МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В. ЛОМОНОСОВА Биологический факультет
реклама
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В. ЛОМОНОСОВА Биологический факультет На правах рукописи Поташникова Дарья Марковна СРАВНЕНИЕ НОРМАЛЬНЫХ И ОПУХОЛЕВЫХ CD5-ПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ В-КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Специальность – 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология Научный руководитель: Доктор биологических наук, профессор И.А. Воробьев Москва 2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ................................................................................................... 4 1.1 Актуальность проблемы…………………………………………………………… 4 1.2 Цель и задачи исследования………………………………………………………. 5 1.3 Научная новизна и практическая значимость работы…………………………… 6 1.4 Апробация работы………………………………………………………………….. 7 ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………….………................................................. 8 2.1 B-лимфоциты в норме. Дифференцировка, созревание и иммунофенотип Вклеток……………………………………………………………………………………. 8 2.1.1 Дифференцировка В-клеток……………………………………………………………. 8 2.1.2 Синтез иммуноглобулинов. Антиген-независимый этап созревания Вклеток……………………………………………………………………………………………... 11 2.1.3 Антиген-зависимоый этап созревания В-клеток…………………………………. 13 2.1.4 В-клеточный рецептор и сигнальный каскад от него……………………………. 15 2.1.5 Иммунофенотип В-клеток…………………………………………………………….. 18 2.2 В-клеточные опухоли. Дифференциальная диагностика. Гетерогенность в группе CD5-положительных В-клеточных лимфом………………………..………... 22 2.2.1 Не-Ходжкинские лимфомы…………………………………………………………….. 22 2.2.2 Дифференциальная диагностика лимфом…………………………………………… 24 2.2.3 Возможные предшественники CD5-положительных лимфом…………………. 25 2.3 Биология передачи сигнала в CD5-положительных лимфомах…………………. 29 2.3.1 Строение В-клеточного рецептора CD5-положительных лимфом…………... 29 2.3.2 Строение ВCR-каскада CD5-положительных лимфом………………………….. 30 2.4 Методические подходы к исследованию В-клеточных популяций…………….. 32 2.4.1 Клеточная сортировка чистых субпопуляций для анализа уровней экспрессии генов…………………………………………………………………………………. 32 2.4.2 Подходы к исследованию В-клеток при помощи ПЦР в реальном времени. Проблема нормализации данных при анализе уровней экспрессии мРНК…………… 34 ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ….................................... 36 3.1 Пациенты и контроли………………………………………………………………. 36 3.2 Гистология и иммуногистохимия……………….………………………………… 37 3.3 Проточная цитофлуориметрия…………………………………………………….. 37 3 3.4 Клеточная сортировка……………………………………………………………… 38 3.5 Получение РНК и кДНК…………………………………………………………… 39 3.6 Подбор праймеров………………………………………………………………….. 39 3.7 ПЦР в реальном времени…………………………………………………………... 41 3.8 Нормализация и статистический анализ………………………………………….. 42 ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ…….…………………………………. 43 4.1 Классификация исследованных в работе опухолевых тканей и реактивных контролей ……………………………………………………………………...……….. 43 4.2 Определение уровней экспрессии мРНК генов сигнальных белков BCRкаскада в опухолевой и реактивной лимфоидной ткани…………………………….. 51 4.3 Описание CD5+CD19+ популяции неопухолевых лимфоцитов миндалин……. 58 4.4 Сортировка нормальных и опухолевых В-клеток. Определение уровней экспрессии мРНК генов сигнальных белков BCR-каскада в чистых субпопуляциях…………………………………………………………………………. 62 4.5 Совместный анализ данных по экспрессии мРНК генов сигнальных белков BCR-каскада в отсортированных и неотсортированных лимфоидных образцах….. 68 4.6 Анализ экспрессии ZAP-70 в CD5+CD19+ В-клетках миндалин методом проточной цитофлуориметрии………………………………………………………… 71 ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ…………….…………………………… 73 5.1 Опухолевые В-клетки В-ХЛЛ и ЛКМЗ имеют уникальный профиль экспрессии сигнальных белков………………………………………………………... 73 5.2 Клетки лимфом из «серой зоны» между В-ХЛЛ и ЛКМЗ отличаются как по экспрессии поверхностных антигенов, так и по уровням экспрессии сигнальных компонентов BCR-каскада…………………………………………………………….. 74 5.3 Характеристика CD5-положительных клеток миндалин………………………... 77 5.4 Уровни экспрессии генов сигнальных молекул BCR-каскада в норме и при патологии……………………………………………………………………………….. 78 ГЛАВА 6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………….. 80 ВЫВОДЫ.......................................................................................................................... 82 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ…………................... 83 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................ 85 ПРИЛОЖЕНИЯ………………………………………………………………………… 106 4 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ 1.1 Актуальность проблемы В-клетки – потомки общего лимфоидного предшественника, прошедшего в процессе дифференцировки и созревания ряд стадий с последовательной сменой поверхностного иммунофенотипа, эпигенетического и транскрипционного профилей. Основополагающую роль в выживании и дифференцировке В-лимфоцита играет сигнал фосфорилирования, получаемый через В-клеточный рецептор (BCR): митогенные и антиапоптотические сигналы передаются в ядро через BCR и ко-рецепторные комплексы. В зависимости от привлеченных ко-рецепторов сигнал может изменяться и приводить к разным последствиям для В-клетки. Помимо специфического комплекса BCR на поверхности В-клетки находится большой набор различных молекул, являющихся рецепторами, ко-рецепторами, лигандами, транспортерами или молекулами адгезии. Вместе они обеспечивают активацию В-клеток, их миграцию в организме по сложным траекториям и, в конечном счете, выполнение их функции в составе иммунной системы. Набор поверхностных молекул на мембране В-лимфоцита позволяет дать развернутую характеристику его происхождения и функционального состояния. Значительный объем информации о структуре, функциях и паттернах экспрессии поверхностных антигенов, накопленный на сегодняшний день, позволяет описывать многообразие В-клеточных субпопуляций в норме, а также при патологических состояниях. Так, диагностика В-клеточных лимфом базируется на развернутом описании поверхностных антигенов. Однако поиск сходств и различий между нозологическими группами зачастую ограничивается анализом поверхностных маркеров и мутационного статуса В-клеточного рецептора, и не касается экспрессии проводящих элементов сигнального BCR-каскада, расположенных в цитоплазме. Передача сигнала от зрелого BCR обеспечивается BCR-ассоциированными тирозинкиназами и тирозинфосфатазами (SYK, LYN, SHP-1, ZAP-70), которые активируют универсальные сигнальные молекулы – PI3K, PLC, PKB и PKC (DeFranco, 1997; Geisberger et al., 2003; Harwood, Batista, 2010). Эффекторными молекулами BCR-каскада являются транскрипционные факторы, обеспечивающие размножение и выживание клеток. Так как важнейшие характерные свойства опухолевых клеток обусловлены аномальным функционированием сигнальных путей, контролирующих клеточный цикл и апоптоз (Hanahan, Weinberg, 2000; Hanahan, Weinberg, 2011), актуальным представляется изучение экспрессии сигнальных белков BCR-каскада в различных В-клеточных лимфомах. 5 В гетерогенной группе не-Ходжкинских лимфом выделяется значительная подгруппа Взрелоклеточных лимфом с неканонической экспрессией маркера CD5. Наибольшую часть случаев в Восточной Европе составляет В-клеточный хронический лимфолейкоз (В-ХЛЛ) (Sant et al., 2010), более редким и более агрессивным заболеванием является лимфома из клеток мантийной зоны (ЛКМЗ). Кроме того, выделяется ряд промежуточных форм между В-ХЛЛ и ЛКМЗ, представляющих трудность для современной диагностики (Zhao, 2009). Отправной точкой в исследовании сигналинга CD5+ В-клеточных опухолей стало разделение группы ВХЛЛ на две подгруппы по способности запускать BCR-каскад (Lankester et al., 1995; Chiorazzi et al., 2005). На сегодняшний день для клеток В-ХЛЛ были показаны аберрантные уровни экспрессии верхних проводящих компонентов ВCR сигнального каскада: СD79b (Cajiao et al., 2007), тирозинкиназ SYK и LYN, а также добавление к общему опухолевому фенотипу неканонической тирозинкиназы ZAP-70 (Chen et al., 2002, Seda, Mraz, 2015). Исследований BCR-ассоциированных сигнальных белков для других CD5+ В-клеточных лимфом проводилось сравнительно мало. На основании данных об гиперэкспрессии циклина D1 и общем высоком уровне активации клеток ЛКМЗ при общем низком уровне фосфорилирования сигнальных компонентов был сделан вывод об их неспособности проводить сигнал извне (de Boer et al., 1997). Исследования методом microarray показали значительно повышенные уровни компонентов PI3K-Akt и Wnt сигнальных путей при ЛКМЗ, но данные о BCR-ассоциированных молекулах в них отсутствовали (Rizzatti et al., 2005). Проблема клеток-предшественников CD5-положительных лимфом также представляет значительный интерес: ведется поиск субпопуляции нормальных В-клеток, наиболее близкой к В-ХЛЛ по фенотипу (Klein, Dalla-Favera, 2005). CD5+ В-клетки миндалин человека являются важными претендентами на роль опухолевых предшественников (Dono et al., 2004), хотя степень сходства этих групп опухолевых и нормальных клеток требует дальнейшего изучения. 1.2 Цель и задачи исследования Целью данной работы было разделение B-клеточных лимфом и нормальных Влимфоцитов по уровню экспрессии генов сигнальных BCR-ассоциированных белков. Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи: 1. Подробно охарактеризовать и разбить на подгруппы выборку первичных CD5+ Вклеточных лимфом с использованием ключевых диагностических методов. 2. Определить уровни экспрессии мРНК генов сигнальных компонентов BCR-каскада (CD79A, CD79B, LYN, SYK, ZAP70, SHP1) в неотсортированных пробах CD5+ В- 6 клеточных лимфом для выявления различий между разными нозологическими формами c известным фенотипом. 3. Составить подробное иммунофенотипическое описание наиболее похожей на клетки ВХЛЛ субпопуляции нормальных CD5+ В-лимфоцитов человека, локализующейся в миндалинах. 4. Отсортировать чистые популяции нормальных CD5- В-лимфоцитов периферической крови и CD5+ В-лимфоцитов миндалин человека, а также опухолевых лимфоцитов ВХЛЛ. 5. Определить и сравнить уровни экспрессии мРНК генов сигнальных компонентов BCRкаскада (CD79A, CD79B, LYN, SYK, ZAP70, SHP1) в отсортированных пробах опухолевых и неопухолевых лимфоцитов человека. 1.3 Научная новизна и практическая значимость работы Для исследования были выбраны образцы CD5+ В-клеточных опухолей 102 пациентов; впервые с помощью современных диагностических методов удалось выделить группу лимфом «серой зоны» с фенотипом, промежуточным между В-ХЛЛ и ЛКМЗ. 1. Таким образом, выборка CD5+ лимфом человека была разделена на 3 подгруппы для последующего исследования экспрессии генов сигнальных белков. 2. Использование корректной стратегии нормализации данных ПЦР в реальном времени позволило найти различия между 3 группами СD5+ В-клеточных лимфом по уровням экспрессии РНК генов сигнальных белков BCR-каскада. 3. В качестве нормальных конторлей рассматривались В-клеточные популяции с разным фенотипом и локализацией в организме. Был получен подробный иммунофенотип малой субпопуляции CD5+ неопухолевых В-клеток миндалин человека. 4. Сравнение отсортированных опухолевых клеток В-ХЛЛ и нормальных В-лимфоцитов показало пониженный уровень экспрессии генов сигнальных белков за исключением гена CD79A в опухоли по сравнению со всеми нормальными контролями. 5. Сравнение чистых популяций неопухолевых В-лимфоцитов из разных источников позволило установить, что профиль экспрессии генов сигнальных белков в нормальных Вклетках универсален и достоверные различия имеются только в уровнях экспрессии мРНК гена ZAP70. Полученные результаты могут быть применены в дифференциальной диагностике лимфоидных опухолей. Данные об экспрессии сигнальных белков, участвующих в проведении 7 сигнала от В-клеточного рецептора, в субпопуляциях опухолевых и нормальных В-лимфоцитов могут быть использованы в курсах лекций по иммунологии, гематологии и клеточной биологии. 1.4 Апробация работы Материалы диссертации доложены на международных конференциях: международной конференции «Experimental Hematology Association» (2010), второй Международной Школе по практической проточной цитометрии (Москва, 2011) и 18-й международной конференции «18th Leipziger Workshop on Cytomics and Congenital Heart Disease» (Лейпциг, 2013), а также обсуждены 1 апреля 2015 года на специализированном семинаре кафедры клеточной биологии и гистологии Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова. Работа поддержана 1-месячной стипендией ICRETT Union for International Cancer Control (UICC). 8 ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 B-лимфоциты в норме. Дифференцировка, созревание и иммунофенотип В-клеток В-лимфоциты являются клетками системы адаптивного иммунитета. В норме у человека они составляют от 5% до 15% от циркулирующего пула лимфоцитов и отвечают за обеспечение гуморального ответа на инфекцию (Roitt, 2001). От остальных клеток иммунной системы их отличает способность секретировать молекулы иммуноглобулинов (Ig) в свободном состоянии (антитела) (Benner et al., 1981; Van Furth et al., 1966) или в составе плазматической мембраны (В-клеточный рецептор, BCR) (Pernis et al., 1971; Wilson, Nossal, 1971). Регулировка специфичности и аффинности синтезируемой молекулы иммуноглобулина – ключевой процесс для В-лимфоцита, включающий набор последовательных генетических перестроек локусов иммуноглобулинов, экспрессию белкового продукта на поверхности лимфоцита в виде рецептора, формирование ко-рецепторных комплексов и сигнального каскада для обеспечения обратной связи, а также клональную селекцию В-лимфоцитов с оптимальной реакцией на связывание поверхностного иммуноглобулина. 2.1.1 Дифференцировка В-клеток Экспрессия иммуноглобулинов, а также ряда других специфических поверхностных белков, исторически стала первым критерием для выделения субпопуляции В-лимфоцитов, а последовательность их появления легла в основу критериев степени зрелости В-клеток в норме и при различных патологических состояниях (Davis, 1975; Janossy, Pizzolo, 1979). Используемые для изучения В-лимфоцитов методы традиционно включали иммуноферментное и иммунофлуоресцентное окрашивания (Janossy, Pizzolo, 1979; Hoffmann-Fezer et al., 1981), а также проточную цитофлуориметрию (Loken et al., 1987), которая удобна для проведения мультипараметрического анализа клеточных суспензий. Так как для начала синтеза иммуноглобулинов (как тяжелых IgH, так и легких IgL цепей) В-клеткам необходимо провести серию продолжительных и сложных перестроек в локусах этих генов, анализ стадии рекомбинации генов IG(VDJ)H и IG(VJ)L методом полимеразной цепной реакции с последующим секвенированием предоставляет еще один популярный маркер зрелости Влимфоцита, который коррелирует с его поверхностным иммунофенотипом (Ghia et al., 1996). С использованием перечисленных методов было показано, что топологически развитие Вклеток человека в эмбриогенезе идет в нескольких органах (Gathings et al., 1977; Nuñez et al., 9 1996), однако в постнатальном периоде оно ограничивается центральным органом иммуногенеза – костным мозгом (Nuñez et al., 1996, Rossi et al., 2003). В-лимфоциты являются потомками стволовой клетки крови (Notta et al., 2011), которая последовательно проходит несколько стадий гемопоэтических предшественников, теряющих способность к самообновлению и постепенно ограничивающих свои дифференцировочные потенции (Doulatov et al., 2012). Для описания последовательности событий при формировании В-клетки была предложена модель индукции В-клеточного фенотипа in vitro (Fluckiger et al., 1998) для выделенных CD34+CD38- ранних гемопоэтических предшественников, описанных впервые Galy и соавторами в 1995 году для взрослого и эмбрионального костного мозга (Galy et al., 1995), а затем Hao и соавторами – для пуповинной крови человека (Hao et al., 1995; Hao et al., 1998). Эта модель позволила охарактеризовать стадии развития В-клетки, начиная с про-В, опираясь в основном на состояние и экспрессию генов В-клеточного рецептора, а также на наличие экспрессии генов, отвечающих за функциональные перестройки в локусах генов иммуноглобулинов. После получения ряда дополнительных данных об иммунофенотипе разных стадий В-клеточной дифференцировки (Ryan et al., 1997) была сформулирована классическая модель В-лимфопоэза (LeBien, 2000), где гемопоэтические предшественники подвергаются однонаправленной универсальной дифференцировке и условно делятся на группы до стадии ранней В-клетки включительно, так как не несут специфических Вклеточных маркеров на поверхности в отличие от про-В и последующих стадий (Imamura et al., 2005). К сожалению, данная модель уделяет мало внимания свойствам ранних субпопуляций и возможностям их взаимного перехода и встречается с некоторыми экспериментальными противоречиями. С одной стороны, работы разных лет указывают на высокую дифференцировочную пластичность в культуре гемопоэтических предшественников, которая сохраняется довольно долго, даже после ряда событий специфической В-клеточной дифференцировки (Imamura et al., 2005; Reynaud et al., 2003; Doulatov et al., 2010). С другой стороны, в своих работах Sanz и соавторы (Sanz et al., 2003; Sanz et al., 2010) описывают субпопуляцию неканонических В-клеток из пуповинной крови человека, которые рано дифференцируются, демонстрируют иной паттерн экспрессии поверхностных маркеров и ряд физиологических отличий от канонических про-В-клеток. Вместе эти данные осложняют поиск первой необратимо коммитированной В-клетки и предполагают наличие сложной «дорожной карты» В-лимфопоэза (Doulatov et al., 2012). С методической точки зрения уточнение карты В-лимфопоэза требует расширения панели исследуемых поверхностных маркеров, а также смещения акцента на генетические методы исследования, так как выбор пути дифференцировки необходимо связан с соответствующим 10 изменением профиля экспрессии генов, а ранее – с соответствующими эпигенетическими изменениями. Особенного внимания заслуживают факторы транскрипции, играющие важнейшую роль в дифференцировке и транс-дифференцировке клеток (Graf, Enver, 2009). Так, современные модели дифференцировки В-клеток сосредоточены на поиске последовательных генетических изменений и выделении «фаз нестабильности», в которых дихотомический выбор судьбы гемопоэтических предшественников определяется взаимодействием пары транскрипционных факторов (Zandi et al., 2010). На сегодняшний день выделены несколько транскрипционных факторов, определяющих судьбу В-лимфоцита: более ранние E2A и EBF (de Pooter, Kee, 2010; Hagman et al., 2012) и более поздний Pax-5(BSAP) (Cobaleda et al., 2007; Medvedovic et al., 2011). Транскрипционный фактор Pax-5(BSAP) является одним из кандидатов на роль необратимо коммитирующего фактора для В-клетки человека в норме (Sanz et al., 2003) и важнейшим опухолевым регулятором при образовании В-клеточных лейкозов (Medvedovic et al., 2011; Familiades et al., 2009). В недавних работах были выявлены различия в общем профиле экспрессии РНК и микроРНК в В-клеточных предшественниках, коррелирующем со статусом реарранжировки генов иммуноглобулинов и позволяющих достоверно различить стадии развития Влимфоцитов, включая ранние В-клетки (van Zelm et al., 2005; Hystad et al., 2007; Jensen et al., 2013). Кроме изменений экспрессии различных РНК для дифференцирующихся В-клеточных предшественников было также показано изменение карты метилирования ДНК при прохождении стадий дифференцировки (Lee et al., 2012). Помимо создания общего генетического «портрета» каждой субпопуляции эти исследования отдельно фокусируются на выделении и установлении иерархии транскрипционных факторов, отвечающих за дифференцировку В-клеток. Данный подход весьма перспективен при анализе различных гемопоэтических субпопуляций, включая самые ранние. Карты иммунофенотипов гемопоэтических предшественников и кластеров транскипционных факторов, используемых ими, значительно расширяют представления о дифференцировке кроветворных клеток (Novershtern et al., 2011). На сегодняшний день при комбинировании фенотипического и генетического подходов к анализу данных о В-клеточной дифференцировке можно достоверно различить стадии общего лимфоидного предшественника, раннего В-клеточного предшественника, про-В-клетки, пре-ВI-клетки, крупной пре-В-II-клетки, мелкой постмитотической пре-В-II-клетки, и зрелого наивного В-лимфоцита (Blom, Spits, 2006). Таким образом, В-клетки – потомки общего лимфоидного предшественника, прошедшего в последовательной процессе сменой дифференцировки поверхностного ряд «би-потенциальных» иммунофенотипа, стадий с эпигенетического и 11 транскрипционного профилей. Современные методы исследования В-клеточных субпопуляций предполагают комбинацию морфологических и молекулярнобиологических подходов. 2.1.2 Синтез иммуноглобулинов. Антиген-независимый этап созревания В-клеток Несмотря на то, что механизм дифференцировки В-лимфоцита запускается задолго до начала синтеза иммуноглобулинов, именно они играют ведущую роль в его созревании начиная со стадии про-В-клетки. Без экспрессии иммуноглобулинов дальнейшее развитие В-клеток оказывается заблокированным на этой стадии (Yel et al., 1996; Meffre et al., 2001). Сходный эффект наблюдается при мутации ряда других генов, кодирующих поверхностные и внутриклеточные сигнальные белки (Minegishi et al., 1998; Minegishi et al., 1999; Ferrari et al., 2007; Schiff et al., 2000). Причиной такого блока в развитии служит необходимость синтезировать, экспрессировать на поверхности и проверить на функциональность сложный белковй комплекс –В-клеточный рецептор и его сигнальный каскад, – состоящий из молекулы тяжелой цепи иммуноглобулина, двух молекул легкой цепи иммуноглобулина (варианта или ) или суррогатной легкой цепи иммуноглобулина и гетеродимера трансмембранных адапторных белков CD79a и CD79b. C комплексом ассоциируются тирозинкиназы, которые обеспечивают проведение сигнала от рецептора внутрь клетки и снятие запрета на дальнейшую дифференцировку В-лимфоцита (Zhang et al., 2004). Молекула иммуноглобулина имеет Y-образную форму и состоит из двух тяжелых цепей (варианта µ, γ, δ, α или ε) и двух лѐгких цепей (варианта κ или λ), связанных между собой дисульфидными мостиками (Migita, Putnam 1963). Структура молекулы иммуноглобулина, за исключением концевых участков, всегда относительно неизменна (константна). Константные участки тяжелых цепей иммуноглобулинов определяют их класс, структуру и особые свойства. У человека различают пять различных классов иммуноглобулинов (IgM, IgG, IgD, IgA и IgE) (Black, 1997; Harlow, Lane, 1988). Изначально В-клетки экспрессируют молекулы IgM, но в результате сдвига изотипа могут переключаться на другие классы (Gathings et al., 1977; Tangye et al., 2002; Saiki et al., 1980); одновременно одна В-клетка может экспрессировать несколько классов иммуноглобулинов с идентичными сайтами связывания антигенов (Gathings et al., 1977). Концевые участки легких и тяжелых цепей иммуноглобулина отвечают за специфичное связывание с антигеном и, в отличие от константных участков, демонстрируют крайне высокую вариабельность структуры. Подобная структура белковой молекулы долгое время вызывала споры о механизме ее образования. Для объяснения этого феномена была предложена модель 12 «два гена – один полипептидный продукт», подразумевающая объединение разрозненных участков на стадии ДНК или РНК для синтеза полноценной белковой молекулы (Dreyer, Bennett, 1965). Впоследствии Hozumi и Tonegawa (Hozumi, Tonegawa, 1976) сравнивая ДНК из эмбриональных клеток мышей Balb/c и клеток плазмацитомы этих же мышей MOPC321 продемонстрировали пространственное разделение двух фрагментов – V (от английского “variable”) и C (от английского “constant”) – в исходной последовательности ДНК и «создание» полноценного гена иммуноглобулина в процессе дифференцировки В-клетки. Эта работа, доказывающая перестройки в ДНК соматических клеток млекопитающих, была удостоена Нобелевской премии в 1987 году. Дальнейшие исследования локусов иммуноглобулинов показали, что вариабельные участки ДНК кодируются набором из трѐх разных генов для тяжелой и двух разных генов для легкой цепи иммуноглобулина соответственно. Гены, кодирующие концевые участки тяжелой цепи иммуноглобулинов, получили названия V- (от английского “variable”), D- (от английского “diversity”) и J- (от английского “joining”). Концевые участки лѐгкой цепи иммуноглобулина кодируются только V- и J-генами. Каждый из этих генов, в свою очередь, представлен несколькими вариантами, расположенными кластерами на большом расстоянии друг от друга. Особенно велико разнообразие V-генов: у человека их существует около сотни вариантов для каждой цепи иммуноглобулина (Cook, Tomlinson, 1995). Сборка функционального гена иммуноглобулина осуществляется путем рекомбинации на ранних этапах жизни В-лимфоцита (Reth, Nielsen, 2014). К С-гену (от английского “constant”), кодирующему неизменную часть цепи иммуноглобулина, присоединяется случайная комбинация из V- D- и J-генов (для тяжелой цепи) или V- и J-генов (для лѐгкой цепи). Таким образом, иммуноглобулины индивидуальны для каждого клона Влимфоцитов. Подобная изменчивость обеспечивает огромное разнообразие репертуара молекул иммуноглобулинов в иммунной системе организма (Rajewsky, 1996). Генетические перестройки, необходимые для начала синтеза иммуноглобулинов, начинаются в В-лимфоците очень рано – на стадии ранней В и про-В клетки (Ghia et al., 1996, Imamura et al., 2005, Davi et al., 1997). Перестройка генов иммуноглобулинов происходит в несколько этапов. На стадии ранней В и про-В клетки путем последовательной рекомбинации формируется DJ-фрагмент тяжелой цепи иммуноглобулина, затем к нему присоединяется Vфрагмент. Представление синтезированных иммуноглобулинов на плазматической мембране происходит на стадии пре-В клетки (Zouali, 2014). Крупная пре-В-II-клетка способна экспрессировать на поверхности всю тяжелую цепь иммуноглобулина в составе пре-Врецептора (Zouali, 2014). От зрелого В-клеточного рецептора его отличает отсутствие легких 13 цепей иммуноглобулинов, так как их рекомбинация происходит позже. Вместо них в составе пре-В-рецептора присутствует так называемая суррогатная легкая цепь, состоящая из продуктов генов VpreB и λ5/14.1. С подмембранной частью пре-В-рецептора ассоциируются тирозинкиназы, формирующие сигнальный каскад. Пре-В-рецептор стимулируется связыванием с белками стромы костного мозга или перекрестным взаимодействием суррогатных легких цепей (Zouali, 2014) и запускает сигнальный каскад. Таким образом проходит проверка функциональности рецептора. Не получающие сигнала клоны В-клеток погибают, а прошедшие селекцию клоны переходят к перестройке легких цепей иммуноглобулина. Первой перестройку, как правило, проходит κ-цепь, при неудачной рекомбинации перестраивается λ-цепь. Готовый В-клеточный рецептор экпрессируется на поверхности наивных зрелых лимфоцитов костного мозга. Перед выходом из костного мозга он проходит проверку на аутореактивность. Чрезмерно сильный сигнал в ответ на связывание с аутоантигенами вводит клетки в состояние анергии (Cambier, Getahun, 2010). Поиск аутоантигенов, участвующих в селекции пре-В-клеток, в строме костного мозга все еще ведется, однако предполагается, что ведущую роль на этом этапе играют конформационные изменеия рецептора и так называемый «тонический» сигнал через него (Melhers, 1999; Tolar, Pierce, 2010). Таким образом, молекула иммуноглобулина, связываясь адапторными белками CD79a и CD79b и подмембранными тирозинкиназами, формирует сигнальную структуру – Вклеточный рецептор, – которая дважды играет определяющую роль в выживании и дифференцировке В-лимфоцита: первый раз сигнал передается через пре-В-клеточный рецептор в антиген-независимую фазу созревания, а второй раз – через зрелый Вклеточный рецептор в антиген-зависимую фазу созревания В-клетки. 2.1.3 Антиген-зависимоый этап созревания В-клеток Дальнейшее созревание В-лимфоцита происходит после его выхода из костного мозга на периферии иммунной системы и подразумевает стимулирование зрелого В-клеточного рецептора антигеном для его более тонкой настройки. Этот этап формирования В-клетки является антиген-зависимым иммуноглобулина. Помимо и также описанных может быть механизмов связан с модификацией изменчивости, гена обуславливающих разнообразие молекул иммуноглобулинов, отдельные области V-региона гена тяжелой цепи отличаются гипервариабельностью, что обуславливает такое явление как соматическая гипермутация генов иммуноглобулинов (MacLennan, 1994) в зрелых В-лимфоцитах. 