancer progression // Int. J. Clin. Exp. Med. – 2014. – 7. – P. 1781–85.
13. Meloni F., Morosini M., Solari N. et al. Foxp3 expressing CD4+CD25+ and CD8+CD28- T regulatory cells in
the peripheral blood of patients with lung cancer and pleural mesothelioma // Hum. Immunol. – 2006. – 67.
– P. 1–12.
14. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay // J. Immunol. Meth. – 1983. – 65. – P. 55–63.
15. Nagorsen D., Scheibenbogen C., Marincola F.M.et al. Natural T Cell Immunity against Cancer // Clin. Cancer Res. – 2003. – 9. – P. 4296–03.
16. Quezada S.A., Peggs K.S., Simpson T.R., Allison J.P. Shifting the equilibrium in cancer immunoediting:
from tumor tolerance to eradication // Immunol. Rev. – 2011. – 241. – P. 104–18.
17. Shevach E.M. Mechanisms of Foxp3+ T regulatory cell-mediated suppression // Immunity. – 2009. – 30. – P.
636−45.
18. Urbaniak-Kujda D., Kapelko-Słowik K., Wołowiec D. et al. Increased percentage of CD8+CD28- suppressor
lymphocytes in peripheral blood and skin infiltrates correlates with advanced disease in patients with cutaneous T-cell lymphomas // Postepy Hig. Med. Dosw. – 2009. – 63. – P. 355–59.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ПОДАВЛЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ КЛЕТОЧНОЙ…
53
УДК 616-006.484-02:577.15.08:615.849.14
И.В. Уласов1; 2, Н.В. Каверина2, З.Г. Кадагидзе2, А.Ю. Барышников2
ПОДАВЛЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ КЛЕТОЧНОЙ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ ТИП 14
УСИЛИВАЕТ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЙ ЭФФЕКТ ТЕМОЗОЛОМИДА
И ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ В КЛЕТКАХ ГЛИОБЛАСТОМ ЧЕЛОВЕКА
1
Центр опухолей головного мозга, Шведский медицинский центр, Сиэтл, США
2
ФГБНУ «РОНЦ им Н.Н. Блохина», Москва
Контактная информация
Уласов Илья Валентинович, к.б.н., ведущий сотрудник центра лечения опухолей головного мозга
адрес: 550 17th Avenue, suite 570, Seattle, Wa, 98122, USA; тел. +1-206-991-2053
e-mail: [email protected]
Статья поступила 03.10.2014, принята к печати 27.04.2015.
Резюме
Цель исследования – дать клиническую и биологическую характеристику ММП14 как гену, способствующему появлению реккурентной глиобластомы.
Проанализированы клинические данные 108 и 129 образцов, представленные базами данных Rembrandt и
Oncomine. Биологическое значение ММП14 было проанализировано путем нокдауна клеток U87 и U251 с последующим анализом их клеточного деления с помощью проточной цитофлуориметрии и генетического анализа уровня экспрессии генов, отвечающих за клеточное деление.
Ингибирование ММП14 нарушало деление опухолевых клеток и приводило к накоплению их в фазе G 2
клеточного деления, что коррелируют с уровнем экспрессии специфических киназ. Последующее облучение клеток ионизирующей радиацией и лечение темозоломидом приводило к значительному нарушению клеточной пролиферации, а комбинация темозоломида с ионизирующим излучением усиливала противоопухолевый эффект.
Полученные данные свидетельствуют о значительном уровне экспрессии ММП14 в неопластических
клетках глиобластом. Коррекция гена ММП14, отвечающего за резистентность к темозоломиду и ионизирующей радиации, приводит к усилению их антиопухолевого эффекта.
Ключевые слова: глиобластома человека, MMP14, темозоломид.
I.V. Ulasov1; 2, N.V. Kaverina2, Z.G. Kadagidze2, A.Y. Baryshnikov2
INHIBITION OF MT1-MMP (MMP14)
IMPROVES ANT-GLIOMA EFFECT OF COMBINATION:
TEMOZOLOMIDE-IONIZING RADIATION IN THE GLIOBLASTOMA CANCER CELLS
1
The Center for Advanced Brain Tumor Treatment, Swedish Medial Center, Seattle, USA;
2
FSBSI «N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center», Moscow
Abstract
The main goal of our study is to provide clinical and biological assessment of MMP14 as gene that causes recurrent glioblastoma. We analyzed expression of MMP14 in 108 and 129 samples represented by Rembrandt
8РOncomine databases. The biological significance was done is based on genetic knockdown and rescuing of
MMP14 attenuated U87 and U251 glioma cells followed by cytofluorimetry and array gene expression. As expected,
genetic silencing of MMP14 led to accumulation cells in the “G 2 ” phase of cell divisions which correlates to cell
kinase’s expression. Furthermore, exposure of MMP14 to ionizing radiation and temozolomidt treatments prolongs
glioma cell proliferation and increase the anti-glioma effect of temozolomide-ionizing radiation therapeutic combination. Our data suggest that most of the neoplastic glioma cells express significantly MMP14.Therefore, alteration of
MMP14, improves anti-tumor effect.
Keywords: glioblastoma multiforme, MMP14, Temozolomide.
Введение
ГБМ представляет собой агрессивную опухоль головного мозга человека, которая обладает
высокой резистентностью к стандартной терапии
№ 2/том 14/2015
[1; 3; 8]. Текущие терапевтические подходы, основанные на хирургической резекции, радиотерапии и
химиотерапии, пролонгируют выживаемость пациентов, но не предотвращают появление рекуррентной опухоли [11]. Таким образом, понимание мехаРОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
54
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
низма, отвечающего за образование опухоли, имеет
большое клиническое значение.
Металлопротеиназы являются ключевыми
молекулами, отвечающими за миграцию и инвазию
опухолевых клеток [2; 3]. Среди всех возможных
типов металлопротеиназ, металлопротеиназа типа
14 является важным регулятором жизнеобеспечения опухоли. Недавно опубликованные результаты
показывают, что роль ММП14 в процессе формирования опухоли не ограничена только миграцией
[7]. Оказалось, что ММП14 участвует в ангиогенезе
клеток и активации резистентности к терапии [9;
14]. Более того, ингибирование опухолевых клеток
полиММП-ингибитором, химическим агентом маримастат, продлевало жизнь больных с опухолями
головного мозга после стандартного курса радиотерапии [6; 10]. Наши недавние результаты показывают, что ингибирование ММП14 нарушает пролиферацию опухолевых клеток [12]. Таким образом,
впервые показана роль ММП14 в регуляции пролиферации клеток глиобластом. В настоящей работе нами продемонстрирована ведущая роль ММП14
в регуляции деления клеток, а также важное значение ингибирования ММР14 для терапии глиобластом человека в присутствии ионизирующей радиации и темозоломида.
Материалы и методы
Клеточные линии
Эмбриональные клетки почки эмбриона человека HEK293, клетки глиобластомы человека
U251 и U87 были получены из американской коллекции клеточных линий (ATCC, Manassas, США).
Клетки были выращены в Дульбеко модифицированной среде Игла (DMEM; Life Technologies,
США), содержащей 10 %-ной фетальной бычьей
сыворотки (GIBCO-Life Technologies, США), Lглутамин (2мM), пенициллин (100 IU/мл), стрептомицин (50 мг/мл) в 5 % CO 2 при температуре
+37 °C.
Химические реагенты и вирусные векторы
Темозоломид и поли-ММП ингибитор маримастат были получены из Sigma-Aldrich (St Luis,
Миссури, США). В качестве растворителя для темозоломида использовали ДМСО, для маримастата
– воду. Для тестов in vitro использовали стоковый
раствор (100 мM для темозоломида и 3,8 мM для
маримастата), из которого готовили ряд десятикратных разведений в среде ДМЕМ или МЕМ. Все стоковые растворы хранили при температуре –20 °C. Для
получения стабильно-трансфицированных линий клеток по методу, описанному ранее [12], был использован лентивирусный вектор (Mission shRNA lentivirus
transduction particles, Sigma Chemicals, St Luis, Миссури, США), содержащий либо контрольную анти-сенс
(SHC002V), либо смысловую к гену ММП14 человека
(NM_004995.2, TRCN0000050854) РНК.
Количественный ПЦР
Тотальная РНК была выделена из U87 и
№ 2/том 14/2015
ПОДАВЛЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ КЛЕТОЧНОЙ…
U251 клеток глиобластом человека, стабильно
трансфицированных лентивирусом содержащим
анти-сенс РНК к РНК гена ММП14 или контрольный
РНК с помощью набора Rneasy mini kit (Qiagen,
США). 1X TaqMan® One-Step RT-PCR Master Mix
Reagents Kit (Applied Biosystems, Foster City, Калифорния, США) использовали для получения кДНК, ее
копийность анализировали с помощью ПЦР в реальном времени. Реакцию количественного ПЦР с праймерами проводили на амплификаторе Opticon 2 (BioRad, USA). Последовательности праймеров, использованные в количественном ПЦР, были опубликованы раннее [5; 13; 15]. В качестве референсного гена
использовали актин [4].
Определение ассоциации гена ММП14
с генами, участвующими в делении клеток
Аттенуированные лентивирусом, содержащим либо анти-сенс РНК к ММП14, либо контрольную РНК, клетки глиобластом человека U87 и
U251, выращенные в присутствии пуромицина,
были использованы для выделения тотальной РНК
с последующим анализом экспрессии клеточных
генов, используя SAbioscience cell cycle RT2 profiler
PCR (Qiagen, США). Уровень экспрессии каждого
из 84 генов, участвующих в регуляции клеточного
деления и дифференцировки, был определен по
отношению к уровню РНК актина.
Тест для определения
пролиферации клеток (MTT)
Опухолевые клетки культивировали при температуре +37 °С в присутствии 5 % СО 2 в среде
ДМЕМ, содержащей 2 мМ L-глутамина и 10% фетальной бычьей сыворотки («Atlanta Bio», Atlanta,
США). Клетки, достигшие логарифмической фазы
роста, пересаживали в плоскодонные 96-луночные
микропланшеты («Costar», США) по 5 000–6 000
клеток на лунку и преинкубировали в указанных
выше условиях в течение 24 ч перед добавлением
тестируемого вещества – темозоломида в количестве
10 или 100 мкМ. Через 120 ч от начала эксперимента
в каждую лунку добавили 3-(4,5-диметилтиазолил-2ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид (МТТ).
Спустя 4 часа инкубации при 5% CO 2 и 37
°C, в каждую лунку добавили 100 мкл ДМСО для
ингибирования метаболической реакции и растворения формазана, образованного активно делящимися клетками. Оптическое поглощение было измерено при длине волны 540 нм. Жизнеспособность клеток производили по исключению красителя трипанового синего (Fisher Scientific США). Облучение клеток в присутствии ДМСО или темозоломида осуществлялось в установке «Phillips» в
суммарной дозе 2 Гр при помощи дозы 1 Гр/мин.
Биоинформатический анализ
экспрессии генов
с использованием научных баз данных
Использовали базы данных Oncomine и
Rembrandt, содержащие данные об экспрессии генов в тканях и клеточных линиях, выделенных от
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
онкологических больных с различной степенью
ПОДАВЛЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ КЛЕТОЧНОЙ…
55
злокачественности.
Рис. 1. Клиническое значение экспрессии ММП14 для пациентов с глиобластомами:
А. Влияние ММП14 на выживаемость;
Б. Графический анализ экспрессии гена ММП14 в клетках пациентов с первичными и вторичными
глиобластомами и здоровых пациентов;
В. Уровень экспрессии гена ММП14 в клетках пациентов с глиобластомами, *p<0,05.
Уровень выживаемости пациентов с глиобластомами мозга в зависимости от уровня экспрессии в тканях гена ММП14, был проанализирован с помощью Каплан-Мейер кривой выживаемости и логарифмических данных, показывающих сравнительные уровни экспрессии в тканях здоровых и онкологических больных, для построения диаграмм.
Статистический анализ
Результаты представлены в виде стандартного
значения ± стандартное отклонение. Статистический
анализ был выполнен с использованием теста Стьюдента (SPSS 13.0, Чикаго, Иллинойс, США). Разница
меньше 0,05 означала существенное различие.
Результаты и обсуждение
Данные, представленные на рис 1, А, показывают, что уровень ММП14 существенно влияет
на выживаемость пациентов с глиобластомой ГМ.
Оказалось, что в тканях пациентов, имеющих более
№ 2/том 14/2015
агрессивную форму глиомы – вторичную, и высокий уровень экспрессии ММП14, уровень выживаемости сравнительно низок по отношению к выживаемости пациентов с первичной глиомой
(p=0,024, соотношение риска (HR)=0,42). На молекулярном уровне мы определили, что пациенты со
вторичными глиомами имеют более высокий уровень экспрессии ММП14 (как группа), в сравнении
с таковым первичной ГБМ (рис. 1, Б). Эти данные
показывают, что ММП14 вовлечен в патологический процесс, а возможное его ингибирование может иметь важное терапевтическое значение.
На следующем этапе работы мы проанализировали уровень изменчивости генов, отвечающих
за клеточной деление и имеющих тесное взаимодействие с ММП14. Оказалось, что ингибирование
ММП14 сушественно увеличивало экспрессию генов, отвечающих за восстановление поврежденной
ДНК и клеточное деление (рис. 2, А). Последующий количественный ПЦР подтвердил, что уровень
ATM, ATR, CDK, а также циклин Е в ММП14аттенуированных клетках был увеличен в среднем
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
56
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
в 3–52 раза по отношению к Scramble (контроль)
ПОДАВЛЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ КЛЕТОЧНОЙ…
инфицированным клеткам (рис. 2, Б).
Рис. 2. Транскрипционный анализ экспрессии генов, вызванных ингибированием ММП14.
А. Результаты аттенуации генов клеток линии U87 при ингибировании ММП14;
Б. Количественный анализ экспрессии РНК генов в стабильно-аттенуированных клетках линий U87 и
U251. Эксперименты повторены трижды, *p<0,05.
Рис. 3. Маримастат сенсибилизирует клетки глиобластом к комбинации темозоломида и ионизирующей радиации:
А. Маримастат нарушает клеточное деление U118 и аккумулирует клетки в G2 фазе клеточного
цикла;
Б. Влияние терапии с применением маримастата на пролиферацию клеток глиобластом U87, U118 и
U251 в присутствии ионизируюшей радиации (2 Грей, XRT) и темодара (10 или 100 мкМ). Анализ
уровня пролиферации проведен с помощью МТТ-теста. Результаты получены на основании 2 независимо проведенных экспериментов, содержащих 4 повтора на каждый вид терапии, *p<0,05;
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ПОДАВЛЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ КЛЕТОЧНОЙ…
57
**P<0,01; ***p<0,001.
Рис. 4. Генетическое ингибирование ММП14 усиливает эффект темозоломида и ионизирующей радиации. Аккумуляция клеток U87 и U251 в фазе G 2 клеточного цикла ассоциирована с ингибированием ММП14.
Tемозоломид (100мкМ) и ионизирующая радиация (2 Грей, однократное облучение).
Таким образом, наши результаты свидетельствуют, что ген ММП14 регулирует экспрессию клеточных циклин-зависимых киназ и активирует механизм восстановления поврежденной ДНК.
При изучении противоопухолевой активности ММП14 нами впервые показано, что ингибирование ММП14 снижает пролиферацию клеток
глиобластомы. В данной работе нами показано, что
нарушение клеточного деления путем ингибирования мРНК гена ММП14 приводило к усилению эффекта темозоломида и ионизирующей радиации.
Так, однократное облучение клеток ионизирующей радиацией в присутствии ингибитора
ММП14 увеличивало токсичность с 11% до 42 % в
различных линиях клеток. Более того, в случае
применения темозоломида в концентрациях 10 или
100 µМ наблюдалось статистически значимое усиление его противоопухолевого эффекта (p<0,05).
По-видимому, усиление токсичности темозоломида
и ионизирующей радиации наблюдалось вследствие сочетания их эффекта на клеточное деление,
что привело к снижению накопления клеток в фазе
G1 с 60 % до 39 % (U87) и с 43 % до 35 % (U251).
Параллельно мы детектировали, что уменьшение клеток в G1 фазе сопровождалось накоплением клеток в фазе G2 с 23 % до 42 % (U87) и с
39 % до 42 % (U251). Нами было установлено, что в
неопластических клетках наблюдалось усиление
противоопухолевого эффекта темозоломида и ионизирующей радиации в случае генетического нокдауна ММП14.
Заключение
Таким образом, наши результаты показывают, что экспрессия гена ММП14 тесно связана с
экспрессией генов, отвечающих за регуляцию клеточного деления. Более того, значительное ингибирование клеточного деления вледствие интерефереции РНК гена ММП14 приводило к усилению эффекта темозоломида и ионизирующей радиации.
Результаты использования ингибитора ММП маримастата, применяющегося в экспериментальном лечении глиобластом человека, позволяют говорить
наличии терапевтического эффекта ингибирования
ММП14, что может быть полезно в нейроонкологии.
Литература
1.
Брюховецкий И.С., Брюховецкий А.С., Мищенко П.В., Хотимченко Ю.С. Роль системных механизмов
миграции и хоуминга стволовых клеток в развитии злокачественных опухолей центральной нервной
системы и разработка новых методов противоопухолевой терапии // Российский биотерапевтический
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
58
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ПОДАВЛЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ КЛЕТОЧНОЙ…
журнал. – 2013. – Т. 12, № 4. – С. 3–12.
2.
Степанова Е.В., Зейналова К.Р. Механизмы резистентности к трантузумабу // Российский биотерапевтический журнал. – 2011. – Т. 10, № 4. – С. 3–8.
3.
Уласов И.В., Каверина Н.В., Кадагидзе З.Г., Барышников А.Ю. Антиглиомная аденовирусная виротерапия: механизм, регуляция и клинические перспективы // Российский биотерапевтический журнал.
– 2014. – Т. 13, № 2. – С. 11–8.
4.
Banerjee N.S., Rivera A.A., Wang M. et al. Analyses of melanoma-targeted oncolytic adenoviruses with tyrosinase enhancer/promoter-driven E1A, E4, or both in submerged cells and organotypic cultures // Mol
Cancer Ther. – 2004. – 3(4). – P. 437–49.
5.
Fernandez-Vidal A., Ysebaert L., Didier C. et al. Cell adhesion regulates CDC25A expression and proliferation in acute myeloid leukemia // Cancer Res. – 2006. – 66(14). – P. 7128–35.
6.
Groves M.D., Puduvalli V.K., Hess K.R. et al. Phase II trial of temozolomide plus the matrix metalloproteinase inhibitor, marimastat, in recurrent and progressive glioblastoma multiforme // J Clin Oncol. – 2002.
– 20(5). – P. 1383–8.
7.
Hagemann C., Anacker J., Ernestus R.I., Vince G.H. A complete compilation of matrix metalloproteinase
expression in human malignant gliomas // World J. Clin. Oncol. – 2012. – 3(5). – P. 67–79.
8.
Kim J.H., Bae Kim Y., Han J.H. et al. Pathologic diagnosis of recurrent glioblastoma: morphologic, immunohistochemical, and molecular analysis of 20 paired cases // Am. J. Surg. Pathol. – 2012. – 36(4). – P. 620–
8.
9.
Lehti K., Allen E., Birkedal-Hansen H. et al. An MT1-MMP-PDGF receptor-beta axis regulates mural cell
investment of the microvasculature // Genes Dev. – 2005. – 19(8). – P. 979–91.
10. Levin V.A., Phuphanich S., Yung W.K. et al. Randomized, double-blind, placebo-controlled trial of marimastat in glioblastoma multiforme patients following surgery and irradiation // J Neurooncol. – 2006. – 78(3). –
P. 295–302.
11. Li R., Li G., Deng L. et al. IL-6 augments the invasiveness of U87MG human glioblastoma multiforme cells
via up-regulation of MMP-2 and fascin-1 // Oncol Rep. – 2010. – 23(6). – P. 1553–9.
12. Ulasov I., Yi R., Guo D. et al. The emerging role of MMP14 in brain tumorigenesis and future therapeutics //
Biochim Biophys Acta. – 2014. – 1846(1). – P. 113–20.
13. Saini D., Shelke S., Mani Vannan A. et al. Transcription profile of DNA damage response genes at G(0)
lymphocytes exposed to gamma radiation // Mol Cell Biochem. – 2012. – 364(1/2). – P. 271–81.
14. Ulasov I., Thaci B., Sarvaiya P. et al. Inhibition of MMP14 potentiates the therapeutic effect of temozolomide and radiation in gliomas // Cancer Med. – 2013. -2(4). – P. 457–67.
15. Wang H., Wang S., Shen L. et al. Chk2 down-regulation by promoter hypermethylation in human bulk gliomas // Life Sci. – 2010. – 86(5/6). – P. 185–91.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРЕПАРАТОВ ТЕМОБЕЛ…
59
УДК 616-006.484-08-059
В.В. Синайко1, Н.А. Артемова1, Т.Л. Юркштович2, П.М. Бычковский3, К.А. Фроленков4
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРЕПАРАТОВ ТЕМОБЕЛ
И ТЕМОДАЛ В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ
ВЫСОКОЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ (GRADE III–IV) ГЛИАЛЬНЫХ ОПУХОЛЕЙ
ГОЛОВНОГО МОЗГА
1
ГУ «РНПЦ онкологии и медицинской радиологии им. Н.Н. Александрова», Минск, Республика Беларусь
2
Учреждение Белорусского государственного университета «Научно-исследовательский институт физикохимических проблем», Минск, Республика Беларусь
3
Учебно-научно-производственное республиканское унитарное предприятие «Унитехпром БГУ», Минск, Республика Беларусь
4
Республиканское унитарное предприятие «Белмедпрепараты», Минск, Республика Беларусь
Контактная информация
Синайко Валерий Васильевич, заведующий радиологическим отделением № 2
адрес: 223040, Республика Беларусь, Минский район, а/г Лесной, ГУ РНПЦО и МР им. Н.Н. Александрова,
тел.: +375 29 692 28 32
е-mail: [email protected]
Статья поступила 28.01.2015, принята к печати 27.04.2015.
Резюме
В открытом ретроспективном сравнительном клиническом исследовании у 90 пациентов с высокозлокачественными (Grade III–IV) глиальными опухолями головного мозга в рамках послеоперационного курса химиолучевой терапии в суммарной очаговой дозе 50–60 Гр изучена эффективность препаратов Темобел производства РУП «Белмедпрепараты» и Темодал производства «Schering-Plough» (представительство АО «Schering-Plough Central East AG»). Сравниваемые группы, состоящие из 45 пациентов каждая, были полностью сопоставимы по прогностическим факторам,
влияющим на результаты лечения. Медиана выживаемости, 1- и 3-летняя общая выживаемость при использовании в
схеме комбинированного лечения препарата Темобел составила 20 мес., 72,7±6,7% и 23,7±9,5%, а препарата Темодал –
17 мес., 77,8±6,2% и 30,3±7,0% соответственно (Р=0,935). В то же время медиана выживаемости без прогрессирования
и 1- и 3-летняя выживаемость без прогрессирования заболевания при использовании препаратов Темобел и Темодал
составила 12 мес., 51,0±7,5%, 21,3±6,4% и 11 мес., 49,3±7,6%, 15,5±5,7% соответственно (Р=0,814). Статистически значимых различий в выживаемости пациентов в сравниваемых группах установлено не было.
Ключевые слова: высокозлокачественные глиомы, химиолучевая терапия, Темобел, Темодал.
V.V. Sinaiko1, N.A. Artemova1, T.L. Yurkshtovich2, P.M. Bychkovsky3, K.A. Frolenkov4
COMPARATIVE EFFICACY OF TEMOBEL
AND TEMODAL DRUGS IN MULTIMODALITY TREATMENT
OF HIGH-GRADE (III–IV)
GLIAL BRAIN TUMORS
1
N.N. Alexandrov National Cancer Centre of Belarus, Minsk, Belarus
2
Belorusian State University, Research Institute for physical сhemikal Problem, Minsk, Belarus
3
Educational and Scientific Production Republican Unitary Enterprise «Unitehprom BSU», Minsk, Belarus
4
Republican unitary production enterprise Belmedpreparaty, Minsk, Belarus
Abstract
An open-label, retrospective comparative clinical trial evaluated the efficacy of Temobel (RUP Belmedpreparaty) and Temodal (Schering-Plough, the Office of the Joint-Stock Company «Schering-Plough Central East AG») in 90
patients with high-grade (III–IV) glial brain tumors within a postoperative chemoradiotherapy course (a total target dose
of 50–60 Gy). The compared groups, 45 patients in each, were fully matchable in prognostic factors affecting treatment
outcomes. Median survival, 1- and 3-year overall survivals with Temobel in the combination treatment scheme were 20
months, 72.7±6.7% and 23.7±9.5%, whereas with Temodal they were 17 months, 77.8±6.2% and 30.3±7.0% respectively (P=0.935). Meanwhile, progressive-free median survival and progressive-free 1- and 3-year survival with Temobel and Temodal were 12 months, 51.0±7.5%, 21.3±6.4% and 11 months, 49.3±7.6%, 15.5±5,7% respectively
(P=0.814). No statistically significant differences were found in the survival of patients in the compared groups.
Key words: high-grade gliomas, chemoradiotherapy, Temobel, Temodal.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
60
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРЕПАРАТОВ ТЕМОБЕЛ…
Введение
Высокозлокачественные глиальные опухоли
головного мозга (Grade III–IV), и в первую очередь
глиобластома, являются самыми частыми и наиболее
агрессивными формами первичных опухолей головного мозга у взрослых, насчитывающими 2–3 случая
на 100 000 населения Европы и Северной Америки
[12; 19]. За последние 50 лет регистрируется постоянный рост заболеваемости глиобластомой в сочетании с увеличением смертности от этого заболевания,
причем рост заболеваемости напрямую не связан
только с повсеместным внедрением КТ и МРТ исследований для диагностики этого заболевания [7;
10; 12; 15]. В Республике Беларусь по данным,
сформированным на основе первичной обращаемости пациентов за медицинской помощью, показатель
заболеваемости всеми видами глиальных опухолей
составляет 3,9 на 100 000 населения, причем глиобластомы (Grade IV) и анапластические глиомы
(Grade III) составляют соответственно около 59,5 %
и 12,9 % от их общего количества [4].
Проблема эффективного лечения высокозлокачественных глиальных опухолей головного мозга
в настоящее время далека от своего решения. Ведущим в лечении глиом остается хирургический
метод, а в ряде рандомизированных исследований
статистически значимо была доказана эффективность стандартной (разовая очаговая доза (РОД)
1,8–2Гр, суммарная очаговая доза (СОД) 54–60Гр)
послеоперационной лучевой терапии [7; 8]. Однако
глиомы головного мозга относятся к радиорезистентным новообразованиям: в работе Р. Bouchard
на материале 63 аутопсий не было зарегистрировано ни одного случая полного исчезновения клеток
глиальной опухоли после облучения [9]. В связи с
этим, попытки улучшения результатов лучевой терапии путем увеличения СОД или использования
различных вариантов фракционирования дозы облучения не дали клинически значимых результатов.
Комбинация хирургического и лучевого методов
лечения высокозлокачественных опухолей головного мозга (Grade III–IV) обеспечивала медиану
выживаемости не более 9–12 месяцев при мультиформной глиобластоме и 36 месяцев при анапластических формах глиом [5; 13; 14].
Новые возможности в лечении глиобластом
открылись в связи с синтезом 4-метил-5-оксо2,3,4,6,8-пентаазобицикло [4,3,0]нона-2,7,9-триен9-карбоксамида (темозоломида) и созданием на его
основе готовой лекарственной формы – препарата
Темодал (производитель – фирма «ScheringPlough»), зарегистрированного для лечения злокачественных глиом. Отличительной особенностью
этого препарата, выгодно отличающей его от
большинства противоопухолевых агентов, является
пенетрация через гематоэнцефалический барьер.
Изучение этого свойства было предпринято при
использовании разных доз препарата (75 мг/м2 в
сутки и 200 мг/м2 в сутки) с определением уровня
препарата в плазме и спинномозговой жидкости
через 1,5–6 ч после приема. В пересчете на сред№ 2/том 14/2015
нюю дозу 200 мг/м2 в сутки отношение концентрации Темодала в спинномозговой жидкости к концентрации его в плазме составляет 29,4 %, а спустя
4 часа увеличивается до 40 % с достижением плато
(равновесия). Это свидетельствует о том, что Темодал легко проникает через гематоэнцефалический
барьер и может использоваться в лечении опухолей
головного мозга [6].
Эффективность Темодала при злокачественных глиомах вначале была установлена в нескольких исследованиях II фазы, а затем окончательно
подтверждена в результате рандомизированного
многоцентрового исследования, организованного
Европейской организацией по исследованию и терапии рака (EORTC) и отделом клинических исследований Национального института рака Канады
(NCIC). Было показано, что послеоперационная
химиолучевая (с использованием темозоломида)
терапия пациентов с глиобластомой в сравнении с
только послеоперационной лучевой терапией повышает медиану выживаемости и 5-летнюю выживаемость пациентов с 12,1 мес. до 14,6 мес. и с
1,9 % до 9,8 % соответственно (p<0,0001) [16; 17].
После публикации данных этого исследования использование темозоломида в программах лечения
пациентов с высокозлокачественными глиомами
головного мозга стало стандартом во всех онкологических клиниках мира [8; 18].
В связи с потребностью внутреннего рынка
страны в современных эффективных лекарственных
препаратах, в Учреждении образования Белорусского
государственного университета «Научно-исследовательский институт физико-химических проблем»
(НИИ ФХП БГУ) разработана технология получения,
а на УП «Унитехпром БГУ» освоена технология производства фармацевтической субстанции темозоломида [3]. С 2010 г. на РУП «Белмедпрепараты» разработана и освоена технология получения готовой лекарственной формы противоопухолевого препарата
Темобел из отечественной субстанции, являющейся
дженериком оригинального препарата Темодал производства фирмы «Schering-Plough», а с 09.2011 г.
началось клиническое использование этого препарата
в Республике Беларусь.
Цель исследования – сравнить клиническую эффективность препаратов Темобел (капсулы) производства РУП «Белмедпрепараты» и Темодал (капсулы) производства «Schering-Plough» в
комплексном лечении пациентов с высокозлокачественными (Grade III–IV) глиальными опухолями
головного мозга по критерию 3-летней выживаемости пациентов.
Материалы и методы
В проводимое на базе ГУ «РНПЦ онкологии
и медицинской радиологии им. Н.Н. Александрова»
открытое ретроспективное нерандомизированное
сравнительное клиническое исследование включено 90 пациентов (42 женщины и 48 мужчин в возрасте от 19 до 70 лет) с впервые выявленными опухолями головного мозга.
