влияние альфа-1-кислого гликопротеина на состояние

Известия Челябинского научного центра, вып. 1 (35), 2007
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ
УДК 616.61-008.64-005.1-08
ВЛИЯНИЕ АЛЬФА-1-КИСЛОГО ГЛИКОПРОТЕИНА НА СОСТОЯНИЕ
КЛЕТОЧНОГО ЗВЕНА ГЕМОСТАЗА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ
ПОЧЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ
М.В. Осиков
e-mail: [email protected]
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования
«Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства
по здравоохранению и социальному развитию», г. Челябинск, Россия
Введение
У больных с уремией при почечной недостаточности различной степени тяжести и остроты
течения имеются нарушения в системе гемостаза [1]. По мнению ряда исследователей, основополагающая роль в механизме нарушений гемостаза при уремии отводится первичному звену — дисфункции тромбоцитов [2—5]. Показано, что при почечной недостаточности изменяется
концентрация реактантов острой фазы в сыворотке, что может быть связано с их определенной
ролью при этой патологии [6—9]. Кроме того, есть данные об эффектах РОФ на систему гемостаза в физиологических условиях и при экспериментальной патологии [10—12]. В связи с этим
определенный интерес вызывает возможность применения фармакологических препаратов на
основе реактантов острой фазы, в частности альфа-1-кислого гликопротеина (КГП), для коррекции нарушений гемостаза при уремии. КГП — гликопротеин плазмы крови с молекулярной массой 44100 Д [13]. КГП входит в группу реактантов острой фазы и его содержание в крови при
патологии увеличивается в 2 – 4 раза [14]. Интерес к КГП обусловлен широким спектром функциональной активности и низкой токсичностью белка [15, 16, 17].
Цель работы — исследовать влияние альфа-1-кислого гликопротеина на функциональное
состояние тромбоцитов при экспериментальной почечной недостаточности.
1. Методика исследования
Работа выполнена на 67 нелинейных крысах-самцах массой 220—240 г. Все манипуляции
с экспериментальными животными выполнялись в соответствии с положениями Хельсинской
декларации о гуманном отношении к животным, методическими рекомендациями по их выведению из опыта и эвтаназии. Экспериментальные животные были случайным образом разделены
на 3 группы: 1 группа — интактные животные, 2 группа — животные с острой почечной недостаточностью (ОПН), 3 группа — животные, которым на фоне ОПН вводили КГП (ОПН+КГП). Самок
в эксперимент не включали, так как показатели системы гемостаза у них весьма вариабельны
и зависят от фазы овариального цикла [18]. ОПН индуцировали подкожным введением в межлопаточную область водного 10 % (масса/объем) раствора хлорида ртути (II) (сулемы) в дозе 5 мг/кг. Модель ОПН как результат сулемового нефроза широко используется в эксперименте [19]. ОПН верифицировали морфологическими и биохимическими методами. Критериями
развития ОПН служили некроз клеток канальцев нефрона и статистически значимое увеличение содержания креатинина и мочевины в сыворотке. Исследования проводили на 5 сутки эксперимента — во время наиболее выраженных изменений в почечной ткани и уровня уремических токсинов в сыворотке. КГП в форме препарата «Орозин» (Челябинская областная станция
переливания крови, Челябинск) применяли у животных 3-ей группы в дозе 150 мг/кг трижды: на
184
М.В. Осиков
1, 2 и 4 сутки эксперимента в связи с данными о периоде полувыведения препарата [20]. Суммарная доза введенного КГП составила 450 мг/кг. Животным 2 группы вводили эквивалентное
количество физиологического раствора. Кровь получали у наркотизированных (диэтиловый
эфир) крыс пункцией сердца при стабилизации 3,8 % (масса/объем) раствором цитрата натрия
на фосфатном буфере (рН = 7,4) в соотношении 1:5 [21].
Количество тромбоцитов в периферической крови определяли общепринятым меланжерным методом путем световой микроскопии в камере Горяева [22], для окраски тромбоцитов использовали краситель метиленовый синий по [23]. Адгезивную способность тромбоцитов исследовали оригинальным методом по их способности прилипать к эндотелию сосудистой
стенки. Для этого у наркотизированной крысы пропускали через участок аорты определенной
площади фиксированный объем аутологичной крови с известным количеством тромбоцитов под
постоянным давлением 100 мм. рт. ст. при температуре 37о С и подсчитывали количество клеток на выходе с определением % адгезии тромбоцитов. Агрегацию тромбоцитов исследовали
турбидиметрическим методом в аутологичной плазме с концентрацией клеток 300⋅109/л при
температуре 37°С по [24]. Для индукции агрегации тромбоцитов применяли раствор АДФ в конечной концентрации 7⋅10-6 М. Регистрировали максимальную амплитуду (МА, %), время агрегации (ВА, мин), скорость агрегации (СА, %/мин) и аналогичные показатели для 1-й и 2-й волн
агрегатограммы. Дополнительно оценивали активность тромбоцитарного фактора P3 по [25].
Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета прикладных
программ «Statistica v. 6.0 for Windows» [26, 27]. Для описания результатов использовали Мсреднее значение признака, s-среднее квадратичное отклонение, характеристику выборки
представляли в формате М (s). Для анализа вида распределения данных применяли критерий
Шапиро-Уилка. Проверку статистических гипотез в группах проводили в зависимости от вида
распределения, используя параметрические (t-критерий Стьюдента, F-точный критерий Фишера) и непараметрические (U — критерий Манна-Уитни и WW - критерий Вальда-Вольфовитца)
критерии. Отличия считали статистически значимыми при р<0,05.
2. Результаты и обсуждение
На 5 сутки эксперимента выживаемость крыс с ОПН составила 60%. Развитие синдрома
ОПН у экспериментальных животных не сопровождалось статистически значимым изменением
количества тромбоцитов в периферической крови (рисунок 1).
1200
1150
Тромбоциты, •109/л
1100
1050
1000
950
900
850
800
Mean
±SD
интактные
ОПН
ОПН+КГП
Рис. 1. Влияние КГП на количество тромбоцитов в периферической крови
при острой почечной недостаточности
Влияние альфа-1 кислого гликопротеина на состояние клеточного звена гемостаза
185
При ОПН у крыс зафиксирована дисфункция тромбоцитов, выражающаяся в нарушении адгезивной и агрегационной способности клеток. Установлено снижение адгезии тромбоцитов
к эндотелиальной выстилке сосуда (табл. 1). Депрессия адгезии тромбоцитов к эндотелию при
ОПН может быть связана с нарушением функциональной активности тромбоцитов и/или эндотелиальных клеток. Для ответа на поставленный вопрос исследовали, во-первых, адгезивную
способность уремических тромбоцитов по отношению к интактному эндотелию, во-вторых, адгезию интактных тромбоцитов к уремическому эндотелию. Показано, что изменение адгезии
тромбоцитов при ОПН детерминировано изменением функциональной активности эндотелиоцитов, а не тромбоцитов.
Таблица 1
Влияние КГП на а дгез и ю тром боц и тов к эндоте лию п р и О ПН (% а д гез ии ; M (s))
Группа 1
Группа 2
Группа 3
интактные
ОПН
ОПН+КГП
n = 10
n=6
n=5
уремические тромбоциты → уремический эндотелий
28,20 (8,39)
25,15 (5,84)
26,27 (2,49)
р1-2=0,013 (WW)
уремические тромбоциты → интактный эндотелий
28,51 (7,67)
31,86 (5,13)
27,96 (6,49)
интактные тромбоциты → уремический эндотелий
29,41 (6,23)
25,87 (3,71)
25,66 (3,96)
р1-2=0,049 (WW)
Примечание. Здесь и далее р — показатель различия между группами по t-критерию (U-критерию Манна-Уитни,
WW-критерию Вальда-Вольфовитца), подчеркиванием отмечены выборки, имеющие неправильное распределение
данных.
В момент манифестации ОПН интегральный показатель агрегации тромбоцитов — скорость
процесса — уменьшался за счет 1-ой и 2-ой волн агрегации, то есть способности клеток к агрегации на внешний стимул (АДФ) и собственной проагрегантной активности, проявляющейся
в ходе реакции высвобождения тромбоцитов (табл. 2). В пользу последнего факта свидетельствует снижение активности тромбоцитарного фактора Р3. Полученные данные согласуются
с результатами других исследователей гемостаза при почечной недостаточности. Показано
[28], что дисфункция тромбоцитов при уремии связана с конформационными перестройками
гликопротеина IIb-IIIa, что приводит к нарушению связывания тромбоцитов с фибриногеном
и тромбоспондином и высвобождению содержимого альфа-гранул, то есть процессов, опосредующих агрегацию клеток. Установлено [29], что адгезия тромбоцитов уремических больных
к субэндотелиальному матриксу снижается за счет дисфункции тромбоцитов, контактирующих
с уремической плазмой. Однако, авторы не уделили внимания исследованию адгезивной способности самого эндотелиального матрикса при уремическом состоянии. Итак, при ОПН отмечено нарушение функционального состояния тромбоцитов и эндотелиальной стенки, что выражалось в депрессии адгезивной и агрегационной способности тромбоцитов.