14 Для наивной В-клетки, покинувшей костный мозг, связывание В-клеточного рецептора (BCR) с антигеном обеспечивает активацию и окончательное созревание. В зрелом терминально дифференцированном состоянии В-клетки могут существовать в виде клеток памяти, экспрессирующих иммуноглобулины в виде рецепторов, или плазматических клеток, экспрессирующих иммуноглобулины в виде антител (Berkowska et al., 2011; Pieper et al., 2011). Существуют два пути созревания В-лимфоцита: оно может проходить по Т-зависимому или Т-независимому пути (Owens, Zeine, 1989). Т-независимыми (T-Independent, TI) антигенами двух типов (TI-1 и TI-2), как правило, являются устойчивые к деградации бактериальные белки, полисахариды и липополисахариды бактериальной стенки, вирусные частицы. В случае с подобными антигенами активация происходит напрямую в результате их связывания с рецептором В-лимфоцита. В процессе задействован только комплекс BCR и его ко-рецепторы, первичный иммунный ответ в среднем слабее, чем при активации Т-зависимыми антигенами (Pieper et al., 2011). Также, преимущественно секретируемым иммуноглобулином во время TIответа является онтогенетически самый ранний IgM и, таким образом, можно говорить, что у Tнезависимой популяции В-клеток при активации созревание не проходит до конца. Активация В-клеток Т-зависимыми антигенами включает кооперацию с Т-лимфоцитами, презентацию антигена Т-клетке с участием как BCR, так и других сигнальных поверхностных молекул. Важнейшую сигнальную роль в этом процессе выполняют молекулы плазматической мембраны CD40, CD80 и CD86 (Gruss et al., 1997; Mir, Agrewala, 2008). Так же, как и комплекс BCR, эти рецепторы ассоциированы с цитоплазматическими тирозинкиназами и тирозинфосфатазами (Kehry, 1996; Slavik et al., 1999). Сигнальные каскады от них дополняют и моделируют сигнал фосфорилирования, получаемый от BCR, и обуславливают запуск в Вклетках программ выживания и пролиферации. В процессе Т-зависимой активации В-клетка мигрирует в лимфатические узлы и включается в герминальный центр фолликула, где проходит соматическую гипермутацию вариабельных участков генов тяжелых цепей иммуноглобулинов (VH-генов). Соматическая гипермутация – генетическая перестройка малых участков V-региона – происходит в герминальном центре вторичного фолликула в периферической лимфоидной ткани (MacLennan, 1994) и требует сложных межклеточных взаимодействий, затрагивающих не только BCR, но и другие поверхностные сигнальные молекулы. Основные ко-стимуляторные сигналы В-клетки на данном этапе получают от Т-клеток (Zhang et al., 2013). Посредством соматической гипермутации происходит наиболее тонкая настройка аффинности молекулы иммуноглобулина, представленной в виде рецептора на поверхности В-клетки, и селекция клонов В-клеток с оптимальной специфичностью и афинностью (Maul, Gearhart, 2010). Прошедший тонкую настройку В-клеточный рецептор проходит тест на афинность в 15 герминальном центре фолликула: в зависимости от интенсивности сигнала фосфорилирования через него клетка выживает или уходит в апоптоз (Zhang et al., 2013). Подобный механизм является наиболее прогрессивным с эволюционной точки зрения, однако не все популяции Влимфоцитов в организме проходят этап гипермутации в процессе своего созревания (Pieper et al., 2011). Таким образом, митогенные и антиапоптотические сигналы передаются в ядро через В-клеточный рецептор и ко-рецепторные комплексы, отличающиеся в зависимости от пути активации В-лимфоцита. В зависимости от привлеченных ко-рецепторов сигнал может изменяться и приводить к разным последствиям для В-клетки. 2.1.4 В-клеточный рецептор и сигнальный каскад от него Молекула иммуноглобулина (чаще M или G-класса, реже D-класса) составляет рецептор В-клетки вместе с гетеродимером из трансмембранных белков с киназной активностью – CD79a и CD79b. Сигнальный каскад от В-клеточного рецептора на первых этапах включает в себя цепочку специализированных тирозинкиназ, последовательно подвергающихся фосфорилированию. На данный момент существуют две гипотезы сборки функционального Вклеточного рецептора – модель преассоциации и модель сборки сигнальных доменов (Geisberger et al., 2003). Однако в обоих случаях функциональное состояние BCR подразумевает кластеризацию поверхностных белков рецептора и ко-рецепторных молекул в одном липидном рафте, а также их ассоциацию с сигнальными подмембранными белками. Наиболее распространенные модели исследования подобных взаимодействий – трансгенные и нокаутные мыши, линии на основе В-лимфоцитов птиц DT40, а также постоянные культуры гемопоэтических опухолей человека. Основываясь на общих данных, полученных из этих моделей, можно представить схему верхних компонентов сигнального ВCR-каскада. Схема трансмембранных и подмембранных компонентов В-клеточного рецептора с ключевыми участниками сигнального BCR-каскада приведена на Рисунке 1. В каноническом варианте сигнального каскада от В-клеточного рецептора сигнал фосфорилирования последовательно передается от CD79a и CD79b на тирозинкиназу LYN из семейства SRC, которая является первой ступенью передачи сигнала по BCR-каскаду непосредственно под клеточной мембраной (Pao, Cambier, 1997). Эта тирозинкиназа фосфорилируется по двум сайтам: Tyr416 и Tyr527. Наличие фосфатной группы на том или ином тирозине в составе LYN определяет ее функциональное состояние и соответственно ингибирует или активирует проведение сигнала к другим компонентам каскада (Donella-Deana et al., 1998). 16 Рисунок 1. Схема трансмембранной и подмембранной части В-клеточного рецептора и ассоциированных с ним сигнальных молекул. На уровне LYN осуществляется обратная связь в цепи передачи сигнала: эта тирозинкиназа активирует ингибиторы сигнала, передаваемого через В-клеточный рецептор, в чиcло ее регуляторов входят тирозинкиназа CSK (Donella-Deana et al., 1998) и ряд тирозинфосфатаз, как трансмембранных, так и подмембранных. Каноническими ингибиторами LYN являются трансмембранная тирозинфосфатаза CD45, характерная для всех лейкоцитов (Pao, Cambier, 1997). Кроме того, ее ингибирует подмембранная тирозинфосфатаза SHP-1, встречающаяся в дендритных клетках, а также в Т- и В-лимфоцитах (Somani et al., 2001; Xu et al., 2002, Geisberger et al., 2003). В цепи передачи сигнала от BCR LYN находится над тирозинкиназой SYK и регулирует ее активность. Цитоплазматическая тирозинкиназа SYK подвергается фосфорилированию по Tyr352, а затем – трансаутофосфорилированию по TyrTyr525/526. Полностью фосфорилированная форма SYK является функционально активной и способна эффективно участвовать в передаче сигнала. Для киназы SYK характерны 2 SH2-повтора и наличие Сконцевого каталитического домена. Как правило, ближайший к С-концу SH2-домен реагирует с ключевыми внутриклеточными медиаторами сигнала, активируя их (Flippakopoulos et al., 2009). 17 Так, известно, что после активации В-клеточного рецептора фосфорилированная форма SYK запускает PKB(Akt)-сигнал, а также стимулирует PLCγ (Li et al. 1999, Law et al. 1996, Geisberger et al. 2003). Родственная SYK тирозинкиназа ZAP-70 в норме играет аналогичную роль в передаче сигнала от Т-клеточного рецептора. Долгое время считалось, что ZAP-70 не экспрессируется в норме В-клетками, зато ее присутствие было выявлено при патологическом состоянии Влимфоцитов: при В-клеточном хроническом лимфолейкозе (В-ХЛЛ) уровень ее экспрессии и метилирования, как правило, ассоциируется с неблагоприятным клиническим прогнозом (Vroblova et al., 2012; Claus et al., 2014). Лишь недавно киназа ZAP-70 была описана на малых популяциях неопухолевых В-клеток (Scielzo et al., 2006), при этом ее функция как в нормальных, так и в опухолевых В-лимфоцитах остается неясной (Gobessi et al., 2007; Deaglio et al., 2007) и, скорее всего, отличается от ее функции в Т-клетках. Передача сигнала от специализированных тирозинкиназ на ключевые для клетки молекулы – фосфолипазу С (PLCγ) и протеинкиназу В – может осуществляется как напрямую, так и через ряд канонических медиаторов. Так, для изоформы PLCγ1 в культуре была показана способность формировать комплексы непосредственно с киназой SYK и активироваться ею (Law et al., 1996). В качестве промежуточных переносчиков сигнала в В-клетке выступают, как правило, фосфатидил-инозитол-3 киназа (PI3K) и киназа BTK. Фосфатидил-инозитол-3 киназа присутствует в лейкоцитах преимущественно в изоформе delta и способна ассоциироваться с фосфорилированными сайтами В-клеточного рецептора и его ко-рецепторнов (Fung-Leung, 2011). Связывание активирует ее каталитический домен, который фосфорилирует фосфатидил-инозитол-4,5-бифосфат (PIP2) до фосфатидил-инозитол3,4,5-трифосфата (PIP3). PIP3 в свою очередь активирует цитоплазматические киназы BTK и Akt (протеинкиназу В) (Maas, Hendriks, 2001; Scheid, Woodgett, 2003). Мишенями Akt-каскада в ядре лимфоцита становятся транскрипционные факторы NFAT (Martin et al., 2012) и семейство транскрипционных факторов Forkhead – так называемые FoxO (Сhaturvedi et al., 2011). Цитоплазматическая киназа BTK в основном экспрессируется в лейкоцитах и играет важную роль в созревании В-клеток (Maas, Hendriks, 2001). После связывания с PIP3 она фосфорилируется Src-киназами по Tyr551 и аутофосфорилируется по Tyr223. Фосфорилированная киназа BTK активирует изоформу PLCγ2 (Guo et al., 2004). Сигнальный каскад от фосфолипазы С мобилизует выброс ионов кальция из эндоплазматического ретикулума через инозитол-трифосфат (IP3) и активирует ядерные транскрипционные факторы NF-κB, Oct-2 Bcl-XL, Bcl-2, Jun и Fos через диацилглицерол (DAG) и протеинкиназу С (PKC) (Numaga et al., 2010), что обеспечивает запуск ключевых для клетки 18 программ выживания и пролиферации. Полная схема каскада от B-клеточного рецептора до его основных эффекторов приведена на Рисунке 2. Рисунок 2. В-клеточный рецептор и основные участники сигнального каскада от него. Рисунок приведен из KEGG Pathway Database; #04662 (http://www.genome.jp/kegg- bin/show_pathway?hsa04662. Таким образом, начальные этапы передачи сигнала от BCR обеспечиваются BCRассоциированными тирозинкиназами и тирозинфосфатазами (SYK, LYN, ZAP-70, SHP-1), которые активируют универсальные сигнальные молекулы – PI3K, PLC, PKB/Akt и PKC напрямую или через дополнительных посредников. Эффекторными молекулами BCRкаскада являются транскрипционные факторы, обеспечивающие размножение и выживание клеток. 2.1.5 Иммунофенотип В-клеток Помимо специфического комплекса BCR на поверхности В-клетки находится большой набор различных молекул, являющихся рецепторами, ко-рецепторами, лигандами, транспортерами или молекулами адгезии. Вместе они обеспечивают активацию клеток, их 19 миграцию в организме по сложным траекториям и, в конечном счете, выполнение их функции в составе иммунной системы. Набор экспрессируемых поверхностных молекул дает точный портрет клетки в зависимости от еѐ свойств и степени зрелости. Вместе с другими видами лейкоцитов В-клетки были подробно охарактеризованы по составу поверхностных маркеров. Несмотря на то, что молекулы плазматической мембраны лейкоцита различаются по структуре и функциям, они объединены номенклатурным названием «CD», что может расшифровываться как «cluster of differentiation» или «cluster of designation». Первые исследования поверхностных молекул проводились на лейкоцитах «вслепую», и аббревиатура CD с порядковым номером присваивалась кластеру антител, демонстрирующих аффинность к одной и той же поверхностной молекуле. В дальнейшем это название закреплялось и за идентифицированном таким способом антигеном. Номенклатура CD была впервые предложена на Первой Международной Школе и Конференции HLDA в 1982 году (Bernard, Boumsell, 1984); по мере включения в список новых молекул им присваивались восходящие порядковые номера. Система претерпела с тех пор ряд серьезных дополнений (Zola, Swart, 2005; Llinàs et al., 2011; Matesanz-Isabel et al., 2011) и на сегодняшний день насчитывает более 300 различных описанных молекул CD, многие из которых уже не относятся к клеткам крови. Для характеристики В-лимфоцитов в норме и при ряде патологических состояний наиболее распространены следующие поверхностные маркеры: CD45, CD79a, CD79b, CD19, CD20 (FMC7), CD22, СD23, CD27, CD38, CD43 и СD5. CD45 является пан-лейкоцитарной маркерной молекулы, которая используется для начального определения клеток крови (van Lochem et al., 2004). Эта молекула экспрессируется на плазматической мембране клеток крови, начиная со стадии стволовой клетки крови (van Lochem et al., 2004). Существует в нескольких изоформах, которые экспрессируются на различных субпопуляциях лейкоцитов в зависимости от степени их зрелости и функционального состояния (van Lochem et al., 2004). Цитоплазматический домен молекулы CD45 обладает тирозинфосфатазной активностью, для В-клеток была показана его ингибиторная роль в проведении BCR-сигнала (Hermiston et al., 2003). Антигены CD79a и CD79b также иногда называются Ig-alpha и Ig-beta из-за их вовлеченности в состав В-клеточного рецептора, хотя структурно они не являются иммуноглобулинами. гетеродимер, соединяющий Эти молекулу две трансмембранные иммуноглобулина с молекулы подлежащими образуют цитоплазматическими тирозинкиназами LYN и SYK через специализированные фосфорилируемые активационные домены (ITAM) (Pao, Cambier, 1997; Pao et al., 1998). Поверхностные молекулы CD19, CD20 и CD22 относятся к ко-рецепторам BCR. CD19 появляется на поверхности В-лимфоцита на стадии про-В и колокализуется с В-клеточным 20 рецептором в одном липидном рафте (Pierce, 2002). Также, согласно колокализационным исследованиям, белок CD19 в цитоплазме связан с фосфатидил инозитол-3 киназой (PI3K) и, вероятно, через нее участвует в передаче сигнала внутрь клетки (Okkenhaug et al., 2003). Данные о независимом от BCR связывании антигена CD19 указывают на его самостоятельную способность мобилизовывать ионы кальция и, таким образом, влиять на активацию и выживание В-лимфоцитов (Monroe, 2004). Белок CD20 представляет собой ионный канал (Bubien et al., 1993) и также рано экспрессируется на В-клетках (Bofill et al., 1985). При гиперэкспрессии на поверхности он переходит в активированную гликозилированную форму FMC7 (Deans, Polyak, 2008). Уровень белка и соотношение его гликозилированной и негликозилированной форм являются маркерами некоторых патологических состояний В-лимфоцита (Delgado et al., 2003). Несмотря на то, что антиген CD20 был описан на низком уровне на популяции Т-клеток (Hultin et al., 1993), он вместе с CD19 и CD22 относится к пан-В-клеточным маркерам. Молекула CD22, представляющая собой иммуноглобулиноподобный ко-рецептор, появляется на В-клетках на стадии пре-В (Hardy, Hayakawa, 2001). CD22 способен связываться как с киназой SYK и фосфолипазой С, так и с фосфатазой SHP-1 (Cyster, Goodnow, 1997). Его функция остается не до конца ясной, так как в составе его цитоплазматической части обнаружены как ингибирующие (ITIM), так и активирующие (ITAM) проведение сигнала фрагменты. Однако преобладают данные о том, что в физиологических условиях основная его роль - это ингибиторный ко-рецептор и модулятор порога чувствительности для BCR (Walker, Smith, 2008; Tsubata, 2012). Вместе CD19, CD20 и CD22 обеспечивают «тонкую настройку» В-клеточного рецептора, регулируя силу поступающего от него сигнала, и отвечают за выживание и селекцию Вклеточных клонов. Особенно важно их участие в селекции В-лимфоцитов, активирующихся по Т-независимому механизму, так как для Т-зависимых В-клеток аналогичную роль могут играть другие ко-стимуляторные молекулы, такие как CD40 и CD40L (Gruss et al., 1997). Активационный маркер CD23 обнаруживается не только на В-лимфоцитах, но и на ряде других клеток, в том числе на фолликулярных дендритных клетках (Yokota et al., 1988). Однако на разных типах клеток он экспрессируется в разных изоформах отличающихся всего 6-7 аминокислотами: изоформа CD23А характерна исключительно для В-лимфоцитов, является низкоафинным рецептором и негативным регулятором иммуноглобулина Е, и обладает плейотропным эффектом на иммунный ответ (Getahun et al., 2005). CD23A изоформа также ассоциирована с подмембранной киназой семейства SRC – LYN (Sugie et al., 1995). В субпопуляции активированных В-клеток и на дендритных клетках детектируется изоформа CD23В (Yokota et al., 1988). CD23 является ко-рецептором для BCR-комплекса и помимо IgE 21 взаимодействует со множеством лигандов, включая CD21 и членов двух семейств интегринов (Acharya et al., 2010). Также CD23 является полезным маркером для диагностики и прогноза течения опухолевых заболеваний, включая В-ХЛЛ и ряд лимфом (Acharya et al., 2010). CD38 – трансмембранный гликопротеин, который экспрессируется на нескольких стадиях развития В-лимфоцита. Он детектируется как на ранних предшественниках В-клеток, так и на зрелых терминально дифференцированных В-лимфоцитах (Deaglio et al., 2001). Помимо этого, он экспрессируется на наивных (CD4+/CD45RA+) и субпопуляции регуляторных Т-клеток (CD4+/CD25+), а также на клетках врожденного иммунитета, включая гранулоциты и NK-клетки (Malavasi et al., 2008). Он обладает целым рядом функций, так, он может работать как эктоэнзим с (ADP)-рибозилциклазной активностью, участвуя в мобилизации кальциевых потоков (Deaglio et al., 2001). Помимо этого, Matsuo и соавторы показали его способность ассоциироваться с подмембранным регулятором тирозинкиназ CBL и автономно проводить сигнал в обход В-клеточного рецептора (Matsuo et al., 1996; Deaglio et al., 2001). Естественным лигандом к CD38 является молекула CD31, экспрессирующаяся на клетках эндотелия и дендритных клетках, которая может участвовать в активации и миграции В-клеток (Deaglio et al., 1998). CD27 – белок из семейства рецепторов к факторам некроза опухолей– является маркером терминальной дифференцировки для В-лимфоцитов (Klein et al., 1998). Он экспрессируется на умеренном уровне на В-клетках памяти и на высоком уровне – на плазматических клетках. Поверхностный гликопротеин CD5 был изначально выявлен на нормальных Тлимфоцитах. В норме CD5 появляется в процессе созревания Т-клеток в тимусе c низким уровнем экспрессии в незрелых CD4-CD8- тимоцитах; по мере созревания его уровень увеличивается в CD4+CD8-, CD4-CD8+ и CD4+CD8+ субпопуляциях в ответ на активацию TCRлигандного комплекса (Arman et al, 2004). На мышиной модели было дополнительно показано, что уровень экспрессии CD5 коррелирует с авидностью TCR. (Azzam et al, 1998). CD5+ клетки составляют значительную долю эмбриональной лимфоидной ткани плода, но количество их падает к моменту рождения. В постнатальном периоде CD5+ В-лимфоциты обнаруживаются в основном в мантийной зоне лимфоидных фолликулов и в том числе в миндалинах (до 30% Вклеток с фенотипом мантийной зоны экспрессирует CD5) (Su et al., 2000). Молекула CD5, имеет сайты связывания с внутриклеточными тирозинфосфатазами и этом случае исполняет роль отрицательного регулятора передачи сигнала. В Т-клетках она физически ассоциирована с SHP-1 тирозинфосфатазой и участвует в сигнальном каскаде Тклеточного рецептора (TCR) (Perez-Villar et al., 1999). Для В-клеток показана колокализация CD5 в одном липидном рафте с В-клеточным рецептором. Как и в случае с Т-клетками, молекула CD5 имеет ингибиторную функцию. Она связывает CD79-alpha/CD79-beta часть BCR 22 c SH2-фосфатазой SHP-1, которая играет роль негативного регулятора в передаче сигнала. После каскада фосфорилирования через тирозинкиназы LYN и SYK становится возможной дальнейшая передача сигнала внутрь клетки. Фосфатаза SHP-1 при этом отделяется от рецепторного комплекса по достижении им определенного уровня фосфорилирования. CD43 – лейкосиалин – относится к семейству муцинов и связывается с адгезивной молекулой PECAM-1 (CD54). CD43 может экспрессироваться на множестве различных типов клеток, но на В-клетках выявляется редко. Его появление часто связывают с лимфопролиферативными заболеваниями, однако он не является специфическим для какоголибо из них. В норме он может недолго экспрессироваться В-клеточными предшественниками на стадии про-В и небольшим количеством перифолликулярных В-клеток кишечника (Lee et al., 2005). Таким образом, набор поверхностных молекул на мембране лейкоцита позволяет дать развернутую характеристику его происхождения и функционального состояния. С методической точки зрения, прорыв в этой области связан с использованием метода проточной цитофлуориметрии (Shapiro, 2003) который позволяет одновременно анализировать большие наборы антигенов на поверхности большого количества клеток. Значительный объем информации о структуре, функциях и паттернах экспрессии поверхностных антигенов, накопленный на сегодняшний день, обусловили ведущую роль иммунофенотипирования при описании любых патологических состояний, связанных с лейкоцитами. В частности, диагностика В-клеточных лимфом требует развернутого описания поверхностных антигенов. 2.2 В-клеточные опухоли. Дифференциальная диагностика. Гетерогенность в группе CD5-положительных В-клеточных лимфом 2.2.1 Не-Ходжкинские лимфомы Представление об опухолях лимфатической системы начало формироваться в середине XIX века – задолго до представлений о лимфоцитах, их особенностях и свойствах (Hamblin, 2000). Первые упоминания о болезни «лейкемия» связаны с именами Джона Хью Беннетта и Рудольфа Вирхова. Последний и предложил термин для обозначения заболевания, в то время как Беннет изначально использовал название «лейкоцитемия». Все первые описанные случаи помимио инвертированного соотношения красных и бесцветных «телец» в крови пациента отличала спленомегалия, чуть реже гепатомегалия и лимфоаденопатия. Позднее Вирхов предложил первую классификацию лейкемий на «селезеночную» и «лимфатическую» формы, 23 указав, что для селезеночной формы характерны гранулярные лейкоциты с ядром в форме трилистника, а для лимфатической – агранулярные лейкоциты с круглыми ядрами. Вирхов полагал, что опухолевые клетки происходят из лимфы или из селезенки. На вовлеченность в процесс образования лейкемии костного мозга впервые в 1870 году обратил внимание Эрнст Нойманн, предложив два механизма ее развития: с превалированием гранулярных и агранулярных элементов соответственно. Параллельно с этим существовал и использовался термин «лимфома» для обозначения иной нозологической формы – опухоли лимфатических узлов, описанной Томасом Ходжкиным. Термины «лимфома» и «лимфосаркома» исторически использовались разными авторами для обозначения заболеваний, поражающих лимфатические узлы, но не кровь и костный мозг, как лейкемия. В дальнейшем, термин «лимфома Ходжкина» – историческое название лимфогранулематоза – оказался некорректным, а собственно лимфомы получили название неХоджкинских. Гетерогенность внутри группы не-Ходжкинских лимфом не вызывала сомнений, однако диагностические критерии для нозологических форм внутри нее вырабатывались постепенно и сравнительно долго. На сегодняшний день в мире ежегодно регистрируется более 300 000 случаев неХоджкинских лимфом, что составляет примерно 2.8% от общего количества опухолей (Skibola, 2007). Наибольшую часть случаев в Восточной Европе и России составляет В-клеточный хронический лимфолейкоз (В-ХЛЛ) (Sant et al., 2010). Заболевание встречается преимущественно у лиц зрелого и пожилого возраста (средний возраст больных составляет около 60 лет). Болезнь на начальных стадиях не имеет симптомов и чаще всего выявляется случайно, при обращениях к врачу по другим поводам. Протекание болезни может быть агрессивным или индолентным с большой разницей в прогнозе. Для определения прогноза течения заболевания в разное время пытались использовать ряд показателей, таких, как возраст больных, выраженность анемии, тромбоцитопении, степень гиперплазии лимфатических узлов и селезенки, характер инфильтрации костного мозга. Однако каждый из этих показателей имеет весьма ограниченное значение. Поиск наиболее характерной для этой болезни хромосомной аберрации также дал мало результатов: ни одна из них не оказалась специфичной для В-ХЛЛ или присутствующей в большинстве случаев этого заболевания. Таким образом, опухоли из лимфоцитов получили название не-Ходжкинских лимфом. Первой описанной и одной из самых распространенных на сегодняшний день В-клеточной лимфомой является В-клеточный хронический лимфолейкоз (В-ХЛЛ). Однако долгое время оставались невыявленными критерии клинического прогноза для этого заболевания. Возможно, внутри этой большой и разнородной группы может быть выделено несколько нозологических форм. 24 2.2.2 Дифференциальная диагностика лимфом Несмотря на то, что первые диагностические критерии для самой распространенной на сегодняшний день болезни накопления В-клеток, B-ХЛЛ, были предложены Тѐрком еще в 1903 году, схожесть клинических и фенотипических черт часто затрудняла попытки отличить В-ХЛЛ от других лимфом. Прорыв в диагностике лимфом был обусловлен прорывом в иммунологии. Так, успехи в исследовании клеток адаптивной иммунной системы и их различий позволили установить, что В-ХЛЛ является болезнью накопления В-клеток (Wilson, Nossal, 1971; Grey et al., 1971). Иммунофенотипирование клеток опухоли показало, что уровень иммуноглобулина на их поверхности ниже, чем на нормальных В-клетках (Chen, Heller, 1978), помимо иммуноглобулина М (IgM) на них часто присутствует IgD (Preud’homme et al., 1974), а кроме него, на их поверхности выявляется Т-клеточный антиген CD5 (Caligaris-Cappio et al., 1982). Многие заболевания ошибочно относились к группе В-ХЛЛ при масштабных исследованиях. Постепенно каждая новая нозология приобретала свои специфические диагностические признаки и откалывалась от общей группы. Последней на сегодняшний день от группы В-ХЛЛ отделилась лимфома из клеток мантийной зоны (ЛКМЗ) (De Oliveira et al., 1989). Эта лимфома имеет некоторые фенотипические черты В-ХЛЛ, однако встречается значительно реже и характеризуется значительно менее благоприятным клиническим прогнозом. Заболевание может возникать у более молодых людей и характеризуется агрессивным клиническим течением, проявляющимся в низкой эффективности стандартной химиотерапии зрелоклеточных лимфом, короткой общей и безрецидивной выживаемости больных. Частота так называемой бластной трансформации при ЛКМЗ значительно выше, чем при В-ХЛЛ. Иммунофенотипически клетки В-ХЛЛ и ЛКМЗ представляют собой клональные малые зрелые лимфоциты с неканонической экспрессией поверхностной молекулы CD5. Однако между ними можно выявить ряд различий: для В-ХЛЛ типичным является фенотип CD5+/CD19+/CD23+/FMC7-. По сравнению с нормальными В-клетками, клетки В-ХЛЛ почти не экспрессируют CD20, CD79b и поверхностные иммуноглобулины. Вдобавок, опухолевые клетки В-ХЛЛ обычно экспрессируют на повышенном уровне CD27, что позволяет идентифицировать их как В-клетки памяти (van Oers et al., 1993). Для ЛКМЗ характерны фенотип CD5+/CD19+/CD23-/FMC7+, а также высокий уровень экспрессии поверхностных иммуноглобулинов и остальных компонентов сигнального BCR-комплекса. Уровень поверхностного CD27 при ЛКМЗ понижен по сравнению с В-ХЛЛ и не отличается от уровня на нормальных В-клетках и других зрелоклеточных В-лимфомах (Dong et al., 2002), хотя последние публикации, основанные на анализе масс-спектрометрическом данных, выявили 25 количественное увеличение CD27 в В-клетках пациентов с ЛКМЗ (Boyd et al., 2009). Маркер активации CD38 встречается почти во всех случаях ЛКМЗ, но лишь в части случаев В-ХЛЛ, преимущественно с агрессивным течением (Domingo-Domenech et al., 2002). Помимо ряда иммунофенотипических различий, ЛКМЗ, в отличие от В-ХЛЛ, имеет выявленную ведущую хромосомную транслокацию – t(11;14) (Raffeld, Jaffe, 1991). Ген BCL-1 в результате этой транслокации перемещается под промотор тяжелой цепи иммуноглобулина, что обуславливает его гиперэкспрессию. Также оказывается аберрантно повышенным и уровень белкового продукта этого гена – циклина D1 (de Boer et al., 1995). Чаще всего, перечисленных различий хватает для того, чтобы достоверно поставить дифференциальный диагноз, однако иногда выявляются формы с промежуточной комбинацией признаков. Даже после отделения группы ЛКМЗ среди больных с иммунофенотипом В-ХЛЛ наблюдалась гетерогенность, связанная с внушительными различиями в протекании болезни. Продолжительность жизни при В-ХЛЛ может колебаться в диапазоне от 8-16 месяцев до 15 лет и более. Еще в 1966 Galton описал два варианта В-ХЛЛ (Galton, 1966): пролиферативный (с неблагоприятным прогнозом) и стабильный (с благоприятным прогнозом) и это разделение болезни на две формы сохраняет актуальность до сих пор (Zanesi et al., 2012). Таким образом, дифференциальная диагностика CD5-положительных В-клеточных лимфом сводится к последовательному выделению новых нозологических форм из группы В-ХЛЛ. Так, иммунофенотип и гиперэкспрессия гена циклина D1 позволили разделить ВХЛЛ и ЛКМЗ. На сегодняшний день потребность в критериях для дифференциальной диагностики CD5-положительных лимфом по-прежнему сохраняется. Постепенно накапливающиеся знания о биологии В-клеток ложатся в основу диагностических критериев для новых подгрупп. 2.2.3 Возможные предшественники CD5-положительных лимфом Помимо исследований механизмов малигнизации клеток, вопрос о происхождени опухолей включает в себя также и поиск их нормальных клеток-предшественников. Этот вопрос широко обсуждается в литературе и в случае с опухолями лимфатической системы однозначный ответ не всегда достижим из-за большого разнообразия вариантов поверхностного иммунофенотипа лимфоцитов и его частых смен на протяжении жизни клетки по мере прохождения ею разных функциональных стадий. Наличие на клетках В-ХЛЛ и ЛКМЗ неканонического маркера CD5 долгое время считалось одним из основных проявлений их опухолевой природы и до сих пор заставляет рассматривать нормальные CD5+ В-клетки как их наиболее возможных предшественников. 