содержание активированных лимфоцитов в периферической

УДК 576.8.097.3:616-001.17+612.112.94
СОДЕРЖ АНИЕ АКТИВИРОВАННЫХ ЛИМФОЦИТОВ
В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПАЦИЕНТОВ
С ТЕРМИЧЕСКОЙ, ЧЕРЕПНО-МОЗГОВОЙ
И МЕХАНИЧЕСКОЙ ТРАВМАМИ В РАННЕМ
ПОСТТРАВМАТИЧЕСКОМ ПЕРИОДЕ
С.Б. Кораблев, М.Ю. Лебедев, М.Н. Шолкина, С.А. Вилков
Нижегородский НИИ травматологии и ортопедии
А.Б. Кукарин
Медицинский институт ФПС при НГМА
В.В. Новиков
Нижегородский госуниверситет
С помощью моноклональных антител исследовали содержание активированных лимфоцитов в периферической крови пациентов с тяжелей ожоговой травмой, изолированной черепно-мозговой травмой, черепномозговой травмой, сочетанной с переломами длинных трубчатых костей
и изолированными переломами длинных трубчатых костей в раннем посттравматическом периоде. Изучали содержание клеток, несущих на
мембране CD25, CD71, CD26 белки и молекулы гистосовместимости II
класса (HLA-DR). Одновременно определяли количество Т-лимфоцитов, Тхелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов.
Показано, что все виды травм вызывают однонаправленные изменения
показателей клеточного иммунитета, которые выражались в снижении
количества Т-клеток, преимущественно за счет уменьшения Т-хелперов, и
в увеличении числа лимфоцитов с активационным фенотипом. При этом
отмечалось снижение интенсивности свечения всех изучаемых субпопуляций лимфоцитов в реакции иммунофлюоресценции. Максимальное снижение числа Т-лимфоцитов с одновременным увеличением количества активированных лимфоцитов выявлено у пациентов с сочетанной черепномозговой травмой.
В наше время ни у кого не вызывает сомнений тот факт, что иммунная система
играет важную роль в патогенезе ожоговой и травматической болезни (Горбунов,
Лихтерман, Ганнушкина, 1996; Долгушин, Эберт, Лифшиц, 1989; Barlow, 1994;
Munster, 1996).
Несмотря на определенные различия в механизмах развития посттравматических иммунных нарушений у тяжелообоженных и пациентов с черепно-мозговой
и механической травмами (Hansbrough, Zapata-Sirvent, Hoyt, 1990; Barlow, 1994),
имеются общие тенденции в изменении количественных показателей одной из
важнейших субъединиц иммунной системы — лимфоцитов периферической крови. Изменения выражаются в снижении общего числа лимфоцитов, снижении В- и
Т-лимфоцитов (Горбунов, Лихтерман, Ганнушкина, 1996; Смирнов, Фрейдлин,
2000; Чеснокова, 2000; Долгушин, Эберт, Лифшиц, 1989), нарушении соотноше79
ния Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток с изменением иммунорегуляторного
индекса (Hansbrough et al., 1984; Barlow, 1994).
Вместе с тем для диагностики иммунной недостаточности необходима информация о функциональном состоянии иммунокомпетентных клеток. Самые разнообразные проявления функциональной активности иммуноцитов сводятся к единому базисному процессу — активации клеток и, как следствие этого, изменению
их мембранного рецепторного репертуара. В первую очередь изменяется плотность экспрессии так называемых маркеров активации или активационных антигенов.
Активационными считаются такие антигены, которые экспрессированы на активированных клетках (Барышников, Тоневицкий, 1997; Ярилин, 1999). Активационные антигены могут быть рецепторами различных биологически активных
молекул, например цитокинов, участвовать в процессах межклеточных взаимодействий и т. д. Для лимфоцитов наиболее широкую известность имеют активационный CD25 (IL-2R, Tac) антиген — являющийся низкоаффинным рецептором
интерлейкина-2; CD71 (T9, transferrin receptor) антиген — рецептор трансферрина;
CD26 ( дипептидилпептидаза IV, ADA-связывающий белок) антиген — молекула,
необходимая для костимуляции Т-лимфоцитов (Барышников, Тоневицкий, 1997).
