РЕТРОСПЕКТИВНАЯ ДИАГНОСТИКА ДВУХ СЛУЧАЕВ БЕШЕНСТВА У ПАЦИЕНТОВ ИЗ АСТРАХАНСКОЙ ОБЛАСТИ

реклама
РЕТРОСПЕКТИВНАЯ ДИАГНОСТИКА
ДВУХ СЛУЧАЕВ БЕШЕНСТВА У
ПАЦИЕНТОВ ИЗ АСТРАХАНСКОЙ
ОБЛАСТИ
Бешенство
• Бешенство – особо опасное вирусное
заболевание
животных
и
человека,
поражающее центральную нервную систему
• Возбудитель бешенства – Rabies virus,
принадлежащий роду Lyssavirus семейства
Rhabdoviridae
2
род Lyssavirus
1. Aravan virus
2. Australian bat lyssavirus
3. Duvenhage virus
4. European bat lyssavirus1
5. European bat lyssavirus2
6. Irkut virus
7. Khujand virus
8. Lagos bat lyssavirus
9. Mokola virus
10. Rabies virus
Andrew M.Q. King, Michael J. Adams, Eric B. Carstens,and Elliot J. Lefkowitz., Virus
Taxonomy, Classification and Nomenclature of Viruses, Ninth Report of the International
Committee on Taxonomy of Viruses, 2012
Распределение риска заражения человека
бешенством в мире (2012 г.)
(WHO Expert consultation on rabies, 2013)
•Бешенство наблюдается более чем в 150
странах
•Более 55 000 человек ежегодно умирают
вследствие инфицирования вирусом
бешенства (преимущественно в Азии и
Африке)
•Более 15 000 000 человек ежегодно
получают антирабическую сыворотку, что
позволяет избегать нескольких сотен тысяч
ВОЗ, сентябрь 2012г.
смертей
Заболевание людей бешенством на территории
России в 1960-2011 гг.
n
25
23
23
22
22
21
21
20
19
18
17
17
17
15
14
15
16
16
14
15
14 14
13
12 12
12
11
10
10
12
11
11
10
12
11
11
10
10
8
8
8
8
8
7
8
7
6
5
5
5
3
3
3
2
1
1
1
0
1960
1963
1966
ВСЕГО
1969
1972
1975
1978
1981
1984
1987
От укусов диких животных
1990
1993
1996
1999
2002
2005
2008
2011
Полещук и др., 2013
ПУТИ ПЕРЕДАЧИ ВОЗБУДИТЕЛЯ
Заражение человека обычно наступает при
укусах, реже при ослюнении повреждённых
участков кожи больными бешенством
животными;
Описаны случаи заражения бешенством при
трансплантации роговицы, почки, печени;
Возможно инфицирование человека
воздушно-капельным путем
СТРОЕНИЕ ВИРИОНА ВИРУСА
БЕШЕНСТВА
75нм
Матриксный
белок
Липидная
мембрана
Гликопротеин
180нм
РНК
нуклеопротеин
фосфопротеи
н
РНКполимераза
Рибонуклео
протеиновый
комплекс
(нуклеокапсид
)
Warrell et al., 2004
ГЕНОМ ВИРУСА БЕШЕНСТВА
Геном представляет собой единую
одноцепочечную молекулу РНК (-)
(~12kb)
Геном вируса состоит из 5 генов:
•N-ген (нуклеопротеин)
•Р-ген (фосфопротеин)
•М-ген (матриксный белок)
•G-ген (гликопротеин)
•L-ген (РНК-зависимая РНКполимераза)
ПАТОГЕНЕЗ
5) инфекция в
ГМ
4) Вирус
реплицируется
в спинальном ганглии и
перемещается по
спинному мозгу
в головной мозг
1) Вирус проникает
в организм человека
после укуса
животного
6) Вирус
перемещается
из головного мозга
по нервам в
другие ткани
организма
3) вирус инфицирует
нерв
периферической
нервной системы,
перемещается по
типу
ретроградного
транспорта
2) Вирус реплицируется
в мышечной ткани
в месте укуса
http://pathmicro.med.sc.edu/virol/rabies.htm, Richard Hunt
КЛИНИЧЕСКАЯ КАРТИНА
Инкубационный период длится обычно 1-3 месяца.
При течении болезни наблюдают 3 периода:
1)Стадия продромы (1-3 суток)
у больного, хотя рана уже зарубцевалась, появляются неприятные ощущения в области
укуса или ослюнения (жжение, тянущие боли, зуд), также наблюдается
беспричинная тревога,
депрессия, бессонница
2) Стадия возбуждения (1-3 суток)
характеризуется гидрофобией, аэрофобией и повышенной чувствительностью.
Температура тела
субфебрильная. Слюноотделение повышено, больной не может
проглотить слюну и постоянно
ее сплевывает. Возбуждение нарастает, появляются
зрительные и слуховые галлюцинации.
Иногда возникают приступы буйства с
агрессивными действиями
3) Стадия паралича (1-5 суток)
Наступает паралич глазных мышц, нижних конечностей. Тяжёлые паралитические
расстройства дыхания вызывают смерть
ЛЕЧЕНИЕ И
ПРОФИЛАКТИКА
Этиотропная терапия не разработана.
