Тест генерации тромбина – интегральный показатель состояния

ISSN 0234-5730
9 "770 23 4"573007
ГЕМАТОЛОГИЯ
И
ТРАНСФУЗИОЛОГИЯ
Hematology and Transfusiology
2'2010
Издательство "МЕДИЦИНА"
Гематол. и трансфузиол., 2010, т. 55, № 2
дение препарата с тщательной коррекцией дозы и
кратности введения [13].
ЛИТЕРАТУРА
1. Баркаган 3. С. Патология гемостаза. В кн.: Воробьев А. И.
(ред.). Руководство по гематологии. М.: Медицина; 1985:
106-152.
2. Андреев Ю. Н. Хирургическое лечение осложнений гемо
филии. В кн.: Гаврилов О. К., Гроздов Д. М. (ред.). Хирур
гическое лечение заболеваний системы крови. М.: Меди
цина; 1981: 200-260.
3. Rivard G.-E. Chemical synovectomy in haemophilia: status and
challenges. Haemophilia 2001; 7(suppl. 2): 16—19.
4. Black C, Batorova A., Street A. et al. Comprehensive care for
haemophilia around the world. Haemophilia 2004; 10(suppl. 4):
47-54.
5. Evatt B. L. The natural evolution of haemophilia care: develop
ing and sustaining comprehensive care globally. Haemophilia
2006; 12(suppl. 3): 13-21.
6. Batistella L., Souza N., Guerra С. С Synoviorthesis with rifocin
— a good choice. Haemophilia 1996; 2(suppl): 29.
7. Rodriguez-Merchan E. C, Caviglia H., Magallon M., Perez Bi
anco R. Chemical synovectomy versus radioactive synovectomy
for the treatment of chronic haemophilic synovitis. A prospec
tive short term study. Haemophilia 1999; 5: 57.
8. Caviglia H., Duhalde C, Galatro G., Perez Bianco R. Intraarticular rifampicine injections. Clinical outcomes in patients with
grade II haemophilic arthropathy. Haemophilia 2000; 6(4): 396.
9. Barrionuevo A., Galatro G., Lorenz M. et al. Rifampicine action
in synovitis caused by experimental hemarthrosis. Haemophilia
1996; 2: 39.
10. Rodriguez-Merchan E. С Methods to treat chronic haemophilic
synovitis. Haemophilia 2001; 7(suppl. 2): 1 — 15.
11. Caviglia H. A., Fernandez-Palazzi F., Galatro G. et al. Chemical
synoviorthesis with rifampicin in haemophilia. Haemophilia
2001; 7(suppl. 2): 26-30.
12. Садыкова Н. В., Чемис А. Г., Зоренко В. Ю. и др. Непосредст
венные и отдаленные результаты синовиортеза с рифампицином у больных гемофилией. Пробл. гематол. 2005; 1: 7—9.
13. Chemis A., Roschina L., Proskurina N. How safe is rifampicine
synovectomy for joint cartilage? Haemophilia 2008; 14(suppl. 2):
77-78.
Поступила 18.04.08
ОБЗОРЫ ЛИТЕРАТУРЫ
© Ю. А. НАМЕСТНИКОВ, 2010 УДК
616.151.5-07:616.153:577.152.344
ТЕСТ ГЕНЕРАЦИИ ТРОМБИНА — ИНТЕГРАЛЬНЫЙ ПОКАЗАТЕЛЬ СОСТОЯНИЯ
СИСТЕМЫ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ
Ю. А. Наместников
ФГУ "Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии" Федерального
медико-биологического агентства, Санкт-Петербург
Резюме. В обзоре литературы представлены данные о диагностической значимости теста
генерации тромбина. Показатели теста характеризуют скорость и интенсивность образования
тромбина — ключевого энзима гемостаза, которые могут быть использованы для объективной
оценки состояний гипо- или гиперкоагуляции.
Ключевые слова: генерация тромбина, эндогенный тромбиновый потенциал, калиброванная автоматизированная тромбограмма
THROMBIN GENERATION TEST AS AN INTEGRAL INDICATOR OF THE BLOOD CLOTTING SYSTEM
STATUS
Yu. A. Namestnikov
Russian Institute of Hematology and Transfusiology, St. Petersburg
Summary. This review presents data on the diagnostic value of thrombin generation test. The
test values characterize the velocity and intensity of formation of thrombin, the key hemostasis enzyme.
These data can be used for objective evaluation of hypo- or hypercoagulation status.
Key w o r d s : thrombin generation, endogenous thrombin potential, calibrated automated thrombogram
Тест генерации тромбина представляет собой
лабораторный метод определения динамики образования и инактивации in vitro ключевого фермента гемостаза — тромбина.
Для корреспонденции:
Наместников Юрий Андреевич, аспирант лаб. свертывания крови, ФГУ "Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии" Федерального медико-биологического агентства.
Адрес: 191024, Санкт-Петербург, 2-я Советская ул., д. 16.
Телефон: 8 (812) 717-35-82. E-mail: namestnikov@inbox.ru
32
После активации системы свертывания крови
на поверхности отрицательно заряженных фосфолипидов клеточных мембран запускается сложный
механизм взаимодействий коагуляционных факторов. В результате происходит образование тромбина из его предшественника протромбина. Динамикой и количеством образовавшегося тромбина определяются скорость и интенсивность превращения фибриногена в фибрин, а следовательно, и
всего процесса тромбообразования [1, 2]. Таким
образом, способностью системы свертывания генерировать тромбин в итоге определяется коагуляци-
Гематол. и трансфузиол., 2010, т. 55, № 2
онный потенциал крови. Оценка динамики изменения концентрации тромбина в образце плазмы
дает возможность количественно оценить суммарный эффект от взаимодействия всех факторов системы свертывания и может служить интегральным
показателем состояния гемостаза.
Цель настоящего обзора — обобщение данных
литературы, накопленных к настоящему времени,
о методических особенностях, информативности и
клинической значимости нового инструмента глобальной оценки гемостаза — тесте генерации тромбина.