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРЕПАРАТОВ ТЕМОБЕЛ…
61
Таблица 1
Данные пациентов с высокозлокачественными (Grade III–IV) глиальными опухолями головного мозга
СтатистиПараметр
Темобел, n=45
Темодал, n=45
ческая значимость
Анапластическая астроцитома
11 (24,4%)
11 (24,4%)
р=1,000
Морфология
(Grade III)
Глиобластома (Grade IV)
34 (75,6%)
34 (75,6%)
р=1,000
50–60%
1 (2,2%)
3 (6,7%)
р=0,616
Шкала Карнов>70%
42 (93,3%)
41 (91,1%)
р=1,000
ского
Не определено
2 (4,4%)
1 (2,2%)
р=1,000
<50 лет
17 (37,8%)
18 (40%)
р=1,000
50-60 лет
20 (44,4%)
18 (40%)
р=0,831
Возраст
>60 лет
8 (17,8%)
9 (20%)
р=1,000
Среднее значение, лет
50,5±1,7
51,3±1,7
р=0,741
Полное (тотальное) удаление
17 (37,8%)
18 (40%)
р=1,000
опухоли
Результаты опеНеполное удаление опухоли
25 (55,6%)
27 (60%)
р=0,831
рации
Биопсия
1 (2,2%)
0 (0%)
р=1,000
Не определено
2 (4,4%)
0 (0%)
р=0,494
50-52 Гр
4 (8,9%)
5 (11,1%)
р=1,000
54-58 Гр
20 (44,4 %)
13 (28,9 %)
р=0,189
СОД лучевой
терапии
60 Гр
21 (46,7 %)
27 (60,0 %)
р=0,291
Среднее значение, Гр
56,9±0,5
57,7±0,5
р=0,255
2000-3000 мг
26 (57,8%)
29 (64,4%)
р=0,666
3200-4000 мг
5 (11,1%)
4 (8,9%)
р=1,000
Суммарная доза
4080-5000 мг
6 (13,3%)
3 (6,7%)
р=0,485
темозоломида
>5000 мг
8 (17,8 %)
9 (20%)
р=1,000
Среднее значение, мг
3559,6±184,9
3495,8±208,2
р=0,819
Таблица 2
Общая выживаемость пациентов с высокозлокачественными (Grade III–IV) глиальными опухолями головного
мозга
Статистическая
Период наблюдения
Темобел (n=45)
Темодал (n=45)
значимость
6 мес.
88,9±4,7%
95,6±3,1%
12 мес.
72,7±6,7%
77,8±6,2%
18 мес.
60,4±7,5%
44,4±7,4%
р=0,935
24 мес.
48,8±8,0%
39,9±7,3%
30 мес.
31,6±8,7%
35,2±7,2%
36 мес.
23,7±9,5%
30,3±7,0%
Выживаемость, медиана, мес.
20
17
Таблица 3
Выживаемость без прогрессирования у пациентов с высокозлокачественными (Grade III–IV) глиомами головного мозга
Статистическая
Период наблюдения
Темобел, n=45
Темодал, n=45
значимость
6 мес.
68,9±6,9%
88,6±4,8%
12 мес.
51,0±7,5%
49,3±7,6%
18 мес.
31,9±7,1%
28,2±6,9%
р=0,814
24 мес.
21,3±6,4%
25,8±6,7%
30 мес.
21,3±6,4%
20,6±6,3%
36 мес.
21,3±6,4%
15,5±5,7%
Выживаемость, медиана, мес.
12
11
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
62
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРЕПАРАТОВ ТЕМОБЕЛ…
Рис. 1. Общая выживаемость пациентов с высокозлокачественными (Grade III–IV) глиомами головного мозга в
зависимости от используемого лекарственного средства.
Рис. 2. Выживаемость без прогрессирования среди пациентов с высокозлокачественными (Grade III–IV) глиомами головного мозга в зависимости от используемого лекарственного средства.
В результате проведенного в 2011–2013 гг.
хирургического лечения у этих пациентов был установлен морфологический диагноз высокозлокачественной (Grade III–IV) глиальной опухоли головного мозга, причем общий клинический статус
пациентов по шкале Карновского перед началом
химиолучевого лечения составил  50 % (ECOG 0–
2). После операции все они получили курс химиолучевой терапии с последующим проведением до 6
курсов адъювантной химиотерапии темозоломидом. В рамках послеоперационного курса химиолучевой терапии проведено изучение сравнительной
эффективности препаратов Темобел (капсулы) производства РУП «Белмедпрепараты» (45 человек) и
Темодал (капсулы) производства «Schering-Plough»
(45 человек).
№ 2/том 14/2015
Конформная дистанционная химиолучевая
терапия у пациентов с высокозлокачественными
глиальными опухолями головного мозга проводилась с использованием классического режима
фракционирования дозы (РОД 1,8–2 Гр, СОД 50–
60 Гр), диапазон СОД определялся толерантностью
критических органов и тканей головного мозга,
главным образом ствола мозга, хиазмы и зрительных нервов [11]. В соответствии со стандартами
лечения этой категории пациентов в Республике
Беларусь, до 03.2012 г. темозоломид (Темобел либо
Темодал) назначался в дозе 75 мг/м2 внутрь ежедневно (5 дней в неделю) за 1 ч до проведения сеанса лучевой терапии в первые и последние 2 недели облучения, а после 03.2012 г. – в той же дозе в
течение всего курса лучевой терапии, включая выРОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРЕПАРАТОВ ТЕМОБЕЛ…
ходные и праздничные дни [1; 2]. Через 3–4 недели
после завершения химиолучевой терапии проводилось до 6 курсов химиотерапии темозоломидом в
дозе 150–200 мг/м2 внутрь в течение 5 дней, причем
курсы повторялись каждые 28 дней. Характеристика пациентов, включенных в исследование, с учетом прогностических факторов, влияющих на результаты лечения, представлена в табл. 1.
Оценка результатов лечения в сравниваемых
группах пациентов, статистически значимо не различающихся ни по одному из прогностических
факторов, влияющих на выживаемость, равно как и
по распределению в группы по средней и суммарной дозе темозоломида и СОД лучевой терапии
(р>0,05), проведена по показателям медианы выживаемости, общей выживаемости и выживаемости
без прогрессирования.
Общая выживаемость рассчитывалась от даты операции до даты смерти, либо даты последнего
наблюдения, если оно еще продолжалось на время
оценки результатов.
Выживаемость без прогрессирования рассчитывалась от даты операции до даты регистрации
прогресса заболевания, даты последнего наблюдения (если прогрессирования заболевания не было, и
пациент продолжал наблюдаться) либо даты смерти
пациента, если дату прогрессирования точно установить не удалось.
Статистический анализ выполнен на основании данных выживаемости канцеррегистра Республики Беларусь с применением статистической программы SPSS Statistics v. 17.
Результаты и обсуждение
В период оценки результатов лечения продолжали наблюдаться 37 из 90 (41,1 %) пациентов,
среди которых 22 (48,9 %) в послеоперационном
периоде получали Темобел и 15 (33,3 %) – Темодал
(р=0,282). Данные общей выживаемости пациентов
и выживаемости без прогрессирования представлены в табл. 2 и 3 и рис. 1 и 2.
Учитывая небольшие сроки наблюдения и
невозможность вследствие этого определения медианы выживаемости у пациентов с анапластической астроцитомой (Grade III; более половины па-
63
циентов на период анализа данных живы), дополнительно были оценены показатели выживаемости
у пациентов с глиобластомой (Grade IV). Медиана
выживаемости, 6-, 12-, 18-, 24-, 30- и 36-месячная
общая выживаемость при использовании в схеме
комбинированного лечения глиобластом препарата
Темобел составила 19 мес., 88,2±5,5%, 72,9±7,7%,
59,4±8,8%, 26,1±11,1%, 26,1±11,1% и 21,4±11,8%, а
препарата Темодал – 16 мес., 94,0±4,0%, 70,6±7,8%,
32,4±8,0%, 23,5±7,3%, 23,5±7,3% и 17,2±6,6% соответственно (р=0,262). В то же время, медиана выживаемости без прогрессирования и 6-, 12-, 18-, 24, 30- и 36-месячная выживаемость без прогрессирования заболевания при использовании препаратов
Темобел и Темодал составила 11 мес., 64,7±8,2%,
49,8±8,6%, 30,1±8,1%, 15,2±6,7%, 15,2±6,7%,
15,2±6,7% и 11 мес., 84,8±6,2%, 41,3±8,7%,
15,9±6,5%, 12,7±5,9%, 9,5±5,2%, 3,2±3,1% соответственно (р=0,479).
Как следует из представленных данных, при
использовании в схеме комбинированного лечения препаратов темозоламида производства РУП
«Белмедпрепараты» и фирмы «Schering-Plough»,
статистически значимых различий в трехлетней
выживаемости не было получено ни при лечении
пациентов с высокозлокачественными (Grade III–
IV) глиальными опухолями головного мозга вообще, ни при лечении пациентов с глиобластомой
в частности.
Заключение
Таким образом, на основании оценки результатов проведенного открытого ретроспективного
сравнительного исследования клинической эффективности лекарственных средств Темобел (капсулы) производства РУП «Белмедпрепараты» и Темодал (капсулы) производства «Schering-Plough» в
комплексном лечении пациентов с высокозлокачественными (Grade III–IV) глиальными опухолями
головного мозга, статистически значимых различий
в медиане выживаемости, 3-летней общей выживаемости и выживаемости без прогрессирования
заболевания не установлено.
Литература
1.
Аверкин Ю.И., Антоненкова Нина Н., Антоненкова Нат.Н. и др. Алгоритмы диагностики и лечения
больных злокачественными новообразованиями / под ред. И.В. Залуцкого, Э.А. Жаврида // Приказ
М-ва здравоохранения Респ. Беларусь № 80 от 09 февраля 2007 г. – Минск, 2007. – 509 с.
2.
Аверкин Ю.И., Антоненкова Нина Н., Антоненкова Нат.Н. и др. Алгоритмы диагностики и лечения
больных злокачественными новообразованиями / Под редакцией О.Г. Суконко, С.А. Красного //
Приказ М-ва здравоохранения Респ. Беларусь № 258 от 11 марта 2012 г. – Минск, 2012. – 508 с.
3.
Бычковский П.М., Юркштович Т.Л., Адамчик Д.А. и др. Фармацевтические субстанции и готовые лекарственные формы, разработанные в НИИ ФХП БГУ и производимые на УНП РУП «Унитехпром
БГУ» // Российский биотерапевтический журнал. – 2013. – Т. 12, № 2. – С. 15.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
64
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРЕПАРАТОВ ТЕМОБЕЛ…
4.
Короткевич Е.А., Жуковец А.Г., Киселева А.Е., Терехов В.С. Внутричерепные опухоли (эпидемиология, диагностика, лечение). – Минск, 2012. – 160 с.
5.
Олюшин В.Е. Глиальные опухоли головного мозга: краткий обзор литературы и протокол лечения
больных // Нейрохирургия. – 2005. – № 4. – С. 41–7.
6.
Поддубная И.В. Новый век – новые возможности химиотерапии: темодал в лечении злокачественных
опухолей // Современная онкология. – 2002. – Т. 4, № 1. – С. 12–5.
7.
Ahlbom A., Rodvall Y. Brain tumor trends // Lancet. – 1989. – 2. – P. 1272–3.
8.
Bartek J.Jr., Ng K., Bartek J. et al. Key сoncepts in glioblastoma therapy // J. Neurol. Neurosurg.
Psychiatry. – 2012. – 83(7). – P. 753–60.
9.
Bouchard P. Results of biopsy high-grade gliomas after high-dose radiotherapy // Am. J. Clin. Oncol. –
2000. – 22(1). – P. 22–33.
10. Davis D.L., Ahlbom A., Hoel D., Percy C. Is brain cancer mortality increasing in industrial countries? // Am.
J. Ind. Med. – 1991. – 19(4). – P. 421–31.
11. Emami B., Lyman J., Brown A. et al. Tolerance of normal tissue to therapeutic irradiation // Int. J. Radiat.
Oncol. Biol. Phys. – 1991. – 21(1). – P. 109–22.
12. Jemal A., Siegel R., Xu J., Ward E. Cancer statistics, 2010 // CA Cancer J. Clin. – 2010. – 60(5). – P. 277–
300.
13. Laperriere N., Zuraw L., Cairncross G. Radiotherapy for newly diagnosed malignant glioma in adults: a
systematic review // Radiother. Oncol. – 2002. – 64(3). – P. 259–73.
14. Mehta M.P., Buckner J.C., Sawaya R., Cannon G. Neoplasms of the central nervous system / Devita, Hellman & Rosenberg's Cancer: Principles & Practice of Oncology, 8th edition / V.T. De Vita, T. S. Lawrence,
S. A. Rosenberg (Eds.). – Lippincott Williams&Wilkins, 2008. – P. 1993–5.
15. Shugg D., Allen B.J., Blizzard L. et al. Brain cancer incidence, mortality and case survival: observations
from two Australian cancer registries // Int. J. Cancer. – 1994. – 59(6). – P. 765–70.
16. Stupp R., Hegi M.E., Mason W.P. et al. Effects of radiotherapy with concomitant and adjuvant temozolomide versus radiotherapy alone on survival in glioblastoma in a randomised phase III study: 5-year
analysis of the EORTC-NCIC trial // Lancet Oncol. – 2009. – 10(5). – P. 459–66.
17. Stupp R., Mason W.P., van den Bent M.J. et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide
for glioblastoma // N. Engl. J. Med. – 2005. – 352(10). – P. 987–96.
18. Weller M., van den Bent M., Hopkins K. et al. EANO guideline for the diagnosis and treatment of anaplastic
gliomas and glioblastoma // Lancet Oncol. – 2014. – 15(9). – P. 395–403.
19. Wen P.Y., Kesari S.N. Malignant gliomas in adults // Engl. J. Med. – 2008. – 359(8). – P. 492–507.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ИНГИБИРОВАНИЕ АКТИВНОСТИ КЛЕТОЧНЫХ…
65
УДК 616-006.482-085.2/.3.015.44:578.826
И.В. Уласов1,2, Н.В. Каверина2, З.Г. Кадагидзе2, А.Ю. Барышников2
ИНГИБИРОВАНИЕ АКТИВНОСТИ КЛЕТОЧНЫХ ТРАНСПОРТЕРОВ ГЛИОБЛАСТОМ
СЕНСИБИЛИЗИРУЕТ КЛЕТКИ-МИШЕНИ К ИНФЕКЦИИ ОНКОЛИТИЧЕСКИМ ВЕКТОРОМ
В ПРИСУТСТВИИ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ
1
Центр опухолей головного мозга, Шведский медицинский центр, Сиэтл, США
2
ФГБНУ «РОНЦ им Н.Н. Блохина», Москва
Контактная информация
Уласов Илья Валентинович, к.б.н., ведущий сотрудник центра лечения опухолей головного мозга
адрес: 550 17th Avenue, suite 570, Seattle, Wa, 98122, USA; тел. +1-206-991-2053
e-mail: [email protected]
Статья поступила 03.10.2014, принята к печати 27.04.2015.
Резюме
Известно, что цитотоксический химиопрепарат верапамил ингибирует экспрессию Pgp в клетках опухолей головного мозга – медуллобластмах человека. Цель настоящего исследования заключалась в оценке чувствительности клеток глиобластом к верапамилу и к его комбинации с онколитическим аденовирусом CRAd-SpK7. Были получены in vitro данные, позволяющие оценить возможности терапевтической комбинации верапамил-CRAd-S-pK7 против клеточных линий глиобластом человека (U87 и U251). Оказалось, что верапамил существенно усиливал активность онколитического вектора в присутствии ионизирующего излучения, что выражалось в большем ингибировании роста опухолевых клеток линии U251.
Ключевые слова: глиобластома человека, аденовирус, онколитический вектор, верапамил.
I.V. Ulasov1,2, N.V. Kaverina2, Z.G. Kadagidze, A.Yu. Baryshnikov2
SUPPRESSION OF GLIOBLASTOMA CELLULAR TRANSPORTERS
SENSITIZES TARGET CELLS TO INFECTION WITH ONCOLYTIC VIRUS
IN THE PRESENCE OF IONIZING RADIATION
1
The Center for Advanced Brain Tumor Treatment, Swedish Medial Center, Seattle, USA
2
FSBSI «N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center», Moscow
Abstract
It is already established that verapamil inhibits Pgp expression in the brain tumor cancer cells such as medulloblastoma.
The aim of this study is to investigate the sensitivity of glioblastoma cancer cells to verapamil and its combination with oncolytic adenoviral victor CRAd-S-pK7. In vitro using U87 and U251 human glioblastoma cell lines, we
obtained experimental data suggesting a therapeutic effect of verapamil and CRAd-S-pK7. Moreover, we established
that verapamil improves anti-glioma effect of oncolytic adenoviral vector in the presence of ionizing radiation, which
results into more suppression of U251 cancer cells via inhibition of their proliferation.
Key words: glioblastoma multiforme, adenovirus, oncolityc vector, verapamil.
Введение
Биотерапия является перспективным направлением в лечении опухолей различных локализаций [1–5; 7; 11–18; 23]. Виротерапия – одно из
альтернативных направлений в лечении глиом [20;
21]. В основе этого метода лежит применение либо
природного лизирующего вируса, либо использование модифицированного вируса дикого типа,
который после генно-инженерных манипуляций
способен лизировать опухолевые клетки-мишени.
Высвобождение вирусных частиц из инфицируемой клетки путем разрушения опухолевой клетки и
последующая инфекция соседних клеток опухоли
опосредуют противоопухолевый эффект, вызывае№ 2/том 14/2015
мый онколитическим вектором.
Интерес к использованию онколитических
противоопухолевых векторов обусловлен недавно
начавшимися клиническими испытаниями [24]. В
ходе предварительных доклинических исследований выяснилось, что клетки глиобластом обладают
различной чувствительностью к аденовирусной
инфекции. Известно, что экспрессия поверхностных аденовирусных рецепторов, таких как Коксаки-аденовирусный рецептор (CAR), гепарансульфаты: Синдекан 1 и Перлекан, а также интерлейкин α v β 3 и α v β 5 , является важным обеспечением высокой инфекции клеток-мишеней [26; 44]. К
сожалению, присутствие высокой концентрации
поверхностных аденовирусных рецепторов, а также
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
66
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ИНГИБИРОВАНИЕ АКТИВНОСТИ КЛЕТОЧНЫХ…
высокая активность промотора аденовирусной
транскрипции гена сурвивина, не всегда обеспечивает высокую вирусную инфекцию онколитического вируса, содержащего промотор гена сурвивин
[43]. В таком случае, применение противоопухолевого химиопрепарата, сенсибилизирующего клетки
опухоли к инфекции вирусным онколитическим
вектором, может многократно усилить цитотоксический эффект самого онколитического вектора.
Последние несколько декад, метилирующие
агенты кармустин, араноза и лизомустин, применяемые для лечения меланом [8; 10; 19; 25; 34],
были широко используемыми химиопрепаратами
для лечения неопластических глиобластом и медуллобластом [25; 34]. Цитотоксичность этих агентов была основана на способности генерировать
алкирущие радикалы, повреждающие клеточную
ДНК. К сожалению, невосприимчивость и приобретенная резистентность клеток рака мозга, ограничивала их чувствительность к терапии данными
агентами [38].
Одним из путей резистентности является повышение активности клеточных транспортеров, в
основном, АТФ-зависимых (ABC) транспортеров
[6; 9; 22; 31; 32; 37; 39; 40; 41]. Это семейство насчитывает более 50 видов разных молекул, регулирующих перенос субстратов через мембрану клеток. Недавние результаты, представленные Lin T. et
al. [30] и Golebiewska A. et al.[27], подтверждают
роль ABC транспортеров в ответе стволовых клеток
опухолей человека на внешние раздражители и в
поддержании внутреннего гомеостаза стволовых
клеток. Таким образом, установлена связь между
активностью ABC регуляторов и чувствительностью опухоли к внешним раздражителям и химиопрепаратам.
В настоящее время получен ряд ингибиторов
ABC транспортеров. Верапамил – один из ингибиторов Pgp, ингибирующий связывание Pgp с субстратом и позволяющий усиливать транспорт лекарственных веществ in vitro и in vivo [35]. Последние данные показывают, что комбинация верапамила с другими агентами вызывала увеличение
чувствительности клеток-мишеней и последующую
токсичность. Так, в частности, комбинация верапамила с инфекцией перевиваемых опухолевых клеток онколитическим вирусом in vitro и in vivo [29;
28], показала свою значимость и создала предпосылки для наших экспериментов. Таким образом,
целью нашей работы являлось изучение на клетках
глиобластом человека влияния верапамила на репликативную и цитотоксическую активности онколитического агента CRAd-S-pK7.
Материалы и методы
Клетки и клеточные линии
Эмбриональные клетки почки эмбриона человека HEK293, клетки глиобластомы U251 и U87
человека, и клетки аденокарциномы человека A549
были получены из американской коллекции клеточных линий (ATCC, Manassas, США). Клетки
№ 2/том 14/2015
были выращены в Дульбеко модифицированной
среде Игла (DMEM; Life Technologies, США) содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки
(GIBCO-Life Technologies, США), L-глутамин
(2мM), пенициллин (100 IU/мл), стрептомицин (50
м/мл) в 5% CO 2 при 37 °C.
Химические реагенты
и аденовирусные вектора
Верапамил был получен из Sigma-Aldrich (St
Luis, Mo, США). В качестве растворителя для верапамила
использовали
диметильсульфоксид
(ДМСО). Для тестов in vitro использовали стоковый
раствор, из которого готовили ряд десятикратных
разведений в среде ДМЕМ.
Постоянно реплицирующийся компетентный
аденовектор, CRAd-S-pK7 был получен путем гомологической рекомбинации с SpeI-обработанной
плазмидой, кодирующей полноразмерный геном
аденовируса, содержащего 7 аминокислотных остатков поли-лизин, вклонированных в Стерминальный конец гена полноразмерного белка
фибера типа 5 аденовирусов, с Е1-pSurvivin шаттл
плазмидой. Полученная вирусная конструкция была получена путем трансфекции HEK293 клеток
плазмидой. CRAd-S-pK7 вирус был наработан в
A549 клетках и тестирован, используя Adeno Titer
X kit (Clontech, Mountain View, Ca, USA).
Тест для определения
пролиферации клеток (MTT)
Опухолевые клетки культивировали при
температуре 37 °С в присутствии 5% СО 2 в среде
ДМЕМ, содержащей 2 мМ L-глутамина и 10% фетальной бычьей сыворотки («Atlanta Bio», Atlanta,
США). Клетки, достигшие логарифмической фазы
роста, пересаживали в плоскодонные 96-луночные
микропланшеты («Costar») по 5 000—6 000 клеток
на лунку и преинкубировали в указанных выше
условиях в течение 24 ч перед добавлением тестируемого вещества. Для определения клеточной цитотоксичности клеточные линии были выращены в
96 луночном планшете, инфицированы CRAd-SpK7 вектором в разной множественности инфекции. Через 72 ч после инфекции в каждую лунку
добавили
3-(4,5-диметилтиазолил-2-ил)-2,5дифенилтетразолия бромид (МТТ), спустя 4 часа
после инкубации при 5% CO 2 и 37° C в каждую
лунку добавили 100 мкл ДМСО для ингибирования
метаболической реакции и разрушения кристаллов
формазана. Оптическое поглощение было измерено
при длине волны 540 нм.
Жизнеспособность клеток производили по
исключению красителя трипанового синего (Fisher
Scientific США).
Облучение клеток в присутствии верапамила, онколитичексого вектора или их комбинации
осуществлялось в установке «Phillips» в дозах 2 Гр
при помощи дозы 1 Гр/мин.
Статистический анализ
Результаты представлены в виде стандартноРОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ИНГИБИРОВАНИЕ АКТИВНОСТИ КЛЕТОЧНЫХ…
го значения ± стандартное отклонение. Статистический анализ был выполнен с использованием теста
Стьюдента (SPSS 13.0, Чикаго, Иллинойс, США).
Разница меньше 0,05 означала существенное различие.
Результаты и обсуждение
Чувствительность клеток U87
и U251 к химиопрепарату верапамил
На первом этапе наших исследований мы
оценивали чувствительность клеток U251 и U87 к
верапамилу. Под действием верапамила на 5 сутки
роста скорость клеточной пролиферации значительно снижалась для обоих видов клеток в зависимости от концентрации химиопрепарата. Оказалось, что в двух независимо повторенных экспериментах почти 100 % ингибирование клеточной пролиферации U251 и U87 наблюдалось при концентрации 14,2 мМ и 1,42 мМ верапамила соответственно (рис. 1). В дальнейшем, при уменьшении
концентрации верапамила с 14,2 мМ до 14,2мкМ,
уровень пролиферации U87 оставался на прежнем
уровне (~80 % от контроля). В противоположность
к этому, клетки U251 оказались более резистентны
к снижению концентрации верапамила. Ингибирующую концентрацию (ИК50) рассчитывали по
стандартной методике, представленной в материалах и методах.
Рис. 1. Чувствительность клеток глиобластом к
терапии верапамил. МТТ-тест, эксперимент повторен дважды, в 4 х репликативах, результаты представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.
Верапамил
увеличивал клеточную токсичность
онколитического вируса
Способность химиопрепарата верапамила
влиять на пролиферативную активность клеток
глиобластом в присутствии онколитического вектора (ОВ) мы также определяли в реакции пролиферации. Показано, что на 5 день выживаемость
U251 и U87 клеток не изменялась или не значительно снижалась в случае комбинации верапамила
(ИК50) и онколитического вируса (рис. 2). Для уве№ 2/том 14/2015
67
личения цитотоксической способности онколитического вектора мы облучали однократно ионизирующей радиацией клетки, инфицированные вирусом ОВ. В таком случае, аддитивный цитотоксический эффект между онколитическим вирусом, верапамилом и ионизирующей радиацией приводил к
90 % гибели опухолевых клеток линии U251. Причем концентрация онколитического вируса (100
или 10 инфекционных частиц на клетку) не влияла
на итоговую высокую токсичность для злокачественных клеток этой линии (рис. 3).
Дальнейшее снижение дозы онколитического вируса снижало аддитивный эффект от комбинации с верапамилом и ионизирующей радиацией.
В отличие от клеток линии U251, в клетках глиобластомы линии U87 инфекция онколитическим вирусом в присутствии ионизируюшей радиации и
верапамила не приводила к аддитивной токсичности. Полученные результаты подтверждают данные
Pezuk J. et al., что в сравнении с U87, U251 клетки
являются высоко чувствительными к ионизируюшему излучению [33].
Высокая
радиационная чувствительность U251
обеспечивает высокую токсичность
комбинации ОВ+верапамил
Одним из логических объяснений нашим результатам, представленным на рис. 3, может служит тот факт, что инонизирующая радиация способна активировать цитотоксические свойства околитического вируса.
В связи с этим, мы оценили способность онколитического вируса нарабатывать вирусные частицы в
присутствии или отсутствии ионизирующей радиации
и верапамила. С этой целью обработанные клетки линий U87 и U251, собранные через 1, 3 и 5 дней после
вирусной инфекции, были последовательно разрушены
и затем добавлены в серийном разведении к клеткам
HEK293. Через 48 часов после инфекции, клетки окрашивали антителами, узнающими аденовирусный
гексон, и подсчитывали титр вируса по предложенной
методике (рис. 4). Оказалось, что в отсутствии ионизирующего излучения, верапамил незначительно увеличивал выделение вирусных частиц опухолями после
инфекции аденовирусом (p>0,05). В присутствии радиации увеличенная продукция вирусных частиц наблюдалась в клетках U251, что связано с высоким
уровнем активности промотора сурвивина [36; 42] и
коротким репликационным циклом CRAd-S-pK7 вируса. Эти данные коррелируют с результатами теста на
пролиферацию, показывающими высокую ингибирующую активность комбинации онколитического
вируса, верапамила и ионизирующей радиации именно
в клетках линии U251.
Заключение
В реакциях клеточной пролиферации и окраске клеточного монослоя с использованием трипанового синего было выявлено достоверное снижение выживаемости клеток глиобластом человека на
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
68
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ИНГИБИРОВАНИЕ АКТИВНОСТИ КЛЕТОЧНЫХ…
40 – 60 % по сравнению с активностью онколити-
ческого вектора или верапамила в отдельности.
Рис. 2. U251 демонстрирует сниженную пролиферацию клеток в случае терапии верапамилом и онколитическим вектором (ОВ). Процент выживаемости клеток был получен по отношению к ДМСО терапии. Меan +/стандартное отклонение. НС-разница статистически недостоверна, “*” р<0.05.
Рис. 3. Ионизирующая радиация усиливала токсичность комбинации онколитический вектор-верапамил на
клетках глиобластом. Процент пролифирирующих клеток определялся в реакции МТТ после инкубации с верапамилом и после инфекции онколитичексим вирусом. НС-разница статистически недостоверна, *р<0,05.
Рис. 4. Лучевая терапия в комбинации с верапамилом активировала репликацию онколитичексого вектора. Детекция вирусных виринов в присутствии верапамила (А) и комбинации верапамил+ однократное облучение в
дозе 2 Грей (Б). Титрование было предено в соответствии с рекомендациями Clontech (США) и представлены
Меan +/- стандартное отклонение для каждой группы клеток. НС-разница статистически недостоверна, “*”
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ИНГИБИРОВАНИЕ АКТИВНОСТИ КЛЕТОЧНЫХ…
р<0.05.
Незначительное снижение наблюдалось в
клетках глиобластом, обработанных онколитическим вирусом и верапамилом.
Динамика вирусной амплификации, определенная с помощью реакции титрования на перевиваемой культуре клеток почки эмбриона человека в присутствии верапамила и ионизирующей
радиации, также свидетельствовала о высокой
69
продукции вирусных вирионов в клетках U251.
Полученные данные свидетельствуют о способности верапамила вызывать ингибирование клеточной пролиферации и усиливать анти-глиомный
эффект, вызываемый экспериментальной генноинженерной вакциной на основе генома аденовируса человека серотипа 5.
Литература
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
Афанасьева Д.А., Барышникова М.А., Соколова З.А., Косоруков В.С. Разработка липосомальной конструкции, содержащей лизат опухолевых клеток // Российский биотерапевтический журнал. – 2013. – Т. 12, № 2.
– С. 5.
Бармашов А.Е., Чкадуа Г.З., Михайлова И.Н. и др. Оценка противоопухолевого иммунитета методом
ELISPOT у больных, получающих дендритноклеточную вакцину // Российский биотерапевтический журнал. – 2012. – Т. 11, № 3. – С. 47–51.
Барышников А.Ю. Взаимодействие опухоли и иммунной системы организма // Практическая онкология. –
2003. – Т. 4, №3 . – С. 127–30.
Барышников А.Ю. Принципы и практика вакцинотерапии рака // Бюллетень Сибирского отделения РАМН.
– 2004. – № 2. – С. 59–63.
Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Михайлова И.Н., Петенко Н.Н. Современные проблемы биотерапии опухолей // Вестник Московского Онкологического Общества. – 2008. – № 1. – С. 6–10.
Блохин Д.Ю., Власенкова Н.К., Герасимова Г.К. и др. Поиск молекулярных механизмов обеспечения множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток // Российский биотерапевтический журнал. –
2013. – Т. 12, № 2. – С. 10.
Голубцова Н.В., Степанова Е.В., Бармашов А.В. и др. Определение специфических противоопухолевых
антител у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии // Российский биотерапевтический журнал. – 2012. – Т. 11, № 3. – С. 25–8.
