Инструкция по применению ФИТЦ

ИНСТРУКЦИЯ
по применению Антирабического лиофилизированного
иммуноглобулина, меченного флуоресцеинизотиоцианатом
(ФИТЦ-иммуноглобулин)
(Организация-производитель ФГБУ «ВНИИЗЖ»,
г. Владимир, мкр. Юрьевец)
I. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
1.
Антирабический
лиофилизированный
иммуноглобулин,
меченный
флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ-иммуноглобулин).
2. ФИТЦ-иммуноглобулин представляет собой поликлональные антитела,
полученные
в
результате
гипериммунизации
кроликов
очищенным
и
концентрированным культуральным инактивированным вирусом бешенства штамма
«ВНИИЗЖ» и конъюгированные люминесцентной меткой.
По
внешнему
виду
ФИТЦ-иммуноглобулин
представляет
собой
сухую
пористую массу от светло-розового до желтого цвета, в растворенном виде прозрачную жидкость лимонно-желтого цвета.
3. ФИТЦ-иммуноглобулин расфасован по 0,5 см3 в стеклянные ампулы
соответствующей вместимости. Ампулы упакованы в коробки с наличием гнезд или
перегородок, обеспечивающих их целостность.
Одна
ампула
исследования
бешенством
10
ФИТЦ-иммуноглобулина
проб
животных
головного
(100
мозга
отпечатков)
рассчитана
от
при
на
проведение
подозреваемых в
заболевании
рабочем
разведении
ФИТЦ-
иммуноглобулина 1:20 или 20 проб головного мозга (200 отпечатков) при рабочем
разведении ФИТЦ-иммуноглобулина 1:40.
В
каждую
коробку
ФИТЦ-иммуноглобулина.
вкладывают
инструкцию
по
применению
2
Срок годности ФИТЦ-иммуноглобулина 24 месяца с даты выпуска, при
соблюдении условий хранения и транспортирования. По истечении срока годности
ФИТЦ-иммуноглобулин к применению не пригоден.
4. Ампулы с ФИТЦ-иммуноглобулином хранят и транспортируют в сухом
темном месте при температуре от 2ºС до 8ºС.
5. Ампулы с ФИТЦ-иммуноглобулином следует хранить в местах, недоступных
для детей.
6. Ампулы с ФИТЦ-иммуноглобулином без маркировки, с истекшим сроком
годности, с нарушением целостности и/или герметичности, с измененным цветом
содержимого подлежат утилизации. Утилизация ФИТЦ-иммуноглобулина не требует
соблюдения специальных мер предосторожности.
II. ПРИНЦИП МЕТОДА И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
7.
Принцип
метода
заключается
в
соединении
меченных
флуоресцеинизотиоцианатом антирабических антител со специфическим антигеном
и
наблюдении
светящихся
комплексов
антитело-антиген
в
полях
зрения
антигеном
вируса
люминесцентного микроскопа.
Молекулы
ФИТЦ-иммуноглобулина
связываются
с
бешенства, обеспечивая специфическую иммунофлуоресценцию.
III. ПОРЯДОК ПРИМЕНЕНИЯ
8. ФИТЦ-иммуноглобулин предназначен для выявления антигена вируса
бешенства в свежем или замороженном патологическом материале – головном
мозгу животных, подозреваемых в заболевании бешенством.
9. Порядок и условия применения диагностикума.
Оборудование и материалы. Для постановки реакции иммунофлуоресценции
(РИФ) необходимы: одноканальные автоматические пипетки переменного объема до
1 см3 со сменными наконечниками, пенициллиновые флаконы или центрифужные
пробирки объемом 1,5 см3 или 2,0 см3, предметные стекла, поддон, пинцет, глазные
ножницы, скальпель, ацетон, фильтровальная бумага, стерилизатор, держатель
предметных стекол, емкости для промывки, термостат с температурой нагрева
(37,0±0,5)ºС, бытовой холодильник, микроскоп Олимпус СХ41 с объективом PLN
40X, укомплектованный для проведения флуоресцентных исследований, с фильтром
CX-DMB-2 (или аналогичный микроскоп другой марки).
Подготовка исследуемых препаратов. Материал для исследования должен
быть отобран из следующих отделов головного мозга:
3
– продолговатый мозг,
– мозжечок,
– аммонов рог,
– кора больших полушарий.
