Федеральное государственное бюджетное учреждение «Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза»
advertisement
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова» Минздрава России На правах рукописи КАЧЕГУРА Лариса Викторовна ПРОГНОЗИРОВАНИЕ ПОСЛЕОПЕРАЦИОННОЙ ВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ РЕАКЦИИ В ХИРУРГИИ ВРОЖДЕННЫХ КАТАРАКТ У ДЕТЕЙ 14.01.07 – Глазные болезни 14.03.03 – Патологическая физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, С.А. Борзенок доктор биологических наук, профессор, С.В. Петричук Москва - 2015 1 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ………………………………………………………5 ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………….7 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Современные аспекты диагностики и лечения врожденных катаракт у детей………………………………….…..…14 1.1.Проблема врожденных катаракт на современном этапе развития офтальмологии……………………………………………………………………14 1.1.1.Этиология врожденных катаракт…………………………………………14 1.1.2.Клинико-функциональная характеристика врожденных катаракт…….16 1.1.3.Лечение врожденных катаракт…………………………………..………17 1.2.Послеоперационные осложнения.………………………………………….21 1.2.1.Патогенез послеоперационной воспалительной реакции у детей……...21 1.2.2.Виды послеоперационных осложнений……………………………….…24 1.2.3.Методы профилактики и коррекции послеоперационной воспалительной реакции…………………………………………………………………………...25 1.2.4.Факторы риска послеоперационной воспалительной реакции………...28 1.3.Информативность иммунологических показателей в офтальмологии…..30 1.3.1.Иммунологические показатели в прогнозировании воспалительных осложнений в хирургии катаракты…………………………………………….30 1.3.2.Диагностические возможности исследования популяционного состава лимфоцитов периферической крови……………..……………………………..33 1.3.3.Диагностические возможности исследования митохондриальной дисфункции лимфоцитов периферической крови………………………..……37 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ…………………………………………..43 2.1.Общая характеристика доклинических методов исследования…………..44 2.2.Общая характеристика клинического материала………………………….45 2.3.Клинико-функциональные методы обследования…………………..…….46 2.4.Иммуноцитохимические методы исследования…………………………..52 2 2.4.1.Метод количественного цитохимического определения активности сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитах периферической крови…………..…...52 2.4.2.Цитоморфоденситометрический метод определения активности сукцинатдегидрогеназы………………………………………………………......54 2.4.3.Метод проточной цитофлуориметрии…………………………………......55 2.5.Материал экспериментальной части исследования (постановка пробы с дексаметазоном in vitro)…………………………………………………………58 2.6.Статистические методы………………………………………………….….60 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ПРЕДОПЕРАЦИОННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ….62 3.1.Результаты изучения анамнестических сведений в выявлении иммунокомпрометированных детей до операции……………………………..62 3.2.Результаты исследования иммунофенотипа лимфоцитов периферической крови у детей с врожденными катарактами……………………………..……69 3.2.1.Результаты исследования иммунофенотипа у детей 2-5-ти лет……….69 3.2.2.Результаты исследования иммунофенотипа у детей 6-14-ти лет……....77 3.3.Результаты исследования показателей активности сукцинатдегидрогеназы у детей с врожденными катарактами.…………………………………….…...82 3.3.1.Результаты исследования активности сукцинатдегидрогеназы в общей популяции лимфоцитов…………………………………………………………82 3.3.2.Результаты исследования активности сукцинатдегидрогеназы в основных и малых популяциях лимфоцитов у детей 2-5-ти лет………………………...89 3.3.3.Результаты исследования активности сукцинатдегидрогеназы в основных и малых популяциях лимфоцитов у детей 6-14-ти лет…………………………93 3.4.Экспериментальное обоснование противовоспалительной терапии…....97 ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ КЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ..……....110 4.1.Особенности течения раннего послеоперационного периода………...….110 4.2.Результаты клинико-функциональных исследований глаз у детей с врожденными катарактами……………………………………………….…….111 3 4.3.Результаты исследование влияния особенностей техники хирургического вмешательства и течения интраоперационного периода на характер и степень выраженности воспалительной реакции…………………………..…………121 4.4.Терапия раннего послеоперационного периода…………………………...123 ГЛАВА 5. КРИТЕРИИ ВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ ПРОГНОЗА РЕАКЦИИ У ПОСЛЕОПЕРАЦИОННОЙ ДЕТЕЙ С ВРОЖДЕННЫМИ КАТАРАКТАМИ………………………………….…………………………....125 ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………...…………………………………………………148 ВЫВОДЫ……………………………………………………………………….168 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ………………………………………171 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………………..172 4 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АТФ – аденозинтрифосфат АФК – активные формы кислорода ВГД – внутриглазное давление ВПГ – вирус простого герпеса ВЭБ – вирус Эпштейн-Барра ГОБ – гематоофтальмический барьер ДС – диагностическая специфичность ДЧ – диагностическая чувствительность ИОЛ – интраокулярная линза ИОП – интегральная оптическая плотность МАРС – малые аномалии развития сердца ОРВИ – острая респираторно-вирусная инфекция ПВР – послеоперационная воспалительная реакция ПЖК – подкожно-жировая клетчатка Раствор BSS+ - сбалансированный ирригационный раствор СДГ – сукцинатдегидрогеназа ЦМВ - цитомегаловирус ЧБД – часто болеющие дети α-ГФДГ – α-глицерофосфатдегидрогеназа ACAID (anterior chamber associated immune deviation) – переднекамерноассоциированное иммунное отклонение CD (cluster of differentiation) – кластер дифференцировки EGF – эпидермальный ростовой фактор FAD – флавинадениннуклеотид FADH2 – восстановленная форма флавинадениннуклеотида IL – интерлейкин МНС (Major Histocompatibility Complex) – главный комплекс гистосовместимости 5 NK-клетки – натуральные клетки-киллеры TGF – трансформирующий фактор роста Tfh – фолликулярные Т-хелперы Th – Т-хелперы TNF – фактор некроза опухоли Treg – регуляторные Т-лимфоциты S-Аг сетчатки – S-антиген сетчатки 6 ВВЕДЕНИЕ Врожденная катаракта является одной из самых актуальных проблем детской офтальмологии (Боброва Н.Ф., 2010; Althomali T., 2012, Сидоренко Е.И., 2013; Randrianotahina H.C., Nkumbe H.E., 2014). Раннее хирургическое лечение – основной метод профилактики обскурационной амблиопии (Азнабаев Р.А. и соавт., 2009; Нероев В.В., 2009; Васильев А.В. и соавт., 2010, 2011; Кононов Л.Б., 2010; Althomali Т., 2012). Несмотря на постоянное совершенствование микрохирургических технологий, врожденная катаракта занимает 3-е место в структуре детской инвалидности по офтальмопатологии (Либман Е.С. и соавт., 2012). Одной из причин отсутствия высокого зрения после хирургического лечения является развитие осложнений в раннем и позднем послеоперационном периоде, которые часто требуют повторных вмешательств (Круглова Т.Б., Кононов Л.Б., 2009, Кононов Л.Б., 2010; Maedel S. et al., 2013). У детей с врожденными катарактами частота воспалительных осложнений в раннем послеоперационном периоде составляет 5,5-48,1% (Нероев В.В., 2009; Althomali T., 2012). Причинами высокой частоты воспалительных реакций у детей в раннем послеоперационном периоде являются анатомо-топографические особенности глаза, техника экстракции катаракты и реактивность иммунной системы (Васильев А.В. и соавт., 2010; Кононов Л.Б., 2010; Harminder S.D. et al., 2012). Наиболее частым послеоперационным осложнением является вторичная катаракта, которая по данным разных авторов составляет от 20,0 до 95,0% (Круглова Т.Б., Кононов Л.Б., 2009; Сидоренко Е.И., 2013; Borghol-Kassar R. et al., 2012; Harminder S.D. et al., 2012; Ilhan O. et al., 2013). Развитие вторичной катаракты с наличием фиброза задней капсулы у детей наиболее часто обусловлено последствиями воспаления в раннем послеоперационном периоде (Егоров В.В. и соавт., 2009; Круглова Т.Б., Кононов Л.Б., 2009, Ozkurt Y.V. et al., 2009; Dixit N.V. et al., 2010; Gupta A., 2011; Bannale S.G. et al., 2012; Vasavada V.A., 2012; Maedel S. et al., 2013; Bar-Sela S.M. et al., 2014). Ранняя диагностика и целенаправленное 7 воздействие на патофизиологические механизмы формирования воспалительной реакции в хирургии врожденных катаракт способны предотвратить развитие осложнений. Существующие в настоящее время прогностические критерии, основанные на анамнестических данных, исследовании тканеспецифических антител и цитокинов в слезной жидкости и сыворотке крови являются недостаточными и неоднозначными (Хватова А.В. и соавт., 1984; Круглова Т.Б. и соавт., 1995; Хватова А.В. и соавт., 1995; Кинзябулатова О.Ю., 2004; Азнабаев Р.А. и соавт., 2009, Егоров В.В. и соавт., 2009; Судовская Т.В., 2011; Архипова Л.Т. и соавт., 2012; Кочергин С.А. и соавт., 2012; Lewis A.C., 2013). Потребность в разработке прогностических критериев развития послеоперационной воспалительной реакции у детей с врожденными катарактами обусловлена необходимостью индивидуального подхода в назначении противовоспалительной терапии как до операции, так и в послеоперационном периоде. Практически неизученной остается роль реактивности иммунной системы в развитии воспалительных реакций раннего послеоперационного периода. В последние годы, в связи с появлением новых диагностических методов, все большее значение в офтальмологии приобретает исследование клеточного иммунитета. Выявлена высокая диагностическая и прогностическая ценность показателей популяционного состава лимфоцитов в развитии офтальмопатологии (Балашова Л.М. с соавт., 2012; Зурочка А.В. с соавт., 2012). Кроме того, в ряде работ установлена высокая информативность показателей энергетического обмена лимфоцитов, отражающая функциональную активность иммунокомпетентных клеток у пациентов до и после офтальмологических операций (Комах Ю.А., 1995; Джавришвили Г.В., 2004; Тонаева Х.Д., 2014). Таким образом, комплексная оценка клинико-анамнестических и иммунологических показателей является актуальной в связи с возможностью 8 выявления новых прогностических критериев развития послеоперационных воспалительных реакций у детей с врожденными катарактами. Цель исследования Разработка критериев прогноза возникновения послеоперационных воспалительных реакций у детей с врожденными катарактами. Задачи исследования 1. Определить информативность анамнестических данных в прогнозе развития послеоперационной воспалительной реакции при хирургическом лечении врожденных катаракт у детей. 2. Выявить наиболее информативные показатели иммунофенотипа лимфоцитов периферической крови в прогнозе развития послеоперационной воспалительной реакции в хирургии врожденных катаракт у детей. Оценить 3. информативность определения активности сукцинатдегидрогеназы в популяциях лимфоцитов в прогнозе развития послеоперационной воспалительной реакции у детей с врожденными катарактами. 4. Изучить в эксперименте глюкокортикортикостероидного in vitro препарата эффект (дексаметазон) воздействия на уровень экспрессии поверхностных рецепторов Т-, В-лимфоцитов, NK-клеток и интенсивность энергетических процессов в них. 5. Изучить клинические особенности течения раннего послеоперационного периода и формирования воспалительных реакций у детей разного возраста после выполнения аспирации катаракты с имплантацией ИОЛ. 6. Разработать алгоритмы прогноза формирования воспалительных реакций у детей разного возраста с врожденными послеоперационном периоде. 9 катарактами в раннем Научная новизна исследования 1. Проведена комплексная оценка анамнестических данных у детей с врожденными показатели катарактами для и выявления установлены риска наиболее развития информативные послеоперационной воспалительной реакции: сумма баллов инфекционного синдрома, сумма баллов аллергического синдрома, а также токсикоз I-ой половины беременности. 2. Впервые оценена информативность иммунофенотипирования лимфоцитов периферической крови у детей с врожденными катарактами и выявлена значимость лимфоцитов и определения содержания в Th17-лимфоцитов цитотоксических прогнозе Т- послеоперационной воспалительной реакции у детей с врожденными катарактами. 3. Впервые исследована активность сукцинатдегидрогеназы в популяциях лимфоцитов периферической крови у детей с врожденными катарактами, показана информативность цитоморфоденситометрических и иммуноцитохимических показателей активности СДГ в прогнозе развития послеоперационной воспалительной реакции. 4. В эксперименте in vitro доказана различная чувствительность популяций лимфоцитов к действию дексаметазона; наибольшие изменения выявлены в Т-лимфоцитах и NK-клетках; устойчивыми к действию препарата являются Th17- и В-лимфоциты. 5. Впервые на основании наиболее значимых анамнестических и иммунологических показателей разработаны алгоритмы прогноза послеоперационной воспалительной реакции у детей разного возраста с врожденными катарактами. 10 Практическая значимость 1. Определены наиболее информативные анамнестические признаки, позволяющие выявлять пациентов из группы риска по развитию послеоперационной воспалительной реакции. 2. Обнаружение у детей 2-5-ти лет снижения относительного количества цитотоксических Т-лимфоцитов менее 26,4%, а у детей 6-14-ти лет – увеличения абсолютного количества Th17-лимфоцитов более 190 кл/мкл является прогностически неблагоприятным признаком, позволяющим предположить развитие послеоперационной воспалительной реакции у пациентов с врожденными катарактами. 3. Снижение активности СДГ в общей популяции лимфоцитов периферической крови у детей 2-5-ти лет (площадь гранул) менее 11,7 усл. ед, у детей 6-14-ти лет – интегральной оптической плотности гранул менее 905 усл.ед. является прогностически неблагоприятным признаком, позволяющим предположить развитие послеоперационной воспалительной реакции у пациентов с врожденными катарактами. 4. Предложенные алгоритмы позволяют прогнозировать развитие послеоперационной воспалительной реакции у детей разного возраста с врожденными катарактами перед проведением хирургического лечения и выделить пациентов, нуждающихся в дополнительной предоперационной подготовке. Основные положения, выносимые на защиту 1. Оценка иммунофенотипа лимфоцитов периферической крови и активности СДГ в популяциях лимфоцитов у детей с врожденными катарактами является информативной в прогнозе развития послеоперационной воспалительной реакции. 2. На основе комплексной оценки анамнестических и иммунологических показателей разработаны алгоритмы, позволяющие с вероятностью 90% 11 прогнозировать развитие послеоперационной воспалительной реакции у детей с врожденными катарактами. Внедрение в практику Разработанные алгоритмы прогноза возникновения послеоперационных воспалительных реакций внедрены в научно-клиническую и практическую деятельность головной организации ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России (Москва), а также включены в курс лекций Научно-педагогического центра головной организации ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России (Москва). Апробация работы Основные положения диссертации доложены и обсуждены на следующих конференциях: на V Всероссийской научно-практической конференции «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2012), на VII Международной научно-практической конференции «Пролиферативный синдром в офтальмологии» (Москва, 2012), на Научно-практической конференции офтальмологов с международным участием «Филатовские чтения» (Одесса, 2013), на VIII и IX Всероссийской научной конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы офтальмологии» (Москва, 2013, 2014). Публикации По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 3 в журналах, рекомендованных ВАК для опубликования основных научных результатов по теме диссертации. 12 Объем и структура работы Текст диссертации изложен на 200-х страницах, содержит 54 таблицы и 37 рисунков. Работа состоит из введения и 5-ти глав, включающих обзор литературы, описание материалов и методов исследований, трех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Список литературы включает 276 источников, из них 100 отечественных и 176 иностранных. 13 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Современные аспекты диагностики и лечения врожденных катаракт у детей 1.1. Проблема врожденных катаракт на современном этапе развития офтальмологии В настоящее время, несмотря на совершенствование микрохирургической техники в детской офтальмологии, инвалидность вследствие врожденных катаракт в России по последним данным у детей составляет 17% и занимает 3е место в структуре детской офтальмопатологии [53]. Кроме того, слепота вследствие врожденных катаракт и слабовидения в разных странах мира составляет от 1-го до 6-ти случаев на 10000 детского населения [34, 74, 91, 150], от 5-ти до 15-ти на 10000 родившихся в развивающихся странах [108]. Ежегодно в мире диагностируется от 20000 до 40000 врожденных катаракт [108]. 1.1.1. Этиология врожденных катаракт Причины возникновения врожденных катаракт различны. Считают, что наследственная катаракта составляет до 25-33% [95, 201], катаракта, возникшая вследствие внутриутробного инфицирования, – до 38% [210], идиопатическая – до 40% всех врожденных катаракт [34, 95, 210]. Аутосомно-доминантный тип наследования встречается в 75% случаев, но возможен также аутосомно-рецессивный, сцепленный с Х-хромосомой тип наследования [16, 44, 115]. Наследственные формы катаракт, как правило, выявляются у нескольких членов одной семьи [16]. На сегодняшний день выявлено более 25-ти генов разных хромосом, которые связывают с врожденной катарактой [156]. Наиболее часто врожденная катаракта развивается вследствие мутации генов, кодирующих белки хрусталика. По данным Rahi J.S. et al. [220], 27% двусторонних изолированных врожденных катаракт и 2% односторонних в основе имеют генетические нарушения. Врожденная катаракта может быть следствием изменений хромосомного 14 набора и встречаться при синдроме Дауна - трисомия по 21-ой хромосоме, при синдроме Эдвардса - трисомия по 18-ой хромосоме, при синдроме Патау трисомия по 13-ой хромосоме, при синдроме Шершевского-Тернера отсутствие одной половой хромосомы, кариотип 45Х0 [94, 107, 139]. Врожденная катаракта может сопровождать ряд синдромов с множественным поражением органов и тканей, в частности, синдром Лоу (окуло- цереброренальный синдром, тип наследования – аутосомно-рецессивный, сцепленный с полом), синдром Ротмунда-Томсона (врожденная пойкилодермия, тип наследования – аутосомно-рецессивный), врожденный ихтиоз (тип наследования – аутосомно-рецессивный), синдром Шефера (врожденная эктодермальная полидисплазия, тип наследования – аутосомнодоминантный), болезнь Блоха-Сульцберга (инфантильный пигментный дерматоз, тип наследования – аутосомно-доминантный), синдром МаринескуСъегрена (сочетание мозжечковой атаксии, двусторонней врожденной катаракты и олигофрении, тип наследования – аутосомно-рецессивный), синдром Халлермана-Штрайфа (черепно-лицевая дисморфия, окуло- мандибуло-фациальный синдром, тип наследования – не установлен) [89, 94, 107, 139]. Среди причин ненаследственных катаракт наибольшее значение придают инфекционным заболеваниям матери в период эмбриогенеза хрусталика на 37-ой неделе беременности (краснуха, токсоплазмоз, цитомегаловирусная инфекция, вирус простого герпеса, ветряной оспы, гриппа и сифилис) [16, 55, 89, 221], приему лекарственных препаратов во время беременности (кортикостероиды, противозачаточные средства, витамин А), воздействию ионизирующего излучения, болезням обмена веществ у матери (сахарный диабет), интоксикациям алкоголем [44, 89, 107]. Большинство вирусов проникают через плацентарный барьер и, кроме врожденной катаракты, определяют развитие других аномалий. 15 1.1.2. Клинико-функциональные особенности врожденных катаракт Клинические формы врожденных катаракт отличаются значительным многообразием в зависимости от локализации, размера и интенсивности помутнения, наличия или отсутствия сопутствующей патологии глаз. От определения клинической формы катаракты во многом зависит лечебная тактика и прогноз заболевания [16, 44]. На сегодняшний день общепринятой в России является классификация Хватовой А.В. (1982) [89]. В соответствии с данной классификацией катаракты разделяют по характеру поражения на односторонние капсулярные, и двусторонние, по капсуло-лентикулярные локализации и помутнения лентикулярные, по – на степени помутнения хрусталика – на частичные и полные. По клинической форме различают полные, зонулярные (слоистые), центральные, полурассосавшиеся, пленчатые, полярные (переднюю и заднюю), атипичные, веретенообразные, передние аксиальные, эмбриональные звездчатые, катаракты швов, ядерные порошкообразные, коронарные, точечные, коралловидные и другие катаракты. Одни авторы описывают как наиболее часто встречающиеся – зонулярные катаракты (до 71,3%) [16, 34, 89], другие – полные [37] и атипичные [44]. Врожденная катаракта может представлять собой как изолированное поражение хрусталика, так и сочетаться с другой патологией органа зрения, в частности, с косоглазием, нистагмом, микрофтальмом, микрокорнеа, колобомой радужки и хориоидеи, аниридией, помутнением стекловидного тела, атрофией зрительного нерва, изменением век, изменением слезных путей [16, 89]. По современным данным, сенситивный период развития зрения приходится на период от второго до шестого месяцев жизни ребенка [16, 77]. Раннее удаление катаракты является необходимым условием профилактики развития обскурационной амблиопии [144, 145, 150, 118, 234, 271]. Тем не менее, врожденная катаракта не обязательно отрицательно влияет на формирование зрения, если помутнение локализовано на периферии хрусталика [16, 89]. В 16 случае, если помутнение находится в оптической зоне, это, как правило, вызывает амблиопию различной степени тяжести [173]. Врожденная катаракта чаще обнаруживается при рождении или в первые 10 лет жизни [228]. 1.1.3. Лечение врожденных катаракт Положение и размер центрального помутнения, сроки его появления и прогрессирования, общее состояние ребенка являются определяющими в формулировании показаний к хирургическому лечению [16, 173]. Считается, что хирургическое лечение в первые 6 недель жизни исключает формирование амблиопии, тем не менее, в этом возрасте возникает наибольшее количество осложнений, поэтому оптимальный срок хирургического лечения врожденной катаракты составляет 6-8 недель жизни [118, 142]. Ряд авторов при плотных односторонних катарактах указывают на необходимость операции в первые 6 недель жизни, при двусторонних катарактах – после 8-й недели жизни [118, 192]. Вопрос о сроках хирургического лечения решается индивидуально и зависит от этиологии и морфологии катаракты, остаточной остроты зрения и общего состояния ребенка. Учитывая все особенности врожденных катаракт, Бобровой Н.Ф. была представлена клинико-хирургическая классификация катаракт [16], в соответствии с которой, в зависимости от клинической формы катаракты, наличия сопутствующей патологии органа зрения и организма, остаточных зрительных функций и состояния задней капсулы определены сроки и вид хирургического вмешательства. Так, при зонулярных катарактах автор предлагает в возрасте 5-6-ти лет выполнять аспирацию-ирригацию через передний капсулорексис с эндокапсулярной имплантацией гибких интраокулярных линз (ИОЛ), с сохранением прозрачной задней капсулы; при тотальных помутнениях хрусталика в возрасте 1-6-ти месяцев – аспирациюирригацию через передний капсулорексис с эндокапсулярной имплантацией гибких ИОЛ, с сохранением задней капсулы при условии ее прозрачности, при 17 атипичных катарактах с наличием помутнения задней капсулы рекомендуется в «раннем грудном возрасте» «сложное вмешательство на передней капсуле для формирования переднего капсулорексиса, восстановление капсульного мешка, внутрикапсульная имплантация ИОЛ, первичное вскрытие задней капсулы с передней витрэктомией» [16]. Но и сегодня в развивающихся странах все еще используется экстракапсулярная экстракция катаракты как с имплантацией ИОЛ, так и без нее [146, 181, 225]. Современным стандартом хирургического лечения врожденной катаракты является аспирация. Факоаспирация обусловлена анатомическими особенностями детского глаза, а именно: отсутствием ядра хрусталика, мягкостью хрусталикового вещества, прочностью цинновых связок, наличием витреокапсулярных сращений, эластичностью задней капсулы [89, 145, 166, 234, 265, 266]. В настоящее время малая травматичность операции обеспечивается использованием вискоэластиков, малых роговичных разрезов для имплантации ИОЛ (1,5-2,0 мм), непрерывного переднего кругового капсулорексиса, аппаратной аспирационно-ирригационной техники, современных моделей ИОЛ [41, 145, 205, 272, 274]. Некоторые авторы рекомендуют детям до 6-ти лет выполнять аспирацию, заднюю капсулотомию, переднюю витрэктомию и внутрикапсульную имплантацию ИОЛ [102, 141, 143, 157, 163, 168, 180, 205, 238, 258]. Для стабилизации капсульного мешка Ventura M.C. с соавт. используют внутрикапсульное кольцо диаметром 12,5 мм у детей раннего возраста [258]. Cпорным является вопрос о сохранении задней капсулы и необходимости передней витрэктомии. Так, ряд специалистов рекомендуют сохранение задней капсулы при ее прозрачности [16, 145, 179, 223, 272], другие – обязательное первичное выполнение заднего капсулорексиса или задней капсулотомии [103, 180, 187, 223, 257]. Определяющим фактором служит возраст ребенка. В последние годы сформировалась точка зрения, что 18 выполнение первичного заднего капсулорексиса и передней витрэктомии детям старше 6-10-ти лет нецелесообразно, учитывая значительное уменьшение частоты вторичных катаракт у детей этой возрастной группы и наличие у данных методик недостатков в виде продления хирургического времени, потребности в высокой квалификации хирурга, возможного развития грыжи стекловидного тела, дислокации ИОЛ в полость стекловидного тела, повышенным риском кистозного отека макулы и отслойки сетчатки [167]. Обязательным считают выполнение первичного заднего капсулорексиса у детей до 6-ти лет, частота помутнения задней капсулы у которых составляет до 95-100%. Существует неоднозначная точка зрения о целесообразности передней витрэктомии при первичном заднем капсулорексисе. Так, большинство публикаций содержат данные о необходимости передней витрэктомии у детей при выполнении первичного заднего капсулорексиса или задней капсулотомии [102, 141, 143, 147, 157, 163, 168, 180, 205], другие утверждают о нецелесообразности данной манипуляции, аргументируя это одинаковой частотой помутнения оптических сред вследствие выраженной пролиферации эпителиальных клеток хрусталика у детей с наличием и без передней витрэктомии [121]. Сторонники передней витрэктомии указывают на ее необходимость, так как передний гиалоид – это основа для миграции и разрастания эпителиальных клеток хрусталика, но, даже в отсутствии миграции эпителиальных клеток хрусталика, помутнение стекловидного тела может быть результатом первичного ответа на контакт между передней гиалоидной мембраной и оптической частью ИОЛ [256]. Кроме того, в последние годы появились исследования, описывающие технику первичного заднего капсулорексиса с захватом оптической части ИОЛ, называемую «buttoning-in» или «buttonholing» [151, 173, 200]. Впервые эффект захвата оптической части ИОЛ без проведения передней витрэктомии был выполнен и описан Gimbel и DeBroff в 1994 году [152]. Преимущества данной техники объясняются тем, что края переднего и заднего рексиса 19 «слипаются и запечатываются» на передней поверхности оптической части ИОЛ, за исключением области перехода оптики в гаптику, что препятствует миграции эпителиальных клеток хрусталика по задней поверхности ИОЛ и передней гиалоидной мембране при условии ее сохранения. В данном случае эпителиальные клетки хрусталика будут регенерировать и мигрировать только в пространство между передней и задней капсулой [151]. В противоположность этому, Коch D.D. и Kohnen T. [175] сообщили, что у 4-х из 5-ти пациентов, перенесших оптический захват без передней витрэктомии развиваются вторичные катаракты через 2,5 года после операции. Другие исследования показали, что передняя витрэктомия необходима, когда проводится задний капсулорексис с оптическим захватом, особенно у детей до 5-ти лет [254]. Оптимальным методом коррекции послеоперационной афакии является ИОЛ. В последние годы наиболее часто используют акриловые ИОЛ для имплантации у детей, которые являются более биосовместимыми, чем ИОЛ из полиметилметакрилата (ПММА), и позволяют использовать малые разрезы для имплантации. При имплантации акриловых ИОЛ реже образуются вторичные катаракты [109, 224, 258]. Имплантация ИОЛ стала непременным этапом удаления катаракты для детей старшего возраста, но все еще очень спорной у детей до двух лет [122, 123, 151, 174, 238, 270, 271]. Среди проблем первичной имплантации ИОЛ у детей основные трудности обусловлены выбором подходящей оптической силы ИОЛ, небольшим размером детского глаза с небольшим капсульным мешком [165, 187], повышенной реактивностью тканей [253]. Gordon R.A. и др. обнаружили, что основные изменения длины и рефракции глаза происходят в первые два года жизни [154, 270, 271]. Это делает имплантацию ИОЛ у детей первых двух лет жизни более непредсказуемой в отношении прогнозирования рефракции во взрослом возрасте [148, 245]. Но с каждым годом растет число сторонников имплантации ИОЛ в первые два года жизни [44, 77, 165, 209, 268]. Расчет 20 ИОЛ проводится по протоколу, в основе которого лежит достижение ребенком эмметропии к 4-летнему возрасту, поэтому при имплантации ИОЛ детям первого года жизни производят расчет на гиперметропию в 6,0 диоптрий [113, 210]. Для расчета ИОЛ наиболее часто используют формулы Holliday II или SRK/T [113, 210]. Кроме того, существуют данные об опережающем росте глаз у детей до 14-ти лет, имеющих аномалию рефракции на момент операции, не соответствующую возрастной норме, после хирургического лечения катаракты с имплантацией ИОЛ [35]. 