Горбунова В.А., Манзюк Л.В., Демидов Л.В., Харкевич Г.Ю. Лизомустин – отечественный препарат из группы производных нитрозомочевины в лечении меланомы кожи // Российский биотерапевтический журнал. –
2014. – Т. 13, № 1. – С. 55–6.
Карапетян В.Г., Степанова Е.В., Барышников А.Ю. и др. Экспрессия маркеров апоптоза (р53, BCL-2, BAX)
и их прогностическое значение при эпителиальных новообразованиях яичников ранних стадий // Российский биотерапевтический журнал. – 2011. – Т. 10, № 2. – С. 45–9.
Лихванцева В.Г., Оборотова Н.А., Когония Л.М. и др. Первый опыт применения аранозы для лечения увеальной меланомы // Российский биотерапевтический журнал. – 2005. – Т. 4, № 3. – С. 34–9.
Манина И.В., Перетолчина Н.М., Сапрыкина Н.С. и др. Доклинические исследования иммунотерапии меланомы кожи с помощью цельноклеточных противоопухолевых вакцин, секретирующих GM-CSF // Российский биотерапевтический журнал. – 2010. – Т. 9, № 3. – С. 47–50.
Манина И.В., Сапрыкина Н.М., Козлов А. М. и др. Повышение эффективности цельноклеточной GM-CSF
секретирующей противоопухолевой вакцины путем преинкубации с цитокинами // Российский биотерапевтический журнал. – 2011. – Т. 10, № 3. – С. 61–6
Мисюрин В.А., Мисюрин А.В., Лукина А.А. и др. Профили экспрессии раково-тестикулярных антигенов в
клеточных линиях меланомы // Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии. –
2014. – Т. 31, № 2. – С. 104.
Михайлова И.Н., Лукашина М.И., Барышников А.Ю. и др. Клеточные линии меланоиы – основа для создания противоопухолевых вакцин // Вестник РАМН. – 2005. – № 7. – С. 37–40.
Михайлова Т.В, Барышникова М.А., Клименко О.В. и др. Разработка липосомальной формы противоопухолевой вакцины // Российский биотерапевтический журнал. – 2011. – Т. 10, № 4. – С. 62–6.
Михайлова Т.В., Барышникова М.А., Багирова Н.С. и др. Стерилизация многослойных протеолипосом //
Российский биотерапевтический журнал. – 2012. – Т. 11, № 1. – С. 13–8.
Михайлова Т.В., Барышникова М.А., Бурова О.С. и др. Сравнение уровня экспрессии hsp70 на клеточных
линиях меланомы // Российский биотерапевтический журнал. – 2010. – Т. 9, № 1. – С. 43–8.
Никитин К.Д., Рубцова М.А., Утяшев И.А., Барышников А.Ю. Противоопухолевые вакцины на основе дендридом // Российский онкологический журнал. – 2010. – Т. 9, № 2. – С. 48–53.
Оборотова Н.А. Основные проблемы создания лекарственных форм противоопухолевых препаратов для
внутривенного введения // Российский онкологический журнал. – 2003. – Т. 2, № 2.- С. 27–31.
Уласов И.В., Каверина Н.В., Кадагидзе З.Г., Барышников А.Ю. Антиглиомная аденовирусная виротерапия:
механизм, регуляция и клинические перспективы // Российский биотерапевтический журнал. – 2014. – Т.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
70
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ИНГИБИРОВАНИЕ АКТИВНОСТИ КЛЕТОЧНЫХ…
13, № 2. – С. 11–8.
21. Уласов И.В., Тусон А., Барышников А.Ю. Белок фибера аденовируса человека обеспечивает стабильность
вирусных капсидов // Российский биотерапевтический журнал. – 2014. – Т. 13, № 2. – С. 51 – 55.
22. Шушанов С.С., Кравцова Т.А., Ставровская А.А. IGF-1-зависимая экспрессия МРНК гена MRP1 и LRP в
линиях клеток множественной миеломы человека // Российский биотерапевтический журнал. – 2014. – Т.
13, № 1. – С. 17–23.
23. Чкадуа Г.З., Заботина Т.Н., Буркова А.А. и др. Адаптирование методики культивирования дендритных клеток человека из моноцитов периферической крови для клинического применения // Российский биотерапевтический журнал. – 2002. – Т. 1, № 3. – С. 55–61.
24. Ahmed A.U., Thaci B., Tobias A.L. et al. A preclinical evaluation of neural stem cell-based cell carrier for targeted
antiglioma oncolytic virotherapy // J Natl Cancer Inst. – 2013. – 105(13). – P. 968–77.
25. Beranek D.T. Distribution of methyl and ethyl adducts following alkylation with monofunctional alkylating agents
// Mutat Res. – 1990. – 231(1). – P. 11–30.
26. 26.Fuxe J., Liu L., Malin S. et al. Expression of the coxsackie and adenovirus receptor in human astrocytic tumors
and xenografts // Int J Cancer. – 2003. – 103(6). – P. 723–9.
27. Golebiewska A., Brons N.H., Bjerkvig R., Niclou S.P. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and
cancer stem cell research // Cell Stem Cell. – 2011. – 8(2). – P. 136–47.
28. Gros A., Puig C., Guedan S. et al. Verapamil enhances the antitumoral efficacy of oncolytic adenoviruses // Mol
Ther. – 2010. – 18(5). – P. 903–11.
29. Koski A., Raki M., Nokisalmi P. et al. Verapamil results in increased blood levels of oncolytic adenovirus in
treatment of patients with advanced cancer // Mol Ther. – 2012. – 20(1). – P. 221–9.
30. Lin T., Islam O., Heese K. ABC transporters, neural stem cells and neurogenesis – a different perspective // Cell
Res. – 2006. – 16(11). – P. 857–71.
31. Michailova I.N., Morozova L.Ph., Golubeva V.A. et al. Cancer/testis genes expression in human melanoma cell
lines // Melanoma Research. – 2008. – 5. – Р. 303–13.
32. Morrison R., Schleicher S.M., Sun Y. et al. Targeting the mechanisms of resistance to chemotherapy and
radiotherapy with the cancer stem cell hypothesis // J Oncol. – 2011. – P. 941876.
33. Pezuk J.A., Brassesco M.S., Morales A.G. et al. Inhibition of polo-like kinase 1 induces cell cycle arrest and
sensitizes glioblastoma cells to ionizing radiation // Cancer Biother Radiopharm. – 2013. – 28(7). – P. 516–22.
34. Prados M.D., Larson D.A., Lamborn K. et al. Radiation therapy and hydroxyurea followed by the combination of
6-thioguanine and BCNU for the treatment of primary malignant brain tumors // Int J Radiat Oncol Biol Phys. –
1998. – 40(1). – P. 57–63.
35. Schmidt W.F., Huber K.R., Ettinger R.S., Neuberg R.W. Antiproliferative effect of verapamil alone on brain tumor
cells in vitro // Cancer Res. – 1988. – 48(13).- P. 3617–21.
36. Siegelin M.D.The flavonoid kaempferol sensitizes human glioma cells to TRAIL-mediated apoptosis by
proteasomal degradation of survivin // Mol Cancer Ther. – 2008. – 7(11). – P. 3566–74.
37. Stavrovskaya A.A., Sedyakhina N.P., Stromskaya T. et al. Prognastic value of P-glicoprotein and correlation with
CD34 antigen // British J. Heamatology. – 1998. – 28(5–6). – С. 469–82.
38. Tseng S.H., Bobola M.S., Berger M.S., Silber J.R.Characterization of paclitaxel (Taxol) sensitivity in human
glioma- and medulloblastoma-derived cell lines // Neuro Oncol. – 1999. – 1(2). – P. 101–8.
39. Turkina A.G., Baryshnikov A.Y., Sedyakhina N.P. et al. Studies of P-glycoprotein in chronic myelogenousleukaemia patients: Expression, activity and correlations with CD34 antigen // British Journal of Heamatology. – 1996. –
92. – P. 88–96.
40. Turkina A.G., Zabotina T.N., Kusnetzov S.V. et al. Studies of some mechanisms of drug resistence in chronic myeloid leukemia (CML) // Advances in Experimental Medicine and Biology. – 1999. – 457. – P. 477–88.
41. Turkina A.G., Logacheva N.P., Stromskaya T.P. et al. Studies of some mechanisms of drug resistance in chronic
myeloid leukemia (CML) // Book Editor(s): Kaspers, GJL; Pieters, R; Veerman, AJP. Conference: 3rd International
Symposium on Drug Resistsnce in Leukemia and Lymphoma III Book Series: Advances in Experimental Medicine
and Biology. – 1999. – 457. – P. 477–88.
42. Uchida H., Tanaka T., Sasaki K. et al. Adenovirus-mediated transfer of siRNA against survivin induced apoptosis
and attenuated tumor cell growth in vitro and in vivo // Mol Ther. – 2004. – 10(1). – P. 162–71.
43. Ulasov I.V. Survivin-driven and fiber-modified oncolytic adenovirus exhibits potent antitumor activity in
established intracranial glioma // Hum Gene Ther. – 2007. – 18(7). – P. 589–602.
44. Zheng S., Ulasov I.V., Han Y. et al. Fiber-knob modifications enhance adenoviral tropism and gene transfer in
malignant glioma // J Gene Med. – 2007. – 9(3). – P. 151–60.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ДОКЛИНИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ…
71
УДК 616-006.092.4:615.277.3.012/014
М.П. Киселева, З.С. Шпрах, Л.М. Борисова, И.Ю. Кубасова, А.В. Ланцова,
Е.В. Санарова, Н.А. Оборотова, З.С. Смирнова, А.Ю. Барышников
ДОКЛИНИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ
ПРОИЗВОДНОГО N-ГЛИКОЗИДА ИНДОЛОКАРБАЗОЛА ЛХС-1208. СООБЩЕНИЕ I
ФГБНУ «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина», Москва
Контактная информация
Киселева Марина Петровна, научный сотрудник лаборатории экспериментальной химиотерапии НИИ ЭДиТО
адрес: 115478 Москва, Каширское шоссе, 24; тел: +7(499)612-87-86
e-mail: [email protected]
Статья поступила 10.03.2015, принята к печати 27.04.2015.
Резюме
Представлены результаты доклинического изучения противоопухолевой активности производного Nгликозида индолокарбазола ЛХС-1208 в лекарственной форме для внутривенного введения «лиофилизат для
приготовления раствора для инъекций».
Показан высокий противоопухолевый эффект на опухолях разного гистогенеза при дифференцированных
режимах введения: в отношении лимфобластоза Р-388 (УПЖ=76 %), лимфаденоза Фишера L5178Y (УПЖ=76 % и
излечение в 33 % случаев) при ежедневном введении в течение 5 дней в дозе 25 мг/кг, в отношении сóлидных
опухолей LLC (ТРО=95 % – 81 % в течение 9 дней) и РШМ-5 (ТРО=74–56 % в течение 9 дней) при однократном
введении в дозе 150 мг/кг. ЛХС-1208 проявляет статистически значимое ТРО = 51 % и 47 % на 3 и 7 день соответственно после однократного внутривенного введения в дозе 150 мг/кг на развившуюся LLC.
При сравнительном исследовании субстанции и лекарственной формы ЛХС-1208 на LLC при внутрибрюшинном введении показано, что при уменьшении терапевтической дозы до 110 мг/кг, не вызывающей гибели животных, противоопухолевый эффект наблюдали только при введении лекарственной формы: ТРО составляло 74–75 % в течение 8 дней после окончания лечения.
Ключевые слова: производное индолокарбазола, ЛХС-1208, перевиваемые опухоли, противоопухолевая
активность.
M.P. Kiseleva, Z.S. Shprakh, L.M. Borisova, I.Yu. Kubasova, A.V. Lantsova,
E.V. Sanarova, N.A. Oborotova, Z.S. Smirnova, A. Yu. Baryshnikov
PRECLINICAL STUDY OF INDOLOCARBAZOLES N-GLYCOSIDES
DERIVATIVE LCS-1208 ANTITUMOR ACTIVITY. REPORT I
FSBSI «N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center», Moscow
Abstract
This article presents the results of preclinical study of antitumor activity of indolo[2,3-a]carbazoles N-glycosides
derivative (LCS-1208) in pharmaceutical dosage form for intravenous administration – lyophilisate for injection. LCS1208 high antitumor efficiency has been shown by different regimens of administration on tumors of diverse histogenesis:
LCS-1208 exhibited increase of life span (ILS) 76% on lympoblastosis P-388 and ILS 76 % and 33 % recovery of Fisher
lympadenosis L5178Y by 25 mg/kg daily intravenous administration during 5 days. Whereas LCS-1208 demonstrated
high antitumor efficiency on solid tumors by 150 mg/kg single intravenous dosing: on LLC – tumor growth inhibition
(TGI) 95% - 81% during 9 days and on RShM-5 (TGI 74% - 56% during 9 days). LCS-1208 appeared statistically significant TGI 51 % and 47 % on 3rd and 7th days after 150 mg/kg single intravenous dosing on established tumor.
Comparative study of LCS-1208 substance and dosage form by intraperitoneal injection has shown that decrease
of therapeutic dose to 110 mg/kg, which doesn’t induce death of animals, resulted only in dosage form antitumor effect
(TGI 74-75 % during 8 days after the end of treatment).
Key words: indolocarbazole derivative, LCS-1208, transplantable tumors, antitumor activity.
Введение
Современный подход при создании новых
противоопухолевых препаратов основан на идентификации молекулярных мишеней, специфиче№ 2/том 14/2015
ских для раковой клетки, и нацелен на поиск ингибиторов этих мишеней [1; 4; 9; 15; 16]. В этом направлении ведется активный поиск индукторов
апоптоза опухолевых клеток, ингибиторов ангиогенеза, важнейших ферментов нуклеинового обмена
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
72
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ДОКЛИНИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ…
– топоизомераз I и II, теломеразы, протеинкиназ
различных типов, регулирующих клеточный цикл и
препаратов, преодолевающих лекарственную устойчивость опухолевых клеток или предотвращающих ее развитие [2; 3; 26; 28; 29].
В лаборатории химического синтеза ФГБНУ
«РОНЦ им. Н.Н. Блохина» активно проводится синтез производных N-гликозидов индолокарбазолов,
представляющих особый интерес в качестве потенциальных противоопухолевых препаратов [13; 21;
23; 24]. Особенность применения препаратов на
основе производных индолокарбазолов определяется их способностью взаимодействовать с несколькими внутриклеточными мишенями и, следовательно, индуцировать разные пути клеточной
гибели. Важными внутриклеточными мишенями,
на которые действуют производные индолокарбазолов, являются серин-треониновые протеинкиназы, циклинзависимые киназы, тирозинкиназы, а
также топоизомеразы. В частности, топоизомераза
I, которая участвует в процессе транскрипции РНК,
репликации ДНК и поддержании стабильности генома за счет регулирования гиперспирализованного
состояния молекулы ДНК [27; 30].
Ранее проведенные исследования по поиску
и углубленному изучению новых противоопухолевых препаратов среди 10 производных Nгликозидов индолокарбазолов позволили отобрать
для доклинического изучения соединение ЛХС1208 [17–20; 22].
Целью настоящего исследования является
доклиническое изучение противоопухолевой активности производного N-гликозида индолокарбазола ЛХС-1208 на перевиваемых опухолях мышей.
Материалы и методы
При доклиническом исследовании использованы перевиваемые опухоли мышей из Банка опухолевых штаммов ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина»: лимфоцитарная лейкемия Р-388, лимфоидная
лейкемия L-1210, эпидермоидная карцинома легкого Льюис (LLC), меланома В-16, рак шейки матки
РШМ-5 и лимфаденоз Фишера L 5178Y [25].
В опытах с перевиваемыми опухолями мышей использованы иммунокомпетентные мыши
линий C57Bl/ 6 j, DBA/2 и СВA (доноры опухолевого материала) и гибриды первого поколения BDF 1
(C 57 Bl/ 6 j × DBA/2) массой 20–22 г, самки и самцы.
Мышей получали из питомника лабораторных животных «Столбовая», а также из отделения лабораторных животных ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина»
и содержали в конвенциональных условиях на брикетированном рационе кормления.
Сóлидные и асцитные опухоли перевивали
лабораторным животным по стандартной методике.
При перевивке сóлидных моделей опухолевую
ткань измельчали ножницами до гомогенной консистенции, добавляли среду 199 до соотношения
1:10 и 0,5 мл полученной суспензии (около 50 мг
опухолевых клеток), вводили подкожно в область
правой подмышечной впадины. При перевивке ас№ 2/том 14/2015
цитных опухолей гибридам первого поколения
BDF 1 вводили внутрибрюшинно по 0,3 мл асцитной жидкости, разведенной средой 199 и содержащей по 1×106 опухолевых клеток [25]. Лечение начинали через 24 ч после перевивки гематобластозов
и через 48 ч – сóлидных опухолей.
Субстанция ЛХС-1208 (аминоиндолокарбазол) – аморфный порошок оранжевого цвета без
запаха, имеющий Мм = 472 г/моль; не растворим в
воде, мало растворим в этаноле и ацетоне, растворим в ДМСО и диметилформамиде [5; 8; 10]. Соединение синтезировано в лаборатории химического синтеза ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» [13].
В лаборатории разработки лекарственных
форм создана лекарственная форма ЛХС-1208 в
виде «лиофилизата для приготовления раствора для
инъекций» следующего состава: субстанция – 9,2
мг; ДМСО – 165 мг; Kollidon 17PF – 600 мг. Перед
введением экспериментальным животным лиофилизат регидратируют 2,8 мл воды для инъекций [6;
7; 11; 12].
В табл. представлены дозы лекарственной
формы ЛХС-1208 при внутривенном введении, не
вызывающие гибели мышей в опытных группах
раньше контрольных животных.
Для оценки противоопухолевого действия
объемы опухолей измеряли каждые 3 – 5 дней в
зависимости от скорости роста опухоли. Объем
опухоли (V) вычисляли перемножением трех максимальных взаимно перпендикулярных размеров
опухоли (длина – l, ширина – b, высота – h) у каждого животного.
Критериями оценки противоопухолевой активности служили: торможение роста опухоли
(ТРО, %), увеличение продолжительности жизни
подопытных животных по сравнению с контрольными животными (УПЖ, %) и излечение (% случаев) [14]. Торможение роста опухоли вычисляли по
формуле:
TPO(%) 
(Vk  Vo)
 100 , где
Vk
Vк – средний объем опухолей в контрольной группе
(мм3);
Vо – средний объем опухолей в опытной группе (мм3).
Увеличение продолжительности жизни вычисляли по формуле:
УПЖ (%) 
(СПЖо  СПЖк )
 100 , где
СПЖк
СПЖк – средняя продолжительность жизни животных в
контрольной группе (дни);
СПЖо – средняя продолжительность жизни животных в
опытной группе (дни).
Излечение (% случаев) – количество животных, проживших 90 дней без признаков опухолевого процесса.
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ДОКЛИНИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ…
В период наблюдения оценивали состояние
и поведение мышей, следили за гибелью животных,
павших мышей подвергали аутопсии для выявления визуальных патологических изменений внутренних органов.
Полученные данные обрабатывали статистически с использованием доверительных интервалов
средних сравниваемых величин по стандартному
методу Стьюдента. Для оценки достоверности различий определяли критерий Т (Т-тест), значимыми
считали различия при p<0,05.
Результаты
Изучение зависимости противоопухолевой
активности ЛХС-1208 от дозы и режима применения на Р-388 показало, что терапевтическая доза
при внутривенном введении соответствовала 25
мг/кг, а УПЖ при этом составляло 76 % (табл. 1).
При однократном введении в максимальной дозе
150 мг/кг и двукратном с интервалом 96 часов в
дозе 50 мг/кг ЛХС-1208 вызывал УПЖ = 34 % и
48 % соответственно, что статистически ниже терапевтического эффекта препарата при ежедневном
внутривенном введении в течение 5 дней
(УПЖ=76 %).
Из табл. 2 следует, что на L-1210 терапевтическая эффективность ЛХС-1208 значительно ниже, чем на Р-388. Так ежедневное внутривенное
введение ЛХС-1208 в дозах 20 мг/кг и 25 мг/кг в
течение 5 дней вызывало УПЖ = 38 % и 40 % соответственно, однократное введение в дозах 140 мг/кг
и 150 мг/кг – 22% и 20% соответственно.
Данные, представленные в табл. 3, показывают, что на L5178Y эффективным оказался также
режим пятикратного внутривенного введения ЛХС1208 в терапевтической дозе 25 мг/кг. При этом наблюдали полное излечение животных в 33 % случаев, УПЖ остальных мышей в группе составляло
83 %. При однократном введении ЛХС-1208 в дозе
150 мг/кг также наблюдали полное излечение мышей в 33 % случаев, УПЖ, однако, составляло 43 %.
Из данных табл. 4 следует, что на LLC при
ежедневном внутривенном введении в течение 5
дней в дозах 20 мг/кг и 25 мг/кг ЛХС-1208 проявлял умеренную противоопухолевую активность,
однако только в течение 5 дней после окончания
лечения: ТРО = 88–57 % и ТРО = 85–60 % соответственно. При однократном введении в дозе 150
мг/кг ЛХС-1208 демонстрировал высокий противоопухолевый эффект в течение 9 дней (ТРО = 95–
81 %), при этом статистически значимый эффект
сохранялся до 17 дня после окончания лечения
(ТРО = 55–49 %).
На рис. 1 показано, что на меланоме В-16
получен слабый кратковременный противоопухолевый эффект ЛХС-1208 в дозе 150 мг/кг при однократном введении на 4 день после окончания лечения: ТРО=59 %.
На РШМ-5 при однократном режиме введения в дозе 150 мг/кг ЛХС-1208 проявлял более высокую терапевтическую эффективность: ТРО на 4
№ 2/том 14/2015
73
день составляло 74 % и на 9 день – 56 % (рис. 2).
Тогда как в дозе 25 мг/кг при ежедневном введении
в течение 5 дней ЛХС-1208 вызывал слабый кратковременный противоопухолевый эффект, равный
51 % ТРО на 4 день после лечения.
Исследование действия ЛХС-1208 на развившуюся опухоль LLC показало, что препарат
оказывал слабое, но статистически значимое
ТРО=51 % на 3 день и ТРО=47 % на 7 день после
окончания лечения.
Сравнительное изучение эффективности субстанции и лекарственной формы на LLC показало,
что при ежедневном внутрибрюшинном введении в
течение 5 дней в дозе 25 мг/кг препарат ни в субстанции, ни в лекарственной форме не проявлял
противоопухолевой активности (табл. 6). При однократном внутрибрюшинном введении субстанции ЛХС-1208 в дозе 150 мг/кг выявлен кратковременный умеренный противоопухолевый эффект:
ТРО=61 % и гибель мышей в 14 % случаев. При
таком же режиме введения лекарственной формы
установлена высокая токсичность препарата – гибель 63 % мышей. Данные о высокой токсичности
лекарственной формы ЛХС-1208 при внутрибрюшинном введении соответствуют результатам изучения острой токсичности на мышах.
Высокая токсичность лекарственной формы
в терапевтической дозе 150 мг/кг при внутрибрюшинном введении явилась основанием для уменьшения вводимых доз как лекарственной формы, так
и субстанции ЛХС-1208 (табл. 7). При значительном уменьшении терапевтической дозы лекарственной формы ЛХС-1208 до 110 мг/кг (на 27 %)
при внутрибрюшинном введении противоопухолевый эффект наблюдался в течение 8 дней только у
лекарственной формы: ТРО составляло 74–75 %, а
субстанция в той же дозе не проявляла противоопухолевой активности.
Заключение
В результате проведенных доклинических
исследований установлено, что на гемобластозах Р388, L-1210 и лимфаденозе Фишера L 5178Y оптимальным режимом применения ЛХС-1208 является
ежедневное внутривенное введение препарата в
течение 5 дней в терапевтической дозе 25 мг/кг,
тогда как на LLC, РШМ-5 и меланоме В-16 – однократное введение в терапевтической дозе 150 мг/кг.
Показана высокая противоопухолевая эффективность ЛХС-1208 в отношении лейкоза Р-388
(УПЖ=76 %) и лимфаденоза Фишера L 5178Y
(УПЖ=83 %, и в 33 % случаев полное излечение
животных, проживших 90 дней без признаков опухолевого процесса).
На LLC ЛХС-1208 проявляет высокий противоопухолевый эффект: ТРО=95–81 % в течение 9
дней и статистически значимый эффект –
ТРО=55 % -– 49 % – сохраняется до 17 дня после
окончания лечения.
На РШМ-5 выявлен умеренный терапевтический эффект препарата на 4 и 9 дни после
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
74
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ДОКЛИНИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ…
окончания его введения: ТРО=74 % и 56 % соот-
ветственно.
Таблица 1
Зависимость противоопухолевой активности ЛХС-1208 от дозы и режима применения при внутривенном введении на Р-388
Доза (мг/кг)/
Группа
№№
СПЖ, дни
УПЖ, %
интервал (час) × число введений
Контроль
1
–
10,2 ± 0,8
–
Растворитель
2
0,4 / 24 × 5*
10,0 ± 0
0
3
10 / 24 × 5
12,6 ± 0,5
26
4
15 / 24 × 5
5
25 / 24 × 5
6
50 / 96 × 2
7
75 × 1
ЛХС-1208
8
100 × 1
9
125 × 1
10
150 × 1
*объем в мл введенного растворителя;
**р<0,05 – разница достоверна между 5 и 6, 5 и10 группами.
15,3 ± 0,7
17,6 ± 0,5
14,8 ± 2,4
13,3 ± 1,7
13,1 ± 1,1
12,9 ± 1,5
13,4 ± 1,2
53
76**
48**
33
31
29
34**
Таблица 2
Зависимость противоопухолевой активности ЛХС-1208 от дозы и режима применения при внутривенном введении на L-1210
Доза (мг/кг)/
СПЖ, дни
УПЖ, %
интервал (час) × число введений
контроль
8,0 ± 0
–
20 / 24 × 5
11,0 ± 0,3
38*
25 / 24 × 5
11,2 ± 0,5
40*
140 × 1
9,8 ± 1,1
22
150 × 1
9,6 ± 0,7
20
*р<0,05 по отношению к контролю.
Таблица 3
Зависимость противоопухолевой активности ЛХС-1208 от дозы и режима применения при внутривенном введении на лимфаденозе Фишера L 5178Y
№№
Доза (мг/кг)/
СПЖ, дни
УПЖ, %
Излечение, % случаев
группы
интервал (час) × число введений
1
Контроль
19,6 ± 9,07
–
–
2
22 / 24 × 5
24,5 ± 7,72
25
33
3
25 / 24 × 5
35,8 ± 13,0
83*
33
4
150 × 1
28,0 ± 8,12
43*
33
*р<0,05 между 3 и 4 группами.
Зависимость противоопухолевой активности ЛХС-1208 от дозы и режима применения при
дении на LLC
ТРО, %
Доза (мг/кг)/
Дни после окончания лечения
интервал (час) × число введений
1
4–5
8–9
12
17
10 / 24 × 5
37
14
15
16
12
15 / 24 × 5
70*
43
34
14
13
20 / 24 × 5
88*
57*
36
29
8
25 / 24 × 5
85*
60*
23
9
3
150 × 1
–
95*
81*
55*
49*
Растворитель 0,4 / 24 × 5**
24
7
17
30
19
*р<0,05 по отношению к контролю;
№ 2/том 14/2015
Таблица 4
внутривенном вве-
УПЖ, %
23
–
–
–
–
38
24
2
3
2
0
12
0
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
75
ДОКЛИНИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ…
**объем в мл введенного растворителя.
Таблица 5
Изучение действия ЛХС-1208 на развившуюся опухоль при однократном внутривенном введении на LLC
ТРО, %
Группа
Доза, мг/кг
Исходный объем опухоли, мм3
УПЖ, %
Дни после окончания лечения
3
7
10
14
Контроль
–
484 ± 148,2
–
–
–
–
–
ЛХС-1208
150
475 ± 50,4
51*
47*
21
0
10
*р<0,05 по отношению к контролю.
Таблица 6
Сравнительное изучение эффективности субстанции и лекарственной формы ЛХС-1208 при внутрибрюшинном
введении на LLC
ТРО, %
Гибель от
Дни после
Доза (мг/кг)/ интервал (час) × число ввеУПЖ,
токсичноокончания лечения
Группа
дений
%
сти,
25 / 24 × 5
Субстанция
5
9
12
16
10
+6*
+15
+17
+1
8
0
61**
30
12
9
7
14
29
68**
2
-
3
-
2
-
7
-
0
63
150 × 1
25 / 24 × 5
150 ×1
*знак «+» означает стимуляцию роста опухоли;
*р<0,05 по отношению к контролю.
11
ЛФ
% случаев
1
Таблица 7
Противоопухолевая активность лекарственной формы ЛХС-1208 в сравнении с субстанцией при однократном
внутрибрюшинном введении на LLC
ТРО, %
Дни после окончания лечения
Соединение
Доза, мг/кг
УПЖ, %
5
8
13
17
23
26
Субстанция
110
39*
8*
16
+16**
+21
+25
0
ЛФ
110
74*
75*
18
15
10
2
3
*р<0,05 между группами, которым вводили ЛФ и субстанцию;
**знак «+» означает стимуляцию роста опухоли.
70
59*
60
ТРО,%
50
45
40
32
30
30
25/24 х 5
150 х 1
28
20
25*
19
10
0
1
4
9
14
Дни после лечения
Рис. 1. Зависимость противоопухолевой активности ЛХС-1208 от режима введения на меланоме В-16:
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
76
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ДОКЛИНИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ…
ТРО,%
*р<0,05 между разными режимами введения на 4 день опыта.
80
70
60
50
40
30
20
10
0
74*
56*
47
51*
36*
43
25/24 х 5
150 х 1
7
1
4
9
14
Дни после лечения
Рис. 2. Зависимость противоопухолевой активности ЛХС-1208 от режима введения на РШМ-5:
*р<0,05 между разными режимами введения на 4 и 9 дни опыта.
На меланоме В-16 получен слабый кратковременный противоопухолевый эффект ЛХС-1208
на 4 день после окончания лечения – ТРО=59 %.
На развившейся LLC ЛХС-1208 вызывает
статистически значимое ТРО на 3 и 7 дни после однократного введения: 51 % и 47 % соответственно.
При сравнительном исследовании субстанции и лекарственной формы ЛХС-1208 при внутрибрюшинном применении на LLC показано, что
при ежедневном введении в течение 5 дней в дозе
25 мг/кг препарат не проявляет противоопухолевой
активности. Субстанция ЛХС-1208 при однократном внутрибрюшинном введении в дозе 150 мг/кг
вызывает кратковременный умеренный противоопухолевый эффект: ТРО=61 % и гибель мышей в
14 % случаев, тогда как лекарственная форма при
введении в той же дозе и таком же режиме высокотоксична и вызывает гибель 63 % животных. При
уменьшении терапевтической дозы до 110 мг/кг
противоопухолевый эффект ЛХС-1208 наблюдается в течение 8 дней после окончания лечения только у лекарственной формы препарата: ТРО составляет 74–75 %; субстанция в той же дозе и при том
же режиме применения не проявляет противоопухолевой активности.