26 Исторически, небольшая субпопуляция нормальных В-клеток, несущих CD5 на поверхности, впервые была описана у мышей и названа B1 (или B1a) клетками. Они отличаются от обычных В-лимфоцитов (В2- или В0-клеток по разной номенклатуре) по целому ряду иммунофенотипических признаков (уровням экспрессии IgM, IgD, CD43 и CD45), а также по локализации и функции в организме. У мышей В1а клетки были изучены наиболее подробно: это долгоживущие, крупные клетки, демонстрирующие повышенные величины как прямого, так и бокового светорассеяния. Помимо коэкспрессии CD5/CD19, они имеют иммунофенотип: CD45 low, CD23-, CD43+, IgM high, IgD low. Эти клетки обнаруживаются в плевральной и перитонеальной полостях (Berland, Wortis, 2002). Большинство работ по исследованию локализации и функций В1а-клеток в организме также проводились на мышах. Преобладает мнение, что эта линия В-лимфоцитов выделяется на ранних этапах в эмбриогенезе и далее существует обособленно и независимо от других В-лимфоцитов постнатального костного мозга. Вторая гипотеза опирается на результаты опытов по индуцированной дифференцировке in vitro и заключается в том, что иммунофенотип В1а-клеток приобретается нормальными B2-лимфоцитами в ответ на их стимуляцию Т-независимыми (TI-2) антигенами (Faragasan, Honjo, 2000). У человека, как и у мышей, по наличию маркера CD5 была выделена субпопуляция так называемых «В-клеток врожденного иммунитета», зачастую в обзорах CD5+ В-лимфоциты мыши и человека рассматриваютя вместе (Sindhava, Bondada, 2012). Однако из-за серьезных различий в строении иммунной системы этих двух видов прямые аналогии не всегда корректно проводить. Не следует также забывать, что у других видов млекопитающих (например, в периферической крови кролика) все В-лимфоциты могут быть положительны по CD5 (Raman, Knight, 1992). У человека локализация CD5+ В-лимфоцитов преимущественно связана с лимфоидной тканью слизистых оболочек (mucosa-associated lymphoid tissue, MALT), преимущественно с областью кольца Пирогова-Вальдейера. Это объясняется тем, что в иммунологическом плане она одна из самых активных, и разнообразие В-клеточных популяций в ней наибольшее (Bienenstock, 1982; Lugton, 1999; Dono et al., 2004). По данным разных авторов, количество CD5+ В-клеток в составе лимфоидной ткани миндалин может достигать 30% от общего числа В-лимфоцитов (Dono et al., 1996). Их количество является индивидуальной характеристикой человека и снижается с возрастом в связи с развитием системы приобретенного иммунитета. Было показано, что маркер CD5 экспрессируют В-клетки мантии вторичного фолликула, а также некоторые лимфоциты субэпителиальной зоны миндалин, весьма гетерогенной по клеточному составу. В-лимфоциты, коэкспрессирующие в норме поверхностные маркеры CD5 и CD19, по аналогии с мышиными, иногда называются В1а-клетками. Уровень экспрессии CD5 27 на таких В-клетках сильно снижен по сравнению, как с нормальными Т-клетками, так и с опухолевыми В-клетками. CD5+ В-клетки миндалин человека являются важными претендентами на роль опухолевых предшественников (Dono et al., 2004). CD5+ В-клетки относят к первой линии защиты организма от инфекции. Основной их функцией является выработка так называемых «натуральных» антител, выявляющихся в организме даже при отсутствии антигенной стимуляции. Это, как правило, IgM-антитела, обладающие пониженной аффиннностью, часто поли- и аутореактивные. На ранних этапах жизни организма эти клетки замещают более специфичную, но еще не до конца развитую в это время стандартную систему В-клеточной защиты. В отличие от других В-лимфоцитов, CD5+ Вклетки используют лишь небольшой эмбриональный набор V-генов для продукции иммуноглобулинов. Помимо реакций на бактериальные патогены они демонстрируют слабую аутореактивность. Возможно, это играет роль при удалении апоптотических продуктов в организме (Duan B, Morel L, 2006). Считается также, что этот тип клеток специально проходит положительную селекцию на реакцию с аутоантигенами, что позволяет им приобрести крайне важную в эволюционном плане специфичность к наиболее распространенным антигенным эпитопам. Если придерживаться гипотезы о многоуровневой организации иммунной системы (Tung et al., 2004), CD5+ В-клетки принадлежат к более раннему уровню организации, экспрессируя молекулярный репертуар, направленный на общее распознавание патогена, а не на антигенспецифичность и высочайшую аффинность антител (Baumgarth et al., 2005). При этом риск возникновения аутоиммунных реакций в процессе развития этих клеток сведен к минимуму: они не контактируют с Т-хелперами, не проходят связывание поверхностной молекулы CD40 и не направляются в герминальные центры фолликулов лимфатических узлов, а значит, не проходят перестройку рецептора, повышающую аффинность продуцируемых ими антител. Также для них не является характерным и сдвиг изотипа от IgM к IgG. Как было сказано ранее, поверхностная молекула CD5 была изначально описана на Тклетках и на В-клетках при ряде патологических состояний. Долгое время экспрессия этого поверхностного маркера считалась нехарактерной для нормальных В-клеток. Помимо набора Вклеточных опухолей, повышенные количества CD5+ В-клеток выявляются у человека при аутоиммунных процессах (ревматоидный артрит, системная красная волчанка, некоторые органоспецифические аутоиммунные заболевания (Youinou, 1993; Youinou, Renaudineau, 2011). Однако это не означает, что именно они являются продуцентами основной массы аутоантител. Имеются сведения, что при наличии тяжелых аутоиммунных расстройств вырабатываются IgGантитела повышенной аффинности и основными их продуцентами являются В-лимфоциты, не несущие поверхностного CD5 (Shirai et al., 1991). Несмотря на это, CD5+ В-клетки были 28 поставлены посередине между двумя крупными патологическими процессами: аутоиммунными и малигнизационными. Важную роль в этом сыграл и тот факт, что при В-ХЛЛ в качестве осложнений часто встречаются аутоиммунная гемолитическая анемия и тромбоцитопения. В литературе появился ряд статей, указывающих на особенную подверженность CD5+ В-клеток трансформации (Dighiero, 1996; Pritsch et al., 1998; Pers et al., 1999). В качестве причины такой особенности предполагалась постоянная стимуляция рецептора этих клеток аутоантигенами, способствующая их малигнизации. Альтернативная версия заключалась в том, что CD5+ Вклетки относятся к фетальной самоподдерживающейся линии В-клеток, имеют селективное преимущество перед более поздними лимфоцитами и специальные генетические программы, нацеленные на повышение их выживаемости. Однако из-за отсутствия исчерпывающих доказательств того, что CD5+ В-лимфоциты – это целиком обособленная популяция, не связанная с остальными лимфоидными предшественниками, эта гипотеза находится под вопросом. В норме больше всего CD5+ В-клеток детектируется в пуповинной крови и у детей в первые годы жизни (Hannet et al., 1992). Со временем их количество снижается, очевидно, по мере того, как в дополнение к системе врожденного иммунитета развивается система адаптивного иммунитета. Второй всплеск количества CD5+ В-клеток наблюдается у людей пожилого возраста (Veneri et al., 2007), зачастую выливающийся в так называемый MBLсиндром – повышенный В-лимфоцитоз, не перетекающий в опухолевый процесс. К сожалению, подробных сравнений между CD5+ клетками ранних и поздних этапов жизни человека не проводилось. Недавно также была выявлена постоянно присутствующая в крови минорная популяция В-клеток, экспрессирующая CD5 на низком уровне, которая у людей получила название регуляторных В-клеток (Griffin et al., 2011). Предстоит выяснить их связь с другими CD5+ популяциями нормальных В-лимфоцитов, а также с CD5+ лимфомами (Chiorazzi, Ferrarini, 2003). Таким образом, проблема клеток-предшественников CD5+ лимфом представляет значительный интерес и исследуется в различных аспектах. Ведется поиск субпопуляции нормальных В-клеток, наиболее близкой к В-ХЛЛ по иммунофенотипу, в основном внимание исследователей привлекает область подслизистой лимфоидной ткани миндалин. Многие авторы склонны полагать, что именно эта популяция клеток и дает начало В-ХЛЛ, хотя окончательно это не было показано и степень сходства групп опухолевых и неопухолевых клеток требует дальнейшего изучения. 29 2.3 Биология передачи сигнала в CD5-положительных лимфомах Вопрос о дифференциальной диагностике для CD5-положительных лимфом еще не исчерпан из-за наличия ряда промежуточных форм между В-ХЛЛ и ЛКМЗ. Агрессивные случаи В-ХЛЛ часто имеют один или несколько признаков ЛКМЗ и таким образом относятся к группе, получившей название «лимфомы серой зоны» (Said, 2013). После того, как выяснилось, что точное разделение двух групп на цитологическом и иммунофенотипическом уровнях затруднено, основным вопросом стал поиск надежных прогностических факторов на иных уровнях. В связи с этим, большой интерес сейчас вызывают исследования в областях генетики и молекулярной биологии CD5-положительных лимфом. Характерные свойства опухолевых клеток зачастую обусловлены аномальным функционированием сигнальных путей, контролирующих клеточный цикл и апоптоз (Hanahan, Weinberg, 2000; Hanahan, Weinberg, 2011). Поэтому повышенное внимание уделяется с одной стороны эффекторным молекулам клеточного цикла, которые при гипо- или гиперэкспрессии в клетках влияют на опухолевую прогрессию, и с другой стороны – поверхностным и внутриклеточным компонентам рецепторных каскадов, которые в недостаточном количестве или аберрантном состоянии делают клетку нечувствительной к различным сигналам извне. 2.3.1 Строение В-клеточного рецептора CD5-положительных лимфом Исследования последовательности генов иммуноглобулинов при В-ХЛЛ показали, что опухолевые клоны всегда используют крайне ограниченный репертуар VDJ-генов при синтезе рецепторов (Dadi et al., 2009). Однако помимо этой особенности, в части случаев рецептор был функциональным, а в части случаев – нет. Отсутствие реакции на связывание В-клеточного рецептора было показано для агрессивной формы В-ХЛЛ, тогда как индолентная форма отвечала на связывание рецептора запуском BCR-каскада. Это послужило отправной точкой в исследовании сигналинга CD5+ В-клеточных опухолей. Было показано, что способностью проводить сигнал обладают опухолевые В-лимфоциты, прошедшие гипермутацию генов иммуноглобулинов (IgVH), а не прошедшие гипермутацию клетки не способны запускать BCR-каскад (Chiorazzi et al., 2005). До сих пор мутационный статус вариабельного участка тяжелых цепей иммуноглобулинов является наиболее ценным прогностическим фактором для В-ХЛЛ. Анализ репертуара и мутационного статуса цепей иммуноглобулинов является довольно сложным методом для широкого применения в практической диагностике, поэтому продолжаются поиски суррогатных маркеров, уровни экспрессии которых коррелировали бы с мутационным статусом IgVH и с прогнозом 30 заболевания. Лимфома из клеток мантийной зоны, имеющая наихудший прогноз, чаще всего имеет немутированные IgVH гены, в то время как клетки индолентной формы ЛКМЗ несут гипермутированные IgVH гены (Fernandez et al., 2010). С точки зрения изменения экспрессии генов, исследования методом microarray показали, что так называемые мутированный (M-B-CLL) и немутированный (U-B-CLL) фенотипы ВХЛЛ, хоть и имеют общие черты, различаются по уровню экспрессии нескольких сотен генов. Большинство из дифференциально экспрессированных генов в нормальных В-лимфоцитах запускается через В-клеточный рецептор (Rosenwald et al., 2001). Таким, образом, различия в функциональном состоянии BCR-каскада и их связь с прогнозом заболевания не раз отмечались для CD5+ В-зрелоклеточных лимфом. На этом основании представляется важным подробный анализ как характерных особенностей строения самих иммуноглобулинов, так и связанных с ними сигнальных молекул. 2.3.2 Строение ВCR-каскада CD5-положительных лимфом Тирозинкиназы рецепторного и нерецепторного типа играют важнейшую роль в передаче сигнала внутри клетки. Часто они бывают задействованы в механизмах развития опухолей (Abrantes et al., 2014; Seda, Mraz, 2015). Для клеток В-ХЛЛ были показаны аберрантные уровни экспрессии верхних проводящих компонентов В-клеточного сигнального каскада, тирозинкиназ SYK, LYN, ZAP-70 (Seda, Mraz, 2015) и СD79b (Cajiao et al., 2007). Так, про тирозинкиназу LYN известно, что она, являясь начальным компонентом BCR-каскада, гиперэкспрессирована и конститутивно фосфорилирована в клетках В-ХЛЛ, а локалицация ее не ограничивается мембранными комплексами, как в нормальных клетках, но и распространяется на цитозоль. (Contri et al., 2005; Trentin et al., 2008). Для немутированных форм В-ХЛЛ характерно добавление к общему опухолевому фенотипу тирозинкиназы ZAP-70, которая ассоциируется с BCR и принимает участие в проведении сигнала через него (Chen et al., 2002). Экспрессия ZAP-70 долгое время считалась проявлением опухолевой природы В-лимфоцитов и лишь недавно была описана на малых популяциях нормальных В-клеток (Scielzo et al., 2006). Было показано, что она не замещает родственную ей киназу SYK, а функционально дополняет ее (Gobessi et al., 2007). Исследование фосфорилированных форм данных киназ показало их независимую активацию (Kaplan et al., 2010). При исследовании тирозинкиназ ZAP-70 и SYK методом ПЦР выяснилось, что отношение их уровней коррелирует с выживаемостью пациентов (Laurenti et al., 2005), однако проведенный анализ не давал представления об индивидуальном уровне экспрессии каждой из тирозинкиназ и его разбросе в выборке. 31 Для клеток ЛКМЗ довольно рано была выявлена транслокация гена bcl-1(CCND1) под активный промотор гена тяжелой цепи иммуноглобулина и, как следствие, значительная гиперэкспрессия циклина D1 (Raffeld, Jaffe, 1991). Этот белок является эффекторным звеном в процессе регулировки клеточного цикла, обеспечивая в норме выход из фазы G1, и, по некоторым данным, защиту от апоптоза (Jares et al., 2012). Из-за того, что для ЛКМЗ характерна серьезная аберрация в эффекторном звене, исследований BCR-ассоциированных сигнальных молекул проводилось сравнительно мало. На основании данных об гиперэкспрессии циклина D1 и общем высоком уровне активации клеток ЛКМЗ при общем низком уровне фосфорилирования сигнальных компонентов был сделан вывод об их неспособности проводить сигнал извне (de Boer et al., 1997). Исследования методом microarray показали значительно повышенные уровни компонентов PI3K-Akt и Wnt сигнальных путей при ЛКМЗ но данные о BCR-ассоциированных молекулах в них отсутствовали (Rizzatti et al., 2005). К сожалению, в масштабные эксперименты по скринингу уровней экспрессии генов участники верхних ступеней BCR-каскада никогда не попадали все вместе и в более узконаправленных исследованиях всегда фигурировали по отдельности или парами. Между тем, для сравнения способности опухолевых лимфоцитов регулировать и проводить сигнал через В-клеточный рецептор актуальным представляется комплексный анализ тирозинкиназ и тирозинфосфатаз BCR-каскада. Исследование дифференциальной экспрессии проводящих элементов BCR-каскада позволяет лучше понять биологию В-ХЛЛ, пути малигнизации и механизмы резистентности этой опухоли к апоптозу. Кроме того, с прикладной точки зрения, выделение подвидов В-ХЛЛ по профилю экспрессии генов сигнальных молекул могло бы заменить или качественно дополнить в диагностике трудоемкую процедуру анализа мутационного статуса тяжелых цепей иммуноглобулинов. Таким, образом, поиск сходств и различий между нозологическими группами зачастую сводится к анализу поверхностных маркеров и мутационного статуса Вклеточного рецептора, не касаясь экспрессии основных проводящих элементов BCRкаскада. Актуальным представляется исследование компонентов BCR-каскада для выявления различий между разными нозологическими формами, а также сравнение уровней экспрессии этих генов в отсортированных чистых популяциях опухолевых и неопухолевых В-клеток, в том числе в популяции CD5-экспрессирующих В-лимфоцитов миндалин. 32 2.4 Методические подходы к исследованию В-клеточных популяций Имея дело с органами, образованными высоко гетерогенными популяциями клеток (кровь, костный мозг, вторичные лимфоидные органы) и ставя задачу подробно исследовать одну чистую субпопуляцю, следует внимательно отнестись к вопросу ее физического выделения. То же относится и к опухолевому клону, который должен быть аккуратно отделен от опухолевого микроокружения, чтобы избежать ошибок в определении профиля экспрессии опухоли (Zaidi et al., 2011). В исследованиях В-клеток актуальной представляется клеточная сортировка В-лимфоцитов с последующим анализом уровней экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени. 2.4.1 Клеточная сортировка чистых субпопуляций для анализа уровней экспрессии генов Попытки выделить CD5+ B-клетки предпринимались неоднократно, сначала на основании их размера и плотности – методом центрифугирования в градиенте перколла или путем удаления ненужных клеток посредством иммунных розеток или магнитных бусин. К сожалению, оба метода обеспечивают лишь обогащение изучаемой популяции, а перколл может приводить к потере поверхностных антигенгов плазматической мембраной клетки, затрудняя последующий иммунофенотипический анализ. На сегодняшний день оптимальным и наиболее аккуратным способом выделения является комбинация проточной сортировки с предварительным обогащением клеточной субпопуляции с использованием магнитных бусин (Hystad et al., 2007; Almamun et al., 2013). Метод FACS используется с конца 60х годов ХХ века (Hulett et al., 1969) и является оптимальным способом выделения гомогенных клеточных популяций по группе признаков, определенных при помощи проточной цитометрии (Orfao, Ruiz-Arguelles, 1996; Herzenberg et al., 2002). На сегодняшний день метод позволяет добиваться высокой чистоты исследуемой популяции (98%), быстрое развитие техники за последние годы позволило детектировать до 18 флуорохромов одновременно, обеспечивая таким образом сложный многопараметрический анализ перед сортировкой клеток. Это делает проточную сортировку особенно привлекательной для исследований в иммунологии и гематологии (Hansen et al., 2005; Tanaka-Harada et al., 2010; Moshaver et al., 2008; Andreasson et al., 2010). Однако область применеия проточной сортировки не ограничивается фундаментальными исследованиями: сортировка клеток также активно применятся и в клинической практике, например для выявления минимальной резидуальной болезни (Engel et al., 1999; Watanabe et al., 2008). Методы молекулярных и генетических исследований, наиболее часто использующихся в комбинации с проточной сортировкой, 33 включают FISH, различные варианты ПЦР-анализа, секвенирование и анализ при помощи РНКмикрочипов. В исследованиях лимфом важность сортировки клеток не раз была доказана. Так, тирозинкиназа ZAP-70, являющаяся прогностическим маркером при В-ХЛЛ, в больших количествах присутствует в нормальных Т-клетках. Исследования ZAP-70 при помощи иммунохимических методов затруднено из-за наличия близкородственных киназ (например, SYK) и недостаточной специфичности окрашивания (Vroblova et al., 2012). Таким образом, стандартный метод определения уровня ZAP-70 в пробе – реакция ПЦР на соответствующую кДНК. При исследовании уровня экспрессии гена ZAP-70 методом ПЦР, затруднение могут представлять даже незначительные примеси Т-клеток, в которых ZAP-70 конститутивно экспрессируется на значительно более высоком уровне, чем в любом из случаев В-ХЛЛ. То же затруднение необходимо преодолевать при поиске нормальных популяций В-лимфоцитов, экспрессирующих эту тирозинкиназу. Во избежание ложного положительного результата определение уровня экспрессии тирозиинкиназы ZAP-70 в субпопуляциях как нормальных, так и опухолевых В-клеток (Scielzo et al., 2006) должно проводиться после их предварительного выделения. 2.4.2 Подходы к исследованию В-клеток при помощи ПЦР в реальном времени. Проблема нормализации данных при анализе уровней экспрессии мРНК Получение чистых популяций является мощным инструментом, позволяющим осуществлять значительно более точный анализ уровней экспрессии генов с привязкой к конкретному типу клеток. Так были параллельно исследованы профили экспрессии мРНК в некоторых опухолях и их микроокружении. С помощью сортировки с последующим проведением реакции ПЦР, были серьезно уточнены профили экспрессии клеток карциномы простаты и опухолевой стромы (Zhao, Peehl, 2009; Santamaria-Martinez et al., 2009; True et al., 2010). Подобные эксперименты стали возможными благодаря развитым технологиям выделения клеток с одной стороны, и высокочувствительным методам детекции уровней экспрессии мРНК – с другой. Их комбинация на сегодняшний день является одним из главных способов оценки клеточной гетерогенности в любых популяциях (Barteneva et al., 2013). Два основных подхода к оценке профиля экспрессии генов используются параллельно в фундаментальных и клинических исследованиях на сегодняшний день, - с помощью РНКмикрочипов и методом ПЦР в реальном времени (Provenzano, Mocellin, 2007; Sanchez-Navarro et al., 2010). Использование микрочипов подразумевает одновременный анализ тысяч генов в сравнительно малом количестве образцов и, таким образом, является оптимальным 34 инструментом первичной селекции генов-мишеней для дальнейшего более детального анализа. Коммерческие чипы и реагенты для анализа позволяют максимально унифицировать условия проведения реакции и, следовательно, получаемые результаты, но при этом оставляют мало возможностей для еѐ оптимизации и адаптации под конкретный эксперимент. Метод ПЦР в реальном времени, напротив, позволяет сконцентрироваться на анализе сравнительно малого количества генов на выборках большего объѐма. Он давно завоевал широкую известность, благодаря скорости и точности (Ginzinger, 2002; Wong, Medrano, 2005; Provenzano, Mocellin, 2007), его легко модифицировать под экспериментальную задачу, однако сложнее сравнивать полученные результаты. Растущая популярность этого метода обусловила выработку универсальных методических критериев для проверки и сравнения данных (Bustin et al., 2009; Taylor et al., 2010), однако до сих пор вопрос о корректном подходе к анализу и интерпретации данных, полученных при помощи ПЦР в реальном времени, остается не до конца решенным. Ключевым является подход к нормализации – поиску референта, относительно которого рассчитывается изменение уровня экспрессии исследуемой мРНК. В различных экспериментальных условиях могут применяться различные стратегии (Huggett et al., 2005), однако наиболее универсальным и распространенным вариантом является нормализация по РНК референтных генов, которые экспрессируются клеткой на постоянном уровне и обеспечивают таким образом стабильный внутренний контроль. В качестве наиболее надежных референтных генов принято использовать так называемые гены «домашнего хозяйства», которые участвуют в основных физиологических процессах внутри клетки. В ходе работ по оптимизации метода ПЦР были сформулированы критерии выбора оптимального референтного гена: это должен быть ген, мРНК которого экспрессируется на постоянном уровне во всех тканях экспериментальных организмов как в норме, так и при любых экспериментальных воздействиях (Suzuki et al., 2000, Andersen et al., 2004). Найти такую референтную мРНК не представляется возможным, так как уровни экспрессии мРНК всех генов, включая гены «домашнего хозяйства», регулируются клеткой и могут варьировать в разных условиях и у разных индивидуумов. Так, исследование паттернов экспрессии многих хорошо известных референтных генов показало их изменения в крайне широких пределах в зависимости от условий, типов тканей и клеток (Hruz et al., 2011). Новые подходы к измерению уровней РНК в клетке позволяют пересмотреть список стабильно экспрессируемых генов «домашнего хозяйства» (Eisenberg, Levanon, 2013), однако консенсусные референтные гены на сегодняшний день отсутствуют, а нормализация данных ПЦР рассматривается строго для конкретных экспериментальных условий (Hruz et al., 2011; Dundas, Ling, 2012). Кроме того, возник вопрос о необходимом и достаточном количестве референтноых генов в эксперименте. 35 Ряд исследований свидетельствует о том, что нормализация по любому единственному референтному гену недостаточна для человеческих тканей (Bas et al., 2004; Tricarico et al., 2002). Таким образом, альтернативный подход к нормализации данных основывается на определении уровней представленности набора из сразу нескольких мРНК генов «домашнего хозяйства». Фактор нормализации для одного образца таким образом вычисляется как среднее значение экспрессии нескольких стабильно экспрессируемых в пробе генов и используется как делитель для уровня экспрессии мРНК исследуемого гена. Математические алгоритмы выбора наиболее стабильно экспрессируемых генов различались у разных авторов (Vandesompele et al., 2002; Pfaffl et al., 2004; Andersen et al., 2004), но, в конечном счете, давали схожие результаты. Стратегия с выбором наиболее надежных референтных генов для проведения эксперимента сильно удлиняет этап получения предварительных данных, однако, несмотря на это, подобные работы постепенно становятся стандартом для ПЦР-исследований и уже были аккуратно проведены для многих опухолевых и неопухолевых тканей (Kheirelseid et al., 2010; Sorby et al., 2010; Ledderose et al., 2011; Gorzelniak et al., 2001; Ferguson et al., 2010), в частности для лимфом человека (Green et al., 2009; Valceckiene et al., 2010). В результате сильно возрастает чувствительность метода ПЦР в реальном времени: для группы В-зрелоклеточных лимфом с помощью правильно подобранных референтных генов были показаны достоверные различия в экспрессии гена циклина D1 между разными нозологиями (Gladkikh et al., 2010). Таким образом, использование новейших подходов к анализу субпопуляций опухолевых и нормальных клеток человека позволяет проводить их более глубокое сравнение на фенотипическом и генетическом уровне. Совмещение сортировки чистых субпопуляций лимфоцитов с улучшенной стратегией ПЦР-анализа является перспективным подходом к исследованию CD5-положительных В-клеток в норме и при патологии. 36 ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1 Пациенты и контроли Работа проводилась на лимфоцитах человека, полученных ex vivo из диагностического и постоперационного материала. В работе соблюдались нормы, утвержденные в Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации 1964 года. Для исследования были выбраны образцы CD5+ В-зрелоклеточных опухолей 102 пациентов, проходивших стандартные диагностические процедуры в Гематологическом Научном Центре (Москва, Россия) и Диагностическом центре «Генотехнология» (Москва, Россия). Пациенты не проходили курс лечения предварительно и на момент забора образца. В первой части работы для 79 образцов была составлена подробная иммунофенотипическая характеристика опухолевых популяций при помощи проточной цитофлуориметрии и иммуногистохимии. В 73 образцах был проанализирован уровень экспрессии гена циклина D1 при помощи ПЦР в реальном времени. Образцы клеток в суспензиях были заморожены в жидком азоте для выделения РНК. Во второй части работы 23 образца мононуклеаров периферической крови пациентов были охарактеризованы методом многоцветной проточной цитофлуориметрии. Из них были отсортированы чистые популяции опухолевых В-клеток для выделения РНК. В качестве контролей были взяты 65 образцов неопухолевой лимфоидной ткани. Пробы включали 13 образцов ткани селезенки от пациентов с реактивными изменениями лимфоидной ткани, проходивших диагностические процедуры в Гематологическом Научном Центре (Москва, Россия), 12 образцов мононуклеаров периферической крови здоровых доноров и 40 образцов тканей миндалин с гиперплазией неопухолевой природы, полученных из детской больницы св. Владимира (Москва, Россия) после стандартных тонзилэктомий. В первой части работы 15 образцов неопухолевой лимфоидной ткани были охарактеризованы методами иммуногистохимии и/или проточной цитофлуориметрии для исключения злокачественной В-клеточной пролиферации. Дополнительно во всех образцах был измерен уровень экспрессии циклина D1 при помощи ПЦР в реальном времени. Образцы клеток в суспензиях были заморожены в жидком азоте для выделения РНК. Во второй части работы 40 неопухолевых образцов миндалин человека были охарактеризованы иммунофенотипически, их неопухолевая природа была подтверждена при помощи многоцветной проточной цитофлуориметрии и иммуногистохимии, клеточные суспензии 10 образцов миндалин человека были использованы для сортировки чистых 37 субпопуляций CD5+CD19+ неопухолевых В-лимфоцитов. Дополнительно чистые субпопуляции нормальных В- и Т-клеток крови были отсортированы из 10 образцов периферической крови здоровых доноров. Отсортированные клетки использовались для выделения РНК. 3.2 Гистология и иммуногистохимия Гистологическая окраска парафиновых срезов толщиной 3-4 мкм проводилась гематоксилином и эозином (Thermo Scientific, США). Иммуногистохимическая окраска проводилась по стандартной методике (Petrosyan et al., 2002). Для демаскирования антигена срезы подвергались тепловой обработке в 0,01 М цитратном буфере (pH 6,8). Срезы инкубировали с антителами к CD5 (клон 4C7, Dako, Дания), CD79a (клон JCB117, Dako, Дания), CD3 (поликлон, Dako, Дания), CD20 (клон L26, Dako, Дания), CD23 (клон SP23, Neomarkers, CA, США), CD27 (клон O323, BioLegend, США), цитокератинам (поликлон, Dako, Дания) и циклину D1 (клон SP4, Neomarkers, CA, США) в течение 1 часа, Детекция первых антител проводилась с помощью набора Ultravision LPValue large Volume Detection System (Thermo Fischer Scientific, США) согласно инструкции производителя. В качестве хромогена использовали 3,3’-диаминобензидин/Н2O2 (Thermo Fischer Scientific, США), срезы докрашивали гематоксилином. 