1.2. Послеоперационные осложнения Несмотря на постоянное совершенствование хирургических технологий в лечении врожденных катаракт, осложнения, возникающие в различные сроки послеоперационного периода, часто снижают послеоперационный оптический эффект и порой требуют повторных вмешательств. 1.2.1. Патогенез послеоперационной воспалительной реакции у детей Проблема патогенеза послеоперационной воспалительной реакции (ПВР) у детей с врожденными катарактами и сегодня остается недостаточно изученной. В середине ХХ века английский биолог Medawar Р. обнаружил, что внедрение чужеродных тканей в некоторые отделы глаза не вызывает обычный иммунный ответ, что позволяет им выживать там неограниченно долго [149, 198]. На основании этого было предложено понятие «иммунной привилегии» глаза. Иммунная привилегия эволюционно создана для тканей, не способных к регенерации, и не позволяет при появлении патогена нарушить функции специализированных тканей [240]. Формирование и поддержание «иммунной привилегии» глаза обеспечивается следующими факторами [240]: 21 - гематоофтальмический барьер (ГОБ) (сосуды радужки, эпителий цилиарного тела, пигментный эпителий и сосуды сетчатки) препятствует проникновению в глаз эффекторных Т-клеток и антител [46]; - отсутствие во внутренних отделах лимфодренажной системы; - стромальные клетки глаза редко экспрессируют молекулы главного комплекса гистосовместимости I (МНС I) и совсем не экспрессируют молекулы МНС II; - экспрессия на поверхности интраокулярных клеток Fas-лиганда и других мембранных ингибиторов предотвращает компонентов иммунозависимый активации клеточный лизис. комплемента Fas-лиганд при нарушении ГОБ противодействует образованию каскада комплемента; - «иммунное отклонение, связанное с передней камерой» - ACAID («anterior chamber associated immune deviation») не позволяет развиться выраженной воспалительной реакции; - внутриглазная жидкость, как было показано, ингибирует ряд молекул, участвующих в воспалении, в частности, клеток и CD4+Т-клетки, полиморфноядерные нейтрофилы, макрофаги, натуральные клетки-киллеры (NK-клетки) и компоненты комплемента C1Q и С3; - эндотелий роговицы образует полупроницаемый барьер между передней камерой и стромой роговицы. Эндотелиальные клетки секретируют вещества, которые подавляют активацию лимфоцитов и воспаление. Кроме того, эндотелиальные клетки экспрессируют на своей апикальной поверхности молекулы, являющиеся ингибиторами активации комплемента, и способствуют апоптозу CD95+ клеток, которые сталкиваются с ними; - пигментный эпителий, покрывающий заднюю поверхность радужной оболочки и цилиарного тела, и формирующий основу для фоторецепторного слоя сетчатки, является еще одним иммунологическим барьером глаза: плотные соединения в пигментном эпителии сетчатки препятствуют проникновению различных клеток и веществ из хориокапилляров в 22 субретинальное пространство. Тем не менее, некоторые клетки, в частности, активированные Т-лимфоциты, способны проникать через барьер пигментного эпителия и вызывать воспалительные заболевания глаза. Клетки пигментного эпителия и пигментные клетки радужки ингибируют активированные Тлимфоциты в опытах in vitro. Ингибирование Т-лимфоцитов происходит при непосредственном контакте с пигментными клетками радужки, а пигментные клетки цилиарного тела и сетчатки выделяют медиаторы, ингибирующие Тлимфоциты на расстоянии; - структуры глаза синтезируют такие иммуносупрессорные факторы, как нейропептидоподобный α-меланоцитстимулирующий гормон (α-MSH), вазоактивный интестинальный пептид и соматостатин, цитокиноподобный трансформирующий фактор роста β2 (TGF-β2), тромбоспондин, индолеамин 2,3-диоксигеназы, простагландин Е2 (PGE2), кальцитонинсвязанный пептид, свободный кортизол, рецепторный антагонист интерлейкин 1 (IL-1) [46, 240, 244]. Внутриглазное хирургическое вмешательство рассматривается как дозированная проникающая рана глазного яблока, при которой происходит повреждение внутренних оболочек глаза, в частности, сосудистой, в результате чего развивается неинфекционное послеоперационное воспаление [162, 193, 215]. Из поврежденных клеток высвобождаются биологически активные вещества, происходит активация свободных радикалов, оксида азота и миграция в очаг повреждения моноцитов, макрофагов, нейтрофилов, выработка ими провоспалительных цитокинов [134, 170, 239]. Происходит высвобождение арахидоновой кислоты с последующим выделением медиаторов воспаления [140, 169, 239]. При повторных хирургических вмешательствах вследствие повторного повреждения ГОБ происходит формирование иммунного ответа, по типу вторичного, с участием Т-клеток иммунологической памяти [52]. 23 Данные об обеспечении иммунной привилегированности глаза, в том числе ингибиторами активированных Т-клеток, выявленные в последние годы, позволяют предположить необходимость изучения Т-клеточного звена иммунной системы для прогнозирования, профилактики и патогенетически обоснованного лечения осложнений, возникающих в раннем и позднем послеоперационном периоде. 1.2.2. Виды послеоперационных осложнений Ранние послеоперационные осложнения возникают в первые 6-10 дней послеоперационного периода [77]. Анализ литературы показывает, что частота воспалительных осложнений в раннем послеоперационном периоде после экстракции катаракты у детей составляет по данным разных авторов от 5,5 до 48,1% случаев [20, 49, 74]. Причина такого явления – выраженная реактивность тканей глаза ребенка, особенно радужки, и повышенная проницаемость сосудов [153]. Кроме того, экссудативная реакция в раннем послеоперационном периоде может развиться вследствие большой длительности оперативного вмешательства, травматизации тканей во время операции, применения большого количества вискоэластиков, ирис- ретракторов [2, 43, 54]. Послеоперационное воспаление характеризуется экссудативной реакцией, миозом, отеком роговицы, явлениями ирита, иридоциклита, болью, светобоязнью, появлением преципитатов на передней поверхности ИОЛ и эндотелии, формированием передних и задних синехий, клеточной реакцией во влаге передней камеры, зрачковым блоком, гиперемией конъюнктивы, инъекцией глазного яблока, повышением внутриглазного давления (ВГД), децентрацией зрачка, иридо- и витреокорнеальными сращениями [44, 48, 158, 226]. Зубарева Л.Н. [35] у детей с катарактой в раннем послеоперационном периоде выделяет 3 вида экссудативной реакции: фибринозный нитевидный экссудат, желевидный экссудат и стерильный гипопион. Послеоперационная 24 воспалительная реакция может быть неинфекционной и инфекционной. Инфекционная воспалительная реакция проявляется эндофтальмитом [6, 7, 29, 111, 160, 203, 226]. При выполнении передней витрэктомии не исключены такие осложнения, как отек макулярной области, повышение ВГД, образование тяжей стекловидного тела, децентрация ИОЛ [126, 173, 189, 216, 260, 263, 267, 274]. К поздним послеоперационным осложнениям относят вторичную катаракту, вторичную глаукому, помутнение передних слоев стекловидного тела при проведении заднего капсулорексиса, отслойку сетчатки. Поздние послеоперационные осложнения могут возникать вследствие особенностей хирургической техники, развития осложнений в раннем послеоперационном периоде, а также их сочетания. Наиболее часто от 20 до 90-95% случаев возникает вторичная катаракта [21, 34, 49, 74, 112, 145]. Выделяют 3 клинических формы «вторичной катаракты» – это послевоспалительный фиброз задней капсулы хрусталика, фиброз задней капсулы хрусталика без клинических признаков воспаления, регенераторную форму, представляющую собой шары Адамюка-Эльшнига, и смешанную форму [21]. Вторичная глаукома у детей, прооперированных на 1-м месяце жизни, развивается в 37-50% случаев в первые 5 лет жизни и в 6-15% у детей, прооперированных в более старшем возрасте, причем, чем меньше возраст ребенка, тем больше риск развития вторичной глаукомы [219, 260]. Факторами риска развития вторичной глаукомы являются микрокорнеа, афакия, развитие воспалительной реакции в раннем послеоперационном периоде, передние синехии и мембрана в области трабекулы [219]. 1.2.3. Методы профилактики и коррекции послеоперационной воспалительной реакции Профилактические реакции мероприятия используются в послеоперационной предопреационном, послеоперационном периодах. 25 воспалительной интраоперационном и В качестве предоперационной профилактики воспалительной реакции в офтальмологии рекомендуют использовать инстилляции кортикостероидов или нестероидных противовоспалительных препаратов за 3-10 дней до хирургического вмешательства детям с полными формами врожденных катаракт и по иммунологическим показаниям, обязательное применение кортикостероидов в виде инстилляций и инъекций при осложненном течении послеоперационного периода на первом оперированном глазу [50, 56]. Кроме того, у взрослых иммунокомпрометированных пациентов при проведении рекератопластики с целью увеличения частоты прозрачного приживления трансплантата используется метаболическая терапия, представленная субстратами и кофакторами цикла Кребса, препаратами, обеспечивающими регуляцию синтеза липидов, стабилизацию клеточных мембран [45]. Такая терапия используется и у детей при хирургической, аллергологической, неврологической патологии [24, 28, 66]. Леванова О.Г. [55] рекомендует при выявлении инфекционного синдрома за 5 дней до операции назначать иммуномодуляторы, а при выявлении аутоиммунного синдрома – цитостатики в низких дозах в течение 10 дней для снижения риска послеоперационной воспалительной реакции при повторной глазной хирургии у взрослых. Все большую популярность получают методы интраоперационной профилактики послеоперационной воспалительной реакции. Среди них – введение кортикостероидов (дексаметазона, триамцинолона) в переднюю камеру или интравитреально [105, 119, 135, 171, 214, 257, 262], введение в переднюю камеру комбинации триамцинолона и гентамицина [237], а также имплантация ИОЛ, обработанных дексаметазоном [179]. Существует опыт введения импланта Озурдекс в капсульный мешок [259]. Проводили исследования введения комбинации триамцинолона с ципрофлоксацином в субтеноново простанство [212]. 26 Для профилактики послеоперационной воспалительной реакции используют гепарин и его низкомолекулярные аналоги, в частности, эноксапарин. Ранее сообщалось о снижении воспалительной реакции при обработке поверхности ИОЛ гепарином [176, 273]. У пациентов при интраоперационном использовании гепарина в качестве одного из компонентов ирригационного раствора уменьшалась клеточная реакция во влаге передней камеры [114, 178, 211, 226, 268]. Ряд исследователей предлагают использовать первичный задний капсулорексис с захватом оптической части ИОЛ, обработанной гепарином, в качестве безопасного и эффективного метода профилактики ПВР в хирургии катаракт у детей [132, 133]. В настоящее время идет изучение эффективности интраоперационного введения аналогов гепарина, в частности, эноксапарина путем добавлении его в ирригационные растворы для профилактики развития послеоперационных воспалительных реакций у детей и взрослых [125, 166, 226]. В России в 2000 г. был предложен метод профилактики послеоперационной воспалительной реакции путем введения гепарина в составе «фармацевтической композиции для расширения зрачка» интраоперационно [85]. Позже, в 2008 году, представлен метод профилактики послеоперационных осложнений у детей при удалении катаракты путем введения 500-1000 ЕД гепарина в субтеноново пространство во время операции [32]. Тем не менее, некоторые исследователи не отмечают достоверных различий в течении послеоперационного периода у детей с врожденными катарактами, где использовали гепарин и эноксапарин интраоперационно, с теми детьми, у которых гепарин не применяли [191, 255]. Для профилактики послеоперационной воспалительной реакции в хирургии катаракт применяют введение рекомбинантного тканевого активатора плазминогена в переднюю камеру [136]. Attarzadeh H. и ряд других авторов [110, 236] рекомендуют офтальмохирургам использовать воздушный пузырь вместо вискоэластиков при имплантации ИОЛ для уменьшения помутнений задней капсулы. Исследование Attarzadeh H. [110] показало, что во всех 27 исследуемых группах, где использовали воздушный пузырь для стабилизации передней камеры, послеоперационная воспалительная реакция была гораздо меньше выражена, чем в случаях, когда применяли только сбалансированный солевой раствор. Предположительно, воздушный пузырь может иметь противовоспалительное действие за счет уменьшения проницаемости гематоофтальмического барьера. По последним данным, уровни оксида азота во влаге передней камеры через 6 дней после операции в случаях с применением пузыря воздуха были достоверно ниже, чем в глазах, где использовали стандартный ирригационный раствор BSS [134]. Кроме того, как было выявлено ранее, воздух не оказывает негативного действия на эндотелий роговицы [208, 252]. Уменьшение воспалительной реакции показали исследования Mansour A.M. с соавт. [194] по введению газового пузыря в витреальную полость. Наиболее доступной и привычной для профилактики послеоперационной воспалительной реакции после хирургического лечения катаракты у детей является назначение комбинации кортикостероидов, антибиотиков, мидриатиков и нестероидных противовоспалительных средств [56, 153]. 1.2.4. Факторы риска послеоперационной воспалительной реакции Детский возраст, офтальмологические операции в анамнезе, хронические конъюнктивиты, измененный эпителий роговицы, наличие эрозий и язв роговицы, окклюзия сосудов глаза, глаукома, увеит, пигментный ретинит, эпиретинальная мембрана, макулярный отек, ювенильный ревматоидный артрит, идиопатический ревматоидный артрит, сахарный диабет, сопутствующие глазные и системные заболевания, микрохирургическая техника экстракции катаракты, тип ИОЛ являются основными факторами риска развития тяжелого внутриглазного воспаления [34, 52, 112, 127, 137, 145, 166, 199]. Травма, воспаление глаз в анамнезе резко повышают проницаемость ГОБ, что часто приводит к осложненному течению раннего и 28 позднего послеоперацинного периода [82]. Наличие у пациентов с катарактой фоновой патологии, очагов хронической инфекции значительно увеличивают риск развития ПВР послеоперационной [14, Кроме 207]. воспалительной того, реакции риск возникновения повышается при ранее развившейся ПВР после операции на другом глазу [52]. Вероятно, наиболее важным фактором риска развития ПВР у детей является возраст на момент операции. Частота послеоперационной воспалительной реакции может быть связана с низкой фибринолитической активностью и незрелостью ГОБ [114]. Keech R.V. и др. [172, 273] обнаружили, что существует значительное увеличение числа осложнений у больных, оперированных в возрасте до 2-х месяцев, по сравнению с детьми, оперированными после этого возраста. Повышение частоты осложнений у детей первых двух месяцев жизни обусловлено выраженным воспалением и рубцеванием в послеоперационном периоде. Стефани Д.В. и Вельтищев Ю.Е. выделяли 5 критических периодов в развитии иммунной системы у детей, которые определяют развитие гиперергической реакции организма в ответ на действие антигена [76]. В связи с этим, очень актуальным является изучение показателей иммунитета для прогнозирования результатов хирургического лечения у детей с врожденными катарактами [30, 60, 77]. Особенности детского организма определяют необходимость выработки мер, которые позволят прогнозировать, а также предотвратить или уменьшить степень выраженности ПВР. Учитывая все факторы риска развития послеоперационных осложнений, необходимо тщательное клиническое обследование пациента перед операцией с целью определения вероятности развития ПВР и своевременного назначения лечения. 29 1.3. Информативность иммунологических показателей в офтальмологии 1.3.1. Иммунологические показатели в прогнозировании воспалительных осложнений в хирургии катаракты Попытки прогнозирования воспалительных осложнений в офтальмологии предпринимались неоднократно. Проводились исследования как местного, так и общего иммунитета при воспалительных, инволюционных заболеваниях глаз [19, 26, 33], при травмах глаза различного генеза [22, 69] и хирургических вмешательствах (при кератопластике, при регматогенных отслойках сетчатки, при антиглаукомных операциях) [51, 68, 75]. Наибольшее количество исследований иммунологических прогнозирования показателей послеоперационных выполнено осложнений при с целью экстракции осложненных катаракт. Изучены уровни S-антигена сетчатки, роговичных, увеальных и хрусталиковых антител в слезной жидкости и сыворотке крови [38, 82]. Учитывая высокую частоту ранних и поздних послеоперационных осложнений у детей с врожденными катарактами, большое внимание было уделено изучению местного и общего иммунного статуса данной категории пациентов [15, 30, 60, 77, 93]. Наибольшую ценность в прогнозировании ПВР у детей представляет одномоментное исследование слезной жидкости и сыворотки крови на антитела к антигенам хрусталика и S-антигенам сетчатки методом реакции исследования пассивной отмечают гемагглютинации вероятность (РПГА) развития [50]. Данные послеоперационных воспалительных осложнений до 89±5% при наличии высоких титров антител к S-Аг сетчатки в слезе и сыворотке крови до операции. Кроме того, проведены исследования изменений гуморального иммунитета в прогнозировании развития послеоперационных осложнений: выявление гипоиммуноглобулинемии классов G, A, M свидетельствует о высоком риске развития воспалительных реакций [60]. 30 Были изучены концентрации цитокинов в сыворотке крови, слезной и внутриглазной жидкостях для прогнозирования возникновения помутнения задней капсулы развития хрусталика у ПВР и детей с врожденными катарактами [30, 41]. Исследование Егорова В.В. с соавт. (2009) [30] основывалось на определении IL-1 в слезной и внутриглазной жидкостях, IL-2 и IL-4 в слезной жидкости у детей от 6-ти месяцев до 3-х лет. Забор биоматериала проводили интраоперационно. Полученные данные характеризовались большим разбросом по частоте выявления и концентрации определяемых цитокинов; выявлена зависимость течения раннего послеоперационного периода от уровня цитокинов. При неосложненном течении раннего послеоперационного периода и отсутствии признаков вторичной катаракты в течении 12-ти месяцев наблюдения отмечали достоверное значение коэффициента IL-2/IL-4, равное 0,96, что соответствовало коэффициенту IL-2/IL-4 у практически здоровых детей. Исследуемые цитокины были обнаружены не у всей группы детей. У детей с развившимся фиброзом задней капсулы хрусталика без наличия признаков воспаления в раннем послеоперационном периоде выявлено увеличение концентрации IL-1 в слезной и внутриглазной жидкостях, превышающей норму в 1,4 раза, уменьшение индекса IL-2/IL-4 до 0,8; из всех определяемых цитокинов только IL-1 определялся в 100% случаев. У детей с наличием нитей фибрина в передней камере и на поверхности ИОЛ IL-1 и IL-2 были обнаружены в 100% случаях. У детей с наличием экссудативной реакции в раннем послеоперационном периоде в исследуемых биологических жидкостях отмечалось увеличение концентрации IL-1 и IL-2, а также увеличение коэффициента IL-2/IL-4. У детей с ареактивным течением раннего послеоперационного периода и развитием гиперрегенераторной формы вторичной катаракты выявлено снижение уровня IL-1; концентрации IL-2 и IL-4 не отличались от показателей соматически здоровых детей. В исследовании Кинзябулатовой О.Ю. (2004) [41] у детей до 5-ти лет 31 проводилось исследование концентрации IL-1β, TNF-α, IL-4, IFN-α, IFN-γ в слезной жидкости и сыворотке крови до и после экстракции катаракты с имплантацией ИОЛ, а также интраоперационно во внутриглазной жидкости. Получен большой разброс концентраций цитокинов. Выявлена тенденция к повышению до операции уровня IL-1β, TNF-α, IL-4, IFN-α, IFN-γ в сыворотке крови, а также повышение исходной концентрации IL-4 в слезной жидкости и уровня IL-4, IL-1β и TNF-α во внутриглазной жидкости у детей с неосложненным течением послеоперационного периода. Кроме того, автор выделяет прогностически значимый признак – соотношение IL-4/IFN-α в слезной жидкости и сыворотке крови, снижение которого ниже 10,0 увеличивает риск развития ПВР [41]. Таким образом, наличие большого разброса концентраций цитокинов, исследуемых в слезной жидкости у детей, снижает их информативность в прогнозе развития ПВР. Определены экссудативной клинико-иммунологические реакции в раннем факторы прогнозирования послеоперационном периоде после экстракции катаракты с имплантацией ИОЛ у взрослых, к которым относят снижение индекса CD4/CD8, низкие показатели Т-хелперов, а также повышенный уровень IL-1β и TNF-α в слезной жидкости [5, 52]. В своих исследованиях Lewis A.C. [183] определяет снижение уровня регуляторных Тклеток и повышение уровня Тh17-клеток как следствие нарушения иммунной привилегии глаза. Кроме того, уделяют большое значение провоспалительному цитокину IL-6, уровень которого повышается после хирургии катаракты и указывает на высокую вероятность развития помутнения задней капсулы, а также является показателем воспаления внутри глаза [183]. Среди медиаторов активации IL-6 обсуждается роль трансформирующего фактора роста (TGF) β, эпидермального ростового фактора (EGF) и матриксных протеиназ в образовании вторичных катаракт [183]. Данные исследования определяют значимость изменений системного 32 иммунитета в развитии патологии глаз и указывают на необходимость выработки новых современных критериев в прогнозе течения заболеваний. 