Тест генерации тромбина впервые был предложен в 1953 г. R. Macfarlane и R. Biggs [3] для оценки
состояния системы свертывания крови у больных,
страдающих гемофилией, и заключался в следующем. Образец цельной венозной крови сразу после
взятия в стеклянную пробирку помещали на водяную баню при температуре 37°С. Затем добавляли
источник тканевого фактора, активировавший
свертывание крови. Одинаковые объемы исследуемого образца через равные промежутки времени
забирали из основной пробирки и переносили в заранее подготовленные пробирки, содержащие раствор высокоочищенного фибриногена. Тромбин,
который успел образоваться в основной пробирке
с момента взятия крови, после переноса превращал
фибриноген в фибрин. Появление фибринового
сгустка оценивали визуально в каждой из серии
пробирок с раствором фибриногена и измеряли с
момента внесения источника тромбина. Генерацию тромбина исследуемого образца рассчитывали
с помощью калибровочного графика, построенного по результатам измерения времени образования
фибринового сгустка высокоочищенным тромбином с известной активностью. Выполнение данной
методики было трудоемким и нестандартизованным. Так, фибрин, образующийся в результате генерации тромбина в основной пробирке, приходилось постоянно удалять деревянной палочкой на
протяжении всего процесса измерения. Показатели
генерации тромбина значительно варьировали изза субъективности оценки конечной точки реакции. Воспроизводимость результатов теста была
низкой.
В последующем группа исследователей Маастрихтского университета под руководством Н. Нетker [4] видоизменила технологию выполнения теста
и разработала автоматизированный метод детекции
генерации тромбина одновременно в нескольких
образцах плазмы крови, что стандартизовало и упростило оценку результатов.
В основе современных методов исследования
генерации тромбина лежит амидолитический
принцип. Для детекции образования тромбина
группой Н. Hemker [5] первоначально был предложен специфический для этого энзима хромогенный субстрат, который расщеплялся медленно и не
обладал высокой степенью аффинности к тромбину. Кроме того, фотометрическая детекция хромогена не позволяла использовать плазму, богатую
тромбоцитами, из-за выраженного влияния последних на оптическую плотность среды. По этой
же причине, как и в клоттинговом методе R. Macfarlane и R. Biggs [3], из реакционной смеси прихо-
дилось постоянно удалять образующийся фибрин,
что значительно усложняло выполнение теста,
вносило в измерение субъективность и в итоге снижало воспроизводимость результатов. Проанализировав недостатки хромогенного субстрата, Н. Hemker [6] предложил использовать специфичный,
медленно реагирующий флюорогенный субстрат —
пептид, меченный 7-амино-4-метилкумарином (ZGly-Gly-Arg-AMC).
С целью автоматизации теста генерации тромбина Н. Hemker [6] использовал планшетный
флюориметр Fluoroskan Ascent ("ThermoFisher
SCIENTIFIC"), оборудованный диспенсером. Согласно этой методике в лунках 96-луночного планшета инкубируется смесь образца исследуемой
плазмы с активатором. В роли последнего выступают рекомбинантный человеческий тканевой
фактор (рчТФ) и отрицательно заряженные фосфолипиды в следующем молярном соотношении:
20% фосфатидилсерина, 20% фосфатидилэтаноламина и 60% фосфатидилхолина. После инкубации
смеси при температуре 37°С для запуска свертывания диспенсер флюориметра автоматически вносит в лунки буфер, содержащий ионизированный
кальций, и флюорогенный субстрат. Генерирующийся тромбин расщепляет субстрат, в результате
чего высвобождается молекула флюорофора. Благодаря наличию в химической структуре флюорофора цепочек чередующихся одинарных и двойных
связей его молекула способна поглощать свет в одном спектральном диапазоне и быстро переизлучать его в другом, более длинноволновом. Это излучение автоматически регистрируется флюориметром через равные промежутки времени. Интенсивность свечения пропорциональна скорости изменения флюоресценции в данный момент времени, а значит, и концентрации образовавшегося
тромбина. На основании измерений посредством
специального программного обеспечения выстраивается кривая генерации тромбина.
Принципиально важным аспектом постановки
и анализа теста генерации тромбина является его
калибровка [7], необходимость которой обусловлена тем, что между активностью тромбина и флюоресцентным сигналом отсутствует прямая линейная зависимость [8]. Это связано с эффектом потребления субстрата и так называемым внутренним
эффектом фильтра, обусловленным перекрыванием областей излучения вновь отщепляющимися
молекулами флюорофора. На результаты измерения значимо влияет и цвет исследуемой плазмы.
Избежать зависимости показателей флюоресценции от цветовых различий также возможно с помощью калибровки [6].
На сегодняшний день существуют два основных
подхода калибровки теста генерации тромбина с
флюорогенным субстратом.
В тесте генерации тромбина "Калиброванная автоматизированная тромбограмма", разработанном
Н. Hemker и соавт. (Calibrated Automated Thrombogram™, "Thrombinoscope") [7], калибровка осуществляется следующим образом. В лунке планшета,
параллельной исследуемой, инкубируется смесь
того же самого образца плазмы, в которую вместо
33
Гематол. и трансфузиол., 2010, т. 55, № 2
Кривая генерации тромбина и измеряемые параметры.
А — время запаздывания — Lag time; В — пиковая концентрация тромбина — Peak
thrombin; С — эндогенный тромбиновый потенциал — ЕТР; D — время достижения
пика — Time to peak/ttPeak.
активатора добавляется калибратор. В роли последнего выступает тромбин-а2-макроглобулин, гидролизующий флюорогенный субстрат с активностью,
выраженной в единицах тромбиновой активности.
Процессы генерации тромбина в образце исследуемой плазмы и калибровка протекают одновременно в соседних лунках одного планшета. Таким образом, генерация тромбина и калибровка осуществляются в одинаковых условиях и в одинаковых образцах плазмы. Как и в методе R. Macfarlane и R.
Biggs [3], сопоставляются результаты измерения генерации тромбина в исследуемой плазме с результатами измерения калибратора. Калибровка, осуществляемая в условиях исследуемого образца
плазмы, позволяет избежать влияния индивидуальных цветовых различий. По данным программ
внешнего и внутреннего контроля качества подобный способ калибровки стандартизует метод и делает его результаты воспроизводимыми [9]. Опубликованные исследования показали приемлемую
воспроизводимость "Калиброванной автоматизированной тромбограммы" с меж- и внутрилабораторным коэффициентами вариации менее 10% как
для богатой, так и для обедненной тромбоцитами
плазмы [6, 10]. По заключению Т. Baglin и соавт.