Литература
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Балаев А.Н., Осипов В.Н., Федоров В.Н. и др. Синтез и изучение цитотоксической активности аналогов гипоталамического гормона соматостатина // Российский биотерапевтический журнал. – 2012. –
Т. 11, № 4. – С. 47–53.
Барышникова М.А., Грищенко Н.В., Бурова О.С. и др. Роль CD95/FAS-рецептора в индукции апоптоза противоопухолевыми препаратами // Российский биотерапевтический журнал. – 2014. – Т. 13, №
3. – С. 3–7.
Грищенко Н.В., Барышникова М.А., Полозкова А.П. и др. Липосомальные противоопухолевые препараты не используют CD95-зависимый сигнальный путь апоптоза // Российский биотерапевтический
журнал. – 2014. – Т.13, № 1. – С. 37–42.
Горбунова В.А., Манзюк Л.В., Демидов Л.В., Харкевич Г.Ю. Лизомустин – отечественный препарат из
группы производных нитрозомочевины для лечения меланомы кожи // Российский биотерапевтический журнал. – 2014. – Т. 13, № 1. – С. 55–6.
Гулякин И.Д., Николаева Л.Л., Санарова Е.В. и др. Применение фармацевтической технологии для
повышения биодоступности лекарственных веществ // Российский биотерапевтический журнал. –
2014. – Т. 13, № 3. – С. 101–8.
Гулякин И.Д., Санарова Е.В., Ланцова А.В. и др. Разработка наноструктурированной модели лекарственной формы производного индолокарбазола – ЛХС-1208 // Российский биотерапевтический журнал. − 2014. − Т. 13, № 1. − С. 78.
Дмитриева М.В., Оборотова Н.А., Санарова Е.В. и др. Наноструктурированные системы доставки противоопухолевых препаратов // Российский биотерапевтический журнал. − 2012. − Т. 11, № 4. − С. 21–7.
Зверева С.О., Краснюк И.И., Миникер Т.Д. и др. Поиск и изучение растворителей для внутривенного
введения ЛХС-1208, обладающего противоопухолевой активностью // Сборник материалов XIX Рос-
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
ДОКЛИНИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ…
77
сийского национального конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 23–27 апреля 2012 г.). – 2012. –
С. 379.
Краснов В.П., Левит Г.Л., Барышникова М.А. и др. Нитрозомочевины на основе аминокислот: оригинальный противоопухолевый препарат лизомустин // Российский биотерапевтический журнал. –
2013. – Т. 12, № 1. – С. 11–5.
Ланцова А.В., Полозкова А.П., Орлова О.Л. и др. Разработка композиции для внутривенного введения
гидрофобной субстанции производной индолокарбазола ЛХС-1208 // Российский биотерапевтический журнал. – 2013. – Т. 12, № 2. – С. 50.
Ланцова А.В., Санарова Е.В., Оборотова Н.А. и др. Разработка технологии получения инъекционной
лекарственной формы на основе отечественной субстанции производной индолокарбазола – ЛХС1208 // Российский биотерапевтический журнал. − 2014. − Т. 13, №3. − С. 25–32.
Ланцова А.В., Санарова Е.В., Полозкова А.П. и др. Разработка лекарственной формы производного
индолокарбазола ЛХС-1208 // Российский биотерапевтический журнал. – 2014. – Т. 13, № 1. – С. 104.
Мельник С.Я. Синтез и изучение гликозидов, производных бисиндола и родственных индоло[2,3а]карбазолов / Давыдов М.И., Барышников А.Ю. (ред.). – Экспериментальная онкология на рубеже
веков. – М., 2003. – С. 281–93.
Методические рекомендации по доклиническому изучению противоопухолевой активности лекарственных средств. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств.
Часть первая. – М.: Гриф и К, 2012. – С. 642–56.
Оборотова Н.А. Направленная доставка противоопухолевых препаратов // Антибиотики и химиотерапия. – 1991. – Т. 36, № 10. – С. 47.
Руководство по химиотерапии опухолевых заболеваний / Ред. Переводчикова Н.И., Горбунова В.А. –
М.: Практическая медицина, 2015. – 686 с.
Смирнова З.С., Борисова Л.М., Киселева М.П. и др. Противоопухолевая активность соединения ЛХС1208 (N-гликозилированные производные индоло[2,3-а]карбазола) // Российский биотерапевтический журнал. − 2010. − Т. 9, № 1. – С. 80.
Смирнова З.С., Борисова Л.М., Киселева М.П. и др. Противоопухолевая эффективность прототипа
лекарственной формы соединения ЛХС-1208 для внутривенного введения // Российский биотерапевтический журнал. − 2012. − Т. 11, № 2. – С. 49.
Смирнова З.С., Борисова Л.М., Киселева М.П. и др. Доклиническое изучение противоопухолевой активности производного индолокарбазола ЛХС-1208 // Российский биотерапевтический журнал. −
2014. − Т. 13, № 1. – С. 129.
Смирнова З.С., Кубасова И.Ю., Борисова Л.М. и др. Изучение противоопухолевой активности производного индоло[2,3-a]карбазола ЛХС-1006 // Российский биотерапевтический журнал. – 2005. – Т. 4,
№ 1. – С. 70–1.
Смирнова З.С., Кубасова И.Ю., Борисова Л.М. и др. Изучение связи структуры и противоопухолевой
активности в ряду N-гликозидов производных индоло[2,3-a]карбазола // Российский биотерапевтический журнал. − 2006. − Т. 5, № 1. – С. 20.
Смирнова З.С., Кубасова И.Ю., Борисова Л.М. и др. Корреляция цитотоксической и противоопухолевой активности в отношении лейкозов в ряду N-гликозилированных производных индоло[2,3a]карбазола // Российский биотерапевтический журнал. – 2007. – Т. 6, № 1. – С. 50–1.
Смирнова З.С., Кубасова И.Ю., Борисова Л.М. и др. Противоопухолевая активность N-гликозидов
производных индоло[2,3-a]карбазола // Российский биотерапевтический журнал. – 2006. – Т. 5, № 3.
– С. 123–7.
Смирнова З.С., Кубасова И.Ю., Миникер Т.Д. и др. Изучение противоопухолевой активности Nгликозидов замещенных индоло[2,3-a]карбазолов // Российский биотерапевтический журнал. – 2004.
– Т. 3, № 2. – С. 34.
Софьина З.П., Сыркин А.Б. (СССР), Голдин А., Кляйн А. (США) (ред.). Экспериментальная оценка
противоопухолевых препаратов в СССР и США. – М.: Медицина, 1980. – С. 71–112.
D`Arpa P., Liu L.F. Topoisomerase targeting antitumor drugs // Biochim. Biophys. Acta. – 1989. – 989. – P.
1–9.
Kleinschrott J., Hartenstein J., Rudolf C. et al. Non-glicosidic/ non aminoalkil- substituted indolocarbazoles
as inhibitors of protein kinase C // Bioorg. Med. Chem. Lett. – 1993. – 3. – P. 1959–64.
Schechtman D., Mochly-Rosen D. Isozyme-specific inhibitors and activators of protein kinase C // Metods
Enzymol. – 2002. – 345. – P. 470–89.
Skeel T., Khleif S.N. Handbook of Cancer Chemotherapy. 8th edition. Philadelphia: Walters Kluwer & Lippincott Williams & Wilkins, 2011.
Yamashita Y., Fujii N., Murakata C. et al. Induction of mammalian DNA topoisomerase I mediated DNA
cleavage by antitumor indolocarbazole derivatives // Biochemistry. – 1992. – 31. – P. 12069–75.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ПЛАН НАУЧНЫХ МЕРОПРИЯТИЙ ФГБНУ "РОНЦ ИМ. Н.Н. БЛОХИНА" НА 2015 ГОД №
Название
Адрес сайта
1
Школа швейцарской
анестезиологии VASTA
www.ronc.ru
www.vas-int.ru
www.biovitar.ru
2
Школа Школа постдипломного образования
www. ronc.ru
www.mitin.pro
3
Семинар Актуальные вопросы ветеринарной медицины
www.ronc.ru
www.irso.ru
4
Конгресс* X Конгресс Российского общества онкоурологов
www.roou.ru,
www.ronc.ru
5
Конференция* Конференция
"Актуальные вопросы онкогинекологии"
www.ronc.ru,
www.osors.com
6
Конференция II конференция
общества специалистов по
онкологической колопроктологии
www.ronc.ru,
www.oncoproct.ru
7
Конгресс* 19-й ежегодный
Российский Онкологический
Конгресс
www.ronc.ru,
www.rosoncoweb.ru
8
Конгресс* Российский онкологический конгресс. Симпозиум «Опухоли головы и
шеи»
www.ronc.ru,
www.rosoncoweb.ru
9
Симпозиум* «I симпозиум
ветеринарных онкологов
России»
www.ronc.ru
10
Мастер-класс Практический
курс (мастер-класс в операционной и курс лекций)
«Реконструктивнопластические операции при
раке молочной железы»
11
Съезд* VI Съезд детских
онкологов России "Достижения и перспективы
детской онкологии"*
www.ronc.ru
12
Конференция Конференция
Российского общества онкоурологов в Северо-Западном
федеральном округе
www.roou.ru,
www.ronc.ru
www.ronc.ru
Место проведения, ответственная
организация
г. Москва ФГБНУ «РОНЦ им.
Н.Н.Блохина», 115478, Москва,
Каширское ш. д.24, стр.10
Тел. 8-903-758-62-36
e-mail: [email protected]
г. Москва ФГБНУ «РОНЦ им.
Н.Н.Блохина», 115478, Москва,
Каширское ш. д.24, стр.10
тел. 8-903-758-62-36,
e-mail: [email protected]
г. Москва ФГБНУ «РОНЦ им.
Н.Н.Блохина» ,115478, г. Москва,
Каширское шоссе, 24 Тел/факс (495)
648-92-91 Тел/факс (495) 324-96-29
e-mail:[email protected]
г. Москва ФГБУ «РОНЦ им.
Н.Н.Блохина» РАМН
115478, г. Москва, Каширское шоссе, 24, тел./факс: (495) 988-89-92 email: [email protected]
г. Москва ФГБУ «РОНЦ им.
Н.Н.Блохина» РАМН
115478, г. Москва,
Каширское шоссе, 24
тел./факс: (499) 324-90-75
e-mail: [email protected]
г. Москва ФГБНУ «РОНЦ им.
Н.Н.Блохина», 115478, г. Москва,
Каширское шоссе, 24 тел./факс:
(499) 324-91-19
e-mail: [email protected]
г. Москва ФГБНУ «РОНЦ им.
Н.Н.Блохина», 115478, г. Москва,
Каширское шоссе, 24 тел./факс:
(499) 324-92-19
e-mail: [email protected]
г. Москва ФГБНУ «РОНЦ им.
Н.Н.Блохина», 115478, г. Москва,
Каширское шоссе, 24, тел.: (499)
324-19-40
e-mail: [email protected]
115478, г. Москва, Каширское шоссе, 24 тел./факс: (499) 324-96-29
тел.: (499) 324-21-55
e-mail: [email protected]
г. Москва ФГБНУ «РОНЦ им.
Н.Н.Блохина», 115478, г. Москва,
Каширское шоссе, 24 тел. 8 (499)
324 -43-79,
e-mail: [email protected]
г. Москва ФГБНУ "РОНЦ им.
Н.Н.Блохина", 115478, г.Москва,
Каширское шоссе, 24. тел.: (499)
324-42-89, факс (499) 324-55-31,
(499) 324-98-55,
e-mail: [email protected],
[email protected]
г. Санкт-Петербург ФГБНУ «РОНЦ
им. Н.Н.Блохина», 115478, г. Москва, Каширское шоссе, 24 тел./факс:
(495) 988-89-92
e-mail: [email protected]
Время проведения
n участников
21-25 сентября (5
дней)
40 (40)
15 сентября – 26
июня (24 дня)
500 (100
иногородних)
3 октября (1 день)
200 (100
иногородних)
1-3 октября (3 дня)
3000 (1000)
октябрь (2 дня)
300 (100)
15-16 октября (2 дня)
250 (150
иногородних)
17-19 ноября (3 дня)
4000 (400)
17-19 ноября (3 дня)
250 (150)
25-26 ноября (2 дня)
200 (100)
ноябрь (1 день)
13 (8 иногородних)
ноябрь (3 дня)
декабрь (1 день)
200 (40
иногородних)
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
РАЗРАБОТКА ЛИОФИЛИЗИРОВАННОЙ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ…
79
УДК 577.352.2:615.45:615.015.44
А.В. Ланцова, Е.А. Котова, Е.В Санарова, А.П. Полозкова, М.А. Барышникова, Н.А. Оборотова
РАЗРАБОТКА
ЛИОФИЛИЗИРОВАННОЙ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ЦИФЕЛИНА
ФГБНУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина», Москва
Контактная информация
Ланцова Анна Владимировна, к.фарм.н., старший научный сотрудник лаборатории разработки лекарственных
форм НИИ ЭДиТО
адрес: 115478 Москва, Каширское шоссе, 24; тел: +7(499)612-81-92
e-mail: [email protected]
Статья поступила 04.03.2015, принята к печати 27.04.2015.
Резюме
Целью настоящего исследования является разработка стерически стабилизированной липосомальной формы цифелина. Субстанция цифелина получена в лаборатории химического синтеза ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина». Все используемые вспомогательные вещества и реактивы соответствовали НД. Способ получения липосом
включает в себя: стадию получения многослойной, а затем однослойной липосомальной дисперсии. Для повышения стабильности липосом с цифелином в процессе хранения разработан режим лиофилизации, для этого использовали сублимационную сушку Эдвардс Minifast Do.2. Размер липосом определяли на автокорреляционном спектрофотометре «Наносайзер». Спектрофотометрический метод применили для количественного определения цифелина в липосомах. Кристаллы не включенного в липосомы препарата отделяли методом фильтрации с использованием фильтров с ø пор 0,22 нм. Перекисное окисление липидов устанавливали по концентрации конечного
продукта окисления – МДА. Для оценки цитотоксической активности исследуемых липосом цифелина in vitro
использован МТТ-тест. Опыт проводили на клеточных линиях опухолей человека: SKOV-3 – аденокарцинома
яичников и Jurkat – Т-клеточный лимфобластный лейкоз. Цифелин как гидрофобное вещество включали в состав
липосомальной мембраны. Оптимальным по эффективности включения и внешнему виду выбран состав с молярным соотношением липидов фосфатидилхолин : холестерин : дистеароилфосфатидилэтаноламинполиэтиленгликоль-2000 165 : 8 : 1 и соотношением «липид : цифелин» 12 :1, включение ЛВ в котором составило
98±1 %, средний размер липосом 136±12 нм. На клеточных линиях опухолей человека SKOV-3 и Jurkat показана
цитотоксическая активность ПЭГ-липосом цифелина. В результате исследований разработан лекарственный препарат «Цифелин липосомальный лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 17 мг».
Ключевые слова: липосомы, цифелин, лиофилизированная липосомальная форма, цитотоксическая активность, SKOV-3, Jurkat.
A.V. Lantsova, E. A. Kotova, E.V. Sanarova, A.P. Poloskova , M.A. Baryshnikova, N.A. Oborotova
DEVELOPMENT
OF LYOPHILIZED LIPOSOMAL PHARMACEUTICAL DOSAGE FORM CIFELIN
FSBNI «N. N. Blokin Russian Cancer Research Center», Moscow
Abstract
This study objective has been to develop optimal composition of Cifelin sterically stabilized liposomal formulation. The substance of Cifelin synthesized in chemical synthesis laboratory FSBNI «N.N. Blokhin RCRC». All used
excipients and reagents conform to the standard documentation. Method of obtaining liposomes includes: a method of
obtaining Cifelin multilamellar and unilamellar liposomes dispersions. Liposomal dispersion has been lyophilized on
freeze-dryer Edwards Minifast DO.2. Liposomes size has been measured by light diffusion dynamic spectrums copy on
Nicomp 380 Submicron Particle Sizer. Quantitative measurement has been conducted by spectrometry in ultraviolet
area. Crystals of unenclosed into lipid bilayer Cifelin have been separated by filtration through filter with pore diameter
of 0,22 µm. Lipids peroxidation has been estimated by concentration of oxidation final product – MDA. MTT-test has
been used to estimate Cifelin LF cytotoxic activity in vitro. In this study the optimum molar ratio of components has
been found for liposomal membrane composed of phosphatidylcholine, cholesterol and DSPE-PEG-2000. Composition
with lipids molar ratio 165 : 8 : 1 and “lipid: Cifelin” ratio 12 : 1 has been chosen as optimal by entrapment efficiency
and appearance, encapsulated API value in this composition has been 98±1 %, liposomal size has been 136±12 nm. On
cell line SKOV-3 and Jurkat in vitro cytotoxic effect of Cifelin liposomal drug form has been highly increased. As a
result of the study drug product “Cifelin lyophilized liposomal for injections 17 mg” has been developed.
Key words: liposomes, Cifelin, lyophilized liposomal drug, cytotoxic activity, SKOV-3, Jurkat.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
80
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
РАЗРАБОТКА ЛИОФИЛИЗИРОВАННОЙ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ…
Введение
Наряду с хирургическими и лучевыми методами лечения широко применяется химиотерапия
злокачественных опухолей, которая получила научное обоснование в 40-х гг. ХХ в. В ФГБУ «РОНЦ
им. Н.Н. Блохина» синтезированы первые отечественные препараты – производные бис-(β-хлорэтил)амина, которым наряду с высокой клинической
эффективностью присуща высокая токсичность.
Наименее токсичным производным является цифелин – оригинальный отечественный препарат [8;
13; 15; 16; 20–22].
Для устранения побочных эффектов, повышения биодоступности за счет возможности внутривенного введения гидрофобного ЛВ, сокращения
вводимых доз разработана ЛЛФ цифелина [8; 21;
22]. При изучении спектра специфического действия на ряде перевиваемых опухолей мышей при
внутрибрюшинном введении показано, что ЛФ
превосходит субстанцию по противоопухолевому
действию на модели аденокарциномы молочной
железы (ТРО 84 и +26 %, УПЖ 25 и 9 % соответственно). Введение липосомального цифелина беспородным крысам с перевиваемой карциносаркомой
Уокера вызывало излечение 89 % животных при
пероральном (для субстанции 13 %) и 100 % – при
внутривенном введении [8; 21; 22].
Наряду с положительными свойствами
“обычных” липосом, таких как защита от биодеградации, постепенное высвобождение ЛВ, снижение
токсичности, пассивное нацеливание в «горячие
точки», появляется нежелательное взаимодействие
липосом с белками плазмы, в результате которого
полученные комплексы захватываются из кровотока макрофагами ретикуло-эндотелиальной системы
[10–12].
Для того, чтобы лекарственный препарат,
вводимый внутривенно, достиг в организме клетокмишеней, предлагаются различные способы снижения опсонизации:
 введение в состав липосомальной мембраны холестерина, липидов с высокой
температурой фазового перехода,
 получение везикул с размером не более
100 нм.
Однако наиболее эффективным методом
оказалась модификация поверхности липосом гликолипидами, например, моносиалоганглиозидами,
фосфатидилинозитолом, цереброзида сульфатом и
липидными производными полиэтиленгликоля
(ПЭГ).
Наибольшую популярность, благодаря дешевизне и простоте синтеза, получили гидрофильные полимеры ПЭГ, обладающие длительным временем циркуляции в кровотоке за счет блокирования механизма поглощения липосом клетками ретикуло-эндотелиальной системы (создают избыточное осмотическое давление в примембранной
области везикулы) [9; 14; 16–19; 23; 25; 31]. Период
полувыведения таких липосом достигает 24 ч у
мышей и крыс и до двух дней в организме челове№ 2/том 14/2015
ка. Данное явление гарантированно способствует
локализации лекарственного препарата в опухоли
или других поврежденных тканях с повышенной
проницаемостью сосудов.
Целью данного исследования явилась разработка оптимального состава стерически стабилизированной липосомальной формы цифелина.
Материалы и методы
Лекарственное вещество – цифелин синтезировано в НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» (рис. 1). Для получения липосом использовали фосфатидилхолин (ФХ, Е PC S Lipoid GmbH,
Германия), холестерин (Хол, SIGMA, Германия),
дистеароилфосфатидилэтаноламинполиэтиленгликоль-2000 (ДСФЭ-ПЭГ-2000, Lipoid
GmbH, Германия).
Методика изготовления дисперсии МСЛ цифелина. Изготовление МСЛ цифелина проводили
методом гидратации липидной пленки. Точные навески ФХ, Хол, ДСФЭ-ПЭГ-2000 и цифелина растворяли в хлороформе и переносили в круглодонную колбу. Раствор упаривали на роторном испарителе (BÜCHI Rotavapor R-200) при температуре
водяной бани 35±2 С (BÜCHI Heating Bath B-490,
BÜCHI Labortechnik AG, Швейцария) и давлении
24 мм рт. ст. до образования тонкой пленки на
стенках колбы с последующим досушиванием в
течение 50 минут под вакуумом. Липидную пленку
гидратировали 0,9% раствором натрия хлорида до
полного смывания со стенок колбы.
Методика изготовления дисперсии однослойных липосом цифелина. Полученную дисперсию
МСЛ цифелина фильтровали через нейлоновые
мембранные фильтры Pall N66 (ООО «Палл Евразия», Россия) с ø пор 1,2 и 0,45 мкм, после чего измельчали на гомогенизаторе Microfluidizer M-110S
(Microfluidics, США) под давлением 40 psig (280
кПа) в течение 1–6 мин (в зависимости от объема) и
фильтровали через мембраны с ø пор 0,22 мкм.
Лиофилизацию липосомальной дисперсии
проводили на установке лиофильной сушки
Edwards Minifast DO.2 (Ero Electronic S.p.A., Великобритания) после добавления криопротектора в
экспериментально подобранной концентрации.
Для достижения поставленной цели исследования использовали следующие методы анализа:
 Размер липосом определяли методом
динамической спектроскопии светорассеяния на наносайзере Nicomp 380 Submicron Particle Sizer (Particle Sizing Systems, США).
 Количественное определение проводили
методом спектрофотометрии в УФобласти на спектрофотометре Cary 100
(Varian, Inс., Австралия).
 Кристаллы не включенного в липидный бислой цифелина отделяли с помощью фильтрации через фильтр с ø
пор 0,22 мкм.
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
РАЗРАБОТКА ЛИОФИЛИЗИРОВАННОЙ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ…

Перекисное окисление липидов устанавливали по концентрации конечного продукта окисления – МДА, образующегося
после взаимодействия липосом с трихлоруксусной и тиобарбитуровой кислотами.
Для оценки цитотоксической активности исследуемой ЛЛФ цифелина in vitro использован
МТТ-тест. Опыт проводили на клеточных линиях
опухолей человека: SKOV-3 – клетки аденокарциномы яичников и Jurkat – Т-клеточный лимфобластный лейкоз. ЛЛФ цифелина исследовали в концентрациях 0,4 мкг/мл, 4,7 мкг/мл, 47 мкг/мл и 426
мкг/мл. Клетки инкубировали с препаратом в течение 24, 48 и 72 часов, затем добавляли МТТ, через
4 ч образовавшиеся кристаллы формазана растворяли в диметилсульфоксиде и измеряли оптическую плотность на фотометрическом анализаторе
иммуноферментных реакций «АИФР-01 Униплан»
(ЗАО «Пикон», Россия).
Результаты и обсуждение
Разработка состава
липосомальной формы цифелина
Цифелин как гидрофобное вещество включали
в состав липосомальной мембраны, основным компонентом которой выбран липид – фосфатидилхолин.
Холестерин добавляли для придания жесткости
структуре бислоя. Такие липосомы легко подвергаются захвату из кровотока клетками ретикулоэндотелиальной системы, поэтому для увеличения
продолжительности циркуляции липосом в состав
вводили дистеароилфосфатидилэтаноламин-полиэтиленгликоль-2000. Липидное производное ПЭГ, повышая осмотическое давление в примембранной области, препятствует поглощению липосом макрофагами и обеспечивает доставку ЛВ в опухолевый очаг
путем пассивного нацеливания [1–7].
Изготавливали составы с различными молярными соотношениями «ФХ : Хол : ДСФЭ-ПЭГ2000», а также изменяли соотношение «липид : цифелин».
Основным параметром выбора явилась эффективность включения ЛВ. По результатам проведенного исследования установлено, что избыточное
количество Хол не включается в бислой, и на стадии получения МСЛ образовывался обильный кристаллический осадок. В образцах с высоким содержанием ДСФЭ-ПЭГ-2000 наблюдали низкое включение цифелина в мембрану. Оптимальным по ЭВ и
внешнему виду выбран состав с молярным соотношением липидов 165 : 8 : 1 и соотношением «липид : цифелин» 12 : 1, включение ЛВ в котором
составило 98±1 %.
При гомогенизации быстрее и без особых
усилий удалось получить липосомы меньшего размера, чем при экструзии. Как видно из табл. 1, для
ЛЛФ цифелина сохраняется оптимальный размер
везикул и величина ЭВ равная 97±1 % при измельчении 100 мл в течение 3–4 минут.
№ 2/том 14/2015
81
Стабилизация
липосомальных дисперсий цифелина
При длительном хранении дисперсии происходит изменение бислойной структуры, липосомы
начинают агрегировать, «вытекает» внутреннее
содержимое. Для повышения срока годности их
стабилизируют лиофилизацией [24; 26–30].
С целью защиты мембраны липосом от повреждения при лиофильной сушке в состав необходимо добавлять криопротектор, в связи с этим изучили влияние криопротекторов на показатели качества ЛЛФ цифелина. Для этого использовали представителей класса углеводов: глюкозу, сахарозу,
лактозу и класса многоатомных спиртов – маннит
(табл. 2).
Как видно из данных этой таблицы, при добавлении в состав ЛЛФ криопротектора в молярном
соотношении «суммарный липид : криопротектор»
1 : 1,6 липосомы с маннитом сильно укрупнялись, а
с сахарами, наоборот, размер везикул уменьшался, и
вместе с ним снижалась эффективность включения
ЛВ в бислой. Лучшие результаты получены с криопротектором сахарозой – стабильный размер липосом и ЭВ 97±1 %.
Изменение в дисперсии цифелина концентрации сахарозы от 4 до 12 % незначительно влияло на величину рН и размер везикул после лиофилизации. В итоге выбран состав ЛЛФ со значением
рН 5,3 и размером везикул 130±12 нм, в котором
концентрация криопротектора составила 8 %, а молярное соотношение «липид : сахароза» – 1 : 1,4.
При хранении ЛЛФ может протекать деструкция липидной мембраны за счет окисления ФЛ,
поэтому исследовано влияние добавления антиоксиданта – α-токоферола (табл. 3).
По результатам, представленным в этой таблице, видно, что антиоксидант не способствует
снижению окисления липидов в ЛЛФ цифелина
при хранении при (+40 С). Содержание продуктов
окисления (С МДА ) в таких составах выше, чем в
составе без антиоксиданта. При сравнении дисперсий по внешнему виду наблюдали выпадение осадка и расслоение в процессе хранения липосом с
антиоксидантом в результате дестабилизации липосомальной мембраны. По результатам проведенного эксперимента обнаружили, что добавление в
липосомальный состав цифелина α-токоферола в
качестве агента, препятствующего перекисному
окислению, привело к возникновению прооксидантного действия, поэтому выбран состав липосомальной дисперсии без добавления антиоксиданта.
Так, в результате исследования разработан лекарственный препарат «Цифелин липосомальный
лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 17 мг». Для ЛЛФ разработаны методики количественного определения разведений ЛЛФ и субстанции цифелина в 95 %-ном этиловом спирте методом
спектрофотометрии в УФ-области при 260±2 нм (рис.
2). По представленным на рис. 1 кривым видно, что
«пустые» липосомы не поглощают в области максимума, поэтому количественное определение можно
проводить относительно растворителя.
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
82
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
РАЗРАБОТКА ЛИОФИЛИЗИРОВАННОЙ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ…
Таблица 1
Изменение размера везикул цифелина при гомогенизации
Время измельчения (объем 100 мл)
Параметр качества
1мин
2мин
3мин
4мин
5мин
Размер, нм
190±10
147±9
131±14
120±12
104±15
6мин
136±18
Таблица 2
Влияние криопротекторов на размер и эффективность включения цифелина в липосомы после лиофильной
сушки
Размер везикул, нм
Эффективность включения после
Криопротектор
До лиофиПосле лиофиЧерез 2 недели после
лиофилизации, %
лизации
лизации
лиофилизации
Глюкоза
158±14
126±20
124±23
74±2
Сахароза
154±9
137±15
136±12
97±1
Лактоза
160±17
129±22
138±18
82±1
Маннит
160±24
225±41
387±49
–
Контроль
158±15
195±27
332±38
–
Таблица 3
Характеристика ЛЛФ цифелина при добавлении α-токоферола
Параметр
качества
Размер
везикул, нм
Значение
рН,
С МДА ,
нмоль/мл
Состав 1
(без α-токоферола)
Состав 2
(с добавлением 6,5 мг
α-токоферола)
Через 6
До
После
мес после
Лиофилизации
Состав 3
(с добавлением 13 мг
α-токоферола)
Через 6
До
После
мес после
До
После
Через 6
мес после
157±11
130±13
131±10
171±8
145±17
152±18
165±14
134±22
182±31
5,4±0,3
5,3±0,4
5,3±0,1
5,6±0,2
5,7±0,3
5,3±0,5
5,6±0,3
5,6±0,5
5,1±0,4
2,73±0,14
2,76±0,06
3,07 ±0,10
2,70±0,09
2,76±0,07
3,08 ±0,12
2,64±0,15
2,66±0,12
3,11 ±0,19
Рис. 1. Структурная формула цифелина.
По результатам определения специфичности,
линейности, правильности, прецизионности и аналитической области разработанные методики количественного определения применимы в диапазоне
концентраций ЛВ от 80 до 120 %.
Стандартные серии ЛЛФ цифелина хранили
в морозильной камере при –180 С, поскольку такая
температура установлена для хранения липидов.
Согласно требованиям нормативной документации,
определяли показатели качества сразу после изготовления, через 3; 6 и 12 месяцев.
Продолжаются исследования для установления максимального срока годности.
Изучение цитотоксической активности
ЛЛФ цифелина в опытах in vitro
В ходе исследования цитотоксического эффекта определяли количество опухолевых клеток,
погибших под воздействием ЛЛФ цифелина.
№ 2/том 14/2015
Цитотоксический эффект характеризует
ИК 50 – ингибирующая концентрация препарата,
при которой наблюдается гибель 50 % опухолевых
клеток. В ходе исследования отмечена тенденция к
ее снижению при увеличении времени инкубации с
ЛЛФ цифелина от 24 до 72 ч (рис. 3). На клеточной
линии SKOV-3 величина ИК 50 при 24 ч инкубации
не была достигнута, при инкубации 72 ч она составила 47 мкг/мл (рис. 3, А). Клеточная линии Jurkat
оказалась более чувствительной к препарату, ИК 50
при 24ч инкубации – 47 мкг/мл и ее значение снижалось при 48 и 72 ч инкубации (рис. 3, Б).