1.3.2. Диагностические возможности исследования популяционного состава лимфоцитов периферической крови Основную функцию в очаге воспаления играют лейкоциты и подвижные макрофаги [98]. Правильная оценка показателей иммунного статуса, как части единого механизма иммунной реактивности, позволяет установить критерии в прогнозе течения и исхода заболевания в разных возрастных группах, подобрать рациональную терапию [17]. В 1986 году Mosmann T. et al. впервые выделяли 2 субпопуляции Тхелперов – Th1 и Th2 [204]. На сегодняшний день в популяции Т-хелперов представлена Th1-лимфоцитами, Th2-лимфоцитами, фолликулярными Тхелперами 1 и 2 типа (Tfh1 и Tfh2), Th17-лимфоцитами, индуцированными регуляторными Т-клетками (iТreg), регуляторными T-клетками 1 типа (Tr1), Тхелперами 9 типа (Th9), (CD4+CD25+FOXP3), Дифференцировка естественными Т-хелперами различных 3 регуляторными типа субпопуляций (Th3) Т-клетками [40, Т-хелперов 47, 120]. зависит от сигнальных цитокинов и транскрипционных факторов. Так, IL-12 и IFN-γ способствуют дифференцировке дифференцировке Th2-лимфоцитов, Th1-лимфоцитов, IL-4 и IL-2 – IL-6 и IL-21 – дифференцировке Tfh- лимфоцитов, IL-21, IL-23, IL-6, TGF-β – дифференцировке Th17-лимфоцитов. Th9-лимфоциты рассматривают как разновидность Th2-клеток. Th3-клетки относят к iТ-регуляторным клеткам, продуцирующим TGF-β [13, 40, 47, 120, 185, 204, 243, 269, 275]. Th1-клетки характеризуются поверхностным маркером CD4 и способностью продуцировать интерлейкин (IL)-2, интерферон (IFN)-γ, фактор некроза опухоли (TNF)-β, участвуют в индукции воспаления, являются маркерами ранней активации, запускают реакцию клеточного и гуморального иммунитета, и регулируют взаимодействие различных популяций лимфоцитов 33 [184, 204, 243, 266, 275]. Кроме того, отвечают за хроническое воспаление, участвуют в формировании противовирусного иммунитета, стимулируют пролиферацию и дифференцировку CD8-клеток [185, 243, 269, 275]. Th2-лимфоциты продуцируют IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13 и IL-25, принимают участие в аллергических реакциях, обеспечивают иммунный ответ к внутриклеточным паразитам [275]. Th2-лимфоциты обеспечивают индуцирование и развитие бронхиальной астмы [243]. IL-4 – основной цитокин, участвующий в аллергическом воспалении; IL-9 – в патогенезе бронхиальной астмы; IL-13 – в устранении внутриклеточных паразитов и процессах фиброзообразования в очаге воспаления [13, 243, 275]. Th1- и Th2ответы являются взаимно ингибирующими [182, 185, 243, 269]. Значительное снижение Th1-клеток, вызванное острым или хроническим стрессом, может свидетельствовать о значительном ослаблении противовирусного иммунитета, а повышенное содержание Th1-клеток может свидетельствовать о наличии аутоиммунного процесса в организме [13, 84, 275]. Регуляторные Т-клетки (Т-reg) являются супрессорами: регулируют Тклеточный гомеостаз, предотвращают аутоиммунные заболевания, аллергические реакции, снижают противоопухолевый иммунитет и иммунитет к инфекциям, обеспечивают толерантность к чужеродному антигену [47, 202]. Супрессорный эффект проявляется за счет связывания α-цепи IL-2, в результате чего происходит ингибирование активации других Т-лимфоцитов. Кроме того, регуляторные Т-клетки продуцируют противовоспалительные цитокины IL-10, TGF-β, IL-35 [131, 202]. Дефицит регуляторных Т-клеток приводит к развитию аутоиммунных заболеваний и патологическому повреждению тканей. Увеличение количества регуляторных Т-клеток может способствовать развитию хронических инфекций и образованию опухолей [84, 117, 202]. Th17-лимфоциты – популяция эффекторных Т-хелперов, продуцирующих IL-17; играют важную роль в защите организма от внеклеточных бактерий и 34 грибов, участвуют в воспалительной реакции с деструкцией ткани и аутоиммунными расстройствами [39, 40, 117, 177, 246]. Было обнаружено, что Th17-лимфоциты стимулируют пролиферацию костно-мозговых мезенхимальных стволовых клеток у человека [164]. По некоторым данным Th17-лимфоциты участвуют в противоопухолевом иммунитете [276]. Повышение уровня Т-хелперов свидетельствует о гиперактивности иммунитета, снижение – об иммунодефиците по клеточному типу [120]. Важное значение в развитии аутоиммунных заболеваний принадлежит соотношению Th17/Treg, которые являются антагонистами и приводят к противоположным эффектам [117, 250]. Цитотоксические Т-лимфоциты (CD3+CD8+CD45+) являются адаптивными иммунными эффекторами, обеспечивают основной цитототоксический эффект в реакции отторжения трансплантата, при вирусной инфекции, лизисе опухолевых клеток [70, 120]. Эффект цитотоксических клеток обеспечивается путем непосредственного цитолиза инфицированных клеток и опосредованно, путем секреции ими IFN-γ, способствующего активации макрофагов. Цитотоксические Т-клетки обеспечивают специфическое распознавание чужеродных антигенов [242]. Способствуют устойчивости организма к внутриклеточным инфекциям, вызванным вирусами, бактериями и простейшими [70, 161]. Активированные Т-хелперы (CD4+CD25+CD127high) являются показателями напряженности иммунной системы: в развитии аутоиммунных заболеваний и при трансплантации органов [106, 233], впервые описаны в 2006 году [186, 233]. Соотношение регуляторных Т-клеток и активированных Т-хелперов – главный показатель, определяющий исход трансплантации органов [106, 233]. HLA-DR-клетки являются маркером поздней и длительной активации клеток, сохраняются в крови длительное время [120]. Их исследование позволяет оценивать остроту процесса и проводить контроль эффективности 35 лечения: динамическое снижение этого показателя свидетельствует об уменьшении воспалительной реакции, повышение – об активизации воспалительного процесса [120]. При острых воспалительных заболеваниях отмечается значительное снижение как относительного, так и абсолютного количества В-клеток [88]. Вклетки обеспечивают гуморальный иммунитет и участвуют в инициировании Т-клеточного иммунитета [88]. В настоящее время выделяют В1–, В2лимфоциты и В-клетки памяти. Маркером В-лимфоцитов является молекула CD5, позволяющая разделить их на субпопуляции CD5+B-клетки (В1-клетки) и CD5-В-клетки (В2-клетки) [86]. В1-лимфоциты обеспечивают врожденный иммунитет: их связывают с продукцией аутоантител, а, следовательно, с аутоиммунными заболеваниями В2-лимфоциты [88]. являются аутореактивными клетками, превращаются в тканях в плазмоциты, которые начинают синтезировать антитела, вследствие чего к активному воспалению подключается гуморальный обеспечивает иммунитет распознавание [58, 86, антигенов 88]. через В2-лимфоциты специфические иммуноглобулировые рецепторы [88]. NK-клетки («натуральные киллеры») – обеспечивают врожденный иммунитет, не относятся ни к Т-, ни к В-лимфоцитам, обладают высокой неспецифической цитолитической активностью [88, 248]. Действуют немедленно, распознают и лизируют любой антиген без предварительной сенсибилизации. NK-клетки секретируют цитокины, участвующие в формировании и регуляции адаптивного иммунного ответа [88]. NK-клетки обеспечивают непосредственную защиту от вирусов, бактерий и паразитов, участвуют в лизисе опухолевых клеток [248]. NK-клетки являются важным источником IFN-γ, который участвует в дифференцировке Th1-лимфоцитов и активирует макрофаги [185, 243, 269]. В последние годы проведены исследования, указывающие на значительную роль состояния клеточного иммунитета в развитии воспалительной реакции 36 глаз. Исследование лимфоцитов позволяет выявлять изменения организма на субклиническом уровне и прогнозировать исход заболевания, течение послеоперационного периода и эффективность терапии. Т-лимфоциты наиболее быстро из всех иммунокомпетентных клеток реагируют на начало воспалительного процесса. Эта реакция проявляется еще до развития клинической картины заболевания. В последние годы особенное внимание уделяется субпопуляциям Т-лимфоцитов, которые являются основными клетками системы клеточного иммунитета, в особенности интенсивно развивается изучение Т-хелперов [87, 101]. В частности, показана роль Тклеточного иммунитета в развитии аутоиммунных нарушений у детей с ретинопатией недоношенных и симпатической офтальмией [9-11, 36]. Балашова Л.М. с соавт. [10] выявили у детей в возрасте 1,5-6-ти месяцев с наличием ретинопатии недоношенных III-IV стадии - снижение общего количества Т-лимфоцитов, Т-хелперов, соотношения Т-хелперов/Т- цитотоксических клеток, регуляторных Т-клеток, повышение количества В1клеток по сравнению с доношенными соматически здоровыми детьми, в популяциях NK-клеток и Т-цитотоксических клеток достоверных изменений выявлено не было. При исследовании венозной крови детей с врожденной глаукомой в возрасте 1,5-6-ти месяцев, взятой до операции, выявлена тенденция к снижению уровня Т-лимфоцитов, регуляторных Т-клеток, В1лимфоцитов, Т-хелперов, цитотоксических Т-лимфоцитов, тенденция к увеличению NK-клеток по сравнению с соматически здоровыми детьми [12]. Но, учитывая малочисленность групп и разнородность их по степени выраженности исследуемой офтальмопатологии [10, 12], полученные результаты являются противоречивыми и требуют дальнейших исследований. Зурочка А.В. с соавт. [36] характеризуют активацию популяций В-клеток, Тхелперов и регуляторных Т-клеток как фактор риска развития симпатической офтальмии. Полученные информативности результаты показателей свидетельствуют Т-клеточного 37 звена о высокой иммунитета в прогнозировании течения и исхода офтальмологической патологии, но являются недостаточными и неоднозначными и свидетельствуют о необходимости дальнейших исследований. 1.3.3.Диагностические возможности исследования митохондриальной дисфункции лимфоцитов периферической крови Изучение метаболизма в митохондриях лимфоцитов в последние 50 лет пользовалось повышенным вниманием. Митохондриальные расстройства представляют собой группу генетически и фенотипически полиморфных расстройств. Нарушение функции митохондриальных ферментов приводит к дефициту продукции АТФ. Заболеваемость митохондриальными расстройствами составляет 1:5000-1:10000 [230]. Выделяют первичную и вторичную митохондриальную недостаточность. Первичная митохондриальная недостаточность обусловлена врожденными изменениями в структурах ДНК самих митохондрий или в ядерных ДНК. Большое внимание этим нарушениям уделяют в различных областях медицины, в том числе в офтальмологии. Так, описаны изменения в структуре ДНК митохондрий при пигментном ретините и прогрессирующей нейросенсорной тугоухости, наследственной оптиконейропатии Лебера, хронической прогрессирующей наружной офтальмоплегии [124, 249]. Тем не менее, точный механизм, который координирует эти сложные процессы, остается неясным. Ко вторичной митохондриальной недостаточности относят заболевания, одним из звеньев патогенеза которых является нарушение клеточной энергетики митохондрий. энергозависимыми Иммунные процессами: для ответы поддержания являются очень жизнеобеспечения активированных Т-клеток происходит увеличение потребления глюкозы и аэробного гликолиза [23, 229]. Митохондрия является клеточной органеллой, которая содержит собственную ДНК, участвует в биосинтезе стероидов, синтезе нуклеиновых кислот и окислении жирных кислот [18]. Основной 38 функцией митохондрий является обеспечение клетки энергией. Метаболическую функцию митохондрий реализуют, преимущественно, цикл трикарбоновых кислот (Кребса) и окислительное фосфорилирование [251]. Нарушение функций митохондрий относится к ранним признакам повреждения клетки [78]. В диагностике митохондриальных нарушений определяющее значение имеют цитохимические методы, основанные на определении активности ферментов в лимфоцитах периферической крови [80, 96]. Наиболее информативным ферментом, определяющим функциональную активность митохондрий лимфоцитов, является сукцинатдегидрогеназа (СДГ) [66, 71]. СДГ участвует в формировании электронно-транспортной цепи и цикле Кребса, прочно связана с внутренней мембраной митохондрий. Сукцинатдегидрогеназа в цикле Кребса катализирует окисление янтарной кислоты в фумаровую. Вследствие этой реакции происходит восстановление окисленной формы флавинадениндинуклеотида (FAD) до FADH2. В дыхательной электронно-транспортной цепи СДГ является ферментным комплексом, участвующим в переносе водорода от сукцината на убихинон [58]. Вследствие этой реакции происходит окисление восстановленной формы флавинадениндинуклеотида (FADH2) и образуется основной источник энергии в клетке – аденозинтрифосфат (АТФ) [58, 227]. Таким образом, функционирование СДГ митохондрий характеризует энергетический обмен в клетке. Нарушение клеточной биоэнергетики является одним из компонентов снижения адаптационных процессов у детей в периоды становления иммунной системы [23]. В норме, в процессе жизнедеятельности митохондрий, образуется 0,4-4% активных форм кислорода, супероксиддисмутазой до которые перекиси метаболизируются водорода, а потом сначала глутатион- пероксидазой до воды, и не накапливаются в митохондриях [155, 206, 261]. Митохондриальная дисфункция приводит к продукции и накоплению 39 активных форм кислорода (АФК), которые оказывают влияние на процессы, происходящие в клетке [138, 206, 264]. Кроме того, в митохондриях NOсинтазой продуцируется оксид азота, который проникает в митохондрию через цитозоль, и вместе с АФК повреждает сами митохондрии и другие клеточные структуры [206]. Митохондриальные АФК непосредственно стимулируют выработку провоспалительных цитокинов. Значительное накопление АФК в клетке усугубляет течение оксидативного стресса, может способствовать формированию мутаций митохондриальной и ядерной ДНК, что еще больше нарушает работу ферментных систем и является причиной выраженного снижения продукции АТФ [249]. В настоящее время выявлено большое количество заболеваний, в патогенезе которых важное значение принадлежит нарушению структуры и функции митохондрий [79, 231]. Так, митохондриальные дисфункции определяют развитие злокачественных опухолей, аутоиммунных заболеваний, атеросклероза, болезни Альцгеймера, сахарного диабета, болезни Паркинсона, шизофрении, синдрома хронической усталости, нефропатий у детей, врожденных миопатий у детей, атопическом дерматите, бронхиальной астме, сепсисе, остеоартрите [24, 28, 99, 104, 129, 184, 214, 241, 247]. Показана роль офтальмопатологии, вторичной но научные митохондриальной исследования в дисфункции этой области в – немногочисленные [27, 45, 61, 83, 130, 159, 182]. Так, весьма актуальным является алгоритм прогноза исхода рекератопластики, разработанный Комахом Ю.А., в основу которого положен совокупный анализ клиникоанамнестических данных и результатов цитохимических исследований митохондриальных ферментов СДГ и α-глицерофосфатдегидрогеназы (αГФДГ) в лимфоцитах периферической крови [27, 45, 83]. Было выявлено, что неблагоприятными для прогноза прозрачного приживления трансплантата при рекератопластики являются как депрессия исследованных ферментов (СДГ и α-ГФДГ), так и их гиперактивация [45]. Гиперактивация митохондриальных 40 ферментов встречается чаще у молодых пациентов и является предшественником депрессии СДГ и α-ГФДГ [45]. В исследованиях Ciulla T.A. и др. описан клинический случай врожденного дефекта I-го ферментного комплекса цепи переноса электронов (НАДНдегидрогеназы) у девочки с прогрессирующей двусторонней врожденной катарактой [130]. После аспирации катаракты была проведена электронная микроскопия хрусталиковых масс. В результате исследования было выявлено повышение содержания внутриклеточного гликогена и увеличенные в размерах митохондрии, что свидетельствует о митохондриальной дисфункции [130]. Исследования Никитина Д.Н. (2013), проведенные на кроликах, обнаружили структурные изменения в митохондриях на всех уровнях зрительного пути при адреналин-индуцированной глаукоме, зависящие от длительности эксперимента: при увеличении срока эксперимента увеличивалась доля вакуолеподобнорасширенных митохондрий [61]. Lee D. с соавторами (2014) в своих исследованиях охарактеризовали воздействие окислительного стресса, как один из патогенетических факторов в развитии глаукомной оптиконейропатии [182]. При электронной микроскопии сетчатки у мышей были обнаружены изменения митохондриальной ДНК, развивающиеся вследствие нарушений ДНК-связывающего белка митохондрий – митохондриального фактора транскрипции (TFAM). Gzarny P. с соавт. (2014) при электронной микроскопии десцеметовой мембраны и лимфоцитов периферической крови у пациентов с эндотелиальной дистрофией Фукса выявили мутации митохондриальной ДНК, обусловленные окислительным стрессом [159]. Полиморфизм, свойственный послеоперационным воспалительным реакциям у детей после хирургии врожденных катаракт, позволяют предположить, что в патогенезе этих изменений определенное значение имеет митохондриальная недостаточность. 41 Изучение неспецифических патогенетических механизмов развития ПВР у детей с врожденной катарактой является крайне актуальным. Вероятно, исследование энергетического статуса лимфоцитов у детей с врожденными катарактами позволит более детально изучить механизмы развития ПВР. Таким образом, данные литературы подчеркивают значительное внимание офтальмологов к проблеме развития послеоперационных осложнений в хирургии врожденных катаракт и их роли в структуре зрительной инвалидности у детей. При этом, несмотря на развитие микрохирургической техники, частота послеоперационных воспалительных осложнений у детей с врожденными катарактами остается достаточно высокой, что требует детального изучения патогенеза воспалительных осложнений и нового подхода к пред- и послеоперационной терапии [20, 49, 74]. Учитывая разброс и низкую информативность большинства иммунологических показателей, используемых для прогнозирования послеоперационной воспалительной реакции у детей с врожденными катарактами, необходим дальнейший поиск наиболее информативных критериев. Несмотря на большое количество применяемых методик, в настоящее время не существует прогностических алгоритмов, сочетающих в себе комплекс анамнестических и иммунологических показателей, позволяющих выявлять детей группы риска по развитию ПВР до хирургического лечения врожденных катаракт. В соответствии с этим представляется актуальным дальнейшее изучение возможности использования дополнительных лабораторных методов исследования в прогнозировании послеоперационной воспалительной реакции и снижении риска ее развития. 42 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ В основу диссертационной работы положен комплекс проспективных клинических исследований и экспериментальное исследование in vitro. Работа выполнялась на базе Центра фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем (руководитель – д.м.н. С.А. Борзенок), отдела микрохирургии и функциональной реабилитации глаза у детей ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России, Москва (заведующий – д.м.н. П.Л. Володин), детского офтальмологического отделения клиники стационара (заведующий – к.м.н. В.В. Павленко) и Лаборатории цитохимии ФГБНУ «Научный центр здоровья детей» (заведующая - д.б.н., проф. С.В. Петричук). Все пациенты были разделены на 2 группы, сформированные на основании течения раннего послеоперационного периода. Оценку воспалительной реакции в раннем послеоперационном периоде проводили на основании биомикроскопии с помощью щелевой лампы при 32-кратном увеличении: Группа 1 – пациенты с 0-й степенью ПВР, Группа 2 – пациенты с 1-й степенью ПВР. Из материала клинического исследования были исключены дети с ПВР 2-й и 3-й степени, у которых в 1-е сутки послеоперационного периода появились признаки ОРВИ. В ходе дооперационного обследования было выполнено анкетирование на основании рекомендаций Мешковой Р.Я. с соавт. (1995) [57]. В результате опроса определяли тип наиболее вероятного иммунопатологического синдрома: инфекционный или аллергический, что позволило выявить факторы риска развития ПВР у детей с врожденными катарактами перед проведением хирургического лечения. Произведено изучение популяционного состава лимфоцитов периферической крови и цитохимические исследования. На втором этапе работы оценивали течение раннего послеоперационного периода после аспирации врожденной катаракты у детей, а также 43 корреляционные зависимости течения раннего послеоперационного периода с результатами предоперационного клинико-анамнестического и иммунологического обследования. Эксперименты in vitro включали изучение воздействия дексаметазона на экспрессию поверхностных рецепторов лимфоцитов периферической крови и комплекс цитохимических исследований. 2.1. Общая характеристика доклинических методов исследования В результате проведенного опроса были определены типы наиболее вероятного иммунопатологического синдрома: инфекционный или аллергический. Инфекционный синдром включал отягощенность анамнеза следующими симптомами: наличие длительного субфебрилитета или лихорадки, хронических инфекций ЛОР-органов, бронхитов и пневмоний, частых ОРВИ (группа «ЧБД»), ОРВИ за 1 месяц и менее до операции, наличие в анамнезе кори, краснухи, ветряной оспы, эпидемического паротита, коклюша, патологических реакций на прививки; грибковых инфекций кожи, слизистых, ногтей; паразитарных инфекций, инфекций ротовой полости, герпеса различной локализации, лимфаденитов, урогенитальных инфекций, дисбиоза кишечника, оппортунистических инфекций, сепсиса. Аллергический синдром включал наличие аллергической патологии кожи, ЛОР-органов и бронхолегочной системы. Определяли частоту возникновения каждого симптома, формирующего основные синдромы, его выраженность и наличие/отсутствие на момент хирургического вмешательства, на основании чего каждому симптому присваивали оценку от 0 до 3-х баллов. Если симптом отсутствовал на данный момент и никогда не наблюдался, данному симптому присваивали «0 баллов». Если симптом на момент обследования отсутствовал или присутствовал, но был слабо выражен, присваивали «1 балл». Если симптом присутствовал в настоящее время и был средне выражен, присваивали «2 балла». Если симптом присутствовал и был сильно выражен, 44 присваивали «3 балла». Показатель выраженности синдрома определяли путем сложения баллов, присвоенных каждому симптому, характеризующему синдром. На основании суммы баллов, полученных при характеристике каждого синдрома, послеоперационной информативность выявляли его значимость воспалительной каждого в реакции. отдельного прогнозировании Также симптома в определяли прогнозировании послеоперационной воспалительной реакции. Кроме того, был проведен анализ факторов, отягощающих анамнез жизни: патологическое течение беременности, наличие врожденных пороков развития. 2.2. Общая характеристика клинического материала В работе проведен анализ результатов обследования и хирургического лечения 106-ти пациентов (114-ти глаз) с врожденными катарактами. Характеристика пациентов представлена в таблице 1. Таблица 1 Характеристика пациентов обследованных групп Состав групп Группа 1 Группа 2 Общее количество Всего пациентов 50 52 106 Всего глаз 52 56 114 Мальчики, % 68 46,2 55,7 Девочки, % 32 53,8 44,3 6,46±2,83 6,15±3,80 6,42±3,53 Средний возраст, лет Пациенты находились офтальмологическом на отделении стационарном клиники лечении стационара в ФГБУ детском «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» МЗ РФ. Исследования проведены в период с 2011-го по 2014-й годы. В соответствии с задачами исследования были сформированы группы больных с учетом воспалительной реакции в раннем послеоперационном 45 периоде. В исследование не включены пациенты, перенесшие ранее травму глаз, увеит; дети с наличием подвывиха хрусталика различной степени тяжести, первичного персистирующего гиперпластического стекловидного тела, глаукомы различного генеза, лучевой катаракты, оперированной отслойки сетчатки, ретинопатии недоношенных, микрофтальма 2-ой и 3-ей степени, микрокорнеа 2-ой и 3-ей степени, аниридии, врожденной колобомы хрусталика, радужки, хориоидеи, врожденных помутнений роговицы, патологии век и слезных органов, аметропии средней и высокой степени из-за увеличения сложности и времени хирургического вмешательства, а, следовательно, повышения риска развития ПВР. Из исследования исключали пациентов с болезнями обмена и системными заболеваниями. У части детей отмечено наличие общесоматической патологии (Табл. 2). Таблица 2 Выявленная сопутствующая общесоматическая патология пациентов Общесоматическая патология Число больных количество % Синдром Дауна 3 2,8 Оперированный порок сердца 4 3,8 Персистирующие инфекцииоппортунисты в анамнезе (ЦМВ, ВЭБ, ВПГ, токсоплазмоз) Неоперированный компенсированный порок сердца Малые аномалии развития сердца (МАРС) 9 8,5 2 2,1 24 25,5 Наиболее часто встречались практически здоровые дети (60,1%) без общесоматической патологии. 2.3. Клинико-функциональные методы обследования Всем детям, вошедшим в представленную работу, было проведено комплексное офтальмологическое обследование, 46 которое включало визометрию, офтальмометрию, тонометрию, периметрию, биомикроскопию, офтальмоскопию, ультразвуковую эхобиометрию, электрофизиологические исследования (определение порогов электрической чувствительности и электрической лабильности). Исследования проводили у пациентов в динамике – до оперативного вмешательства и непосредственно после операции во время пребывания в стационаре. Остроту зрения определяли без коррекции, а также с максимальной коррекцией при помощи пробной оправы и набора сферических и цилиндрических стекол. Визометрия проводилась с использованием проектора оптотипов «Zeiss» (Германия). Авторефрактометрию проводили на авторефрактометре «Nidek AR-310А» (Япония). Офтальмометрию выполняли на офтальмометре фирмы «Opton» (Германия). Для проведения периметрии использовали проекционный периметр АППЗ01 (Россия). Методика заключалась в использовании объектов белого цвета различной величины и яркости, в зависимости от исходной остроты зрения. Периметрию проводили детям старше 5-ти лет. Тонометрию производили с помощью пневмотонометра «Topcon» (Япония). Биомикроскопию проводили с помощью щелевой лампы модели SL-30 фирмы «OPTON» (Германия). Выполняли осмотр придаточного аппарата глаза, конъюнктивы, роговицы, радужной оболочки (форму зрачка, реакцию зрачка на свет, наличие передних и задних синехий) и хрусталика (форму катаракты, состояние задней капсулы хрусталика). После аспирации катаракты с имплантацией ИОЛ оценивали воспалительную реакцию глаза в раннем послеоперационном периоде: наличие инъекции глазного яблока, отека роговицы, состояние влаги передней камеры (наличие феномена Тиндаля, экссудативной реакции), радужной оболочки (реакция зрачка на 47 свет, форма зрачка), положение ИОЛ, состояние передних слоев стекловидного тела. Для оценки воспалительной реакции использовали классификацию воспалительной реакции Сергиенко Н.М., Веселовской З.Ф. (1985) [72], которую наиболее часто используют в детском возрасте с дополнениями Азнабаева Р.А. с соавт. (2009) [3]. Согласно данной классификации ранняя ПВР возникает в 1-5-е сутки после операции и подразделяется на три степени тяжести: 1-я степень - слабо выраженная гиперемия конъюнктивы, незначительный отек эпителия верхней трети роговицы, полностью исчезающий к третьим суткам. В соответствии с данной классификацией, 1-я степень характеризуется минимальными признаками воспаления и относится к неосложненному течению; 2-я степень – иридоциклит, проявляющийся легким раздражением глазного яблока, вялой реакцией зрачка на свет, феноменом Тиндаля 1+, отложением небольшого количества преципитатов на ИОЛ, появлением единичных задних синехий, иногда выпадением отдельных нитей фибрина, в некоторых случаях легким отеком роговицы; 3-я степень – выраженное раздражение глазного яблока, отек роговицы, феномен Тиндаля 2+, 3+; появление протяженных синехий, иногда выпадение длительно не рассасывающегося фибрина, появление большого количества преципитатов на ИОЛ и плавающих помутнений в стекловидном теле. Классификации, основанные на подсчете клеток во влаге передней камеры, не использовались, учитывая затруднения в применении данных методик у детей младшего возраста. Офтальмоскопию проводили с помощью ручного электрического офтальмоскопа «Heine» (Германия) и за щелевой лампой с использованием бесконтактных диагностических линз «OCULAR OSHER MAXFIELD®» 78 и 90D (США). 48 Биометрию проводили на приборе «OcuScan» фирмы Alcon (США) с использованием местной анестезии раствором Алкаина 0,5%. Детям до 3-4летнего возраста проводили исследование в условиях операционной. Измеряли глубину передней камеры, толщину хрусталика, величину переднезадней оси глазного яблока. В-сканирование осуществляли с помощью ультразвукового прибора «SONOMED» (США) с резонансной частотой ультразвука 10 МГц. В ходе исследования оценивалось состояние стекловидного тела, сетчатой оболочки. Расчет оптической силы ИОЛ проводили по методике MIKOF/ALF, разработанной на базе ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Тахчиди Х.