Кроме того, на В-лимфоцитах и части Т-хелперов возрастает плотность молекул
гистосовместимости II класса (Ярилин, 1999).
Целью настоящего исследования явилось изучение динамики изменения относительного содержания Т-лимфоцитов, их субпопуляций (Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов) и активированных лимфоцитов в периферической крови
пациентов с тяжелой термической и механической травмой в раннем посттравматическом периоде, как начальном этапе формирования иммунных нарушений.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Обследовано 108 пациентов с различными видами травм. Возраст пациентов
— от 18 до 67 лет. 45 пациентов пострадали от термической травмы. Площадь
ожогового поражения составляла от 30 до 65 % поверхности тела. 28 пациентов
имели черепно-мозговую травму (ЧМТ) средней и тяжелой степени, у 18 пациентов ЧМТ средней и тяжелой степени сочеталась с переломами длинных трубчатых костей (СЧМТ). 17 больных имели изолированные переломы длинных трубчатых костей. Исследования проводили в первые трое суток после травмы ежедневно, в дальнейшем — через день.
Мононуклеарные
клетки
выделяли
на
одноступенчатом
фиколлтразограффовом градиенте (1.077 мг/мл) по методу, описанному Д.К. Новиковым
(1979). Жизнеспособность клеток оценивалась по тесту с трипановым синим и
составляла 96–98 %. Клетки выделяли не позднее двух часов после забора крови.
Содержание антиген-положительных клеток определяли методом непрямой иммунофлюоресценции с помощью панели моноклональных антител (МКА), как
описано ранее (Lebedev et al., 2001). Количество основных субпопуляций лимфоцитов определяли с помощью МКА ИКО-90 (против CD3 антигена), ИКО-86
(против CD4 антигена) и ИКО-31 (против CD8 антигена). Поверхностные активационные антигены выявляли с помощью МКА ИКО-1 (против мономорфной детерминанты HLA-DR антигенов), ИКО-92 (против CD71 антигена), ИКО-105
(против CD25 антигена), ИКО-147 (против CD26 антигена). Подсчитывали число
светящихся клеток на 100 лимфоцитов. Клетки с морфологией моноцитов и ней80
трофилов при подсчете не учитывали. Интенсивность свечения оценивали визуально.
В качестве контрольной группы исследовали кровь 35 клинически здоровых
добровольцев. Исследования экспрессии активационных антигенов проводили вне
периода эпидемии гриппа.
Статистическую обработку полученных результатов проводили по методу
Стьюдента. При р<0.05 результаты считались достоверными. Корреляционный
анализ проводили линейным параметрическим методом (рассчитывали коэффициент Пирсона). Статистические расчеты проводили с использованием пакета
программ «Statistica» (StatSoft-Russia, 1998).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Согласно полученным данным, как ожоговая, так и механическая травма приводят к изменению популяционного состава лимфоцитов в самые ранние сроки с
момента получения травмы. В первую очередь это относится к относиттельному
содержанию CD3+ и CD4+ лимфоцитов, достоверное снижение которых выявляется уже в первые посттравматические сутки (табл. 1). Уменьшение количества
Т-лимфоцитов и Т-хелперов сопровождалось значительным снижением интенсивности их свечения. Изменение количества CD8+ клеток и снижение интенсивности их свечения на первой неделе после травмы было выражено в меньшей степени. Достоверное снижение содержания CD8+ клеток было обнаружено только у
пациентов с ЧМТ на 4–7 сутки от момента травмы (табл. 2), а у пациентов с переломами длинных трубчатых костей даже имелась тенденция к увеличению относительного числа цитотоксических Т-лимфоцитов и усилению интенсивности их
свечения в первые три дня после повреждения. При других видах травм достоверных различий между числом CD8+ клеток у пациентов и клинически здоровых лиц
получено не было. При этом соотношение CD4+/CD8+ лимфоцитов (иммунорегуляторный индекс) был, как правило, снижен за счет уменьшения числа
Т-хелперов. Продолжительность снижения относительного количества CD3+ и
CD4+ клеток охватывала весь острый период и ожоговой, и травматической болезни. Тяжелообожженные и пациенты с СЧМТ отличались крайне низкой интенсивностью свечения CD3, CD4 и CD8-положительных Т-клеток. У пациентов с
ожоговой травмой в большинстве случаев нормализации относительного содержания Т-лимфоцитов и Т-хелперов не происходило и по прошествии двух месяцев после травмы.