[8], "Калиброванная автоматизированная тромбограмма" по показателям воспроизводимости является методом, который может быть принят для использования в клинической лабораторной практике.
Другой способ калибровки результатов в тесте
генерации тромбина реализован в методе Technothrombin TGA® ("Technoclone") [9]. Принцип калибровки заключается в сравнении показателей генерации тромбина в исследуемом образце плазмы
с активностью калибратора в серии разведений в
34
стандартном буфере. При этом калибровка выполняется отдельно от измерения генерации тромбина
в исследуемом образце. Коррекция результатов с
учетом потребления субстрата и внутреннего эффекта фильтра при данном подходе к калибровке не
производится. В связи с использованием для калибровки стандартного буфера, всегда отличающегося
по цвету от исследуемых образцов, показатель воспроизводимости результатов теста генерации тромбина при таком калибровочном подходе, по данным
Y. Dargaud и соавт. [11], значительно ниже в сравнении с подходом, предложенным Н. Hemker.
После калибровки результатов теста, которая
производится автоматически путем сопоставления
сигналов, получаемых из лунки с исследуемым образцом и лунки с калибратором, программным
обеспечением выстраивается кривая генерации
тромбина. Для оценки результатов, отражающих
количественные и динамические характеристики
генерации тромбина, используют параметры кривой, представленные на рисунке.
В кривой генерации тромбина оценивают следующие показатели.
Lag time (время запаздывания, мин) — время,
измеренное от момента внесения смеси флюорогенного субстрата и ионизированного кальция в
лунку с образцом и активатором, до момента отклонения флюоресцентного сигнала от основной
горизонтальной линии более чем на 2 стандартных
отклонения. Peak thrombin (пиковая концентрация
тромбина, нмоль/л) — максимальная концентрация тромбина, достигаемая в процессе его генерации в образце. Time to peak/ttPeak (время достижения пика, мин) — время, за которое в образце достигается максимальная концентрация тромбина.
ЕТР (endogenous thrombin potential — эндогенный
тромбиновый потенциал, нмоль • мин) — площадь
под кривой генерации тромбина. Показатель ЕТР
был предложен Н. Hemker [12] для количественного выражения генерации тромбина с учетом его
инактивации.
Применение флюорогенного субстрата и разработка системы калибровки получаемых результатов
позволили использовать следующие виды плазмы в
зависимости от целей проводимого исследования:
богатую и обедненную тромбоцитами, бестромбоцитную и ультрацентрифугированную. По данным
литературы [13], особый интерес представляет использование богатой тромбоцитами плазмы, так
как в этом случае оценивается вклад в генерацию
тромбина не только коагуляционного, но и тромбоцитарного звена гемостаза. Однако использование такого вида плазмы требует проведения исследования в течение 4 ч после взятия крови во избежание активации тромбоцитов, что делает невозможным проведение многоцентровых исследований и осуществление внешнего контроля качества
работы удаленных друг от друга лабораторий. Для
преодоления этих недостатков V. Regnault и соавт.
[14] оценили возможность исследования богатой
тромбоцитами плазмы после цикла замораживания—размораживания. Они сравнили результаты
теста, проведенного с использованием свежей и замороженной плазмы, богатой тромбоцитами. В
сравнении со свежей в замороженной—разморо-
Гематол. и трансфузиол., 2010, т. 55, № 2
женной плазме показатели Lag time и ttPeak были
укорочены, показатели Peak thrombin и ЕТР — увеличены, причем ЕТР — менее значимо, чем Peak
thrombin, — приблизительно на 12%. Поэтому, используя замороженные образцы богатой тромбоцитами плазмы, следует ориентироваться на показатели нормы, полученные на том же виде плазмы.
Это позволяет преодолеть организационные трудности в условиях рутинной работы лаборатории
[14]. Сравнивая результаты теста генерации тромбина, проведенного с бестромбоцитной и ультрацентрифугированной плазмой, можно оценить
вклад в коагуляционный потенциал микрочастиц,
экспонирующих на своей поверхности тканевой
фактор. L. Bidot и соавт. [15] с помощью теста генерации тромбина показали влияние на гемостаз
микрочастиц, выделенных из плазмы больных,
страдающих рецидивирующими тромбозами. Усиление генерации тромбина наблюдалось после добавления микрочастиц в нормальную плазму.
Таким образом, использование различных способов подготовки плазмы для постановки теста генерации тромбина расширяет возможности оценки
гемостаза, но с другой стороны, различия на преаналитическом этапе создают сложности в прямом
сравнении результатов, полученных в разных лабораториях. Отсутствие стандартизации метода на
этапе подготовки плазмы, по мнению J. van Veen и
соавт. [9], является препятствием на пути внедрения теста генерации тромбина в рутинную лабораторную практику.
В качестве активатора, моделирующего физиологические условия запуска свертывания крови и
генерацию тромбина in vivo, используется смесь
рчТФ и отрицательно заряженных фосфолипидов
[6]. Установлено, что концентрация ТФ определяет
чувствительность метода к определенным факторам системы свертывания крови. Французские исследователи под руководством J. Duchemin [16]
оценили влияние различных концентраций ТФ на
чувствительность параметров кривой генерации
тромбина к снижению активности факторов свертывания крови. При низкой концентрации добавляемого в качестве активатора рчТФ на генерацию
тромбина оказывают влияние все факторы, за исключением ФХ1, при высокой — только факторы
так называемого внешнего пути свертывания:
ФУН, ФХ, ФУ, ФИ, Ф1.
Большое значение имеют исследования, в которых изучается зависимость изменений тех или
иных показателей кривой генерации тромбина от
уменьшения или увеличения концентраций различных про- и антикоагулянтов. Так по данным
J. Duchemin и соавт. [16], ЕТР и Peak thrombin находятся в линейной зависимости от концентрации
протромбина и гиперболически увеличиваются с
нарастанием концентраций ФУ и ФУII. Изложенные данные совпадают с результатами, полученными группой М. Giansily-Blaizot [17], оценившей изменения показателей кривой на серии разведений
нормальной плазмы. Исследователи обнаружили
пропорциональное увеличение ЕТР и Peak
thrombin в интервале изменения активности ФУII
от 1 до 10%. В отсутствие ФУШ и Ф1Х ЕТР снижался до 70%, Peak thrombin — до 30% от нормы.