П., Бессарабовым А.Н. и Пантелеевым Е.Н. (2007) с поправкой на возраст ребенка [81]. Помимо комплексного офтальмологического обследования всем детям до операции было выполнено общеклиническое обследование, включающее общий и биохимический анализы крови, общий анализ мочи, исследование свертываемости крови, определение уровня глюкозы крови, исследование крови на наличие антигенов к гепатитам В и С, исследование крови на наличие ВИЧ-инфекции, реакцию Вассермана, рентгенографию грудной клетки, ультразвуковое и электрокардиографическое исследования сердца. Обязательными являлись консультации оториноларинголога, невролога, стоматолога, педиатра. Кроме того, до хирургического лечения у всех пациентов был выполнен забор венозной крови для проведения иммуноцитохимических исследований. Профилактическую противовоспалительную терапию до операции не проводили. Предоперационная подготовка больных включала: - двукратные инстилляции в конъюнктивальную полость препарата Мидриацил 0,5% или Мидриацил 1% (в зависимости от возраста) за 1 час до аспирации катаракты для получения 49 мидриаза не менее 6-ти мм, способствующего получению хорошей визуализации на всех этапах оперативного вмешательства; - всех пациентов оперировали в условиях общей анестезии. Основные этапы операции: Двукратную обработку операционного поля осуществляли марлевым шариком, смоченным 0,5% раствором хлоргексидина. Затем проводили инстилляцию витабакта 0,05% в конъюнктивальную полость дважды. Для эпибульбарной анестезии использовали Алкаин 0,5%. Операционное поле накрывали офтальмологической салфеткой с карманом и липким слоем «Здравмедтех-М» (Москва). На ресничный край век накладывали защитное пленочное покрытие «Tegaderm» (Германия); для расширения и удержания век использовали блефаростат. Визуальный контроль в ходе операции осуществляли на операционном микроскопе. Иммобилизацию глазного яблока ребенка производили за счет наложения шва-держалки лимбально на 6-ти часах 8-0 VIRGIN SILK 30 cm. Затем копьевидным ножом шириной 1,2 мм на 2-х и 11-ти часах выполняли парацентезы. Для поддержания адекватного мидриаза в течение всей операции в переднюю камеру однократно последовательно вводили раствор мезатона и маркаина по 0,1-му мл. Для поддержания объема передней камеры и защиты эндотелия роговицы во время операции вводили комбинированный вискоэластик дисковиск. Непрерывный круговой капсулорексис диаметром 5,5 мм с ровными краями у всех детей производили цанговым пинцетом. Удаление хрусталиковых масс выполняли автоматической аспирационноирригационной системой бимануальной техникой с использованием сбалансированного ирригационного раствора BSS+ (Alcon). Операцию выполняли на факовитреальной установке «Millenium» фирмы «Bausch&Lomb» (США) или «Accurus» фирмы «Alcon» (США). Ультразвук для эмульгации ядра хрусталика не использовали. Полировку задней капсулы и задней поверхности передней 50 капсулы хрусталика проводили аспирационным и ирригационным наконечниками факоэмульсификатора. После удаления остатков хрусталиковых масс капсульный мешок заполняли вискоэластиком. Затем копьевидным ножом шириной 2,0 мм выполняли роговичный тоннельный разрез. Основной разрез выполняли путем расширения парацентеза на 11-ти часах, если оперировали правый глаз, и на 2х часах – левый. Для имплантации использовали моноблочные ИОЛ Acrysof SA60AT. Имплантацию ИОЛ производили инжекторным способом через основной разрез: картридж предварительно заполняли вискоэластиком, ИОЛ помещали в картридж, который присоединялся к инжектору, после чего проводилась имплантация ИОЛ. При обнаружении до или во время операции стойких помутнений задней капсулы выполняли заднюю капсулотомию диаметром 5,0 мм с помощью витреотома 25G, который вводили за ИОЛ, после чего витреотомом 25G выполняли переднюю витрэктомию. Детям с неизмененной задней капсулой заднюю капсулотомию не проводили. После имплантации ИОЛ аспирационно-ирригационной системой бимануально с визуальным контролем выполняли полное удаление вискоэластика. На все операционные доступы накладывали погружные узловые швы 10-0 VICRIL Polyglactin 10 cm. Объем передней камеры восстанавливали раствором для ирригации BSS+. После наложения швов проводили контроль адекватности герметизации разрезов с помощью микротупферов. В завершении операции выполняли инъекцию раствора Дексазона 0,4% 0,3 мл и накладывали стерильную асептическую салфетку. Тактика ведения больных в послеоперационном периоде Все дети были осмотрены через 3-4 часа после операции и ежедневно 2 раза в день в течении 5-7-ми суток их пребывания в стационаре. Учитывая детский возраст пациентов, была исключена повышенная активность детей, связь развития воспалительной реакции послеоперационном периоде. 51 с разгерметизацией швов в Послеоперационный медикаментозный режим включал в себя инстилляции стероидных противовоспалительных средств – раствор дексаметазона 0,1% по 1-ой капле 4 раза в день, антибиотика – раствора тобрамицина 0,3% по 1-ой капле 4 раза в день и мидриатика – раствора Мидриацила: детям до 6-ти лет в концентрации 0,5%, старше 6-ти лет – в концентрации 1% по 1-ой капле 2 раза в день. В зависимости от течения раннего послеоперационного периода при появлении каких-либо изменений, свидетельствующих о развитии воспалительной реакции, проводили коррекцию терапии. 2.4. Иммуноцитохимические методы исследования В работе применяли определения активности количественный цитохимический анализ сукцинатдегидрогеназы в общей для популяции лимфоцитов периферической крови с использованием световой микроскопии и цитоморфоденситометрии. Исследование СДГ позволяло оценить интенсивность энергетических процессов в клетках. Любой стресс может вызвать кратковременную активацию СДГ с последующей нормализацией ее активности [59, 66]. При длительном воздействии неблагоприятных факторов сначала возникает гиперактивация СДГ с дальнейшим снижением ее активности, называемой депрессией [65, 66]. Одной из причин несостоятельности ответа лимфоцитов на любое внешнее воздействие является снижение активности СДГ [65]. Для оценки популяционного состава лимфоцитов и митохондриальной активности СДГ в каждой исследуемой субпопуляции лимфоцитов в работе использован метод проточной цитофлуориметрии. 2.4.1. Метод количественного цитохимического определения активности сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитах периферической крови Количественный цитохимический метод был предложен в 1969 г. Нарциссовым Р.П. и в дальнейшем модифицирован в 2005 г. [65]. Метод 52 основан на способности красителя п-нитротетразолия фиолетового в процессе ферментативных реакций образовывать нерастворимые в воде гранулы формазана в клетках крови и срезах органов [59, 65]. На мазках венозной крови производили постановку цитохимических реакций, которые включали в себя фиксацию мазков, проведение реакции для выявления активности ферментов, докраску ядер. В течение 30-ти секунд для количественного цитохимического исследования и в течение 60-ти секунд для цитоморфоденситометрического анализа при комнатной температуре фиксировали препараты в надосадочной жидкости 60% раствором ацетона, насыщенного трилоном Б при рН=5,2-5,4. Фиксированные препараты промывали дистиллированной водой и высушивали на воздухе при комнатной температуре. Активность митохондриальных ферментов определяли с использованием наборов для цитохимических исследований фирмы «ХИМТЕХМАШ». Использована инкубационная среда, представленная 40 мл фосфатного буфера 13 мг п-нитротетразолия фиолетового, 13 мг трилона Б и специфическим субстратом для исследуемого фермента. В основную среду в качестве субстрата для определения активности СДГ добавляли 43 мг сукцината натрия. Постановку реакции осуществляли в водном термостате при температуре 37С и рН=7,3 в течение 60-ти минут. После инкубации мазки промывали водой и погружали в насыщенный раствор метилового зеленого (ядерного красителя) на 15-20 секунд, после чего мазки вновь промывали и высушивали при комнатной температуре на воздухе. Готовые мазки микроскопировали с использованием водного объектива с 630-кратным увеличением (63х10) на микроскопе фирмы «Zeiss» (Германия). Активность фермента в клетке характеризовали количеством темно- фиолетовых гранул формазана (количество очагов ферментативной реакции), образовавшихся в процессе восстановления п-нитротетразолия фиолетового. Подсчет гранул в популяции лимфоцитов проводили в 30-ти клетках. 53 Активность фермента определяли средним числом гранул на одну клетку и статистическими параметрами распределения клеток по активности, которые рассчитывали по специальной программе. 2.4.2. Цитоморфоденситометрический метод определения активности сукцинатдегидрогеназы У здоровых детей отмечали высокую функциональную активность митохондрий при цитоморфоденситометрическом анализе СДГ, что выражалось в большом количестве очагов ферментной активности. Наиболее активно работающие митохондрии образуют конгломераты (кластеры) вследствие объединения митохондрий с увеличенной оптической плотностью. Для поддержания энергетических процессов в клетках организма необходимо соотношение активности отдельных митохондрий и кластеров – 40:60, которое нарушается при различных патологических состояниях [66]. В первую очередь изменения происходят в отдельно лежащих митохондриях, у которых сначала изменяется их площадь, а затем оптическая плотность. Более тяжелые патологические состояния приводят к снижению функциональной активности кластеров [64, 97]. В работе был использован цитоморфоденситометрический метод выявления активности СДГ. С помощью аппаратно-программного комплекса визуализации, анализа и регистрации оптических и морфологических показателей «Видеотест» и программы «Морфология-5.2» были оценены геометрические и оптические характеристики гранул продукта ферментативной реакции в лимфоцитах. В ходе исследования проведена оценка количества, площади и оптической плотности гранул, определена интегральная оптическая плотность гранул, произведена интегральная оценка активности фермента по некластеризованным и кластеризованным очагам и оценена общая активность фермента в клетке путем сложения показателей кластеризованных и некластеризованных очагов. 54 2.4.3. Метод проточной цитофлуориметрии Произведено иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови и определение митохондриальной активности лимфоцитов с использованием метода проточной цитофлуориметрии [62] на приборе CYTOMICS FC 500 (Beckman Coulter, США). Метод проточной цитофлуориметрии основан на регистрации сигналов флуоресценции по нескольким каналам (FL1-FL5), прямого (рассеяния под малыми углами от 1 до 100) и бокового светорассеяния (рассеяния под углом 900) от каждой отдельной клетки дисперсной среды. Дисперсная среда представлена клеточной суспензией, предварительно меченной флуоресцирующими моноклональными антителами, специфически связывающими определенные компоненты рецепторного аппарата лимфоцита. Гидродинамическая фокусировка позволяет создать ламинарный поток без перемешивания клеточной суспензии, что обеспечивает строго определенное положение каждой клетки в проточной ячейке относительно луча света. Высокая воспроизводимость и точность метода обеспечивается большой выборкой анализируемых объектов, высокой скоростью измерения, возможностью измерения параметров малых популяций лимфоцитов. Данный метод позволяет определить количество клеток в различных популяциях лимфоцитов и их энергетический метаболизм, основанный на определении активности цитофлуориметрии является СДГ. Преимуществами возможность проведения проточной одновременного иммунофенотипирования лимфоцитов периферической крови, определения митохондриальной активности основных и малых популяций лимфоцитов [57]. В работе были исследованы следующие популяции лимфоцитов (Табл. 3). 55 Таблица 3 Исследуемые популяции лимфоцитов Основные популяции лимфоцитов Общее количество Т-лимфоцитов CD3+CD45+ Т-хелперы (Th-лимфоциты) CD3+CD4+CD45+ Цитотоксические Т-лимфоциты CD3+CD8+CD45+ В-лимфоциты CD3-CD19+CD45+ NK-клетки CD3-CD16+/CD56+ Активированные HLA-DR-лимфоциты CD3+HLA-DR+ Малые популяции лимфоцитов В1-клетки CD3-CD19+CD5+CD45+ В2-клетки CD3+CD19+CD5-CD45+ Th2-лимфоциты CD3+CD4+CD294+ Регуляторные Т-клетки CD4+CD25+CD127low Активированные Т-хелперы CD4+CD25+CD127high Th-17 лимфоциты CD3+CD4+CD161+CD45+ В исследовании использовались флуоресцирующие моноклональные анктитела производства Beckman Coulter и Beckton Dicinson (США): CD4FITS, CD3-FITS, CD3-PerCP, CD3-PE-Cy5, HLA-DR-FITS, CD8-PE, CD19-PE, CD294-PE, CD127-PE, CD161-PE, CD(16-56)-PE, CD25PE-Cy7, CD45-PERCP, CD45PE-Cy5, CD45PE-Cy7. Для оценки популяционного состава лимфоцитов был использован стандартный протокол [88]. После инкубации цельной крови с моноклональными антителами, образцы лизировали и фенотипировали на автоматической станции пробоподготовки TQ-PREPTM (Beckman Coulter, США) с использованием набора реагентов ImmunoPrep Reagent System (Beckman Coultr, США) [58]. Для определения активности СДГ был использован лимфоконцентрат венозной крови. Пробу крови разбавляли средой RPMI-1640, предварительно 56 подогретой до 370С, в соотношении 1:3, после чего разбавленную кровь наслаивали на градиент фиколл-Гипак плотностью 1,077 (Histopaque-1077 Sigma diagnostics №1077-1) в соотношении 4:1 в пробирку с коническим дном. Пробу центрифугировали 20 минут при 2000 об./мин. После этого путем центрифугирования клетки отмывали средой RPMI-1640, предварительно подогретой до 370С (10 минут при 2000 об./мин.). Надосадочную жидкость отбирали, к осадку добавляли среду RPMI-1640, предварительно подогретую до 370С до общего объема 1000 мкл. Полученную клеточную суспензию добавляли в маркированные пробирки, содержащие флуоресцирующие моноклональные антитела, в соответствии с разработанным протоколом, по 50 мкл в каждую. Пробирки выдерживали в темноте при комнатной температуре в течение 15-ти минут. Затем в маркированные пробирки добавляли по 50 мкл реагента Cytofix/Cytoperm (BD Cytofix/Cytoperm № 554722) для пермеабилизации клеток, выдерживали 15 минут, после чего клетки отмывали реагентом Cell Wash (BD Cell Wash № 349524) (5 минут при 2000 об./мин.). Далее в маркированные пробирки добавляли по 200 мкл реагента Perm/Wash (BD Pharmingem Perm/Wash Buffer № 554723), выдерживали 15 минут и отмывали реагентом Cell Wash (5 минут при 2000 об./мин.). После отмывки в каждую пробирку с клеточной суспензией пробы «стандарт» добавляли 400 мкл фиксирующего раствора CellFIX (BD CellFIX № 340181). Пробы «стандарт» исследовали на проточном цитофлуориметре. К клеткам пробы «цитохимия» добавляли по 1000 мкл раствора СДГ, клетки инкубировали 30 минут в водном термостате при температуре 370 С. После этого клетки отмывали реагентом Cell Wash в течение 5-ти минут при 2000 об/мин. В каждую пробирку добавляли по 400 мкл фиксирующего раствора CellFIX (BD CellFIX № 340181). Пробы «цитохимия» исследовали на проточном цитофлуориметре. 57 Оценку количественных характеристик основных и малых популяций лимфоцитов проводили в соответствии с существующими рекомендациями [85]. 2.5. Материал экспериментальной части исследования (постановка пробы с дексаметазоном in vitro) Для оценки влияния раствора дексаметазона (раствор для инъекций, KRKA, 4 мг/мл) на популяции лимфоцитов была проведена проба in vitro на цельной крови и на выделенных лимфоцитах. В основу метода положен способ инкубации in vitro выделенных лимфоцитов с раствором дексаметазона 0,4%, описанный в 2006 г. Жуковой О.Б. [31]. Экспериментальная часть исследования включала в себя: 1. Оценку влияния различных концентраций и времени экспозиции раствора дексаметазона на количественный состав и уровень экспрессии поверхностных рецепторов Т-лимфоцитов (CD3, CD4, CD8, CD 25, CD127, CD161), В-лимфоцитов (CD19), NK-клеток (CD16 и CD56); 2. Оценку влияния различных концентраций раствора дексаметазона на функциональную активность популяций лимфоцитов (активность СДГ). Материалом для исследования была венозная кровь практически здоровых детей разного возраста, взятая утром до приема пищи. В эксперименте анализировали влияние различных концентраций препарата. Терапевтическая доза дексаметазона составляет 0,01-0,02 мг/кг. Выбор количества препарата проводили из расчета терапевтической дозы на объем цикрулирующей крови. Объем циркулирующей крови рассчитывали по Баирову Г.А. (1973) [8] в зависимости от возраста: дети 1-3-х лет – 67,5-78,5 мл/кг, дети 4-6-ти лет – 65,3-79,7 мл/кг, дети 7-9-ти лет – 70,5-88,5 мл/кг, дети 10-16-ти лет – 66,5-83,5 мл/кг. При проведении оценки воздействия различных концентраций раствора дексаметазона на клетки периферической крови, первым этапом в пробирки, 58 содержащие по 500 мкл цельной крови, были добавлены 2, 20 и 200 мкл (концентрация 4,0, 40,0 и 360,0 мкг/л) исследуемого лекарственного препарата. Количество лимфоцитов в пробе было одинаковым и составляло 2000-2700 клеток/мкл. В каждой группе исследуемых поверхностных рецепторов лимфоцитов (CD, cluster of differentiation) выполняли контрольную пробу, куда не вводили раствор дексаметазона. В этой серии экспериментов время экспозиции цельной крови с раствором дексаметазона составило 1 час. После чего проводили пробоподготовку, включающую инкубирование цельной крови с моноклональными антителами, с последующим лизисом эритроцитов и фиксацией клеток раствором CellFIX (BD CellFIX № 340181) по стандартной методике [58]. В эксперименте использованы флуоресцирующие моноклональные анктитела производства Beckman Coulter и Beckton Dikinson (США): CD4-FITS, CD3-FITS, CD3-PE-Cy5, CD8-PE, CD161-PE, CD(16/56)-PE, CD45-PerCP, CD25PE-Cy7, CD19-PE, CD127-PE, CD25PE-Cy7. Проведение эксперимента по изучению влияния раствора дексаметазона на функциональную активность исследуемых популяций лимфоцитов включало подготовку лимфоконцентрата из пробы венозной крови по стандартной методике. Полученный лимфоконцентрат разводили 8000 мкл среды RPMI1640, предварительно подогретой до 370С. Полученную клеточную суспензию делили на 4 пробирки по 2000 мкл. Одну пробирку (2000 мкл клеточной суспензии) оставляли в качестве контроля, в другие 3 пробирки, содержащие по 2000 мкл лимфоконцентрата, добавляли 2, 20 и 200 мкл раствора дексаметазона и выдерживали в течении 1-го часа. Потом клетки отмывали с использованием среды RPMI-1640, предварительно подогретой до 370С в течение 10-ти минут. Клеточную суспензию после взаимодействия с раствором дексаметазона обрабатывали по методике для проточной цитофлуориметрии (проба «цитохимия»), описанной ранее. Проведено исследование влияния различного времени экспозиции раствора дексаметазона на митохондриальную активность исследуемых популяций 59 лимфоцитов периферической крови в предварительно полученном лимфоконцентрате. Клеточную суспензию готовили по стандартной методике. Полученный лимфоконцентрат разводили 6000 мкл среды RPMI-1640, предварительно подогретой до 370С. Полученную клеточную суспензию делили на 3 пробирки по 2000 мкл. Одну пробирку (2000 мкл клеточной суспензии) оставляли в качестве контроля, в другие 2 пробирки, содержащие по 2000 мкл лимфоконцентрата, добавляли 5 мкл раствора дексаметазона и выдерживали в течение 1-го и 3-х часов. Потом клетки отмывали с использованием среды RPMI-1640, предварительно подогретой до 370С в течение 10-ти минут при 2000 об./мин. Полученные после взаимодействия с раствором дексаметазона клетки, обрабатывали по методике проточной цитофлуориметрии, описанной ранее. В исследовании использованы флуоресцирующие моноклональные антитела производства Beckman Coulter и Beckton Dikinson (США): CD4-FITS, CD3-FITS, CD3-PerCP, CD19-PE, CD161PE, CD45-PERCP, CD45PE-Cy7, CD127-PE, CD25PE-Cy7. В ходе проведенного эксперимента методом проточной цитофлуориметрии были исследованы уровни экспрессии поверхностных рецепторов лимфоцитов (CD), оцениваемые по логарифму флуоресценции, количественный состав исследуемых популяций лимфоцитов и их функциональная активность (СДГ). 2.5. Статистические методы Для статистической обработки программу «STAISTICA-8.0» полученных («StatSoft Inc.», данных США). использовали При сравнении исследуемых групп друг с другом применены критерии непараметрической (Манна-Уитни) и параметрической (Стьюдента) статистики. Статистически значимыми считали различия при p<0,05. Результаты исследований представлены в виде М ± σ, где М – среднее значение, а σ – стандартное отклонение и в виде Me (LQ-HQ), где Me – медиана, LQ – нижняя квартиль, HQ – верхняя квартиль. 60 Для определения информативности (диагностической чувствительности (ДЧ) и диагностической специфичности (ДС)), а также оценки уровня пороговых значений (cut off) исследуемых параметров использовали метод характеристических кривых (receiver operator characteristic, ROC-анализ) с использованием программы «SPSS 16.0» («SPSS: An IMB Company», США). 61 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ПРЕДОПЕРАЦИОННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Результаты изучения анамнестических сведений в выявлении иммунокомпрометированных детей до операции Проведенные ранее исследования определяют высокую информативность анамнестических сведений в выявлении риска развития послеоперационных осложнений в хирургии врожденных катаракт [90]. Всем детям до операции на основании рекомендаций Мешковой Р.Я. с соавт. (1995) [57] было проведено исследование анамнестических факторов с целью выявления групп риска по развитию послеоперационной воспалительной реакции. У каждого ребенка определен ведущий тип наиболее вероятного иммунопатологического синдрома: инфекционный или аллергический. Анамнез пациентов, данные которых представлялись сомнительными в связи с дальней степенью родства сопровождающих (родственники второй и третьей степени родства: бабушки, дедушки, тети), не проживающих совместно с обследуемым ребенком в повседневной жизни и не владеющих достоверной информацией о перенесенных им заболеваниях, исключались из исследования. Симптомы, характеризующие инфекционный синдром, представлены в таблице 4. Таблица 4 Частота встречаемости симптомов, характеризующих инфекционный синдром, по группам, М±σ (n=102), ед. Симптом Длительный субфебрилитет, лихорадка Хронические инфекции ЛОР-органов (тонзиллит, аденоиды, отит) Бронхиты и пневмонии Группа 1 (n1=50) 0,04±0,20 0,12±0,33 0,36±0,48 62 Группа 2 (n2=52) 0,15±0,37* 0,19±0,40 0,42±0,50 Частые ОРВИ (дети из группы «ЧБД») 0,20±0,40 0,39±0,49* ОРВИ за 1 мес и менее до операции 0,20±0,40 0,15±0,36 Бактериальные инфекции кожи и подкожно-жировой клетчатки Корь в анамнезе 0,04±0,20 0,23±0,43* 0,0 0,08±0,27* Краснуха в анамнезе 0,04±0,20 0,04±0,19 Ветряная оспа в анамнезе 0,20±0,40 0,27±0,45 Эпидемический паротит в анамнезе 0,0 0,0 Коклюш в анамнезе 0,0 0,04±0,19 Патологические реакции на прививки 0,0 0,12±0,32* Грибковые инфекции кожи, слизистых, ногтей Паразитарные инфекции 0,0 0,04±0,19 0,12±0,3 0,12±0,32 Инфекции ротовой полости (кариес, стоматит) Герпес различной локализации 0,52±0,50 0,54±0,50 0,16±0,37 0,12±0,32 Лимфадениты 0,24±0,43 0,54±0,50* Урогенитальные инфекции (цистит, вульвит, пиелонефрит) Дисбиозы кишечника 0,08±0,27 0,12±0,32 0,28±0,45 0,42±0,50 Сепсис и другие генерализованные инфекции в анамнезе Оппортунистические инфекции 0,0 0,0 0,04±0,20 0,15±0,36* *p<0,05 при сравнении Группы 1 и Группы 2 М – среднее значение σ – стандартное отклонение Таким образом, на основании полученных данных, характеризующих инфекционный синдром, выявлено, что в Группе 2, с наличием воспалительной реакции в раннем послеоперационном периоде, в анамнезе достоверно чаще встречались: длительный субфебрилитет или лихорадка (p<0,05), увеличение частоты ОРВИ (дети из группы «ЧБД») (p<0,05), бактериальные инфекции кожи и подкожно-жировой клетчатки (p<0,01), корь 63 (p<0,05), патологические реакции на прививки (p<0,05), лимфадениты (p<0,01), оппортунистические инфекции (p<0,05). Суммарная оценка всех симптомов, составляющих инфекционный синдром, представлена в таблице 5. Таблица 5 Сумма баллов оценки симптомов, характеризующих инфекционный синдром, для всех случаев и по группам (n=102), % Сумма баллов 0 Всего (n=102) Группа 1 (n1=50) Группа 2 (n2=52) 2 (1,9%) 2 (4,0%) 0 (0,0%) 1 30 (29,5%) 18 (36,0%) 12 (23,2%) 2 6 (5,9%) 4 (8,0%) 2 (3,8%) 3 16 (15,7%) 12 (24,0%) 4 (7,7%) 4 22 (21,6%) 6 (12,0%) 16 (30,8%) 5 10 (9,9%) 4 (8,0%) 6 (11,6%) 6 6(5,9%) 2 (4,0%) 4 (7,7%) 7 4 (3,9%) 2 (4,0%) 2 (3,8%) 8 2 (1,9%) 0 2 (3,8%) 9 2 (1,9%) 0 2 (3,8%) 10 2 (1,9%) 0 2 (3,8%) При суммарной оценке симптомов, образующих инфекционный синдром, выявлено увеличение частоты развития послеоперационной воспалительной реакции у детей с суммой баллов ≥ 4-м. Симптомы, характеризующие аллергический синдром, представлены в таблице 6. 64 Таблица 6 Частота встречаемости симптомов, характеризующих аллергический синдром, по группам, М±σ (n=102), ед. Симптом Аллергическая патология кожи (дерматит, крапивница) Аллергическая патология ЛОР-органов (аллергический ринит, поллиноз) Группа 1 (n1=50) 0,44±0,50 Группа 2 (n2=52) 0,73±0,45* 0,04±0,20 0,12±0,32 0,0 0,04±0,19 Бронхолегочная патология (астматический бронхит, бронхиальная астма) *p<0,01 при сравнении Группы 1 и Группы 2 М – среднее значение σ – стандартное отклонение На основании полученных данных выявлено достоверно чаще встречающаяся отягощенность анамнеза по аллергической патологии кожи у детей Группы 2 (p<0,01). Суммарная оценка всех симптомов, характеризующих аллергический синдром, представлена в таблице 7. Таблица 7 Сумма баллов оценки симптомов, характеризующих аллергический синдром, для всех случаев и по группам (n=102), % Сумма баллов 0 Всего (n=102) Группа 1 (n1=50) Группа 2 (n2=52) 42 (41,2%) 28 (56,0%) 14 (26,9%) 1 50 (49,0%) 20 (40,0%) 30 (57,7%) 2 10 (9,8%) 2 (4,0%) 8 (15,4%) В Группе 2 у более 70% детей была выявлена отягощенность аллергологического анамнеза (сумма баллов аллергического синдрома ≥ 1). Отмечается увеличение риска развития послеоперационной воспалительной реакции у детей с суммой баллов аллергического синдрома равной 2-м в 3,85 раз. 65 Кроме того, были определены ряд факторов, отягощающих анамнез жизни детей (патологическое течение беременности, наличие врожденных пороков), которые представлены в таблице 8. Таблица 8 Частота встречаемости факторов, отягощающих анамнез жизни, по группам, М±σ (n=102), ед. Фактор Группа 1 (n1=50) Группа 2 (n2=52) Мертворождения в анамнезе у матери 0,04±0,20 0,12±0,32 Преждевременное разрешение данной беременности Наличие вредных привычек у матери во время беременности Наличие профессиональных вредностей во время беременности Внутриутробная инфекция 0,20±0,40 0,12±0,32 0,16±0,37 0,08±0,27 0,0 0,0 0,20±0,40 0,31±0,47 Герпес во время беременности 0,04±0,20 0,0 Токсикоз I-ой половины беременности 044±0,50 0,65±0,48* Гестоз II-ой половины беременности 0,60±0,49 0,58±0,50 Другие (неофтальмологические операции) в анамнезе у ребенка Синдром Дауна 0,20±0,40 0,12±0,32 0,04±0,20 0,04±0,19 Порок сердца 0,04±0,20 0,12±0,32 Оперированный порок сердца 0,04±0,20 0,08±0,27 ДЦП 0,04±0,20 0,08±0,27 Эпилепсия 0,04±0,20 0,08±0,27 *p<0,05 при сравнении Группы 1 и Группы 2 М – среднее значение σ – стандартное отклонение Оценка факторов, отягощающих анамнез жизни, характеризует более частое выявление токсикоза I-ой половины беременности у матерей пациентов Группы 2. 