3.3 Проточная цитофлуориметрия Пробоподготовку образцов проводили по стандартной методике, описанной ранее (Gretsov et al., 2004). Солидные ткани были предварительно превращены в суспензию при помощи медимашины (BD, США); полученную суспензию (примерно из 20 мг ткани) пропускали через фильтр с диаметром ячейки 40 мкм. Эритроциты лизировались 10 минут при +37°С в гипотоническом растворе на основе хлорида аммония для выделения фракции мононуклеаров. Отмывка образцов производилась 1% раствором BSA в PBS (Amresco, США), центрифугированием в течение 5 минут при 400 g (центрифуга IEC Centra-CL3R, Thermo Scientific, США). При окрашивании поверхностными антителами использовалась следующая панель антител: 1) anti-CD3-FITC (клон UCHT1, Dako, Дания), anti-CD19-PE (клон HD37, Dako, Дания), anti-CD45-PE-Cy5 (клон T29/33, Dako, Дания); 2) anti-CD5-FITC (клон DK23, Dako, Дания), anti-CD38-PE (клон AT13/05, Dako, Дания), anti-CD19-PE-Cy5 (клон HIB19, eBioscience, США); 38 3) anti-CD5-FITC (клон DK23, Dako, Дания), anti-CD23-PE (клон MHM6, Dako, Дания), anti-CD19-PE-Cy5 (клон HIB19, eBioscience, США); 4) anti-FMC7-FITC (клон MCA792F, AbD Serotec, США), anti-CD22-PE (клон 4KB128, Dako, Дания), anti-CD20-PE-Cy5 (клон 2H7, eBioscience, США); 5) anti-CD43-FITC (клон DF-T1, Dako, США), anti-CD22-PE (клон 4KB128, Dako, Дания), anti-CD20-PE-Cy5 (клон 2H7, eBioscience, США); 6) anti-CD8-FITC (клон DK25, Dako, Дания), anti-CD4-PE (клон MT310, Dako, Дания), anti-CD3-PE-Cy5 (клон UCHT1, Dako, Дания); 7) anti-κ-FITC (поликлон, Dako, Дания), anti-λ-PE (поликлон, Dako, Дания), anti-CD19-PECy5 (клон HD37, Dako, Дания); или 7а) anti-CD19-FITC (клон HD37, Dako, Дания), anti-λ-PE (поликлон, Dako, Дания), anti-κ-АРС (поликлон, Dako, Дания). Инкубация с антителами проводилась при +4°С в течение 20 минут с последующей отмывкой PBS-BSA. При внутриклеточном окрашивании антителами клетки префиксировались 1% раствором параформальдегида (Merck, Германия) в PBS в течение 5 минут и пермеабилизировались раствором Perm II (BD, США) в течение 10 минут. Фиксация и пермеабилизация проводились при комнатной температуре в темноте, отмывки проводились 1% раствором BSA в PBS. Панель окрашивания включала 1) anti-κ-FITC (поликлон, Dako, Дания), anti-λ-PE (поликлон, Dako, Дания); 2) anti-Ki67-FITC (клон MIB-1, Dako, Дания), anti-CD79a-PE (клон HM57, AbD Serotec, США), anti-CD3-PE-Cy5 (клон UCHT1, eBioscience, США). Инкубация с антителами проводилась при +4°С в течение 20 минут с последующей отмывкой PBS-BSA. Анализ проводился на двухлазерном (488 нм, 640 нм) приборе FACSCalibur с программным обеспечением CellQuest (BD BioSciences, США). 3.4 Клеточная сортировка Окрашивание для сортировки проводилось поверхностными антителами по стандартному протоколу для проточной цитофлуориметрии. Использовалась следующая панель антител: 1) anti-CD3-AlexaFluor488 (клон HIT3a, BioLegend, США), anti-CD23-PE (клон EBVCS-5, BioLegend, США), anti-CD19-PerCP-Cy5.5 (клон HIB19, eBioscience, США), anti-CD5-APC (клон UCHT2, BD, США), anti-CD38-PE-Cy7 (клон HIT2, eBioscience, США), anti-CD27-AlexaFluor700 (клон O323, BioLegend, США); 2) anti-CD3-AlexaFluor488 (клон HIT3a, BioLegend, США), anti-CD23-PE (клон EBVCS-5, BioLegend, США), anti-CD19-PerCP-Cy5.5 (клон HIB19, eBioscience, США), anti-CD5-APC (клон 39 UCHT2, BD, США), anti-CD38-PE-Cy7 (клон HIT2, eBioscience, США), anti-CD25-AlexaFluor700 (клон M-A251, BioLegend, США). Сортировка проводилась на приборе FACSAria SORP (BD, США) с диаметром сопла 70 мкм и соответствующими ему параметрами давления в системе. Сортировка проводилась в лизирующий буфер для выделения РНК (Qiagen, США). 3.5 Получение РНК и кДНК Выделение РНК из клеток осуществлялось при помощи RNeasy Mini Kit (для образцов с количеством клеток > 10 000) и RNeasy Micro Kit (для отсортированных образцов с количеством клеток < 10 000) (Qiagen, США) по протоколу производителя. Обработка проб ДНКазой входила в протокол RNeasy Micro Kit, а в случае выделения набором RNeasy Mini Kit проводилась дополнительно в течение 30 минут при 37С (DNase I, Fermentas, США) c последующим перевыделением образца. Концентрация РНК измерялась на спектрофотометре (Nanodrop, Implen, Германия); кДНК синтезировали с помощью Random Primers AMV-Reverse Transcriptase Kit (Promega, США) согласно протоколу производителя. В каждой реакции использовали негативные контроли без РНК. Полученная кДНК хранилась при -20 ºC. 3.6 Подбор праймеров Для ПЦР в реальном времени использовались следующие последовательности праймеров: YWHAZfor acttttggtacattgtggcttcaa; YWHAZrev ccgccaggacaaaccagtat; HPRT1for tgacactggcaaaacaatgca; HPRT1rev ggtccttttcaccagcaagct; UBCfor atttgggtcgcggttcttg; UBCrev tgccttgacattctcgatggt; SYKfor ttcggactctccaaagcact; SYKrev tcatccctcgatatggcttc; LYNfor tcctgaagagcgatgaaggt; LYNrev ctgccttttctttccagcac; ZAP70for ccagaggagctcaaggaca; ZAP70rev ccacgtcgatctgcttctt; SHP1for tcggactcctgcttcttgtt; SHP1rev cctggagacttcgtgctttc; CD79Afor agggcaacgagtcataccag; CD79Arev gagcttctcgttctgccatc; CD79Bfor gtcatgggattcagcacctt; CD79Brev gcagcgtcactatgtcctc; CCND1for acaaacagatcatccgcaaacac; CCND1rev tgttggggctcctcaggttc. Праймеры для исследуемых генов (CD79А, CD79В, LYN, SYK, ZAP70, SHP1) были написаны при помощи онлайн-инструментов Primer III и Primer Blast. Последовательности праймеров для референтных генов (YWHAZ, HPRT1, UBC) и гена циклина D1 (BCL1, CCND1) были взяты из литературы и использовались ранее (Vandesompele et al., 2002; Gladkikh et al., 2010). Все праймеры были синтезированы в фирме Синтол (Россия) и очищены с помощью ВЖКХ. 40 Таблица 1. Размер апмликонов и локализация описываемых генов Обозна- Номер чение Название Функция Размер Хромо- последователь- ампли- сомная ности кона локализ ация LYN NM_002350 Homo sapiens Протоонкоген, LYN proto- начальные oncogene, Src сигнала family tyrosine клеточного рецептора 426 8q13 154 9q22 99 2q12 267 12р13 В-клеточного 174 19q13 стадии от В- kinase (LYN) SYK NM_003177 Homo sapiens Нерецепторная spleen tyrosine тирозинкиназа, kinase (SYK) связывает иммуноглобулины с нижними ступенями сигнального каскада ZAP70 NM_001079.3 Homo sapiens Тирозинкиназа, zeta-chain (TCR) начальные associated protein сигнала kinase 70kDa клеточного рецептора стадии от Т- (ZAP70) PTPN6 NM_002831 (SHP1) Homo sapiens Белковая protein tyrosine тирозинфосфатаза, phosphatase, non- контроль receptor type 6 сигнальных систем в (PTPN6) гемопоэтических различных клетках CD79A NM_001783 Homo sapiens Часть CD79a molecule, рецептора immunoglobulinassociated alpha (CD79A) 41 CD79B NM_000626 Homo sapiens Часть В-клеточного 126 CD79b molecule, рецептора 17q23 immunoglobulinassociated beta (CD79B) YWHAZ NM_003406 Tyrosine 3- Проведение сигнала 94 monooxygenase через связывание с tryptophan 5- фосфорилированным monooxygenase и остатками серина у 2p25 activation protein, различных zeta polypeptide сигнальных молекул UBC NM_26880 Ubiquitin C Деградация белка 133 12q24 HPRT1 NM_000194 Hypoxanthine Синтез пурина 94 Xq26 phosphoribosyltransferase 1 BCL1(CC NM_053056.2 Cyclin D1 Белок семейства 109 11q13 циклинов, регулятор ND1) клеточного цикла 3.7 ПЦР в реальном времени Количественные ПЦР-реакции в реальном времени проводили на приборах StepOne Plus (Applied Biosystems, США) и Quantica (Barlow Scientific, Великобритания) методом неспецифической детекции с красителем SYBRGreen I. Реакция проводилась в объеме 25 мкл с реактивами фирмы «Синтол» (Россия) и включала в себя 2,5 мкл 10х кратного ПЦР буфера с SYBRGreen I, 2,5 мМ MgCl2, 2,5 мМ дНТФ, 1,5 единицы Taq-полимеразы, 10 пмоль каждого праймера и 5 мкл 5х разведения кДНК. Условия реакции включали первоначальную денатурацию (при 95С) и последующие 40 циклов амплификации (95С 15 сек, 60С 30 сек, 72С 60 сек). Все реакции ставились в трипликатах. Относительное количество кДНК рассчитывалось по формуле Q= 2 С(t)min-C(t)n, 42 где С(t)n – среднее значение порогового цикла в трипликате для каждого образца, а С(t)min – минимальное значение порогового цикла в выборке. Данные разных реакций на один ген объединялись в один эксперимент при помощи межреакционных калибровочных проб (inter-run calibrator, IRC). 3.8 Нормализация и статистический анализ В работе была использована методика расчета относительного нормализованного количества кДНК с помощью фактора нормализации (Vandesompele et al., 2002). Уровень экспрессии мРНК исследуемых генов в каждом образце нормализовали по уровням экспрессии трех референтных генов с доказанной стабильной экспрессией в лимфоидной ткани. Три стабильно экспрессирущихся референтных гена были выбраны и успешно использовались ранее (Gladkikh et al., 2010; Potashnikova et al., 2015). Фактор нормализации (NF) для каждого образца расчитывали как среднее пропорциональное из относительных уровней экспрессии трех референтных генов (HKG1, HKG2, HKG3): Далее, относительное количество (Q) исследуемого гена в образце делили на фактор нормализации для получения относительного нормализованного уровня экспрессии мРНК исследуемого гена в образце (Q1): Q1= Q/NF Для статистического анализа данных и построения графиков использовалась программа GraphPad® Prism (GraphPad Software, v.5, США). При сравнении выборок использовался непараметрический тест Манна-Уитни, анализ корреляций проводился по Спирману. 43 ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 4.1 Классификация исследованных в работе опухолевых тканей и реактивных контролей В первой части работы были исследованы 79 образцов первичных В-клеточных лимфом человека (61 образец мононуклеаров периферической крови, 4 образца костного мозга, 9 образцов суспензии лимфатических узлов и 5 образцов суспензии селезенок). Для 77 образцов было проведено цитофлуориметрии. иммунофенотипирование Диагноз клеток «В-клеточное в суспензии методом лимфопролиферативное проточной заболевание» устанавливался путем анализа количества В-клеток в образце и их клональности по легким цепям иммуноглобулина (Рисунок 3). Преобладание одного из двух вариантов легких цепей иммуноглобулина может быть детектировано на высоком уровне простым поверхностным окрашиванием В-лимфоцитов, как в случае лимфомы из клеток мантийной зоны. Однако в некоторых случаях легкие цепи иммуноглобулинов не детектируются на поверхности клетки и требуют цитоплазматического окрашивания для визуализации клона, что в наибольшей степени характерно для клеток В-ХЛЛ. Образцы солидных тканей были дополнительно описаны посредством гистологического и иммуногистохимического окрашивания на парафиновых срезах. Примеры гистологического (гематоксилин + эозин) и иммуногистохимического (пероксидаза/диаминобензидин + гематоксилин) окрашиваний парафиновых срезов ткани селезенки приведены на Рисунке 4 и Рисунке 5 соответственно. Кроме того, для образцов было определено относительное нормализованное количество кДНК гена циклина D1, что является фактором дифференциального диагноза для лимфомы из клеток мантийной зоны. Разделение образцов по нозологическим формам проводилось согласно рекомендациям ВОЗ (WHO lymphomas classification, 2001) на базе иммунофенотипа, гистологической картины (для солидных опухолей) и данных об экспрессии гена циклина D1 (BCL1/CCND1). 44 Рисунок 3. Анализ клональности В-лимфоцитов человека при иммунофенотипировании методом проточной цитофлуориметрии. Окрашивание поликлональными кроличьими антителами kappa-FITC, lambda-PE (Dako). (A-Г) Клональность опухолевых клеток выявляется как при поверхностном, так и при внутриклеточном окрашивании; (Д-З) Клональность опухолевых клеток выявляется только при внутриклеточном окрашивании, фенотип «low»; (И-М) Клетки поликлональны. A,Д,И – выделение лимфоцитарного полигона в суспензии живых клеток; Б,Е,К – двойное поверхностное флуоресцентное окрашивание; В,Ж,Л – изменение формы лимфоцитарного полигона после фиксации и пермеабилизации клеток; Г,З,М – двойное внутриклеточное флуоресцентное окрашивание. 45 Рисунок 4. Морфология опухолевых и неопухолевых образцов ткани селезенки. Окрашивание гематоксилином и эозином. Объектив х10. Масштабный отрезок – 50 мкм. A – реактивный процесс. Соотношение между красной и белой пульпой умеренно смещено в пользу последней. Белая пульпа представлена умеренно гиперплазированными селезеночными муфтами типичного строения. Тяжи красной пульпы инфильтрированы клетками гранулоцитарного ряда на разных стадиях созревания, а также лимфоидными клетками и немногочисленными макрофагами. Митозы не встречаются. Б – В-клеточная опухоль (В-ХЛЛ). Соотношение между красной и белой пульпой смещено в пользу последней. Лимфоидная ткань характеризуется диффузным ростом и представлена в основном мелкими клетками с округлыми ядрами. Митозы не встречаются. В – В-клеточная опухоль (ЛКМЗ). Морфология ткани полностью нарушена, все пространство среза заполнено диффузным, умеренно полимофным клеточным пролифератом. Митозы не встречаются. Рисунок 5. Иммуногистохимическое окрашивание последовательных срезов образца опухолевой ткани селезенки. Объектив х10. Масштабный отрезок – 50 мкм. A – anti-CD3. 46 Позитивна небольшая часть клеток, расположенных диффузно. Б – anti-CD5. Позитивно большинство клеток на срезе. В – anti-CD79а. Позитивно большинство клеток на срезе. Г – anti-CD20. Позитивно большинство клеток на срезе, окрашивание яркое. Д – anti-CD23. Большая часть клеток на срезе позитивна. Е – anti-cyclin D1. Позитивны ядра малочисленных лимфоидных клеток, образующих небольшие рыхлые скопления. Лимфоидная ткань характеризуется диффузным ростом и представлена в основном мелкими клетками с округлыми ядрами. Митозы не встречаются. Наблюдаемая картина соответствует В-ХЛЛ. Дальнейшей задачей работы было разделение образцов В-клеточных лимфом по нозологическим группам при помощи комплексной оценки диагностических факторов. Выборка из 79 образцов была разделена на 3 группы: ЛКМЗ, В-ХЛЛ и лимфомы «серой зоны». Лимфома из клеток мантийной зоны (ЛКМЗ) имеет характерный иммунофенотип CD19+/CD5+/CD20+/CD22+/CD23-/FMC7+ (Рисунок 6). Для опухолевых клеток характерны высокие уровни экспрессии поверхностных ко-рецепторных молекул, ассоциированных с BCR, и легких цепей иммуноглобулина (Рисунок 3, A-Г). Также В-лимфоциты ЛКМЗ отрицательны или слабо положительны по поверхностному маркеру CD43 и, как правило, положительны по маркеру активации CD38. Отличительной чертой лимфомы из клеток мантийной зоны является наличие ведущей хромосомной транслокации t(11;14) и гиперэкспрессия гена циклина D1 (CCND1). В исследуемой выборке первичных В-клеточных лимфом 27 случаев были классифицированы как ЛКМЗ. Возраст пациентов составлял от 27 до 77 лет (медиана – 58 лет). В одном случае опухолевые В-клетки не несли на поверхности маркер CD5, однако образец был включен в выборку на основании сведений о транслокации, гиперэкспрессии циклина D1 и клинических данных. Также в выборку было включено 5 случаев, отрицательных по маркеру FMC7, но соответствующих ЛКМЗ по остальным параметрам иммунофенотипа и уровню экспрессии гена циклина D1. Уровень экспрессии поверхностных ко-рецепторных молекул CD20 и CD22, а также легких цепей иммуноглобулина был высоким на опухолевых клетках во всех образцах. Маркер CD23 отсутствовал или был экспрессирован слабо. Относительное нормализованное количество кДНК гена циклина D1 в выборке ЛКМЗ составляло от 0,0145 до 107,19 (медиана – 4,414). Для 7 пациентов из 27 дополнительно было известно о наличии хромосомной транслокации. Полное описание образцов ЛКМЗ приведено в Приложении 1. 47 Рисунок 6. Иммунофенотип клеток ЛКМЗ по данным проточной цитофлуориметрии. A – выделение лимфоцитарного полигона. Б – опухолевая популяция ЛКМЗ имеет фенотип CD5+CD19+. В – лимфоциты ЛКМЗ отрицательны или слабо положительны по маркеру CD23 (фенотип «-/low») Г – лимфоциты имеют высокий уровень поверхностного маркера CD20 и экспрессируют гликозилированный эпитоп FMC7. Д – клетки имеют высокий уровень активации по CD38. Е – CD43 на опухоли не экспрессируется. В-клеточный хронический лимфолейкоз (В-ХЛЛ) имеет характерный иммунофенотип CD19+/CD5+/CD20low+/CD22+/CD23+/FMC7- (Рисунок 7). На опухолевых клетках часто встречается сниженный уровень экспрессии поверхностного ко-рецептора BCR CD20, а также легких цепей иммуноглобулина (Рисунок 3, Д-З). Также клетки В-ХЛЛ несут поверхностный маркер CD43. Уровень активации клеток В-ХЛЛ, определяемый по наличию поверхностного маркера CD38, варьирует в широких пределах от пациента к пациенту. В исследуемой выборке первичных В-клеточных лимфом 28 случаев были классифицированы как В-ХЛЛ. Возраст пациентов составлял от 39 до 85 лет (медиана – 60,5 лет). Относительное нормализованное количество кДНК гена циклина D1 в выборке В-ХЛЛ составляло от 0,0002 до 0,1055 (медиана – 0,011). приведено в Приложении 2. Подробное описание образцов В-ХЛЛ 48 Рисунок 7. Иммунофенотип клеток В-ХЛЛ по данным проточной цитофлуориметрии. A – выделение лимфоцитарного полигона. Б – опухолевая популяция В-ХЛЛ, как и ЛКМЗ, имеет фенотип CD5+CD19+. В – в отличие от ЛКМЗ, все лимфоциты В-ХЛЛ положительны по CD23. Г – лимфоциты имеют низкий уровень CD20 (фенотип «low»), FMC7 отсутствует. Д – опухолевые клетки имеют низкий уровень активации по CD38. Е – CD43 экспрессируется на опухоли. В 24 случаях из 79 образец невозможно было достоверно отнести ни к группе ЛКМЗ, ни к группе В-ХЛЛ. В 22 образцах методом проточной цитофлуориметрии детектировались клональные зрелые В-лимфоциты (18 образцов имели высокий уровень поверхностных легких цепей иммуноглобулина, 4 образца имели сниженный уровень поверхностных легких цепей иммуноглобулина), что указывало на В-клеточную лимфому. При этом развернутый иммунофенотип каждого образца, включающий уровень экспрессии поверхностных маркеров CD23 и FMC7, не соответствовал в полной мере ни В-ХЛЛ, ни ЛКМЗ. Дополнительно, уровень поверхностного маркера CD5 был снижен в 5 образцах, а в одном полностью отсутствовал, что требовало исключения еще одной нозологической формы – лимфомы маргинальной зоны селезенки (фенотип CD19+/CD5-/CD20+/CD22+/CD23low/FMC7+, уровень экспрессии гена 49 циклина D1 достоверно снижен по сравнению с ЛКМЗ и В-ХЛЛ). Вариант лимфомы с промежуточным фенотипом приведен на Рисунке 8. Относительное нормализованное количество кДНК гена циклина D1 во всех 24 образцах превышало норму, что является характерным для В-клеточных лимфопролиферативных заболеваний, и составляло от 0,0005 до 5,64 (медиана – 0,088). Большинство значений занимало промежуточное положение между В-ХЛЛ и ЛКМЗ, что не позволяло достоверно исключить ни одну из нозологий. В образцах со сниженным уровнем маркера CD5 повышенное относительное нормализованное количество кДНК гена циклина D1 позволило исключить лимфому маргинальной зоны селезенки. В нескольких случаях, напротив, сниженный уровень экспрессии гена циклина D1 не позволил отнести исследуемые образцы к группе ЛКМЗ несмотря на соответствующий ЛКМЗ иммунофенотип. Рисунок 8. Пример иммунофенотипа клеток лимфомы «серой зоны» по данным проточной цитофлуориметрии. A – выделение лимфоцитарного полигона. Б – опухолевая популяция имеет фенотип CD5(+/low)CD19+. В – опухолевые лимфоциты отрицательны по CD23. Г – лимфоциты имеют низкий уровень CD20 (фенотип «low»), FMC7 отсутствует. Д – опухолевые клетки имеют высокий уровень активации по CD38. Е – CD43 экспрессируется на опухоли частично (фенотип «low»). 50 Таким образом, в группу лимфом «серой зоны» были включены все случаи Взрелоклеточных лимфом с неканоническим иммунофенотипом, а также с уровнем экспрессии гена циклина D1, не позволяющим достоверно дифференцировать нозологическую форму или не соответствующим ожидаемому при данном иммунофенотипе. Возраст пациентов в группе лимфом «серой зоны» составил от 41 до 87 лет (медиана – 59 лет). Подробное описание образцов приведено в Приложении 3, на основании имеющихся данных их можно разделить на следующие группы: В 1 образце иммунофенотип полностью соответствовал ЛКМЗ (CD19+/CD5+/CD20+/CD22+/CD23-/FMC7+) при крайне низком уровне экспрессии гена циклина еще D1; 3 образца имели иммунофенотип CD19+/CD5+/CD20+/CD22+/CD23low/FMC7+, формально близкий к ЛКМЗ, при низком уровне экспрессии гена циклина D1. 2 образца соответствовали ЛКМЗ по уровню экспрессии гена циклина D1, однако один был отрицателен, а второй слабо положителен по уровню поверхностного маркера CD5 (общий фенотип: CD19+/CD5- low/CD20+/CD22+/CD23-/FMC7low). 3 образца частично экспрессировали как CD23, так и FMC7, при этом у одного из них был понижен уровень CD5 (общий фенотип: CD19+/CD5+ low/CD20+/CD22+/CD23low/FMC7low). Уровень экспрессии гена циклина D1 в двух образцах соответствовал нижней границе при ЛКМЗ, а в одном образце соответствовал В-ХЛЛ. 5 образцов имели пониженный уровень CD23 и не имели FMC7, при этом у одного из них был понижен уровень CD5 (общий фенотип: CD19+/CD5+ low/CD20+/CD22+/CD23low/FMC7-). Уровень экспрессии гена циклина D1 в этих образцах занимал промежуточное положение между В-ХЛЛ и ЛКМЗ. 6 образцов не экспрессировали ни CD23, ни FMC7, при этом в двух из них был понижен уровень CD5 (общий фенотип: CD19+/CD5+low/CD20+/CD22+/CD23-/FMC7-). Уровень экспрессии гена циклина D1 соответствовал ЛКМЗ в двух образцах, В-ХЛЛ в одном образце, а в остальных занимал промежуточное положение между В-ХЛЛ и ЛКМЗ. 1 образец имел иммунофенотип формально близкий к В-ХЛЛ, CD19+/CD5+/CD20+/CD22+/CD23+/FMC7low, и уровень экспрессии гена циклина D1, соответствующий нижней границе при ЛКМЗ. 1 образец содержал две клональные опухолевые популяции с иммунофенотипом CD19+/CD5+/CD20+/CD22+/CD23+/FMC7- и CD19+/CD5-/CD20+/CD22+/CD23low/FMC7- и имел уровень экспрессии гена циклина D1, соответствующий нижней границе при ЛКМЗ. Еще 2 образца были включены в выборку на основании повышенного уровня экспрессии гена циклина D1 без клинической картины ЛКМЗ. Предварительные данные о наличии В- 51 клеточного лимфопролиферативного заболевания были получены в другой лаборатории. В качестве контроля для В-клеточных опухолей были взяты 15 образцов неопухолевой лимфоидной ткани – 13 образцов ткани селезенки и 2 образца мононуклеаров периферической крови с гиперлейкоцитозом неопухолевой природы. Возраст пациентов составлял от 21 до 64 лет (медиана – 40,5 лет). Для всех образцов солидной ткани имелись гистологические данные, подтверждающие наличие реактивных процессов. Для образцов крови и 4 образцов селезенок отсутствие лимфатических опухолей было подтверждено методом проточной цитофлуориметрии. Для всех образцов в выборке также было оценено относительное нормализованное количество кДНК гена циклина D1, которое составляло от 0,0001 до 0,0046 (медиана – 0,00033). Подробное описание контрольных образцов приведено в Приложении 4. Таким образом, 94 исследованных образца лимфоидной ткани человека были разделены на четыре группы в соответствии с их иммунофенотипом, гистологической картиной (для солидных тканей) и уровнем экспрессии мРНК гена циклина D1. В группу ЛКМЗ были отнесены 27 образцов; в группу В-ХЛЛ были отнесены 28 образцов; 24 образца с промежуточным фенотипом были отнесены в группу лимфом «серой зоны»; 15 образцов реактивной лимфоидной ткани были взяты в качестве контроля. 4.2 Определение уровней экспрессии мРНК генов сигнальных белков BCR-каскада в опухолевой и реактивной лимфоидной ткани Из 94 образцов опухолевой и реактивной лимфоидной ткани была выделена РНК, транскрибирована кДНК и поставлена полимеразная цепная реакция в реальном времени для оценки уровней экспрессии генов сигнальных молекул BCR-каскада. В группах различных Вклеточных лимфом и реактивной лимфоидной ткани анализировались уровни экспрессии генов CD79А и CD79В, BCR-ассоциированных тирозинкиназ LYN, SYK, ZAP70, а также тирозинфосфатазы SHP1 (PTPN6). Оказалось, что относительные нормализованные уровни экспрессии генов сигнальных молекул демонстрируют разброс в несколько порядков во всех группах (Рисунок 9). Для гена LYN (Рисунок 9, А) разброс значений относительных нормализованных уровней экспрессии составил от 35,41 до 0,45 (медиана – 2,11) в выборке ЛКМЗ; от 7,73 до 0,15 (медиана – 1,48) в выборке лимфом «серой зоны»; от 11,11 до 0,01 (медиана – 1,55) в выборке В-ХЛЛ; от 0,65 до 0,03 (медиана – 0,23) в выборке реактивной лимфоидной ткани. Статистически достоверные отличия (p<0,05) были получены между медианой группы реактивной лимфоидной ткани (самый низкий уровень экспрессии LYN) и медианами всех других групп. Кроме того, достоверные отличия были получены для медианы группы ЛКМЗ и 52 медианы группы В-ХЛЛ (экспрессия гена LYN выше при ЛКМЗ, чем при В-ХЛЛ). Группы ВХЛЛ и лимфом «серой зоны», а также ЛКМЗ и лимфом «серой зоны» по уровню экспрессии данного гена достоверно не различаются. Для SHP1 (PTPN6) (Рисунок 9, Б) разброс значений относительных нормализованных уровней экспрессии составил от 43,79 до 0,64 (медиана – 7,80) в выборке ЛКМЗ; от 9,46 до 0,11 (медиана – 1,73) в выборке лимфом «серой зоны»; от 49,45 до 0,13 (медиана – 2,75) в выборке В-ХЛЛ; от 6,82 до 0,08 (медиана – 0,49) в выборке реактивной лимфоидной ткани. Уровень мРНК гена SHP1 достоверно (p<0,05) понижен в выборке реактивной лимфоидной ткани по сравнению с другими исследуемыми группами и достоверно повышен в выборке ЛКМЗ по сравнению с другими исследуемыми группами. Группы В-ХЛЛ и лимфом «серой зоны» достоверно не различаются. Для SYK (Рисунок 9, В) разброс значений относительных нормализованных уровней экспрессии составил от 7,91 до 0,07 (медиана – 0,80) в выборке ЛКМЗ, от 3,56 до 0,26 (медиана – 0,52) в выборке лимфом «серой зоны», от 4,31 до 0,004 (медиана – 0,47) в выборке В-ХЛЛ, от 1,15 до 0,08 (медиана – 0,20) в выборке реактивной лимфоидной ткани. Статистически достоверные отличия (p<0,05) были получены для групп ЛКМЗ и В-ХЛЛ (экспрессия гена SYK выше при ЛКМЗ, чем при В-ХЛЛ), для групп ЛКМЗ и реактивной лимфоидной ткани, а также для групп лимфом «серой зоны» и реактивной лимфоидной ткани. Достоверных отличий для групп В-ХЛЛ и лимфом «серой зоны», а также В-ХЛЛ и реактивной лимфоидной ткани получить не удалось из-за большого разброса значений уровня экспрессии SYK в выборке ВХЛЛ. Для ZAP70 (Рисунок 9, Г) разброс значений относительных нормализованных уровней экспрессии составил от 5,61 до 0,31 (медиана – 0,75) в выборке ЛКМЗ, от 3,33 до 0,13 (медиана – 0,94) в выборке лимфом «серой зоны», от 22,45 до 0,008 (медиана – 2,26) в выборке В-ХЛЛ, от 5,32 до 0,04 (медиана – 0,12) в выборке реактивной лимфоидной ткани. При этом важно отметить, что в выборке В-ХЛЛ разброс значений экспрессии ZAP70 был наибольшим и внутри этой группы можно было выделить две подгруппы – с низким и высоким относительным уровнем экспрессии ZAP70 соответственно. Статистически достоверные отличия (p<0,05) удалось получить для медианы группы реактивной лимфоидной ткани (самый низкий уровень экспрессии ZAP70) и медиан всех других групп. Достоверных отличий для медианы группы ВХЛЛ и медиан всех других исследуемых групп получить не удалось из-за большого разброса значений в выборке В-ХЛЛ. Группы ЛКМЗ и лимфом «серой зоны» также достоверно не различаются. 