При этом большая чувствительность параметров
наблюдалась при низкой концентрации ТФ
(1 пмоль/л). Уменьшение концентрации фибриногена также приводило к снижению ЕТР и Peak
thrombin и удлинению Lag time [16]. Уменьшение
активности естественного антикоагулянта антитромбина вызывало усиление генерации тромбина.
При этом отмечалось значительное увеличение
ЕТР и Peak thrombin.
В постановке теста с использованием рчТФ и
смеси фосфолипидов в качестве активатора не учитывается вклад системы протеина С в генерацию
тромбина, так как исследуемые образцы не содержат тромбомодулин, который in vivo интегрирован
в мембрану эндотелия. Как известно, система протеина С обеспечивает ингибицию избыточного
тромбинообразования и по направленности действия является антикоагулянтной. Оценка вклада
системы протеина С в генерацию тромбина in vitro
в ряде исследований была произведена добавлением в реакционную смесь кроличьего или рекомбинантного человеческого тромбомодулина или активированного протеина С [18—20]. Благодаря подобной модификации тест становится чувствительным к состоянию системы протеина С и способен
оценить резистентность к активированному протеину С как наследственного, так и приобретенного
характера [21, 22]. Резистентность к активированному протеину С в тесте генерации тромбина
проявляется отсутствием снижения или небольшим снижением показателей ЕТР и Peak thrombin
в ответ на добавление в реакционную смесь тромбомодулина в концентрации, значимо снижающей
эти показатели в контрольной плазме. N. Hezard и
соавт. [22] продемонстрировали чувствительность
теста генерации тромбина с добавлением тромбомодулина к мутациям в генах ФУ (Лейден) и протромбина (G20210A). Тем самым авторы показали,
что тест генерации тромбина представляет собой
многообещающий метод скрининга факторов риска
тромбофилий. С помощью теста генерации
тромбина Y. Dargaud и соавт. [18] определили степень резистентности к активированному протеину
С при различных тромбофилиях. Оказалось, что
при добавлении в реакционную смесь тромбомодулина генерация тромбина снижается неодинаково
при разных формах врожденных и приобретенных
тромбофилий. Наибольшая резистентность к активированному протеину С, по их данным, наблюдается в случае приобретенного дефицита протеина С.
Чуть менее выражена резистентность при сочетании мутаций в генах ФУ (Лейден) и протромбина
(G20210A). Менее выражена резистентность в случае изолированного носительства вышеуказанных
мутаций и дефицита протеина S. Резистентность к
активированному протеину С была обнаружена
также у пациентов с изолированным повышением
активности ФУШ выше 150%. Рядом других исследователей [23—25] были подтверждены результаты
Y. Dargaud в тесте генерации тромбина у пациентов
с мутацией в гене ФУ (Лейден), дефицитом протеинов С и S, а также с высокими уровнями ФУШ.
Модификация теста добавлением тромбомодулина в качестве модулятора позволила выявить ряд
приобретенных форм резистентности к активиро35
Гематол. и трансфузиол., 2010, т. 55, № 2
ванному протеину С (АРС-резистентность). Так,
при исследовании генерации тромбина с тромбомодулином было показано, что в присутствии волчаночного антикоагулянта показатель Lag time удлинялся, ЕТР и Peak thrombin были повышены, что
свидетельствовало о наличии АРС-резистентности
[26]. S. Tchaikovski и соавт. [21] отмечали развитие
АРС-резистентности у женщин, принимающих
гормональные контрацептивы. Сравнив влияние
на гемостаз препаратов 2-го и 3-го поколений с помощью теста генерации тромбина, авторы пришли
к выводу о большей тромбогенной опасности гормональных контрацептивов 3-го поколения.
Большое количество публикаций посвящено
изучению клинической значимости теста генерации тромбина в диагностике геморрагических и
протромботических состояний.
Наиболее изученным заболеванием, при котором тест генерации тромбина показал свою информативность, является гемофилия. Прежде всего
была установлена выраженная корреляция активности OVIII и Ф1Х с показателями кривой генерации тромбина [3, 27]. При значительном снижении
активности этих факторов показатель Lag time удлинен, показатели ЕТР и Peak thrombin снижены.
Эти данные легли в основу предложения об использовании теста для оценки степени тяжести состояния больных гемофилией [28—30]. По мнению
ряда авторов, применение теста генерации тромбина также дает более полное представление о влиянии вводимых препаратов на гемостаз по сравнению с определением изменений активности отдельных факторов свертывания [29—31]. Тест генерации тромбина, в частности, был применен для
мониторинга терапии препаратом рекомбинантного OVIIa у больных гемофилией. Было продемонстрировано дозозависимое влияние препарата на
показатели кривой генерации тромбина и установлено, что для нормализации пиковой концентрации тромбина требуется большее количество препарата, чем рекомендовано в настоящее время клиническими руководствами [32—34].
В литературе имеются данные о клинической
значимости теста генерации тромбина в диагностике тромбоцитопатий и приобретенных коагулопатий. Так, L. Rugeri и соавт. [35] наблюдали снижение ЕТР и Peak thrombin и удлинение Lag time в
тесте генерации тромбина при обследовании 53 пациентов, страдающих болезнью Виллебранда. Эти
нарушения отмечались как в плазме, богатой тромбоцитами, так и в обедненной тромбоцитами плазме. Генерация тромбина у обследованных больных
зависела от уровня OVIII, что отражалось на пиковой концентрации тромбина в образце, и коррелировала с клинической картиной, оцениваемой по
шкале кровоточивости.
Замедление генерации тромбина было продемонстрировано в богатой тромбоцитами плазме
больных синдромом Бернара—Сулье и тромбастенией Гланцманна, что подтверждает значимость
метода для оценки гемостаза при тромбоцитопатиях [36, 37]. С помощью теста генерации тромбина
S. Cauwenberghs и соавт. [38] оценили эффективность гемокомпонентной терапии, показав, что генерация тромбина усиливается после трансфузии
36
тромбоцитной массы у больных с тромбоцитопенией, индуцированной химиотерапией.