66 Суммарная оценка отягощенности анамнеза жизни представлена в таблице 9. Таблица 9 Сумма баллов оценки факторов, отягощающих анамнез жизни, для всех случаев и по группам (n=102), % Сумма баллов 0 Всего (n=102) Группа 1 (n1=50) Группа 2 (n2=52) 10 (9,8%) 8 (16,0%) 2 (3,8%) 1 32 (31,4%) 16 (32,0%) 16 (30,8%) 2 30 (29,5%) 14 (28,0%) 16 (30,8%) 3 10 (9,8%) 2 (4,0%) 8 (15,5%) 4 10 (9,8%) 4 (8,0%) 6 (11,5%) 5 2 (1,9%) 2 (4,0%) 0 (0,0%) 6 2 (1,9%) 0 (0,0%) 2 (3,8%) 7 6 (5,9%) 4 (8,0%) 2 (3,8%) Суммарная оценка факторов, отягощающих анамнез жизни, не выявила достоверной информативности по данному параметру. Для выявления наиболее информативных анамнестических показателей в прогнозировании ПВР проведен ROC-анализ. Учитывая наличие второго перекреста в лейкоцитарной формуле у детей в возрасте 5-ти лет, определяющего изменение количественных характеристик лейкоцитов и лимфоцитов, наиболее информативные анамнестические характеристики выявляли у детей 2-5-ти лет и 6-14-ти лет (Табл. 10). 67 Таблица 10 ROC-анализ анамнестических показателей в ПВР у детей 2-5-ти и 6-14-ти лет с врожденными катарактами Показатель Площадь под ROC-кривой AUC, p<0,05 Дети 2-5 лет Сумма баллов инфекционного синдрома AUC=0,665 (0,501-0,830) Дети 6-14 лет Сумма баллов аллергического синдрома AUC=0,731 (0,598-0,864) Токсикоз I-ой половины беременности AUC=0,718 (0,581-0,855) Сумма баллов инфекционного синдрома AUC=0,700 (0,561-0,839) Определение суммы баллов аллергического синдрома, токсикоза I-ой половины беременности у матери и суммы баллов инфекционного синдрома у детей 6-14-ти лет характеризовалось хорошим прогностическим качеством модели (AUC=0,7-0,8), суммы баллов инфекционного синдрома у детей 2-5-ти лет – удовлетворительным прогностическим качеством модели (AUC=0,6-0,7). Для суммы баллов инфекционного синдрома у детей 2-5-ти и 6-14-ти лет и для суммы баллов аллергического синдрома у детей 6-14-ти лет были определены пороговые значения (cut-off) (Табл. 11). Таблица 11 Пороговое значение, чувствительность и специфичность наиболее информативных анамнестических показателей в прогнозе ПВР у детей 2-5-ти и 6-14-ти лет Показатель Сумма баллов инфекционного синдрома Пороговое Чувствительность, Специфичность, значение % % 2-5 лет 4 балла 69,2 80,0 76,9 60,0 6-14 лет Сумма баллов аллергического синдрома 1 балл 68 Сумма баллов инфекционного синдрома Таким образом, 3 балла наиболее 76,9 значимыми 46,7 для прогнозирования послеоперационной воспалительной реакции у детей 2-5-ти лет является сумма баллов инфекционного синдрома 4 и более (ДЧ=69,2%, ДС=80,0%, p<0,05), у детей 6-14-ти лет – сумма баллов аллергического синдрома 1 и более (ДЧ=76,9%, ДС=60,0%, p<0,05), наличие токсикоза I-ой половины беременности (p<0,05), сумма баллов инфекционного синдрома – 3 и более (ДЧ=76,9%, ДС=46,7%, p<0,05). 3.2. Результаты исследования иммунофенотипа лимфоцитов периферической крови у детей с врожденными катарактами Для достижения цели работы была изучена возможность прогнозирования развития ПВР у детей с врожденными катарактами на основе данных исследования популяционного состава лимфоцитов периферической крови. Учитывая изменения количественных характеристик лейкоцитов у детей в 5-летнем возрасте, обусловленных вторым перекрестом в лейкоцитарной формуле, были оценены иммунофенотипы лимфоцитов периферической крови у детей 2-5-ти лет и 6-14-ти лет. 3.2.1. Результаты исследования иммунофенотипа лимфоцитов периферической крови у детей 2-5-ти лет Для определения прогностических возможностей показателей клеточного иммунитета у детей 2-5-ти лет с врожденными катарактами было проведено исследование основных популяций лимфоцитов. Сравнение количественных характеристик основных популяций лимфоцитов у детей 2-5-ти лет до операции не выявило значительных отклонений относительного и абсолютного количества основных популяций лимфоцитов от возрастной нормы [100]. Тем не менее, отмечено достоверное снижение относительного количества 69 Т-лимфоцитов, снижение относительного количества цитотоксических Т-лимфоцитов, снижение относительного и абсолютного количества активированных Т-лимфоцитов, увеличение показателя иммунорегуляторного индекса (CD4/CD8), увеличение относительного количества В-лимфоцитов, увеличение абсолютного количества NK-клеток у детей Группы 2 (Табл. 12; рис. 1-2). Таблица 12 Содержание основных популяций лимфоцитов у детей от 2-х до 5-ти лет с врожденными катарактами до операции Популяции лимфоцитов Т-лимфоциты (CD3+CD45+) T-хелперы (CD3+CD4+CD45+) Цитотоксические Тлимфоциты (CD3+CD8+CD45+) В-лимфоциты (CD3-CD19+CD45+) Активированные Тлимфоциты (CD3+HLA-DR+) NK-клетки (CD3-CD16+/CD56+) Содержание клеток Относительное количество, % Абсолютное количество, кл/мкл (Ме, LQ-HQ) Группа 1 Группа 2 74,9 (66,2-79,2) 3032,4 (2525,4-3416,9) 36,0 (35,1-42,8) 1552,4 (1355,5-1763,8) 28,8 (26,7-30,0) 1180,5 (1001,6-1374,2) 13,7 (12,2-17,3) 609,6 (443,5-824,5) 5,4 (3,3-7,0) ((% от CD3+) 7,2 (3,3-8,4)) 232,5 (158,3-354,2) 10,1 (9,0-10,5) 398,7 (373,5-424,9) 1,3 (1,0-1,7) 66,7 (64,3-68,3)* 2937,4 (2272,4-3537,7) 40,2 (33,0-42,7) 1694,5 (1320,4-2194,1) 24,2 (19,9-26,2)* 1093,3 (1027,0-1228,7) 22,9 (16,6-25,4)* 915,5 (679,3-1177,5)* 2,5 (2,0-5,7)* ((% от CD3+) 2,9 (2,0-6,2))* 130,2 (84,0-242,0)* 10,3 (7,9-19,1) 509,0 (426,4-540,3)* 1,7 (1,3 -2,0)* Норма Относительное количество, % Абсолютное количество, кл/мкл 62-80 1610-4230 35-51 900-2860 22-38 630-1910 21-28 700-1300 3-13 4-17 130-720 Иммунорегуляторный индекс (CD4+/CD8+) *p<0,05 при сравнении Группы 1 и Группы 2 При сравнительном анализе показателей обеих 1,0-2,1 групп выявлено достоверное снижение активированных Т-лимфоцитов ниже возрастной 70 нормы в Группе 2, остальные показатели в Группе 2 соответствовали нормативным значениям. 90 40 p=0,016 p=0,0004 35 Т-цитотоксические клетки, % Т-лимфоциты, % 80 70 60 50 40 30 25 20 15 30 Группа 1 Группа 2 Median 25%-75% Min-Max 10 Группа 1 Группа 2 Median 25%-75% Min-Max А В Рис. 1. Относительное количество Т-лимфоцитов (А) и цитотоксических Тлимфоцитов (В) у детей Группы 1 (отсутствие воспалительной реакции) и Группы 2 (наличие воспалительной реакции) в возрасте 25-ти лет 1400 800 p=0,0025 p=0,0048 700 1000 NK-клетки, клеток/мкл В-лимфоциты, клеток/мкл 1200 800 600 400 600 500 400 300 200 0 Группа 1 Группа 2 Median 25%-75% Min-Max 200 Группа 1 Группа 2 Median 25%-75% Min-Max А В Рис. 2. Абсолютное количество В-лимфоцитов (А) и NK-клеток (В) у детей Группы 1 (отсутствие воспалительной реакции) и Группы 2 (наличие воспалительной реакции) в возрасте 2-5-ти лет Для выявления наиболее информативных показателей в прогнозировании ПВР у детей 2-5-ти лет с врожденными катарактами был проведен ROCанализ результатов исследования количественных характеристик основных популяций лимфоцитов периферической крови (Табл. 13, рис. 3). 71 Таблица 13 ROC-анализ количественных характеристик основных популяций лимфоцитов периферической крови в прогнозе ПВР у детей 2-5-ти лет с врожденными катарактами Популяции лимфоцитов Площадь под ROC-кривой AUC, p<0,05 0,850 (0,736-0,964) Цитотоксические Т-лимфоциты, % Иммунорегуляторный индекс (CD4/CD8) В-лимфоциты, % 0,825 (0,702-0,948) В-лимфоциты, клеток/мкл 0,742 (0,596-0,888) Т-лимфоциты, % 0,742 (0,587-0,896) Активированные Т-лимфоциты, % от CD3+CD45+ NK-клетки, клеток/мкл 0,721 (0,568-0,874) Активированные Т-лимфоциты, % 0,712 (0,558-0,867) NK-клетки, % 0,642 (0,475-0,808) Т-хелперы, клеток/мкл 0,675 (0,508-0,842) 0,775 (0,630-0,920) 0,717 (0,548-0,885) AUC=0,850 (0,736-0,964) AUC=0,825 (0,702-0,948) Цитотоксические Т-клетки, % CD4/CD8 А В Рис. 3. ROC-кривые для относительного количества цитотоксических Тлимфоцитов (А) и иммунорегуляторного индекса (CD4/CD8) (В) у детей 2-5-ти лет, p<0,05 72 Определение относительного количества цитотоксических Т-лимфоцитов и иммунорегуляторного индекса характеризовалось очень хорошим качеством модели (интервал AUC 0,8-0,9), относительного количества Т-лимфоцитов, Влимфоцитов, активированных Т-лимфоцитов и абсолютного количества Влимфоцитов и NK-клеток – хорошим прогностическим качеством модели (интервал AUC 0,7-0,8). Вероятность правильного прогноза ПВР на основе определения исходных концентраций других популяций лимфоцитов не превышала вероятность случайных событий. Для наиболее информативных показателей был определен уровень пороговых значений (cut-off) (Табл. 14). Таблица 14 Пороговое значение, чувствительность и специфичность наиболее информативных количественных показателей основных популяций лимфоцитов в прогнозе ПВР у детей 2-5-ти лет с врожденными катарактами Показатель Пороговое значение Чувствительность, Специфичность, % % Цитотоксические Тлимфоциты, % Иммунорегуляторный индекс (CD4/CD8) 26,4 83,3 80,0 1,24 91,7 50,0 Таким образом, иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови у детей с врожденными катарактами позволяют с высокой вероятностью прогнозировать развитие послеоперационном периоде. воспалительной Наиболее реакции значимыми в раннем показателями для прогнозирования ПВР у детей 2-5-ти лет являются: снижение относительного количества цитотоксических Т-лимфоцитов менее 26,4% и увеличение иммунорегуляторного индекса более 1,24. Актуальность изучения малых популяций лимфоцитов, возрастающая в последние годы [84, 85], обусловила дальнейшие исследования у детей 2-5-ти лет с врожденными катарактами. 73 Исследование субпопуляций В-лимфоцитов в периферической крови до операции у детей 2-5-ти лет выявило увеличение относительного и абсолютного количества В2-лимфоцитов в Группе 2 (Табл. 15, рис. 4). Таблица 15 Содержание малых популяций В-лимфоцитов у детей в возрасте от 2-х до 5-ти лет с врожденными катарактами до операции Популяции лимфоцитов Содержание клеток Относительное значение, %, (%CD19+) Абсолютное значение, клеток/мкл, (Ме, LQ-HQ) Группа 1 Группа 2 В1-лимфоциты (CD3-CD19+CD5+) 7,8 (3,6-8,6) 46,6 (29,7-57,7) 301,4 (123,6-462,7) В2-лимфоциты 8,5 (5,3-10,8) (CD3-CD19+CD5-) 53,5 (42,3-70,3) 375,0 (198,3-460,4) *p<0,05 при сравнении Группы 1 и Группы 2 7,4 (5,8-10,3) 36,9 (34,9-45,7) 310,3 (250,7-409,7) 11,5 (9,2-15,5)* 63,1 (54,3-65,1) 605,2 (428,6-796,2)* 22 20 p=0,0009 18 В2-лимфоциты, % 16 14 12 10 8 6 4 2 Группа 1 Группа 2 Median 25%-75% Min-Max Рис. 4. Относительное количество В2-лимфоцитов у детей Группы 1 (отсутствие воспалительной реакции) и Группы 2 (наличие воспалительной реакции) в возрасте 2-5-ти лет Исследование малых популяций лимфоцитов в периферической крови до операции у детей 2-5-ти лет выявило уменьшение относительного количества активированных Т-хелперов в Группе 2 (Таблица 16, рисунок 5). 74 Таблица 16 Содержание малых популяций лимфоцитов у детей в возрасте от 2-х до 5-ти лет с врожденными катарактами до операции Популяции лимфоцитов Содержание клеток Относительное значение, %, (%CD4+) Абсолютное значение, клеток/мкл, (Ме, LQ-HQ) Группа 1 Группа 2 Th2-лимфоциты (CD3+CD4+CD294+) 0,3 (0,2-0,5) 0,8 (0,5-1,2) 12,8 (8,1-14,9) Treg-лимфоциты 3,3 (0,8-4,8) low (CD4+CD25+CD127 ) 9,2 (2,1-12,0) 150,0 (31,3-162,7) Активированные Т3,2 (2,5-3,4) хелперы 8,3 (6,5-9,6) high (CD4+CD25+CD127 ) 104,8 (79,9-180,8) Th-17-лимфоциты 4,1 (3,5-5,0) (CD3+CD4+CD161+) 11,5 (10,1-12,4) 164,8 (141,8-169,9) *p<0,05 при сравнении Группы 1 и Группы 2 0,2 (0,1-0,6) 0,5 (0,4-1,6) 12,7 (6,9-20,2) 3,5 (2,9-4,7) 9,0 (8,1-11,1) 152,5 (107,5-221,7) 2,3 (1,6-3,3)* 5,3 (3,9-10,2)* 90,1 (64,4-131,6) 3,8 (3,5-5,3) 10,2 (8,0-13,1) 151,2 (146,6-220,4) 7 p=0,03 Активированные Т-хелперы, % 6 5 4 3 2 1 0 Группа 1 Группа 2 Median 25%-75% Min-Max Рис. 5. Относительное количество активированных Т-хелперов у детей Группы 1 (отсутствие воспалительной реакции) и Группы 2 (наличие воспалительной реакции) в возрасте 2-5-ти лет ROC-анализ малых популяций лимфоцитов у детей 2-5-ти лет выявил, что определение абсолютного количества Th17-лимфоцитов, абсолютного и относительного количества В2-лимфоцитов характеризовалось хорошим прогностическим качеством моделей (интервал AUC 0,7-0,8) (Табл. 17) 75 Таблица 17 ROC-анализ количественных характеристик малых популяций лимфоцитов периферической крови в прогнозе ПВР у детей 2-5-ти лет с врожденными катарактами Популяции лимфоцитов Площадь под ROC-кривой AUC, p<0,05 0,775 (0,632-0,918) Th17-лимфоциты, клеток/мкл В2-лимфоциты, % 0,758 (0,618-0,899) В2-лимфоциты, клеток/мкл 0,708 (0,555-0,861) Активированные Т-хелперы, % 0,683 (0,520-0,846) Активированные Т-хелперы, % от CD4 0,650 (0,501-0,819) Учитывая отсутствие высокой прогностической значимости количественных характеристик малых популяций лимфоцитов у детей 2-5-ти лет, уровни пороговых значений не определялись. Достоверность прогноза ПВР на основе определения других количественных характеристик малых популяций лимфоцитов не превышала вероятность случайных событий. Таким образом, изучение показателей иммунофенотипа у детей 2-5-ти лет выявило достоверное снижение относительного количества Т-лимфоцитов (p=0,016), увеличение лимфоцитов (p=0,0025 относительного и p=0,0025), и абсолютного уменьшение количества относительного Ви абсолютного количества активированных Т-лимфоцитов (p=0,004 и p=0,04), увеличение абсолютного количества NK-клеток (p=0,0048), уменьшение относительного количества активированных Т-хелперов в общей популяции лимфоцитов (p=0,03), увеличение абсолютного и относительного количества В2-лимфоцитов (p=0,002 и p=0,0009) в Группе 2 по сравнению с Группой 1. Наиболее информативными показателями при оценке популяционного состава лимфоцитов в прогнозе развития ПВР у детей 2-5-ти лет являются: содержание цитотоксических Т-лимфоцитов 76 менее 26,4% (ДЧ=83,3%, ДС=80,0%, p<0,05), увеличение иммунорегуляторного индекса более 1,24 (ДЧ=91,7%, ДС=50,0%, p<0,05). 3.2.2. Результаты исследования иммунофенотипа у детей 6-14-ти лет Для определения прогностических возможностей показателей клеточного иммунитета у детей 6-14-ти лет с врожденными катарактами также было проведено исследование основных и малых популяций лимфоцитов. Сравнение количественных характеристик основных популяций лимфоцитов у детей от 6-ти до 14-ти лет до операции не выявило значительных отклонений относительного и абсолютного количества основных популяций лимфоцитов от возрастной нормы [100]. Тем не менее, в Группе 2 отмечено достоверное снижение относительного и абсолютного количества NK-клеток по сравнению с Группой 1 (Табл. 18, рис. 6). Таблица 18 Содержание основных популяций лимфоцитов у детей от 6-ти до 14-ти лет с врожденными катарактами до операции Популяции лимфоцитов Т-лимфоциты (CD3+CD45+) T-хелперы (CD3+CD4+CD45+) Цитотоксические Тлимфоциты (CD3+CD8+CD45+) В-лимфоциты (CD3-CD19+CD45+) Содержание клеток Норма Относительное количество, % Относительное Абсолютное количество, кл/мкл (Ме, количество, % LQ-HQ) Абсолютное количество, Группа 1 Группа 2 кл/мкл 74,2 (70,1-78,2) 75,8 (72,0-76,4) 66-76 1976,2 2207,0 1400-2000 (1607,0-2456,0) (1509,4-2558,9) 38,3 (35,9-40,4) 1011,0 (810,4-1399,6) 28,0 (25,3-31,7) 763,7 (616,1-1006,9) 11,9 (10,0-16,9) 357,2 (300,4-432,1) 77 41,5 (34,7-45,9) 1156,1 (904,1-1508,8) 29,1 (24,2-36,5) 808,8 (543,8-1169,6) 14,7 (11,6-17,3) 395,8 (274,7-524,8) 33-41 700-1100 27-35 600-900 12-22 300-500 Активированные Тлимфоциты (CD3+HLA-DR+) NK-клетки (CD3-CD16+CD56+) 7,3 (5,4-10,4) 5,1 (3,4-11,1) ((% от CD3+) 10,4 (% от CD3+) 5,1 (7,6-12,7)) (3,6-13,2)) 167,1 152,1 (127,5-397,2) (104,9-298,5) 14,0 (10,5-16,6) 10,8 (8,3-13,1)* 346,1 272,3 (376,0-529,8) (232,2-398,9)* 1,3 (1,0-1,7) 1,4 (1,0-1,8) 3-13 10,6-22,4 257-619 Иммунорегуляторный индекс (CD4+/CD8+) *p<0,05 при сравнении Группы 1 и Группы 2 22 900 p=0,01 20 NK-клетки, клеток/мкл 700 16 NK-клетки, % p=0,04 800 18 14 12 10 600 500 400 300 8 200 6 4 1,1-1,4 Группа 1 Группа 2 Median 25%-75% Min-Max 100 Группа 1 Median 25%-75% Min-Max Группа 2 А В Рис. 6. Относительное (А) и абсолютное (В) количество NK-клеток у детей Группы 1 (отсутствие воспалительной реакции) и Группы 2 (наличие воспалительной реакции) в возрасте 6-14-ти лет ROC-анализ выявил удовлетворительную прогностическую значимость (интервал AUC=0,6-0,7) количественных характеристик основных популяций лимфоцитов у детей 6-14-ти лет (Табл. 19). Таблица 19 ROC-анализ количественных характеристик основных популяций лимфоцитов периферической крови в прогнозе ПВР у детей 6-14-ти лет с врожденными катарактами Популяции лимфоцитов Площадь под ROC-кривой AUC, p<0,05 0,689 (0,555-0,823) NK-клетки, % Т-хелперы, клеток/мкл 0,655 (0,515-0,796) 78 NK-клетки, клеток/мкл 0,651 (0,512-0,791) В-лимфоциты, % 0,626 (0,484-0,768) Учитывая отсутствие высокой прогностической значимости количественных характеристик основных популяций лимфоцитов у детей 614-ти лет, уровни пороговых значений не определялись. Исследование малых популяций лимфоцитов в периферической крови у детей с врожденными катарактами в возрасте от 6-ти до 14-ти лет до операции выявило увеличение относительного и абсолютного количества Th17лимфоцитов у детей Группы 2 (Табл. 20, рис. 7). Таблица 20 Содержание малых популяций лимфоцитов у детей в возрасте от 6-ти до14-ти лет с врожденными катарактами до операции Популяции лимфоцитов Содержание клеток Относительное значение, %, (%CD4+), Абсолютное значение, клеток/мкл, (Ме, LQ-HQ) Группа 1 Группа 2 Th2-лимфоциты (CD3+CD4+CD294+) 0,5 (0,3-0,6) 1,2 (1,0-1,3) 13,5 (7,8-18,2) Treg-лимфоциты 2,6 (2,2-3,6) low (CD4+CD25+CD127 ) 7,2 (6,1-8,5) 69,9 (62,4-106,6) Активированные Т3,7 (2,6-4,5) хелперы 10,0 (7,8-12,3) high (CD4+CD25+CD127 ) 108,0 (81,7-135,8) Th-17-лимфоциты 6,1 (5,4-7,4)* (CD3+CD4+CD161+) 14,9 (14,0-17,1)* 175,8 (148,1-187,2)* *p<0,05 при сравнении группы 1 и группы 2 79 0,5 (0,3-0,7) 1,2 (0,7-1,6) 13,7 (6,9-19,9) 2,8 (2,4-3,6) 7,6 (5,9-9,2) 80,2 (54,9-95,9) 3,6 (2,9-4,7) 9,4 (7,1-12,7) 96,5 (86,6-122,2) 7,6 (5,1-8,3)* 19,8 (16,6-23,0)* 219,4 (162,7-273,2)* 400 p=0,002 Th17-лимфоциты, клеток/мкл 350 300 250 200 150 100 50 Группа 1 Группа 2 Median 25%-75% Min-Max Рис. 7. Абсолютное количество Th17-лимфоцитов у детей Группы 1 (отсутствие воспалительной реакции) и Группы 2 (наличие воспалительной реакции) в возрасте 6-14-ти лет Исследование малых популяций В-лимфоцитов в периферической крови у детей с врожденными катарактами в возрасте 6-14-ти лет до операции выявило увеличение относительного количества В2-лимфоцитов (Табл. 21). Таблица 21 Содержание малых популяций В-лимфоцитов у детей в возрасте 6-14-ти лет с врожденными катарактами до операции Популяции лимфоцитов Содержание клеток Относительное значение, %, (%CD19+), Абсолютное значение, клеток/мкл, (Ме, LQ-HQ) Группа 1 Группа 2 В1-лимфоциты (CD3-CD19+CD5+) 4,0 (2,7-5,3) 33,8 (26,3-52,0) 118,7 (97,7-143,4) В2-лимфоциты 8,0 (4,8-9,1) (CD3-CD19+CD5-) 66,2 (48,0-73,7) 210,1 (161,6-264,3) *p<0,05 при сравнении группы 1 и группы 2 5,4 (4,0-6,8) 34,8 (24,1-45,4) 149,1 (113,1-178,4) 10,3 (6,7-12,2)* 65,3 (54,6-75,9) 283,9 (147,6-383,0) ROC-анализ малых популяций лимфоцитов у детей 6-14-ти лет выявил, что определение абсолютного количества Th17-лимфоцитов характеризовалось очень хорошим прогностическим качеством модели (AUC=0,887 (0,801-0,972), p<0,05) (Табл. 22). 80 Таблица 22 ROC-анализ количественных характеристик малых популяций лимфоцитов периферической крови в прогнозе ПВР у детей 6-14-ти лет с врожденными катарактами Популяции лимфоцитов Площадь под ROC-кривой AUC, p<0,05 0,887 (0,801-0,972) Th17-лимфоциты, клеток/мкл В2-лимфоциты, % 0,634 (0,486-0,783) В1-лимфоциты, % 0,626 (0,482-0,770) Достоверность прогноза воспалительной реакции в раннем послеоперационном периоде на основе определения исходных концентраций других малых популяций лимфоцитов не превышала вероятность случайных событий. Уровень порогового значения был определен для наиболее значимого иммунологического показателя – абсолютного количества Тh17лимфоцитов и составил 190 клеток/мкл (ДЧ=85,7%, ДС=85,3%, p<0,05). Таким образом, изучение показателей иммунофенотипа лимфоцитов периферической крови у детей 6-14-ти лет выявило достоверное снижение относительного и абсолютного количества NK-клеток (p=0,01 и p=0,04), увеличение относительного количества Th17-лимфоцитов в популяции Тхелперов (p=0,017), увеличение абсолютного количества Th17-лимфоцитов (p=0,002), увеличение относительного количества В2-лимфоцитов (p=0,005) в Группе 2. Наиболее информативным показателем Т-клеточного звена иммунитета в прогнозе развития ПВР у детей 6-14-ти лет является увеличение абсолютного количества Th17-лимфоцитов более 190 клеток/мкл (ДЧ=85,7%, ДС=85,3%, p<0,05). 81 3.3. Результаты исследования активности сукцинатдегидрогеназы в общей популяции лимфоцитов Одним из факторов, определяющих высокую частоту послеоперационной воспалительной реакции у детей с врожденными катарактами, является исходный иммунный статус ребенка до операции. В работах Комаха Ю.А. (1995) [45], Тонаевой Х.Д. (2014) [83] показана значимость метода количественного определения активности СДГ лимфоцитов периферической крови в прогнозировании вероятности помутнения трансплантата при сквозной кератопластике. Для прогнозирования воспалительной реакции у детей с врожденными катарактами в данной работе были использованы цитохимические исследования. 3.3.1. Результаты исследования активности сукцинатдегидрогеназы в общей популяции лимфоцитов У всех пациентов перед проведением аспирации врожденной катаракты с имплантацией ИОЛ изучалась активность СДГ лимфоцитов периферической крови методом световой использованием микроскопии аппаратно-программного и цитоморфоденситометрии комплекса «Видеотест» с и программы «Морфология-5.2». Затем, на протяжении 7-10 дней, оценивалась степень воспалительной реакции. Данные цитохимического исследования активности СДГ в лимфоцитах периферической крови у детей 2-5-ти лет представлены в таблице 23 и на рисунке 8. Таблица 23 Активность СДГ в лимфоцитах периферической крови детей 2-5-ти лет с врожденными катарактами до операции, усл. ед. Цитохимические параметры Количество гранул, усл. ед. Показатели, усл.ед. (Me, LQ-HQ) Группа 1 Группа 2 17,5 (16,5-18,3) 16,0 (16,1-17,2)* 82 Норма, усл.ед. 18,7-19,9 Общая оптическая плотность гранул, усл. ед. Площадь гранул, усл. ед. Интегральная оптическая плотность гранул, усл. ед. % клеток с кластерами 0,48 (0,45-0,51) 0,44 (0,40-0,49) 0,469-0,528 12,7 (12,2-13,8) 9,6 (9,5-11,10)* 11,0-13,0 1051,1 (938,5-1245,3) 793,7 (773,7-855,4)* 840-1000 95,8 (89,4-100,0) 75,0 (66,7-90,0) >80% *p<0,05 при сравнении Группы 1 Группы 2 21 p=0,01 20 Активность СДГ, усл.ед. 19 18 17 16 15 14 13 Группа 1 Группа 2 Median 25%-75% Min-Max Рис. 8. Активность СДГ (количество гранул) у детей Группы 1 (отсутствие воспалительной реакции) и Группы 2 (наличие воспалительной реакции) в возрасте 2-5-ти лет Выявлено достоверное снижение площади и интегральной оптической плотности гранул (ИОП) в Группе 2. У детей Группы 1 ИОП и площадь гранул соответствовали нормативным значениям (Рис. 9). 83 1500 p=0,000002 Площадь гранул, СДГ, Ме, усл.ед. 16 15 14 13 12 11 10 9 8 Группа 1 Группа 2 Median 25%-75% Min-Max Интегральная оптическая плотность гранул, СДГ, усл. ед. 17 p=0,0001 1400 1300 1200 1100 1000 900 800 700 600 Группа 1 Median 25%-75% Min-Max Группа 2 А В Рис. 9. Активность СДГ (площадь гранул) (А) и ИОП (В) у детей Группы 1 группы (отсутствие воспалительной реакции) и Группы 2 (наличие воспалительной реакции) в возрасте 2-5-ти лет Для выявления наиболее информативных показателей в прогнозировании ПВР у детей 2-5-ти лет с врожденными катарактами был проведен ROCанализ данных цитохимических исследований. Определение исходной активности СДГ площадь гранул характеризовалось отличным прогностическим качеством модели (AUC=0,955 (0,896-0,999), p<0,05), ИОП гранул и процента клеток с кластерами – очень хорошим прогностическим качеством модели (интервал AUC 0,8-0,9), количество гранул в общей популяции лимфоцитов – хорошим прогностическим качеством модели (интервал AUC 0,7-0,8). Результаты проведенного ROC-анализа представлены в таблице 24. Таблица 24 ROC-анализ активности СДГ в лимфоцитах периферической крови в прогнозе ПВР у детей 2-5-ти лет с врожденными катарактами Цитохимические параметры Площадь под ROC-кривой AUC, p<0,05 0,955 (0,896-1,000) Площадь гранул ИОП гранул 0,852 (0,733-0,972) % клеток с кластерами 0,852 (0,723-0,962) Количество гранул 0,720 (0,544-0,856) 84 Общая оптическая плотность гранул 0,670 (0,482-0,859) Наиболее прогностически значимыми показателями активности СДГ в общей популяции лимфоцитов являются площадь гранул ферментативной реакции СДГ, ИОП, % клеток с кластерами и количество гранул. Уровень порогового значения (cut-off) был определен для наиболее значимых показателей (Табл. 25). Таблица 25 Пороговое значение, чувствительность и специфичность наиболее информативных показателей активности СДГ в прогнозе ПВР у детей 2-5-ти лет с врожденными катарактами Показатель Количество гранул, усл. ед. Общая оптическая плотность гранул, усл. ед. Площадь гранул, усл. ед. ИОП гранул, усл. ед. % клеток с кластерами Пороговое значение 17,0 Чувствительность, Специфичность, % % 69,2 60,0 0,481 72,7 62,5 11,7 90,9 87,5 859 81,8 87,5 90,8 81,8 62,5 На основании полученных данных, можно прогнозировать развитие послеоперационной воспалительной реакции при уменьшении количества гранул менее 17,0 усл.ед., общей оптической плотности гранул – менее 0,481 усл. ед., площади гранул – менее 11,7 усл. ед., ИОП – менее 859 усл. ед., % клеток с кластерами – менее 90,8% (p<0,05). Таким образом, наиболее значимыми цитоморфоденситометрическими показателями активности СДГ лимфоцитов периферической крови являются – площадь, ИОП гранул и % клеток с кластерами. 85 Аналогичные исследования были проведены у детей 6-14-ти лет. Полученные результаты представлены в таблице 26. Таблица 26 Активность СДГ в лимфоцитах периферической крови детей 6-14-ти лет с врожденными катарактами до операции, усл. ед. Цитохимические Показатели, усл.ед. (Me, LQ-HQ) параметры Группа 1 Группа 2 Количество гранул, 17,7 (17,0-19,6) 16,9 (16,8-18,0)* усл. ед. Общая оптическая 0,475 0,445 плотность гранул, (0,464-0,519) (0,365-0,488)* усл. ед. Площадь гранул, 11,65 10,52 усл. ед. (10,47-12,17) (8,89-11,60)* ИОП гранул, усл. 1006,4 856,6 ед. (933,8-1093,8) (709,1-890,6)* % клеток с 72,5 (68,7-75,2) 64,8 (61,4-73,8)* кластерами *p<0,05 при сравнении Группы 1 и Группы 2 Исследование активности СДГ выявило Норма, усл.