53 Рисунок 9. Относительное нормализованное количество кДНК генов сигнальных белков BCRкаскада. A – уровень экспрессии гена LYN. Б – уровень экспрессии гена PTPN6 (SHP1). В – уровень экспрессии гена SYK. Г – уровень экспрессии гена ZAP70. Д – уровень экспрессии гена CD79A. Е – уровень экспрессии гена CD79B. 54 Для CD79A (Рисунок 9, Д) разброс значений относительных нормализованных уровней экспрессии составил от 5,61 до 0,15 (медиана – 0,67) в выборке ЛКМЗ, от 14,19 до 0,52 (медиана – 0,93) в выборке лимфом «серой зоны», от 14,84 до 0,009 (медиана – 1,19) в выборке В-ХЛЛ, от 3,96 до 0,04 (медиана – 1,20) в выборке реактивной лимфоидной ткани. Уровень экспрессии CD79A достоверно понижен (p<0,05) в выборке ЛКМЗ по сравнению с группой лимфом «серой зоны». Другие группы между собой достоверно не различались. Для CD79B (Рисунок 9, Е) разброс значений относительных нормализованных уровней экспрессии составил от 7,06 до 0,0005 (медиана – 0,73) в выборке ЛКМЗ, от 2,17 до 0,26 (медиана – 0,41) в выборке лимфом «серой зоны», от 74,14 до 0,002 (медиана – 0,37) в выборке В-ХЛЛ, от 0,72 до 0,07 (медиана – 0,29) в выборке реактивной лимфоидной ткани. Статистически достоверные отличия (p<0,05) были получены для групп ЛКМЗ и реактивной лимфоидной ткани, а также для групп лимфом «серой зоны» и реактивной лимфоидной ткани. Кроме того, достоверные отличия были получены для групп В-ХЛЛ и ЛКМЗ (экспрессия гена CD79B выше при ЛКМЗ, чем при В-ХЛЛ). Другие группы между собой достоверно не различались. Таким образом, группа В-ХЛЛ демонстрирует наибольший разброс уровней экспрессии генов сигнальных белков BCR-каскада и отличается от группы ЛКМЗ по достоверно сниженным уровням экспрессии мРНК генов LYN, PTPN6 (SHP1), SYK, CD79B, но не по уровню экспрессии мРНК CD79A. По уровню экспрессии гена ZAP70 группа В-ХЛЛ делится на две подгруппы: ZAP70high и ZAP70low, что отличает ее как от группы ЛКМЗ, так и от группы лимфом «серой зоны». Группа лимфом «серой зоны» занимает промежуточное положение между группами В-ХЛЛ и ЛКМЗ по уровням экспрессии мРНК сигнальных белков BCR-каскада и достоверно отличается от ЛКМЗ по сниженному уровню экспрессии мРНК PTPN6 (SHP1) и повышенному уровню экспрессии мРНК CD79A, а от В-ХЛЛ по отсутствию разделения на ZAP70high и ZAP70low популяции внутри выборки. Достоверно сниженный уровень экспрессии мРНК генов LYN, PTPN6 (SHP1), SYK, ZAP70 и CD79B наблюдался в образцах реактивных контролей по сравнению с опухолевыми образцами, что требует дополнительной оценки их уровней экспрессии в чистых субпопуляциях B-лимфоцитов. На основании предположения о пропорциональных уровнях экспрессии генов, кодирующих сигнальные компоненты рецептора, был проведен анализ корреляций между относительными нормализованными количествами кДНК генов сигнальных белков в группах опухолевой и реактивной лимфоидной ткани. Дополнительно было проверено наличие 55 корреляций с относительным нормализованным количеством кДНК гена циклина D1, так как этот белок является не только диагностическим фактором при лимфомах, но и одним из эффекторных компонентов BCR-каскада в норме. Таблица 2. Корреляции уровней экспрессии генов сигнальных белков в выборке реактивной лимфоидной ткани (n=15). Коэффициенты Спирмана рассчитаны для каждой пары генов и представлены в виде матрицы. Жирным шрифтом выделены коэффициенты с достоверным уровнем корреляции (p<0.01). LYN SYK ZAP70 SHP1 CD79A SYK 0,168 ZAP70 0,071 0,15 SHP1 0,332 0,157 0,386 CD79A 0,196 0,454 -0,154 0,354 CD79B 0,096 0,114 0,079 0,343 0,739 CCND1 -0,025 -0,146 -0,125 0,018 0,064 CD79B 0,254 В реактивной лимфоидной ткани уровни экспрессии генов CD79A и CD79B положительно и статистически достоверно коррелируют между собой (Таблица 2), что может свидетельствовать о ко-регуляции их экспрессии в В-лимфоцитах. Корреляций между уровнями экспрессии других компонентов BCR-каскада не было обнаружено, возможно, из-за недостаточного количества В-клеток в реактивных образцах и менее строгой ко-регуляции экспрессии этих генов. Корреляция относительных нормализованных уровней экспрессии генов сигнальных белков и гена циклина D1 также не было обнаружено: в норме циклин D1 экспрессируется в солидной лимфоидной ткани на крайне низком уровне и его экспрессия преимущественно связана с клетками стромы. 56 Таблица 3. Корреляции уровней экспрессии генов сигнальных белков в выборке ЛКМЗ (n=27). Коэффициенты Спирмана рассчитаны для каждой пары генов и представлены в виде матрицы. Жирным шрифтом выделены коэффициенты с достоверным уровнем корреляции (p<0.01). LYN SYK ZAP70 SHP1 CD79A SYK 0,529 ZAP70 0,020 0,355 SHP1 0,611 0,482 -0,043 CD79A 0,654 0,284 -0,328 0,552 CD79B 0,299 0,505 0,303 0,535 0,073 CCND1 -0,012 -0,005 -0,423 0,0006 0,139 CD79B -0,005 В опухолевых В-клетках ЛКМЗ существует корреляция уровней экспрессии генов сигнальных белков (Таблица 3): положительно коррелируют между собой уровни экспрессии CD79A и LYN, CD79A и SHP1, CD79В и SHP1, CD79В и SYK, SYK и LYN. При этом отсутствует статистически достоверная корреляция уровней экспрессии генов CD79A и CD79В. Отсутствие корреляции уровней экспрессии генов сигнальных белков и гена циклина D1 может свидетельствовать о его эндогенной гиперэкспрессии, которая не связанна с передачей сигналов от В-клеточного рецептора. Таблица 4. Корреляции уровней экспрессии генов сигнальных белков в выборке лимфом «серой зоны» (n=24). Коэффициенты Спирмана рассчитаны для каждой пары генов и представлены в виде матрицы. Жирным шрифтом выделены коэффициенты с достоверным уровнем корреляции (p<0.01). LYN SYK ZAP70 SHP1 CD79A SYK -0,113 ZAP70 -0,181 0,551 SHP1 0,306 0,441 0,471 CD79A 0,272 -0,436 -0,125 0,162 CD79B 0,228 0,216 0,132 0,402 -0,01 CCND1 0,566 0,081 -0,169 0,15 -0,105 CD79B 0,105 57 В выборке лимфом «серой зоны» практически не прослеживается корреляций уровней экспрессии генов сигнальных белков, кроме положительной корреляции уровней ZAP70 и SYK (Таблица 4). Отсутствие корреляций может свидетельствовать о полной дерегуляции клеточного сигналинга в этой группе. Наличие положительной корреляции уровня экспрессии гена LYN с геном циклина D1 может свидетельствовать об аберрантной активности тирозинкиназы LYN в этих клетках. Таблица 5 Корреляции уровней экспрессии генов сигнальных белков в выборке В-ХЛЛ (n=22). Коэффициенты Спирмана рассчитаны для каждой пары генов и представлены в виде матрицы. Жирным шрифтом выделены коэффициенты с достоверным уровнем корреляции (p<0.01). LYN SYK ZAP70 SHP1 CD79A SYK 0,442 ZAP70 0,08 0,531 SHP1 0,134 0,505 0,589 CD79A 0,785 0,516 0,141 0,414 CD79B 0,162 0,514 0,361 0,791 0,394 CCND1 -0,056 0,084 -0,113 -0,155 -0,204 CD79B -0,076 В выборке В-ХЛЛ положительно коррелируют уровни экспрессии CD79A и LYN, CD79В и SHP1, а также ZAP70 и SHP1 (Таблица 5). Уровни экспрессии CD79A и CD79В не коррелируют между собой, как и в выборке ЛКМЗ. Также отсутствуют корреляции уровней экспрессии генов сигнальных белков и гена циклина D1. Таким образом, в неопухолевой лимфоидной ткани достоверно положительно коррелируют между собой уровни экспрессии мРНК генов CD79B и CD79A. Отсутствие данной корреляции в группах опухолевых образцов может свидетельствовать об аберрантной сборке В-клеточного рецептора на опухолевых лимфоцитах. Наличие корреляций между уровнями экспрессии генов других сигнальных компонентов может указывать на состав аберрантного BCR при различных видах лимфом. Так как экспрессия генов некоторых сигнальных белков (LYN, PTPN6 (SHP1), ZAP70) не ограничивается Влимфоцитами, актуальным представляется анализ корреляций в отсортированных пробах опухолей. 58 4.3 Описание CD5+CD19+ популяции неопухолевых лимфоцитов миндалин Для анализа распределения лимфоцитарных популяций в лимфоидной ткани миндалин человека было проведено иммуногистохимическое окрашивание последовательных парафиновых срезов на основные линейные маркеры (Рисунок 10, Рисунок 11). Использовались антитела к маркеру В-клеток CD79a, маркеру Т-клеток CD3, маркеру Т-клеток и субпопуляции В-клеток CD5, а также поликлональные антитела к цитокератинам для распознавания эпителиальных клеток в составе ткани миндалин. Более развернутое иммуногистохимическое окрашивание включало также антитела к функциональным маркерам CD38, CD27, CD23 (Рисунок 12). Миндалины имеют характерное строение вторичного лимфоидного органа и содержат Ви Т-клетки с преимущественно активированным иммунофенотипом (Рисунок 12). На Рисунке 10, А-Б и Рисунке 11, А видно, что В-клетки локализуются в них в области фолликулов и обильно инфильтрируют субэпителиальный, а также интраэпителиальный слой крист. Т-клетки, напротив, преимущественно локализуются в межфолликулярном пространстве, частично – в фолликуле и крайне редко в субэпителиальной зоне (Рисунок 11, В). Паттерн распределения маркера CD5 преимущественно повторяет паттерн CD3, однако необходимо отметить, что в субэпителиальной зоне клеток CD5+ больше, чем CD3+. Рисунок 10. Иммуногистохимическое окрашивание последовательных срезов образца неопухолевой ткани миндалин. Объектив х10. Масштабный отрезок – 50 мкм. A – anticytokeratin, поликлональные антитела к цитокератинам. Позитивны клетки эпителия крист. Б – anti-CD79а. Позитивны клетки фолликула и субэпителиальной зоны крист. 59 Рисунок 11. Иммуногистохимическое окрашивание последовательных срезов образца неопухолевой ткани миндалин. Объектив х10. Масштабный отрезок – 50 мкм. A – anti-CD79а. Позитивны клетки фолликула и субэпителиальной зоны крист. Б – anti-CD5. Позитивно большинство клеток в межфолликулярном пространстве, единичные клетки в фолликуле и скопления клеток в субэпителиальной зоне. В – anti-CD3. Позитивно большинство клеток в межфолликулярном пространстве, скопления клеток в фолликуле и единичные клетки в субэпителиальной зоне. Рисунок 12. Иммуногистохимическое окрашивание последовательных срезов образца неопухолевой ткани миндалин. Объектив х10. Масштабный отрезок – 50 мкм. A – anti-CD3. Б – anti-CD5. В – anti-CD79а. Г – anti-CD27. Д – anti-CD23. E – anti-CD38. Суспензии 40 образцов миндалин детей от 2 до 14 лет были проанализированы методом проточной цитофлуориметрии для поиска нормальной популяции CD5+CD19+ В-лимфоцитов (Рисунок 13). Все образцы миндалин имели схожий иммунофенотип, в них детектировалась 60 популяция неопухолевых CD5+lowCD19+ В-клеток (Рисунок 13, Б), составлявшая 3-45% от всех В-клеток в образце. Рисунок 13. Пример иммунофенотипа клеток суспензии миндалин. A – выделение лимфоцитарного полигона. Б – из общей популяции В-лимфоцитов выделяется популяция с фенотипом CD5(low)CD19+. В – В-лимфоциты имеют высокий уровень активации. Дополнительно в суспензии миндалин присутствует популяция В-лимфоцитов CD19+/CD38high. Г – полигон (CD5(low)CD19+ В-лимфоциты), отложенный в координатах CD19/CD38. На графике видно, что популяция CD5+ В-лимфоцитов миндалин имеют фенотип CD38+, но не CD38high. Д – В-лимфоциты суспензии миндалин гетерогенны по уровню экспрессии CD23. Е – все В-клетки имеют высокий уровень экспрессии ко-рецепторных молекул CD20 и CD22. Ж – В-клетки отрицательны или слабо положительны по CD43 (фенотип «-low»). З – В-лимфоциты суспензии миндалин поликлональны. Для образцов, полученных от пациентов с точно известным возрастом, был проведен анализ зависимости процента CD5lowCD19+ популяции от возраста (Рисунок 14). В целом, доля CD5+ В-клеток от общего количества В-клеток снижалась с возрастом пациентов. 61 Рисунок 14. Зависимость количества CD5+ B-клеток от возраста. Количество CD5+ Вклеток приведено в процентах от общего количества В-клеток в суспензии миндалин. Для более полного описания коэкспрессии поверхностных маркеров на неопухолевых CD5+ В-лимфоцитах было проведено их развернутое иммунофенотипирование методом проточной цитофлуориметрии с использованием шестицветной метки (Рисунок 15). При дальнейшем анализе поверхностных маркеров популяции CD5+ В-клеток крайне мало различались от пробы к пробе. Было показно, что эти клетки имеют фенотип CD38+ (Рисунок 13, Г, Рисунок 15, Е), CD25- (Рисунок 15, З) и отличаются от В-ХЛЛ по уровням экспрессии CD23 (Рисунок 15, Д), CD43 (Рисунок 13, Ж) и CD27 (Рисунок 15, Ж). Таким образом, популяция неопухолевых CD5-положительных В-клеток детектируется в миндалинах человека и имеет фенотип: CD5+low/CD19+/CD38+/CD43-/CD23-/CD27-low/CD25-. Процент этих клеток в образце варьирует в широких пределах и в целом снижается с возрастом. 62 Рисунок 15. Развернутое иммунофенотипирование нормальных CD5+ B-клеток суспензии миндалин. A –лимфоцитарный полигон. Б – синглеты. В – Т- и В-лимфоциты. Г – фиолетовым выделена популяция В-лимфоцитов с фенотипом CD19+CD5+low. Д – выделенные В-клетки имеют фенотип CD5+CD19+CD23-. Е – выделенные В-клетки имеют фенотип CD5+CD19+CD38+. Ж – выделенные В-клетки имеют фенотип CD5+CD19+CD27-low. З – выделенные В-клетки имеют фенотип CD5+CD19+CD25-. 4.4 Сортировка нормальных и опухолевых В-клеток. Определение уровней экспрессии мРНК генов сигнальных белков BCR-каскада в чистых субпопуляциях Так как субпопуляция CD5+CD19+ В-клеток считается наиболее всего похожей на CD5+ В-клеточные опухоли по иммунофенотипу и из-за этого часто называется нормальным предшественником В-ХЛЛ, в данной работе они использовались в качестве нормальных контролей для оценки уровней экспрессии генов сигнальных белков BCR-каскада. Для определения уровней экспрессии генов BCR-ассоциированных сигнальных молекул в чистых популяциях была предпринята сортировка клеток с многоцветной флуоресцентной меткой при помощи FACS сортера. Были отсортированы CD5+ B-клетки из 23 образцов В-ХЛЛ 63 и 10 образцов суспензии миндалин. Дополнительно в качестве контроля были отсортированы Т-клетки периферической крови здоровых доноров и В-клетки периферической крови здоровых доноров, которые в норме не несут на поверхности маркер CD5. Эффективность сортировки во всех случаях превысила 98%. Из отсортированных образцов опухолевых и неопухолевых клеток была выделена РНК, транскрибирована кДНК и поставлена полимеразная цепная реакция в реальном времени для оценки уровней экспрессии генов сигнальных молекул BCR-каскада в Т- и В-клетках периферической крови, в субпопуляции CD5+ В-клеток миндалин, а также в отсортированных образцах В-ХЛЛ. Значения относительных нормализованных уровней экспрессии генов в выборках не подчиняются законам нормального распределения, как и в случае с неотсортированными пробами (Рисунок 16). Для статистического анализа, таким образом, использовались разброс, медиана и тест Манна-Уитни для сравнения выборок. Для LYN (Рисунок 16, A) разброс значений относительных нормализованных уровней экспрессии составил от 1,84 до 0,05 (медиана – 0,24) в выборке отсортированных образцов ВХЛЛ; от 0,09 до 0 (медиана – 0,01) в выборке отсортированных Т-клеток периферической крови; от 3,49 до 0,35 (медиана – 0,68) в выборке отсортированных В-клеток периферической крови; от 17,28 до 0,60 (медиана – 2,62) в выборке отсортированных CD5+ В-клеток миндалин. Статистически достоверные отличия (p<0,05) были получены для медианы группы отсортированных Т-клеток (самый низкий уровень экспрессии LYN, в 5 случаях из 10 не детектируемый) и медиан всех других групп. Кроме того, достоверные отличия были получены для медианы отсортированных образцов В-ХЛЛ и медиан всех других групп (экспрессия гена LYN при В-ХЛЛ выше, чем в Т- и ниже ,чем в нормальных В-клетках). Достоверных отличий между группами неопухолевых В-лимфоцитов периферической крови и CD5+ В-лимфоцитами миндалин обнаружено не было. Для SHP1 (PTPN6) (Рисунок 16, Б) разброс значений относительных нормализованных уровней экспрессии составил от 4,63 до 0,01 (медиана – 0,53) в выборке отсортированных образцов В-ХЛЛ; от 2,70 до 0,24 (медиана – 0,91) в выборке отсортированных Т-клеток периферической крови; от 3,56 до 0,33 (медиана – 2,17) в выборке отсортированных В-клеток периферической крови; от 14,00 до 0,61 (медиана – 2,81) в выборке отсортированных CD5+ В-клеток миндалин. Достоверные отличия (p<0,05) были обнаружены для медианы выборки отсортированных Т-клеток периферической крови и медиан выборок неопухолевых Вклеток (как В-клеток периферической крови, так и от CD5+ В-клеток миндалин), но не для медианы выборки отсортированных Т-клеток и медианы выборки отсортированных образцов 64 В-ХЛЛ. Выборка отсортированных образцов В-ХЛЛ также достоверно отличается от двух выборок неопухолевых В-клеток по уровню экспрессии SHP1. Достоверных отличий между группами неопухолевых В-лимфоцитов периферической крови и CD5+ В-лимфоцитами миндалин обнаружено не было. Для SYK (Рисунок 16, В) разброс значений относительных нормализованных уровней экспрессии составил от 5,79 до 0,08 (медиана – 0,68) в выборке отсортированных образцов ВХЛЛ; от 0,91 до 0,02 (медиана – 0,06) в выборке отсортированных Т-клеток периферической крови; от 12,97 до 5,32 (медиана – 7,03) в выборке отсортированных В-клеток периферической крови; от 26,81 до 1,80 (медиана – 3,12) в выборке отсортированных CD5+ В-клеток миндалин. Статистически достоверные отличия (p<0,05) были получены для медианы группы отсортированных Т-клеток и медиан всех других групп, а также для медианы выборки отсортированных образцов В-ХЛЛ и медиан всех других групп (экспрессия гена SYK при ВХЛЛ выше, чем в образцах Т-клеток и достоверно ниже, чем в нормальных В-клетках). Достоверных отличий для медиан групп неопухолевых В-лимфоцитов крови и неопухолевых CD5+ В-лимфоцитов миндалин обнаружено не было. Для ZAP70 (Рисунок 16, Г) разброс значений относительных нормализованных уровней экспрессии составил от 0,78 до 0 (медиана – 0,07) в выборке отсортированных образцов В-ХЛЛ. В отсортированных образцах сохранилась та же тенденция, что и в неотсортированных пробах В-ХЛЛ (Рисунок 9, Г): общая выборка В-ХЛЛ делится на группы с низким и высоким уровнем экспрессии мРНК ZAP70. Полученные результаты позволяют утверждать, что подобный разброс является следствием разных свойств опухолевых клеток В-ХЛЛ у разных пациентов и никак не зависит от примесей Т-клеток в пробе. В выборках неопухолевых контролей разброс значений относительных нормализованных уровней экспрессии ZAP70 составил от 2,42 до 0,66 (медиана – 1,30) в выборке отсортированных Т-клеток периферической крови; от 0,68 до 0,02 (медиана – 0,08) в выборке отсортированных В-клеток периферической крови; от 0,45 до 0,06 (медиана – 0,22) в выборке отсортированных CD5+ В-клеток миндалин. Статистически достоверные отличия (p<0,05) удалось получить для медианы группы отсортированных Тклеток (самый высокий уровень экспрессии ZAP70) и медиан всех других групп. Также достоверные отличия были получены для медиан групп В-клеток периферической крови и CD5+ В-клеток миндалин (в миндалинах уровень экспрессии гена ZAP70 достоверно повышен по сравнению с периферической кровью). Достоверных отличий для медианы выборки отсортированных образцов В-ХЛЛ и медиан выборок неопухолевых В-клеток (как В-клеток периферической крови, так и от CD5+ В-клеток миндалин) получить не удалось из-за большого разброса значений в выборке В-ХЛЛ. 65 Рисунок 16. Относительное нормализованное количество кДНК генов сигнальных молекул BCR-каскада в отсортированных пробах. A – уровень экспрессии гена LYN. Б – уровень экспрессии гена PTPN6 ( SHP1). В – уровень экспрессии гена SYK. Г – уровень экспрессии гена ZAP70. Д – уровень экспрессии гена CD79A. Е – уровень экспрессии гена CD79B. 66 Для CD79A (Рисунок 16, Д) разброс значений относительных нормализованных уровней экспрессии составил от 21,40 до 0,25 (медиана – 5,22) в выборке отсортированных образцов ВХЛЛ; от 0,85 до 0,03 (медиана – 0,13) в выборке отсортированных Т-клеток периферической крови; от 43,76 до 2,50 (медиана – 9,63) в выборке отсортированных В-клеток периферической крови; от 30,00 до 2,90 (медиана – 11,04) в выборке отсортированных CD5+ В-клеток миндалин. Статистически достоверные отличия (p<0,05) были получены для медианы группы отсортированных Т-клеток (самый низкий уровень экспрессии CD79A) и медиан всех других групп. Также по уровню экспрессии CD79A достоверно отличается выборка отсортированных образцов В-ХЛЛ от выборки CD5+ В-клеток миндалин. Достоверных различий для групп ВХЛЛ и В-клеток периферической крови, а также для В-клеток периферической крови и CD5+ Вклеток миндалин обнаружено не было. Для CD79В (Рисунок 16, Е) разброс значений относительных нормализованных уровней экспрессии составил от 12,97 до 0,19 (медиана – 1,15) в выборке отсортированных образцов ВХЛЛ; от 9,10 до 0,17 (медиана – 0,37) в выборке отсортированных Т-клеток периферической крови; от 31,57 до 2,47 (медиана – 19,18) в выборке отсортированных В-клеток периферической крови; от 84,25 до 6,50 (медиана – 55,72) в выборке отсортированных CD5+ В-клеток миндалин. Статистически достоверные отличия (p<0,05) были получены для медианы группы отсортированных Т-клеток (самый низкий уровень экспрессии CD79В) и медиан всех других групп, а также для выборки отсортированных образцов В-ХЛЛ и всех других групп. Достоверных отличий для медиан групп неопухолевых В-лимфоцитов периферической крови и неопухолевых CD5+ В-лимфоцитов миндалин обнаружено не было. Для проверки пропорциональности уровней экспрессии генов сигнальных белков BCRкаскада был проведен анализ корреляций между относительными нормализованными количествами кДНК исследованных генов в выборках отсортированных клеток. Таблица 6. Корреляции уровней экспрессии генов сигнальных белков в выборке отсортированных образцов В-ХЛЛ (n=23). Коэффициенты Спирмана рассчитаны для каждой пары генов и представлены в виде матрицы. Жирным шрифтом выделены коэффициенты с достоверным уровнем корреляции (p<0.01). LYN SYK ZAP70 SHP1 SYK -0,017 ZAP70 -0,125 0,623 SHP1 -0,074 0,694 0,699 CD79A 0,082 -0,25 -0,253 0,016 CD79B -0,157 0,754 0,534 0,783 CD79A 0,176 67 В отсортированных образцах В-ХЛЛ положительно коррелируют между собой уровни экспрессии ZAP70, SYK, CD79В и SHP1 (Таблица 6). Не прослеживается корреляций с LYN и CD79A. Таблица 7. Корреляции уровней экспрессии генов сигнальных белков в выборке отсортированных Т-клеток периферической крови (n=10). Коэффициенты Спирмана рассчитаны для каждой пары генов и представлены в виде матрицы. Жирным шрифтом выделены коэффициенты с достоверным уровнем корреляции (p<0.01). LYN SYK ZAP70 SHP1 SYK -0,110 ZAP70 0,356 -0,091 SHP1 0,291 -0,430 0,818 CD79A 0,110 0,358 -0,624 -0,782 CD79B -0,037 0,567 0,067 -0,533 CD79A 0,517 В отсортированных Т-клетках положительно коррелируют между собой уровни экспрессии ZAP70 и SHP1, которые принимают участие в проведении сигнала от Т-клеточного рецептора (Таблица 7). Также уровень экспрессии SHP1 отрицательно коррелирует с уровнем экспрессии CD79A. Таблица 8. Корреляции уровней экспрессии генов сигнальных белков в выборке отсортированных В-клеток периферической крови (n=10). Коэффициенты Спирмана рассчитаны для каждой пары генов и представлены в виде матрицы. Жирным шрифтом выделены коэффициенты с достоверным уровнем корреляции (p<0.01). LYN SYK ZAP70 SHP1 SYK 0,006 ZAP70 -0,067 0,539 SHP1 0,546 -0,212 -0,588 CD79A 0,08 0,285 -0,042 0,455 CD79B 0,326 -0,217 -0,667 0,867 CD79A 0,733 В нормальных В-лимфоцитах периферической крови положительно коррелируют между собой уровни экспрессии генов CD79B и SHP1. 68 Таблица 9. Корреляции уровней экспрессии генов сигнальных белков в выборке отсортированных CD5+ В-клеток миндалин (n=10). Коэффициенты Спирмана рассчитаны для каждой пары генов и представлены в виде матрицы. LYN SYK ZAP70 SHP1 SYK -0,05 ZAP70 0,067 0,383 SHP1 -0,267 0,45 0,533 CD79A -0,333 0,4 0,55 0,1 CD79B -0,317 0,65 -0,017 0,183 CD79A 0,583 Малое количество достоверных корреляций в выборках отсортированных проб неопухолевых клеток, по-видимому, связано с малыми объемами выборок (n=10), требующими высоких критических значений коэффициента Спирмана. Таким образом, уровни экспрессии генов сигнальных BCR-ассоциированных молекул были проанализированы в группах отсортированных чистых субпопуляций клеток a) ВХЛЛ (n=23), б) неопухолевых CD5+ В-клеток миндалин человека (n=10), в) неопухолевых CD5- В-клеток периферической крови человека (n=10) и г) неопухолевых Т-клеток периферической крови человека (n=10). На основании профиля экспрессии этих генов оказалось возможным достоверно отличить опухолевые клетки от любых нормальных предшественников. 4.5 Совместный анализ данных по экспрессии мРНК генов сигнальных белков BCRкаскада в отсортированных и неотсортированных лимфоидных образцах Использование одного и того же контрольного образца кДНК (IRC, inter-run calibrator) в каждой реакции ПЦР в реальном времени позволило объединить выборки отсортированных и неотсортированных образцов для совместного анализа. Исходя из того, что одна и та же проба кДНК в последовательных реакциях должна давать постоянные значения поргового цикла, можно ввести поправочный коэффициент для объединения образцов в общий эксперимент. Объединение выборок отсортированных и неотсортированных образцов опухолевых и неопухолевых лимфоцитов человека позволило оценить влияние клеточной сортировки на относительные уровни экспрессии генов при В-ХЛЛ а также оценить свойства контролей, часто используемых для сравнения уровней экспрессии генов в опухолевых и неопухолевых клетках (Рисунок 17). 69 При сравнении расширенных выборок отсортированных и неотсортированных образцов В-ХЛЛ было показано, что относительные уровни экспрессии генов, не являющихся специфичными для В-лимфоцитов, завышаются без предварительной сортировки клеток. Из шести исследованных генов LYN, SYK, ZAP70, PTPN6(SHP1), CD79B и CD79А три экспрессируются только В-лимфоцитами (SYK, CD79B, CD79А) и три представлены в других типах клеток (LYN в моноцитах, ZAP70 в Т- и NK-клетках, PTPN6 (SHP1) во всех клетках крови). В соответствии с ожидаемыми результатами, относительные нормализованные количества кДНК генов LYN, ZAP70 и PTPN6 (SHP1) достоверно ниже в отсортированных образцах В-ХЛЛ, чем в неотсортированных. Относительные нормализованные количества кДНК генов, специфичных для В-лимфоцитов, остаются неизменными (SYK) или достоверно повышаются (CD79B, CD79А) после сортировки. Для гена ZAP70 в отсортированных образцах сохраняется та же тенденция, что и в неотсортированных пробах В-ХЛЛ: общая выборка делится на две группы – с низким и высоким относительным нормализованным количеством кДНК ZAP70 соответственно (Рисунок 17, Г). Полученные результаты позволяют утверждать, что подобный разброс является следствием разных свойств опухолевых клеток В-ХЛЛ у разных пациентов и никак не зависит от примесей Т-клеток в пробе. 70 Рисунок 17. Относительное нормализованное количество кДНК генов сигнальных молекул BCR-каскада в объединенной выборке. A – ген PTPN6 (SHP1). Б –ген LYN. В – ген SYK. Г – ген ZAP70. Д – ген CD79A. Е – ген CD79B. 71 Неотсортированные образцы с гиперлейкоцитозом неопухолевой природы демонстрируют достоверно сниженные уровни экспрессии генов сигнальных белков BCRкаскада LYN, SYK, ZAP70, PTPN6(SHP1), CD79B из-за слишком малого количества В-клеток по сравнению с образцами лимфом и, таким образом, не являются релевантными биологическими контролями для анализа уровней экспрессии генов BCR-ассоциированных белков в Вклеточных опухолях. В то же время отсортированные нормальные В-клетки демонстрируют достоверно повышенные относительные уровни экспрессии LYN, SYK, PTPN6(SHP1), CD79B и CD79А по сравнению с отсортированными опухолевыми клетками. Таким образом, по уровням экспрессии генов сигнальных BCR-ассоциированных молекул опухолевые лимфоциты В-ХЛЛ можно отличить от нормальных субпопуляций Влимфоцитов. Однако различные нормальные субпопуляции В-лимфоцитов не различаются между собой за исключением повышенного уровня экспрессии ZAP70 в CD5+ В-клетках миндалин. Выборка В-ХЛЛ делится на группы ZAP70low и ZAP70high как до, так и после сортировки. 4.6 Анализ экспрессии ZAP-70 в CD5+CD19+ В-клетках миндалин методом проточной цитофлуориметрии Полученные данные позволяют говорить об общем паттерне экспрессии сигнальных белков BCR-каскада для нормальных В-лимфоцитов независимо от их поверхностного иммунофенотипа и гистологической локализации, так как относительные нормализованные количества кДНК исследуемых генов не демонстрировали достоверных различий для выборок CD5- В-лимфоцитов периферической крови и CD5+ В-лимфоцитов миндалин человека. Исключение составляет ген ZAP70, относительный нормализовазованный уровень экспрессии которого достоверно повышен в группе CD5+ В-лимфоцитов миндалин. 15 образцов клеток из суспензии миндалин были внутриклеточно окрашены на ZAP-70 для проточной цитофлуориметрии. В 8 случаях в образцах выявлялась популяция В-клеток, экспрессирующих эту тирозинкиназу (Рисунок 18). Возможно, тирозинкиназа ZAP-70 дополнительно экспрессируется физиологических условиях. в нормальных CD5+ В-лимфоцитах в некоторых 72 Рисунок 18. ZAP-70+ B-клетки в суспензии миндалин. A – R1, лимфоцитарный полигон. B – Выделение ZAP-70+ В-лимфоцитов – полигон R2. C – Т-лимфоциты имеют высокий уровень ZAP-70. D – полигон R2 (ZAP-70+ В-лимфоциты). Таким образом, уровень экспрессии мРНК гена ZAP70 повышен в неопухолевых CD5+ В-лимфоцитах по сравнению с CD5- В-лимфоцитами. Эти данные подтверждаются на белковом уровне методом проточной цитофлуориметрии. 