Применение теста генерации тромбина при обследовании больных, страдающих приобретенными коагулопатиями, позволило открыть новые стороны патогенеза кровоточивости. Так, было показано, что у больных циррозом печени более значимым фактором, влияющим на генерацию тромбина, было количество тромбоцитов, нежели концентрация коагуляционных факторов [39]. У больных
сепсисассоциированной коагулопатией, несмотря
на замедление активации свертывания, выявляемой традиционными методами, параметры кривых
генерации тромбина были нормальными или даже
повышенными, что отражает факт наличия у них
тромбинемии [40].
Тест генерации тромбина как способ глобальной оценки гемостаза в целом активно изучается в
настоящее время в отношении возможности его
использования для мониторинга антитромботической терапии [41]. Актуальность вопроса адекватного мониторинга антитромботической терапии
обусловлена ростом числа пациентов, которым показана терапия препаратами различного механизма
действия.
Мониторингу терапии непрямыми антикоагулянтами посвящены исследования С. Jackson и соавт. [42]. С помощью теста генерации тромбина
они установили, что ЕТР отрицательно коррелирует
со значениями международного нормализованного
отношения (MHO) при мониторинге терапии
варфарином. Важной находкой, по результатам исследования A. Gatt и соавт. [43], явилось наблюдение значительной вариабельности значений ЕТР у
пациентов с одинаковыми значениями MHO. Это
позволило предположить, что адекватность дозы
варфарина у отдельных больных может быть определена с помощью теста генерации тромбина: снижение ЕТР на фоне терапевтических значений
MHO, по мнению авторов, следует расценивать как
результат избыточной дозы препарата, и наоборот.
Тест генерации тромбина показал чувствительность в оценке влияния, оказываемого на гемостаз
нефракционированным гепарином [44], низкомолекулярными гепаринами [45, 46] и данапароидом
[47]. Действие препаратов проявлялось удлинением Lag time и снижением Peak thrombin и ЕТР.
Были изучены возможности теста генерации
тромбина и в мониторинге эффекта антитромбоцитарных препаратов. Эти сведения представляют
большую ценность, поскольку клиническая практика до сих пор не располагает методами оценки
действия препаратов данной группы. Для определения влияния антитромбоцитарных препаратов
тест проводили с богатой тромбоцитами плазмой.
Изучали действие аспирина, клопидогреля и антагониста гликопротеина ПЬ/IIIa — абсиксимаба на
параметры генерации тромбина [48, 49]. Исследования показали, что у пациентов, принимающих
аспирин или клопидогрель, наблюдалось удлинение Lag time и ttPeak, при этом влияния препаратов
на ЕТР не отмечено. Чувствительность теста к воздействию антитромбоцитарных препаратов и антикоагулянтов открывает возможность мониторинга
комбинированной антитромбоцитарной, антикоа-
Гематол. и трансфузиол., 2010, т. 55, № 2
гулянтной, а также сочетанной антитромбоцитарной и антикоагулянтной терапии. В настоящее время многими авторами отмечается актуальность
этой проблемы из-за частого сочетания двух или
более препаратов в терапии больных с кардиологической и неврологической патологией.
Тест генерации тромбина активно изучается и в
качестве метода лабораторной оценки протромботических состояний [18]. Показатели кривой генерации тромбина были оценены у больных венозным тромбоэмболизмом в анамнезе. Наблюдалось
статистически значимое увеличение ЕТР и Peak
thrombin даже при исключении из группы больных,
у которых были выявлены мутации OV {Лейден) и
протромбина (G20210A). Это наблюдение свидетельствует о чувствительности метода при клинических состояниях, ассоциированных с повышенным риском тромбообразования.
Актуальной в настоящее время является проблема принятия решения об отмене антикоагулянтов
при проведении курса профилактики рецидивирующего тромбоэмболизма. После окончания 6месячного курса приема антикоагулянтов почти у
19% больных в последующие 2 года развиваются
рецидивы венозного тромбоэмболизма [50]. Наличие различных генетических и приобретенных
факторов, предрасполагающих к венозному тромбоэмболизму, выявленных после первого эпизода,
слабо коррелирует с частотой рецидивирования заболевания в дальнейшем [51].
Для оценки степени риска развития рецидива
тромбоза исследовали в динамике активированное
парциальное тромбопластиновое время (АПТВ) и
уровень D-димера. По данным С. Legnani и соавт.
[52], частота рецидивов венозных тромбозов в
группе с индексом АПТВ не выше 0,9 составила
17,5%, в то время как в группе с индексом АПТВ
выше 1,05 составила 7,5%. Авторы не выявили зависимости показателей АПТВ от врожденных
тромбофилии. Опубликованы результаты нескольких исследований, в которых была оценена прогностическая значимость уровня D-димера в среднем через 1 мес после отмены антикоагулянтов в
принятии решения о продолжительности терапии
этими препаратами [53—55]. Метаанализ результатов 4 исследований выявил следующее. Среди пациентов с повышенным уровнем D-димера рецидив тромбоза развивался у 16,6% больных, с нормальным уровнем D-димера — у 7,2% больных [56].
Несмотря на статистически более низкую степень
риска рецидивов тромбоза в группе с индексом
АПТВ выше 1,05 и группе с нормальным уровнем
D-димера, в 7,5 и в 7,2% случаев соответственно у
больных развился рецидив венозного тромбоза.
Это свидетельствует о том, что использование данных тестов не полностью отражает степень опасности тромбообразования. Для индивидуальной характеристики риска рецидивирования М. Besser и
соавт. [26] был применен тест генерации тромбина,
с помощью которого был оценен кумулятивный
эффект протромботических факторов в период после отмены антикоагулянтов. Исследователи обнаружили, что у больных с высоким ЕТР частота рецидивов венозного тромбоза с невыявленными
провоцирующими факторами была значительно
выше, чем у больных с низким ЕТР. При этом не
отмечено корреляции высоких значений ЕТР с выявлением D-димера: у 30% больных с высоким ЕТР
D-димер не обнаруживался, в то время как у 65%
больных с низким ЕТР уровень D-димера повышен.