Результаты исследования активационных антигенов показали, что в острый
посттравматический период происходит увеличение относительного количества
CD25+ и CD71+ лимфоцитов. У пациентов с ЧМТ, СЧМТ и переломами длинных
трубчатых костей увеличение числа этих клеток статистически достоверно повышено на протяжении всей первой недели после травмы. У тяжелообожженных
имеется тенденция к увеличению содержания CD25+ и CD71+ лимфоцитов в раннем периоде ожоговой болезни.
Тенденция к увеличению числа CD26+ лимфоцитов в раннем посттравматическом периоде прослеживается у пациентов с ЧМТ и тяжелообожженных больных.
У пострадавших с СЧМТ и переломами длинных трубчатых костей в течение первой недели после травмы отмечались тенденции и к увеличению и к снижению
относительного содержания этих клеток в периферическом кровотоке.
81
Таблица 1
Содержание антиген-положительных лимфоцитов периферической крови
по отношению к контрольной группе (%) в первые трое суток после травмы
Вид травмы
Антигенположительные
клетки
ЧМТ
n=28
СЧМТ
n=17
CD3+
CD4+
CD8+
CD25+
CD71+
CD26+
HLA-DR+
43*
23*
74
118*
117
104
49*
34*
21*
80
193*
218*
75
65*
Изолированный пере- Тяжелая ожоговая
лом длинных костей
травма
n=18
n=45
85
50*
65*
41*
108
101
140*
104
154*
150
108
106
85
68
* – р<0.05.
Таблица 2
Содержание антиген-положительных лимфоцитов периферической крови
по отношению к контрольной группе (%) в период 4–7 суток
от момента травмы
Антигенположительные
клетки
CD3+
CD4+
CD8+
CD25+
CD71+
CD26+
HLA-DR+
Вид травмы
ЧМТ
n=28
СЧМТ
n=17
32*
23*
61*
119*
150*
133*
51*
56*
38*
70
125*
133*
104
73
Изолированный пере- Тяжелая ожолом длинных костей говая травма
n=18
n=45
58*
62*
51*
43*
85
83
121*
125
159*
118
93
132
101
69
* – р<0.05.
Для HLA-DR+ лимфоцитов прослеживается обратная динамика. На первой неделе после травмы было выявлено снижение относительного числа этих клеток. У
пациентов с ЧМТ и СЧМТ снижение содержания HLA-DR+ лимфоцитов было
статистически достоверным. Интенсивность свечения всех лимфоцитов с активационным фенотипом была сниженной по сравнению с контролем.
При мониторинге лимфоцитов с активационным фенотипом у пациентов с
термической травмой, в отличие от пострадавших от механической травмы, была
выявлена высокая вариабельность показателей в пределах непродолжительных
интервалов времени. В течение суток содержание CD25+, CD71+, CD26+ и HLADR+ лимфоцитов у тяжелообоженных изменялось на 400–600 %, тогда как изменения количества клеток с активационным фенотипом у пациентов с ЧМТ, СЧМТ
и переломами длинных трубчатых костей происходили в пределах 30–70 %. Веро82
ятно, это объясняет тот факт, что, при сопоставимых средних значениях относительного содержания активированных лимфоцитов у пациентов с механической и
ожоговой травмой, статистически достоверных различий в сравнении с нормой
для последних не выявлено.