73 ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 5.1 Опухолевые В-клетки В-ХЛЛ и ЛКМЗ имеют уникальный профиль экспрессии сигнальных белков Недавние исследования указывают на то, что аберрантная передача сигналов через Вклеточный рецептор является характерной для различных лимфом человека; так, автономно проводящий сигнал рецептор при В-ХЛЛ является фактором туморогенеза для этой опухоли (Duhren-von Minden et al., 2012). Как правило, это зависит от генетических поломок (Davis et al., 2010), меняющих свойства проводящих элементов каскада. Помимо поиска мутаций, однако, важность представляет сравнение относительных уровней экспрессии мРНК генов основных сигнальных белков BCR-каскада, позволяющих определить общее функциональное состояние В-лимфоцита и лучше дифференцировать разные нозологические формы. Данная работа показывает, что выборки В-ХЛЛ и ЛКМЗ достоверно отличаются друг от друга по уровням экспрессии мРНК большинства сигнальных BCR-ассоциированных компонентов. Достоверные отличия были установлены для пяти генов из шести, что дает дополнительные возможности для дискриминации этих двух нозологий. Пониженные уровни экспрессии мРНК генов LYN, SHP1, SYK и CD79B в группе В-ХЛЛ по сравнению с ЛКМЗ соответствуют данным о том, что при В-ХЛЛ значительно снижен уровень поверхностных иммуноглобулинов и BCR-ассоциированных ко-рецепторных белков (Chen, Heller, 1978; Klein, Dalla-Favera, 2005). Таким образом, различия распространяются и на проводящие сигнальные белки BCR-каскада. Достоверных различий между группами В-ХЛЛ и ЛКМЗ не наблюдалось только для уровня экспрессии мРНК гена CD79A: по-видимому, экспрессия этого гена не является лимитирующей для сборки BCR. Данные о дефектах сигналинга, связанных с белком СD79a, при В-ХЛЛ существуют, но связаны не с его количеством а с аберрантным гликозилированием и фолдингом этого белка (Vuillier et al., 2005). В целом, полученные данные согласуются с представлениеи о том, что клетки В-ХЛЛ экспрессируют на низком уровне конститутивно активные сигнальные молекулы (Contri et al., 2005; Gobessi et al., 2009; Duhrenvon Minden et al., 2012) и имеют более агрессивный статус в зависимости от способности воспринимать максимальное количество активирующих сигналов (Cesano et al., 2013). В то же время, клетки ЛКМЗ, очевидно, проходят иной путь малигнизации, сохраняя поверхностные элементы BCR-каскада в состоянии максимально приближенном к норме, и в наибольшей степени завися от мутаций основного эффектора сигнального пути – циклина D1 (Raffeld, Jaffe, 1991). 74 Повышенный уровень экспрессии мРНК гена ZAP70 в группе В-ХЛЛ по сравнению с ЛКМЗ отражает наличие многократно описанных случаев В-ХЛЛ, экспрессирующих тирозинкиназу ZAP-70 (Chen et al., 2002; Wiestner et al., 2003). По данным литературы, эти две субпопуляции случаев В-ХЛЛ имеют достоверно отличающийся прогноз: неблагоприятный при наличии ZAP-70 и благоприятный при отсутствии ZAP-70 (Orchard, 2004; Reinoso-Martín, 2008;). Группа В-ХЛЛ делится на две выраженных подгруппы по количеству мРНК этой тирозинкиназы, однако при этом минимальные значения относительного нормализованного уровня экспрессии гена ZAP70 не всегда означают отсутствие белка ZAP-70 в опухолевых клетках В-ХЛЛ. Вносимая ошибка определяется размером популяций Т- и NK-клеток, которые экспрессируют тирозинкиназу ZAP-70 на очень высоком уровне. Так, случаи В-ХЛЛ, не экспрессирующие ген ZAP70 непосредственно в опухолевых В-клетках, но имеющие большой процент Т- и NK-клеток в пробе, могут демонстрировать более высокий относительный нормализованный уровень мРНК гена ZAP70, чем случаи В-ХЛЛ, экспрессирующие ген ZAP70 в опухолевых В-клетках, но содержащие малый процент Т- и NK-клеток. Для того, чтобы избежать подобной ошибки и подтвердить наличие двух популяций В-ХЛЛ, различающихся по уровню экспрессии гена ZAP70, необходимо оценивать уровень экспрессии мРНК гена ZAP70 в отсортированных клетках В-ХЛЛ (Barteneva et al., 2013). В качестве положительного контроля целесообразно использовать Т-клетки, чтобы оценить их вклад в относительный нормализованный уровень экспрессии гена ZAP70 в неотсортированном образце. В качестве отрицательного контроля возможно использовать В-лимфоциты периферической крови, которые в норме не экспрессируют тирозинкиназу ZAP-70. Выборка В-ХЛЛ демонстрировала наибольший разброс значений относительных нормализованных уровней экспрессии не только для ZAP70, но и для остальных исследуемых генов. Возможно, подобная гетерогенность свидетельствует о наличии нескольких вариантов этой нозологии в составе этой группы и возможности ее дальнейшего деления. 5.2 Клетки лимфом из «серой зоны» между В-ХЛЛ и ЛКМЗ отличаются как по экспрессии поверхностных антигенов, так и по уровням экспрессии сигнальных компонентов BCRкаскада Субклассификация лимфом – незаконченный процесс, требующий дополнительных исследований биологии этих опухолей. Термин «лимфома» описывает не одно заболевание, а целую категорию опухолей, включающую несколько десятков нозологических форм с разной биологией, морфологией и клиническим течением. Попытки классифицировать эти нозологические формы предпринимались неоднократно: в качестве критериев в разное время 75 предлагались морфологические клинический прогноз. характеристики Предпринимались даже опухолей, попытки иммунофенотип разделения клеток нозологий и по предполагаемому нормальному предшественнику, хотя многие опухоли, особенно агрессивные, не имеют соответствующей им популяции нормальных клеток. Каждая отдельная попытка систематизировать знания о лимфомах не получила широкого признания у специалистов (Lennert, 2006), однако все они легли в основу современного ВОЗ-классификатора. Первым универсальным классификатором лимфом, получившим широкое распространение и мировое признание, стало третье издание руководства ВОЗ, вышедшее под редакцией E.S. Jaffe в 2001 году (Jaffe et al., 2001). В нем В-клеточный хронический лимфолейкоз (В-ХЛЛ) и лимфома из клеток мантийной зоны (ЛКМЗ) являются отдельными нозологиями, с выработанными диагностическими критериями. Несмотря на их общую схожесть, в частности, наличие поверхностного маркера CD5, различия между ними были продемонстрированы по целому ряду иммунофенотипических, генетических и молекулярных критериев. Однако ряд вопросов сохранился и после выделения двух групп (Barna et al., 2008) из-за наличия промежуточных форм и, следовательно, потребовал уточнения некоторых подходов к диагностике. В настоящее время широко используется четвертое издание, вышедшее в 2008 году (Swerdlow et al., 2008). В нем нашли отражение новые данные по генетике и молекулярной биологии опухолей, были уточнены некоторые диагностические критерии и добавлены новые нозологические формы и их подклассы. Однако главным его достоинством является введение понятия «серой зоны», как группы случаев, обладающих промежуточными характеристиками по сравнению с двумя известными схожими между собой нозологиями. На данный момент официально уже различают три пары и одно «трио» из нозологий, формирующих между собой диагностическую «серую зону»: 1) классическая лимфома Ходжкина (cHL) и первичная медиастинальная В-крупноклеточная лимфома (PMLBL); 2) лимфома Беркитта (BL) и диффузная В-крупноклеточная лимфома (DLBCL); 3) лимфома Ходжкина нодулярного типа с лимфоидным преобладанием (NLPHL) и В-крупноклеточная лимфома с преобладанием Т-клеток/гистиоцитов (T/HRLBL); 4) классическая лимфома Ходжкина (cHL) и ALK-негативная анапластическая крупноклеточная лимфома (ALCL), и лимфома из клеток с иммунофенотипом периферических Т-лимфоцитов (PTCL). Кроме того, наличие новых «серых зон» обсуждается для классической лимфомы Ходжкина (cHL): под вопросом находится существование Т-клеточной лимфомы Ходжкина (T-cell cHL), и ALCLподобной лимфомы Ходжкина (Zhao, 2010). То, что понятие «серая зона» начало обсуждаться на примере В-крупноклеточных лимфом, закономерно, – это гетерогенная группа агрессивных лимфом с весьма зыбкой классификацией. То, как быстро разрастается количество описываемых «серых зон», отражает тенденцию к субклассификации имеющихся нозологий и 76 выделению новых на базе промежуточных форм. Наличие промежуточных форм фиксируется для любой пары схожих нозологий, что может отражать стадии развития нормального лимфоцита с одной стороны, и последовательную трансформацию опухолевого клона в организме – с другой. Исходя из этого, следует ожидать выделения новых «серых зон» в гематоонкологии (Korac et al., 2012). Закономерным также является использование термина «серая зона» для вариантов CD5-положительных лимфом с промежуточными характеристиками между В-ХЛЛ и ЛКМЗ. В данной работе он впервые применен к этой группе опухолей. В своем обзоре Xianfeng Zhao (Zhao, 2009) описывает варианты лимфом с промежуточным фенотипом между В-ХЛЛ и ЛКМЗ, которые могут представлять диагностические трудности. Это, во-первых, В-ХЛЛ со сниженным уровнем CD23, во-вторых, ЛКМЗ со сниженным уровнем CD5, в-третьих, ЛКМЗ со сниженным уровнем циклина D1 и, вчетвертых, В-ХЛЛ с повышенным уровнем циклина D1. К ним применим термин «серая зона», в экспериментальной выборке настоящей работы были подробно описаны 24 таких образца (Приложение 3). Эти случаи были выделены в самостоятельную группу и анализировались отдельно от «классичкских» В-ХЛЛ и ЛКМЗ. Получившаяся группа при анализе уровней экспресии мРНК сигнальных белков BCR-каскада оказалась довольно гомогенной: разброс значений относительных нормализованных уровней экспресси исследуемых генов был сопоставим с разбросом в группе ЛКМЗ и ниже разброса в группе «классических» В-ХЛЛ. При этом от группы ЛКМЗ она достоверно отличалась по уровням экспрессии двух генов из шести: SHP1 и CD79A. По уровням экспрессии исследуемых генов между группами лимфом «серой зоны» и ВХЛЛ достоверных отличий нет, кроме отсутствия гетерогенности по уровню экспрессии мРНК гена ZAP70. В целом, группа лимфом «серой зоны» напоминает ZAP70-негативный В-ХЛЛ. Однако важно, что эта группа почти не демонстрирует корреляций уровней экспрессии мРНК сигнальных белков. Внимания заслуживает также корреляция уровней экспрессии мРНК генов LYN и CCND1. Это может указывать на то, что аберрантная активность сигнальных белков BCR-каскада может индуцировать экспрессию эффекторной молекулы циклина D1 в небольшой субпопуляции CD5-положительных лимфом. Гиперэкспрессия мРНК гена циклина D1 была описана для всех вариантов CD5-положительных лимфом (Gladkikh et al., 2010), в том числе тех, которые не несут транслокацию t(11;14). Так, возможно, в группе В-клеточных лимфом экспрессия циклина запускается не эндогенно, а посредством BCR-сигналинга. Таким образом, выделенная по отличиям в иммунофенотипе и уровне экспрессии мРНК гена циклина D1, группа лимфом «серой зоны» между В-ХЛЛ и ЛКМЗ демонстрирует профиль экспрессии генов сигнальных белков, отличающийся от «классических» В-ХЛЛ и ЛКМЗ. 77 5.3 Характеристика CD5-положительных клеток миндалин Для человека была описана малая субпопуляция В-лимфоцитов, в норме экспрессирующая на поверхности Т-клеточный маркер CD5, основным местом их локализации является лимфоидная ткань, ассоциированная со слизистой оболочкой верхних дыхательных путей, где идет активная презентация антигена (Dono et al., 1996; Dono et al., 2000; Dono et al., 2007). Их доля от общего количества В-клеток достигала 30%, не зависела от воспалительных процессов и линейно снижалась с возрастом (Bergler et al., 1999). Наличие на поверхности этих В-клеток маркера CD5 сразу сделало их основными кандидатами на роль нормальных предшественников CD5-положительных лимфом, однако отсутствие полной идентичности b[ иммунофенотипов отмечалось другими авторами ранее (Su et al., 2000). Таким образом, подробный анализ иммунофенотипа субпопуляции CD5+ неопухолевых В-лимфоцитов и их сортировка для анализа уровней экспрессии мРНК сигнальных белков BCR-каскада позволили точнее определить степень подобия опухолевых и нормальных В-лимфоцитов с неканоническим фенотипом. Анализ поверхностных маркеров позволил выявить во всех 40 пробах суспензии клеток миндалин В-клетки с фенотипом CD5+lowCD19+ (Рисунок 13, Рисунок 15). Популяции CD5+ В-клеток крайне мало различались от пробы к пробе и демонстрировали общий иммунофенотип CD5+low/CD19+/CD38+/CD43-/CD23-/CD27-low/CD25-, наиболее похожий на иммунофенотип В-клеток, описанных Dono и соавторами в субэпителиальной зоне миндалин (Dono et al., 2007). Данный фенотип отличается от канонического В-ХЛЛ по уровням экспрессии CD23, CD43 и CD27 (Swerdlow et al., 2008). Формально он ближе к ЛКМЗ или лимфоме «серой зоны», однако подобные аналогии не проводились ранее в литературе. Было показно, что CD5+ В-клетки имеют активированный фенотип (определяемый по маркеру CD38), что, вероятнее всего, является следствием активной презентиции антигенов в миндалинах. При неизменном фенотипе доля CD5+ B-клеток от общего числа В-лимфоцитов в суспензии мндалин варьировала в широких пределах и составляла от 3% до 45% в разных пробах. Процент этих клеток линейно снижался с возрастом, что соответствует литературным данным (Bergler et al., 1999). Опыты по индукции CD5+ фенотипа на В-клетках проводились успешно как на мышах, так и на человеческих клетках in vitro, что позволяет предполагать роль сигнальных каскадов в развитии популяции CD5+ клеток в норме. Недавно была описана популяция CD5+ Влимфоцитов в периферической крови человека, получившая название «регуляторных Вклеток»; их количество также регулируется путем передачи сигнала через В-клеточный 78 рецептор (Lee et al., 2011). Однако вопрос о том, являются ли нормальные CD5+ В-клетки отдельной самоподдерживающейся популяцией, которая получает клональное преимущество при стимуляции специфическим антигеном, или экспрессия поверхностного маркера CD5 индуцируется как вторичное событие при антигенной стимуляции произвольной субпопуляции В-лимфоцитов, остается не до конца решенным. В пользу второго варианта развития событий говорят более новые данные, показавшие существование небольших популяций CD5+ В-клеток разной локализации и несколько различающегося иммунофенотипа (Fuda et al., 2009; Vossenkamper et al., 2013) в норме. Тот же вопрос остается актуальным и для CD5-положительных В-клеточных опухолей, особенно в свете многочисленных данных о специфическом и весьма ограниченном репертуаре В-клеточного рецептора В-ХЛЛ (Chiorazzi, Ferrarini, 2003) и роли передачи сигнала в выживании опухолевых В-клеток. Так же, как и в случае с нормальными В-клетками, этот вопрос не решен до конца. Но концепция о вторичной индукции экспрессии CD5 на различных по происхождению В-лимфоцитах в ответ на сигнал объяснила бы различия опухолевых фенотипов и клинические отличия различных CD5-положительных зрелоклеточных лимфом. По некоторым данным, наличие CD5 на мембране В-лимфоцита может являться следствием его впадения в состояние анергии при слишком интенсивном сигнале через BCR (Zupo et al., 1994; Sindhava, Bondada, 2012). 5.4 Уровни экспрессии генов сигнальных молекул BCR-каскада в норме и при патологии Анализ уровней экспрессии мРНК сигнальных белков BCR-каскда был проведен на 23 отсортированных образцах В-ХЛЛ. Отсортированные неопухолевые Т- и В-лимфоциты периферической крови, а также CD5+ В-лимфоциты миндалин были взяты в качестве контролей. В группе В-ХЛЛ сохранился разброс значений относительных нормализованных уровней экспрессии исследуемых мРНК, как и в выборке неотсортированных образцов, хотя степень разброса стала заметно ниже. Важно отметить, что разделение группы В-ХЛЛ на субпопуляции по уровню экспрессии мРНК гена ZAP70 сохранилось. Это позволяет утверждать, что существенная разница в уровне экспрессии гена этой тирозинкиназы является специфицеским свойством популяций клеток В-ХЛЛ у разных больных и не зависит от опухолевого окружения. Так как метод оценки уровня тирозинкиназы ZAP-70 при помощи проточной цитофлуориметрии часто дает сложные для интерпретации результаты (Rossi et al., 2010) метод оценки экспресси мРНК представляется перспективным для диагностики и прогноза течения заболевания, однако установка отсечки для правильной интерпретации данных все равно часто 79 представляла сложность. Аккуратная нормализация данных по нескольким референтным генам позволила достоверно выделить две группы из выборки канонических случаев В-ХЛЛ. При сравнении опухолевых клеток В-ХЛЛ и нормальных В-лимфоцитов был подтвержден пониженный уровень экспресси всех исследуемых генов в опухоли по сравнению с нормальными контролями. Исключение представляет только ген CD79A, который не зазличался также по уровню относительной нормализованной экспрессии в разных лимфомах. Дальнейший интерес может представлять анализ экспрессии генов сигнальных компонентов BCR-каскада в отсортированных образцах ЛКМЗ и лимфом «серой зоны». Возможно, это позволит установить более тонкие различия между ними. Сравнение неопухолевых В-лимфоцитов из разных источников позволило установить, что профиль экспресии сигнальных белков в нормальных В-клетках в целом универсален и достоверные различия имеются только в уровнях экспрессии мРНК гена ZAP70. ZAP-70положительные неопухолевые В-лимфоциты были описаны у человека как малая субпопуляция (Nolz et al., 2005; Davis, Schwartz, 2006), локализующаяся, в частности, в миндалинах (Scielzo et al., 2006). Однако никаких данных о преимущественной коэкспрессии поверхностного CD5 и внутриклеточной тирозинкиназы ZAP-70 в литературе нет. Функции ZAP-70 в В-лимфоцитах также неясны, по некоторым данным, она дополняет канонический сигнал от тирозинкиназы SYK. Повышенный уровень ZAP-70 и активированный фенотип CD5-положительных Влимфоцитов миндалин могут свидетельствовать о гипервозбуждении В-клеточного рецептора в этих клетках. Таким образом, экспрессия на поверхности маркера «анергического состояния» CD5 может свидетельствовать о попытке клеток затормозить поступающий через BCR сигнал. Таким образом, В-клеточные лимфомы, демонстрирующие фенотипические и клинические различия, могут быть разделены также по профилю экспрессии генов BCRассоциированных проводящих белков (тирозинкиназ и тирозинфосфатаз), что согласуется с гипотезой о разной биологии этих опухолей и их различающейся способностью отвечать на стимуляцию В-клеточного рецептора. При сравнении отсортированных уровней опухолевых экспрессии и генов нормальных BCR-ассоциированных В-клетках, нормальные демонстируют отличия от группы лимфом, но не между белков в В-клетки собой. Исключение представляет только повышенный уровень экспрессии мРНК гена ZAP70 в неопухолевых CD5+ В-лимфоцитах по сравнению с CD5- В-лимфоцитами. Достоверные отличия уровней экспрессии этой тирозинкиназы в двух подгруппах В-ХЛЛ и двух субпопуляциях нормальных CD5+ и CD5- В-лимфоцитов показывают, что ее экспрессия может дополнять канонический BCR-каскад как при некоторых патологических состояниях, так и в нормальных В-клетках. 80 ГЛАВА 6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Данная работа показывает, что выборки В-ХЛЛ и ЛКМЗ достоверно отличаются друг от друга по уровням экспрессии мРНК большинства сигнальных BCR-ассоциированных молекул. Достоверные отличия были установлены для пяти генов из шести, что дает дополнительные возможности для дискриминации этих двух нозологий. Пониженные уровни экспрессии мРНК генов LYN, SHP1, SYK и CD79B в группе В-ХЛЛ по сравнению с ЛКМЗ согласуются с представлениеи о том, что клетки В-ХЛЛ экспрессируют на низком уровне конститутивно активные сигнальные молекулы (Contri et al., 2005; Gobessi et al., 2009; Duhren-von Minden et al., 2012) и имеют более агрессивный статус в зависимости от способности воспринимать максимальное количество активирующих сигналов (Cesano et al., 2013). Клетки ЛКМЗ, очевидно, проходят иной путь малигнизации, сохраняя поверхностные элементы BCR-каскада в состоянии максимально приближенном к норме и в наибольшей степени завися от мутаций гена основного эффектора сигнального пути – циклина D1 (Raffeld, Jaffe, 1991). Достоверных различий между группами В-ХЛЛ и ЛКМЗ не наблюдалось только по уровню экспрессии мРНК гена CD79A: по-видимому, экспрессия этого гена не является лимитирующей для сборки BCR. Выделенная группа лимфом «серой зоны» включала спорные с диагносической точки зрения случаи, описанные Xianfeng Zhao (Zhao, 2009). При анализе уровней экспресии мРНК сигнальных белков BCR-каскада она оказалась весьма гомогенной: разброс значений относительных нормализованных уровней экспрессии исследуемых генов был сопоставим с разбросом в группе ЛКМЗ и ниже разброса в группе «классических» В-ХЛЛ. При этом от группы ЛКМЗ она достоверно отличалась по уровням экспрессии двух генов из шести: SHP1 и CD79A. В целом, группа лимфом «серой зоны» более всего походила на ZAP70- В-ХЛЛ. Дальнейший интерес может представлять анализ экспрессии генов сигнальных компонентов BCR-каскада в отсортированных образцах ЛКМЗ, В-ХЛЛ и лимфом «серой зоны». Возможно, это позволит установить более тонкие различия между ними. Полученные данные позволяют говорить об общем паттерне экспрессии сигнальных белков BCR-каскада для нормальных В-лимфоцитов независимо от их поверхностного иммунофенотипа и гистологической локализации, так как относительные нормализованные количества кДНК исследуемых генов не демонстрировали достоверных различий для выборок CD5- В-лимфоцитов периферической крови и CD5+ В-лимфоцитов миндалин человека. Исключение составляет ген ZAP70, относительный нормализовазованный уровень экспрессии которого достоверно повышен в группе CD5+ В-лимфоцитов миндалин. Возможно, тирозинкиназа ZAP-70 дополнительно экспрессируется в нормальных CD5+ В-лимфоцитах в 81 некоторых физиологических условиях. ZAP-70-положительные неопухолевые В-лимфоциты были описаны у человека как малая субпопуляция (Nolz et al., 2005; Davis, Schwartz, 2006), локализующаяся, в частности, в миндалинах (Scielzo et al., 2006). Однако никаких данных о преимущественной коэкспрессии поверхностного CD5 и внутриклеточной тирозинкиназы ZAP70 в литературе нет. При сравнении отсортированных опухолевых клеток В-ХЛЛ и нормальных Влимфоцитов был подтвержден пониженный уровень экспрессии всех исследуемых генов в опухоли по сравнению с нормальными контролями. Исключение составляет только ген CD79A, который не различался также по уровню относительной нормализованной экспрессии в разных лимфомах. По-видимому, его количество не является лимитирующим фактором при сборке Вклеточного рецептора, а уровень его экспрессии регулируется независимо от других компонентов BCR-каскада. 82 ВЫВОДЫ 1. В-зрелоклеточные лимфомы отличаются от нормальной лимфоидной ткани по уровням экспрессии генов сигнальных белков BCR-каскада. 2. CD5+ В-лимфоциты миндалин человека не отличаются от нормальных В- лимфоцитов периферической крови по уровням экспрессии генов сигнальных белков BCR-каскада, за исключением повышенного уровня экспрессии гена ZAP70. 3. В-зрелоклеточные лимфомы В-ХЛЛ и ЛКМЗ различаются между собой по уровням экспрессии мРНК генов сигнальных белков BCR-каскада LYN, SYK, SHP1, CD79B. 4. Между нозологическими группами В-ХЛЛ и ЛКМЗ выделяется группа лимфом «серой зоны», иммунофенотипически не соответствующая ни одной из них и достоверно отличающаяся от ЛКМЗ по уровню экспрессии генов SHP1 и CD79A. 5. Клетки В-ХЛЛ имеют достоверно сниженные уровни экспрессии генов LYN, SYK, SHP-1, CD79B, по сравнению с субпопуляциями нормальных CD5+ и CD5- Влимфоцитов. 6. По уровню экспрессии гена ZAP70 можно выделить два варианта В-ХЛЛ. 83 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ BCR – B-cell receptor BTK – Bruton's tyrosine kinase CBL – Casitas B-lineage lymphoma CCND1 (BCL1) – cyclin D1 CD – cluster of differentiation/ cluster of designation CSK – C-terminal Src tyrosine kinase E2A – transcription factor E2-alpha EBF – early B-cell factor, Collier/Olf/EBF family transcription factor HLDA – Human Leucocyte Differentiation Antigens HPRT1 – hypoxantine phosphorybosiltransferase 1 IgA – immunoglobulin A IgD – immunoglobulin D IgE – immunoglobulin E IgG – immunoglobulin G IgM – immunoglobulin M ITAM – immunoreceptor tyrosine-based activation motifs ITIM – immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs LYN – Lck/Yes novel tyrosine kinase, Src family tyrosine kinase NF – normalization factor NFkB – nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells Pax-5(BSAP) – B-cell lineage specific activator protein, Pax family transcription factor PBS, BSA – phosphate buffered saline, bovine serum albumin PI3K – Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase PKB/Akt – protein kinase B PKC – protein kinase С PLCγ2 – phosphatidylinositol phospholipase C isoform γ2 SHP-1 (PTPN6) – Src homology region 2 domain-containing phosphatase-1 (Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6) SRC – sarcoma proto-oncogene tyrosine-protein kinase, Src family tyrosine kinase SYK – spleen tyrosine kinase, SYK family tyrosine kinase TI-1, TI-2 – T-cell-independent antigens, class 1, 2 UBC – ubiquitin C WHO – World Health Organization 84 Wnt – wingless-type MMTV integration family YWHAZ – Tyrosine 3-monooxygenase tryptophan 5-monooxygenase activation protein, zeta polypeptide ZAP-70 – zeta-chain (TCR) associated protein kinase 70kDa, SYK family tyrosine kinase ВОЗ – всемирная организация здравоохранения В–ХЛЛ – хронический В–клеточный лимфолейкоз ЛКМЗ – лимфома из клеток мантийной зоны ПЦР – полимеразная цепная реакция 85 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Abrantes J.L., Tornatore T.F., Pelizzaaro-Rocha K.J., de Jesus M.B., Cartaxo R.T., Milani R., Ferreira-Halder C.V. Crosstalk between kinases, phosphatases and miRNAs in cancer. // Biochemie. –2014. –V.107 PtB. –P.167-187. 2. Almamun M., Schnabel J.L., Gater S.T., Ning J., Taylor K.H. Isolation of precursor B-cell subsets from umbilical cord blood. // J Vis Exp. –2013. –V.74. – e50402. 3. Acharya M., Borland G., Edkins A.L., MacLellan L.M., Mateson J., Ozanne B.W., Cushley W. CD23/FcɛRII: molecular multi-tasking. // Clin Exp Immunol. –2010. –V.162. №1. – P.12-23. 4. Andersen C.L., Ledet-Jensen J., Orntoft T. Normalization of real-time quantitative RT-PCR data: a model based variance estimation approach to identify genes suited for normalization - applied to bladder- and colon-cancer data-sets. // Cancer Research. –2004. –V.64. №15. –P.5245-5250. 5. Andreasson U., Eden P., Peterson C., Hogerkorp C.M., Jerkeman M., Andersen N., Berglund M., Sundstrom C., Rosenquist R., Borrebaeck C.A., Ek S. Identification of uniquely expressed transcription factors in highly purified B-cell lymphoma samples. // Am J Hematol. – 2010. – V.85. №6. –P.418-425. 6. Arman M., Calvo J., Trojanowska M.E., Cockerill P.N., Santana M., Lopez-Cabrera M., Vives J., Lozano F. Transcriptional regulation of human CD5: important role of Ets transcription factors in CD5 expression in T cells. // J Immunol. –2004. –V.172. №12. –P.7519-7529. 7. Azzam H.S., Grinberg A., Lui K., Shen H., Shores E.W., Lowe P.E. CD5 expression is developmentally regulated by T-cell receptor (TCR) signals and TCR avidity. // J Experim Med. –1998. –V.188. №12. –P.2301-2311. 8. Barna G., Reiniger L., Tatrai P., Kopper L., Matolcsy A. The cut-off levels of CD23 expression in the differential diagnosis of MCL and CLL. // Hematol Oncol. –2008 –V.26. №3. –P.167-170. 9. Barteneva N.S., Ketman K., Fasler-Kan E., Potashnikova D., Vorobjev I.A. Cell sorting in cancer research--diminishing degree of cell heterogeneity. // Biochim Biophys Acta. –2013. – V.1836. №1. –P.105-122. 10. Bas A., Forsberg G., Hammarstrom S., Hammarstrom M.L. Utility of the housekeeping genes 18S rRNA, beta-actin and glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase for normalization in realtime quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction analysis of gene expression in human T lymphocytes. // Scand J Immunol. –2004. –V.59. №6. –P.566-573. 11. Baumgarth N., Tung J.W., Herzenberg L.A. Inherent specificities in natural antibodies: a key to immune defense against pathogen invasion. // Springer Semin Immunopathol. –2005. –V.26. №4. –P.347-362. 86 12. Benner R., Hijmans W., Haaijman J.J. The bone marrow: the major source of serum immunoglobulins, but still a neglected site of antibody formation. // Clin Exp Immunol. –1981. – V.46. №1. –P.1-8. 13. Bergler W., Adam S., Gross H.J., Hormann K., Schwartz-Albiez R. Age-dependent altered proportions in subpopulations of tonsillar lymphocytes. // Clin Exp Immunol. –1999. –V.116. №1. –P.9-18. 14. Berkowska M.A., Driessen G.J., Bikos V., Grosserichter-Wagener C., Stamatopoulos K., Cherutti A., He B., Bierman K., Lange J.F., van der Burg M., van Dongen J.J.M., van Zelm M.C. Human memory B cells originate from three distinct germinal center-dependent and independent maturation pathways. // Blood –2011. –V.118. №8. –P.2150-2158. 15. Berland R., Wortis H.H. Origins and functions of B-1 cells with notes on the role of CD5. // Annu Rev Immunol. –2002. –V.20. –P.253-300. 16. Bernard A., Boumsell L. The clusters of differentiation (CD) defined by the First International Workshop on Human Leucocyte Differentiation Antigens. // Hum Immunol. –1984. –V.11. №1. –P.1-10. 17. Bienenstock J. Gut and bronchus associated lymphoid tissue: an overview. // Adv Exp Med Biol. –1982. –V.149. –P.471-477. 18. Black C.A. A brief history of the discovery of the immunoglobulins and the origin of the modern immunoglobulin nomenclature. // Immunol Cell Biol. –1997. –V.75. №1. –P.65-68. 19. Blom B., Spits H. Development of human lymphoid cells. // Annu Rev Immunol. –2006. –V.24. –P.287-320. 20. Bofill M., Janossy G., Janossa M., Burford G.D., Seymour G.J., Wernet P., KelemenE. Human B cell development. II Subpopulations in the human fetus. // J Immunol. –1985. –V.134. №3. – P.1531-1538. 21. Boyd R.S., Jukes-Jones R., Walewska R., Brown D., Dyer M.J., Cain K. Protein profiling of plasma membranes defines aberrant signaling pathways in mantle cell lymphoma. // Mol Cell Proteomics. –2009. –V.8. №7. –P.1501-1515. 22. Bubien J.K., Zhou L.J., Bell P.D., Frizzell R.A., Tedder T.F. Transfection of the CD20 cell surface molecule into ectopic cell types generates a Ca2+ conductance found constitutively in B lymphocytes. // J Cell Biol. –1993. –V.121. №5. –P.1121-1131. 