Чувствительность теста генерации тромбина к
выявлению гиперкоагуляции была изучена отечественными исследователями [57, 58]. Было показано, что с помощью теста генерации тромбина гиперкоагуляция выявлялась у 53% больных сепсисом по сравнению с 13% при использовании тромбоэластографии и 16% при оценке АПТВ [57].
Представленные авторами данные подтвердили
большую чувствительность теста генерации тромбина к активации свертывания крови.
Резюмируя вышеизложенное, можно сделать
вывод о том, что тест генерации тромбина, в отличие от других методов исследования гемостаза характеризует динамику образования тромбина. Известно, что генерация тромбина зависит от целого
ряда составляющих, в том числе от кровяных пластинок, естественных антикоагулянтов, плазменных факторов, и соответственно отражает состояние системы свертывания крови в целом. Недостатком метода следует считать вариабельность результатов исследования, которая в значительной
степени обусловлена отсутствием стандартизации
преаналитического этапа.
Таким образом, тест генерации тромбина можно
считать интегральным показателем состояния системы свертывания крови. Наиболее физиологичными условиями постановки теста являются: использование богатой тромбоцитами плазмы и добавление в качестве активатора свертывания смеси
рекомбинантного тканевого фактора, отрицательно заряженных фосфолипидов и тромбомодулина.
На сегодняшний день большинством авторов признается необходимость стандартизации методики
постановки теста генерации тромбина и проведения больших многоцентровых исследований для
принятия окончательного решения о клинической
значимости метода. Только такие исследования позволят определить показания для использования
теста генерации тромбина в рутинной клинической
практике.
ЛИТЕРАТУРА
1. Hemker H. С, Beguin S. Thrombin generation in plasma: its as
sessment via the endogenous thrombin potential. Thromb. Haemost. 1995; 74(5): 134-138.
2. Baglin T. The measurement and application of thrombin gen
eration. Br. J. Haematol. 2005; 130: 653-661.
3. Macfarlane R. G, Biggs R. A thrombin generation test: the ap
plication in haemophilia and thrombocytopenia. J. Clin. Pathol.
1953; 6: 3-8.
4. Hemker H. C, Giesen P. L., Ramjee M. et al. The thrombogram:
monitoring thrombin generation in platelet-rich plasma.
Thromb. Haemost. 2000; 83(4): 589—591.
5. Hemker H. C, Wielders S., Kessels H. et al. Continuous regis
tration of thrombin generation in plasma, its use for the deter
mination of the thrombin potential. Thromb. Haemost. 1993;
70(4): 617-624.
6. Hemker H. C, Giesen P., Al Dieri R. et al. Calibrated automated
thrombin generation measurement in clotting plasma. Pathophysiol. Haemost. Thromb. 2003; 33: 4-15.
7. De Smedt E., Al Dieri R., Spronk H. M. et al. The technique of
measuring thrombin generation with fluorogenic substrates:
37
Гематол. и трансфузиол., 2010, т. 55, № 2
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
38
1. Necessity of adequate calibration. Thromb. Haemost. 2008;
100(2): 343-349.
Baglin T. The measurement and application of thrombin gen
eration. Br. J. Haematol. 2005; 130: 653-661.
Van Veen J. J., Gatt A., Makris M. Thrombin generation testing
in routine clinical practice: are we there yet? Br. J. Haematol.
2008; 142(6): 889-903.
Gerotziafas G. Т., Depasse F., Busson J. et al. Towards a stand
ardization of thrombin generation assessment: the influence of
tissue factor, platelets and phospholipids concentration on the
normal values of thrombogram—thrombinoscope assay.
Thromb. J. 2005; 3: 16.
Dargaud Y., Luddington R., Gray E. et al. Effect of standardiza
tion and normalization on imprecision of calibrated automated
thrombography: an international multicentre study. Br. J. Hae
matol. 2007; 139(2): 303-309.
Hemker H. C, Willems G. M., Beguin S. A computer assisted
method to obtain the prothrombin activation velocity in whole
plasma independent of thrombin decay processes. Thromb.
Haemost. 1986; 56(1): 9-17.
Garcia-Hejl C, Vest P., Renard C. et al. Reliability of thrombin
generation assay on frozen-thawed platelet-rich plasma: a reply.
Clin. Chem. 2006; 11: 52.
Regnault V., Beguin S., Lecompte T. Calibrated automated
thrombin generation in frozen-thawed platelet-rich plasma to
detect hypercoagulability. Pathophysiol. Haemost. Thromb.
2003; 33: 25-31.
Bidot L., Jy W., Bidot С Jr. et al. Microparticle-mediated
thrombin generation assay: increased activity in patients with re
current thrombosis. J. Thromb. Haemost. 2008; 6(6): 913—919.
Duchemin J., Pan-Petesch В., Arnaud B. et al. Influence of co
agulation factors and tissue factor concentration on the
thrombin generation test in plasma. Thromb. Haemost. 2008;
99(4): 767-773.
Giansily-Blaizot M., Al Dieri R., Schved J. F. Thrombin gener
ation measurement in factor Vll-depleted plasmas compared to
inherited factor VH-deficient plasmas. Pathophysiol. Haemost.
Thromb. 2003; 33: 38-44.
Dargaud Y, Trzeciak M. C, Bordet J. С et al. Use of calibrated
automated thrombinography +/- thrombomodulin to recognize
the prothrombotic phenotype. Thromb. Haemost. 2006; 96(5):
562-567.
Tripodi A., Martinelli I., Chantarangkul V. et al. The endogenous
thrombin potential and the risk of venous thromboembolism.
Thromb. Res. 2007; 121: 353-359.
Liesel S., Sandset P. M., Mowinckel M. C, Wisloff F. Activated
protein С resistance determined with a thrombin generationbased test is associated with thrombotic events in patients with
lupus anticoagulants. J. Thromb. Haemost. 2007; 5(11): 2204—
2210.
Tchaikovski S., Huib A. A., van Vliet M. et al. Effect of oral con
traceptives on thrombin generation measured via calibrated au
tomated thrombography. Thromb. Haemost. 2007; 98(6):
1350-1356.
Hazard N., Bouaziz-Borgi L., Remy M. G., Nguyen P. Utility of
thrombin-generation assay in the screening of factor V G1691A
(Leiden) and prothrombin G20210A mutations and protein S
deficiency. Clin. Chem. 2006; 52(4): 665-670.