ед. 18,7-19,9 0,469-0,528 11,0-13,0 840-1000 >80% снижение активности исследуемого фермента в Группе 1 и Группе 2 у детей 6-14-ти лет. Более выраженное снижение активности СДГ по сравнению с нормативными значениями отмечалось в группе детей, у которых развилась воспалительная реакция (Группа 2) в раннем послеоперационном периоде (Рис. 10). 86 22 p=0,04 21 Активность СДГ, усл.ед. 20 19 18 17 16 15 14 13 Группа 1 Группа 2 Median 25%-75% Min-Max Рис. 10. Активность СДГ (количество гранул) у детей Группы 1 (отсутствие воспалительной реакции) и Группы 2 (наличие воспалительной реакции) в возрасте 6-14-ти лет Кроме того, выявлено достоверное снижение площади и общей оптической плотности гранул ниже нормы в Группе 2; а ИОП соответствовала нормативным значениям, но в Группе 2 данный показатель был достоверно ниже (Рис. 11). Таким образом, выявление снижения активности СДГ в общей популяции лимфоцитов позволяет предположить развитие ПВР у детей 6-14ти лет с врожденными катарактами. 1300 p=0,006 Площадь гранул, СДГ, Ме, усл.ед. 13 12 11 10 9 8 7 Группа 1 Группа 2 Median 25%-75% Min-Max Интегральная оптическая плотность гранул, СДГ, усл.ед. 14 p=0,0002 1200 1100 1000 900 800 700 600 500 400 Группа 1 Группа 2 Median 25%-75% Min-Max А В Рис. 11. Активность СДГ (площадь гранул) (А) и ИОП (В) у детей Группы 1 (отсутствие воспалительной реакции) и Группы 2 (наличие воспалительной реакции) в возрасте 6-14-ти лет Для выявления наиболее информативных показателей в прогнозировании ПВР у детей 6-14-ти лет с врожденными катарактами был проведен ROCанализ данных цитохимических исследований. 87 Определение ИОП характеризовалось очень хорошим прогностическим качеством модели (AUC=0,816 (0,685-0,946), p<0,05), общей оптической плотности, площади гранул и процента клеток с кластерами – хорошим прогностическим качеством модели (интервал AUC 0,7-0,8). Результаты проведенного ROCанализа представлены в таблице 27. Таблица 27 ROC-анализ активности СДГ в лимфоцитах периферической крови в прогнозе ПВР у детей 6-14-ти лет с врожденными катарактами Цитохимические параметры Площадь под ROC-кривой AUC, p<0,05 0,816 (0,685-0,946) ИОП гранул, усл. ед. Площадь гранул, усл. ед. 0,728 (0,592-0,865) % клеток с кластерами 0,703 (0,559-0,847) Общая оптическая плотность гранул, усл. ед. Количество гранул, усл. ед. 0,703 (0,546-0,860) 0,651 (0,511-0,791) Уровень порогового значения (cut-off) был определен для наиболее значимых иммунологических показателей (Табл. 28). Таблица 28 Пороговое значение, чувствительность и специфичность наиболее информативных показателей активности СДГ в прогнозе ПВР у детей 6-14-ти лет с врожденными катарактами Показатель Количество гранул, усл. ед. Общая оптическая плотность гранул, усл. ед. Площадь гранул, усл. ед. ИОП гранул, усл. ед. Пороговое значение 16,95 Чувствительность, Специфичность, % % 60,7 73,5 0,46 60,0 75,0 11,35 70,0 62,5 906 80,0 77,5 88 % клеток с кластерами Метод 89,9 количественного 80,0 определения 62,5 активности СДГ лимфоцитов периферической крови у детей 6-14-ти лет с врожденными катарактами позволяет с высокой вероятностью прогнозировать развитие ПВР. Наиболее значимым является определение интегральной оптической плотности гранул. Таким образом, выявлено снижение активности СДГ (ИОП) у детей обследованных возрастных групп при протекании раннего послеоперационного периода с воспалительной реакцией. Снижение общей активности происходит за счет уменьшения количества гранул и их площади. Проведение ROC-анализа показало, что фактором риска развития ПВР является снижение активности СДГ: у детей 2-5-ти лет – снижение площади гранул менее 11,7 усл. ед. (ДЧ=90,9%, ДС=87,5%, p<0,05), у детей 6-14 лет – снижение ИОП гранул менее 906 усл. ед. (ДЧ=80,0%, ДС=77,5%, p<0,05). 3.3.2. Результаты исследования активности сукцинатдегидрогеназы в основных и малых популяциях лимфоцитов у детей 2-5-ти лет с врожденными катарактами На следующем этапе работы провели исследование активности СДГ в основных и малых популяциях лимфоцитов иммуноцитохимическим методом. Оценка активности СДГ в общей популяции лимфоцитов (CD45+) выявила достоверное снижение активности в группе детей с наличием ПВР, что согласуется с результатами, полученными выше (Глава использованием цитоморфоденситометррического метода (Рис. 12). 89 3.4.1) с Процент наблюдений 13% 12% 10% 9% 8% 6% 5% 4% % 3% 1% 0% 141 158 149 174 166 191 182 Группа 1 Группа 2 199 Активность СДГ, усл. ед. Рис. 12. Распределение активности СДГ в Группе 1 (отсутствие воспалительной реакции) и в Группе 2 (наличие воспалительной реакции) в возрасте 2-14-ти лет (распределения отличаются достоверно, p<0,05, критерий χ2) Оценка митохондриальной активности в основных популяциях лимфоцитов периферической крови у детей 2-5-ти лет до операции выявила достоверное снижение активности СДГ в популяциях Т-лимфоцитов, Т-хелперов, активированных Т-лимфоцитах у детей Группы 2 (Табл. 29, рис. 13). Таблица 29 Активность СДГ в основных популяциях лимфоцитов у детей в возрасте от 2-х до 5-ти лет с врожденными катарактами до операции, усл. ед. Популяции лимфоцитов Активность СДГ, усл. ед. (Ме, LQ-HQ) Группа 1 Группа 2 Т-лимфоциты (CD3+CD45+) 184,2 (168,1-193,0) 169,7 (164,0-182,8)* Т-хелперы (CD3+CD4+CD45+) Цитотоксические Тлимфоциты (CD3+CD8+CD45+) В-лимфоциты (CD3+CD19+CD45+) 181,4 (165,5-191,5) 163,6 (160,4-182,4)* 183,9 (171,3-192,7) 174,3 (166,8-182,8) 144,8 (127,6-156,1) 136,8 (127,5-143,4) 90 NK-клетки (CD3172,4 (156,5-193,8) CD16+CD56+CD45+) Активированные Т174,6 (164,8-178,7) лимфоциты (CD3+HLADR+CD45+) *p<0,05 при сравнении Группы 1 и Группы 2 220 p=0,009 210 200 Активность СДГ в Т-хелперах, усл. ед. Активность СДГ в Т-лимфоцитах, усл. ед. 164,1 (160,1-172,8)* 210 p=0,03 200 190 180 170 160 150 140 162,7 (155,3-171,0) 190 180 170 160 150 140 Группа 1 Группа 2 Median 25%-75% Min-Max 130 Группа 1 Median 25%-75% Min-Max Группа 2 А В Рис. 13. Активность СДГ в популяциях Т-лимфоцитов (А) и Т-хелперов (В) у детей Группы 1 группы (отсутствие воспалительной реакции) и Группы 2 (наличие воспалительной реакции) в возрасте 2-5-ти лет Для выявления наиболее информативных показателей в прогнозировании ПВР у детей 2-5-ти лет с врожденными катарактами был проведен ROCанализ показателей активности СДГ в основных популяциях лимфоцитов (Табл. 30). Таблица 30 ROC-анализ показателей активности СДГ в основных популяциях лимфоцитов периферической крови в прогнозе ПВР у детей 2-5-ти лет с врожденными катарактами Активность СДГ Площадь под ROC-кривой AUC, p<0,05 0,750 (0,595-0,905) Т-хелперы Т-лимфоциты 0,708 (0,546-0,871) Активированные Т-лимфоциты 0,700 (0,533-0,867) Цитотоксические Т-лимфоциты 0,675 (0,508-0,842) 91 NK-клетки 0,625 (0,504-0,810) Учитывая отсутствие высокой прогностической значимости показателей активности СДГ в основных популяциях лимфоцитов у детей 2-5-ти лет, уровни пороговых значений не определялись. Исследование митохондриальной активности малых популяций лимфоцитов у детей с врожденными катарактами достоверных различий у пациентов групп наблюдения не выявило (Табл. 31). Таблица 31 Активность СДГ малых популяций лимфоцитов у детей в возрасте от 2-х до 5-ти лет с врожденной катарактой до операции, усл. ед. Популяции лимфоцитов Активность СДГ, усл. ед. (Me, LQ-HQ) Th2-лимфоциты (CD3+CD4+CD294+) Treg-лимфоциты (CD4+CD25+CD127low) Активированные Тхелперы (CD4+CD25+CD127high) Th17-лимфоциты (CD3+CD4+CD161+) В1-лимфоциты (CD3-CD19+CD5+) В2-лимфоциты (CD3-CD19+CD5-) Группа 1 Группа 2 157,0 (153,0-186,3) 166,8 (157,3-180,8) 178,7 (175,6-206,5) 180,2 (173,5-194,4) 182,1 (167,7-202,0) 177,4 (172,9-189,0) 183,0 (170,3-196,3) 175,6 (164,7-185,5) 144,7 (132,1-153,1) 139,2 (137,5-145,1) 140,5 (116,5-146,1) 132,3 (127,8-137,0) Таким образом, изучение митохондриальной активности лимфоцитов у пациентов 2-5-ти лет выявило снижение активности СДГ лимфоцитов периферической крови. Данные изменения обусловлены снижением активности в популяциях Т-лимфоцитов (Т-хелперах и активированных Тлимфоцитах), при этом активность СДГ в В-лимфоцитах и NK-клетках не отличается от показателей детей послеоперационного периода. 92 с благоприятным течением 3.3.3. Результаты исследования активности сукцинатдегидрогеназы в основных и малых популяциях лимфоцитов у детей 6-14-ти лет Для определения прогностических возможностей показателей функциональной активности основных и малых популяций лимфоцитов у детей 6-14-ти лет с врожденными катарактами, в работе проведены исследования активности СДГ в них. Оценка митохондриальной активности основных популяций лимфоцитов периферической крови у детей в этой возрастной группе выявила достоверное снижение активности СДГ в популяциях Т-лимфоцитов, Т-хелперов, цитотоксических Т-лимфоцитов, NK-клеток, активированных Т-лимфоцитов у детей Группы 2 (Табл. 32, рис. 14-15). Таблица 32 Активность СДГ в основных популяциях лимфоцитов у детей в возрасте от 6-ти до 14-ти лет с врожденными катарактами до операции, усл. ед. Популяции лимфоцитов Активность СДГ, усл.ед. (Ме, LQ-HQ) Группа 1 Группа 2 176,2 (168,1-193,0) 164,0 (160,2-170,1)* Т-хелперы 170,1 (162,4-188,7) (CD3+CD4+CD45+) Цитотоксические Т176,7 (165,0-183,6) лимфоциты (CD3+CD8+CD45+) В-лимфоциты 126,3 (119,4-130,8) (CD3+CD19+CD45+) NK-клетки (CD3161,6 (151,5-175,4) CD16+CD56+CD45+) Активированные Т173,9 (165,9-179,5) лимфоциты (CD3+HLADR+CD45+) *p<0,05 при сравнении Группы 1 и Группы 2 160,0 (154,9-167,2)* Т-лимфоциты (CD3+CD45+) 93 167,0 (158,3-175,2)* 122,2 (114,7-132,1) 152,3 (140,2-162,1)* 160,9 (154,0-167,4)* 210 220 190 180 170 160 150 140 p=0,01 210 Активность СДГ в Т-хелперах, усл. ед. Активность СДГ в Т-лимфоцитах, усл. ед. p=0,01 200 200 190 180 170 160 150 Группа 1 Median 25%-75% Min-Max Группа 2 140 Группа 1 Группа 2 Median 25%-75% Min-Max А В Рис. 14. Активность СДГ в популяциях Т-лимфоцитов (А) и Т-хелперов (В) у детей Группы 1 группы (отсутствие воспалительной реакции) и Группы 2 (наличие воспалительной реакции) в возрасте 6-14-ти лет Активность СДГ в популяции NK-клеток, усл.ед. 200 p=0,02 190 180 170 160 150 140 130 120 110 Группа 1 Группа 2 Median 25%-75% Min-Max Рис. 15. Активность СДГ в популяции NK-клеток у детей Группы 1 (отсутствие воспалительной реакции) и Группы 2 (наличие воспалительной реакции) в возрасте 6-14-ти лет Для выявления наиболее прогностически значимых показателей активности СДГ в основных популяциях лимфоцитов у детей 6-14-ти лет был проведен ROC-анализ (Табл. 33). 94 Таблица 33 ROC-анализ активности СДГ в основных популяциях лимфоцитов периферической крови в прогнозе ПВР у детей 6-14-ти лет с врожденными катарактами Активность СДГ Площадь под ROC-кривой AUC, p<0,05 0,744 (0,615-0,872) Активированные Т-лимфоциты Т-лимфоциты 0,689 (0,554-0,824) Т-хелперы 0,685 (0,551-0,819) Цитотоксические Т-лимфоциты 0,681 (0,546-0,815) NK-клетки 0,668 (0,533-0,803) Определение активности СДГ в популяциях активированных Т- лимфоцитов характеризовалось хорошим прогностическим качеством модели (AUC=0,744 (0,615-0,872), p<0,05). Учитывая отсутствие высокой прогностической значимости показателей активности СДГ в основных популяциях лимфоцитов у детей 6-14-ти лет, уровни пороговых значений не определялись. Исследование митохондриальной активности малых популяций лимфоцитов у детей с врожденными катарактами в возрасте от 6-ти до 14-ти лет выявило достоверное снижение активности СДГ в популяциях Трегуляторных лимфоцитов, активированных Т-хелперах и Th17-лимфоцитов у пациентов Группы 2 (Табл. 34, рис. 16). Таблица 34 Активность СДГ малых популяций лимфоцитов у детей с врожденной катарактой в возрасте 6-14-ти лет до операции, усл. ед. Популяции лимфоцитов Th2-лимфоциты (CD3+CD4+CD294+) Активность СДГ, усл. ед. (Me, LQ-HQ) Группа 1 Группа 2 167,6 (153,9-179,6) 160,1 (148,0-169,5) 95 Treg-лимфоциты 184,8 (170,2-190,7) low (CD4+CD25+CD127 ) Активированные Т183,1 (169,5-191,5) хелперы (CD4+CD25+CD127high) Th17-лимфоциты 177,5 (168,1-192,5) (CD3+CD4+CD161+) В1-лимфоциты 136,6 (126,4-140,9) (CD3-CD19+CD5+) В2-лимфоциты 121,6 (116,9-125,9) (CD3-CD19+CD5-) *p<0,05 при сравнении Группы 1 и Группы 2 240 p=0,02 230 220 210 200 190 180 170 160 150 140 170,5 (159,4-181,2)* 164,6 (152,0-173,8)* 129,4 (119,1-138,2) 119,3 (107,5-129,1) 240 Активность СДГ в Th17-лимфоцитах, усл. ед. Активность СДГ в регуляторных Т-клетках, усл. ед. 250 171,9 (164,2-179,4)* Группа 1 Группа 2 Median 25%-75% Min-Max 230 p=0,0008 220 210 200 190 180 170 160 150 140 Группа 1 Median 25%-75% Min-Max Группа 2 А В Рис. 16. Активность СДГ в популяциях регуляторных Т-лимфоцитов (А) и Th17-лимфоцитов (В) у детей Группы 1 (отсутствие воспалительной реакции) и Группы 2 (наличие воспалительной реакции) в возрасте 614-ти лет Для выявления наиболее информативных показателей в прогнозировании ПВР у детей 6-14-ти лет с врожденными катарактами был проведен ROCанализ данных активности СДГ в малых популяциях лимфоцитов (Табл. 35). Таблица 35 ROC-анализ активности СДГ в малых популяциях лимфоцитов периферической крови в прогнозе ПВР у детей 6-14-ти лет с врожденными катарактами Активность СДГ, усл. ед. Площадь под ROC-кривой AUC, p<0,05 0,748 (0,625-0,871) Тh17-лимфоциты 96 Активированные Т-хелперы 0,697 (0,564-0,831) Регуляторные Т-лимфоциты 0,668 (0,531-0,805) Определение активности СДГ в популяции Th17-лимфоцитов характеризовалось хорошим прогностическим качеством модели (AUC=0,748 (0,625-0,871), p<0,05). Учитывая отсутствие высокой прогностической значимости активности СДГ в малых популяциях лимфоцитов у детей 6-14-ти лет, уровни пороговых значений не определялись. Таким образом, изучение митохондриальной активности лимфоцитов у детей 6-14-ти лет с наличием воспалительной реакции показало, что снижение активности СДГ в общей популяции лимфоцитов происходит за счет снижения активности цитотоксических в популяции Т-лимфоцитах, Т-лимфоцитов активированных (Т-хелперах, Т-лимфоцитах, регуляторных Т-клетках, активированных Т-хелперах, Th17-лимфоцитах); в популяции NK-клеток, при этом активность В-лимфоцитов не отличается от показателей детей с благоприятным течением послеоперационного периода. 3.4. Экспериментальное обоснование противовоспалительной терапии Дексаметазон является базовым препаратом профилактики и лечения ПВР у детей в хирургии врожденных катаракт. В большинстве случаев назначение стандартной противовоспалительной схемы лечения обеспечивает благоприятное течение раннего послеоперационного периода. В случае развития ПВР, одним из методов ее купирования является увеличение дозы дексаметазона в применяемой терапии. Такая тактика обеспечивает различную степень купирования воспалительного процесса, и, в ряде случаев, может быть вовсе неэффективной. Из экспериментальных и клинических исследований известно, что дексаметазон угнетает пролиферацию лимфоцитов (в большей степени Т97 лимфоцитов и NK-клеток), ослабляет взаимодействие Т- и В-лимфоцитов, снижает синтез провоспалительных цитокинов и антител [116, 128, 195, 196, 213]. Кроме того, показано снижение эффективности взаимодействия кластеров дифференцировки (CD) с диагностическим флуоресцирующим антителом при введении терапевтических доз кортикостероидов в реакцию фенотипирования лимфоцитов моноклональными антителами [67]. В соответствии с поставленной задачей в данной работе изучен эффект воздействия глюкокортикостероидного препарата дексаметазон на экспрессию поверхностных рецепторов лимфоцитов и интенсивность энергетических процессов в них в экспериментах in vitro. Оценен эффект воздействия различных концентраций и времени экспозиции раствора дексаметазона (раствор для инъекций, KRKA 4 мг/мл) на количественный состав и уровень экспрессии поверхностных маркеров общей популяции лимфоцитов (CD45), популяций Т-лимфоцитов (CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, CD161), Влимфоцитов (CD19), NK-клеток (CD16 и CD56) и их функциональную активность. Время экспозиции различных концентраций дексаметазона в цельной крови и выделенных клетках составляло 1 час, кроме того, был проведен анализ экспозиции концентрации препарата, соответствующей его терапевтической дозе, в выделенных клетках в течении 1-го и 3-х часов. В результате проведенных экспериментов выявлено, что эффект воздействия определяется дозой препарата. Выявлено достоверное снижение уровня экспрессии маркера CD45 и относительного количества общей популяции лимфоцитов (количество лимфоцитов снижалось в 2 раза) в цельной крови при применении максимальной концентрации дексаметазона (Табл. 36, рис. 17). 98 Таблица 36 Оценка эффекта воздействия различных концентраций дексаметазона на относительное количество и уровень экспрессии поверхностного маркера общей популяции лимфоцитов (Me, LQ-HQ) Концентрация дексаметазона, мкг/мл Мембранный маркер CD45, % Контроль (без дексаметазона) 39,8 (37,4-44,8) (100%) 50,8 (49,1-54,1) *p<0,05 при сравнении с контролем 40,0 360,0 39,5 (34,5-46,7) (99,3%) 50,9 (48,2-53,6) 34,5 (32,3-39,5)* (86,7%) 48,8 (47,8-53,6) 19,7 (15,121,2)* (49,5%) 45,1 (42,349,4)* 60 58 55 56 50 54 45 52 CD45, lg FL, усл. ед. Относительное количество лимфоцитов (CD45), % CD45, lg FL 4,0 40 35 30 * 25 48 46 44 20 42 15 10 * 50 40 без ДМ 4 мкг/мл 40 мкг/мл 360 мкг/мл Median 25%-75% Min.- Max. 38 Концентрация дексаметазона без ДМ 4 мкг/мл 40 мкг/мл Концентрация дексаметазона 360 мкг/мл Median 25%-75% Min.- Max. А В Рис. 17. Изменение относительного количества лимфоцитов (А) и уровня экспрессии поверхностного маркера общей популяции лимфоцитов (CD45) (В) при воздействии различных концентраций дексаметазона в эксперименте с цельной кровью Существующие данные о влиянии дексаметазона на количественный состав различных популяций лимфоцитов немногочисленны, а данные о влиянии препарата на активность СДГ отсутствуют вовсе. Известно о значительном снижении Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток под воздействием дексаметазона, а также менее выраженном уменьшении регуляторных Тклеток [128, 196, 213]. Исследование мокроты и периферической крови у 99 пациентов со стероидрезистентной бронхиальной астмой выявило высокое содержание Th17-лимфоцитов [190, 197]. При исследовании влияния дексаметазона на популяции Т-лимфоцитов периферической крови выявлено достоверное снижение уровня экспрессии маркеров Т-лимфоцитов (CD3), Т-хелперов (CD4), цитотоксических Тлимфоцитов (CD8), регуляторных Т-клеток (CD25, CD127low), активированных Т-хелперов (CD127high), а также достоверное увеличение относительного количества Т-лимфоцитов при увеличении концентрации препарата. Уровень экспрессии поверхностного маркера Th17-лимфоцитов (CD161) достоверно не изменялся (Табл. 37, рис. 18-20). Таблица 37 Оценка эффекта воздействия различных концентраций дексаметазона на относительное количество и уровень экспрессии поверхностных маркеров популяций Т-лимфоцитов (Me, LQ-HQ) Концентрация дексаметазона, мкг/мл Мембранный маркер Контроль (без 4,0 40,0 360,0 дексаметазона) Популяция Т-лимфоцитов (CD3+CD45+) CD3, % 79,6 82,0 82,6 84,3 (72,2(65,8-80,9) (69,4-85,5)* (69,4-84,3%) 85,8)* (100%) (103,0%) (103,8%) (105,9%) CD3, lg FL 8,4 (7,8-9,1) 8,6 (7,8-9,4) 7,6 (6,7-8,25)* 4,2 (3,864,68)* Популяция Т-хелперов (CD3+CD4+CD45+) CD4, % 43,1 42,7 44,6 44,8 (37,3-46,4) (37,6-45,4) (37,5-47,7) (36,6-45,8) (100%) (99,1%) (103,5%) (103,9%) CD4, lg FL 8,07 8,14 7,14 3,70 (3,36(7,41-8,25) (7,67-8,20) (6,46-7,41)* 3,81)* Популяция цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3+CD8+CD45+) CD8, % 29,2 27,7 27,9 27,7 (25,2-30,9) (26,7-30,7) (25,9-31,1) (27,3-28,7) (100%) (94,9%) (95,6%) (94,9%) CD8, lg FL 61,1 61,3 57,9 52,6 (50,8(59,2-70,9) (59,7-70,3) (56,8-66,4) 59,8)* 100 95 12 90 11 10 85 9 80 CD3, lg Fl, усл. ед. Относительное количество CD3-лимфоцитов, % Популяция Th17-лимфоцитов (CD3+CD4+CD161+CD45+) CD161, % 15,0 12,8 13,4 13,7 (1,9-29,8) (10,7-29,6) (11,0-28,3) (10,2-27,2) (100%) (85,3%) (89,3%) (91,3%) CD161, lg FL 4,5 4,5 4,6 4,3 (3,8-5,0) (3,8-5,0) (3,7-5,0) (3,7-4,6) Популяция регуляторных Т-лимфоцитов (CD3+CD4+CD25+CD127low) CD25, lg FL 1,70 1,56 1,51 1,28 (1,42-1,80) (1,28-1,67) (1,26-1,59) (1,09-1,47) low CD127 , % 6,60 (6,5-7,6) 7,5 8,2 (7,0-8,6)* 9,1 (6,9(100%) (6,8-8,2) (124,2%) 9,4)* (113,6%) (137,9%) low CD127 , lg FL 0,42 (0,39-0,46) 0,42 0,41 0,26 (0,25(0,4-0,46) (0,40-0,42) 0,26)* Популяция активированных Т-хелперов (CD3+CD4+CD25+CD127high) CD25, lg FL 0,60 0,56 0,55 0,51 (0,46(0,54-0,63) (0,51-0,66) (0,52-0,61) 0,55)* high CD127 , % 19,6 21,0 17,9 13,1 (13,0-28,8) (13,9-29,4) (14,1-31,0) (10,9-26,4) (100%) (107,1%) (91,3%) (66,8%) high CD127 , lg FL 1,7 1,92 1,64 0,68 (0,64(1,44-2,22) (1,68-2,23) (1,55-1,76) 0,72)* *p<0,05 при сравнении с контролем 75 70 * 65 7 * 6 5 60 4 55 50 8 3 * без ДМ 4 мкг/мл 40 мкг/мл Концентрация дексаметазона 360 мкг/мл Median 25%-75% Min. - Max. 2 без ДМ 4 мкг/мл 40 мкг/мл Концентрация дексаметазона 360 мкг/мл Median 25%-75% Min.- Max. А В Рис. 18. Изменение относительного количества (А) и уровня экспрессии поверхностного маркера дифференцировки Т-лимфоцитов (CD3) (В) при воздействии различных концентраций дексаметазона в эксперименте с цельной кровью 101 76 74 33 72 32 70 68 31 66 30 64 8-PE, ф Относительное количество CD8-лимфоцитов, % 34 29 28 * 62 60 58 56 27 54 26 52 50 25 48 24 без ДМ 4 мкг/мл 40 мкг/мл 360 мкг/мл Концентрация дексаметазона Median 25%-75% Min. - Max. 46 без ДМ 4 мкг/мл 40 мкг/мл 360 мкг/мл Концентрация дексаметазона Median 25%-75% Min. - Max. 32 6,0 30 5,8 5,6 28 5,4 26 5,2 CD161, lg FL, усл. ед. Относительное количество CD161-лимфоцитов, % А В Рис. 19. Изменение относительного количества (А) и уровня экспрессии поверхностного маркера дифференцировки цитотоксических Тклеток (CD8) (В) при воздействии различных концентраций дексаметазона в эксперименте с цельной кровью 24 22 20 18 16 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 14 3,8 12 3,6 10 8 3,4 без ДМ 4 мкг/мл 40 мкг/мл 360 мкг/мл Концентрация дексаметазона Median 25%-75% Min. - Max. 3,2 без ДМ 4 мкг/мл 40 мкг/мл Концентрация дексаметазона 360 мкг/мл Median 25%-75% Min. - Max. А В Рис. 20. Изменение относительного количества (А) и уровня экспрессии поверхностного маркера дифференцировки Th17-лимфоцитов (CD161) (В) при воздействии различных концентраций дексаметазона в эксперименте с цельной кровью Существует мнение, что глюкокортикостероиды влияют на В-лимфоциты опосредованно, за счет ингибирования индукции цитидиндезаминазы – основного регулятора генов, кодирующих синтез иммуноглобулинов [116]. В данном исследовании достоверных изменений уровня экспрессии поверхностного В-клеточного маркера выявлено не было из-за большого разброса значений. Выявлено достоверное количества В-лимфоцитов (Табл. 38, рис. 21). 102 снижение относительного Таблица 38 Оценка эффекта воздействия различных концентраций дексаметазона на относительное количество и уровень экспрессии поверхностного маркера В-лимфоцитов, (Me, LQ-HQ) Концентрация дексаметазона, мкг/мл Мембранный маркер CD19, % Контроль (без 4,0 дексаметазона) 10,3 (8,6-11,9) 6,6 (1,1-8,5)* (100%) (64,1%) CD19, lg FL 4,43 4,68 (3,55-5,08) (4,17-6,08) *p<0,05 при сравнении с контролем 360,0 6,4 (0,7-6,6)* (62,1%) 6,8 (0,98,5)* (66,0%) 3,04 (2,70-3,85) 3,58 (2,86-4,68) 7 12 6 * 10 * CD19, lg FL, усл. ед. Относительное количество CD19-лимфоцитов, % 14 40,0 * 8 6 5 4 3 4 2 2 0 Без ДМ 4 мкг/мл 40 мкг/мл 360 мкг/мл Median 25%-75% Min. - Max. 1 Концентрация дексаметазона Без ДМ 4 мкг/мл 40 мкг/мл Концентрация дексаметазона 360 мкг/мл Median 25%-75% Min. - Max. А В Рис. 21. Изменение относительного количества (А) и уровня экспрессии (В) CD19-лимфоцитов при воздействии различных концентраций дексаметазона в эксперименте с цельной кровью Кроме того, известно о значительном снижении популяций NK-клеток под воздействием дексаметазона [128, 196]. Считается, что эффект дексаметазона на NK-клетки является проапоптотическим и антипролиферативным, что способствует снижению абсолютного количества клеток данной популяции при назначении глюкокортикостероидной терапии [195]. В ходе эксперимента выявлено достоверное снижение уровня экспрессии поверхностных маркеров NK-клеток (CD16 и CD56) при воздействии 103 дексаметазона, при этом достоверного снижения относительного количества NK-клеток не обнаружено (Табл. 39, рис. 22). Таблица 39 Оценка эффекта воздействия различных конценраций дексаметазона на относительное количество и уровень экспрессии поверхностных марекров NK-клеток (Me, LQ-HQ) Концентрации дексаметазона, мкг/мл Мембранный маркер CD16 и CD56; % Контроль (без дексаметазона) 12,7 (11,3-26,5) (100%) 45,1 (33,8-45,6) 4,0 40,0 360,0 10,6 (10,4-27,7) (83,5%) 39,5 (31,8-47,2) 10,5 (10,1-23,9) (82,7%) 31,1 (29,935,4)* 7,8 (7,0-17,1) (61,4%) 19,2 (17,923,2)* CD16 и CD56; lg FL *p<0,05 при сравнении с контролем lg FL – десятичный логарифм флуоресценции 50 28 45 26 24 CD16/CD56, lg FL, усл. ед. Относительное количество CD16/CD56-клеток, % 30 22 20 18 16 14 12 40 * 35 30 * 25 10 8 20 6 4 без ДМ 4 мкг/мл 40 мкг/мл 360 мкг/мл Концентрация дексаметазона Median 25%-75% Min. - Max. 15 без ДМ 4 мкг/мл 40 мкг/мл Концентрация дексаметазона А 360 мкг/мл Median 25%-75% Min. - Max. В Рис. 22. Изменение относительного количества (А) и уровня экспрессии (В) CD16 и CD56 при воздействии различных концентраций дексаметазона в эксперименте с цельной кровью Для оценки влияния дексаметазона на энергообмен в лимфоцитах проводили исследование взаимодействия различных концентраций дексаметазона (экспозиция 1 час) на клетки лимфоконцентрата и определяли активность СДГ в популяциях лимфоцитов (Табл. 40, рис. 23). 