Применение КГП достоверно повышало выживаемость крыс при ОПН (83% против 60 %
в группе «ОПН»; р < 0,05; точный критерий Фишера). На фоне введения КГП при экспериментальной ОПН не отмечено статистически значимого изменения числа тромбоцитов в периферической крови (рисунок 1). КГП не оказывал влияния на процесс адгезии тромбоцитов к эндотелиальной стенке сосуда (таблица 1). Установлено, что КГП нормализовал скорость агрегации
тромбоцитов как в целом, так и отдельных волн, преимущественно за счет уменьшения времени процесса (таблица 2). Кроме того, КГП восстанавливал до уровня интактных животных активность тромбоцитарного фактора Р3. Отмеченные факты, по всей видимости, связаны со
структурно-функциональными изменениями в рецепторном аппарате, опосредующем агрегацию
клеток. Возможно, что это связано с дезинтоксикационными свойствами КГП при ОПН, умень-
186
М.В. Осиков
шением количества циркулирующих в крови и контактирующих с тромбоцитами уремических
токсинов. Эфферентные свойства КГП описаны в литературе при ожоговой болезни [30],
а также зафиксированы нами ранее при экспериментальной патологии. Кроме того, нельзя
исключить факт специфического рецептор-опосредованного действия КГП на тромбоциты
с последующим изменением функциональной активности клеток, экспрессии рецепторов на поверхность и пр.
Таблица 2
Влияние КГП на показатели агрегации тромбоцитов при ОПН (M (s))
Группа животных /
Группа 1
Группа 2
Группа 3
Показатели
Интактные
ОПН
ОПН+КГП
n=12
n=7
Максимальная амплитуда, %
39,39 (4,12)
Время агрегации, мин
6,48 (0,99)
23,66 (7,59)
n=5
33,21 (14,44)
р1-2<0,001 (U)
6,41 (1,12)
4,72 (1,95)
р1-3=0,025
Скорость
%/мин
агрегации,
6,21 (1,07)
Амплитуда 1-ой волны,
%
33,79 (8,13)
Время агрегации
волны, мин
3,37 (0,59)
1-ой
3,71 (1,06)
7,13 (2,56)
р1-2<0,001 (U)
р2-3=0,009
18,81 (7,05)
26,58 (13,18)
р1-2<0,001 (U)
3,43 (0,43)
2,22 (0,73)
р1-3=0,004
р2-3=0,005
Скорость агрегации 1-ой
волны, %/мин
9,66 (1,68)
Амплитуда 2-ой волны,
%
7,64 (2,19)
Время агрегации
волны, мин
2-ой
3,11 (0,73)
2,84 (1,28)
2,50 (1,54)
Скорость агрегации 2-ой
волны, %/мин
2,51 (0,63)
1,72 (0,46)
2,79 (0,69)
р1-2=0,011
р2-3=0,009
Р3, с
63,92 (16,49)
36,08 (17,39)
52,00 (13,78)
р1-2<0,001 (U)
р2-3=0,020 (U)
5,46 (1,93)
11,77 (3,89)
р1-2<0,001
р2-3=0,004
4,85 (2,79)
6,63 (3,34)
р1-2=0,027
Заключение
Таким образом, экспериментальная ОПН, индуцированная хлоридом ртути (II), сопровождается изменениями в клеточном звене гемостаза, которые выражаются в снижении адгезивной
и агрегационной функции тромбоцитов. Применение КГП в суммарной дозе 450 мг/кг приводит
к повышению выживаемости крыс при ОПН и нормализации показателей агрегации тромбоцитов.
Список литературы
1.
2.
3.
4.
Opatrny K. Jr. Hemostasis disorders in chronic renal failure // Kidney Int. Suppl., 1997. 62. P. 87—89.
Steiner R.W., Coggins C., Corvalho A.C.A. Bleeding in uremia: a useful to assess clinical bleeding //
Am. J. of Hematol., 1979. 7. P. 107—117.
Remuzzi G. Bleeding in renal failure // Lancet, 1988. i. P. 1205—1208.
Castillo R., Lozano T., Escolar G. et al. Defective platelet adhesion on Vessel Subendothelium in uremic
patients // Blood, 1986. 68. P. 337—342.
Влияние альфа-1 кислого гликопротеина на состояние клеточного звена гемостаза
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
187
Ware J.A. Clark B.A., Smith M. et al. Abnormalities of cytoplasma Ca++ in platelets from patients with uremia
// Blood, 1989. 73. P. 172—176.
Vasson M.P., Paul J.L., Couderc R. et al. Serum alpha-1 acid glycoprotein in chronic renal failure and
hemodialysis // Int. J. Artif. Organs, 1991. 14(2). P. 92—96.