Regnault V., Beguin S., Wahl D. et al. Thrombinography shows
acquired resistance to activated protein С in patients with lupus
anticoagulants. Thromb. Haemost. 2003; 89(2): 208—212.
Eilertsen A. L., Liestol S., Mowinckel M. C. et al. Differential
impact of conventional and low-dose oral hormone therapy
(HT), tibolone and raloxifene on functionality of the activated
protein С system. Thromb. Haemost. 2007; 97(6): 938—943.
Lecompte Т., Wahl D., Perret-Guillaume C. et al. Hypercoagu
lability resulting from opposite effects of lupus anticoagulants is
associated strongly with thrombotic risk. Haematologica 2007;
92: 714-715.
Besser M., Baglin C, Luddington R. et al. High rate of unpro
voked recurrent venous thrombosis is associated with high
thrombin-generating potential in a prospective cohort study. J.
Thromb. Haemost. 2008; 6(10): 1720-1725.
Chantarangkul V., Clerici M., Bressi С et al. Thrombin gener
ation assessed as endogenous thrombin potential in patients with
hyper- or hypo-coagulability. Haematologica 2003; 88: 547—
554.
Beltran-Miranda С P., Khan A., Jaloma-Cruz A. R. et al.
Thrombin generation and phenotypic correlation in haemo
philia A. Haemophilia 2005; 11: 326—334.
29. Dargaud Y, Beguin S., Lienhart A. et al. Evaluation of thrombin
generating capacity in plasma from patients with haemophilia
A and B. Thromb. Haemost. 2005; 93(3): 475-480.
30. Siegemund Т., Petros S., Siegemund A. et al. Thrombin genera
tion in severe haemophilia A and B: the endogenous thrombin
potential in platelet-rich plasma. Thromb. Haemost. 2003;
90(5): 781-786.
31. Varadi K., Negrier C, Berntorp E. et al. Monitoring the bioavailability of FEIBA with a thrombin generation assay. J.
Thromb. Haemost. 2003; 1(11): 2374-2380.
32. Kjalke M., Ezban M., Monroe D. M. et al. High-dose factor Vila
increases initial thrombin generation and mediates faster platelet
activation in thrombocytopenia-like conditions in a cell-based
model system. Br. J. Haematol. 2001; 114(1): 114-120.
33. Gerotziafas G. Т., Depasse F., Chakroun T. et al. Recombinant
factor Vila partially reverses the inhibitory effect of fondaparinux on thrombin generation after tissue factor activation in
platelet rich plasma and whole blood. Thromb. Haemost. 2004;
91(3): 531-537.
34. Allen G. A., Hoffman M., Roberts H. R. et al. Manipulation of
prothrombin concentration improves response to high-dose fac
tor Vila in a cell-based model of haemophilia. Br. J. Haematol.
2006; 134: 314-319.
35. Rugeri L., Beguin S., Hemker H. С et al. Thrombin-generating
capacity in patients with von Willebrand's disease. Haematolog
ica 2007; 92: 1639-1646.
36. Reverter J. C, Beguin S., Kessels H. et al. Inhibition of plateletmediated, tissue factor-induced thrombin generation by the
mouse/human chimeric 7E3 antibody. Potential implications
for the effect of c7E3 Fab treatment on acute thrombosis and
"clinical restenosis". J. Clin. Invest. 1996; 98(3): 863-874.
37. Beguin S., Keularts I., Al Dieri R. et al. Fibrin polymerization is
crucial for thrombin generation in platelet-rich plasma in a
VWF-GPIb-dependent process, defective in Bernard-Soulier
syndrome. J. Thromb. Haemost. 2004; 2(1): 170-176.
38. Cauwenberghs S., Feijge M. A., Theunissen E. et al. Novel meth
odology for assessment of prophylactic platelet transfusion ther
apy by measuring increased thrombus formation and thrombin
generation. Br. J. Haematol. 2007; 136: 480-490.
39. Tripodi A., Primignani M., Chantarangkul V. et al. Thrombin
generation in patients with cirrhosis: the role of platelets. Hepatology 2006; 44: 440-445.
40. Collins P. W., Macchiavello L. I., Lewis S. J. et al. Global tests
of haemostasis in critically ill patients with severe sepsis syn
drome compared to controls. Br. J. Haematol. 2006; 135: 220—
227.
41. Altman R., Scazziota A., Herrera L., Gonzalez C. Relationship
between thrombin generation and international normalized ra
tio in patients receiving oral vitamin К antagonist therapy. J.
Thromb. Haemost. 2007; 5(7): 1552-1569.
42. Jackson C. M., EsnoufM. P., Lindahl T. L. A critical evaluation
of the prothrombin time for monitoring oral anticoagulant ther
apy. Pathophysiol. Haemost. Thromb. 2003; 33: 43—51.
43. Gatt A., van Veen J. J., Bowyer A. et al. Significant variation in
thrombin generation potential in "adequately" anticoagulated
patients. XXI-st Congress of the international society on haemo
stasis and thrombosis 2007, Geneva, Switzerland, P-M-097.
44. Al Dieri R., Alban S., Beguin S. et al. Thrombin generation for
the control of heparin treatment, comparison with the activated
partial thromboplastin time. J. Thromb. Haemost. 2004; 2(8):
1395-1401.
45. Al Dieri R., Alban S., Beguin S., Hemker H. C. Fixed dosage of
low-molecular-weight heparins causes large individual variation
in coagulability, only partly correlated to body weight. J.
Thromb. Haemost. 2006; 4(1): 83-89.
46. Gerotziafas G. Т., Petropoulou A. D., Verdy E. et al. Effect of the
anti-factor Xa and anti-factor Ha activities of low-molecularweight heparins upon the phases of thrombin generation. J.
Thromb. Haemost. 2007; 5(5): 955-962.
47. StiefT. W. Inhibition of thrombin generation in recalcified plas
ma. Blood Coagul. Fibrinolyt. 2007; 18: 751-760.
48. Altman R., Scazziota A., Santoro S. et al. Abciximab does not
inhibit the increase of thrombin generation produced in plateletrich plasma in vitro by sodium arachidonate or tissue factor.
Clin. Appl. Thromb. Hemost. 2005; 11: 271-277.