104 Таблица 40 Оценка влияния различных концентраций дексаметазона на функциональную активность (активность СДГ) популяций лимфоцитов, Me (LQ-HQ) Концентрации дексаметазона, мкг/мл Популяция Т-лимфоциты (CD3+CD45+) Контроль (без 4,0 дексаметазона) 182,2 165,7 (161,2(172,4-192,8) 170,8)* 40,0 360,0 171,8 (161,9181,4)* 182,2 (170,8194,2) 185,8 (183,0193,7) 178,7 (168,2186,9) Т-хелперы (CD3+ CD4+CD45+) 179,0 (177,1-181,4) 176,4 (166,4-182,5) Цитотоксические Т-лимфоциты (CD3+CD8+ CD45+) В-лимфоциты (CD3-CD19+ CD45+) NK-клетки (CD3CD16+CD56+) 184,0 (175,7-190,8) 166,6 179,0 (163,7-177,0)* (164,7-188,6) 177,8 (173,6-187,9) 125,0 (123,3-130,8) 133,9 (129,1-142,2) 133,9 (125,9-151,8) 157,9 (151,6-171,5) 158,8 (147,6-160,7) 153,7 (130,6-158,1) Th17-лимфоциты 177,8 172,8 179,7 (CD3+CD4+ (173,8-184,0) (162,3-177,7) (162,3-177,7) CD161+CD45+) Регуляторные Т194,1 181,5 179,0 клетки (CD4+ (183,6-197,1) (172,7-190,4) (178,6-187,4) low CD25+CD127 ) Активированные 188,3 182,3 (177,2177,6 Т-хелперы (185,8-190,9) 185,3)* (172,4-190,1) (CD4+CD25+ CD127high) *p<0,05 при сравнении с контролем 105 129,1 (125,8150,6) 151,4 (131,2161,4) 179,7 (171,2185,5) 190,9 (189,6192,2) 180,4 (177,1192,9) 194 Активность СДГ в CD127 high-лимфоцитах, усл. ед. Активность СДГ в CD8-лимфоцитах, усл. ед. 195 190 185 * 180 175 170 165 160 Без ДМ 4 мкг/мл 40 мкг/мл 360 мкг/мл Концентрация дексаметазона Mean Min. - Max. 192 * 190 188 186 184 182 180 178 176 174 172 170 168 Без ДМ 4 мкг/мл 40 мкг/мл 360 мкг/мл Концентрация дексаметазона Mean Min. - Max. А В Рис.23. Активность СДГ в популяциях цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8) (А) и активированных Т-хелперов (CD127high) (В) при воздействии различных концентраций дексаметазона в эксперименте с лимфоконцентратом Исследование влияния различных концентраций дексаметазона на энергетические процессы в популяциях Т-лимфоцитов выявило достоверное снижение активности СДГ в Т-лимфоцитах (CD3), цитотоксических Тлимфоцитах (CD8) и активированных Т-хелперах (CD127high) при воздействии терапевтической концентрации препарата (4,0 мкг/мл); увеличение концентрации препарата не выявило достоверных изменений ферментативной активности. Оценка влияния различных концентраций дексаметазона на популяции Т-хелперов (CD4), Th17-лимфоцитов (CD161), регуляторных Тклеток (CD127low) достоверных изменений активности СДГ не выявила. При воздействии различных концентраций препарата активность СДГ в популяциях В-лимфоцитов (CD19) и NK-клеток (CD16 и CD56) достоверно не изменялась. В ходе эксперимента было оценено влияние различной экспозиции (1 и 3 часа) концентрации дексаметазона, соответствующей его терапевтической дозе, на активность СДГ и уровень экспрессии поверхностных маркеров различных популяций лимфоцитов (Табл. 41). 106 Таблица 41 Оценка влияния дексаметазона на активность СДГ и уровень экспрессии поверхностных маркеров различных популяций лимфоцитов (эксперимент на клетках лимфоконцентрата) Влияние терапевтической концентрации дексаметазона при различной экспозиции, (Me, LQ-HQ) Показатель Контроль (без 1 час 3 часа дексаметазона) Общая популяция лимфоцитов (CD45+) CD45, lg FL 12,3 12,6 12,3 (11,9-12,7) (12,1-13,0) (11,9-12,6) СДГ 170,8 149,5 147,6 (165,4-176,1) (145,3-157,6) * (141,7-156,6) * Популяция Т-лимфоцитов (CD3+CD45+) CD3 (PerCP), lg FL 64,5 47,0 58,2 (61,3-67,7) (44,4-49,6) (55,1-61,2) CD3 (fits), lg FL 4,4 4,3 4,6 (4,1-4,7) (4,1-4,6) (4,4-4,9) СДГ 171,6 150,2 147,2 (166,0-178,2) (145,0-156,4)* (141,6-153,8)* Популяция В-лимфоцитов (CD3-CD19+CD45+) CD19, lg FL 6,4 5,0 8,9 (5,6-7,3) (4,7-5,4) (7,7-10,2) СДГ 119,5 113,6 120,0 (115,0-123,9) (108,8-118,4) (118,7-121,4) Популяция NK-клеток (CD3-CD16+CD56+) СДГ 146,0 141,8 144,2 (143,5-148,6) (136,0-147,5) (138,8-149,5) Популяция Т-хелперов (CD3+CD4+CD45+) CD4, lg FL 2,5 2,1 2,5 (2,1-2,9) (1,7-2,6) (2,2-2,7) СДГ 164,4 156,1 149,2 (162,7-170,3) (149,6-162,1) (145,3-152,9)* Популяция цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3+CD8+CD45+) СДГ 173,83 164,2 161,3 (167,7-179,9) (156,8-168,5)* (154,1-169,4)* Популяция регуляторных Т-клеток (CD4+CD25+CD127low) CD127low, lg FL 0,52 0,50 0,57 (0,50-0,53) (0,49-0,51) (0,56-0,57) 107 СДГ 183,9 171,4 163,3 (182,7-185,1) (170,9-181,9) (154,8-168,8)* Популяция активированных Т-хелперов (CD4+CD25+CD127high) CD127high, lg FL 2,21 2,17 2,40 (2,16-2,26) (2,10-2,24) (2,30-2,50) СДГ 181,9 173,0 163,5 (181,4-182,4) (166,3-179,7)* (158,9-167,1)* Популяция Th17-лимфоцитов CD161, lg FL 4,20 3,99 4,30 (3,70-4,80) (3,64-4,33) (3,80-4,90) СДГ 175,84 173,0 169,3 (171,76-179,93) (167,4-177,6) (166,8-176,9) * p<0,05 при сравнении с контролем При оценке полученных данных выявлено достоверное снижение активности СДГ в общей популяции лимфоцитов (CD45), за счет снижения активности в популяциях Т-лимфоцитов (CD3), цитотоксических Т- лимфоцитов (CD8), активированных Т-хелперов (CD127high) при экспозиции терапевтической концентрации дексаметазона (4,0 мкг/мл) в течении 1-го и 3х часов, а также в популяциях Т-хелперов (CD4) и регуляторных Т-клеток (CD127low) при увеличении времени экспозиции до 3-х часов. Достоверных изменений активности СДГ в популяциях В-лимфоцитов (CD19), NK-клеток (CD16 и CD56) и Th17-лимфоцитов (CD161) при времени экспозиции 1 и 3 часа выявлено не было. Таким образом, при исследовании влияния различных концентраций дексаметазона на лимфоциты цельной крови выявлено достоверное снижение уровня экспрессии поверхностных маркерных рецепторов общей популяции лимфоцитов (CD45). Это снижение происходит за счет снижения уровня экспрессии в популяциях Т-лимфоцитов (CD3), Т-хелперов (CD4), цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8), регуляторных Т-клеток (CD127low), активированных Т-хелперов (CD127high), NK-клеток (CD16 и CD56). Кроме того, выявлено достоверное снижение относительного количества общей популяции лимфоцитов (CD45), В-лимфоцитов (CD19), а также увеличение 108 относительного количества Т-лимфоцитов (CD3) и регуляторных Т-клеток (CD127low). При исследовании влияния дексаметазона на энергетические процессы в лимфоцитах периферической крови выявлено достоверное снижение активности СДГ в Т-лимфоцитах (CD3), Т-хелперах (CD4), цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8), активированных Т-хелперах (CD127high) и регуляторных Т-клетках (CD127low) в зависимости от времени экспозиции препарата. При исследовании влияния различных концентраций дексаметазона на популяцию NK-клеток (CD16 и CD56) выявлено дозозависимое снижение уровня экспрессии поверхностных маркеров, при этом активность СДГ оставалась на исходном уровне. В популяциях Влимфоцитов (CD19) и Th17-лимфоцитов (CD161) достоверных изменений уровня экспрессии поверхностных рецепторов и активности СДГ выявлено не было. 109 ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ КЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ У ДЕТЕЙ С ВРОЖДЕННЫМИ КАТАРАКТАМИ 4.1. Особенности течения раннего послеоперационного периода С целью определения характера воспалительных реакций и зависимости частоты их развития от возраста проведена оценка течения раннего послеоперационного периода после аспирации врожденной катаракты с имплантацией ИОЛ. Анализ течения раннего послеоперационного периода показал, что у большинства детей (94,7%) отмечалась ПВР 0-й и 1-й степени (По классификации Сергиенко Н.М. и Веселовской З.Ф. (1985) с учетом дополнений к классификации Азнабаева Р.А. с соавт. (2009) [3, 72]. В соответствии с этой классификацией 1 степень ПВР характеризуется минимальными признаками воспаления и относится к неосложненному течению. На основании классификации были выделены 2 основные группы: Группа 1 – 52 глаза (48,2%), характеризующаяся 0-й степенью ПВР (ареактивное течение), Группа 2 – 56 глаз (51,8%) с 1-й степенью ПВР. Кроме того, был проведен анализ частоты встречаемости воспалительной реакции в раннем послеоперационном периоде у детей в зависимости от возраста (Табл. 42, рис. 24). Таблица 42 Частота встречаемости ПВР у пациентов разного возраста, n=108, М± σ Группа Группа 1 Возраст 2-5 лет, n=46 0,43±0,50 Возраст 6-14 лет, n=62 0,52±0,50 Достоверность различий, р p>0,05 Группа 2 0,57±0,50 0,48±0,50 p>0,05 110 % Возраст Рис. 24. Частота встречаемости ПВР у детей в зависимости от возраста Достоверных различий частоты воспалительной реакции у детей разного возраста не выявлено. Однако, прослеживается тенденция увеличения частоты встречаемости послеоперационной воспалительной реакции у детей 2-5-ти лет. 4.2. Результаты клинико-функциональных исследований глаз у детей с врожденными катарактами Исследование остроты зрения, формы катаракты, рефракции, сопутствующей офтальмологической патологии, симметричности поражения глаз у детей проводили с целью определения тактики хирургического вмешательства, прогноза послеоперационной воспалительной реакции. Визометрия. У части детей 2-х и 3-летнего возраста острота зрения была определена ориентировочно: на основании реакции ребенка на игрушки, соответствующие величине оптотипов первой строки таблицы СивцеваГоловина, предъявляемых с различного расстояния. Если ребенок правильно узнавал игрушку с расстояния 5-ти метров, острота зрения определялась 0,1. При отсутствии реакции на игрушку – определяли светоощущение. Острота зрения у детей с врожденными катарактами была снижена и составляла с максимальной коррекцией от «правильной светопроекции» до 0,6. 111 Клинические формы врожденных катаракт определялись в соответствии с классификацией Хватовой А.В. (1982) [89]. Наиболее часто встречающийся вид врожденных катаракт – зонулярные. В данном исследовании зонулярные катаракты наблюдались в 60-ти случаях (55,6%), полные – в 6-ти случаях (6 глаз) (5,5%), заднекапсулярные – в 34-ти случаях (34 глаза) (31,5%), атипичные – в 8 случаях (8 глаз) (7,4%) (Табл. 43, рис. 25). Во всех случаях клинические формы врожденных катаракт определяли тактику хирургического лечения. Таблица 43 Частота встречаемости клинических форм катаракт по группам, n=108, М± σ Клинические формы катаракты* Группа 1 (n1=52) Группа 2 (n2=56) Достоверность различий, p Зонулярные 0,54±0,50 0,57±0,50 p>0,05 Заднекапсулярные 0,35±0,48 0,29±0,46 p>0,05 Атипичные 0,04±0,19 0,11±0,31 p>0.05 Полные 0,08±0,27 0,04±0,19 p>0,05 *По классификации врожденных катаракт Хватовой А.В. (1982) [88] При сравнительном анализе Группы 1 и Группы 2 достоверных различий по частоте встречаемости клинических форм катаракт выявлено не было. % Форма катаракты Рис. 25. Частота встречаемости клинических форм катаракт по группам 112 Клинически помутнением, зонулярная катаракта расположенным характеризовалась между эмбриональным дисковидным ядром и периферическими слоями хрусталика. Эмбриональное ядро и периферические отделы хрусталика при таких катарактах прозрачные. Размеры и интенсивность дисковидного помутнения хрусталика в каждом случае были различными. При исследовании в проходящем свете виден четко ограниченный диск на фоне ярко-красного рефлекса. В зависимости от степени помутнения диска, у некоторых детей до операции был возможен детальный осмотр глазного дна. Полная катаракта представляла собой диффузное гомогенное помутнение хрусталика, рефлекс с глазного дна отсутствовал во всех случаях, в некоторых случаях интраоперационно выявлялось помутнение задней капсулы. Атипичная катаракта характеризовалась частичным помутнением хрусталика разнообразной формы и локализации, интраоперационно часто обнаруживалось помутнение задней капсулы. Заднекапсулярная катаракта характеризовалась помутнением задней капсулы различных размеров и прилежащих слоев хрусталика, остальная часть хрусталика была прозрачной. Визуализация глазного дна при такой катаракте, как правило, не вызывала затруднений. При определении величины переднезадней оси глазного яблока методом ультразвуковой биометрии все пациенты были условно разделены на гиперметропов, эмметропов и миопов. При распределении детей по виду клинической рефракции учитывали нормативные значения длины глаза, соответствующие возрасту. Величина передне-задней оси глаза варьировала от 19,64 до 24,4 мм, составив в среднем 21,85±2,40 мм. Показатели остроты зрения до операции и в раннем послеоперационном периоде, распределение пациентов по форме врожденных катаракт и рефракции в группах исследования представлено в таблице 44. 113 Таблица 44 Показатели остроты зрения до операции и в раннем послеоперационном периоде, форма катаракты и рефракция у детей с врожденными катарактами, n-количество случаев Всего Правильная светопроекция Менее 0,01 0,01-0,05 0,06-0,1 0,2-0,5 0,5-0,6 Более 0,6 2 10 0 2 6 0 0 20 0 0 8 2 20 2 0 32 114 0 0 6 0 10 2 2 20 0 0 2 6 10 6 8 32 0 0 0 0 4 0 0 4 0 0 6 0 8 0 0 14 0 2 0 0 2 0 0 4 0 0 2 0 12 0 0 14 0 6 0 0 2 0 0 8 0 0 4 0 0 0 0 4 Гиперметропия 2 2 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 Миопия 0 2 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 Эмметропия Заднекапсулярная Зонулярная 0 6 0 2 2 0 0 10 0 0 2 2 12 2 0 18 Полная Всего 6-14 лет Правильная светопроекция Менее 0,01 0,01-0,05 0,06-0,1 0,2-0,5 0,5-0,6 Более 0,6 Рефракция** Атипичная Группа 2-5 1 лет Форма катаракты* После операции Острота зрения с коррекцией До операции Группа Возра ст 2 2 0 2 2 0 0 8 0 0 2 2 8 2 0 14 Всего Правильная светопроекция Менее 0,01 0,01-0,05 0,06-0,1 0,2-0,5 0,5-0,6 Более 0,6 0 4 16 2 4 0 0 26 0 2 8 4 14 2 0 30 0 0 0 8 16 2 0 26 0 0 6 2 8 4 8 30 115 0 0 2 2 0 0 0 4 0 0 4 2 6 0 0 12 0 2 4 2 0 0 0 8 0 2 2 4 6 2 0 16 0 2 6 0 0 0 0 8 0 0 6 0 4 0 0 10 Гиперметропия 0 2 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 Миопия 0 2 4 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 Эмметропия Заднекапсулярная Зонулярная 0 0 10 0 4 0 0 14 0 2 4 2 8 2 0 18 Полная Всего 6-14 лет Правильная светопроекция Менее 0,01 0,01-0,05 0,06-0,1 0,2-0,5 0,5-0,6 Более 0,6 Рефракция** Атипичная Группа 2-5 2 лет Форма катаракты* После операции Острота зрения с коррекцией До операции Группа Возра ст 0 0 6 0 4 0 0 10 0 0 0 0 4 0 0 4 Группа 2-14 1 лет Правильная светопроекция Менее 0,01 0,01-0,05 0,06-0,1 0,2-0,5 0,5-0,6 Более 0,6 2 0 0 0 0 2 10 0 6 0 2 2 8 8 2 6 0 0 2 6 2 0 0 0 26 20 14 12 0 0 2 6 2 0 0 0 0 10 0 0 0 0 Всего 52 52 28 18 2 4 Группа 2-14 Правильная светопроекция 0 0 0 0 0 0 2 лет Менее 0,01 6 0 2 0 2 2 0,01-0,05 22 6 14 4 4 0 0,06-0,1 6 8 2 4 0 0 0,2-0,5 16 24 10 6 0 0 0,5-0,6 2 6 2 0 0 0 Более 0,6 0 8 0 0 0 0 Всего 56 56 32 16 6 2 *По классификации врожденных катаракт Хватовой А.В. (1982) [89] ** По данным Э. С. Аветисова о возрастной динамике переднее-заднего размера глаза (2003) [25] 116 0 2 2 0 14 0 0 18 0 4 6 6 6 2 0 24 0 6 4 0 2 0 0 12 0 2 12 0 4 0 0 18 Гиперметропия Миопия Рефракция Эмметропия Полная Атипичная Заднекапсулярн ая Зонулярная Форма катаракты После операции Острота зрения с коррекцией До операции Группа Возра ст 2 2 2 4 10 2 0 22 0 0 6 0 8 0 0 14 Частота встречаемости остроты зрения ≤ 0,05 до операции была достоверно выше у детей 2-5-ти лет (0,67±0,47) по сравнению с детьми 6-14-ти лет (0,24±0,43) (p<0,05). Сравнение этого показателя в Группе 1 (0,55±0,47) и Группе 2 (0,77±0,43) у детей в возрасте 2-5-ти лет не выявило статистически значимых различий (p>0,05). У детей 6-14-ти лет наиболее часто (0,58±0,50), чем у детей 2-5-ти лет (0,22±0,42) отмечалась исходная острота зрения равная 0,2-0,5, что и определяло более поздние сроки хирургического лечения (p<0,01). Сравнение остроты зрения до операции у детей 6-14-ти лет в Группе 1 (0,69±0,47) и Группе 2 (0,47±0,51) не выявило статистически значимых различий (p>0,05). У детей в возрасте 2-5-ти лет преобладали зонулярные катаракты, но встречались также атипичные и полные катаракты, сопровождающиеся более низкой исходной остротой зрения. Среди детей 614-ти лет присутствовали зонулярная и заднекапсулярная катаракта, определяющие высокую исходную остроту зрения ≥ 0,2, атипичные и полные катаракты не отмечались. Оценка клинической рефракции по величине передне-задней оси глаза не выявила достоверных различий частоты встречаемости эмметропии, гиперметропии и миопии в Группе 1 и Группе 2 у детей 2-5-ти и 6-14-ти лет (p>0,05) (Табл. 45, рис. 26). Таблица 45 Частота встречаемости типов клинической рефракции по группам, n=108, М± σ Тип клинической рефракции* Группа 1 (n1=52) Группа 2 (n2=56) Достоверность различий, p 2-5 лет Эмметропия 0,2±0,41 0,31±0,47 p>0,05 Миопия 0,4±0,50 0,31±0,47 p>0,05 Гиперметропия 0,4±0,50 0,38±0,50 p>0,05 0,53±0,51 p>0,05 6-14 лет Эмметропия 0,38±0,49 117 Миопия 0,19±0,40 0,33±0,48 p>0,05 Гиперметропия 0,44±0,50 0,13±0,35 p>0,05 * По Аветисова Э.С. (2003 г.) [25] % Рефракция Рис. 26. Частота встречаемости типов клинической рефракции по группам У всех детей (100% случаев) отмечалось повышение остроты зрения в послеоперационном периоде. У детей с односторонними врожденными катарактами острота зрения после операции не превышала 0,3, у детей с двусторонними врожденными катарактами острота зрения в послеоперационном периоде могла составлять до 1,0. Была проведена оценка частоты встречаемости одно- и двусторонних катаракт. В некоторых случаях, при двусторонней катаракте один глаз был прооперирован по месту жительства или в ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» в более ранние сроки, до начала проведения данного исследования. По симметричности преобладали двусторонние врожденные катаракты – 69 глаз (60,5%), односторонние врожденные катаракты составили 45 глаз (39,5%) (Табл. 46). Преобладание двусторонних катаракт в группах исследования определило более высокую остроту зрения после операции, в связи с меньшей степенью амблиопии. 118 Таблица 46 Частота встречаемости одно- и двусторонних катаракт по группам, n = 108, М± σ По симметричности поражения* Односторонние Группа 1, n1=52 0,42±0,50 Группа 2, n2=56 0,39±0,49 Достоверность различий, p p>0,05 Двусторонние 0,58±0,50 0,61±0,49 p>0,05 *По классификации врожденных катаракт Хватовой А.В. (1982) [89] При сравнительном анализе Группы 1 и Группы 2, достоверных различий по частоте встречаемости одно- и двусторонних катаракт выявлено не было. По наличию сопутствующих изменений органа зрения у одного ребенка (1 глаз – 0,9%) присутствовала микрокорнеа I-ой степени (передний микрофтальм I-ой степени по классификации Агатовой М.Д. (1988)) [1], содружественное монолатеральное косоглазие отмечено в 41-ом случае (41 глаз – 36,0%), нистагм в 5-ти случаях (4,4%), задний лентиконус – на 2-х глазах (1,8%). Данные по сопутствующей патологии органа зрения представлены в таблице 47. Таблица 47 Частота встречаемости сопутствующей патологии органа по группам, n = 108, М± σ Сопутствующая патология микрокорнеа I-ой степени Группа 1, n1=52 0,02±0,14 Группа 2, n2=56 0 Достоверность различий, p p>0,05 нистагм 0,04±0,19 0,04±0,19 p>0,05 задний лентиконус 0,02±0,14 0,02±0,13 p>0,05 косоглазие 0,38±0,49 0,38±0,46 p>0,05 При сравнительном анализе Группы 1 и Группы 2, достоверных различий по частоте встречаемости сопутствующей патологии органа зрения выявлено не было. 119 Результаты предоперационного обследования Офтальмометрию выполняли всем пациентам для расчета оптической силы ИОЛ. Средние параметры офтальмометрии составили в Группе 1 – 43,17±0,48 дптр; в Группе 2 – 43,03±0,39 дптр. Исследование поля зрения у детей до 5-ти лет было часто затруднено. Границы поля зрения определены у 72-х детей (76 глаз – 65,5%). Состояние полей зрения находилось в пределах нормы. У всех обследованных детей уровень внутриглазного давления варьировал в пределах от 13-ти до 21-го мм рт. ст., составив в среднем 16,1±2,43 мм рт. ст. Световую биомикроскопию проводили всем детям с целью выявления изменений роговицы (из исследования исключали детей с наличием рубцов роговицы, помутнений роговицы, преципитатов на роговице), влаги передней камеры, глубины передней камеры, радужки, зрачкового края радужки, хрусталика и его связочный аппарата. У всех обследованных детей изменений роговицы, влаги передней камеры, радужки, связочного аппарата хрусталика, наличия передних и задних синехий выявлено не было. Проведение офтальмоскопии у части детей было затруднено из-за помутнения оптических сред глаза (наличия катаракты), у большинства детей с заднекапсулярными катарактами и части детей с зонулярными катарактами глазное дно визуализировалось. Грубой патологии сетчатки и зрительного нерва у обследованных детей выявлено не было. При проведении В-сканирования из данного исследования были исключены дети с гемофтальмом, отслойкой сетчатки и внутриглазными новообразованиями. Электрофизиологические исследования позволили исключить из настоящего исследования детей с грубой патологией сетчатки и зрительного нерва. Таким образом, выявлено, что частота развития ПВР у обследованных детей не зависела от исходного состояния глаз: остроты зрения, клинической 120 рефракции, патологии, формы не катаракты, оказывающей сопутствующей значительного офтальмологической влияние на анатомо- топографические особенности структур глаза. Уровень послеоперационной остроты зрения зависел от исходной остроты зрения. Острота зрения была выше при двусторонней катаракте. 4.3. Результаты исследования влияния особенностей техники хирургического вмешательства и течения интраоперационного периода на характер и степень выраженности воспалительной реакции По данным ряда авторов выполнение первичного заднего капсулорексиса и/или капсулотомии в сочетании с передней витрэктомией увеличивает частоту развития ПВР [77, 167]. С целью изучения течения интраоперационного периода и закономерностей формирования воспалительных реакций в раннем послеоперационном периоде в зависимости от тактики хирургического лечения были обследованы 101 пациент (108 глаз), которым была выполнена аспирация катаракты с имплантацией ИОЛ как в сочетании с 25G задней капсулотомией и передней витрэктомией, так и без нее, в зависимости от исходного состояния задней капсулы. Средний возраст пациентов составил 6,31 ± 2,82 лет. Средний возраст мальчиков – 6,38 ± 3,01 лет, девочек 6,65 ± 2,71 лет. Анализ течения операций показал, что у всех детей интраоперационных осложнений выявлено не было (100%). При проведении непрерывного кругового переднего капсулорексиса не были отмечены ситуации, при которых капсулорексис выходил из-под контроля и смещался к периферии. Проведение непрерывного кругового капсулорексиса, аспирация хрусталиковых масс и, при необходимости выполнение 25G задней капсулотомии в сочетании с передней витрэктомией, проходило без особенностей. У всех детей произведена имплантация ИОЛ Acrysof SA60AT. Положение ИОЛ во всех случаях было центральным, фиксация капсульная. 121 Детям с прозрачной задней капсулой задняя капсулотомия в сочетании с передней витрэктомией не проводились. Полировку задней капсулы и задней поверхности передней капсулы проводили аспирационным и ирригационным наконечниками факоэмульсификатора. При обнаружении помутнений задней капсулы в ходе дооперационного обследования или интраоперационно во всех случаях проводилась 25G задняя капсулотомия в сочетании с передней витрэктомией. У детей с атипичными и заднекапсулярными формами катаракт, как правило, отмечалось стойкое, не устранимое полировкой, помутнение задней капсулы, определяющее необходимость проведения 25G задней капсулотомии в сочетании с передней витрэктомией одномоментно в процессе хирургического вмешательства. Для исключения выхода волокон стекловидного тела в переднюю камеру, первым этапом имплантировалась ИОЛ, после чего, проводилась аспирация остатков вискоэластика, аспирационный наконечник заменяли на витреотом 25G, вводили его позади ИОЛ и проводили заднюю капсулотомию диаметром 5,05,5 мм и переднюю витрэктомию. Тактика в отношении задней капсулы представлена в таблице 48 и на рисунке 27. Таблица 48 Частота выявленного помутнения задней капсулы по возрасту и по группам, n = 108, М± σ Состояние задней капсулы (тактика в отношении задней капсулы) Возраст Группа 1 Группа 2 Достовер ность различий, p 2-5 лет 0,60±0,50 0,62±0,50 p>0,05 Прозрачная задняя капсула (задняя капсулотомия в сочетании 6-14 лет 0,56±0,50 0,53±0,51 с передней витрэктомией не Всего 0,58±0,50 0,57±0,50 проводилась) Наличие помутнения задней 2-5 лет 0,40±0,50 0,38±0,50 капсулы (проведена задняя 6-14 лет 0,44±0,50 0,47±0,51 капсулотомия в сочетании с передней витрэктомией) Всего 0,42±0,50 0,43±0,50 122 p>0,05 p>0,05 p>0,05 p>0,05 p>0,05 Достоверных различий частоты проведенной задней капсулотомии с передней витрэктомией у пациентов групп наблюдения выявлено не было. % Рисунок 27. Частота встречаемости помутнения задней капсулы по группам Таким образом, достоверного анализ влияния полученных расширения данных показал хирургического отсутствие вмешательства в отношении задней капсулы (25G задняя капсулотомия в сочетании с передней витрэктомией) на увеличение частоты развития воспалительной реакции в раннем послеоперационном периоде. 4.4. Терапия раннего послеоперационного периода С целью определения эффективности послеоперационной противовоспалительной терапии у детей с врожденными катарактами была проведена оценка зависимости эффективности купирования воспалительной реакции от кратности инстилляций раствора дексаметазона. В послеоперационном периоде всем детям в первые сутки назначалась одинаковая терапия. Пациенты получали раствор дексаметазона 0,1% по 1 капле 4 раза в день, раствор тобрамицина 0,3% по 1 капле 4 раза в день, дети до 6 лет получали Мидриацил 0,5% по 1 капле 2 раза в день, дети старше 6 лет - Мидриацил 1% по 1 капле 2 раза в день. В зависимости от течения раннего послеоперационного периода, при 123 появлении каких-либо изменений, свидетельствующих о развитии воспалительной реакции, проводилась коррекция терапии. Детям из Группы 2 (наличие послеоперационной воспалительной реакции) к стандартной терапии добавляли раствор дексаметазона 0,1% в виде форсажа (инстилляции каждые 10 минут в течение 1 часа) 1-2 раза в день. На фоне проводимой терапии у пациентов Группы 2 отмечалась положительная динамика в первые 1-3 дня. Таким образом, частота развития воспалительной реакции в раннем послеоперационном периоде у обследованных детей не зависела от исходного состояния глаз: остроты зрения, клинической рефракции, формы катаракты, сопутствующей офтальмологической патологии, не оказывающей значительное влияние на анатомо-топографические особенности структур глаза, а также не определялась расширением хирургического вмешательства в отношении задней капсулы (25G задней капсулотомии в сочетании с передней витрэктомией). Обнаружена тенденция увеличения частоты встречаемости ПВР у детей 2-5-ти лет. 124 ГЛАВА 5. КРИТЕРИИ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ПОСЛЕОПЕРАЦИОННОЙ ВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ РЕАКЦИИ У ДЕТЕЙ С ВРОЖДЕННЫМИ КАТАРАКТАМИ Известны различные способы прогнозирования ПВР у детей с врожденными катарактами, включающие анализ клинико-анамнестических и лабораторных данных [3-4, 30, 41, 46, 50, 77, 90, 92, 183]. Однако, в настоящее время не создан комплексный диагностический алгоритм, позволяющий поэтапно прогнозировать развитие послеоперационной воспалительной реакции у детей с врожденными катарактами. Проведенное в представленной работе исследование анамнестических и иммунологических показателей у детей с врожденными катарактами выявило ряд маркеров, демонстрирующих высокую информативность в прогнозе ПВР. На основании полученных данных методом множественной пошаговой регрессии были разработаны модели прогнозирования послеоперационной воспалительной реакции у детей с врожденными катарактами в возрасте 2-5ти и 6-14-ти лет. 1. Прогностическая модель воспалительной реакции у детей 2-5-ти лет с врожденными катарактами на основании анамнестических данных. Методом множественной пошаговой регрессии было получено математическое уравнение для коэффициента прогноза К1 послеоперационной воспалительной реакции у детей 2-5-ти лет на основании выявления в анамнезе патологических реакций на прививки, аллергической патологии кожи и суммы баллов инфекционного синдрома: К1 = 0,03 + 0,75*(патологические реакции на прививки) + 0,09*(сумма баллов инфекционного синдрома) + 0,33*(аллергическая патология кожи) Достоверность коэффициентов регрессии представлена в таблице 49. 