Таким образом, на клеточных линиях опухолей
человека выявили цитотоксическую активность ЛЛФ
цифелина, которая оказалась более выраженной на
клетках лейкоза. Снижение ИК 50 при увеличении
времени инкубации доказывает теорию о пролонгированном действии ПЭГилированных липосом.
Заключение
Разработана стерически стабилизированная
ЛЛФ цифелина: «Цифелин липосомальный лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 17 мг»,
обладающая длительным временем циркуляции в
кровотоке. На клеточных линиях опухолей человека
SKOV-3 и Jurkat выявили возрастание цитотоксичности стерически стабилизированных липосом цифелина при увеличении времени инкубации.
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
РАЗРАБОТКА ЛИОФИЛИЗИРОВАННОЙ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ…
83
Рис. 2. Электронные спектры поглощения спиртовых разведений ЛЛФ (1), «пустых» липосом (2) и субстанции
цифелина (3).
А
SKOV‐3
Выживаемость, %
120
100
80
24 ч
60
48 ч
40
72 ч
20
0
0,4
4,7
47
426
Концентрация цифелина, мкг/мл
Jurkat
Б
Выживаемость, %
120
100
80
24 ч
60
48 ч
40
72 ч
20
0
0,4
4,7
47
426
Концентрация цифелина, мкг/мл
Рис. 3. Цитотоксическая активность ЛЛФ цифелина.
А: на клеточной линии SKOV-3
Б: на клеточной линии Jurkat.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
84
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
РАЗРАБОТКА ЛИОФИЛИЗИРОВАННОЙ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ…
Литература
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
Барышников А.Ю. Наноструктурированные липосомальные системы как средство доставки противоопухолевых препаратов // Вестник РАМН. – 2012. – № 3. – С. 23–30.
Барышников А.Ю., Блохина Н.Г., Кадагидзе З.Г. и др. Моноклональные антитела ИКО-1 против константной части Iaподобных антигенов // Экспериментальная онкология. – 1984. – № 6. – С. 123–5.
Барышников А.Ю., Оборотова Н.А. Иммунолипосомы – новое средство доставки лекарственных препаратов // Современная онкология. – 2001. – Т. 3, №2. – С. 4.
Безруков Д.А., Королева А.И., Ланцова А.В. и др. Оптимизация метода получения стерически стабилизированных термочувствительных липосом с активной загрузкой доксорубицином // Российский биотерапевтический журнал. – 2006. –
Т. 5, № 4. – С. 79–83.
Гулякин И.Д., Санарова Е.В., Ланцова А.В. и др. Разработка наноструктурированной модели лекарственной формы производного индолкарбазола – ЛХС-1208 // Российский биотерапевтический журнал. − 2014. − Т. 13, № 1. − С. 78.
Дмитриева М.В., Оборотова Н.А., Санарова Е.В. и др. Наноструктурированные системы доставки противоопухолевых
препаратов. // Российский биотерапевтический журнал. − 2012. − Т. 11, №4. − С. 21–7.
Каплун А.П., Шон ЛеБанг, Краснопольский Ю.М. и др. Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ // Вопросы мед. химии. – 1999. – Т. 45, № 1. − С. 3–12.
Котова Е.А., Полозкова А.П., Денисова Т.В. и др. Оптимизация состава и технологии изготовления stealth липосом цифелина // Химико-фармацевтический журнал. – 2011. – Т. 45, № 12. – С. 37–40.
Ланцова А.В., Барышникова М.А., Санарова Е.В. и др. Изучение активности в системе in vitro наноструктурированной
лекарственной формы лизомустина // Российский биотерапевтический журнал. – 2012. – Т. 11, № 2. – С. 31.
Ланцова А.В., Оборотова Н.А., Перетолчина Н.М. и др. Сравнительное изучение противоопухолевой активности липосомальных лекарственных форм препаратов производных нитрозоалкилмочевины // Сибирский онкологический журнал. – 2005. – № 2. – С. 25–9.
Ланцова А.В., Сапрыкина Н.С., Оборотова Н.А. и др. Противоопухолевая активность наноструктурированной формы
лизомустина на мышах с солидной опухолью меланомой B-16 // Российский биотерапевтический журнал. – 2013. – Т.
12, № 2. – С. 52.
Ланцова А.В., Сапрыкина Н.С., Санарова Е.В. и др. Изучение противоопухолевой активности наноструктурированной
липосомальной формы лизомустина in vivo // Российский биотерапевтический журнал. – 2012. – Т. 11, № 2. – С. 32.
Оборотова Н.А. Достижения в области современных лекарственных форм противоопухолевых препаратов // Российский биотерапевтический журнал. − 2013. − Т. 12, № 2. − С. 61.
Оборотова Н.А., Барышников А.Ю. Липосомальные лекарственные формы в клинической онкологии // Успехи современной биологии. − 2009. − Т. 121, № 5. − С. 464.
Оборотова Н.А., Лопатин П.В., Барышников А.Ю. Биофармацевтические аспекты создания лекарственных форм противоопухолевых соединений // Российский онкологический журнал. – 2002. – № 5. – С. 8–11.
Оборотова Н.А., Санарова Е.В. Роль новых фармацевтических технологий в повышении избирательности действия
противоопухолевых препаратов // Российский химический журнал. − 2012. – Т. LVI, № 3–4. − С. 33–40.
Санарова Е.В., Оборотова Н.А., Смирнова З.С. и др. Применение липосомальных систем доставки для создания нового
эффективного противоопухолевого фотосенсибилизатора // Российский биотерапевтический журнал. – 2013. – Т. 12, №
2. – С. 72.
Санарова Е.В., Оборотова Н.А., Смирнова З.С. и др. Химико-фармакологическая и биологическая стандартизация липосомальной лекарственной формы противоопухолевого фотосенсибилизатора тиосенса // Биофармацевтический журнал. – 2013. – Т. 5, № 3. – С. 31–5.
Санарова Е.В., Полозкова А.П., Орлова О.Л. и др. Разработка плана валидации технологического процесса получения
лиофилизированной липосомальной лекарственной формы тиосенса // Российский биотерапевтический журнал. – 2012.
– Т. 11, № 2. – С. 46.
Смирнова Л.И., Оборотова Н.А., Зимакова Н.И. и др. Доклинические и клинические исследования нового противоопухолевого препарата – таблетки цифелина // Российский онкологический журнал. – 2001. – № 5. – С. 46–8.
Чикинева Н.А. Автореф. дис. … канд. мед. наук. – Москва. – 2002. – 24 с.
Чикинева Н.А., Смирнова 3.С., Орлова О.Л. и др. Создание и изучение липосомальной лекарственной формы цифелина
// Химико-фармацевтический журнал. – 2001. – Т. 4, № 8. – С. 19.
Шадрина А.В., Перетолчина Н.М., Полозкова А.П. и др. Биофармацевтические исследования липосомального лизомустина // Российский биотерапевтический журнал. – 2004. – Т. 3, № 1. – С. 49–53.
Arshinova O.Y., Sanarova E.V., Lantsova A.V. et al. Drug synthesis methods and manufacturing technology lyophilization of
liposomal drug forms (review) // Pharmaceutical Chemistry Journal. – 2012. – 46(4). – P. 228–33.
Gregoriadis G. (ed.). Liposome Technology Vol. 3. –New York: Informa Healthcare USA, 2007. – P. 49–65.
Lantsova A., Kotova E., Sanarova K. et al. Biopharmaceutical study of nanostructured formulation of the anticancer drug derivative of nitrosoalkylurea Lysomustine // Journal of Drug Delivery Science and Technology. – 2012. – 22(6). – P. 469–72.
Sanarova E.V., Kotova E.A., Lantsova A.V. et al. Quality of liposomal phospholipids at different stages in the manufacturing
process // Pharmaceutical Chemistry Journal. – 2012. – 46(3). – P. 192–5.
Sanarova E.V., Polozkova A.P., Meerovich I.G. et al. Structure of chemical compounds, methods of analysis and process control: quantitative determination of Thiosens in a new liposomal drug a form // Pharmaceutical Chemistry Journal. – 2012. –
46(6). – P. 386–8.
Sanarova E.V., Polozkova A.P., Meerovich I.G. et al. Quantita antitative determination of Thiosens in a new liposomal drug
form // Pharmaceutical Chemistry Journal. –2011. – 45. – P. 1–3.
Sanarova E.V., Kotova E.A., Lantsova A.V. Technology of liposomal thiosens, Cifelin and Lysomustin for industrial purposes //
Journal of Physics: Conference Series. – 2012. – 345(1). – P. 012045.
V.P. Torchilin (ed.). Nanoparticulates as Drug Carriers. – London: Imperial College Press, 2006. – P. 437–62.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ЛИМФОЦИТАРНАЯ ИНФИЛЬТРАЦИЯ ГЕПАТОКАРЦИНОМ…
85
УДК 616.36-006-092.9:615.322:599.324.4
Е.В. Бочаров1,2, Р.В. Карпова1, А.А. Вершинская1, В.Г. Кучеряну2, О.А. Бочарова1
ЛИМФОЦИТАРНАЯ ИНФИЛЬТРАЦИЯ ГЕПАТОКАРЦИНОМ МЫШЕЙ
ВЫСОКОРАКОВОЙ ЛИНИИ СВА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ МУЛЬТИФИТОАДАПТОГЕНА
В РАННЕМ ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ
1
ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина», Москва
2
ФГБНУ «НИИ общей патологии и патофизиологии», Москва
Контактная информация
Бочарова Ольга Алексеевна, д.б.н., проф., зав. лабораторией иммунофармакологии НИИ ЭДиТО
адрес: 115478 Москва, Каширское ш., 24; тел. +7(499) 324-55-26
e-mail: [email protected]
Статья поступила 16.04.2015, принята к печати 27.04.2015.
Резюме
В статье представлены результаты морфологического исследования ткани печени мышей высокораковой
линии СВА на разных этапах онтогенеза при воздействии мультифитоадаптогена в течение 1 месяца жизни.
Выявлены умеренно- и низкодифференцированные трабекулярные и трабекулярно-ацинарные гепатокрциномы.
У мышей опытной группы в возрасте 22 мес определена лимфоцитарная инфильтрация гепатокарцином, а также деструкция опухолевых узлов. У мышей контрольной группы инфильтрации и деструкции гепатокарцином
не наблюдали.
Ключевые слова: высокораковая линия мышей СВА, трабекулярные и трабекулярно-ацинарные гепатокарциномы, опухоль-инфильтрирующие лимфоциты, фитоадаптогены.
E.V. Bocharov1; 2, R.V. Karpova1, А.А. Vershinskaya1, V.G. Kucheryanu2, O.A. Bocharova1
LYMPHOCYTE INFILTRATION
IN HIGH-CANCER CBA MICE HEPATOCARCINOMAS
USING MULTIPHYTOADAPTOGENE EARLY POSTNATAL ONTOGENESIS ADMINISTRATION
1
FSBSI «N.N. Blokhin Russib Cancer Research Center», Moscow
2
FSBSI «The institute of general pathology and pathophysiology», Moscow
Abstract
The article presents the results of high-cancer CBA inbred mice liver morphological research while using multiphytoadaptogene early postnatal ontogenesis administration. Moderate and pooly differentiated trabecular and trabecular-acinar hepatocarcinomas were determined. Lymphocytes infiltration and destructive features were microscopically
visible in hepatocarcinomas at the age of 22 months. Infiltrated lymphocytes and destructive features in control mouse
hepatocarcinomas were not detected.
Key words: high-cancer CBA inbred mice, trabecular and trabecular-acinar hepatocarcinomas, tumours infiltrated lymphocytes, phytoadaptogenes.
Введение
В предыдущих исследованиях на модели
спонтанного гепатоканцерогенеза у мышей-самцов
высокораковой линии СВА было выявлено снижение в онтогенезе экспрессии молекул лейкоцитарных интегринов LFA-1 (СD11a/CD18) и Mac-1
(СD11b/CD18), обеспечивающих контактные взаимодействия эффекторов иммунитета и опухолевых
клеток. Вместе с тем определено возрастание сывороточного уровня интерлейкинов -6 и -10 [11; 12].
Применение МФА фитомикса-40 у высокораковых мышей СВА в раннем постнатальном онтогенезе в течение первого месяца жизни, захватывая завершающий период дифференцировки нор№ 2/том 14/2015
мальной ткани печени, способствовало усилению
экспрессии молекул LFA-1 и Mac-1, подавлению
сывороточных уровней ИЛ-6 и ИЛ-10, снижению
уровня наследственного опухолеобразования, количества и размеров гепатокарцином по сравнению
с контрольными животными. Применение МФА,
начиная с 6 мес постнатального развития (периода
возникновения первых гепатом) и до естественной
гибели животного, также приводило к коррекции
показателей лейкоцитарных интегринов LFA-1 и
Mac-1, ИЛ -6 и -10, снижению частоты возникновения и размеров гепатокарцином, не влияя на их
количество у одного животного [11; 12; 13].
Целью настоящей работы явились морфологические исследования печени высокораковых
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
86
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ЛИМФОЦИТАРНАЯ ИНФИЛЬТРАЦИЯ ГЕПАТОКАРЦИНОМ…
мышей-самцов линии СВА, генетически предрасположенных к развитию спонтанных гепатом, при
введении МФА в течение первого месяца постнатального развития.
В задачи работы входила оценка морфологических изменений в ткани печени мышей линии
СВА на разных этапах онтогенеза при воздействии
МФА.
Материалы и методы
Работу проводили на мышах-самцах высокораковой инбредной линии СВА (сублиния СВА/Lac
Y; [3; 4; 19]). Первые спонтанные гепатомы у мышей-самцов возникают в период, близкий к 6месячному возрасту, и встречаются в 7 раз чаще,
чем у самок. В возрасте 18-22 мес в 100% случаев у
самцов выявляют гепатокарциномы [17; 27].
Мыши контрольной группы (n=90) получали
в качестве питья воду. Мышам опытной группы
(n=80) 10 %-ный раствор МФА добавляли в воду,
которую получали самки, начиная с момента рождения и до отъема детенышей в возрасте 1 мес постнатального развития. Всего в работе использовано 170 мышей.
Часть животных (13–30 мышей из каждой
группы) забивали (с использованием эфирного наркоза) в возрасте 4; 8; 22 мес. Печень контрольных и
опытных животных, помимо макроскопического
исследования, подвергали гистологической обработке по стандартной методике и окрашиванию
гематоксилином и эозином.
МФА представляет собой препарат на основе
компонентов экстрактов сорока растений, включенных в Госфармакопею РФ [5; 6], в том числе –
известных адаптогенов женьшеня (Panax L.), родиолы розовой (Rhodiola rosea L.), элеутерококка
(Eleutherococcus M.), лимонника (Schisandra
coccinea), заманихи (Oplopanax elatus) и аралии
(Aralia racemosa L.).
Разработаны способы биологической и химической стандартизации [7; 20; 21; 22]. В предыдущих исследованиях выявлены антиоксидантное,
антимутагенное, противоопуховолевое, радиопротекторное, нейропротекторное, иммуномодулирующее, в том числе – противовоспалительное и
интерфероногенное, действия МФА [2; 8–10; 14–
16; 18].
Результаты и обсуждение
В возрасте 4 мес. у мышей контрольной и
опытной групп опухоли обнаружены не были.
На рис. 1 в качестве примера представлен
срез ткани печени самца контрольной группы в
возрасте 4 мес. Обычные гепатоциты с нормальными ядрами и цитоплазмой образуют печёночные
балки, характерные для нормальной ткани органа.
Виден также срез сосуда с эритроцитами внутри
просвета. Микроскопическое строение ткани печени опытных животных в этом же возрасте было
аналогичным.
№ 2/том 14/2015
На рис. 2 показан срез ткани печени животного контрольной группы в возрасте 8 мес, который также демонстрирует нормальное строение:
рисунок печеночных балок, просвет кровеносного
сосуда, наличие желчных капилляров.
Между тем известно, что у высокораковых
самцов линии СВА первые опухоли в печени возникают в период, близкий к шестимесячному возрасту [17]. В нашем эксперименте в контрольной
группе мышей в возрасте 8 мес макроскопически и
микроскопически мы наблюдали опухоли у 10 %
исследованных животных.
На рис. 3 продемонстрирован гистологический препарат с гепатокарциномой контрольного
животного в возрасте 8 мес. Вокруг просвета кровеносного сосуда видны полиморфные опухолевые
клетки, образующие тяжи (трабекулы), практически лишь отдалённо похожие на структуры печеночных балок. В данном случае опухоль можно
оценить как трабекулярную гепатокарциному умеренной дифференцировки. У животных опытной
группы, принимавших МФА, мы не наблюдали
признаков опухолевого процесса в этом возрасте.
В позднем онтогенезе (в возрасте 22 мес) у
всех мышей контрольной группы были выявлены
гепатокарциномы. На рис. 4 представлен гистологический препарат спонтанной гепатокарциномы
самца линии СВА контрольной группы. В данном
случае на препарате видны полиморфные опухолевые клетки с гиперхромными ядрами, расположенные в виде трабекул и характерных атипичных полостей (ацинусов). Увеличено соотношение «ядроцитоплазма». В синусоидах между трабекулами и
просветах ацинусов отмечаются эритроциты, муцинозное вещество или желчный пигмент. По своему строению наблюдаемая ткань далека от нормального морфологического строения печени. В
данном случае наблюдается низкодифференцированная трабекулярно-ацинарная гепатокарцинома,
т.е. опухоль смешанного строения.
У мышей опытной группы, получавших
МФА в течение первого месяца постнатального
онтогенеза, гепатокарциномы были выявлены в
69,2 % случаев. В качестве примера на рис. 5 представлен гистологический препарат опухоли в этом
возрасте (в данном случае, судя по однородным
крупным клеточным ядрам, гепатокарцинома инфильтрирована массой активированных лимфоцитов; в соседних участках и по периферии опухоли
также видны отдельные лимфоциты и их группы;
наблюдаются также деструктивные элементы клеток опухоли).
У животных контрольной группы лимфоцитарной инфильтрации в опухолях не наблюдали.
При этом были выявлены сниженная экспрессия
лейкоцитарных интегринов, высокая частота возникновения опухолей, существенное их количество
и размеры.
Следует отметить, что миграция и накопление активированных лимфоцитов в опухолевом
очаге служит положительным прогностическим
признаком опухолевого процесса [9].
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ЛИМФОЦИТАРНАЯ ИНФИЛЬТРАЦИЯ ГЕПАТОКАРЦИНОМ…
87
Рис. 1. Самец линии СВА 4 мес., контрольная группа; ткань печени, окраска гематоксилином и эозином, увеличение × 400.
Рис. 2. Самец линии СВА 8 мес., контрольная группа; ткань печени, окраска гематоксилином и эозином, увеличение × 400.
Рис. 3. Самец линии СВА 4 мес., ткань печени, трабекулярно-ацинарная гепатокарцинома низкой дифференцировки, окраска гематоксилином и эозином, увеличение × 400.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
88
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ЛИМФОЦИТАРНАЯ ИНФИЛЬТРАЦИЯ ГЕПАТОКАРЦИНОМ…
Рис. 4. Трабекулярно-ацинарная гепатокарцинома низкой дифференцировки. Самец линии мышей СВА контрольной группы 22 мес; окраска гематоксилином и эозином, увеличение × 400.
Рис. 5. Трабекулярно-ацинарная гепатокарцинома низкой дифференцировки. Самец линии мышей СВА в возрасте 22 мес, получавший фитомикс-40 в течение 1-го месяца жизни;окраска гематоксилином и эозином, увеличение ×400.
Клеточные эффекторы иммунитета (активированные лимфоциты, нейтрофилы, NK-клетки) контактируют с клетками-мишенями, что может выступать
критическим фактором, который приводит в конечном итоге к гибели опухолевых клеток [1; 23; 24; 26].
Такой контакт может быть обусловлен усилением на
эффекторах иммунитета экспрессии молекул адгезии,
в том числе лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac1. Экспрессия последних может быть индуцирована
их лигандами (например, ICAM-1, -2) на клеткахмишенях с помощью регуляторных реакций при участии цитокинов (ИЛ-6, -10, 12, ИФН-γ, ФНО и др.;
[25]). Морфологическая картина опухолевых очагов в
результате воздействия МФА в раннем онтогенезе в
течение первого месяца постнатального развития сочеталась с долговременным повышением экспрессии
лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1 на клетках
крови, снижением сывороточного содержания ИЛ-6 и
ИЛ-10, частоты опухолеобразования, а также уменьшением размеров опухолей у мышей опытной группы.
№ 2/том 14/2015
Заключение
Введение нетоксичного, неканцерогенного
препарата мультифитоадаптогена с адгезиогенным
действием высокораковым мышам в течение первого месяца постнатального развития, захватывая
завершающий период дифференцировки нормальной ткани печени, приводит к долговременному
усилению экспрессии молекул гетеротипической
адгезии
лейкоцитарных
интегринов
LFA-1
(СD11a/CD18) и Mac-1 (СD11b/CD18), обеспечивающих контактные взаимодействия иммунных
эффекторов и клеток-мишеней в опухолевых узлах.
Инфильтрация спонтанных гепатокарцином активированными лимфоцитами может способствовать повышению активности противоопухолевых реакций иммунитета и деструкции опухолевой ткани. В результате снижена частота
возникновения, количества и размеров наследственных опухолей.
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ЛИМФОЦИТАРНАЯ ИНФИЛЬТРАЦИЯ ГЕПАТОКАРЦИНОМ…
89
Литература
1.
Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Кадагидзе З.Г. и др. Современные проблемы биотерапии злокачественных опухолей // Вестник московского онкологического общества. – 2008. – № 1. – С. 6–10.
2.
Бочаров Е.В., Карпова Р.В., Казеев И.В. и др. Исследование радиозащитной активности мультифитоадаптогена в эксперименте на мышах // Патологическая физиология и экспериментальная терапия.
– 2013. – № 3. – С. 55–8.
3.
Бочарова О.А., Модянова Е.А., Ушаков В.Ф. Механические свойства межклеточных контактов гепатоцитов у мышей инбредных линий и предрасположенность к спонтанным гепатомам // Бюлл. экспер. биол и мед. – 1980. – Т. 89, № 4. – С. 459–62.
4.
Бочарова О.А., Модянова Е.А. Изменение межклеточных контактов гепатоцитов в онкогенезе у мышей инбредных линий с высокой (СВА) и низкой (С57ВI) частотой спонтанных гепатом // Онтогенез. – 1982. – Т. 13, № 4. – С. 427–9.
5.
Бочарова О.А. Патент РФ № 2099410. Композиция ингредиентов для бальзама Алексеевой (Фитомикс-40). 1998. – Бюлл. № 35.
6.
Бочарова О.А., Лыженкова М.А., Мезенцева М.В. и др. Фитоадаптоген для профилактической онкологии: иммунобиологические критерии состава. // Бюлл. экспер. биол. и мед. – 2003. – Т. 136, № 12. –
С. 670–3.
7.
Бочарова О.А., Лыженкова М.А., Куренная О.Н., Княжев В.А. Способ биологического контроля комплексного фитоадаптогена // Бюлл. экспер. биол. и мед. – 2003. – Т. 136, № 12. – С. 694–9.
8.
Бочарова О.А., Барышников А.Ю. Фитоадаптогены в онкологии. – М.: ЗооМедВет, 2004. – 138 с.
9.
Бочарова О.А., Давыдов М.И., Клименков А.А. и др. Перспективы применения фитоадаптогена в лечении распространенного рака желудка // Бюлл. экспер. биол. и мед. – 2009. – Т. 148, № 7. – С. 96–9.
10. Бочарова О.А., Давыдов М.И., Барышников А.Ю. и др. Комплексные фитоадаптогены в онкологии и
геронтологии // Вестник РАМН. – 2009. – № 8. – С. 21–5.
11. Бочарова О.А., Карпова Р.В., Ильенко В.А. и др. Лейкоцитарные интегрины при гепатоканцерогенезе
мышей высокораковой линии СВА // Российский биотерапевтический журнал. – 2013. – Т. 12, № 3. –
С. 53–6.
12. Бочарова О.А., Бочаров Е.В., Карпова Р.В. и др. LFA-1, Mac-1 интегрины и IL-6, -10 цитокины у высокораковых мышей под воздействием фитоадаптогена // Бюлл. экспер. биол. и мед. – 2014. – Т. 157,
№ 2. – С. 223–6.
13. Бочарова О.А., Бочаров Е.В., Карпова Р.В. и др. Снижение возникновения гепатом при воздействии
фитоадаптогена у высокораковых мышей СВА // Российский биотерапевтический журнал. – 2014. –
Т. 13, № 2. – С. 73–6.
14. Бочков Н.П., Бочарова О.А., Аксенов А.А. и др. Частота хромосомных аберраций в лимфоцитах пациентов с доброкачественной гиперплазией предстательной железы // Медицинская генетика. – 2005. –
Т. 4, № 1. – С. 15–9.
15. Карпова Р.В., Бочаров Е.В., Казеев И.В. и др. Радиозащитная эффективность мультифитоадаптогена в
опытах на собаках // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. – 2013. – № 4. – С. 51–4.
16. Куренная О.Н., Карпова Р.В., Бочарова О.А. и др. Антимутагенез мультифитоадаптогена в клетках
дрожжей-сахаромицетов // Генетика. – 2013. – Т. 49, № 12. – С. 1364–9.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
90
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ЛИМФОЦИТАРНАЯ ИНФИЛЬТРАЦИЯ ГЕПАТОКАРЦИНОМ…
17. Медведев Н.Н. Линейные мыши. – Л.: Медицина, 1964. – 230 с.
18. Пожарицкая М.М., Бочарова О.А., Чекалина Т.Л., Воронин В.Ф. Современные аспекты патогенеза и
лечения лейкоплакии слизистой оболочки полости рта. Методическое руководство для врачей. – М.:
ГОУ ВУНМЦ, 2004. – 46 с.
19. Фактор В.М., Шипова Л.Я. и др. Уровень клеточной ДНК в спонтанных гепатомах мышей линии
СВА. Cell DNA of CBA mouse strain spontaneous hepatomas // Бюлл. экспер. биол. и мед. – 1984. – Т.
97, №6. – С. 710–3.
20. Шейченко В.И., Бочарова О.А., Шейченко О.П. и др. Аналитические возможности метода ЯМР для
определения компонентов препарата Фитомикс- 40 // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. – 2006. – Т. 72, № 8. – С. 15–23.
21. Шейченко О. П., Бочарова О. А., Шейченко В. И. и др. Возможности использования электронных
спектров поглощения для стандартизации многокомпонентного препарата «Фитомикс-40» // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. – 2007. – № 2. – С. 20–5.
22. Шейченко О.П., Бочарова О.А., Крапивкин Б.А. и др. Исследование комплексного фитоадаптогена
методом ВЭЖХ // Вопр. биол. мед. фарм. химии. – 2012. – № 10. – С. 52–9.
23. Chiou S.H., Sheu B.C., Chang W.C. et al. Current concepts of tumor-infiltrating lymphocytes in human malignancies // Reprod Immunol. – 2005. – 67(1–2). – P. 35–50.
24. Lu P., Zhu X.Q., Xu Z.L. et al. Increased infiltration of activated tumor-infiltrating lymphocytes after high
intensity focused ultrasound ablation of human breast cancer // Surgery. – 2009. – 145(3). – P. 286–93.
25. Oble D., Loewe R., Yu P., Mihm M. Focus on TILs: Prognostic significance of tumor infiltrating lymphocytes in human melanoma // Cancer Immun. – 2009. – 9(3). – P. 245–51.
26. Sasada T., Suekane S. Variation of tumor-infiltrating lymphocytes in human cancers: controversy on clinical
significance // Immunotherapy. – 2011. – 3(10). – P. 1235–51.
27. Sharp J., Riches A., Littlewood V., Thomas D. The incidence, pathology and transplantation of hepatomas in
CBA mice // J Pathol. – 1976. – 119(4). – P. 211–20.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
МАЛАЯ ГТФАЗА ARF6 АКТИВИРУЕТ mTORC1-ЗАВИСИМЫЙ…
91
УДК 616-006.484:576.385.5
А.Ю. Журавская, А.В. Комельков, Е.М. Чевкина
МАЛАЯ ГТФАЗА ARF6 АКТИВИРУЕТ mTORC1-ЗАВИСИМЫЙ СИГНАЛЬНЫЙ ПУТЬ
И СТИМУЛИРУЕТ РОСТ КЛЕТОК ГЛИОБЛАСТОМЫ
ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина», Москва
Контактная информация
Журавская Анна Юрьевна – н.с. лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогенов НИИ канцерогенеза
ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина».
e-mail: [email protected] тел.: +7 (926) 163-21-38.
Резюме
В работе впервые идентифицировано участие малой ГТФазы Arf6 в стимуляции пролиферации и автономного роста клеток глиобластомы. Показано, что белок Arf6 активирует комплекс mTORС1, и этот процесс
представляет собой альтернативный, независимый от PI3K/Akt-сигнального каскада, механизм активации
mTORC1-зависимого пути. Кроме того, обнаружено, что Arf6 является негативным регулятором протеинкиназы
ERK1/2 в клетках глиобластомы.
Ключевые слова: пролиферация, Arf6, mTORC1, p70S6K1, ERK1/2, линии клеток глиобластомы.
A.Yu. Zhuravskaya, A.V. Komelkov, E.M. Tchevkina
SMALL GTPASE ARF6 ACTIVATES mTORC1-DEPENDENT SIGNALING PATHWAY
AND STIMULATES GLIOBLASTOMA CELL GROWTH
FSBSI "N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center", Moscow
Abstract
In this study we first identified role of small GTPase Arf6 in stimulation of proliferation and autonomous growth
of human glioblastoma cells. We revealed that Arf6 activates the mTOR complex 1 (mTORC1) and this process is appeared to be an alternative mechanism of mTORC1-signaling activation, independent of PI3K/Akt-signaling pathway.
We also showed that Arf6 is a negative regulator of protein kinase ERK1/2 in glioblastoma cells.
Key words: proliferation, Arf6, mTORC1, p70S6K1, ERK1/2, glioblastoma cells.
Введение
В процессе опухолевой прогрессии первично
трансформированные клетки помимо способности к
неограниченному делению приобретают целый ряд
дополнительных характеристик, необходимых для
их выживания и распространения по организму,
включая «уход» от апоптоза и других форм программируемой клеточной гибели, уклонение от иммунного надзора, приобретение ряда свойств, обеспечивающих способность к автономному росту и
выживанию в условиях гипоксии, приобретение миграционного и инвазивного фенотипа и др. Очевидно, что повышенная пролиферативная активность
является одним из ключевых компонентов формирования малигнизированного фенотипа опухолевых
клеток. Ведь именно это свойство в совокупности с
генетической нестабильностью позволяет образовываться огромному количеству разнообразных по
свойствам клонов и создает материал для селекции.
Несмотря на большие достижения последних лет,
молекулярные механизмы, регулирующие пролиферацию, остаются не до конца выясненными, и продолжается поиск новых биологических молекул и
сигнальных путей, определяющих пролиферативный
потенциал трансформированных клеток.