Vasson M.P., baguette J.C., Arveiler M.R. et al. Serum and urinary alpha-1 acid glycoprotein in chronic renal failure // Nephron, 1993. 65(2). P. 299—303.
Bartelik S., Starzyk J. Serum levels of alpha-1 acid glycoprotein, haptoglobin, C 3c component of the complement and immunoglobulins IgG, IgA and Ig M in liver damage in patients with chronic renal failure treated
by repeated hemodialysis // Wiad Lek, 1989. Vol. 42(8). P. 520—524.
Кривохижина Л.В., Солодовникова О.А., Потапкина Н.Н. Динамика активности церулоплазмина
и концентрации меди в плазме под влиянием гемодиализной терапии у больных с хронической почечной недостаточностью // Нефрология, 2003. Т.7. №2. С. 72—75.
Макаров Е.В., Кривохижина Л.В., Саломатин В.В. О влиянии альфа-1-кислого гликопротеина на
АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека // Медицинский академический журнал,
2003. Т.3. №3. С. 98—99.
Осиков М.В., Кривохижина Л.В. К патогенезу нарушений гемореологии при печеночной недостаточности и их коррекция церулоплазмином // Тромбоз, гемостаз и реология, 2005. № 4. С. 55—60.
Ермолаева Е.Н. Влияние церулоплазмина на функциональное состояние тромбоцитов при экспериментальных нарушениях гемостаза: Автореф. дисс. канд. мед. наук. Челябинская гос. мед. академия.
Челябинск, 2003.
Keyler D.E., Pentel P.R., Haughey D.B. Pharmacokinetics and toxicity of high-dose human alpha-1-acid
glycoprotein infusion in rat // J. Pharm. Sci, 1987. 76(2). Р.101—104.
Andersen P., Godal H.C.The antiheparin effect of alpha-1-acid glycoprotein probably due to steric hindrance
of the heparin-thrombin interaction // Thromb Res, 1979. Vol.15(5-6). P. 857—868.
Пухальский А.Л., Шмарина Г.В., Лютов А.Г и др. Альфа-1-кислый гликопротеин обнаруживает in vitro
как про-, так и противовоспалительную активность // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2001. Т.131. №5. С. 564—567.
Daemen M.A.R.C., Heemskerk V.H., van't Veer C. et al. Functional protection by acute phase proteins a1acid glycoprotein and a-antitrypsin against ischemia/reperfusion injury by preventing apoptosis and inflammation // Circulation, 2000. 102. P. 1420—1426.
Sorrenson J., Ohlson M., Bjornson A. et al. Orosomucoid has a cAMP-dependent effect on human endothelial cells and inhibits the action of histamine // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 2000. 278.
P. H1725— H1731.
Скипетров В. Рейман Г., Корешкова Г. Состояние свертывающей и антисвертывающей системы при
оварио–менструальном цикле // Проблемы гематологии и переливания крови, 1964. № 8. С.15—17.
Ершов Ю.А., Плетенева Т.В. Механизмы токсического действия неорганических соединений.
М.: Медицина, 1989. 272 с.
Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний / Под ред. Петрищева Н.Н., Папаян Л.П. СПб, 1999. 117с.
Тодоров Й. Клинические лабораторные исследования в педиатрии. София: Медицина и физкультура, 1968. 1064с.
Ронин В.С. Способ окраски тромбоцитов для подсчета в счетной камере // Лаб. дело, 1983. №1.
С.61—62.
Born G.V.R. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal // Nature, 1962.
194. P. 927—929.
Иванов Е. П. Диагностика нарушений гемостаза. Минск: Беларусь, 1983. 222 с.
Гланц С. Медико – биологическая статистика. М.: Практика, 1999. 438с.
Реброва О. Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М.: Медиа сфера, 2006. 312с.
Gawaz M. P., Dobos G., Spath M. et al. Impaired function of platelet membrane glycoprotein ΙΙb-ΙΙΙa in endstage renal disease // J. of the Am. Soc. of Nephrol., 1994. 5. P. 36—46.
Саломатин В.В., Лютов А.Г, Холодов А.Ю. и др. Влияние альфа-1-кислого гликопротеина на реологические показатели крови при экспериментальных термических ожогах // Патологическая физиология
и экспериментальная терапия, 1992. №1. С. 35—37.
Осиков М.В., Кривохижина Л.В. Эфферентные свойства альфа-1-кислого гликопротеина при почечной недостаточности // Эфферентная терапия, 2006. № 2. С. 43—46.
Makarov E.V., Osikov M.V., Krivohizhina L.V. Alpha-1-acid glycoprotein as detoxifying agent in acute hepatic failure // The International Journal of Artificial Organs, 2005. 28(9). Р. 931.