Изготавливают по 2 препарата каждого из вышеперечисленных отделов мозга
(по одному с каждой стороны). Препараты готовят следующим образом:
- глазными ножницами или скальпелем вырезают небольшой фрагмент мозга,
при необходимости удаляют лишнюю влагу путем промокания фрагмента ткани о
фильтровальную бумагу;
- путем легкого прикосновения поверхностью разреза к обезжиренному стеклу
и некоторого смещения фрагмента мозга вдоль стекла приготавливают отпечаток;
- если материал слишком размягчён и невозможно приготовить отпечатки,
готовят мазки, для этого небольшой кусочек ткани мозга помещают на предметное
стекло и раздавливают другим стеклом, немного сдвигая их относительно друг
друга;
- полученные препараты выдерживают на воздухе при комнатной температуре
до полного высыхания;
- препараты помещают в охлажденный до минус 20ºС ацетон и фиксируют при
температуре минус 20ºС в течение 18 ч. При необходимости проведения срочных
исследований время фиксации препарата можно сократить до 2 часов, но не менее;
- препараты выдерживают на воздухе до полного высыхания отпечатка или
мазка (если есть необходимость, препараты можно хранить в кассете, помещенной в
плотно завязанный полиэтиленовый пакет, при температуре минус 60ºС в течение
нескольких месяцев до проведения РИФ).
♦ Перед приготовлением рабочего раствора ФИТЦ-иммуноглобулина
ампулы с препаратом выдерживают 30 мин при температуре от 15 0С
до 25 0С.
Приготовление
рабочего
разведения
антирабического
ФИТЦ-иммуноглобулина. В ампулу с антирабическим ФИТЦ-иммуноглобулином
вносят 0,5 см3 раствора бидистиллированной или деионизированной воды и
выдерживают препарат при комнатной температуре до полного растворения.
Полученный исходный раствор переносят в центрифужную пробирку объемом 1,5
см3 и центрифугируют при 3000 g в течение 10-15 минут. Для приготовления
рабочего раствора ФИТЦ-иммуноглобулина требуемый объем раствора делят на
величину разведения, указанного на этикетке ампулы. Полученное число будет
4
составлять то количество растворенного сухого препарата, которое нужно взять для
приготовления рабочего раствора.
Пример: Нужно приготовить 1 см3 ФИТЦ-иммуноглобулина в рабочем
разведении 1:40. Для этого 1см3 делим на 40, получаем 0,025 см3. Таким образом,
для приготовления 1 см3 рабочего раствора ФИТЦ-иммуноглобулина нужно взять
0,025 см3 исходного раствора препарата и смешать с 0,975 см3 (1 – 0,025)
фосфатно-солевого буферного раствора. Рабочий раствор используют в день
приготовления.
Остатки исходного раствора ФИТЦ-иммуноглобулина хранят при температуре
минус 20ºС до следующего его использования. Для повторного использования
исходный раствор ФИТЦ-иммуноглобулина необходимо после размораживания
тщательно перемешать и центрифугировать, как описано выше.
Фосфатно-солевой
буферный
раствор
для
приготовления
рабочего
раствора ФИТЦ-иммуноглобулина и для отмывания исследуемых препаратов. Для
получения 500 см3 фосфатно-солевого буферного раствора, pH 7,4±0,2 в 450 см3
бидистиллированной или деионизированной воды растворяют хлорид натрия - 4,35
г, двузамещенный двенадцативодный фосфат натрия - 3,87 г и однозамещенный
фосфата калия - 0,21 г, затем объем доводят до 500 см3. Приготовленный раствор
фильтруют через нитроцеллюлозный фильтр (или аналог) с диаметром пор 0,45 мкм
или через бумажный фильтр. Хранят при температуре 4ºС не более 20 суток. Можно
использовать
сухой
таблетированный
фосфатно-солевой
буферный
раствор
производства «Sigma, Р4417».
10. Проведение исследования
Инкубация с антирабическим ФИТЦ-иммуноглобулином. На исследуемые
препараты, высушенные после фиксации в ацетоне, наносят от 0,05 см3 до 0,1 см3
рабочего
раствора
антирабического
ФИТЦ-иммуноглобулина,
осторожно
распределяя жидкость по поверхности отпечатка или мазка. Затем помещают их во
влажную камеру (стерилизатор с уложенной на дно увлажнённой фильтровальной
бумагой) и инкубируют при температуре 37ºС в течение 30 мин.