№ 2/том 14/2015
Малая ГТФаза Arf6 (ADP-ribosylation factor
6) является членом семейства белков Arf, входящего в суперсемейство малых ГТФаз Ras. Arf6, как и
прочие G-белки суперсемейства Ras, циклирует в
клетке между ГДФ- и ГТФ-связанным состояниями, которые сопровождаются конформационными
изменениями белка. Эти структурные изменения
обеспечивают его компартментализацию и функциональную активность. Белок Arf6 считается преимущественно активным в ГТФ-связанной форме,
которая обеспечивает его взаимодействие с большинством эффекторных молекул [1]. Arf6 известен,
главным образом, как регулятор процессов, связанных с мембранным транспортом, а также с разного
рода изменениями в цитоплазматической мембране
клетки и во внутриклеточных мембранных компартментах. В частности, Arf6 опосредует различные
типы эндоцитоза [2], участвует в экзоцитозе [3] и
сортировке транспортируемых молекул [4], влияет
на реорганизацию актинового цитоскелета [5], а
также регулирует липидный состав [6] и радиус
кривизны клеточных мембран. Участие в этих процессах обусловливает и роль данного белка в канцерогенезе: Arf6 регулирует интернализацию и рециклирование β-интегрина [7] и E-кадгерина [8],
секрецию опухолевых микрочастиц, содержащих
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
92
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
МАЛАЯ ГТФАЗА ARF6 АКТИВИРУЕТ mTORC1-ЗАВИСИМЫЙ…
протеазы MMP-2, MMP-9, MT1-MMP и зимогены
uPA и EMMPRIN [9]. Arf6 также является одним из
важнейших регуляторов миграции [10] и инвазии
[11] опухолевых клеток. В то же время, практически ничего не известно о возможном участии Arf6 в
регуляции пролиферативного потенциала трансформированных клеток.
Ранее нами впервые была показана роль малой ГТФазы Arf6 в усилении пролиферативной активности опухолевых клеток на экспериментальной
модели фибробластов сирийского хомяка, трансформированных вирусом саркомы Рауса [12].
Целью данной работы стало изучение роли
Arf6 в изменении пролиферации клеток глиобластомы человека и участия данного белка во внутриклеточных сигнальных путях, регулирующих
пролиферативную активность клеток.
Материалы и методы
Культивирование клеток
В качестве экспериментальной модели мы
использовали клеточные линии глиобластомы человека LN229 и U87. Для получения ретро- и лентивирусных частиц использовали линии эпителиальных
клеток GP293 (Clonetech, Япония) и 293FT
(Invitrogen, США; производные линии HEK-293 –
линии эмбриональных клеток почки человека). Все
эукариотические линии культивировали в CO 2 инкубаторе (при 37 °C, в атмосфере 5 %-ного CO 2 ).
В качестве среды для культивирования применяли
DMEM c добавлением 0,294 мг/мл L-глутамина и
10%-ной ТЭС (PAA Laboratories, Австрия), 0,1 мг/мл
стрептомицина, 100 ЕД/мл пенициллина. Подсчет
клеток производили с помощью камеры Горяева.
Получение экспрессирующих векторов
Кодирующие последовательности белка Arf6
человека (Arf6WT, Arf6(Q67L)), конъюгированные с
гемагглютининовой меткой (HA-tag), были клонированы в ретровирусный вектор pLXSN-neo. Плазмида
pLXSN-neo любезно предоставлена доктором J. Camonis (Институт Кюри, Париж, Франция).
Мы использовались следующие последовательности малых шпилечных РНК:
shA Arf6:
5’-CCGGGCATTATCAATGACCGGGAGACTCGAGTCTCCCGGTCATTGATAATGCTTTTTG-3’;
shB Arf6:
5’-CCGGGCTCACATGGTTAACCTCTAACTCGAGTTAGAGGTTAACCATGTGAGCTTTTTG-3’
(смысловая и антисмысловая последовательности подчеркнуты).
Для клонирования каждого конструкта в вектор pLKO.1 puro (Addgene, США) синтезировали
олигонуклеотиды (F и R для каждой конструкции),
модифицированные липкими концами для соответствующих рестриктных сайтов. Полученные конструкции проверялись секвенированием.
Трансфекция
Для получения псевдоретровирусных частиц
клетки GP293 наращивали до 70 %-ной конфлюентности. Для трансфекции брали 2 мкг ДНК – рет№ 2/том 14/2015
ровирусный вектор pLXSN (Clontech, Япония) с
целевым геном и плазмиду pVSV-G (Clontech, Япония), кодирующую белок оболочки вируса везикулярного стоматита, необходимый для сборки вируса и увеличения тропности вирусных частиц к эукариотическим клеткам. Плазмиды смешивали в
эквимолярном соотношении. Трансфекцию проводили с использованием липофектамина 2000
(Lipofectamine 2000™ Reagent, Invitrogen, США)
согласно протоколу производителя. Среду собирали через 24; 48 и 72 ч; центрифугировали 10 мин
при 1500 g для удаления клеточного дебриса и использовали для инфекции. Для получения псевдолентивирусных частиц использовали клеточную
линию 293FT. Для трансфекции брали 2 мкг плазмидной ДНК – лентивирусный вектор pLKO.1 puro
(Addgene, США), несущий последовательность малой шпилечной РНК, pVSV-G и пакующую плазмиду pDeltaR8.2, кодирующую вирусные белки, в
эквимолярном соотношении. В остальном процедура трансфекции не отличалась от таковой для клеток GP293.
Инфекция псевдовирусными частицами
Среду клеткам-мишеням заменяли на смесь
вирусного супернатанта и обычной среды в соотношении 1 : 1 с добавлением полибрена (Sigma,
США) до конечной концентрации 8 мкг/мл. Использовали 24–; 48– и 72–часовые инокуляты вируса. Для контроля селекции использовали неинфицированные клетки. В случае ретровирусной инфекции селекцию проводили на G418 (1200 мкг/мл,
Sigma, США) в течение 8–9 дней. В случае лентивирусной инфекции отбор проводили с добавлением пуромицина (4,5 мкг/мл, Sigma, США) в течение
5 дней. Для дальнейших экспериментов использовали свежеразмороженные аликвоты полученных
клеточных линий.
Иммуноблоттинг
Клеточные лизаты получали из субконфлюентного монослоя клеток с использованием буфера
RIPA, содержащего смесь ингибиторов протеаз
(25× protease cocktail inhibitor, Roche, Швейцария) и
фосфатаз (Thermo Scientific, США). Полученные
лизаты нормализовали по количеству белка, используя метод Бредфорд, на гель наносили 20 мкг
белка. Белки разделяли в SDS-полиакриламидном
геле, после чего переносили на PVDF мембрану
(Millipore, США) методом мокрого переноса по
стандартному протоколу (прибор Mini Trans-Blot,
Bio-Rad Laboratories Inc., США). Мембрану инкубировали в 0,5 %-ном р–ре обезжиренного молока
(Bio-Rad Laboratories Inc., США) в течение 1 ч. Затем мембрану инкубировали в течение 12 ч с соответствующими первичными антителами при +4 °С,
с последующей стандартной отмывкой, после чего
мембрану инкубировали 1–1,5 часа при комнатной
температуре с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена. После стандартной отмывки мембрану проявляли с помощью реагента для хемилюминесцентной реакции ECL
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
МАЛАЯ ГТФАЗА ARF6 АКТИВИРУЕТ mTORC1-ЗАВИСИМЫЙ…
(Milipore, США). Хемилюминесцентную реакцию
регистрировали на приборе Kodak GelLogic 2200
Imaging system с последующей обработкой с помощью программы Kodak Molecular Imaging Software
SE ver. 5.0.1.27.
В работе использовали следующие антитела:
anti-Arf6 (Clone ARFAG) A5230 (Sigma, США),
anti-HA-tag 2367 (Cell Signaling, США), anti-ERK1/2
4696S (Cell Signaling, США), anti-pERK-1/2
(T202/Y204) 9106S (Cell Signaling, США), antip70S6K1 2708S (Cell Signaling, США), anti-pp70S6K1 (T389) 9205S (Cell Signaling, США), antiS6 2217S (Cell Signaling, США), anti-pS6 (S235/236)
4858S (Cell Signaling, США), anti-Akt (pan) 4691S
(Cell Signaling, США), anti-pAkt (S473) 4060S (Cell
Signaling, США), anti-beta-actin ab8227 (Abcam, Великобритания).
Стимуляция EGF
Клетки рассеивали на 6-луночные плашки в
количестве 4х105 на лунку. На следующий день
среду меняли на бессывороточную и инкубировали
в течение суток. Далее кондиционированную бессывороточную среду меняли на бессывороточную
среду с EGF (концентрация 50 нг/мл) и инкубировали 2 минуты. После этого клетки лизировали.
Анализ динамики роста клеток
Для анализа скорости пролиферации клетки
каждой культуры рассеивали на 6-луночные плашки (по 2×104 клеток на лунку в 2 повторностях для
каждой временнóй точки). Клетки культивировались в стандартных условиях. Для анализа ежедневно из двух лунок снимали клетки раствором
Версена. Полученную клеточную суспензию смешивали с 0,4 %-ным раствором трипанового синего
в отношении 1 : 1 и подсчитывали количество клеток в камере Горяева.
Тест на образование колоний в условиях разреженной популяции (клоногенность)
Культуры клеток рассаживали по 200 шт
клеток на 60 мм культуральные чашки Петри в
стандартных условиях. Спустя 10 дней образовавшиеся колонии фиксировали 96 %-ным спиртом,
окрашивали водным раствором кристаллического
фиолетового и фотографировали. Размер колоний
оценивали с помощью программы ImageJ.
Результаты
Arf6 стимулирует рост клеток
глиобластомы
В качестве экспериментальной модели были
выбраны две линии клеток глиобластомы человека,
LN229 и U87. Для исследования влияния Arf6 на
динамику роста клеток были получены производные
данных линий с гиперэкспрессией экзогенного (рис.
1. А) или подавлением эндогенного Arf6 (рис. 1, Б).
Гиперэкспрессию Arf6 осуществляли с помощью
трансдукции последовательностей, кодирующих
Arf6 "дикого" типа (Arf6 WT) либо белок
№ 2/том 14/2015
93
Arf6(Q67L), являющийся активированной мутантной
формой (с заменой глутамина на лейцин в 67 положении, обеспечивающей конститутивную связь белка с ГТФ). Для облегчения детекции экзогенного и
эндогенного Arf6 последовательности были конъюгированы с гемагглютининовой меткой. Подавление
экспрессии эндогенного Arf6 осуществляли при помощи двух различных малых шпилечных РНК – shA
Arf6 и shB Arf6 (последовательности приведены в
разделе «Материалы и методы»). Трансдукцию экзогенных последовательностей Arf6 в векторе pLXSN
проводили методом ретровирусной инфекции,
трансдукцию малых шпилечных РНК в векторе
pLKO.1-puro – методом лентивирусной инфекции. В
качестве контроля изменения уровня продукции
Аrf6 при его гиперэкспрессии здесь и далее использовали производные линии LN229 и U87, экспрессирующие «пустой» вектор pLXSN. В качестве контроля специфичности подавлении эндогенного Arf6
малыми шпилечными РНК использовали производные линий LN229 и U87, экспрессирующие малые
шпилечные РНК к зеленому флуоресцентному белку
GFP (shGFP). Анализ изменения экспрессии проводили методом вестерн-блот гибридизации. По результатам сравнительного анализа продукции Arf6
важно отметить, что, в отличие от производных линии LN229, где наблюдался равно высокий уровень
экспрессии обеих форм экзогенного Arf6, в производных линии U87 (в трех независимых повторах
получения линий) экспрессия активированного Arf6
оказывалась существенно ниже, чем экспрессия Arf6
"дикого" типа. Это не позволяло оценить роль активации Arf6 на данной линии клеток. Таким образом,
при сравнительной оценке результатов экспериментов для линии U87 необходимо учитывать различия
в уровне экспрессии Arf6(Q67L) и Arf6 "дикого"
типа. В случае подавления экспрессии Arf6 малыми
шпилечными РНК, как в линии LN229, так и в линии
U87, shB Arf6 снижал продукцию эндогенного Arf6
более эффективно, в то время как эффект shA на
экспрессию Arf6 был менее выражен.
Сравнение скорости пролиферации клеток с
модифицированной экспрессией Arf6 по сравнению
с соответствующими контролями показал, что гиперэкспрессия обеих форм белка Arf6 в линии
LN229 приводит к достоверному увеличению скорости деления клеток, причем в большей степени
эффект выражен в клетках, экспрессирующих
Arf6(Q67L) (рис. 1, B). В линии U87 увеличение
пролиферации наблюдается в клетках, гиперэкспрессирующих Arf6 "дикого" типа. В случае подавления экспрессии Arf6 как в клетках линии LN229,
так и U87, наиболее выраженное снижение пролиферации наблюдалось в клетках, экспрессирующих
shB Arf6. Таким образом, мы показали, что белок
Arf6 усиливает пролиферацию клеток глиобластомы, причем его влияние прямо пропорционально
уровню экспрессии Arf6. В то же время, при равном
уровне экспрессии экзогенных форм Arf6 конститутивная активация белка также вносит дополнительный вклад в увеличение пролиферативного потенциала клеток.
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
94
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
МАЛАЯ ГТФАЗА ARF6 АКТИВИРУЕТ mTORC1-ЗАВИСИМЫЙ…
Рис. 1. Arf6 стимулирует рост клеток глиобластомы.
А – экспрессия экзогенного белка Arf6 в линиях LN229 и U87.
Б – подавление экспрессии эндогенного белка Arf6 в линиях LN229 и U87.
В – влияние экспрессии различных форм белка Arf6 на пролиферацию клеток.
Г – влияние экспрессии различных форм белка Arf6 на автономный рост клеток.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
МАЛАЯ ГТФАЗА ARF6 АКТИВИРУЕТ mTORC1-ЗАВИСИМЫЙ…
95
Рис. 2. Влияние Arf6 на активацию mTOR-зависимого сигнального пути и MAP-киназы ERK1/2.
А – анализ изменения фосфорилирования киназы p70S6K1.
Б – анализ изменения фосфорилирования рибосомального белка S6.
В – анализ изменения фосфорилирования киназы Akt.
Г – анализ изменения фосфорилирования MAP-киназы ERK1/2.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
96
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
МАЛАЯ ГТФАЗА ARF6 АКТИВИРУЕТ mTORC1-ЗАВИСИМЫЙ…
Помимо анализа пролиферации клеток в
стандартных условиях культивации, мы исследовали влияние Arf6 на динамику клеточного роста в
условиях сильно разреженной популяции, когда
имеет место дефицит стимулирующих пролиферацию цитокинов, секретируемых клетками микроокружения. Данный тест оценивает формирование и
рост колоний, образуемых единичными клетками,
при этом основным критерием способности клеток
к автономному росту является размер колоний. Результаты анализа показали, что в обеих клеточных
линиях экспрессия Arf6 достоверно увеличивает
размер колоний по сравнению с контролями, при
этом в производных линиях LN229 эффект наиболее выражен в клетках Arf6(Q67L), а в производных U87 – в клетках, экспрессирующих Arf6 WT
(Рис. 1, Г). Полученные результаты хорошо согласуются с данными анализа пролиферации и свидетельствуют о том, что Arf6 усиливает рост клеток –
как в условиях стандартной культивации, так и при
недостатке пролиферативных стимулов от клеток
микроокружения. При этом в обоих случаях промитогенный эффект пропорционален экспрессии экзогенного белка Arf6, а его активация дополнительно
усиливает рост клеток.
Полученные результаты являются первыми
доказательствами промитогенной активности Arf6.
В единственной работе, затрагивающей данную
тематику и выполненную также на клетках глиобластомы, продемонстрировано влияние стимуляции
EGF на Arf6-зависимое усиление EGFRопосредованной пролиферации [13]. При этом авторы статьи не исследовали роль собственно белка
Arf6 в усилении клеточной пролиферации.
Arf6 активирует mTOR-сигнальный путь
Одним из основных эффекторов малой
ГТФазы Arf6 является фосфолипаза D, которая,
согласно некоторым литературным данным, способна активировать протеинкиназу mTOR [14].
Протеинкиназа mTOR является «центральным узлом» одного из ключевых сигнальных каскадов,
регулирующих пролиферацию и рост клеток в ответ на внешние стимулы (ростовые факторы, гормоны и пр.). mTOR функционирует в клетке в составе двух комплексов – mTORC1 и mTORC2, каждый из которых имеет собственные эффекторы.
«Классическую» активацию комплекса mTORC1 в
ответ на стимуляцию ростовыми факторами осуществляет PI3K/Akt-зависимый сигнальный путь.
Наиболее хорошо изученными субстратами
mTORC1 являются белки p70S6K (киназы, фосфорилирующие рибосомальный белок S6 (rpS6)) и
белок 4E-BP1 (белок, связывающий эукариотический фактор инициации трансляции eIF4E), при
помощи которых данный комплекс осуществляет
регуляцию биосинтеза белка и роста клетки [15]. В
благоприятных для клетки условиях mTORC1 промотирует белковый синтез, клеточный рост и пролиферацию, а в условиях стресса и дефицита питательных веществ ингибирует процессы биосинтеза
и инициациирует процесс аутофагии. Нарушения
№ 2/том 14/2015
регуляции mTORC1 и гиперактивация mTORзависимого сигнального каскада характерна для
целого ряда злокачественных новообразований
[16], а ингибиторы активности mTOR-ассоциированного сигнального пути используются в качестве
противоопухолевых терапевтических средств. [17].
Ранее мы показали, что Arf6 способнен активировать mTOR-зависимый сигнальный путь на модели
трансформированных фибробластов сирийского
хомяка [12]. Данные о возможном влиянии Arf6 на
этот сигнальный путь в клетках человека в литературе отсутствуют.
Для изучения влияния Arf6 на активацию
mTORC1-зависимого сигнального пути в клетках
глиобластомы мы проанализировали уровень активирующего фосфорилирования основного эффектора mTORC1 – киназы p70S6K1 – в полученных производных клеточных линиях LN229 и U87 с модифицированной экспрессией Arf6. Киназа р70S6K1
напрямую фосфорилируется белком mTOR, находящимся в составе комплекса mTORC1, по 389 треонину [18], поэтому активирующее фосфорилирование p70S6K1 по данному сайту является общепризнанным маркером активации протеинкиназы mTOR
[15]. Анализ проводили методом вестерн-блот гибридизации с использованием антител к фосфорилированной форме р70S6K1(Thr389) в сравнении с
соответствующими контролями.
В результате эксперимента установлено, что
фосфорилирование p70S6K1 значительно усиливается в клетках LN229, гиперэкспрессирующих экзогенный Arf6 как дикого типа, так и его конститутивно-активную форму. Среди производных клеточных линий U87 фосфорилирование p70S6K1
усиливается по сравнению с контролем в клетках,
гиперэкспрессирующих Arf6 "дикого" типа (рис. 2,
А). При подавлении экспрессии Arf6 как в линии
LN229, так и в линии U87, наблюдается сильное
снижение фосфорилирования p70S6K1, наиболее
выраженное при экспрессии малой шпилечной РНК
shB. Соответственно, изменение количества фосфорилированной формы белка p70S6K1 происходит пропорционально уровню экспрессии малой
ГТФазы Arf6.
Далее мы проанализировали изменение статуса фосфорилирования рибосомального белка S6
(rpS6), являющегося мишенью S6-киназы, для чего
методом вестерн-блот гибридизации оценили уровень активирующего фосфорилирования двух сайтов
rpS6: Ser235 и Ser236 (рис. 2, Б). В производных линиях LN229 и U87 наблюдалось усиление фосфорилирования белка S6 по данным сайтам как при экспрессии Arf6 дикого типа, так и при экспрессии
Arf6(Q67L). При подавлении экспрессии эндогенного Arf6 фосфорилирование rpS6 по сайтам
Ser235/236 снижалось в обеих линиях (при этом эффект выражен сильнее в клетках линии U87). Описанные изменения статуса фосфорилирования белков p70S6K1 и rpS6 не сопровождались изменением
общего количества данных белков в клетках, что
свидетельствует о том, что Arf6 влияет на активацию
белков-мишеней mTOR, а не на их продукцию.
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
МАЛАЯ ГТФАЗА ARF6 АКТИВИРУЕТ mTORC1-ЗАВИСИМЫЙ…
Поскольку основным путем активации
mTORC1 в ответ на ростовые стимулы считается
PI3K/Akt-сигнальный каскад, мы проверили возможность влияния Arf6 на данный сигнальный
путь. Для этого мы проанализировали уровень активирующего фосфорилирования киназы Akt
(Ser473) при гиперэкспрессии Arf6 (рис. 2, В). Результаты вестерн-блот анализа не выявили различий в статусе фосфорилирования Akt в производных обеих исследуемых линий по сравнению с контрольными линиями. Таким образом, Arf6 активирует mTORC1 независимо от PI3K/Akt-сигнального
пути. Эти результаты соответствуют данным, полученным ранее на экспериментальной модели
трансформированных фибробластов хомяка [12] и
свидетельствуют об альтернативном механизме
активации mTORC1 малой ГТФазой Arf6.
Arf6 негативно регулирует
фосфорилирование ERK1/2
Другим хорошо известным сигнальным путем, регулирующим пролиферацию клеток, является каскад MAPK. Данный путь активируется гормонами, факторами роста, различными хемокинами
и нейротрансмиттерами, которые распознаются
соответствующими рецепторными тирозинкиназами или рецепторами, ассоциированными с Gбелками, что приводит к передаче сигнала по пути
Ras-MAPK-ERK1/2. Важно отметить, что ряд белков МАРК-ERK1/2 сигнального пути способен активировать как сам mTORC1-комплекс, так и его
мишени [19].
Поэтому мы проанализировали возможное
влияние Arf6 на активность Erk1/2 как возможного
посредника Arf6 в стимуляции пролиферации и в
активации mTOR-сигнального пути. В литературе
имеется несколько указаний на связь Arf6 c ERKпутем, однако эти данные противоречивы и свидетельствуют как о возможном стимулирующем [20],
так и о негативном [21; 22] влиянии белка Arf6 на
ERK1/2, а также об участии ERK1/2 в активации
Arf6 [13].
97
В полученных линиях было проанализировано
влияние белка Arf6 на статус фосфорилирования MAPкиназы ERK1/2 (активирующее фосфорилирование по
сайту Thr202/Tyr204) методом вестерн-блот гибридизации. Эксперимент проводился в условиях стимуляции EGF. Установлено, что в клетках линий LN229 и
U87 при гиперэкспрессии малой ГТФазы Arf6 наблюдается снижение уровня фосфорилирования ERK1/2 по
сравнению с контрольными линиями (рис. 2, Г). В
свою очередь, подавление экспрессии Arf6 малыми
шпилечными РНК приводит к усилению фосфорилирования ERK1/2. Таким образом, в линиях глиобластом LN229 и U87 малая ГТФаза Arf6 участвует в негативной регуляции MAP-киназы ERK1/2. При этом
активация белка Arf6 оказывает дополнительный вклад
в подавление фосфорилирования ERK1/2. Эти результаты хорошо согласуются с некоторыми литературными данными, свидетельствующими об увеличении
фосфорилирования ERK1/2 при подавлении экспрессии Arf6 в эндотелиальных клетках линии EaHY 926
[21]. Способность снижать фосфорилирование ERK1/2
также показана для миристоилированного N-концевого
пептида Arf6 (аминокислотные остатки со второго по
тринадцатый) в клетках линии меланомы B16-BL6
[22]. Результаты данной работы свидетельствуют о
том, что в клетках глиобластомы ERK1/2 также является мишенью Arf6, при этом Arf6 осуществляет негативную регуляцию данной киназы. Таким образом,
ERK1/2 не может являться посредником Arf6 в проведении промитогенного сигнала, а также не может опосредовать Arf6-зависимую активацию mTORС1ассоциированного сигнального пути.
Заключение
В работе впервые показано, что Arf6 стимулирует пролиферацию и автономный рост клеток
глиобластомы, активирует сигнальный путь
mTORC1-S6K1, однако играет негативную роль в
регуляции активности протеинкиназы ERK1/2.
Работа поддержана фондом РФФИ (грант
№14-04-01706).
Литература
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Donaldson J.G., Jackson C.L. ARF family G proteins and their regulators: roles in membrane transport,
development and disease. // Nature reviews Molecular cell biology. – 2011. – Vol. 12. – P. 362-75.
D'Souza-Schorey C, Chavrier P. ARF proteins: roles in membrane traffic and beyond. // Nature reviews
Molecular cell biology. – 2006. – Vol. 7. – P. 347-58.
Prigent M, Dubois T, Raposo G, Derrien V, Tenza D, Rosse C, et al. ARF6 controls post-endocytic
recycling through its downstream exocyst complex effector. // The Journal of cell biology. – 2003. – Vol.
163. – P. 1111-21.
Shteyn E, Pigati L, Folsch H. Arf6 regulates AP-1B-dependent sorting in polarized epithelial cells. // The
Journal of cell biology. – 2011. – Vol. 194. – P. 873-87.
Myers KR, Casanova JE. Regulation of actin cytoskeleton dynamics by Arf-family GTPases. // Trends in
cell biology. – 2008. – Vol. 18. – P. 184-92.
Schweitzer JK, Sedgwick AE, D'Souza-Schorey C. ARF6-mediated endocytic recycling impacts cell
movement, cell division and lipid homeostasis. // Seminars in cell & developmental biology. – 2011. – Vol.
22. – P. 39-47.
Dunphy JL, Moravec R, Ly K, Lasell TK, Melancon P, Casanova JE. The Arf6 GEF GEP100/BRAG2
regulates cell adhesion by controlling endocytosis of beta1 integrins. // Current biology : CB. – 2006. – Vol.
16. – P. 315-20.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
98
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
МАЛАЯ ГТФАЗА ARF6 АКТИВИРУЕТ mTORC1-ЗАВИСИМЫЙ…
Paterson AD, Parton RG, Ferguson C, Stow JL, Yap AS. Characterization of E-cadherin endocytosis in
isolated MCF-7 and chinese hamster ovary cells: the initial fate of unbound E-cadherin. // The Journal of
biological chemistry. – 2003. – Vol. 278. – P. 21050-7.
D'Souza-Schorey C, Clancy JW. Tumor-derived microvesicles: shedding light on novel microenvironment
modulators and prospective cancer biomarkers. // Genes & development. – 2012. – Vol. 26. – P. 1287-99.
Hu Z, Du J, Yang L, Zhu Y, Yang Y, Zheng D, et al. GEP100/Arf6 is required for epidermal growth factorinduced ERK/Rac1 signaling and cell migration in human hepatoma HepG2 cells. // PloS one. – 2012. –
Vol. 7. – P. e38777.
Hashimoto S, Onodera Y, Hashimoto A, Tanaka M, Hamaguchi M, Yamada A, et al. Requirement for Arf6
in breast cancer invasive activities. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States
of America. – 2004. – Vol. 101. – P. 6647-52.
Knizhnik AV, Kovaleva OV, Komelkov AV, Trukhanova LS, Rybko VA, Zborovskaya IB, et al. Arf6 promotes
cell proliferation via the PLD-mTORC1 and p38MAPK pathways. // Journal of cellular biochemistry. –
2012. – Vol. 113. – P. 360-71.
Li M, Wang J, Ng SS, Chan CY, He ML, Yu F, et al. Adenosine diphosphate-ribosylation factor 6 is required
for epidermal growth factor-induced glioblastoma cell proliferation. // Cancer. – 2009. – Vol. 115. – P.
4959-72.
Foster DA, Xu L. Phospholipase D in cell proliferation and cancer. // Molecular cancer research : MCR. –
2003. – Vol. 1. – P. 789-800.
Averous J, Proud CG. When translation meets transformation: the mTOR story. // Oncogene. – 2006. – Vol.
25. – P. 6423-35.
Zhou H, Huang S. mTOR signaling in cancer cell motility and tumor metastasis. // Critical reviews in
eukaryotic gene expression. – 2010. – Vol. 20. – P. 1-16.
Bjornsti MA, Houghton PJ. The TOR pathway: a target for cancer therapy. // Nature reviews Cancer. –
2004. – Vol. 4. – P. 335-48.
Dennis PB, Pullen N, Kozma SC, Thomas G. The principal rapamycin-sensitive p70(s6k) phosphorylation
sites, T-229 and T-389, are differentially regulated by rapamycin-insensitive kinase kinases. // Molecular
and cellular biology. – 1996. – Vol. 16. – P. 6242-51.
Mendoza MC, Er EE, Blenis J. The Ras-ERK and PI3K-mTOR pathways: cross-talk and compensation. //
Trends in biochemical sciences. – 2011. – Vol. 36. – P. 320-8.
Tague SE, Muralidharan V, D'Souza-Schorey C. ADP-ribosylation factor 6 regulates tumor cell invasion
through the activation of the MEK/ERK signaling pathway. // Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America. – 2004. – Vol. 101. – P. 9671-6.
Daher Z, Noel J, Claing A. Endothelin-1 promotes migration of endothelial cells through the activation of
ARF6 and the regulation of FAK activity. // Cellular signalling. – 2008. – Vol. 20. – P. 2256-65.
Kato Y, Lambert CA, Colige AC, Mineur P, Noel A, Frankenne F, et al. Acidic extracellular pH induces
matrix metalloproteinase-9 expression in mouse metastatic melanoma cells through the phospholipase Dmitogen-activated protein kinase signaling. // The Journal of biological chemistry. – 2005. – Vol. 280. – P.
10938-44.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ICO-406…
99
УДК 616-097:616-006-018:576.3.017.2:616.5-006.81]:576.3.08
Н.В. Голубцова, O.C. Бурова, К.А. Барышников, М.В. Оборотова, В.И. Карасева, Л.Т. Мамедова,
К.И. Жорданиа, М.А. Барышникова, А.С. Гриневич, П.К. Иванов, А.Ю. Барышников
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ICO-406 ПРОТИВ АНТИГЕНА CD117
ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина», Москва
Контактная информация
Голубцова Наталья Валерьевна, старший научный сотрудник лаборатории экспериментальной диагностики и
биотерапии опухолей НИИ ЭДиТО
адрес:115478, Москва, Каширское шоссе, 24; тел: +7(499)324-10-65
e-mail: [email protected]
Статья поступила 29.04.2015, принята к печати 12.05.2015.
Резюме
Получены МКА против антигена CD117 – маркера стволовых опухолевых клеток человека. Штамм ICO406 получали путем слияния клеток мышиной миеломы NS-1 с клетками селезенки мышей линии BALB/C,
предварительно трехкратно иммунизированных с интервалом в две недели клетками клеточной линии меланомы кожи человека mel Kor. Слияние проведено при помощи раствора ПЭГ/ДМСО. Для скрининга полученных
МКА ICO-406 использовались клеточные линии меланомы человека, различающиеся экспрессией антигена
CD117 из коллекции ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина». Экспрессию антигена изучали в РИФ и оценивали на
проточном цитофлуориметре BD FACSCantoTMII. МКА ICO-406 сравнивали с коммерческими МКА против
антигена СD 117 (Германия). Результаты показали их идентичность по частоте антиген-положительных случаев
и проценту антигенположительных клеток. МКА ICO-406 блокируют связывание с клетками mel Kor МКА анти-CD117. Связывание МКА ICO-406 с антиген-положительными клетками вызывает модуляцию антигена
CD117.