49. Altman R., Scazziota A., De Lourdes Herrera M. et al. Recom
binant factor Vila reverses the inhibitory effect of aspirin or as
pirin plus clopidogrel on in vitro thrombin generation. J.
Thromb. Haemost. 2006; 4(9): 2022-2027.
50. Baglin Т., Luddington R., Brown K. et al. Incidence of recurrent
venous thromboembolism in relation to clinical and throm-
Гематол. и трансфузиол., 2010, т. 55, № 2
51.
52.
53.
54.
bophilic risk factors: prospective cohort study. Lancet 2003; 362:
523-526.
Christiansen S. C, Cannegieter S. C, Koster T. et al. Thrombophilia, clinical factors, and recurrent venous thrombotic
events. J. A. M. A. 2005; 293: 2352-2361.
Legnani C, Mattarozzi S-, Cini M. et al. Abnormally short ac
tivated partial thromboplastin time values are associated with in
creased risk of recurrence of venous thromboembolism after oral
anticoagulation withdrawal. Br. J. Haematol. 2006; 134: 227—
232.
Eichinger S., Minar E., Bialonezyk С et al. D-dimer levels and
risk of recurrent venous thromboembolism. J. A. M. A. 2003;
290: 1071-1074.
Palareti G., Cosmi В., Legnani С et al. D-dimer testing to de
termine the duration of anticoagulation therapy. N. Engl. J.
Med. 2006; 355(17): 1780-1789.
55. Baglin Т., Palmer C. R., Luddington R., Baglin С Unprovoked
recurrent venous thrombosis: prediction by D-dimer and clini
cal risk factors. J. Thromb. Haemost. 2008; 6(4): 577-582.
56. Bruinstroop E., Klok F. A., Van de Ree M. A. et al. Elevated Ddimer levels predict recurrence in patients with idiopathic ve
nous thromboembolism: a meta-analysis. J. Thromb. Haemost.
2009; 7(4): 611-618.
57. Кречетова А. В., Синауридзе Е. И., Васильев С. А. и др. Ак
тивация свертывания крови в первые сутки сепсиса. Ма
териалы конференции "Клиническая гемостазиология и
гемореология в сердечно-сосудистой хирургии", Москва;
2009: 258-259.
58. Синауридзе Е. И., Горбатенко А. С, Грибкова И. В. и др. Ги
перкоагуляция, вызванная разбавлением плазмы искусст
венными плазмозамещающими растворами. Технологии
живых систем 2008; 5(1): 3—14.
Поступила 22.09.09
© Н. В. ЗУБКОВА, 2010
УДК 615.45:547.962.4].012.6
СОЛЬВЕНТ-ДЕТЕРГЕНТНЫЙ МЕТОД ИНАКТИВАЦИИ ВИРУСОВ В ТЕХНОЛОГИИ
ПРОИЗВОДСТВА ИММУНОГЛОБУЛИНОВ
Н. В. Зубкова
Филиал «Нижегородское предприятие по производству бактерийных препаратов "ИмБио"» Федерального
государственного унитарного предприятия «НПО по медицинским иммунобиологическим препаратам
"Микроген" Минздрава РФ"», Нижний Новгород
Резюме. В обзоре литературы охарактеризованы различные варианты сольвент-детергентной
(СД) обработки препаратов иммуноглобулинов, включающие использование три-М-бутилфосфата в
комбинации с одним из детергентов, например натрия холатом, твином-80 (полисорбат), тритоном
Х-100 или Х-45 (октоксинол). Описаны технологические приемы проведения процедуры и способы очистки от примесей. Обоснованы допустимые остаточные количества используемых реагентов в готовых
лекарственных формах. Представлены этапы валидации процесса СД-обработки и методы определения вирусной редукции. Продемонстрировано, что безопасность СД-обработанных препаратов обеспечивается, с одной стороны, за счет инактивации покрытых оболочкой вирусов, с другой — за счет
сохранения биологических свойств препаратов и активности специфических антител.
препараты иммуноглобулинов, сольвент-детергентная обработка,
Ключевые слова
хроматографическая очистка, редукция вирусов
SOLVENT/DETERGENT METHOD FOR VIRUS INACTIVATION IN THE IMMUNOGLOBULIN PRODUCTION
TECHNOLOGY
N. V. Zubkova
"ImBio" Affiliated Department of Nizhny Novgorod Firm for Bacterial Preparation Manufacture, Microgen Firm for
Medical Immunobiological Preparations, Nizhny Novgorod
Summary. This review of literature presents the characteristics of various solvent/detergent (SD)
methods for the treatment of immunoglobulin preparations, including the use of tri-N-butylphosphate in
combination with a detergent - for example, sodium cholate, Twin-80 (polysorbate), Triton X-100 or X-45
(octoxynol). Technology of the removing of the mixtures is described. Permissible residual levels of the
reagents in ready dosage forms are substantiated. Stages of validation of the SD processing and methods for evaluating the virus reduction are presented. It is shown that the safety of SD processed preparations is provided by inactivation of enveloped viruses and by sparing the biological characteristics of
the preparations and activities of specific antibodies.
Key w o r d s : immunoglobulin preparations, solvent/detergent processing, chromatographic purification, virus reduction
Качество лечебных препаратов иммуноглобулинов
определяют три основных параметра: терапевтичеДля корреспонденции:
Зубкова Наталия Васильевна, канд. биол. наук, нач. цеха диагностических препаратов филиала «Нижегородское предприятие
по производству бактерийных препаратов "ИмБио"» Федерального государственного унитарного предприятия «НПО по медицинским иммунобиологическим препаратам "Микроген"
Минздрава РФ"».
Адрес: 603000, Нижний Новгород, ул. Грузинская, д. 44.
Телефон: (831) 296-91-16 доб. 2230. E-mail:
zubkova@imbio.ru
екая эффективность, клиническая переносимость и вирусная безопасность. Разработка нового поколения нативных форм иммуноглобулинов обострила проблему вирусной безопасности
препаратов. Технологические изменения, часто
недостаточно обоснованные, привели к тому,
что в середине 90-х годов прошлого века фирма
"Бакстер" объявила об отзыве внутривенного иммуноглобулина с мирового рынка в связи с инфицированием пациентов вирусом гепатита С
(ВГС) [1, 2].
39