В случае контакта с бешеным животным,
покусов диких и домашних животных при
невозможности их обследования
проводится экстренная
вакцинопрофилактика и/или
иммунноглобулинотерапия
Первичная профилактика антирабической
вакциной проводится декретированным
группам населения (охотники, звероводы,
ветеринарные врачи)
Диагностика бешенства
Золотой стандарт
лабораторной диагностики бешенства
– метод флюоресцирующих антител (МФА)
Недостатки методов:
Биопроба – имеет длительный временной
интервал наблюдения (30 дней);
МФА – требуется высокая квалификация
специалиста;
ИФА – имеет относительно более низкую
чувствительность ;
WHO Expert consultation on rabies, 2013
13
Микроскопия
Клинический
или патматериал
Молекулярнобиологические
методы
Микробиологические
и вирусологические
методы
ИФА
Выделение
ДНК/РНК
Выделение
ДНК/РНК
Иммуночипы
Секвенирование по Сэнгеру
Real-Time
PCR
Неспецифическая
амплификация
SISPA/VEDISCA
PCRфорез
Mass-Tag
PCR
Родоспецифичес
кая ПЦР
ДНК-чипы
Высокопроизводительное
Секвенирование. Платформы
Illumina, 454-Roche
Расширение спектра
специфических RealTime диагностикумов
Улучшение
качества рутинной
диагностики
Расширение спектра
серологических
маркеров
2003 г., Астраханская областная
инфекционная больница;
Смерть 2-х пациентов (мужчина 50 лет и
ребенок 7 лет), энцефалит неясной
этиологии;
15
Молекулярно-генетические методы
исследования
RNA-extraction
kit (Qiagen)
Мозговая
суспензия
ОТ (SuperScript III
[Invitrogen])
РНК
кДНК
ПЦР в присутствии набора
специчных для разных родов
вирусов праймеров
Смесь
ампликонов
кДНК
TrueSeq
Смесь
ампликонов
Illumina library
MiSeq
16
Результаты NGS
• Согласно результатам секвенирования ~2%
прочтений (124781 из 6041914) обладали
высокой степенью схожести к геному вируса
бешенства;
• Для подтверждения результатов
секвенирования провели ОТ ПЦР в реальном
времени с помощью набора реагентов
«Амплисенс ® RABV-FL»
17
Набор реагентов для выявления РНК вируса
бешенства методом ПЦР в режиме реального
времени «Амплисенс ® RABV-FL»
(проходит процедуру регистрации)
• Целевая последовательность - фрагмент N-гена;
• Аналитическая чувствительность 5*103 копий/мл
• Аналитическая чувствительность, составила 0.1-1.0
LD50/мл;
• Диагностическая чувствительность 100%
(в сравнении с МФА , методом биологической пробы на мышах и ИФА)
• Аналитическая специфичность 100%
[Оценку аналитической специфичности набора реагентов проводили на
разных семействах вирусов (Bunyaviridae, Reoviridae, Togaviridae, Picornaviridae и др.),
мозговой ткани мыши, кошки, собаки, человека]
18
Подтверждение результатов NGS с
помощью ПЦР в реальном времени
0,8
0,7
0,6
Норм. Флуоресц.
0,5
ПКО+
0,4
образец1
образец2
0,3
0,2
0,1
ОКО-
0,0
5
10
15
20
25
Цикл
30
35
40
19
45
Валидация результатов (биопроба)
(Исследования выполнены на базе ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций»
Роспотребнадзора)
• проводили на 3-недельных беспородных белых мышах (6-8 г)
путём интрацеребральной инокуляции 30 мкл 10% суспензии
головного мозга погибших. Срок наблюдения составлял 30
дней;
• Животные, заражённые первичным материалом, заболели на
12-13 (в среднем 12,4) и 8-15 сутки (в среднем 11,8);
заболевание сопровождалось характерными клиническими
признаками;
• Выделили штаммы 8329H и 8330Н;
20
Валидация результатов (МФА)
(Исследования выполнены на базе ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых
инфекций» Роспотребнадзора)
Специфическая иммуннофлуоресценция антигена вируса
бешенства в отпечатках головного мозга
Отпечаток
головного мозга
инокулированных
белых мышей
8229H
8330H
Отпечаток
головного мозга
здоровых белых
мышей
21
Валидация результатов (ИФА)
(Исследования выполнены на базе ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых
инфекций» Роспотребнадзора)
8329Н
8330H
10-1
10-2
10-1
10-2
K-
K-
K+
K+
22
Полногеномное секвенирование
При помощи секвенирования методом
Сэнгера получены все белок-кодирующие
последовательности нуклеотидов 2 штаммов
вируса бешенства, выделенных из мозговой
ткани пациентов, погибших в результате
энцефалита неясной этиологии;
23
Maximum Likelihood,
General Time Reversible
model
(best according to AIC),
Gamma Distributed,
No of Discrete Gamma
Categories – 4,
No.
of
Bootstrap
Replications – 1000
Степная подгруппа
Северо-восточноевропейская подгруппа
Европейские подгруппы
WE/CE
Кавказская подгруппа
Арктическая подгруппа
Cosmopolitan group
N-gene, cds
ВЫВОД:
Использование современных
молекулярно-биологических методов в
сочетании с классическими методами
диагностики бешенства существенно
повышает эффективность диагностики
и улучшает качество надзора за этой
опасной инфекцией.
25
Спасибо за внимание!
Скачать