Ключевые слова: моноклональные антитела, антиген, стволовые опухолевые клетки, меланома кожи
человека, проточная цитометрия.
N.V. Golubtsova, O.S. Burova, K.A. Baryshnikov, M.V. Oborotova, V.I. Karaseva, L.T. Mamedovа,
K.I. Zhordania, M.A. Baryshnikovа, A.S. Grinevich, P.K. Ivanov, A.Yu. Baryshnikov
MONOCLONAL ANTIBODIES ICO-406 AGAINST THE ANTIGEN CD117
FSBSI «N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center», Moscow
Abstract
mAb against the antigen CD117 – stem marker of human tumor cells. Strain 406 PPI prepared by cell fusion of
mouse myeloma NS-1 cells with spleen mice BALB/ C, pre-immunized three times at an interval of two weeks, the
cells of the cell line of human melanoma melKor. Merging conducted using a solution of PEG/DMSO. For screening
received mAb 406 used human melanoma cell lines which differed in the expression of CD117 antigen FSBSI "N.N.
Blokhin RCRC" collection. N.N Blokhin. Antigen expression was studied in immunofluorescence and evaluated on a
flow cytometer BD FACS CantoTMII. ICA ICO-406 was compared with commercial ICA against antigen CD 117
(Germany). The results indicated the identity of the frequency of antigen-positive cases and the percentage of antigen
cells. ICA ICO-406 block binding to cells melKor ICA anti-CD117. Linking ICA ICO-406 antigen-positive cells causes
modulation of antigen CD117.
Key words: monoclonal antibodies, antigen, stem tumour cells, human skin melanoma, flow сytometry.
Введение
Среди опухолевых клеток имеется небольшая популяция клеток, способных к формированию
дифференцированных опухолевых клеток, а также
способных к собственному воспроизведению, т.е.
имеющих характеристики стволовой клетки [7; 20;
22]. В гематологических опухолях также выявлена
популяция клеток со свойствами стволовых [4; 10;
12]. Эти клетки получили название опухолевых
№ 2/том 14/2015
стволовых клеток (СОК) [14]. Первоначально СОК
были обнаружены при остром миелоидном и хроническом миелоидном лейкозах [12; 16; 17; 23; 24].
Эти клетки характеризовались экспрессией CD34
антигена [9]. В последующем ОСК были идентифицированы при многих злокачественных заболеваниях.
Фактор роста стволовых клеток (SCF или
KL) CD117(c-Kit) – гемопоэтический ростовой фактор. Он является цитокиновым рецептором, эксРОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
100
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
прессированном на клеточной поверхности гемопоэтических стволовых клеток, а также некоторых
других клеток [4; 15]. Измененные формы рецептора ассоциированы с некоторыми типами рака [15].
CD117 является рецепторной тирозинкиназой III
типа, рецептором для стволового фактора роста cKit. СD117 взаимодействует со многими другими
белками: APS, BCR, CD63, CD81, CD9, CRK,
CRK1, DOK1, FES, GRB1`0, Grb2, KITLG, LNK,
MPDZ, PIK3R1, PTPN11, PTPN6, STAT1, SOCS1,
SOCS6, TEC.
Рецептор CD117 является обязательным
компонентом клеточной поверхности гемопоэтических стволовых клеток и прогениторных клеток.
Доказано его участие в поддержании циркулирующих гемопоэтических стволовых клеток, а также в
механизмах, позволяющих этим клеткам возвращаться из системного кровотока в их ниши в костном мозге.
Более 90 % нейральных стволовых и прогениторных СОК несут на своей поверхности CD117.
Взаимодействие SCF с c-Kit активирует многочисленные сигнальные каскады, включая RAS/ERK,
P13-K, JAK/STAT, Src-киназы, результатом чего
является направленная миграция, выживание и
пролиферация стволовых клеток. Антиген обнаружен на клеточных линиях меланомы кожи [11].
Иммунологический фенотип СОК характеризуется экспрессией различных антигенов: CD24,
CD34, CD44, CD90, CD117, CD133, CD271 [4–11;
13]. Антигены CD24, CD34, CD90, определяются
МКА ICO-150, ICO-115, ICO-10 соответственно [1;
3; 5; 13].
Целью настоящей работы явилось получение МКА против антигена CD117 – маркера СОК
человека.
Материалы и методы
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ICO-406…
иммунизированных с интервалом в две недели
клетками клеточной линии меланомы кожи человека mel Kor (происхождение – подкожный метастатический узел пациентки диссеминированной меланомой кожи). Слияние проведено при помощи
раствора
полиэтиленгликоля
ПЭГ/ДМСО
(«Sigma»). Одну из гибридом, супернатант которой
выявлял около 70–80 % АГ+ клеток, дважды клонировали методом лимитирующих разведений. Для
скрининга полученных МКА ICO-406 при помощи
реакции иммунофлуоресценции использовались
клеточные линии меланомы человека, различающиеся экспрессией антигена CD117, из коллекции
ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» [11].
Реакция иммунофлуоресценции
Экспрессию антигена определяли в реакции
иммунофлуоресценции. 5×105 клеток (mel Kor и
др.) инкубировали с 20 мкл МКА в течение 30 мин
при комнатной температуре, после чего 10 мин отмывали в 1 мл PBS при 1500 об/мин.
К осадку клеток добавляли 10 мкл F(ab)2
(goat anti mouse IgG: FITC, фирмы Serotec, кат.№
0106) и инкубировали в течение 30 мин при +4 С.
После этого клетки дважды отмывали в 1 мл PBS в
тех же условиях, осадок клеток ресуспендировали в
300 мкл 1 %-ного р-ра формалина.
Реакция прямой иммунофлуоресценции
5×105 клеток (mel Kor и др.) инкубировали с
10 мкл антител, меченных PE в течение 30 мин при
+4 С, после чего клетки дважды отмывали по 10
мин в 1 мл PBS при 1500 об/мин, осадок клеток
ресуспендировали в 300 мкл 1 %-ного р-ра формалина. Полученные результаты оценивали на проточном цитофлуориметре BD FACSCantoTMII
USA. Реактивы для буферов использовали компании «ПанЭКО» (Россия). Анализ данных, полученных с помощью проточного цитофлуориметра BD
FACSCantoII (USA).
МКА ICO-406 получали путем слияния клеток мышиной миеломы NS-1 с клетками селезенки
мышей линии BALB/C, предварительно трехкратно
Очистка и мечение МКА
Реагенты:
ДМСО (DMSO) – диметилсульфоксид безводный (Applichem #A3672.0050)
ДТТ (DTT) – дитиотриэтол (Serva #39759)
ФЭ (РЕ) – R-фикоэритрин (Fluka #52412)
PBS – 0,1 М фосфат-солевой буфер, рН 7,2 – 7,4
PBS-ЭДТА – PBS с 1 мМ этилендиамином тетраацитатом
NEM – N-этил малеимид (ABSR #209300)
SMCC – Сукцинимидил 4 [N-малеимидометил] циклогексан-1-карбоксилат (Fluka #63181)
SPDP – N-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио) пропионат (Sigma #P3415)
Tris-HCl – 10 мМ Трис-HCL буфер, рН 7,8
ТВS – 10 мМ Трис-буфер, 150 мМ NaCl, 0,02% NaN 3 pH 7,8
Для очистки IgG 5–10 мл асцитной жидкости осветляли центрифугированием 60 мин при 4000 об/мин.
Асцитную жидкость термостатировали при
+4 °С при постоянном перемешивании на магнитной мешалке и капельно добавляли равный объем
насыщенного при +4 °С раствора сульфата аммония в течение 15–20 минут. Образовавшийся осадок
отделяли центрифугированием (30 мин. при 4000
№ 2/том 14/2015
об/мин) и ресуспендировали в ТВS в объеме, равном 0,5 объема исходного асцита. Процедуру высаливания повторяли еще раз. Полученный осадок
отделяли центрифугированием (30 мин при 4000
об/мин) и ресуспендировали в ТВS. Полученный
препарат переводили в Tris-HCl на колонке PD-10 и
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
наносили на колонку Mono Q 10/100, уравновешенную тем же буфером. Это и последующие разделения проводили на хроматографе ÄKTA purifier 10.
Скорость потока составляла 1 мл/мин, выход белковых продуктов оценивали денситометрией при
280 нм. После отмывки колонки от не связавшейся
белковой фракции, на колонку подавали градиент
0–40 % 1М раствора NaCl на Tris-HCl.
Выходящие фракции собирали по 1 мл, и в
последующем анализировали SDS-ПААГ электрофорезом по Лэммли на наличие IgG. Фракции,
имеющие молекулярную чистоту 95–98 % объединяли. Препарат IgG дополнительно дочищали
гельфильтрацией на колонке Superdex 200 10/300.
На колонку наносили 0,6–0,8 мл образца IgG,
и проводили разделение со скоростью потока 0,5
мл/мин, выход белковых продуктов оценивали денситометрией при 280 нм. Фракции, соответствующие выходу гомогенного по молекулярной массе
IgG, объединяли, переводили в PBS-ЭДТА, концентрировали до 8–12 мг/мл и стерилизовали через
шприц-насадку 0,22 мкм.
Конъюгирование IgG с РЕ проводили по методам [18; 21] с модификациями. В мечение брали
300–350 мкг IgG и 1 мг РЕ, что соответствуют молярному соотношению 1 : 2. РЕ ресуспендировали
в 0,5 мл PBS-ЭДТА и обессоливали на PD-10 против того же буфера. Полученный материал концентрировали на Centricon 30 (Millipor) до 0,5–0,7 мл,
добавляли 16 мкл SPDP в DMSO в концентрации
1,33 мг/мл и инкубировали в темноте при комнатной температуре при постоянном перемешивании
2,5 часа.
За 0,5 часа до окончания инкубации PE, к
IgG в концентрации 2,5 мг/мл и добавляли 5 мкл
раствора SMCC в DMSO в концентрации 1,75
мг/мл. Смесь оставляли при комнатной температуре с периодическим встряхиванием на 1 час. По
окончании инкубации РЕ, к нему добавляли 30 мкл
0,5 М раствора DTT в PBS-ЭДТА и инкубировали
еще 0,5 часа при тех же условиях.
После инкубации модифицированные РЕ и
IgG освобождали от продуктов реакции и не прореагировавших реагентов на колонках PD-10 против PBS-ЭДТА. Полученные с колонок РЕ и IgG
концентрировали на Centricon 30 до совместного
объема 0,8–1,2 мл, после чего РЕ и IgG объединяли
в пробирке и инкубировали в темноте при +4 °С
при постоянном перемешивании 16–18 ч.
Реакцию останавливали добавлением 40 мкл
0,1 мМ раствора NEM в DMSO с последующей инкубацией при комнатной температуре при постоянном перемешивании в течение 45 мин.
Полученный образец концентрировали на
Centricon 30 до объема 0,5–0,6 мл и фильтровали на
Spin-X (Millipor).
Разделение продуктов конъюгации проводили на колонке Superdex 200 10/300, при скорости
потока 0,5 мл/мин c денситометрией при ν280 и 565
нм. Фракции собирали по 1 мл.
Собранные фракции анализировали на соотношение IgG – РЕ [19]:
№ 2/том 14/2015
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ICO-406…
101
Молярная концентрация [IgG] =[(A280 нм –
0,18 × A565 нм)/203,000]×фактор разведения;
Молярная концентрация [R-PE] = (Amax
/1,960,000) × фактор разведения,
где Amax должна быть в диапазоне 0,3–0,8
при измерении на 565 нм;
Степень включения РЕ = [R-PE]/ [Ig G],
где степень включения должна быть в пределах 0,7–2,0.
После разделения препараты антител стабилизировали бычьим сывороточным альбумином в
конечной концентрации 10 мг/мл, консервировали
0,1 %-ным NaN 3 и стерилизовали через шприцнасадку 0,22 мкм.
Результаты и обсуждение
Тестирование полученных МКА ICO-406 на
клеточной линии меланомы кожи человека mel Kor
выявило 100 % антиген-положительных клеток. В
качестве положительного контроля для CD117 использовали МКА СD117 (A3C6E2)-APC («MACS
Miltenyi Biotec», Германия), которые также реагировали с 100 % этих клеток. Гистограммы распределения клеток mel Kor, окрашенных МКА ICO-406
и МКА анти-СD 117, представлены на рис. 1. Сходство профилей флуоресценции МКА ICO-406 и
МКА СD117 позволило предположить, что эти антитела распознают один и тот же антиген.
Для следующего этапа в изучении специфичности МКА ICO-406 использовали метод конкурентной ингибиции. Клетки линии mel Kor первоначально инкубировали с избытком немеченых
МКА ICO-406, после чего инкубировали с МКА
ICO-406РЕ или анти-CD117АРС. Проведенные
эксперименты показали, что инкубация клеток mel
Kor с насыщающей концентрацией МКА ICO-406
приводит к полной блокаде связывания с этими
клетками меченных PE МКА ICO-406 и меченных
АРС МКА анти-CD117 (рис. 2).
Таким образом, можно сделать вывод, что
МКА ICO-406 распознают тот же самый или близко
расположенный эпитоп, что и МКА CD117.
Для дальнейшей характеристики МКА ICO406 был использован метод антигенной модуляции.
Преинкубация клеток mel Kor с МКА ICO-406 приводила к исчезновению с клеточной поверхности
антигена CD117, выявляемого МКА СD117 APC.
Антиген полностью исчезал с клеточной поверхности через 2 ч после начала инкубации при +37 °С
(рис. 3) с МКА и отсутствовал в течение 20 ч (срок
наблюдения). Эти результаты свидетельствуют о
том, что МКА ICO-406 реагируют с той же самой
молекулой, что и МКА CD117APC
Таким, образом, по результатам характеристики МКА ICO-406 можно сделать вывод, что гистограммы иммунофлюоресценции антиген-положительных клеток, окрашенных МКА ICO-406 и анти-CD117
идентичны, оба МКА распознают тот же самый или
близко расположенный эпитоп, оба МКА реагируют с
одной и той же молекулой, которая исчезает с поверхности клетки после контакта с МКА.
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
102
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ICO-406…
А
Б
В
Г
Рис. 1. Гистограммы распределения клеток mel Kor, окрашенных МКА ICO-406 и анти-СD117:
А – отрицательный контроль;
Б – гистограмма распределения клеток окрашенных МКА анти-СD117, меченных АРС;
В – отрицательный контроль;
Г – гистограмма распределения клеток окрашенных МКА ICO-406, меченных фикоэритрином ( РЕ).
А
Б
В
Г
Д
Е
Рис. 2. Конкурентная ингибиция связывания МКА ICO-406 с СD117 (A3C6E2)-APC («MACS Miltenyi Biotec»,
Германия) против антигена СD117:
А – отрицательный контроль;
Б – гистограмма распределения клеток окрашенных МКА анти-СD117, меченных АРС;
В – клетки линии mel Kor, инкубированные с насыщающей концентрацией МКА ICO-406 и проявленные МКА
СD117 (A3C6E2)-APC;
Г – отрицательный контроль;
Д – гистограмма распределения клеток, окрашенных МКА ICO-406РЕ;
Е – клетки линии mel Kor, инкубированные с насыщающей концентрацией МКА ICO-406 и проявленные МКА
ICO-406 РЕ.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ICO-406…
А
Б
В
Г
Д
Е
103
Рис. 3. Модуляция антигена СD117 МКА СD117 (A3C6E2)-APC («MACS Miltenyi Biotec», Германия):
А – отрицательный контроль;
Б – клетки линии mel Kor, инкубированные с насыщающей концентрацией МКА ICO-406 в течение 2 часов
37 °С и проявленные МКА СD117;
В – клетки линии mel Kor, инкубированные с насыщающей концентрацией МКА ICO-406 в течение 20 часов
37 °С и проявленные МКА СD117;
Г – отрицательный контроль;
Д – клетки линии mel Kor, инкубированные с насыщающей концентрацией МКА ICO-406 в течение 2 часов
37 °С и проявленные МКА ICO-406 РЕ;
Е – клетки линии mel Kor, инкубированные с насыщающей концентрацией МКА ICO-406 в течение 20 часов
37 °С и проявленные МКА. ICO-406 РЕ.
при
при
при
при
Литература
1.
Барышников А.Ю., Тоневицкий А.Г. Моноклональные антитела в лаборатории и клинике. – М.: Медицина, 1997. – 212 с.
2. Барышников А.Ю., Голубцова Н.В, Бурова О.С. и др. Экспрессия антигена CD44 у больных метастатической меланомой кожи // Российский биотерапевтический журнал. – 2013. – №4. – С. 17–20.
3. Барышников А.Ю. Моноклональные антитела серии ИКО к дифференцировочным антигенам лимфоцитов человека // Гематология и трансфузиология. – 1990. – №8. – С.4.
4. Барышников А.Ю. Иммунологический фенотип ранних гемопоэтических клеток-предшественников
человека // Экспериментальная онкология. – 1993. – Т. 15, № 6. – С. 3–7.
5. Барышников А.Ю., Короткова О.В., Тупицын Н.Н. и др. Моноклональные антитела ИКО-10 к антигену Thy-1 // Бюлл. эксперим. биол. мед. – 1989. – № 1. – С. 74–7.
6. Боценовский В.А., Барышников А.Ю. Молекулы клеточной адгезии // Успехи современной биологии.
– 1994. – Т. 114, № 6. – С. 741.
7. Брюховецкий И.С., Брюховецкий А.С., Моценко П.В., Хотимченко Ю.С. Роль системных механизмов
миграции и хоуминга стволовых клеток в развитии злокачественных опухолей центральной нервной
системы и разработка новых методов противоопухолевой терапии // Российский биотерапевтический
журнал. – 2013. – Т. 12, № 4. – С. 3–12.
8. Брюховецкий И.С., Брюховецкий А.С., Мищенко П.В. и др. Миграция гемопоэтических стволовых
клеток человека к клеткам глиобластомы линии U87 in vitro // Российский биотехнологический журнал. – 2014. – Т. 13, № 4. – С. 31–6.
9. Заботина Т.Н., Седяхина Н.П., Хорошко Н.Д. и др. Коэкспрессия антигена CD34 ранних гемопоэтических предшествеников и антигена Fas/АРО-1, опосредующего апоптоз // Экспериментальная онкология. – 1994. – Т. 16, № 4–6. – С. 343–7.
10. Кадагидзе З.Г., Тупицын Н.Н., Заботина Т.Н. и др. Иммунофенотипические и функциональные
особенности стволовоклеточных лейкозов// Российский онкологический журнал. – 1996. – № 1. –
С. 43–8.
11. Оборотова М.В., Бурова О.С., Барышникова М.А. и др. Экспрессия маркеров стволовых опухолевых
клеток на клеточных линиях меланомы человека // Российский биотерапевтичекий журнал. – 2015. –
Т. 14, № 1. – С. 11–4.
12. Туркина А.Г., Моисеенкова И.Н., Фролова Е.А. и др. "Примитивный" вариант бластного криза хронического миелолейкоза // Тер. архив. – 1995. – Т. 67, № 7. – С. 22–5.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
104
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ICO-406…
13. Фролова Е.А., Френкель М.А., Лебедева Н.Б.и др. Моноклональные антитела ICO-115 к антигену
CD34 человека // Вестник ОНЦ РАМН. – 1994. – Прил. – С. 10–2.
14. Al-Haij M., Wicha S.M., Benito-Hernandez A. et al. Prospective identification of tumotogenic breast cancer
cells. // Proc. Natl.Acad. Sci. USA. – 2003. – 100. – P. 3983–8.
15. Eding C.E., Hallberg B. C-Kit hematopoietic cell essential receptor tyrosine kinase // Int J Biochem Cell
Biol. – 2007. – 39. – P. 1995–8.
16. Baryshnikov A.Y,. Zabotina T.N., Sedyachina N.P. et al. Coexpression pf antigens CD34 specific for early
hematopoietic precursors and CD95 (Fas/APO-1) meduating apoptosis // Experimental oncology. – 1994. –
16. – C. 343.
17. Bonnet D., Dick J.E. Human acute myeloid leukemia is a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell // Nat Med. – 1997. – 3 – P. 730–7.
18. Kronick M.N., Grossman P.D. Immunoassay techniques with fluorescent phycobiliprotein conjugates //
Clinical chemistry. – 1983. – 29. – P. 1582–6.
19. Instructions for AnaTag R-Phycoerythrin Protein Labeling Kit. http://www.anaspec.com/pdfs/72113.pdf
20. La Porta C. Cancer stem cells: lessons from melanoma // Stem Cell Rev. – 2009. – 5(1). – P. 61–5.
21. Oi V.T., Glazer A.N., Stryer L. Fluorescent phycobiliprotein conjugates for analyses of cells and molecules //
Journal of Cell Biology. – 1982. – 93. – P. 981–6.
22. Schatton T., Schutte U., Frank N.Y. et al. Modulation of T-cell activation by malignant melanoma initiating
cells // Cancer Res. – 2010. – P. 697–798.
23. Turkina A.G., Baryshnikov A.Y., Sedyakhina N.P. et al. Studies of P-glycoprotein in chronic myelogenousleukaemia patients: Expression, activity and correlations with CD34 antigen // British Journal of Heamatology. – 1996. – 92. – P. 88–96.
24. Turkina A.G., Zabotina T.N., Kusnetzov S.V. et al. Studies of some mechanisms of drug resistence in chronic
myeloid leukemia (CML) // Advances in Experimental Medicine and Biology. – 1999. – 457. – P. 477–88.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ РЕКОМБИНАНТНЫХ…
105
УДК 618.19-006.6:616-097:615.322.012
В.С. Косоруков1, Е.Н. Кособокова1, М.В. Пинюгина1, М.А. Севостьянова1, А.И. Щербаков1,
Н.В. Андоронова1, Э.Ш. Соломко1, Е.В. Шешукова2, Е.М. Трещалина1, Ю.Л. Дорохов2
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ
ПРОТИВ РЕЦЕПТОРА HER2, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО ИСТОЧНИКА
1
ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина», Москва
2
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва
Контактная информация
Косоруков Вячеслав Станиславович, к.б.н., заведующий лабораторией трансгенных препаратов НИИ ЭДиТО
адрес: 115478 Москва, Каширское шоссе, 24; тел. +7(499)324-14-59
e-mail: [email protected]
Статья поступила 29.04.2015, принята к печати 12.05.2015.
Резюме
Лекарственные препараты, полученные из растений, становятся одним из лидирующих коммерческих
направлений в современной биотехнологии. Преимущества, которые дают подобные технологии, не сравнятся
ни с каким другим современным методом получения лекарственных препаратов на основе рекомбинантных
белков. Среди основных положительных моментов технологии получения рекомбинантных белков из растительного источника назовем легкую масштабируемость, экономичность, биобезопасность, простоту культивирования и сбора биоматериала. Этот подход обещает быть наиболее перспективным для получения широкого
спектра лекарственных субстанций и вакцин. В своей работе мы провели исследования in vitro и in vivo биологической активности рекомбинантных антител против онкоантигена HER2 из растений – фитотрастузумаба.
Фитотрастузумаб и трастузумаб имеют схожие антипрофлиферативные свойства в отношении клеток РМЖ с
гиперэкспрессией HER2 in vitro. In vivo на подкожных ксенографтах SK-BR-3 Her2+ РМЖ человека у иммунодефицитных мышей Balb/c nude показано, что фитотрастузумаб достоверно ингибирует рост опухоли SK-BR-3.
Ключевые слова: HER2, рак молочной железы, рекомбинантные антитела, экспрессия в растениях.
V.S. Kosorukov1, E.N. Kosobokova1, M.V. Pinyugina1, M.A. Sevostyanova, A.I. Scherbakov1,
N.V. Andronova1, E.Sh. Solomko1, E.V. Sheshukova2, E.M. Treschalina1, Yu.L. Dorokhov2
THE BIOLOGICAL ACTIVITY
OF PLANT-DERIVED ANTI-HER2 RECOMBINANT ANTIBODIES
1
FSBSI «N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center», Moscow
2
Moscow State University. M.V. Lomonosov, Moscow
Abstract
Pharmaceuticals derived from plants, have become one of the leading commercial directions in modern biotechnology. The benefits that offer these technologies, cannot be matched with any other modern technology for producing
drugs from recombinant proteins. Main advantages of plant technologies for production of proteins are easy scalability,
efficiency, bio-safety, ease of cultivation and collection of biological material. This approach promises to be the most
perspective for production of a wide range of drug substances and vaccines. In current investigation we have analyzed
in vitro and in vivo biological activity of plant-derived anti-HER2 recombinant antibodies – phytotrastuzumab. Phytotrastuzumab and trastuzumab have similar activity in grows suppression of breast cancer cells overexpressing HER2 invitro and were active in suppression of xenografted tumors SK-BR-3 in-vivo.
Key words: HER2, breast cancer, recombinant antibodies, plant-derived proteins.
Введение
Люди веками использовали растения и экстракты из них для профилактики и лечения различных заболеваний. Даже сейчас, в век химического производства, более четверти лекарственных средств содержат
компоненты, полученные из растений [23]. Только недавно разработаны технологии, позволяющие синтезировать в растениях рекомбинантные лекарственные
№ 2/том 14/2015
белки, которые ранее получали только экспрессией в
трансформированных культурах клеток бактерий и
эукариотов [17]. Первые такие препараты уже близки к
коммерческому использованию [19].
В настоящее время применение биотехнологических методов позволяет получать из растений
широкий спектр рекомбинантных белков, таких как
цитокины, антитела, вакцины, ферменты и т.д. [3;
6; 13; 16; 22].
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
106
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ РЕКОМБИНАНТНЫХ…
Использование растений в качестве платформы для получения биологических молекул имеет экономические и производственные преимущества в сравнении с другими платформами. Показано, что стоимость фармацевтической продукции
белка в растениях может быть от 10 до 50 раз ниже,
чем производство того же белка из клеток млекопитающих. В растениях экспрессируются как одноцепочечные [7; 24], так и полноразмерные антитела
[9; 12; 14; 15]. Также можно синтезировать специфические противоопухолевые вакцины для конкретного пациента [18]. Благодаря наличию эффективной системы посттрансляционной модификации
белков, растения как фармацевтическая платформа
могут быть удобным продуцентом новых противоопухолевых антител [5].
В последние десятилетия достаточно большое клиническое значение приобрело терапевтическое применение моноклональных антител. Технология получения терапевтических антител прошла
путь от их очистки из крови и асцитов животных до
высокотехнологичного получения рекомбинантных
гуманизированных и человеческих моноклональных антител методами генной инженерии и биотехнологии. Впервые препараты на основе гуманизированных антител стали применять в конце прошлого века в борьбе с опухолями, характеризующимися специфическими антигенными маркерами.
Яркий представитель таких новообразований –
HER2+ рак молочной железы.
Human epidermal growth factor receptor 2
(HER2/neu) – рецептор, участвующий в росте опухолевых клеток рака молочной железы. Этот рецептор является приоритетной мишенью для рекомбинантных антител против HER2/neu, таких как
трастузумаб [11]. Этот препарат был одобрен FDA
(USА) для лечения метастазирующего рака молочной железы.
У 20–30 % пациенток с метастатическим раком молочной железы иммуногистологически обнаруживается гиперэкспрессия рецепторов HER2,
что приводит к нарушению передачи сигналов в
клетку, вызывает развитие резистентности к апоптозу и нарушению роста клетки. Трастузумаб инициирует реакцию антителзависимой цитотоксичности, ингибирует передачу сигналов через рецептор
Her2, а так же препятствует расщеплению внеклеточного домена рецептора [10]. Было показано, что
трастузумаб повышает выживаемость больных с
метастазирующим раком молочной железы, и этот
препарат входит сейчас в большинство схем лечения [21; 25].
Кроме прямой терапии моноклональными
антителами развивается их применение в качестве
прицеливающих агентов в различных подходах
таргетной терапии. Например, возможно связывание моноклональных антител с поверхностью липосом, нагруженных лекарственными средствами.
Такой подход позволяет химиопрепаратам целенаправленно попадать и накапливаться в районе опухолевого узла [1; 2].
Трастузумаб получают с помощью техноло№ 2/том 14/2015
гии рекомбинантной ДНК из культуры клеток млекопитающих клеток яичников китайского хомячка.
Нашей группой был получен фитотрастузумаб –
моноклональное рекомбинантное антитело, аффинное к эпитопу на молекуле HER2, аналогично трастузумабу, из растения с использованием транзиентной системы трансформации растений [14].
Проведенные исследования показали, что
трастузумаб и фитотрастузумаб имеют сходные
антипролиферативные свойства к клеткам рака молочной железы с гиперэкспрессией Her2.
Для экспрессии антител в листьях Nicotiana
benthamiana использовали гены, кодирующие тяжелые и легкие цепи антитела и векторы, несущие
компоненты вирусов растений. Показано, что при
коинфильтрации векторные системы обеспечивают
высокий выход полноразмерных антител, которые
распознают и связываются с рецепторами HER2 на
поверхности опухолевых клеток и проявляют биологическую активность.
Целью настоящего исследования является
определение биологической эффективности субстанции рекомбинантных антител против онкоантигена HER2, полученной из растений.
Материалы и методы
Генетические последовательности, кодирующие гены тяжелой и легкой цепей рекомбинантного антитела фитотрастузумаб, клонировали в
трансфекционные векторы под контроль 35Sпромотора. Для снижения эффектов интерференции
при коинфильтрации векторных конструкций были
использованы основы на базе разных вирусов. Конструкция для тяжелой цепи была построена на основе вирусного вектора с элементами TMV, конструкция легкой цепи на основе вектора с элементами
X вируса картофеля [14]. Получены векторы VTMPT-HC и PVX-PT-LC. Для повышения уровня экспрессии использовали дополнительный вектор, несущий супрессор р19 Tomato Bushy Stunt Virus, блокирущий эндогенный транспорт РНК.
Для агроинфильтрации Agrobacterium
tumefaciens штамм GV3101 трансформировали
соответствующими конструкциями и получили
индивидуальные штаммы-носители векторов. Далее наращивали в течение ночи при +28 °C в среде
LB, содержащей соответствующие конструкции
антибиотики.
Аликвоту
клеточной
суспензии
A.
tumefaciens после наращивания в течение ночи разводили в 10мМ MES-буфера (рН 5,5) с добавлением 10 мМ MgSO 4 до конечной оптической плотности OD 600 =0,3.
Агроинфильтрацию проводили на полностью сформированных листьях N. Benthamiana методом шприцевания. Для накопления продукта в
листьях растение выращивали в тепличных условиях при температуре +23 °С в течение 5 дней.
Выделение рекомбинантных антител из
растительной биомассы. Навеску листьев измельчали в гомогенизаторе с добавлением буфера
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ РЕКОМБИНАНТНЫХ…
для экстракции (100мМ раствор натрия цитрата,
25мМ раствор ЭДТА), инкубировали при перемешивании 40 минут и полученный экстракт пропускали через фильтр с ø пор 190 мкм. Фильтрат центрифугировали при +6 °С и скорости 4000 об/мин в
течение 30 мин. Супернатант последовательно пропускали через фильтры с ø пор 20 мкм и 0,4 мкм.