Корреляционный анализ между количеством клеток с активационным фенотипом и содержанием Т-клеток и их субпопуляций показал наличие многочисленных положительных взаимосвязей как в первые трое суток, так и в четвертые —
седьмые сутки от момента травмы. В основном корреляционные взаимосвязи выявлялись между Т-лимфоцитами и цитотоксическими Т-клетками, с одной стороны, и CD25+, CD71+ и CD26+ лимфоцитами, с другой. HLA-DR+ лимфоциты чаще
коррелировали с содержанием общих лимфоцитов.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Изменения в содержании Т-лимфоцитов и их субпопуляций в периферической
крови после ожоговой и механической травмы описаны в литературе неоднократно (Горбунов, Лихтерман, Ганнушкина, 1996; Долгушин, Эберт, Лифщиц, 1989;
Barlow, 1994; Munster, 1996). При этом ряд авторов говорит о том, что ожоговое
поражение оказывает на клеточное звено иммунитета большее воздействие по
сравнению с другими видами травм (Hansbrough, Zapata-Sirvent, Hoyt, 1990;
Barlow, 1994).
Наши исследования показали, что при всех видах травм уже в ранний посттравматический период происходит достоверное снижение относительного содержания Т-лимфоцитов за счет падения количества Т-хелперов. Методом непрямой иммунофлюоресценции было обнаружено, что уже в первые трое суток от
момента травмы происходит снижение числа СD3+ и СD4+ клеток, но не СD8+
клеток. При этом происходит снижение соотношения СD4/СD8 клеток (иммунорегуляторного индекса). Наиболее выраженным падение количества Т-лимфоцитов и Т-хелперов было у пациентов с ЧМТ и СЧМТ. Ожоговая травма вызывала
снижение относительного числа СD3+ и СD4+ клеток в меньшей степени по сравнению с механической травмой.
Данные литературы об активационном фенотипе лимфоцитов периферической крови после тяжелой ожоговой травмы довольно противоречивы. Ряд авторов показывает снижение числа CD25+, CD71+ и HLA-DR+ лимфоцитов у ожоговых больных (Zapata-Sirvent, Hansbrough, 1993; Teodorczyk-Injeyan et al., 1986;
Смирнов, Фрейдлин, 2000), другие говорят об увеличении содержания этих клеток после термической травмы (Maldonado et al., 1991; Schleter et al., 1991;
Kataranovski et al., 1994). При механической травме большинство исследователей
говорит о снижении экспрессии лимфоцитами периферической крови активационных антигенов (Wakefield et al., 1993; Decker et al., 1997). Согласно полученным
нами данным, на фоне механической и термической травмы у больных происходит увеличение числа клеток с активационным фенотипом.
Особенностью экспрессии маркеров активации у тяжелообоженных является
их крайняя нестабильность во время острого периода. Вероятно, именно высокая
вариабельность клеток с активационным фенотипом объясняет разноречивые
данные, полученные различными авторами. Этим же, по-видимому, объясняется
отсутствие статистически достоверных различий в относительном содержании
клеток, несущих активационные антигены, между больными и здоровыми лицами.
83
У пациентов с механической травмой содержание СD25+, СD71+, СD26+ и
HLA-DR+ лимфоцитов было значительно стабильнее. При этом происходило увеличение содержания СD25+, СD71+, СD26+ лимфоцитов и снижение количества
HLA-DR+ лимфоцитов, что в целом повторяет направленность изменений относительного количества этих клеток у ожоговых больных.
Нужно заметить, что при всех видах травм было выявлено снижение интенсивности свечения клеток с активационным фенотипом. Вероятно, это указывает
на то, что активационные процессы являются одним из начальных элементов развития посттравматической иммунной недостаточности. Так, низкая интенсивность свечения клеток, несущих активационные рецепторы, отчасти может объясняться сбрасыванием части мембранных форм рецепторов в жидкую фазу (переход в растворимую форму). Такой механизм поведения СD25 антигена показан
при ожоговой болезни (Teodorczyk-Injeyan, 1991). Повышение уровня растворимого CD25 в сыворотке на фоне увеличения количества СD25+ клеток указывает
на то, что повышение сывороточной концентрации данного белка является и признаком активации, и элементом иммуносупрессии. Другими словами, посттравматическая активация иммунокомпетентных клеток может являться элементом развития иммунной недостаточности.
Таким образом, наши исследования показали, что все виды травм вызывают
однонаправленные изменения показателей клеточного иммунитета. Наибольшее
снижение содержания Т-лимфоцитов и их субпопуляций и одновременное повышение количества лимфоцитов с активационным фенотипом наблюдается при
черепно-мозговой травме, сочетанной с переломами длинных трубчатых костей.