23. Bustin S.A., Benes V., Garson J.A., Hellemans J., Huggett J., Kubista M., Mueller R., Nolan T., Pfaffl M.W., Shipley G.L., Vandesompele J., Wittwer C.T. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. // Clin Chem. –2009. – V.55. №4. –P.611-622. 87 24. Cajiao I., Sargent R., Elstrom R., Cooke N.E., Bagg A., Liebhaber S.A. Igbeta(CD79b) mRNA expression in chronic lymphocytic leukaemia cells correlates with immunoglobulin heavy chain gene mutational status but does not serve as an independent predictor of clinical severity. // Am J Hematol. –2007. –V.82. №8. –P.712-720. 25. Caligaris-Cappio F., Gobbi M., Bofill M., Janossy G. Infrequent normal B lymphocytes express features of B-chronic lymphocytic leukemia. // J Exp Med. –1982. –V.155. №2. –P.623-628. 26. Cambier J.C., Getahun A. B cell activation versus anergy; the antigen receptor as a molecular switch. // Immunol Lett. –2010. –V.128. №1. –P.6-7. 27. Cesano A., Perbellini O., Evensen E., Chu C.C., Cioffi F., Ptacek J., Damle R.N., Chignola R., Cordeiro J., Yan X.J., Hawtin R.E., Nichele I., Ware J.R., Cavallini C., Lovato O., Zanotti R., Rai K.R., Chiorazzi N., Pizzolo G., Scupoli M.T. Association between B-cell receptor responsiveness and disease progression in B-cell chronic lymphocytic leukemia: results from single cell network profiling studies. // Haematologica. –2013. –V.98. №4. –P.626-634. 28. Chaturvedi A., Martz R., Dorward D., Waisberg M., Pierce S.K. Endocytosed BCRs sequentially regulate MAPK and Akt signaling pathways from intracellular compartments. // Nat Immunol. – 2011. –V.12. №11. –P.1119-1126. 29. Chen Y.H., Heller P. Lymphocyte surface immunoglobulin density and immunoglobulin secretion in vitro in chronic lymphocytic leukemia (CLL). // Blood. –1978. –V.52. №3. –P.601608. 30. Chen L., Widhopf G., Huynh L., Rassenti L., Rai K.R., Weiss A., Kipps T.J. Expression of ZAP70 is associated with increased B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia. // Blood. –2002. –V.100. №13 –P.4609-4614. 31. Chiorazzi N., Ferrarini M. B cell chronic lymphocytic leukemia: lessons learned from studies of the B cell antigen receptor. // Annu Rev Immunol. –2003. –V.21. –P.841-894. 32. Chiorazzi N., Rai K.R., Ferrarini M. Chronic lymphocytic leukemia. // N Engl J Med. –2005. – V.352. –P.804-815. 33. Claus R., Lucas D.M., Ruppert A.S., Williams K.E., Weng D., Patterson K., Zucknick M., Oakes C.C., Rassenti L.Z., Greaves A.W., Geyer S., Wierda W.G., Brown J.R., Gribben J.G., Barrientos J.C., Rai K.R., Kay N.E., Kipps T.J., Shields P., Zhao W., Grever M.R., Plass C., Byrd J.C. Validation of ZAP-70 methylation and its relative significance in predicting outcome in chronic lymphocytic leukemia. // Blood –2014. –V.124. №1 –P.42-48. 34. Cobaleda C., Schebesta A., Delogu A., Busslinger M. Pax5: the guardian of B cell identity and function. // Nat Immunol. –2007. –V.8. №5. –P.463-470. 35. Contri A., Brunati A.M., Trentin L., Cabrelle A., Miorin M., Cesaro L., Pinna L.A., Zambello R., Semenzato G., Donella-Deana A. Chronic lymphocytic leukemia B cells contain anomalous 88 LYN tyrosine kinase, a putative contribution to defective apoptosis. // J Clin Invest. –2005. – V.115. №2. –P.369–378. 36. Cook G.P., Tomlinson I.M. The human immunoglobulin VH repertoire. // Immunol Today. – 1995. –V.16. №5. –P.237-242. 37. Cyster J.G., Goodnow C.C. Tuning antigen receptor signaling by CD22: integrating cues from antigens and the microenvironment. // Immunity –1997. –V.6. №5. –P.509-517. 38. Dadi S., Le Noir S., Asnafi V., Beldjord K., Macintyre E.A. Normal and pathological V(D)J recombination: contribution to the understanding of human lymphoid malignancies. // Adv Exp Med Biol –2009. –V.650. –P.180-194. 39. Davi F., Faili A., Gritti C., Blanc C., Laurent C., Sutton L., Schmitt C., Merle-Beral H. Early onset of immunoglobulin heavy chain gene rearrangements in normal human bone marrow CD34+ cells. // Blood. –1997. –V.90. №10. –P.4014-4021. 40. Davis S. Hypothesis: differentiation of the human lymphoid system based on cell surface markers. // Blood. –1975 –V.45. №6. –P.871-880. 41. Davis R.E., Ngo V.N., Lenz G., Tolar P., Young R.M., Romesser P.B., Kohlhammer H., Lamy L., Zhao H., Yang Y., Xu W., Shaffer A.L., Wright G., Xiao W., Powell J., Jiang J.K., Thomas C.J., Rosenwald A., Ott G., Muller-Hermelink H.K., Gascoyne R.D., Connors J.M., Johnson N.A., Rimsza L.M., Campo E., Jaffe E.S., Wilson W.H., Delabie J., Smeland E.B., Fisher R.I., Braziel R.M., Tubbs R.R., Cook J.R., Weisenburger D.D., Chan W.C., Pierce S.K., Staudt L.M. Chronic active B-cell-receptor signalling in diffuse large B-cell lymphoma. // Nature. –2010. – V.463. –P.88–92. 42. Davis B.H., Schwartz M. ZAP-70 expression is low in normal precursor B cells or hematogones. // Cytometry B Clin Cytom. –2006. –V.70. №4. –P.315-319. 43. Deaglio S., Vaisitti T., Aydin S., Bergui L., D'Arena G., Bonello L., Omede P., Scatolini M., Jaksic O., Chiorino G., Efremov D., Malavasi F. CD38 and ZAP-70 are functionally linked and mark CLL cells with high migratory potential. // Blood. –2007 –V.110. №12. –P.4012-4021. 44. Deaglio S., Mehta K., Malavasi F. Human CD38: a (r)evolutionary story of enzymes and receptors. // Leukemia Res –2001. –V.25. №1. –P.1-12. 45. Deaglio S., Morra M., Mallone R., Ausiello C.M., Prager E., Garbarino G., Dianzani U., Stockinger H., Malavasi F. Human CD38 (ADP-ribosyl cyclase) is a counter-receptor of CD31, an Ig superfamily member. // J Immunol. –1998. –V.160. №1. –P.395–402. 46. Deans J.P., Polyak M.J. FMC7 is an epitope of CD20. // Blood. –2008. –V.111. №4. –P.2492. 47. De Boer C.J., van Krieken J.H., Kluin-Nelemans H.C., Kluin P.M., Schuuring E. Cyclin D1 messenger RNA overexpression as a marker for mantle cell lymphoma. // Oncogene. –1995. – V.10. №9. –P.1833-1840. 89 48. De Boer C.J., van Krieken J.H., Schuuring E., Kluin P.M. Bcl-1/cyclin D1 in malignant lymphoma. // Ann Oncol. –1997. –V.8. Suppl 2. –P.109-117. 49. DeFranco A.L. The complexity of signaling pathwats activated by the BCR. // Curr Opin Immunol. –1997. –V.9. №3. –P.296-308. 50. Delgado J., Matutes E., Morilla A.M., Morilla R.M., Owusu-Ankomah K.A., Rafig-Mohammed F., del Guidice I., Catovsky D. Diagnostic significance of CD20 and FMC7 expression in B-cell disorders. // American J Clin Pathol. –2003. –V.120. №5. –P.754-759. 51. De Oliveira M.S., Jaffe E.S., Catovsky D. Leukaemic phase of mantle zone (intermediate) lymphoma: its characterisation in 11 cases. // J Clin Pathol. –1989. –V.42. №9. –P.962-972. 52. de Pooter R.F., Kee B.L. E proteins and the regulation of early lymphocyte development. // Immunol Rev. –2010. –V.238. №1. –P.93-109. 53. Dighiero G. Autoimmunity and B-cell malignancies. // Hematol Cell Ther. –1998. –V.40. №1. – P.1-9. 54. Domingo-Domenech E., Domingo-Claros A., Gonzalez-Barca E., Beneitez D., Alonso E., Romagosa V., De Sanjos S., Petit J., Granena A., Fernandez de Sevilla A. CD38 expression in Bchronic lymphocytic leukemia: association with clinical presentation and outcome in 155 patients. // Haematologica. –2002. –V.87. №10. –P.1021-1027. 55. Donella-Deana A., Cesaro L., Ruzzene M., Brunati A.M., Marin O., Pinna L.A. Spontaneous autophosphorylation of LYN tyrosine kinase at both its activation segment and C-terminal tail confers altered substrate specificity. // Biochemistry. –1998. –V.37. №5. –P.1438-1446. 56. Dong H.Y., Shahsafaei A., Dorfman D.M. CD148 and CD27 are expressed in B cell lymphomas derived from both memory and naive B cells. // Leuk Lymphoma. –2002. –V.43. №9. –P.18551888. 57. Dono M., Burgio V.L., Tacchetti C., Favre A., Augliera A., Zupo S., Taborelli G., Chiorazzi N., Grossi C.E., Ferrarini M. Subepithelial B cells in the human palatine tonsil. I. Morphologic, cytochemical and phenotypic characterization. // Eur J Immunol. –1996. –V.26. №9. –P.20352042. 58. Dono M., Zupo S., Leanza N., Melioli G., Fogli M., Melagrana A., Chiorazzi N., Ferrarini M. Heterogeneity of tonsillar subepithelial B lymphocytes, the splenic marginal zone equivalents. // J Immunol. –2000. –V.164. №11. –P.5596-5604. 59. Dono M., Cerruti G., Zupo S. The CD5+ B-cell. // Int J Biochem Cell Biol. –2004. –V.36. №11. –P.2105-2111. 60. Dono M., Burgio V.L., Colombo M., Sciacchitano S., Reverberi D., Tarantino V., Cutrona G., Chiorazzi N., Ferrarini M. CD5+ B cells with the features of subepithelial B cells found in human tonsils. // Eur J Immunol. –2007. –V.37. №8. –P.2138-2147. 90 61. Doulatov S., Notta F., Eppert K., Nguyen L.T., Ohashi P.S., Dick J.E. Revised map of the human progenitor hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymphoid development. // Nat Immunol. –2010. –V.11. №7. –P.585-593. 62. Doulatov S., Notta F., Laurenti E., Dick J.E. Hematopoiesis: a human perspective. // Cell Stem Cell. –2012. –V.10. №2. –P.120-136. 63. Dreyer W.J., Bennett J.C. The molecular basis of antibody formation: a paradox. // Proc Natl Acad Sci U S A. –1965. –V.54. №3. –P.864-869. 64. Duan B., Morel L. Role of B-1a cells in autoimmunity. // Autoimmun Rev. –2006. –V.5. №6. – P.403-408. 65. Duhren-von Minden M., Ubelhart R., Schneider D., Wossning T., Bach M.P., Buchner M., Hofmann D., Surova E., Follo M., Kohler F., Wardemann H., Zirlik K., Veelken H., Jumaa H. Chronic lymphocytic leukaemia is driven by antigen-independent cell-autonomous signalling. // Nature. –2012. –V.489. –P.309–312. 66. Dundas J., Ling M. Reference genes for measuring mRNA expression. // Theory Biosci. –2012. –V.131. –P.215-223. 67. Eisenberg E., Levanon E.Y. Human housekeeping genes, revisited. // Trends Genet. –2013. – V.29. №10. –P.569-574. 68. Engel H., Drach J., Keyhani A., Jiang S., Van N.T., Kimmel M., Sanchez-Williams G., Goodacre A., Andreeff M., Quantitation of minimal residual disease in acute myelogenous leukemia and myelodysplastic syndromes in complete remission by molecular cytogenetics of progenitor cells. // Leukemia. –1999. –V.13. №4. –P.568–577. 69. Familiades J., Bousquet M., Lafage-Pochitaloff M., Bene M.C., Beldjord K., De Vos J., Dastugue N., Coyaud E., Struski S., Quelen C., Prade-Houdellier N., Dobbelstein S., Cayuela J.M., Soulier J., Grardel N., Preudhomme C., Cave H., Blanchet O., Lheritier V., Delannoy A., Chalandon Y., Ifrah N., Pigneux A., Brousset P., Macintyre E.A., Huguet F., Dombret H., Broccardo C., Delabesse E. PAX5 mutations occur frequently in adult B-cell progenitor acute lymphoblastic leukemia and PAX5 haploinsufficiency is associated with BCR-ABL1 and TCF3PBX1 fusion genes: a GRAALL study. // Leukemia. –2009. –V.23. №11. –P.1989-1998. 70. Faragasan S., Honjo T. T-independent immune response: new aspects of B cell biology. // Science. –2000. –V.290. №5489. –P.89-92. 71. Fernandez V., Salamero O., Espinet B., Sole F., Royo C., Navarro A., Camacho F., Bea S., Hartmann E., Amador V., Hernandez L., Agostinelli C., Sargent R.L., Rozman M., Aymerich M., Colomer D., Villamor N., Swerdlow S.H., Pileri S.A., Bosch F., Piris M.A., Montserrat E., Ott G., Rosenwald A., Lopez-Guillermo A., Jares P., Serrano S., Campo E. Genomic and gene 91 expression profiling defines indolent forms of mantle cell lymphoma. // Cancer Res. –2010. – V.70. №4. –P.1408-1418. 72. Ferguson B.S., Nam H., Hopkins R.G., Morrison R.F. Impact of reference gene selection for target gene normalization on experimental outcome using real-time qRT-PCR in adipocytes. // PLoS One. –2010. –V.5. №12. e15208. 73. Ferrari S., Lougaris V., Caraffi S., Zuntini R., Yang J., Soresina A., Meini A., Cazzola G., Rossi C., Reth M., Plebani A. Mutations of the Igbeta gene cause agammaglobulinemia in man. // J Exp Med. –2007. –V.204. №9. –P.2047-2051. 74. Flippakopulos P., Mueller S., Knapp S. SH2 domains: modulators of non-receptor tyrosine kinase activity. // Curr Opin Struct Biol. –2009. –V.19. №6. –P.643-649. 75. Fluckiger A.C., Sanz E., Garcia-Lloret M., Su T., Hao Q.L., Kato R., Quan S., de la Hera A., Crooks G.M., Witte O.N., Rawlings D.J. In vitro reconstitution of human B-cell ontogeny: from CD34(+) multipotent progenitors to Ig-secreting cells. // Blood. –1998. –V.92. №12. –P.45094520. 76. Fuda F.S., Karandikar N.J., Chen W. Significant CD5 expression on normal stage 3 hematogones and mature B Lymphocytes in bone marrow. // Am J Clin Pathol. –2009. –V.132. №5. –P.733-737. 77. Fung-Leung W.P. Phosphoinositide 3-kinase delta in leukocyte signaling and function. // Cell signal. –2011. –V.23. №4. –P.603-608. 78. Galton D.A. The pathogenesis of chronic lymphocytic leukemia. // Can Med Assoc J. –1966. – V.94. №19. –P.1005-1010. 79. Galy A., Travis M., Cen D., Chen B. Human T, B, natural killer, and dendritic cells arise from a common bone marrow progenitor cell subset. // Immunity. –1995. –V.3. №4. –P.459-473. 80. Gathings W.E., Lawton A.R., Cooper M.D. Immunofluorescent studies of the development of pre-B cells, B lymphocytes and immunoglobulin isotype diversity in humans. // Eur J Immunol. –1977. –V.7. №11. –P.804-810. 81. Geisberger R., Crameri R., Achatz G. Models of signal transduction through the B-cell antigen receptor. // Immunology. –2003. –V.110. №4. –P.401-410. 82. Getahun A., Hjelm F., Heyman B. IgE enhances antibody and T cell responses in vivo via CD23+ B cells. // J Immunol. –2005. –V.175 №3. –P.1473-1482. 83. Ghia P., ten Boekel E., Sanz E., de la Hera A., Rolink A., Melchers F. Ordering of human bone marrow B lymphocyte precursors by single-cell polymerase chain reaction analyses of the rearrangement status of the immunoglobulin H and L chain gene loci. // J Exp Med. –1996. – V.184. №6. –P.2217-2230. 92 84. Ginzinger D.G. Gene quantification using real-time quantitative PCR: an emerging technology hits the mainstream. // Exp Hematol. –2002. –V.30. №6. –P.503-512. 85. Gladkikh A., Potashnikova D., Korneva E., Khudoleeva O., Vorobjev I. Cyclin D1 expression in B-cell lymphomas. // Exp Hematol. –2010. –V.38. №11 –P.1047-1057. 86. Gobessi S., Laurenti L., Longo P.G., Sica S., Leone G., Efremov D.G. ZAP-70 enhances B-cellreceptor signaling despite absent or inefficient tyrosine kinase activation in chronic lymphocytic leukemia and lymphoma B cells. // Blood. –2007. –V.109. №5 –P.2032-2039. 87. Gobessi S., Laurenti L., Longo P.G., Carsetti L., Berno V., Sica S., Leone G., Efremov D.G. Inhibition of constitutive and BCR-induced SYK activation downregulates Mcl-1 and induces apoptosis in chronic lymphocytic leukemia B cells. // Leukemia. –2009. –V.23. №4 –P.686-697. 88. Gorzelniak K., Janke J., Engeli S., Sharma A.M. Validation of endogenous controls for gene expression studies in human adipocytes and preadipocytes. // Horm Metab Res. –2001. –V.33. №10. –P.625-627. 89. Graf T., Enver T. Forcing cells to change lineages. // Nature. –2009. –V.462. №7273. –P.587594. 90. Green T.M., de Stricker K., Moller M.B. Validation of putative reference genes for normalization of Q-RT-PCR data from paraffin-embedded lymphoid tissue. // Diagn Mol Pathol. –2009. –V.18. №4. –P.243-249. 91. Grey H.M., Rabellino E., Pirofsky B. Immunoglobulins on the surface of lymphocytes. IV. Distribution in hypogammaglobulinemia, cellular immune deficiency, and chronic lymphatic leukemia. // J Clin Invest. –1971. –V.50. №11. –P.2368-2375. 92. Gretsov E.M., Churakova Zh.V., Sheval E.V., Vorob'ev I.A. [Comparative characteristics of immunological, clinical and morphological features of human lymphoid tumors in respect with tumor genesis and progression]. // Ontogenez. –2004. –V.35. №3. –P.229-238. 93. Griffin D.O., Holodick N.E., Rothstein T.L. Human B1 cells in umbilical cord and adult peripheral blood express the novel phenotype CD20+ CD27+ CD43+ CD70-. // J Exp Med. – 2011. –V.208. №1. –P.67-80. 94. Gruss H.J., Herrmann F., Gattei V., Gloghini A., Pinto A., Carbone A. CD40/CD40 ligand interactions in normal, reactive and malignant lympho-hematopoietic tissues. // Leuk Lymphoma. –1997. –V.24. №5-6. –P.393-422. 95. Guo S., Ferl G.Z., Deora R., Riedinger M., Yin S., Kerwin J.L., Loo J.A., Witte O.N. A phosphorylation site in Bruton's tyrosine kinase selectively regulates B cell calcium signaling efficiency by altering phospholipase C-gamma activation. // Proc Natl Acad Sci USA. –2004. – V.101. №5. –P.14180-14185. 93 96. Hagman J., Ramirez J., Lukin K. B lymphocyte lineage specification, commitment and epigenetic control of transcription by early B cell factor 1. // Curr Top Microbiol Immunol. – 2012. –V.356. –P.17-38. 97. Hamblin T. Historical aspects of chronic lymphocytic leukaemia. // Br J Haematol. –2000. – V.111. №4. –P.1023-1034. 98. Hanahan D., Weinberg R.A. Hallmarks of cancer. // Cell. –2000. –V.100. №1. –P.57-70. 99. Hanahan D., Weinberg R.A. Hallmarks of cancer: the next generation. // Cell. –2011. –V.144. №5. –P.646-674. 100. Hannet I., Erkeller-Yuksel F., Lydyard P., Deneys V., DeBruyere M. Developmental and maturational changes in human blood lymphocyte subpopulations. // Imm Today. –1992. –V.13. №6. –P.215-218. 101. Hansen A., Reiter K., Doerner T., Pruss A., Cryopreserved human B cells as an alternative source for single cell mRNA analysis. // Cell Tissue Bank. –2005. –V.6. №4. –P.299-308. 102. Hao Q.L., Shah A.J., Thiemann F.T., Smogorzewska E.M., Crooks G.M. A functional comparison of CD34 + CD38- cells in cord blood and bone marrow. // Blood. –1995. –V.86. №10. –P.3745-3753. 103. Hao Q.L., Smogorzewska E.M., Barsky L.W., Crooks G.M. In vitro identification of single CD34+CD38- cells with both lymphoid and myeloid potential. // Blood. –1998. –V.91. №11. – P.4145-4151. 104. Hardy R.R., Hayakawa K. B cell development pathways. // Annual Rev Immunol. –2001. –V.19. –P.595-621. 105. Harlow E., Lane D. Antibodies: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. 731 c. 106. Harwood N.E., Batista F.D. Early events in B cell activation. // Annual Rev Immunol. –2010. – V.28. –P.185-210. 107. Hermiston M.L., Xu Z., Weiss A. CD45: A Critical Regulator of Signaling Thresholds in Immune Cells. // Annual Rev Immunol. –2003. –V.21. –P.107-137. 108. Herzenberg L.A., Parks D., Sahaf B., Perez O., Roederer M., Herzenberg L.A.. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. // Clin. Chem. –2002. –V.48. №10. –P.1819-1827. 109. Hoffmann-Fezer G., Lohrs U., Rodt H.V., Thierfelder S. Immunohistochemical identification of T- and B-lymphocytes delineated by the unlabelled antibody enzyme method. III. Topographical and quantitative distribution of T- and B-cells in human palatine tonsils. // Cell Tissue Res. – 1981. –V.216. №2. –P.361-375. 94 110. Hozumi N., Tonegawa S. Evidence for somatic rearrangement of immunoglobulin genes coding for variable and constant regions. // Proc Natl Acad Sci USA. –1976. –V.73. №10. –P.36283632. 111. Hruz T., Wyss M., Docquier M., Pfaffl M.W., Masanetz S., Borghi L., Verbrugghe P., Kalaydjieva L., Bleuler S., Laule O., Descombes P., Gruissem W., Zimmermann P. RefGenes: identification of reliable and condition specific reference genes for RT-qPCR data normalization. // BMC Genomics. –2011. –V.12. №156. 112. Huggett J., Dheda K., Bustin S., Zumla A. Real-time RT-PCR normalisation; strategies and considerations. // Genes Immun. –2005. –V.6. №4. –P.279-284. 113. Hulett H.R., Bonner W.A., Barrett J., Herzenberg L.A. Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence. // Science. –1969. –V.166. №3906. – P.747-749. 114. Hultin L.E., Hausner M.A., Hultin P.M., Giorgi J.V. CD20 (pan-B cell) antigen is expressed at a low level on a subpopulation of human T lymphocytes. // Cytometry. –1993. –V.14. №2. – P.196-204. 115. Hystad M.E., Myklebust J.H., Bo T.H., Sivertsen E.A., Rian E., Forfang L., Munthe E., Rosenwald A., Chiorazzi M., Jonassen I., Staudt L.M., Smeland E.B. Characterization of early stages of human B cell development by gene expression profiling. // J Immunol. –2007. –V.179. №6. –P.3662-3671. 116. Imamura R., Miyamoto T., Yoshimoto G., Kamezaki K., Ishikawa F., Henzan H., Kato K., Takase K., Numata A., Nagafuji K., Okamura T., Sata M., Harada M., Inaba S. Mobilization of human lymphoid progenitors after treatment with granulocyte colony-stimulating factor. // J Immunol. –2005. –V.175. №4. –P.2647-2654. 117. Jaffe E.S., Harris N.L., Stein H., Vardiman J.W. Pathology and Genetics of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Lyon: IARC Press, 2001. 351c. 118. Janossy G., Pizzolo G. Lymphocytes. 2. Differentiation. Differentiation of lymphoid precursor cells. // J Clin Pathol Suppl (R Coll Pathol). –1979. –V.13. –P.48-58. 119. Jares P., Colomer D., Campo E. Molecular pathogenesis of mantle cell lymphoma. // J Clin Invest. –2012. –V.122. №10. –P.3416-3423. 120. Jensen K., Brusletto B.S., Aass H.C., Olstad O.K., Kierulf P., Gautvik K.M. Transcriptional profiling of mRNAs and microRNAs in human bone marrow precursor B cells identifies subsetand age-specific variations. // PLoS One. –2013. –V.8. №7. –e70721. 121. Kaplan D., Meyerson H.J., Li X., Drasny C., Liu F., Costaldi M., Barr P., Lazarus H.M. Correlation between ZAP-70, phospho-ZAP-70, and phospho-SYK expression in leukemic cells from patients with CLL. // Cytometry B Clin Cytom. –2010. –V.78. №2. –P.115-122. 95 122. Kehry M.R. CD40-mediated signaling in B-cells. Balancing cell survival, growth, and death. // J Imm. –1996. –V.156. №7. –P.2345-2348. 123. Kheirelseid E.A., Chang K.H., Newell J., Kerin M.J., Miller N. Identification of endogenous control genes for normalisation of real-time quantitative PCR data in colorectal cancer. // BMC Mol Biol. –2010. –V.11. №12. 124. Klein U., Dalla-Favera R. New insights into the phenotype and cell derivation of B cell chronic lymphocytic leukemia. – в Caligaris-Cappio F., Dalla-Favera R. Chronic Lymphocytic Leukemia. Curr Top Microbiol Immunol 2005. Berlin Heidelberg: Springer-Verlag, 2005. 200 с. 125. Klein U., Rajewsky K., Kueppers R. Human immunoglobulin (Ig)M+IgD+ peripheral blood B Cells expressing the CD27 cell surface antigen carry somatically mutated variable region genes: CD27 as a general marker for somatically mutated (memory) B Cells. // J Exp Med. –1998. – V.188. №9. –P.1679-1689. 126. Korac P., Dotlic S., Dominis M. "Double hit" lymphoma or secondary MYC translocation lymphoma. // Periodicum Biologorum. –2012. –V.114. №4. –P.527-537. 127. Lankester A.C., van Schijndel G.M., van der Schoot C.E., van Oers M.H., van Noesel C.J., van Lier R.A. Antigen receptor nonresponsiveness in chronic lymphocytic leukemia B cells. // Blood. –1995. –V.86. –P.1090-1097. 128. Laurenti L., Petlickovski A., Rumi C., Gobessi S., Piccioni P., Tarnani M., Puggioni P., Marietti S., Sica S., Leone G., Efremov D.G. Comparison of ZAP-70/SYK mRNA levels with immunoglobulin heavy-chain gene mutation status and disease progression in chronic lymphocytic leukemia. // Haematologica. –2005. –V.90. №11. –P.1533-1540. 129. Law C.L., Chandran K.A., Sidorenko S.P., Clark E.A. Phospholypase C-gamma1 interacts with conserved phosphotyrosyl residues in the linker region of SYK and is a substrate for SYK. // Mol Cell Biol. –1996. –V.16. №4. –P.1305-1315. 130. LeBien T.W. Fates of human B-cell precursors. // Blood. –2000. –V.96. №1. –P.9-23. 131. Ledderose C., Heyn J., Limbeck E., Kreth S. Selection of reliable reference genes for quantitative real-time PCR in human T cells and neutrophils. // BMC Res Notes. –2011. –V.4. №427. 132. Lee P.S., Beneck D., Weiserberg D., Gorczyca W. Coexpression of CD43 by benign B cells in the terminal ileum. // Appl Immunohistochem Mol Morphol. –2005. –V.13. №2. –P.138-141. 133. Lee S.T., Xiao Y., Muench M.O., Xiao J., Fomin M.E., Wiencke J.K., Zheng S., Dou X., de Smith A., Chokkalingam A., Buffler P., Ma X., Wiemels J.L. A global DNA methylation and gene expression analysis of early human B-cell development reveals a demethylation signature and transcription factor network. // Nucleic Acids Res. –2012. –V.40. №22. –P.11339-11351. 96 134. Lee J.H., Noh J., Noh G., Choi W.S., Lee S.S. IL-10 is predominantly produced by CD19(low)CD5(+) regulatory B cell subpopulation: characterisation of CD19 (high) and CD19(low) subpopulations of CD5(+) B cells. // Yonsei Med J. –2011. –V.52. №5. –P.851-855. 135. Lennert K. History of the European Association for Haematopathology. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, 2006. 131 c. 136. Li H.L., Davis W.W., Whiteman E.L., Birnbaum M.J., Pure E. The tyrosine kinases SYK and LYN exert opposing effects on the activation of protein kinase Akt/PKB in B lymphocytes. // Proc Natl Acad Sci U S A. –1999. –V.96. №12. –P.6890-6895. 137. Llinas L., Lazaro A., de Salort J., Matesanz-Isabel J., Sintes J., Engel P. Expression profiles of novel cell surface molecules on B-cell subsets and plasma cells as analyzed by flow cytometry. // Immunol Lett. –2011. –V.134. №2. –P.113-121. 138. Loken M.R., Shah V.O., Dattilio K.L., Civin C.I. Flow cytometric analysis of human bone marrow. II. Normal B lymphocyte development. // Blood. –1987. –V.70. №5. –P.1316-1324. 139. Lugton I. Mucosa-associated lymphoid tissues as sites for uptake, carriage and excretion of tubercle bacilli and other pathogenic mycobacteria. // Immunol Cell Biol. –1999. –V.77. №4. – P.364-372. 140. Maas A., Hendriks R.W. Role of Bruton's tyrosine kinase in B cell development. // Dev Immunol. –2001. –V.8. №3-4. –P.171-181. 141. MacLennan I.C. Germinal centers. // Annual Rev Immunol. –1994. –V.12. –P.117-139. 142. Malavasi F., Deaglio S., Funaro A., Ferrero E., Horenstein A.L., Ortolan E., Vaisitti T., Aydin S. Evolution of the ADP ribosyl cyclase/CD38 gene family in physiology and pathology. // Physiol Rev. –2008. –V.88. №3. –P.841-886. 143. Martin V.A., Wang W.H., Lipchik A.M., Parker L.L., He Y., Zhang S., Zhang Z.Y., Geahlen R.L. Akt2 inhibits the activation of NFAT in lymphocytes by modulating calcium release from intracellular stores. // Cell Signal. –2012. –V.24. №5. –P.1064-1073. 144. Matesanz-Isabel J., Sintes J., Llinas L., de Salort J., Lazaro A., Engel P. New B-cell CD molecules. // Immunol Lett. –2011. –V.134. №2. –P.104-112. 145. Matsuo T., Hazeki K., Tsujimoto N., Inoue S., Kurosu H., Kontani K., Hazeki O., Ui M., Katada T. Association of phosphatidylinositol 3-kinase with the proto-oncogene product Cbl upon CD38 ligation by a specific monoclonal antibody in THP-1 cells. // FEBS Letters. –1996. –V.397. №1. –P.113-116. 146. Maul R.W., Gearhart P.J. Controlling somatic hypermutation in immunoglobulin variable and switch regions. // Immunol Res. –2010. –V.47. №1-3. –P.113-122. 147. Medvedovic J., Ebert A., Tagoh H., Busslinger M. Pax5: a master regulator of B cell development and leukemogenesis. // Adv Immunol. –2011. –V.111. –P.179-206. 97 148. Meffre E., Milili M., Blanco-Betancourt C., Antunes H., Nussenzweig M.C., Schiff C. Immunoglobulin heavy chain expression shapes the B cell receptor repertoire in human B cell development. // J Clin Invest. –2001. –V.108. №6. –P.879-886. 149. Melchers F. Fit for life in the immune system? Surrogate L chain tests H chains that test L chains. // Proc Natl Acad Sci U S A. –1999. –V.96. №6. –P.2571-2573. 150. Migita S., Putnam F.W. Antigenic relationships of Bence Jones proteins, myeloma globulins, and normal human gama-globulin. // J Exp Med. –1963. –V.117. –P.81-104. 151. Minegishi Y., Coustan-Smith E., Wang Y.H., Cooper M.D., Campana D., Conley M.E. Mutations in the human lambda5/14.1 gene result in B cell deficiency and agammaglobulinemia. // J Exp Med. –1998. –V.187. №1. –P.71-77. 152. Minegishi Y., Coustan-Smith E., Rapalus L., Ersoy F., Campana D., Conley M.E. Mutations in Igalpha (CD79a) result in a complete block in B-cell development. // J Clin Invest. –1999. – V.104. №8. –P.1115-1121. 153. Mir M.A., Agrewala J.N. Signaling through CD80: an approach for treating lymphomas. // Expert Opin Ther Target. –2008. –V.12. №8. –P.969-979. 154. Monroe J.G. Ligand-independent tonic signaling in B-cell receptor function. // Curr Opin Immunol. –2004. –V.16. №3. –P.288-295. 155. Moshaver B., van Rhenen A., Kelder A., van der Pol M., Terwijn M., Bachas C., Westra A. H., Ossenkoppele G. J., Zweegman S., Schuurhuis G. J. Identification of a small subpopulation of candidate leukemia-initiating cells in the side population of patients with acute myeloid leukemia. // Stem Cells. –2008. –V.26. №12. –P.3059-3067. 156. Nolz J.C., Tschumper R.C., Pittner B.T., Darce J.R., Kay N.E., Jelinek D.F. ZAP-70 is expressed by a subset of normal human B-lymphocytes displaying an activated phenotype. // Leukemia. – 2005. –V.19. №6. –P.1018-1024. 157. Notta F., Doulatov S., Laurenti E., Poeppl A., Jurisica I., Dick J.E. Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment. // Science. –2011. – V.333. №6039. –P.218-221. 158. Novershtern N., Subramanian A., Lawton L.N., Mak R.H., Haining W.N., McConkey M.E., Habib N., Yosef N., Chang C.Y., Shay T., Frampton G.M., Drake A.C., Leskov I., Nilsson B., Preffer F., Dombkowski D., Evans J.W., Liefeld T., Smutko J.S., Chen J., Friedman N., Young R.A., Golub T.R., Regev A., Ebert B.L. Densely interconnected transcriptional circuits control cell states in human hematopoiesis. // Cell. –2011. –V.144. №2. –P.296-309. 