Фильтрат наносили на аффинную колонку
HiTrap MabSelect SuRe (GE Healthcare) на приборе
AKTA prime plus (производитель GE Healthcare).
Далее проводили элюцию буфером с 100мМоль
раствором глицина при pH=2,7. Элюат стабилизировали раствором 1M Tris-HCl pH=7,5.
Доочистку рекомбинантного белка проводили гель-фильтрацией на колонке Superdex 200
10/300 GL (GE Healthcare) с заменой буфера на
0,9% раствор NaCl.
Электрофоретическое разделение белков
проводили в ПААГ по методу Лемли в денатурирующих и нативных условиях с окраской
Coomassie brilliant blue G-250 по стандартной методике.
Иммуноферментный анализ проводили с
использованием набора реагентов для иммуноферментного определения концентрации общих иммуноглобулинов класса G в сыворотке крови человека
(ЗАО «Вектор-Бест»), согласно рекомендациям
производителя.
Антипролиферативный эффект фитотрастузумаба in vitro проверяли на клетках аденокарциномы молочной железы человека линии SK-BR-3
с помощью МТТ-теста по стандартной методике.
Клетки SK-BR-3 высаживали в низкой плотности
(30 тыс. клеток/мл) в триплетах на 48-луночный
планшет в среде, содержащей 10 % сыворотки FCS.
На следующий день эту среду заменяли на среду с
низким содержанием сыворотки (1 %), добавляли
различные концентрации тестируемых препаратов.
Среду, антибиотики и препараты меняли один раз в
3–4 дня. Рост клеток определяли модифицированным «митогенным методом по Crystal Violet».
Клетки промывали PBS и фиксировали 1 %ным парафармальдегидом на PBS и окрашивали 0,5
%-ным р-ром Crystal Violet (Sigma Chemical Co) на
96 %-ном этаноле. Краситель растворяли в этаноле
и измеряли на спектрофотометре при ν 540–560 нм.
Выживаемость клеток рассчитывали, как отношение оптической плотности в каждой лунке, содержащей действующий агент, к оптической плотности контрольных лунок.
Эффективность ТРО in vivo определяли на
п/к ксенографтах SK-BR-3 Her2+, имплантированных иммунодефицитным мышам Balb/c nude
(CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl) 3 млн. клеток билатерально.
Фитотрастузумаб в разовой дозе 20 мг/кг вводили
парентерально, затем 8-кратно через 48 ч в дозе 10
мг/кг на 6–20 сутки роста при стартовом объеме
опухоли Vcp=16±2,5мм3. В качестве положительного контроля использовали трастузумаб (Герцептин,
Rôche, Швейцария), в качестве отрицательного –
0,9 %-ный р-р NaCl. Для вычисления Т/С
(treatment/control) с помощью электронного изме№ 2/том 14/2015
107
рителя многократно в процессе и после лечения
измеряли опухолевые узлы и рассчитывали средние
объемы опухолей в каждой группе. Минимальный
критерий эффективности Т/С<42%. Статистическая
обработка полученных данных проведена с использованием ДИ средних сравниваемых величин, рассчитанных по стандартному методу Стьюдента в
модификации Р.Б. Стрелкова. Достоверными считали различия при p<0,05. Наблюдение проводили
в течение 30 дней после трансплантации опухолей,
затем
животных умерщвляли передозировкой
эфирного наркоза в рамках правил гуманного обращения с лабораторными животными.
Результаты и обсуждение
Ранее была разработана транзиентная система экспрессии белка в растении на основе вирусных векторов для получения полноразмерных противоопухолевых моноклональных антител. Это дало возможность использования растений как платформы для получения антител для терапевтического применения. В системе используются провирусные векторы и интрон опитимизации TMV-вектора,
в котором скрытый участок сплайсинга удален и
вставлены несколько интронов. Для сборки в растении полноразмерных антител необходима одновременная экспрессия в одной клетке генов легкой
и тяжелой цепи. Для этого листья инфицируют
двумя различными не конкурирующими между
собой векторами, такими как TMV и PVX. В данном исследовании мы использовали 35S-векторные
системы, в которых TMV и PVX векторы кодируют
тяжелые и легкие цепи фитотрастузумаба.
Были синтезированы гены, кодирующие тяжелую и легкую цепи фитотрастузумаба. На основе
этих последовательностей были сконструированы
35S-векторы (35S-LC и
35S-HC). Листья
N.benthamiana, инфильтрованные векторами VTMPT-HC, PVX-PT-LC и супрессором р19, экспрессировали значимое количество антител, что подтверждалось результатами электрофоретического разделения белка в ПААГ. Антитела были экстрагированы из листьев и очищены аффинной хроматографией (рис. 1).
Полученные антитела были проанализированы методом SDS-ПААГ в нативных и денатурирующих условиях. Полосы, соответствующие тяжелой (~55 кДа) и легкой (~25 кДа) цепи, ярко выражены на электрофореграмме и соответствуют по
подвижности в геле контрольному препарату трастузумаб.
Экспрессия конструкции на основе промотора 35S была максимальной на 5 день после инфильтрации листьев.
Оценку накопления фитотрастузумаба в листьях и количество в растворах в процессе очистки
проводили методом ИФА набором для определения
сывороточных иммуноглобулинов класса G человека. В среднем выход очищенных антител составлял 100–150 мкг/г от сырого веса листьев, в зависимости от эксперимента (рис. 2).
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
108
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ РЕКОМБИНАНТНЫХ…
Рис. 1. Хроматограмма элюции 20 мг фитотрастузумаба с аффинной колонки с сорбентом MabSelect на основе
белка А.
Рис. 2. Электрофореграмма результатов очистки фитотрастузумаба (денатурирующие условия).
Дорожки:
1 – экстракт перед хроматографией;
2 – несвязавшиеся белки;
3 – элюция с колонки MabSelect;
4 – элюция фитоантител с колонки MabSelect начало;
5 – элюция фитоантител с колонки MabSelect окончание;
6 – очищенный фитотрастузумаб после гель-фильтрационной хроматографии;
7 – контрольный образец трастузумаб.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ РЕКОМБИНАНТНЫХ…
Полученные данные показывают, что чистота
получаемой субстанции была более 97 % и размер
легкой и тяжелой цепей фитотрастузумаба полностью соответствуют нормальным IgG человека.
Исследование биологической активности фитотрастузумаба при связывании с клеточным рецептором HER2 проводили in vitro на культуре клеток
SK-BR-3, имеющих гиперэкспрессию рецептора
HER2 в количестве 106–107 молекул на клетку.
Известно, что анти-HER2 антитела значительно подавляют рост опухолей молочной железы,
что даже может привести к исчезновению уже развившейся опухоли [20]. Анализ жизненного цикла
HER2-положительных раковых клеток молочной
железы SK-BR-3 показывает, что антиHER2 антитела дозо-зависимым образом уменьшают количество клеток SK-BR-3, находящихся в S-фазе, и увеличивают процент клеток в фазе G 0 /G 1 .
Результаты представлены на рис. 3. Не обнаружено статистически значимых различий в количестве клеток при добавлении контрольного препарата трастузумаб и растительных антител к онкобелку HER2.
Рис. 3. Сравнение антипролиферативного действия
фитотрастузумаба и трастузумаба в концентрациях
1–0,01 мкг/мл. Митогенный метод по Crystal Violet.
При концентрации препаратов 1 мкг/мл ингибирование пролиферации составляет 45,97%+10,09
для фитотрастузумаба и 41,93%+17,25 для трастузумаба, для концентраций 100 нг/мл ингибирование
пролиферации составляет 36,6%+19,63 для фитотрастузумаба и 39,27%+18,96 для трастузумаба; для концентрации 10 нг/мл – 8,45%+3,29 для фитотрастузумаба и 21,35%+14,81 для трастузумаба.
В качестве контроля на неспецифическое
действие антител мы использовали ритуксимаб
(антитела против CD20 нормальных и раковых Влимфоцитов; препарат Мабтера, Хоффман-Ла Рош),
и показали отсутствие заметного эффекта (рис. 3).
Таким образом, рекомбинантные антитела
фитотрастузумаб блокируют пролиферацию клеточной линии рака молочной железы с гиперэкспрессией HER2 в концентрациях, сравнимых с таковой трастузумаба. Это говорит об эквивалентности активности обоих антител в данном тесте.
Дальнейшие исследования проводили in vivo
с целью определения влияния лечения фитотрасту№ 2/том 14/2015
109
зумаба на рост ксенографтов Her2+ опухолей человека SK-BR-3 в сравнении с трастузумабом.
Культура клеток SK-BR-3 из Коллекции
штаммов опухолей человека РОНЦ была имплантирована мышам п/к в ранее отработанной прививочной дозе 3 млн. клеток на мышь в 0,1 мл питательной среды 199. Гиперэкспрессия рецептора
HER2 на клетках культуры SK-BR-3 была подтверждена в серии предварительных исследований методом проточной цитофлуорометрии.
На +6 сутки после трансплантации, когда
опухолевые узлы появились у всех мышей (100%
прививаемость), были измерены размеры опухолей,
после чего животные ранжированы на 3 группы:
 контроль роста опухоли,
 контроль ответа на трастузумаб
 опытная с лечением фитотрастузумабом.
Средний начальный объем опухолей в каждой из групп составил 16±2,5 мм3.
1 группа (контроля роста опухоли) – животные
не получали специфического лечения, им проводили
внутрибрюшинные инъекции 0,9% р-ра NaCl в режиме, аналогичном таковому опытной группы.
2 группа (контроля эффективности трастузумаба) – животные получали лечение трастузумбом, который начинали вводить на +6 сутки после трансплантации внутрибрюшинно 9-дневным курсом: 1 инъекция в
дозе 20 мг/кг, вторая – через 24 ч, а остальные 7 – через
48 ч в РД 10 мг/кг. Курсовая доза составила 100 мг/кг,
длительность курса – 15 дней, с +6 по +21 сутки.
3 группа (фитотрастузумаба) – мыши получали лечение по аналогичной по дозировке, кратности, длительности и пути введения схеме.
Противоопухолевый эффект лечения оценивали по общепринятому показателю ТРО [4].
Эффективность фитотрастузумаба при применении вышеописанной схемы показана в таблице. В группе контроля рост опухоли в течение 4 нед
после трансплантации характеризуется достаточно
высокой скоростью, объем опухоли с 6 по 22 сутки
увеличился более чем в 20 раз, что свидетельствует
о стандартности модели.
Результаты показали, что в опытной группе
введение фитотрастузумаба было осуществлено в
запланированном режиме при удовлетворительной
переносимости лечения. Ухудшения состояния или
гибели мышей в результате введения фитотрастузумаба не отмечали. В 3 группе (фитотрастузумаба)
на протяжении всего периода лечения и в течение 1
суток после лечения опухоли были достоверно в 11
раз меньше, чем в контроле, ТРО=31–9% (p<0,05).
В группе мышей, получавших трастузумаб
(2), на все сроки наблюдения размеры опухоли были достоверно, в 6 раз, меньше, чем в группе контроля. В течение этого периода и спустя день после
окончания лечения Т/С=32–15% (p<0,05). Статистически достоверных различий с данными группы
фитотрастузумаба не выявлено.
Полученный эффект дает возможность охарактеризовать фитотрастузумаб как равноэффективный трастузумабу препарат в отношении аденокарциномы молочной железы человека SK-BR-3.
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
110
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ РЕКОМБИНАНТНЫХ…
Таблица
Эффективность фитотрастузумаба при лечении мышей-самок Balb/c nude c гетеротрансплантатами рака молочной железы человека SK-BR3 Her2+
V ср. (мм3); сутки после перевивки опухоли
Воздействие
Vo
Vt на фоне и после лечения
6
11
15
19
22
КРО (физ. р-р)
16 [13÷19]
87 [56÷118]
137 [79÷195]
242 [131÷353]
429 [284÷574]
Фитотрастузумаб
16 [14÷18]
27 [19÷35]
28 [17÷39]
33 [21÷45]
38 [25÷51]
Т/С%
–
31
20
14
9
Трастузумаб
16 [14÷18]
28 [14÷42]
31 [15÷46]
51 [21÷81]
65 [16÷114]
Т/C%
–
32
22
21
15
n=10; лечение внутрибрюшинное; Vo и Vt – средний объем с ДИ.
Таким образом, при исследовании in vivo
биологической активности созданной субстанции
рекомбинантных антител против онкоантигена
HER2 показало наличие выраженной специфической активности в виде торможения роста ксенографтов HER2+ опухолей человека на модели линий
клеток SK-BR-3.
Заключение
На данном этапе развития исследований в
области терапевтического применения моноклональных антител становится ясно, что наиболее
перспективным лекарственным агентом будут
полноразмерные гуманизированные или человеческие антитела, производимые биотехнологическими способами. В отличие от различных вариантов
«коротких» и мини-антител полноразмерные антитела обладают полным спектром активностей,
включая взаимодействие с иммунной системой
организма, что значительно увеличивает их терапевтическую ценность.
Наши результат показывают, что для получения рекомбинантных антител из N. benthamiana с
успехом применена методика транзиентной экспрессии белка в ткани листа растения. Использование в транзиентной системе вирусных векторов
демонстрирует высокий потенциал для быстрой
наработки полноразмерных антител. Растения, как
биопродуцент, обладают схожей с человеческими
клетками структурой мембран и секреторными путями. Гликозилирование белков в растительных и
животных клетках имеет некоторые различия. Однако эти различия незначительны и, как показывают наши исследования и результаты других исследовательских групп, не влияют на биологическую
активность получаемой субстанции.
Фитотрастузумаб и трастузумаб имеют схожие антипрофлиферативные свойства в отношении
клеток РМЖ с гиперэкспрессией HER2 in vitro. Более того, очищенный фитотрастузумаб распознает
HER2/neu на поверхности клеток SK-BR-3 так же,
как и трастузумаб.
Трастузумаб представляет собой гумманизированное мышиное антитело 4D5, которое связывается с доменом IV рецепторов HER2. Точные механизмы взаимодействия трастузумаба с рецептором,
а также механизмы появления устойчивости до сих
пор изучены плохо. Недавние исследования показали, что трастузумаб не снижает фосфорилирование HER2. Эта способность может обусловливать
лекарственную резистентность, неизбежно возникающую у пациентов, которым назначали монотерапию трастузумабом [8].
Фитотрастузумаб эффективно тормозит рост
ксенотрансплантанта клеток SK-BR-3 рака молочной железы с гиперэкспрессией HER2. Фитотрастузумаб оказался несколько более эффективным в
подавлении опухолевого роста, чем трастузумаб.
Причина данного эффекта пока остается неясной.
Необходимы дополнительные исследования для
доказательства того, что фитотрастузумаб и трастузумаб полностью идентичны по аминокислотному
составу, гликозилированию и ADCC.
Литература
1.
Афанасьева Д.А., Барышникова М.А., Соколова З.А., Косоруков В.С. Разработка липосомальной конструкции, содержащей лизат опухолевых клеток // Российский биотерапевтический журнал. – 2013. –
Т. 12, № 2. – С. 5.
2.
Зангиева М.Т., Игнатьева Е.В., Косоруков В.С. Оценка эффективности включения доксорубицина в
иммунолипосомы, направленные против HER2 рецептора // Российский биотерапевтический журнал.
– 2013. – Т. 12, № 2. – С. 31.
3.
Соколова Т.М., Кособокова Е.Н., Шувалов А.Н. и др. Активность генов системы интерферона в клетках аденокарциномы толстого кишечника НСТ–116: регуляция рекомбинантными интерферонами–
альфа–2 из бактериальных и растительных продуцентов // Российский биотерапевтический журнал. –
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ РЕКОМБИНАНТНЫХ…
111
2013. – Т. 12. – № 3. – С. 39–44.
4.
Трещалина Е.М., Жукова О.С., Герасимова Г.К. и др. Методические указания по изучению противоопухолевой активности фармакологических веществ. – В кн.: Руководство по экспериментальному
(доклиническому) изучению новых фармакологических веществ/под общей ред. член–корр.РАМН
проф. Р.У.Хабриева.–2 изд., перераб. и доп. – М.: ОАО изд. «Медицина», 2005. – C. 637–51.
5.
Arntzen C.J. Using tobacco to treat cancer // Science. – 2008. – 321. – P. 1052–3.
6.
De Muynck B., Navarre C., Boutry M. Production of antibodies in plants: status after twenty years // Plant
Biotechnol J. – 2010. – P. 529–63.
7.
Galeffi P., Lombardi A., Donato MD. et al. Expression of single–chain antibodies in transgenic plants //
Vaccine. – 2005. – 15. – P. 1823–7.
8.
Gijsen M., King P., Perera T. et al. HER2 phosphorylation is maintained by a PKB negative feedback loop
in response to anti–HER2 Herceptin in breast cancer // PLoS Biol. – 2010. – 8(12). – e1000563.
9.
Giritch A., Marillonnet S., Engler C. et al. Rapid high–yield expression of full–size IgG antibodies in plants
coinfected with noncompeting viral vectors // Proc Natl Acad Sci USA. – 2006. – 103. – P. 14701–6.
10. Hudis C.A. Trastuzumab–mechanism of action and use in clinical practice // N Engl J Med. – 2007. – 357 –
P. 39–51.
11. Hudziak R.M., Lewis G.D., Winget M. et al. p185HER2 monoclonal antibody has antiproliferative effects in
vitro and sensitizes human breast tumor cells to tumor necrosis factor // Mol Cell Biol. – 1989. – 3. – P.
1165–72.
12. Ko K., Steplewski Z., Glogowska M., Koprowski H. Inhibition of tumor growth by plant–derived mAb //
Proc Natl Acad Sci USA. – 2005. – 102. – P. 7026–30.
13. Komarova T.V., Baschieri S., Donini M. et al. Transient expression systems for plant–derived biopharmaceuticals // Expert Rev Vaccines. – 2010. – 9. – P. 859–76.
14. Komarova T.V., Kosorukov V.S., Frolova O.Y. et al. Plant–Made Trastuzumab (Herceptin) Inhibits
HER2/Neu+ Cell Proliferation and Retards Tumor Growth // PLoS ONE. – 2011. – 6. – Iss. 3. – e17541.
15. Lai H., Engle M., Fuchs A. et al. Monoclonal antibody produced in plants efficiently treats West Nile virus
infection in mice // Proc Natl Acad Sci USA. – 2010. – 107. – P. 2419–24.
16. Lie´nard D., Sourrouille C., Gomord V., Faye L. Pharming and transgenic plants // Biotechnol Annu Rev. –
2007. – 13. – P. 115–47.
17. Ma J.K – C. The production of recombinant pharmaceutical proteins in plants // Nat. Rev. Genet. – 2003. –
4. – P. 794–805.
18. McCormick A.A., Reddy S., Reinl S.J., Cameron T.I., Czerwinkski D.K., et al. Plant–produced idiotype vaccines for the treatment of non–Hodgkin’s lymphoma: safety and immunogenicity in a phase I clinical study
// Proc Natl Acad Sci USA. – 2008. – 105. – P. 10131–6.
19. Mett V., Farrance C.E., Green B.J., Yusibov V. Plants as biofactories // Biologicals. –2008. – 36. – P. 354–8.
20. Pegram M., Hsu S., Lewis G. et al. Inhibitory effects of combinations of HER–2/neu antibody and chemotherapeutic agents used for treatment of human breast cancers // Oncogene. – 1999. – 18. – P. 2241–51.
21. Piccart–Gebhart M.J., Procter M., Leyland–Jones B. et al. Trastuzumab after adjuvant chemotherapy in
HER2–positive breast cancer // N Engl J Med. – 2005. – 353. – P. 1659–72.
22. Pujol M., Gavilondo J., Ayala M. et al. Fighting cancer with plant–expressed pharmaceuticals // Trends Biotechnol. – 2007. – 10. –P. 455–9.
№ 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
112
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ РЕКОМБИНАНТНЫХ…
23. Raskin I., Ribnicky D.M., Komarnytsky S. et al. Plants and human health in the twenty–first century //
Trends Biotechnol. – 2002. – 20. – P. 522–31.
24. Semenyuk E.G., Stremovskiy O.A., Edelweiss E.F. et al. Expression of single–chain antibody–barstar fusion
in plants // Biochimie. –2007. – 89. – P. 31–8.
25. Slamon D.J., Leyland–Jones B., Shak S. et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against
HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2 // N Engl J Med. – 2001. – 344. – P. 783–92. № 2/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АОС – антиоксидантная система
АОК – антителообразующие клетки
АЛК – 5-аминолевулиновая кислота
АФК – активные формы кислорода
АЛС – антилимфоцитарная сыворотка
АТГ
– антитимоцитарный глобулин
АТК
– аденокарцинома толстой кишки
БОВ
– большие одноламеллярные везикулы
БПВП – базисные противовоспалительные препараты
БКС
– бинарная каталитическая система
ВБН
– вирус болезни Ньюкасла
ВКМ – внеклеточный матрикс
ВРПС – водорастворимые полисахариды
ВМ
– васкулогенная мимикрия
ВЧД
– внутричерепное давление
ВЭБ
– вирус Эпштейна-Барр
ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография
ВЭФР-А– васкулоэндотелиальный фактор роста-А
в/б
– внутрибрюшинно
в/в
– внутривенно
ГДА
− гистоновая деацетилаза
ГЧЗТ – гиперчувствительность замедленного типа
ГИСО – гастроинтестинальные стромальные опухоли
ГИБП – генно-инженерные биологические препараты
ГК
– гепатоцеллюлярная карцинома
бГК – быстрорастущая дедифференцированная
гепатоцеллюлярная карцинома
мГК – медленнорастущая гепатоцеллюлярная
карцинома
ГПВ
– гликопептидная противоопухолевая вакцина
ГЯФ – гепатоцитарные ядерные факторы
ДГПЖ – доброкачественная гиперплазия
предстательной железы
Докс – Доксорубицин
ИК Докс – иммунолипосомальные конструкции с
Доксорубицином
ДРС – динамическое рассеяние света
ДМБА – диметил-α-бензантрацен
ДМТ − ДНК-метилтрансферазы
ДЛФО – теория Дерягина – Ландау – Фервея – Овербека
ДК – диеновые конъюгаты
ДЭС – двойной электрический слой
ЖТ – жировая ткань
ЗНО – злокачественные новообразования
ЗО – злокачественное образование
ЗХВК – золотохлористоводородная кислота
ИДМ – иммунодецифитные мыши
ИДР – инфильтративный дольковый рак
ИК – иммунолипосомальные конструкции
ИРИ – иммунорегуляторный индекс
ИРО – индекс роста опухоли
ИФА – иммуноферментный анализ
ИЭ – индекс эффективности
ИП – импульсные последовательности
ИС – иммунная система
ИФН-γ – интерферон гамма
ККМ – критическая концентрация мицеллообразования
КРР – колоректальный рак
КРО – контроль роста опухоли
КЗ – коллоидное золото
КОИР – коэффициент ориентировочно-исследовательской
реакции
КЭР – кардиоэзофагеальный рак
ЛЛФ – липосомальная лекарственная форма
ЛВ – лекарственное вещество
ЛТ – лучевая терапия
ЛМ – липосомальный митоксантрон
ЛЛЛФ – лиофилизированная липосомальная ЛФ
МАРК − митоген-активируемые протеинкиназы
МЛВ – мультиламеллярные везикулы
МДС − миелодиспластический синдром
МВДП – медиана времени до прогрессирования
МИБТ – медицинские иммунобиологические препараты
МКА – моноклональные антитела
МЛ – мононуклеарные лейкоциты
Мм – метамиелоцит(ы)
ММ – множественная миелома
МОВ – медиана общей выживаемости
МРЛ – мелкоклеточный рак легкого
МСЛ – многослойные липосомы
ММП – матриксные металлопротеиназы
МРТ – магнитно-резонансная томография
МФА – мультифитоадаптоген
МЧРА – метилчувствительный рестриктный анализ
НАД − никотинамидадениндинуклеотид
НК – натуральные киллеры
НМРЛ – немелкоклеточный рак легкого
НО – нанооболочки
НПТ – наилучшая поддерживающая терапия
НСф – наносферы
НСт – наностержни
НСПВС – нестероидные противовоспалительные средства
НХЛ – неходжкинская лимфома
НЭ – нуклеиновый эквивалент
ОбО – объективный ответ
ОДС – оптическая диффузионная спектроскопия
ОО – отсутствие ответа
ОКТ – оптическая когерентная томография
ОЦ – окисленные целлюлозы
ОЦК – объем циркулирующей крови
ОП – опухолевой плеврит
ОМ – опухолеассоциированные маркеры
ОЭ – объективный эффект
ПАВ – поверхностно активные вещества
НПАВ – неионогенные поверхностно-активные вещества
ПВП – поливинилпирролидон
ПД – пролиферация и дифференцировка
ПЖ – поджелудочная железа
ПЗ – прогрессирование заболевания
ПМЗО – первично-множественные злокачественные новообразования
ПО – полный ответ
ПОПР – полиоксипропилен
ПС – плевросклерозирующие средства
ПСА – простатический специфический антиген
ПСАсф – простатический специфический антиген,
свободная форма
ПСАобщ – простатический специфический
антиген, общая форма
%ПСАсв – соотношение свободной формы ПСА
к общей, выраженное в процентах
ПТПП – паратироид-подобный протеин и его рецептор (ПТПП-Р1)
ПТПГ – паратиреоидподобный гормон
ПФОС – перфторорганические соединения
ППК – первичные половые клетки
ПК – периферическая кровь
ПКЛ – приподнятый крестообразный лабиринт
ПКГШ – плоскоклеточная карцинома головы и шеи
ПХТ – полихимиотерапия
ПЭГ – полиэтиленгликоль
ПЯ – палочкоядерный
РМЖ – рак молочной железы
МР РМЖ – местнораспространенный РМЖ
ОИФ РМЖ – отечно-инфильтративная форма РМЖ
РЭС – ретикулоэндотелиальная система
ОАА – опухолеассоциированный антиген
РА – ревматоидный артрит
РСО – раствор стандартного образца
РКТ – рентгеновская компьютерная томография
РЛ – рак легкого
РМП – рак мочевого пузыря
РМЖ – рак молочной железы
РП – рак почки
РПК – рак прямой кишки
РПЖ – рак поджелудочной железы
РСО – рабочий стандартный образец
РЭ – рецепторы эстрогенных гормонов
РЭМП – расширенная экстирпация матки с придатками
РЭС – ретикуло-эндотелиальная система
РФ – ревматоидный фактор
РФр – растворимые углеводные фракции
НФр – нерастворимые углеводные фракции
РЧА – радиочастотная эффективность аблации
РШМ – рак шейки матки
СВФ – стромально-васкулярная фракция
СДЛВ – система доставки лекарственных веществ
СИТ – специфическая иммунотерапия
СК – селекартен
СЗП – свежезамороженная плазма
СО – суперинвазионный описторхоз
СПК – суммарный полисахаридный комплекс
СПС – сосудисто-подобные структуры
СПЖ – средняя продолжительность жизни
СЯ – сегментоядерный
ТБК – 2-тиобарбитуровая кислота
ТИК – тканеинжнерная конструкция
ТИМП – тканевые ингибиторы
ТСХ – тонкослойная хроматография
ТФ – транскрипционные факторы
ТЭМ – трансмиссионная электронная микроскопия
ТЭОС – тетроэтилортосиликата
ТЭС – телячья эмбриональная сыворотка
УЗКТ – ультразвуковая компьютерная томография
ФГА – фитогемагглютитнин
ФД – флуоресцентная диагностика
ФИЦХ – флуоресцентная иммуноцитохимия
ФР – факторы роста
ФС – фотосенс
ФСБ – фосфатно-солевой буфер
ФСП – фармакопейная статья предприятия
ФТ − фарнезил-трансфераза
ФТС – фетальная телячья сыворотка
ХГ – хорионический гонадотропин
ХЛЛ – хронический лимфоцитарный лейкоз
ХТ – химиотерапия
ЛСП – лимфосаркома Плисса
ЦП – церулоплазмин
ЦТАБ – цетилтриметиламмониумбромид
ЦФ – циклофосфан
ЧО – частичный ответ
ШМ – шейка матки
ШО – шиффовые основания
ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭВ – эффективность включения
ЭФР – эпидермальный фактор роста
ЭК – эндотелиальные клетки
ЭМ – электронная микроскопия
ЭМП – эпителиально-мезенхимальный переход
alk (δ-aminolevulinic acid)
fPSA – fPSA/tPSA
Akt – протеинкиназа В
AACR – American Association for Cancer Research
ВМР-4 – bone morphogenic protein-4
ADMET – drug administration, distribution, metabolism,
excretion, and toxicological studies
ASCUS – atypical squamous cells of undetermined significance
AUC – Area Under the Curve
BC – breast cancer
BCRP – breast cancer resistance protein
IBC – inflammatory breast cancer
BDFI – bioactivity-directed fractionation and isolation
c-Kit – рецептор фактора стволовых клеток
CFSE – carboxyfluorescein diacetate succinimidyl este
CIN – cervical intraepithelial neoplasia
COX – cyclooxygenase
CRC – colorectal cancer
CRD – cysteine-rich domain
DD (DED) – death (effector) domain
DISC – death-inducing signaling complex
EGFR – рецептор эпидермального фактора роста
EPCAM – adhesion molecule of epithelial cells
ЕРR effect – enhanced permeability and retention effect
EMT – epithelio-mezenhimal transition
FADD – FAS-associated protein with death domain
FAMMM – Familial Atypical Multiple Mole Melanoma syndrome)
FLDF – freeze-dried liposomal drug formulation
FLICE (IP) – сellular Fas-associated death domain-like
IL-1ß-converting enzyme; FLICE-like-inhibitory-protein
GAP (GMP; GCP) – Good Agricultiral Manufacturing (Clinical)Practice
GCV – glycopeptide cancer vaccine
LDCI – Lomustine-Dacarbazine-Cisplatin-Ingaron
LLC – lung Lewis carcinoma
LSIL – low-grade intraepithelial lesions
MRP – multidrug resistance associated protein
MNNG – N-methyl-N1-nitro-N-nitrosoguanidine
Mw – molecular weight
N–DMNA – N-dimethylnitrosoamine
NE – nucleic equivalents epitope
NER – nucleotide excision repair
NSE – нейроспецифической энолазы
NTA – nitril triacetate acid
IGFBP – insulin-like growth factor binding protein
HER – human epidermal growth factor receptor
HIF-1 – hypoxia-inducible factor 1
HSE – heat shock elements
HSP90 − hot shock protein
МНС – major hystocompatability complex
PCa – prostate cancer
PSA – prostate-specific antigen
tPSA – prostate-specific antigen, total form
fPSA – prostate-specific antigen, free form
PDT – photodynamic therapy
PTHRP – parathyroid hormone-related protein
PLAD – pre-ligand assembly domain
RA(F) – rheumatoid arthritis (factor)
ROC–analysis – Receiver Operating Characteristics curve analysis
ROS – reactive oxygen species
SAL – sterility assurance level
SDD – systems delivery drugs
SSCP a – single-strand conformation polymorphism analysis
TGF – Transforming Growth Factors
TRAIL–TNF-related apoptosis-inducing ligand
TNF – tumor necrosis factor
VM – vasculogenic mimicry