ЛИТЕРАТУРА
Барышников А.Ю., Тоневицкий А.Г. Моноклональные антитела в лабораторной практике. М.: ВНТИЦ, 1997.
Горбунов В.И. Лихтерман Л.Б., Ганнушкина И.В. Иммунопатология травматической
болезни головного мозга. Ульяновск, 1996.
Долгушин И.И., Эберт Л.Я., Лифшиц Р.И. Иммунология травмы. Свердловск, 1989.
Новиков Д.К., Новикова В.И. Клеточные методы иммунодиагностики. Минск: Изд-во
«Беларусь», 1979. С. 25–27.
Смирнов В.С., Фрейдлин И.С. Иммунодефицитные состояния. СПб.: «Фолиант», 2000.
Чеснокова И.Г. Изменения в иммунной системе при травматической болезни (клинико-патогенетическое, прогностическое значение и коррекция) // Иммунология. 2000. № 6.
С. 39–42.
Ярилин А.А. Основы иммунологии М.: Медицина, 1999.
Barlow Y.T. T-lymphocyte and immunosuppresion in the burned patient. A review // Burns.
1994. V. 20. P. 487–457.
Decker D., Lindemann C., Low A., Bidlingmaier F., Hirner A., von Ruecker A.
// Changes in the cytokine concentration (Il-6, Il-8, Il-1) and their cellular expression of membrane molecules (CD25, CD30, HLA-DR) after surgical trauma // Zentralbl. Chir. 1997. V. 122.
№ 3. P. 157–164.
Hansbrough J.F., Bender E.M., Zapata-Sirvent R., Anderson J. Altered helper and suppressor lymphocyte population in surgical patients: a measure of postoperative immunosuppression // Am. J. Surg. 1984. V. 148. P. 303–307.
Hansbrough J.F., Zapata-Sirvent R., Hoyt D. Postburn immune suppression: an inflammatory response to the burn wound? // J. Trauma. 1990. V. 30. № 6. P. 671–674.
84
Kataranovski M., Kuuk J., Coli M., еt al. Post-traumatic activation of draining lymph node
cells. II. Proliferative and phenotypic characteristics // Burns. 1994. V. 20. № 5. P. 403–408.
Lebedev M.Ju., Sholkina M.N., Utkina T.M. et al. Immunophenotype of peripheral blood
lymphocytes in burn patients // Rus. J. Immun. 2001. V. 6. № 1. P. 47–54.
Maldonado M.D., Venturoli A., Franco A., Nunez-Roldan A. // Specific changes in peripheral blood lymphocyte phenotype from burn patients. Probable origin of the thermal injury-related
lymphocytopenia // Burns. 1991. V.17. № 3. Р. 188–192.
Munster A.M. The immunological response and strategies for intervention // Total burn care.
London, Philadelphia, Toronto, Sydney, Tokyo, 1996. P. 279–292.
Schleter B., Konig W., Koller M. et al. Differential regulation of T- and B-lymphocyte activation in severely burned patients // J. Trauma. 1991. V. 31. № 2. P. 239–246.
Teodorczyk-Injeyan J.A., Sparkes B.G., Mills G.B. et al. Impairment of T cell activation in
burn patients: a possible mechanism of thermal injury-induced immunosuppression // Clin. Exp.
Immunol. 1986. V. 65. № 3. P. 570–581.
Teodorczyk-Injeyan J.A., Sparkes B.G., Mills G.B., Peters W.J. Immunosuppression follows systemic T lymphocyte activation in the burn patient // Clin. Exp. Immunol. 1991. V. 85.
№ 3. P. 515–518.
Wakefield C.H., Carey P.D., Foulds S., Monson J.R., Guillou P.J. // Changes in major histocompatibility complex class II expression in monocytes and T cells of patients developing infection after surgery. Br. J. Surg. 1993. V. 80. № 2. P. 205–209.
Zapata-Sirvent R.L., Hansbrough J.F. Temporal analysis of human leukocyte surface antigen expression and neutrophil respiratory burst activity after thermal injury // Burns. 1993. V. 19.
№ 1. P. 5–11.
85