159. Numaga T., Nishida M., Kiyonaka S., Kato K., Katano M., Mori E., Kurosaki T., Inoue R., Hikida M., Putney J.W. Jr, Mori Y. Ca2+ influx and protein scaffolding via TRPC3 sustain PKCbeta and ERK activation in B cells. // J Cell Sci. –2010. –V.123 Pt6. –P.927-938. 98 160. Nunez C., Nishimoto N., Gartland G.L., Billips L.G., Burrows P.D., Kubagawa H., Cooper M.D. B cells are generated throughout life in humans. // J Immunol. –1996. –V.156. №2. –P.866-872. 161. Okkenhaug K., Vanhaesebroeck B. PI3K in lymphocyte development, differentiation and activation. // Nat Rev Immunol. –2003. –V.3. №4. –P.317-330. 162. Orchard J.A., Ibbotson R.E., Davis Z., Wiestner A., Rosenwald A., Thomas P.W., Hamblin T.J., Staudt L.M., Oscier D.G. ZAP-70 expression and prognosis in chronic lymphocytic leukaemia. // Lancet. –2004 –V.363. №9403. –P.105-111. 163. Orfao A., Ruiz-Arguelles A. General concepts about cell sorting techniques. // Clin Biochem. – 1996. –V.29. №1. –P.5-9. 164. Owens T., Zeine R. The cell biology of T-dependent B cell activation. // Biochem Cell Biol. – 1989. –V.67. №9. –P.481-489. 165. Pao L.I., Cambier J.C. SYK, but not LYN, recruitment to B cell antigen receptor and activation following stimulation of CD45- B cells. // J Immunol. –1997. –V.158. №6. –P.2663-2669. 166. Pao L.I., Famiglieti S.J., Cambier J.C. Asymmetrical phosphorylation and function of immunoreceptor tyrosine-based activation motif tyrosines in B-cell antigen receptor signal transduction. // J Immunol. –1998. –V.160. №7. –P.3305-3314. 167. Perez-Villar J.J., Whitney G.S., Bowen M.A., Hewgill D.H., Aruffo A.A. CD5 Negatively Regulates the T-Cell Antigen Receptor Signal Transduction Pathway: Involvement of SH2Containing Phosphotyrosine Phosphatase SHP-1. // Mol Cell Biol. –1999. –V.19. №4. –P.29032912. 168. Pernis B., Forni L., Amante L. Immunoglobulins as cell receptors. // Annals of New York Academy of Sciences. –1971. –V.190. –P.420-431. 169. Pers J.O., Jamin C., Predine-Hug F., Lydyard P., Youinou P. The role of CD5-expressing B cells in health and disease (review). // Int J Mol Med. –1999. –V.3. №3. –P.239-245. 170. Petrosyan K., Tamayo R., Joseph D. Sensitivity of a Novel Biotin-free Detection Reagent (Powervision+) for Immunohistochemistry. // Journal of Histotecnol. –2002. –V.25. №4. –P.247250. 171. Pfaffl M.W., Tichopad A., Prgomet C., Neuvians T.P. Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper--Excel-based tool using pair-wise correlations. // Biotechnol Lett. –2004. –V.26. №6. –P.509-515. 172. Pieper K., Grimbacher B., Eibel H. B-cell biology and development. // J Allergy Clin Immunol. –2011. –V.131. №4. –P.959-971. 173. Pierce S.K. Lipid rafts and B-cell activation. // Nat Rev Immunol. –2002. –V.2. №2. –P.96-105. 99 174. Potashnikova D., Gladkikh A., Vorobjev I.A. Selection of Superior Reference Genes' Combination for Quantitative Real-time PCR in B-cell Lymphomas. // Ann Clin Lab Sci. –2015. –V.45. №1. –Р.64-72. 175. Preud’homme J.L., Brouet J.C., Clauvel J.P., Seligmann M. Surface IgD in immunoproliferative disorders. // Scand J Immunol. –1974. –V.3. №6. –P.853-858. 176. Pritsch O., Maloum K., Dighiero G. Basic biology of autoimmune phenomena in chronic lymphocytic leukemia. // Semin Oncol. –1998. –V.25. №1. –P.34-41. 177. Provenzano M., Mocellin S. Complementary techniques: validation of gene expression data by quantitative real time PCR. // Adv Exp Med Biol. –2007. –V.593. –P.66-73. 178. Raffeld M., Jaffe E.S. bcl-1, t(11;14), and mantle cell-derived lymphomas. // Blood. –1991. – V.78. №2. –P.259-263. 179. Rajewsky K. Clonal selection and learning in the antibody system. // Nature. –1996. –V. 381. №6585. –P.751-758. 180. Raman C., Knight K.L. CD5+ B cells predominate in peripheral tissues of rabbit. // J Immunol. – 1992. –V.149. №12. –P.3858-3864. 181. Reinoso-Martin C., Jantus-Lewintre E., Ballesteros C.G., Campos C.B., Ferrer J.R., GarciaConde J. ZAP-70 mRNA expression provides clinically valuable information in early-stage chronic lymphocytic leukemia. // Haematologica. –2008. –V.93. №9. –P.1422-1424. 182. Reth M., Nielsen P. Signaling circuits in early B-cell development. // Adv Immunol. –2014. – V.122. –P.129-175. 183. Reynaud D., Lefort N., Manie E., Coulombel L., Levy Y. In vitro identification of human pro-B cells that give rise to macrophages, natural killer cells, and T cells. // Blood. –2003. –V.101. №11. –P.4313-4321. 184. Rizzatti E.G., Falcao R.P., Panepucci R.A., Proto-Sigueira R., Anselmo-Lima W.T., Okamoto O.K., Zago M.A. Gene expression profiling of mantle cell lymphoma reveals aberrant expression of genes from the PI3K-AKT, WNT and TGFbeta signalling pathways. // Br J Haematol. –2005. –V.130. №4. –P.516-526. 185. Roitt I.M., Brostoff J., Male D.K. Immunology 6th ed. Maryland Heights: Mosby, 2001. 480 с. 186. Rosenwald A., Alizadeh A.A., Widhopf G., Simon R., Davis R.E., Yu X., Yang L., Pickeral. O.K., Rassenti L.Z., Powell J., Botstein D., Byrd J.C., Grever M.R., Cheson B.D., Chiorazzi N., Wilson W.H., Kipps T.J., Brown P.O., Staudt L.M. Relation of gene expression phenotype to immunoglobulin mutation genotype in B cell chronic lymphocytic leukemia. // J Exp Med. – 2001. –V.194. №11. –P.1639-1647. 100 187. Rossi M.I., Yokota T., Medina K.L., Garrett K.P., Comp P.C., Schipul A.H. Jr, Kincade P.W. B lymphopoiesis is active throughout human life, but there are developmental age-related changes. // Blood. –2003. –V.101. №2. –P.576-584. 188. Rossi F.M., Del Principe M.I., Rossi D., Irno Consalvo M., Luciano F., Zucchetto A., Bulian P., Bomben R., Dal Bo M., Fangazio M., Benedetti D., Degan M., Gaidano G., Del Poeta G., Gattei V. Prognostic impact of ZAP-70 expression in chronic lymphocytic leukemia: mean fluorescence intensity T/B ratio versus percentage of positive cells. // J Transl Med. –2010. –V.8. №23. 189. Ryan D.H., Nuccie B.L., Ritterman I., Liesveld J.L., Abboud C.N., Insel R.A. Expression of interleukin-7 receptor by lineage-negative human bone marrow progenitors with enhanced lymphoid proliferative potential and B-lineage differentiation capacity. // Blood. –1997. –V.89. №3. –P.929-940. 190. Said J.W. Aggressive B-cell lymphomas: how many categories do we need? // Mod Pathology. – 2013. –V.26 Suppl 1. –P.S42-S56. 191. Saiki O., Kishimoto T., Kuritani T., Muraguchi A., Yamamura Y. In vitro induction of IgM secretion and switching to IgG production in human B leukemic cells with the help of T cells. // J Immunol. –1980. –V.124. №6. –P.2609-2614. 192. Sanchez-Navarro I., Gamez-Pozo A., Gonzalez-Baron M., Pinto-Marin A., Hardisson D., Lopez R., Madero R., Cejas P., Mendiola M., Espinosa E., Vara J.A. Comparison of gene expression profiling by reverse transcription quantitative PCR between fresh frozen and formalin-fixed, paraffin-embedded breast cancer tissues. // Biotechniques. –2010. –V.48. №5. –P.389-397. 193. Sant M., Allemani C., Tereanu C., De Angelis R., Capocaccia R., Visser O., Marcos-Gragera R., Maynadie M., Simonetti A., Lutz J.M., Berrino F. HAEMACARE Working Group. Incidence of hematologic malignancies in Europe by morphologic subtype: results of the HAEMACARE project. // Blood. –2010. –V.116. №19. –P.3724-3734. 194. Santamaria-Martinez A., Barguinero J., Barbosa-Desongles A., Hurtado A., Pinos T., Seoane J., Poupon M.F., Morote J., Reventos J., Munell F. Identification of multipotent mesenchymal stromal cells in the reactive stroma of a prostate cancer xenograft by side population analysis. // Exp Cell Res. –2009. –V.315. №17. –P.3004-3013. 195. Sanz E., Alvarez-Mon M., Martinez-A C., de la Hera A. Human cord blood CD34+Pax-5+ Bcell progenitors: single-cell analyses of their gene expression profiles. // Blood. –2003. –V.101. №9. –P.3424-3430. 196. Sanz E., Munoz-A N., Monserrat J., Van Den Rym A., Escoll P., Ranz I., Alvarez-Mon M., de la Hera A.. Ordering human CD34+CD10-CD19+ pre/pro-B-cell and CD19- common lymphoid 101 progenitor stages in two pro-B-cell development pathways. // Proc Natl Acad Sci USA. –2010. – V.107. №13. –P.5925-5930. 197. Scheid M.P., Woodgett J.R. Unravelling the activation mechanisms of protein kinase B/Akt. // FEBS Letters. –2003. –V.546. №1. –P.108-112. 198. Schiff C., Lemmers B., Deville A., Fougereau M., Meffre E. Autosomal primary immunodeficiencies affecting human bone marrow B-cell differentiation. // Immunol Rev. – 2000. –V.178. –P.91-98. 199. Scielzo C., Camporeale A., Geuna M., Alessio M., Poggi A., Zocchi M.R., Chilosi M., CaligarisCappio F., Ghia P. ZAP-70 is expressed by normal and malignant human B-cell subsets of different maturational stage. // Leukemia. –2006. –V.20. №4. –P.689-695. 200. Seda V., Mraz M. B-cell signalling and its crosstalk with other pathways in normal and malignant cells. // Eur J Haermotol. –2015. –V.94. №3. –P.193-205. 201. Shapiro H.M. Practical flow cytometry. 4th Edition. Hoboken: Willey, 2003. 736 c. 202. Shirai T., Hirose S., Okada T., Nishimura H. CD5+ B cells in autoimmune disease and lymphoid malignancy. // Clin Immunol Immunopathol. –1991. –V.59. №2. –P.173-186. 203. Sindhava V.J., Bondada S. Multiple regulatory mechanisms control B-1 B cell activation. // Front Immunol. –2012. –V.3. №372. 204. Skibola S.M. Obesity, diet and risk of non-Hodgkin lymphoma. // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. –2007. –V.16. №3. –P.392-395. 205. Slavik J.M., Hutchcroft J.E., Bierer B.E. CD28/CTLA-4 and CD80/CD86 families. // Immunol Res. –1999. –V.19. №1. –P.1-24. 206. Somani A.K., Yuen K., Xu F., Zhang J., Branch D.R., Siminovitch K.A. The SH2 domain containing tyrosine phosphatase-1 down-regulates activation of LYN and LYN-induced tyrosine phosphorylation of the CD19 receptor in B cells. // J Biol Chem. –2001. –V.276. №3. –P.19381944. 207. Sorby L.A., Andersen S.L., Bukholm I.R., Jacobsen M.B. Evaluation of suitable reference genes for normalization of real-time reverse transcription PCR analysis in colon cancer. // J Exp Clin Cancer Res. –2010. –V.29. №144. 208. Su W., Yeong K.F., Spencer J. Immunohistochemical analysis of human CD5 positive B cells: mantle cells and mantle cell lymphoma are not equivalent in terms of CD5 expression. // J Clin Pathol –2000. –V.53. №5. –P.395-397. 209. Sugie K., Minami Y., Kawakami T., Uchida A. Stimulation of NK-like YT cells via leukocyte function-associated antigen (LFA)-1. Possible involvement of LFA-1-associated tyrosine kinase in signal transduction after recognition of NK target cells. // J Immunol –1995. –V.154. №4. – P.1691-1698. 102 210. Suzuki T., Higgins P.J., Crawford D.R. Control selection for RNA quantitation. // Biotechniques. –2000. –V.29. №2. –P.332-337. 211. Swerdlow S.H., Campo E., Harris N.L., Jaffe E.S., Pileri S.A., Stein H., Theile J., Vardiman J.W. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues 4th ed. Lyon: World Health Organization Press, 2008. 439 с. 212. Tanaka-Harada Y., Kawakami M., Oka Y., Tsuboi A., Katagiri T., Elisseeva O.A., Nishida S., Shirakata T., Hosen N., Fujiki F., Murao A., Nakajima H., Oji Y., Kanda Y., Kawase I., Sugiyama H. Biased usage of BV gene families of T-cell receptors of WT1 (Wilms’ tumor gene)-specific CD8+ T cells in patients with myeloid malignancies. // Cancer Sci. –2010. – V.101. №3. –P.594-600. 213. Tangye S.G., Ferguson A., Avery D.T., Ma C.S., Hodgkin P.D. Isotype switching by human B cells is division-associated and regulated by cytokines. // J Immunol. –2002. –V.169. №8. – P.4298-4306. 214. Taylor S., Wakem M., Dijkman G., Alsarraj M., Nguen M. A practical approach to RT-qPCRPublishing data that conform to the MIQE guidelines. // Methods. –2010. –V.50. №4. –P.S1-5. 215. Tolar P., Pierce S.K. A conformation-induced oligomerization model for B cell receptor microclustering and signaling. // Curr Top Microbiol Immunol. –2010. –V.340. –P.155-169. 216. Trentin L., Frasson M., Donella-Deana A., Frezzato F., Pagano M.A., Tibaldi E., Gattazzo C., Zambello R., Semenzato G., Brunati A.M. Geldanamycin-induced LYN dissociation from aberrant Hsp90-stabilized cytosolic complex is an early event in apoptotic mechanisms in Bchronic lymphocytic leukemia. // Blood. –2008. –V.112. №12. –P.4665-4674. 217. Tricarico C., Pinzani P., Bianchi S., Paglierani M., Distante V., Pazzagli M., Bustin S.A., Orlando C. Quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction: normalization to rRNA or single housekeeping genes is inappropriate for human tissue biopsies. // Anal Biochem. –2002. –V.309. №2. –P.293-300. 218. True L.D., Zhang H., Ye M., Huan C.Y., Nelson P.S., von Haller P.D., Tjoelker L.W., Kim J.S., Qian W.J., Smith R.D., Ellis W.J., Liebeskind E.S., Liu A.Y. CD90/TH1 is overexpressed in prostate cancer-associated fibroblasts and can serve as a cancer biomarker. // Mod Pathol. –2010. –V.23. №10. –P.1346-1356. 219. Tsubata T. Role of inhibitory BCR co-receptors in immunity. // Infect Disord Drug Targets. – 2012. –V.12. №3. –P.181-190. 220. Tung J.W., Parks D.R., Moore W.A., Herzenberg L.A., Herzenberg L.A. Identification of B-cellsubsets: an exposition of 11-color (Hi-D) FACS methods. // Methods Mol Biol. –2004. –V.271. –P.37-58. 103 221. Valceckiene V., Kontenyte R., Jakubauskas A., Griskevicius L. Selection of reference genes for quantitative polymerase chain reaction studies in purified B cells from B cell chronic lymphocytic leukaemia patients. // Br J Haematol. –2010. –V.151. №3. –P.232-238. 222. Vandesompele J., De Preter K., Pattyn F., Poppe B., Van Roy N., De Paepe A., Speleman F. Accurate normalization of real-time quantitive RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. // Genome Biol. –2002. –V.3. RESEARCH0034. 223. Van Furth R., Schuit H.R., Hijmans W. The formation of immunoglobulins by human tissues in vitro. 3. Spleen, lymph nodes, bone marrow and thymus. // Immunology. –1966. –V.11. №1. – P.19-27. 224. van Lochem E.G., van der Velden V.H., Wind H.K., Marvelde J.G., Westerdaal N.A., van Dongen J.J. Immunophenotypic differentiation patterns of normal hematopoiesis in human bone marrow: Reference patterns for age-related changes and disease-induced shifts. // Cytometry. – 2004. –V.60. №1. –P.1-13. 225. van Oers M.H., Pals S.T., Evers L.M., van der Schoot C.E., Koopman G., Bonfrer J.M., Hintzen R.Q., von dem Borne A.E., van Lier R.A. Expression and release of CD27 in human B-cell malignancies. // Blood –1993. –V.82. №11. –P.3430-3436. 226. van Zelm M.C., van der Burg M., de Ridder D., Barendregt B.H., de Haas E.F., Reinders M.J., Lankester A.C., Revesz T., Staal F.J., van Dongen J.J. Ig gene rearrangement steps are initiated in early human precursor B cell subsets and correlate with specific transcription factor expression. // J Immunol. –2005. –V.175. №9. –P.5912-5922. 227. Veneri D., Franchini M., Vella A., Tridente G., Semenzato G., Pizzolo G., Ortolani R. Changes of human B and B-1a peripheral blood lymphocytes with age. // Hematology. –2007. –V.12. №4. –P.337-341. 228. Vossenkamper A., Blair P.A., Safinia N., Fraser L.D., Das L., Sanders T.J., Stagg A.J., Sanderson J.D., Taylor K., Chang F., Choong L.M., D'Cruz D.P., Macdonald T.T., Lombardi G., Spencer J. A role for gut-associated lymphoid tissue in shaping the human B cell repertoire. // J Exp Med. –2013. –V.210. №9. –P.1665-1674. 229. Vroblova V., Smolej L., Krejsek J. Pitfalls and limitations of ZAP-70 detection in chronic lymphocytic leukemia. // Hematology. –2012. –V.17. №5. –P.268-274. 230. Vuillier F., Dumas G., Magnac C., Prevost M.C., Lalanne A.I., Oppezzo P., Melanitou E., Dighiero G., Payelle-Brogard B. Lower levels of surface B-cell-receptor expression in chronic lymphocytic leukemia are associated with glycosylation and folding defects of the mu and CD79a chains. // Blood. –2005. –V.105. №7. –P.2933-2940. 231. Walker J.A., Smith K.G.C. CD22: an inhibitory enigma. // Immunology. –2008. –V.123. №3. – P.314-325. 104 232. Watanabe N., Takahashi S., Ishige M., Ishii Y., Ooi J., Tomonari A., Tsukada N., Konuma T., Kato S., Sato A., Tojo A., Nakauchi H. Recipient-Derived Cells after Cord Blood Transplantation: Dynamics Elucidated by Multicolor FACS, Reflecting Graft Failure and Relapse. // Biol Blood Marrow Transplant. –2008. –V.14. №6. –P.693-701. 233. Wiestner A., Rosenwald A., Barry T.S., Wright G., Davis R.E., Henrickson S.E., Zhao H., Ibbotson R.E., Orchard J.A., Davis Z., Stetler-Stevenson M., Raffeld M., Arthur D.C., Marti G.E., Wilson W.H., Hamblin T.J., Oscier D.G., Staudt L.M. ZAP-70 expression identifies a chronic lymphocytic leukemia subtype with unmutated immunoglobulin genes, inferior clinical outcome, and distinct gene expression profile. // Blood. –2003. –V.101. №12. –P.4944-4951. 234. Wilson J.D., Nossal G.J. Identification of human B lymphocytes in normal peripheral blood and in chronic lymphocytic leukaemia. // Lancet. –1971. –V.2. №7728. –P.788-791. 235. Wong M.L., Medrano J.F. Real-time PCR for mRNA quantitation. // Biotechniques. –2005. – V.39. №1. –P.75-85. 236. Xu Y., Beavitt S.J., Harder K.W., Hibbs M.L., Tarlinton D.M. The activation and subsequent regulatory roles of LYN and CD19 after B cell receptor ligation are independent. // J Immunol. – 2002. –V.169. №12. –P.6910-6918. 237. Yel L., Minegishi Y., Coustan-Smith E., Buckley R.H., Trubel H., Pachman L.M., Kitchingman G.R., Campana D., Rohrer J., Conley M.E. Mutations in the mu heavy-chain gene in patients with agammaglobulinemia. // N Engl J Med. –1996. –V.335. №20. –P.1486-1493. 238. Yokota A., Kikutani H., Tanaka T., Sato R., Barsumian E.L., Suemura M., Kishimoto T. Two species of human Fc receptor II (Fc RII/CD23): tissue-specific and IL-4-specific regulation of gene expression. // Cell. –1988. –V.55. №4. –P.611–618. 239. Youinou P., Mackenzie L.E., Lamour A., Mageed R.A., Lydyard P.M. Human CD5-positive B cells in lymphoid malignancy and connective tissue diseases. // Eur J Clin Invest. –1993. –V.23. №3. –P.139-150. 240. Youinou P., Renaudineau Y. CD5 expression in B cells from patients with systemic lupus erythematosus. // Crit Rev Immunol. –2011. –V.31. №1. –P.31-42. 241. Zaidi M.R., Day C.P., Merlino G. Fluorescent protein-assisted purification for gene expression profiling. // Methods Mol Biology. –2011. –V.699. –P.393-405. 242. Zandi S., Bryder D., Sigvardsson M. Load and lock: the molecular mechanisms of B-lymphocyte commitment. // Immunol Rev. –2010. –V.238. №1. –P.47-62. 243. Zanesi N., Balatti V., Bottoni A., Croce C.M., Pekarsky Y. Novel insights in molecular mechanisms of CLL. // Curr Pharm Des. –2012. –V.18. №23. –P.3363-3372. 244. Zhao X.F. Pitfalls in Diagnostic Hematopathology: Part I. // Int J Clin Exp Pathol. –2009. –V.2. №1. –P.11–20. 105 245. Zhao X.F. Pitfalls in Diagnostic Hematopathology: Part II. // Int J Clin Exp Pathol. –2010. –V.3. №1. –P.39–46. 246. Zhang Y., Meyer-Hermann M., George L.A., Figge M.T., Khan M., Goodall M., Young S.P., Reynolds A., Falciani F., Waisman A., Notley C.A., Ehrenstein M.R., Kosco-Vilbois M., Toellner K.M. Germinal center B cells govern their own fate via antibody feedback. // J Exp Med. –2013. –V.210. №3. –P.457-464. 247. Zhang M., Srivastava G., Lu L. The pre-B cell receptor and its function during B cell development. // Cell Mol Immunol. –2004. –V.1. №2. –P.89-94. 248. Zhao H., Peehl D.M. Tumor-promoting phenotype of CD90hi prostate cancer-associated fibroblasts. // Prostate. –2009. –V.69. №9. –P.991-1000. 249. Zola H., Swart B. The human leucocyte differentiation antigens (HLDA) workshops: the evolving role of antibodies in research, diagnosis and therapy. // Cell Res. –2005. –V.15. №9. – P.691-694. 250. Zouali M. Transcriptional and metabolic pre-B cell receptor-mediated checkpoints: Implications for autoimmune diseases. // Mol Immunol. –2014. –V.62. №2. –P.315-320. 251. Zupo S., Dono M., Massara R., Taborelli G., Chiorazzi N., Ferrarini M. Expression of CD5 and CD38 by human CD5- B cells: requirement for special stimuli. // Eur J Immunol. –1994. –V.24. №6. –P.1426-1433. 106 ПРИЛОЖЕНИЯ Приложение 1. Таблица 10: Описание выборки образцов ЛКМЗ. Данные по транслокации t(11;14) доступны для 7 случаев из 27, н/д – нет данных. CCND1 – относительное нормализованное количество кДНК гена циклина D1. Для солидных опухолей приведен гистологический вариант. № Возрас Тип t CCND т ткан (11;14) 1 Клон Иммунофенотип Уровен Гистоло опухоли ь гически активац й ии вариант и 1 74 кровь t(11;14) 55,35 κ CD19+/CD5+/CD20 CD38 +/CD22+/CD23- low /FMC7+/CD432 40 л/у t(11;14) 9,15 κ CD19+/CD5+/CD20 CD38 бластоид +/CD22+/CD23- low ный /FMC7-/CD43low 3 76 кровь н/д 5,61 κ CD19+/CD5+/CD20 CD38 +/CD22+/CD23- low /FMC7-/CD434 59 кровь t(11;14) 0,47 CD19+/CD5+/CD20 CD38 +/CD22+/CD23- high /FMC7low/CD435 64 л/у н/д 26,29 CD19+/CD5+/CD20 CD38 бластоид +/CD22+/CD23- high ный /FMC7+/CD43+ 6 45 кровь н/д 0,22 κ CD19+/CD5+/CD20 CD38 +/CD22+/CD23- high /FMC7-/CD43+ 7 70 кровь t(11;14) 7,98 κ CD19+/CD5+/CD20 CD38 107 +/CD22+/CD23low/ low FMC7+/CD43low 8 53 селез н/д 0,0145 енка CD19+/CD5+/CD20 CD38 бластоид +/CD22+/CD23- high ный CD19+/CD5+/CD20 CD38 диффузн +/CD22+/CD23- high ый CD19+/CD5+/CD20 CD38 нодуляр +/CD22+/CD23- high ный /FMC7-/CD43low 9 47 л/у н/д 6,12 κ /FMC7+/CD43+ 10 66 селез н/д 5,94 енка /FMC7low/CD4311 74 кровь н/д 0,21 CD19+/CD5+/CD20 CD38 +/CD22+/CD23- low /FMC7low/CD43lo w 12 77 кровь н/д 0,102 κ CD19+/CD5+/CD20 CD38 +/CD22+/CD23low/ high FMC7+/CD4313 54 кровь н/д 5,18 CD19+/CD5+/CD20 CD38 +/CD22+/CD23low/ high FMC7+/CD4314 48 кровь н/д 2,17 κ CD19+/CD5+/CD20 CD38 +/CD22+/CD23- high /FMC7+/CD4315 44 кровь t(11;14) 65,257 κ 4 CD19+/CD5- CD38 /CD20+/CD22+/CD high 23-/FMC7+/CD4316 27 кровь н/д 6,8639 7 CD19+/CD5+/CD20 CD38 +/CD22+/CD23- high 108 /FMC7+/CD4317 58 кровь н/д 1,1821 CD19+/CD5+/CD20 CD38 +/CD22+/CD23- high /FMC7low/CD43+ 18 75 л/у t(11;14) 1,4977 CD19+/CD5+/CD20 CD38 бластоид +/CD22+/CD23low/ high ный FMC7+/CD43+ 19 58 костн н/д ый 25,371 κ 4 мозг 20 69 кровь CD19+/CD5+/CD20 CD38 +/CD22+/CD23- high /FMC7+/CD43н/д 4,4136 CD19+/CD5+/CD20 CD38 +/CD22+/CD23low/ high FMC7+/CD43+ 21 53 кровь t(11;14) 3,78 κ CD19+/CD5+/CD20 CD38 +/CD22+/CD23- low /FMC7+/CD4322 23 55 76 костн н/д κ CD19+/CD5+/CD20 CD38 ый +/CD22+/CD23- high мозг /FMC7+/CD43low кровь н/д 0,078 0,67 CD19+/CD5+/CD20 CD38 +/CD22+/CD23- high /FMC7-/CD43low 24 34 кровь н/д 3,48 CD19+/CD5+/CD20 CD38 +/CD22+/CD23- low /FMC7+/CD4325 70 кровь н/д 107,19 κ CD19+/CD5+/CD20 CD38 +/CD22+/CD23- high /FMC7+/CD4326 53 кровь н/д 6,15 CD19+/CD5+/CD20 CD38 109 +/CD22+/CD23- high /FMC7+/CD43low 27 52 л/у н/д 1,06 CD19+/CD5+/CD20 н/д диффузн ый +/CD23low Приложение 2. Таблица 11: Описание выборки образцов В-ХЛЛ. CCND1 – относительное нормализованное количество кДНК гена циклина D1, н/д – нет данных. В 1 случае из 28 экспрессия легких цепей иммуноглобулина не детектировалась ни внутри, ни снаружи клеток. Для солидных опухолей приведен гистологический вариант. № Возраст Тип CCND1 Клон ткани Иммунофенотип Уровен Гистолог опухоли ь ический активац вариант ии 1 63 л/у 0,015 κ low CD19+/CD5+/CD20+ CD38 диффузн /CD22+/CD23+/FMC low ый 7-/CD43+ 2 85 кровь 0,0002 κ CD19+/CD5+/CD20lo CD38 w/CD22+/CD23low/F low MC7-/CD43+ 3 н/д кровь 0,001 κ low CD19+/CD5+/CD20lo CD38 w/CD22+/CD23+/FM high C7-/CD43+ 4 74 кровь 0,002 κ CD19+/CD5low/CD2 CD38 0low/CD22+/CD23lo low w/FMC7-/CD43+ 5 н/д кровь 0,0004 κ CD19+/CD5+/CD20lo CD38 w/CD22+/CD23low/F low MC7-/CD43+ 6 70 л/у 0,006 κ CD19+/CD5+/CD20+ CD38 диффузн /CD22+/CD23+/FMC low ый 110 7-/CD43+ 7 61 кровь 0,1044 CD19+/CD5+/CD20+ CD38 /CD22+/CD23+/FMC low 7-/CD43+ 8 39 костны 0,001 κ low й мозг CD19+/CD5+/CD20+ CD38 /CD22+/CD23+/FMC high 7-/CD43+ 9 78 кровь 0,005 CD19+/CD5+/CD20+ CD38 /CD22+/CD23+/FMC low 7-/CD43+ 10 48 кровь 0,01 κ CD19+/CD5+/CD20+ CD38 /CD22+/CD23low/FM low C7-/CD43+ 11 65 кровь 0,0277 CD19+/CD5+/CD20lo CD38 w/CD22+/CD23+/FM high C7-/CD43+ 12 71 кровь 0,028 κ low CD19+/CD5+/CD20+ CD38 /CD22+/CD23+/FMC low 7-/CD43+ 13 56 кровь 0,003 CD19+/CD5low/CD2 CD38 0low/CD22+/CD23+/ low FMC7-/CD43+ 14 52 селезен 0,0024 CD19+/CD5+/CD23+ ка 15 62 кровь CD38 high 0,057 κ low CD19+/CD5+/CD20+ CD38 /CD22+/CD23+/FMC high 7-/CD43+ 16 55 кровь 0,1055 κ low CD19+/CD5+/CD20lo CD38 w/CD22+/CD23+/FM high 111 C7-/CD43+ 17 56 л/у 0,01 κ CD19+/CD5+/CD20lo CD38 диффузн w/CD22+/CD23+/FM high ый C7-/CD43+ 18 60 кровь 0,065 κ CD19+/CD5+/CD20+ CD38 /CD22low/CD23low/ low FMC7-/CD43+ 19 58 кровь 0,077 CD19+/CD5+/CD20+ CD38 /CD22+/CD23+/FMC low 7-/CD43+ 20 81 кровь 0,012 легкие CD19+/CD5+/CD20+ CD38 цепи /CD22+/CD23+/FMC low не 7-/CD43- экспре ссирую тся 21 65 кровь 0,07 κ low CD19+/CD5+/CD20lo CD38 w/CD22+/CD23+/FM low C7-/CD43+ 22 56 кровь 0,049 κ low CD19+/CD5+/CD20lo CD38 w/CD22+/CD23+/FM low C7-/CD43+ 23 48 кровь н/д κ CD19+/CD5+/CD20+ CD38 /CD22+/CD23+/FMC low 7-/CD43+ 24 59 кровь н/д κ CD19+/CD5+/CD20+ CD38 /CD22+/CD23+/FMC low 7-/CD43low 25 64 кровь н/д κ low CD19+/CD5+/CD20+ /CD22+/CD23+/FMC CD38 112 26 54 кровь н/д κ 7-/CD43+ low CD19+/CD5+/CD20+ CD38 /CD22+/CD23+/FMC high 7-/CD43+ 27 76 кровь н/д κ CD19+/CD5+/CD20+ CD38 /CD22+/CD23+/FMC low 7-/CD43+ 28 57 кровь н/д κ CD19+/CD5+/CD20+ CD38 /CD22+/CD23+/FMC low 7-/CD43+ Приложение 3. Таблица 12: Описание выборки образцов лимфом «серой зоны». CCND1 – относительное нормализованное количество кДНК гена циклина D1, н/д – нет данных. Для солидных опухолей приведен гистологический вариант. № Возраст Тип CCND1 Клон ткани Иммунофенотип Уровен Гистологи опухоли ь ческий активац вариант ии 1 71 кровь 0,29 н/д н/д н/д 2 43 селезен 0,08 κ 2 популяции: CD38 нодулярны CD19+/CD5+/CD20- low й ка /CD22+/CD23+/FMC 7-/CD43+ CD19+/CD5/CD20+/CD22+/CD23 low/FMC7-/CD433 50 кровь 0,044 CD19+/CD5+/CD20+ CD38 /CD22+/CD23low/FM low C7+/CD43- 113 4 87 селезен 0,0008 κ ка CD19+/CD5+/CD20+ CD38 нодулярны /CD22+/CD23- high й /FMC7+/CD435 41 кровь 0,54 κ low CD19+/CD5+/CD20+ CD38 /CD22+/CD23low/FM high C7low/CD436 54 кровь 0,087 CD19+/CD5+/CD20+ CD38 /CD22+/CD23low/FM high C7+/CD43low 7 63 л/у 0,74 CD19+/CD5low/CD2 CD38 диффузный 0+/CD22+/CD23low/ high (ЛКМЗ?) FMC7low/CD43low 8 н/д кровь 1,807 κ CD19+/CD5- CD38 /CD20+/CD22+/CD23 high -/FMC7low/CD439 н/д кровь 3,22 н/д н/д н/д 10 64 кровь 0,25 CD19+/CD5+/CD20+ CD38 /CD22+/CD23low/FM low C7-/CD4311 56 кровь 0,089 CD19+/CD5+/CD20lo CD38 w/CD22+/CD23low/F high MC7-/CD43+ 12 71 кровь 0,047 λ low CD19+/CD5+/CD20lo CD38 w/CD22+/CD23- high /FMC7-/CD43+ 13 46 кровь 0,55 κ low CD19+/CD5+/CD20+ CD38 /CD22+/CD23+/FMC high 7low/CD43low 14 53 кровь 5,64 κ CD19+/CD5low/CD2 CD38 114 0+/CD22+/CD23- low /FMC7-/CD4315 59 кровь 0,26 κ CD19+/CD5low/CD2 CD38 0+/CD22+/CD23low/ low FMC7-/CD4316 47 кровь 0,042 CD19+/CD5+/CD20lo CD38 w/CD22+/CD23low/F high MC7-/CD43+ 17 62 кровь 0,018 κ CD19+/CD5+/CD20+ CD38 /CD22+/CD23low/FM high C7-/CD43low 18 68 костны 0,0006 κ й мозг CD19+/CD5+/CD20+ CD38 /CD22+/CD23low/FM low C7low/CD4319 63 кровь 0,011 κ CD19+/CD5+/CD20+ CD38 /CD22+/CD23- low /FMC7-/CD43low 20 55 кровь 0,027 CD19+/CD5low/CD2 CD38 0+/CD22+/CD23- low /FMC7-/CD4321 75 кровь 2,18 κ CD19+/CD5+/CD20lo CD38 w/CD22+/CD23- high /FMC7-/CD4322 н/д кровь 1,14 κ low CD19+/CD5low/CD2 CD38 0+/CD22+/CD23- low /FMC7low/CD4323 47 кровь 0,004 CD19+/CD5+/CD20+ CD38 /CD22+/CD23low/FM high C7+/CD43- 115 24 73 кровь 0,0005 CD19+/CD5+/CD20+ CD38 /CD22+/CD23- low /FMC7-/CD43+ Приложение 4. Таблица 13: Описание выборки образцов реактивной лимфоидной ткани. CCND1 – относительное нормализованное количество кДНК гена циклина D1, н/д – нет данных. № Возраст Тип CCND ткани 1 Клон Иммунофе Уровен Гистологический нотип ь вариант опухоли активац ии 1 64 селезен 0,0003 Не ка 2 выявлен Не выявлен CD38 гистологическая high картина соответствует реактивному процессу 2 3 39 26 кровь 0,0007 Не 8 выявлен селезен 0,0001 н/д ка 8 Не выявлен CD38 high Не выявлен н/д гистологическая картина соответствует реактивному процессу 4 37 селезен 0,0003 Не ка 9 выявлен Не выявлен CD38 гистологическая high картина соответствует реактивному процессу 5 60 кровь 0,0002 Не выявлен Не выявлен CD38 high 116 6 н/д селезен 0,0002 Не ка 7 выявлен Не выявлен CD38 гистологическая high картина соответствует реактивному процессу 7 21 селезен 0,0046 н/д Не выявлен н/д ка гистологическая картина соответствует реактивному процессу 8 58 селезен 0,0002 ка 2 н/д Не выявлен н/д гистологическая картина соответствует реактивному процессу 9 49 селезен 0,0004 ка 3 н/д Не выявлен н/д гистологическая картина соответствует реактивному процессу 10 26 селезен 0,0007 ка 5 н/д Не выявлен н/д гистологическая картина соответствует реактивному процессу 11 37 селезен 0,0003 н/д Не выявлен н/д ка гистологическая картина соответствует реактивному процессу 12 59 селезен 0,0004 н/д Не выявлен н/д гистологическая 117 ка картина соответствует реактивному процессу 13 23 селезен 0,0003 ка 3 н/д Не выявлен н/д гистологическая картина соответствует реактивному процессу 14 52 селезен 0,001 н/д Не выявлен н/д ка гистологическая картина соответствует реактивному процессу 15 39 селезен ка 0,0001 Не выявлен Не выявлен CD38 гистологическая high картина соответствует реактивному процессу