♦ Стекла с отпечатками и нанесенным ФИТЦ-иммуноглобулином
должны лежать строго горизонтально, без перекосов. Не допускается
осушение поверхности отпечатков во время инкубации.
Промывание. Препараты извлекают из влажной камеры и промывают 2 раза в
течение 10 мин в двух объемах (на 250 см3 максимальное количество стекол 20)
фосфатно-солевого буферного раствора и затем 1 раз дистиллированной водой 5
мин.
5
Подготовка к исследованию методом флуоресцентной микроскопии. После
промывания препараты высушивают в вертикальном положении и исследуют в день
приготовления с использованием флуоресцентного микроскопа при увеличении
1 х 400.
11. Учёт и оценка результатов
Антиген вируса бешенства выявляется в виде ярко зеленых (бриллиантовая
зелень) или желтовато-зеленых включений, как правило, округло-овальной формы
разной морфологии (в основном плоские на вид с достаточно четкими краями) и
величины (от мелких, размером с песчинку, до крупных, сравнимых по величине с
тельцами Негри), наблюдаемых преимущественно в нейронах и их отростках.
Непораженная вирусом бешенства мозговая ткань светится тусклым сероватожелтоватым или серовато-зеленоватым цветом.
Результаты оценивают по интенсивности специфичного свечения:
++++ - яркое зеленое или желтовато-зеленое свечение;
+++ - отчетливо выраженное, достаточно яркое желтовато-зеленое свечение;
++ - неяркое свечение желтовато-зеленого цвета;
+
- слабое (тусклое) свечение желтовато-зелёного цвета;
–
- отсутствие специфического свечения.
Результат считают положительным, если обнаруживается специфичная
флуоресценция не менее чем на два креста.
13. Обеззараживание отработанных материалов
Материалы, содержащие вирус бешенства и соприкасавшуюся с ним посуду,
латексные перчатки, инструменты автоклавируют в течение 1 часа при 1,5 атм. или
кипятят в течение 30 минут в 1% растворе жидкого мыла или детергента. Для
дезинфекции рабочих поверхностей используют 45-70 % этанол, 1% мыльный
раствор или раствор детергента, четвертичный аммоний в разведении 1:500.
Рабочую поверхность кюветы протирают 70 % этанолом и обжигают с помощью
ваты, смоченной в 70% этаноле. Наконечники замачивают в 1 % мыльном растворе
или в растворе детергента, затем кипятят в течение 30 минут. Поверхность столов и
пола протирают горячим раствором мыла или детергента. Рабочее помещение
облучают ультрафиолетовым светом не менее 10 мин.
IV. МЕРЫ ЛИЧНОЙ ПРОФИЛАКТИКИ
14. Диагностические исследования на бешенство должны проводиться в
специально
оборудованном
помещении
с
соблюдением
санитарно-
6
эпидемиологических правил предусмотренных при работе с микроорганизмами I-II
групп патогенности.
15. Лабораторный персонал, осуществляющий диагностику бешенства, в
обязательном порядке должен быть вакцинирован против бешенства, уровень
антирабических вируснейтрализующих антител у них в крови должен быть не ниже
0,5 МЕ/см3.
16. Отбор образцов ткани головного мозга и приготовление отпечатков
(мазков) необходимо проводить в халате, в латексных перчатках, в защитной маске
или в марлевой повязке. В случае нарушения герметичности латексных перчаток и
контакта
патологического
(например,
при
патологическим
порезе
материала
с
поврежденными
анатомическим
материалом)
необходимо
инструментом,
тщательно
кожными
покровами
контактировавшим
вымыть
с
поврежденную
поверхность с мылом, обработать 70% спиртовым раствором и обратиться за
антирабической врачебной помощью.
17. В местах работы должна быть аптечка первой доврачебной помощи.
18. Организация-производитель: ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья
животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), 600901, Россия, Владимирская область, город
Владимир, микрорайон Юрьевец тел.: (4922) 26-19-14, тел./факс: (4922) 26-38-77,
E-mail: [email protected].
Инструкция
по
иммуноглобулина,
применению
меченного
«Антирабического
лиофилизированного
флуоресцеинизотиоцианатом
(ФИТЦ-
иммуноглобулин)» разработана ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья
животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), 600901, Владимирская область, город Владимир,
микрорайон Юрьевец.