125 Таблица 49 Регрессионные коэффициенты и уровень достоверности для уравнения расчета прогностического коэффициента К1 Параметр Регрессионный коэффициент Свободный член 0,029 Патологические 0,746 реакции на прививки Сумма баллов 0,090 инфекционного синдрома Аллергическая 0,325 патология кожи Стандартная t-критерий ошибка 0,166 0,18 0,253 2,95 Достоверность, р 0,8607 0,0051 0,041 2,20 0,0332 0,146 2,22 0,0296 Множественный коэффициент корреляции R1 для данной модели составил 0,51 (Рис. 28). Согласно полученному уравнению, при наличии в анамнезе патологических реакций на прививки, аллергической патологии кожи и увеличении суммарного коэффициента инфекционного синдрома, происходит возрастание значения прогностического коэффициента К1, а значит, вероятности развития ПВР у детей 2-5-ти лет. Коэффициент определения равен (R1)2*100=26%. Это означает, что только 26% изменчивости прогностического коэффициента определяются показателями, вошедшими в уравнение. Несомненно, существуют определяющие 74% изменчивости К1. 126 дополнительные факторы, Зависимая переменная: Наличие воспалительной реакции Модель К1 1,2 1,1 Предсказанные значения 1,0 0,9 0,8 Множественный коэффициент корреляции 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 R1 = 0,51 0,2 0,1 0,0 -0,1 -0,4 -0,2 0,0 0,2 Группа 1 0,4 0,6 0,8 Наблюдаемые значения 1,0 1,2 1,4 Группа 2 Рис. 28. Распределение пациентов по прогностическому коэффициенту К1 у детей с отсутствием воспалительной реакции (Группа 1) и при наличии воспалительной реакции (Группа 2) 2. Прогностическая модель воспалительной реакции у детей 2-5-ти лет с врожденными катарактами на основании анамнестических данных и активности СДГ в общей популяции лимфоцитов. Для улучшения качества прогностической модели К1 у детей 2-5-ти лет методом множественной пошаговой регрессии было получено уравнение К2, включающее, наряду с анамнестическими данными, показатели интенсивности энергетических процессов в лимфоцитах, определяемые методом цитоморфоденситометрии. К2 = 2,98 + 0,23*(частые ОРВИ в анамнезе) – 0,22*(площадь гранул) Достоверность коэффициентов регрессии представлена в таблице 50. Таблица 50 Регрессионные коэффициенты и уровень достоверности для уравнения расчета прогностического коэффициента – К2 Параметр Регрессионный коэффициент Свободный член 2,975 Стандартная t-критерий Достоверность, ошибка р 0,316 9,41 <0,0001 127 Частые ОРВИ в анамнезе (дети из группы «ЧБД») Площадь гранул 0,232 0,103 2,25 0,0309 -0,220 0,028 -7,86 <0,0001 Множественный коэффициент корреляции для данной модели составил R2=0,80 (Рис. 25). Согласно полученному уравнению, увеличение частоты ОРВИ в анамнезе и низкий уровень СДГ лимфоцитов определяет увеличение риска развития ПВР у детей 2-5-ти лет с врожденными катарактами. Коэффициент определения равен (R2)2*100=64%. Это означает, что 64% изменчивости прогностического показателями, вошедшими в коэффициента уравнение. К2 определяется Несомненно, существуют дополнительные факторы, определяющие 36% изменчивости К2. Однако, модель К2 позволяет лучше прогнозировать развитие послеоперационной воспалительной реакции по сравнению с моделью К1 (Рис. 29). Зависимая переменная: Наличие воспалительной реакции 1,4 Модель К2 Предсказуемые значения 1,2 1,0 0,8 Множественный коэффициент корреляции 0,6 0,4 0,2 R2 = 0,80 0,0 -0,2 -0,4 -0,4 -0,2 0,0 Группа 1 0,2 0,4 0,6 0,8 Наблюдаемые значения 1,0 1,2 1,4 Группа 2 Рис. 29. Распределение пациентов по прогностическому коэффициенту К2 у детей с отсутствием воспалительной реакции (Группа 1) и при наличии воспалительной реакции (Группа 2) 3. Прогностическая модель воспалительной реакции у детей 2-5-ти лет с врожденными катарактами на основании анамнеза, данных иммунофенотипа лимфоцитов периферической крови и активности СДГ. 128 Для улучшения качества прогностической модели К2 у детей 2-5-ти лет методом множественной пошаговой регрессии было получено уравнение К3, включающее, наряду с анамнестическими данными и показателями интенсивности энергетических процессов в общей популяции лимфоцитов, определяемыми методом цитоморфоденситометрии, результаты исследований количественного состава различных популяций лимфоцитов и активность СДГ в них. К3 = 9,41 + 0,58*(патологические реакции на прививки) + 0,07*(сумма баллов инфекционного синдрома) – 0,12*(площадь гранул) – 0,05*(цитотоксические Т-клетки) – 0,04*СДГ(акт. Т-ЛФ) Достоверность коэффициентов регрессии представлена в таблице 51. Таблица 51 Регрессионные коэффициенты и уровень достоверности для уравнения расчета прогностического коэффициента – К3 Параметр Регрессионный коэффициент Свободный член 9,411 Патологические 0,578 реакции на прививки Сумма баллов 0,069 инфекционного синдрома Площадь гранул -0,124 Относительное -0,045 количество цитотоксических Т-лимфоцитов Активность СДГ -0,039 в популяции активированных Т-лимфоцитов Стандартная t-критерий ошибка 0,580 7,98 0,182 3,18 Достоверность, р <0,0001 0,0035 0,026 2,64 0,0133 0,029 0,007 -4,32 -6,15 0,0002 <0,0001 0,010 -3,68 0,0010 Множественный коэффициент корреляции для данной модели составил R3=0,93 (Рис. 30). Полученная модель К3 позволила разделить пациентов с 129 наличием воспалительной реакции и без нее. Коэффициент определения равен (R3)2*100=86%, что означает, что 86% изменчивости прогностического коэффициента определяются показателями, вошедшими в уравнение, и дополнительными факторами определяется только 14% К3. Зависимая переменная: Наличие воспалительной реакции Модель К3 1,6 Предсказанные значения 1,4 1,2 1,0 Множественный коэффициент корреляции 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 R3 = 0,93 -0,2 -0,4 -0,4 -0,2 0,0 Группа 1 0,2 0,4 0,6 0,8 Наблюдаемые значения 1,0 1,2 1,4 Группа 2 Рис. 30. Распределение пациентов по прогностическому коэффициенту К3 у детей с отсутствием воспалительной реакции (Группа 1) и при наличии воспалительной реакции (Группа 2) Для проверки информативности коэффициента К3 и расчета уровня cut-off для этого коэффициента был проведен ROC-анализ полученных данных, который продемонстрировал очень хорошее качество модели (AUC=0,830 (0,687-0,997), p<0,05) (Рис. 31). Диагностическая значимость определения прогностического коэффициента К3 значительно превышала значимость отдельных показателей, вошедших в регрессионное уравнение. 130 AUC=0,830 (0,687-0,997) Модель К3 Рис. 31. ROC-кривая для прогностического коэффициента К3 у детей 2-5-ти лет Был определен уровень порогового значения (cut-off) коэффициента прогноза К3 у детей 2-5-ти лет, который составил 0,33 (ДЧ=90,0%, ДС=87,5%, p<0,05). Величина К3≥0,33 позволяет прогнозировать развитие ПВР у детей 25-ти лет. Таким образом, проведенный анализ показал, что прогностическая значимость клинико-анамнестических данных является недостаточной (R1=0,51) в оценке риска развития ПВР у детей с врожденной катарактой в возрасте 2-5-ти лет, что определяет необходимость использования дополнительных показателей. Создание математического уравнения на основании анамнестических данных, показателей состояния клеточного иммунитета и интенсивности энергетических процессов в популяциях лимфоцитов у детей 2-5-ти лет позволило увеличить информативность прогностической модели до 90% (R3=0,93). Получено уравнение для расчета прогностического коэффициента К3, включающее отягощенность анамнеза наличием патологических реакций на прививки, сумму баллов инфекционного синдрома, показатели активности СДГ (площадь гранул) в общей популяции лимфоцитов, относительного количества цитотоксических Т-клеток и активности СДГ в популяции активированных Т-лимфоцитов, которое 131 позволяет прогнозировать развитие послеоперационной воспалительной реакции. На основании определения информативности отдельных показателей и построенных прогностических моделей был создан алгоритм пошагового действия в выявлении риска развития послеоперационной воспалительной реакции у детей 2-5-ти лет (Рис. 32). На первом этапе (шаг 1) у пациентов определяется сумма баллов инфекционного синдрома. При сумме баллов инфекционного синдрома ≥ 4-х необходимо выполнение второго этапа (шаг 2). При сумме баллов инфекционного синдрома < 4-х необходимо определение активности СДГ в общей популяции лимфоцитов. Снижение площади гранул менее 4-х свидетельствует о необходимости выполнения 2-го этапа алгоритма. Если сумма баллов инфекционного синдрома составила менее 4-х и активность СДГ (площадь гранул) в общей популяции лимфоцитов – более 11,7 усл. ед., то у детей можно прогнозировать низкий риск развития ПВР. Шаг 2 включает проведение иммуноцитохимического исследования с определением относительного количества цитотоксических Т-лимфоцитов и вычисление коэффициента К3. Расчет коэффициента прогноза К3 включает суммарную оценку анамнестических сведений (наличие патологических реакций на прививки, сумма баллов инфекционного синдрома), данных цитоморфоденситометрии (площадь гранул ферментативной активности СДГ в общей популяции лимфоцитов) и результатов иммунологического обследования (относительное количество цитотоксических Т-клеток и активность СДГ в популяции активированных Т-лимфоцитов). Значение коэффициента К3 < 0,33 позволяет прогнозировать низкий риск развития ПВР. Коэффициент К3 ≥ 0,33 свидетельствует о высоком риске ПВР и определяет необходимость проведения предоперационной подготовки. 132 Инфекционный синдром < 4 баллов ≥ 4 баллов Ш А Г Активность СДГ в общей популяции лимфоцитов (площадь гранул) 1 < 11,7 усл. ед. > 11,7 усл. ед. Относительное количество цитотоксических Т-лимфоцитов Ш А Г Активность СДГ в общей популяции лимфоцитов и в активированных Т-лимфоцитах 2 Вычисление прогностического коэффициента К3 > 0,33 < 0,33 Высокий риск развития послеоперационной воспалительной реакции Низкий риск развития послеоперационной воспалительной реакции Предоперационная терапия Рис. 32. Алгоритм пошагового действия в выявлении риска развития ПВР у детей 2-5-ти лет Клинические примеры Пример 1. Больной А., 2 года. Диагноз: Врожденная зонулярная катаракта обоих глаз. 133 В мае 2012 года проведена аспирация врожденной катаракты правого глаза с имплантацией ИОЛ. В первые сутки послеоперационного периода возникла воспалительная реакция 1-ой степени. К стандартной противовоспалительной терапии в раннем послеоперационном периоде был добавлен форсаж раствора дексаметазона 0,1% 2 раза в день. На 3-и сутки послеоперационного периода воспалительная реакция купировалась. На первом этапе оценивали сумму баллов инфекционного синдрома, которая у ребенка А. была равна 5-ти, что указывало на высокий риск ПВР, поэтому на следующем этапе оценили активность СДГ (площадь гранул) в общей популяции лимфоцитов, которая составила 10,45 усл. ед.; относительное количество цитотоксических Тлимфоцитов, равное 24,56%; и активность СДГ в популяции активированных Т-лимфоцитов, равную 164,05 усл. ед. К3 = 9,41 + 0,58*0 + 0,07*5 - 0,12*10,45 - 0,05*24,56 - 0,04*164,05 = 0,72 Прогностический коэффициент К3 = 0,72, что превышало уровень cut off=0,33, и соответствовало развитию ПВР. В декабре 2012 года проведена аспирация врожденной катаракты левого глаза. ПВР не отмечалась. В послеоперационном периоде проведена стандартная противовоспалительная терапия. На первом этапе оценивали сумму баллов инфекционного синдрома, которая у ребенка А. была равна 5-ти, что указывало на высокий риск ПВР, поэтому на следующем этапе оценили активность СДГ (площадь гранул) в общей популяции лимфоцитов, которая составила 12,81 усл. ед.; относительное количество цитотоксических Тлимфоцитов, равное 25,07%; и активность СДГ в популяции активированных Т-лимфоцитов, равную 203,81 усл. ед. К3 = 9,41 + 0,58*0 + 0,07*5 - 0,12*12,81 – 0,05*25,07 – 0,04*203,81 = -1,18 Прогностический коэффициент К3 составил (-1,18), что меньше уровня cut off = 0,33 и соответствует благоприятному течению раннего послеоперационного периода. 134 4. Прогностическая модель воспалительной реакции у детей 6-14-ти лет с врожденными катарактами на основании анамнестических данных. Методом множественной пошаговой регрессии было получено математическое уравнение для коэффициента прогноза (К4) ПВР у детей 6-14ти лет на основании изучения анамнестических данных: частоты заболеваемости ОРВИ (группа «ЧБД»), бактериальных инфекций кожи и подкожно-жировой клетчатки, лимфаденитов, оппортунистических инфекций, суммарного коэффициента аллергического синдрома, токсикоза I-ой половины беременности: К4 = -0,60 + 0,35*(частые ОРВИ в анамнезе) + 0,28*(бактериальные инфекции кожи и ПЖК) + 0,83*(лимфадениты в анамнезе) + 0,47*(оппортунистические инфекции) + 0,53*(сумма баллов аллергического синдрома) + 0,48*(токсикоз I-ой половины беременности) Достоверность коэффициентов регрессии представлена в таблице 52. Таблица 52 Регрессионные коэффициенты и уровень достоверности для уравнения расчета прогностического коэффициента К4 Параметр Регрессионный Стандартная t-критерий коэффициент ошибка Свободный член -0,598 0,090 0,16 Частые ОРВИ в 0,348 0,166 2,09 анамнезе – группа «ЧБД» Бактериальные 0,282 0,136 2,07 инфекции кожи и ПЖК Лимфадениты 0,829 0,152 5,44 Оппортунистичес 0,472 0,178 2,64 кие инфекции Сумма баллов 0,534 0,166 3,21 аллергического синдрома Токсикоз I-ой 0,476 0,113 4,21 половины беременности 135 Достоверность, р 0,5615 0,0417 0,0436 <0,0001 0,0111 0,0024 0,0001 Множественный коэффициент корреляции для данной модели составил R4=0,82 (Рис. 33). Согласно полученному уравнению, при наличии в анамнезе частых ОРВИ (группа «ЧБД»), бактериальных инфекций кожи и подкожножировой клетчатки, лимфаденитов, оппортунистических инфекций, токсикоза I-ой половины беременности, а также увеличении суммы баллов аллергического синдрома происходит возрастание значения прогностического коэффициента К4, а значит, и вероятности развития ПВР. Коэффициент определения равен (R4)2*100=67%. Это означает, что в 67% изменчивости прогностического коэффициента определяются показателями, вошедшими в уравнение. Несомненно, существуют дополнительные факторы, определяющие 33% изменчивости К4. Зависимая переменная: Наличие воспалительной реакции 1,4 Модель К4 Предсказанные значения 1,2 1,0 0,8 Множественный коэффициент корреляции 0,6 0,4 0,2 0,0 -0,2 R4 = 0,82 -0,4 -0,4 -0,2 0,0 Группа 1 0,2 0,4 0,6 0,8 Наблюдаемые значения 1,0 1,2 1,4 Группа 2 Рис. 33. Распределение пациентов по прогностическому коэффициенту К4 у детей с отсутствием воспалительной реакции (Группа 1) и при наличии воспалительной реакции (Группа 2) Для проверки информативности коэффициента К4 и расчета уровня cut off для этого коэффициента был проведен ROC-анализ полученных данных, который продемонстрировал хорошее качество модели (AUC=0,782 (0,6420,922), p<0,05). Уровень порогового значения (cut off) коэффициента К4 составил 0,35 (ДЧ=84,6%, ДС=73,3%, p<0,05). Величина К4 ≥ 0,35 позволяет прогнозировать развитие ПВР у детей 6-14-ти лет. 136 Клинические примеры Пример 2. Пациент Ч., 6 лет. Диагноз: Врожденная зонулярная катаракта правого глаза; артифакия левого глаза. В январе 2012 года проведена аспирация врожденной катаракты левого глаза с имплантацией ИОЛ. ПВР не отмечалась. В мае 2012 года проведена аспирация врожденной катаракты правого глаза с имплантацией ИОЛ. В послеоперационном периоде проведена стандартная противовоспалительная терапия. ПВР не отмечалась. Был рассчитан прогностический коэффициент К4. К4 = -0,60 + 0,35*0 + 0,28*0 + 0,83*0 + 0,47*0 + 0,53*1 + 0,48*1 = 0,41 Прогностический коэффициент К4 составил 0,41, что больше уровня cut off = 0,35 и соответствует развитию ПВР. Пример 3. Пациент Б., 8 лет. Диагноз: Врожденная заднекапсулярная катаракта левого глаза, осевая миопия слабой степени обоих глаз. В июне 2012 года проведена аспирация врожденной катаракты левого глаза с имплантацией ИОЛ + задняя капсулотомия и передняя витрэктомия. В послеоперационном периоде проведена стандартная противовоспалительная терапия. ПВР не отмечалась. Был рассчитан коэффициент К4. К4 = -0,60 + 0,35*0 + 0,28*0 + 0,83*0 + 0,47*0 + 0,53*0 + 0,48*0 = -0,60 Прогностический коэффициент К4 составил -0,60, что меньше уровня cut off = 0,35 и соответствует благоприятному течению раннего послеоперационного периода. Пример 4. Пациент М., 14 лет. Диагноз: Врожденная зонулярная катаракта обоих глаз; осевая миопия слабой степени обоих глаз. В октябре 2012 года проведена аспирация врожденной катаракты левого глаза с имплантацией ИОЛ. В первые сутки послеоперационного периода возникла воспалительная реакция 1-й степени. К стандартной противовоспалительной терапии в раннем послеоперационном периоде был добавлен форсаж раствора дексаметазона 0,1% 2 раза в день. На 3-и сутки послеоперационного периода 137 воспалительная реакция купировалась. У пациента М. была рассчитана величина коэффициента К4. К4 = -0,60 + 0,35*0 + 0,28*1 + 0,83*0 + 0,47*0 + 0,53*2 + 0,48*0 = 0,74 Прогностический коэффициент К4 составил 0,74, что больше уровня cut off = 0,35, и соответствует развитию ПВР. Пример 5. Пациент С., 12 лет. Диагноз: Врожденная заднекапсулярная катаракта левого глаза, миопия слабой степени левого глаза. В ноябре 2012 года проведена аспирация врожденной катаракты левого глаза с имплантацией ИОЛ + задняя капсулотомия с передней витрэктомией. В 1-е сутки послеоперационного периода возникла воспалительная реакция 1-ой степени. К стандартной противовоспалительной терапии в раннем послеоперационном периоде был добавлен форсаж раствора дексаметазона 0,1% 2 раза в день. На 3-и сутки ПВР купировалась. Был рассчитан коэффициент К4. К4 = -0,60 + 0,35*0 + 0,28*0 + 0,83*1 + 0,47*0 + 0,53*0 + 0,48*0 = 0,23 Прогностический коэффициент К4 составил 0,23, что меньше уровня cut off = 0,35 и соответствует благоприятному течению послеоперационного периода. У части пациентов (16%) наблюдается несовпадение прогноза и реальности. Несмотря на высокий коэффициент корреляции (R4=0,82) для данной прогностической модели у детей 6-14-ти лет, получение ложноотрицательных и ложноположительных заключений при расчете коэффициента К4 свидетельствует используемой модели и о недостаточной необходимости применения информативности дополнительных параметров для увеличения ее прогностической эффективности. 5. Прогностическая модель воспалительной реакции у детей 6-14-ти лет с врожденными катарактами на основании анамнестических данных активности СДГ в общей популяции лимфоцитов. Для улучшения качества прогностической модели К4 у детей 6-14-ти лет методом множественной пошаговой регрессии было получено уравнение К5, 138 включающее, наряду с анамнестическими данными, показатели интенсивности энергетических процессов (плотность гранул) в лимфоцитах, определяемые методом цитоморфоденситометрии. К5 = 1,77 + 0,53*(частые ОРВИ в анамнезе – группа «ЧБД») + 0,29*(бактериальные инфекции кожи и ПЖК) + 0,38*(лимфадениты) + 0,34*(оппортунистические инфекции) + 0,46*(сумма баллов аллергического синдрома) – 4,29*(общая плотность гранул) Достоверность коэффициентов регрессии представлена в таблице 53. Таблица 53 Регрессионные коэффициенты и уровень достоверности для уравнения расчета прогностического коэффициента – К5 Параметр Регрессионный Стандартная t-критерий коэффициент ошибка Свободный член 1,765 0,368 5,78 Частые ОРВИ в 0,529 0,113 4,68 анамнезе (дети из группы «ЧБД») Бактериальные 0,289 0,109 2,65 инфекции кожи и ПЖК Лимфадениты 0,379 0,832 4,55 Оппортунистичес 0,339 0,136 2,50 кие инфекции Сумма баллов 0,462 0,148 3,13 аллергического синдрома Общая плотность -4,290 0,756 -5,68 клеток Достоверность, р <0,0001 <0,0001 0,0111 <0,0001 0,1619 0,0031 <0,0001 Множественный коэффициент корреляции для данной модели составил R5=0,90 (Рис. 34). Согласно полученному уравнению, чем меньше общая оптическая плотность клеток, тем выше риск развития ПВР у детей 6-14-ти лет с врожденными катарактами. Коэффициент определения равен (R5)2*100=81%, что означает, что в 81% изменчивости прогностического коэффициента определяются показателями, 139 вошедшими в уравнение. Несомненно, существуют дополнительные факторы, определяющие 19% изменчивости К5. Зависимая переменная: Наличие воспалительной реакции Модель К5 1,4 Предсказанные значения 1,2 1,0 Множественный коэффициент корреляции 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 R5 = 0,90 -0,2 -0,4 -0,2 0,0 Группа 1 0,2 0,4 0,6 Наблюдаемые значения 0,8 1,0 1,2 Группа 2 Рис. 34. Распределение пациентов по прогностическому коэффициенту К5 у детей с отсутствием воспалительной реакции (Группа 1) и при наличии воспалительной реакции (Группа 2) Для проверки информативности коэффициента К5 был проведен ROCанализ полученных данных и расчет уровня cut off для этого коэффициента, который продемонстрировал отличное качество модели (AUC=0,910 (0,8390,982), p<0,05). Уровень порогового значения (cut off) коэффициента прогноза К5 составил 0,60 (ДЧ=81,8%, ДС=80,7%, p<0,05). Величина К5 ≥ 0,60 позволяет прогнозировать развитие ПВР у детей 6-14-ти лет. Диагностическая значимость определения прогностического коэффициента К5 значительно превышала значимость отдельных показателей, вошедших в регрессионное уравнение. 6. Прогностическая модель на основании анамнестических данных, данных иммунофенотипа и активности СДГ в популяциях лимфоцитов у детей 6-14-ти лет с врожденными катарактами. Для улучшения качества прогностической модели К5 у детей 6-14-ти лет методом множественной пошаговой регрессии было получено уравнение К6, 140 включающее, наряду с анамнестическими данными и показателями интенсивности энергетических процессов в общей популяции лимфоцитов, определяемыми методом цитоморфоденситометрии, результаты исследований количественного состава различных популяций лимфоцитов и активность СДГ в них. К6 = 5,06 + 0,19*(лихорадка) + 0,30*(частые ОРВИ в анамнезе – группа «ЧБД») + 0,20*(бактериальные инфекции кожи и подкожно-жировой клетчатки) + 0,43*(патологические реакции на прививки) + 0,25*(лимфадениты) + 0,56*(оппортунистические инфекции) + 0,02*(сумма баллов аллергического синдрома) - 0,02*активность СДГ (количество гранул) – 5,43*активность СДГ (общая плотность гранул) – 0,11*активность СДГ (площадь гранул) + 0,003*(абсолютное количество Th17-лимфоцитов) – 0,009*(активность СДГ в популяции Т-лимфоцитов) Достоверность коэффициентов регрессии представлена в таблице 54. Таблица 54 Регрессионные коэффициенты и уровень достоверности для уравнения расчета прогностического коэффициента – К6 Параметр Регрессионный Стандартная t-критерий коэффициент ошибка Свободный член 5,063 1,234 2,86 Длительный субфебрилитет, лихорадка Частые ОРВИ в анамнезе (дети из группы «ЧБД») Бактериальные инфекции кожи и подкожножировой клетчатки Патологические реакции на прививки Достоверность, р 0,007366 0,187 0,207 0,90 0,373369 0,296 0,210 1,41 0,168427 0,204 0,159 1,28 0,210485 0,432 0,398 1,08 0,286061 141 Лимфадениты 0,246 0,207 1,19 0,241817 Оппортунистичес кие инфекции Сумма баллов аллергического синдрома Количество гранул Общая плотность гранул Площадь гранул 0,555 0,145 3,84 0,000527 0,015 0,229 0,06 0,948596 -0,016 0,040 -0,40 0,690206 -5,429 2,106 -2,58 0,014587 -0,106 0,081 -1,32 0,197344 0,003 0,001 2,07 0,045834 -0,009 0,004 -2,23 0,032856 Абсолютное количество Th17лимфоцитов Активность СДГ в популяции Тлимфоцитов Множественный коэффициент корреляции для данной модели составил R6=0,95 (Рис. 35). Зависимая переменная: Наличие воспалительной реакции Модель К6 1,4 Предсказанные значения 1,2 1,0 Множественный коэффициент корреляции 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 -0,2 R6 = 0,95 -0,4 -0,6 -0,2 0,0 Группа 1 0,2 0,4 0,6 Наблюдаемые значения 0,8 1,0 1,2 Группа 2 Рис. 35. Распределение пациентов по прогностическому коэффициенту К6 у детей с отсутствием воспалительной реакции (Группа 1) и при наличии воспалительной реакции (Группа 2) 142 Согласно полученному уравнению, коэффициент определения равен (R6)2*100=90%, что означает, что в 90% изменчивости прогностического коэффициента определяются показателями, вошедшими в уравнение. Несомненно, существуют дополнительные факторы, определяющие 10% изменчивости К6. Для проверки информативности коэффициента К6 был проведен ROCанализ полученных данных и расчет уровня cut off для этого коэффициента, который продемонстрировал отличное качество модели (AUC=0,975 (0,9330,998), p<0,05). Значимость определения прогностического коэффициента К6 значительно превышала значимость отдельных показателей, вошедших в регрессионное уравнение. Уровень порогового значения (cut off) коэффициента прогноза К6 составил 0,63 (ДЧ=96,7%, ДС=90,3%, p<0,05). Величина К6 ≥ 0,63 позволяет прогнозировать развитие ПВР у детей 6-14-ти лет. AUC=0,975 (0,933-0,998) Модель К6 Рис. 36. ROC-кривая для прогностического коэффициента К6 у детей 6-14-ти лет Таким образом, сравнение прогностической значимости полученных моделей для детей 6-14-ти лет выявило умеренную информативность модели К4, основанную на определении анамнестических данных (R4=0,82). Создание прогностической модели на основе анамнестических и иммунологических 143 данных, позволило значительно увеличить информативность коэффициента К6 (R6=0,95). На основании определения прогностической значимости отдельных показателей и прогностических моделей был создан алгоритм пошагового действия в выявлении риска развития ПВР у детей 6-14-ти лет (Рисунок 37). Оценка анамнестических факторов и вычисление коэффициента К4 Ш А Г > 0,35 < 0,35 Активность СДГ в общей популяции лимфоцитов (ИОП) 1 < 905 усл. ед. > 905 усл. ед. Абсолютное количество Th17-лимфоцитов Ш А Г 2 Активность СДГ в общей популяции лимфоцитов и в Т-лимфоцитах Вычисление прогностического коэффициента К6 > 0,63 < 0,63 Низкий риск развития послеоперационной воспалительной реакции Высокий риск развития послеоперационной воспалительной реакции Предоперационная терапия Рис. 37. Алгоритм пошагового действия в выявлении риска развития ПВР у детей 6-14-ти лет 144 На первом этапе (шаг 1) у пациентов на основании анамнестических данных производится вычисление коэффициента К4. Если К4 ≥ 0,35 необходимо выполнение следующего этапа алгоритма (шаг 2). При К4<0,35 необходимо определение активности СДГ (ИОП) в общей популяции лимфоцитов. Снижение ИОП < 905 усл. ед. свидетельствует о необходимости 2-го этапа алгоритма. Величина К4 < 0,35 и ИОП > 905 усл. ед. позволяют предположить низкий риск развития ПВР. Шаг 2 включает проведение иммуноцитохимического исследования с определением абсолютного количества Th17-лимфоцитов и вычисление коэффициента К6. Значение К6 менее 0,63 поволяет прогнозировать низкий риск развития ПВР. Коэффициент К6 ≥ 0,63 свидетельствует о высоком риске ПВР и определяет необходимость предоперационной подготовки. Клинические примеры Пример 6. Пациент Ч., 6 лет. Диагноз: Врожденная зонулярная катаракта правого глаза, артифакия левого глаза. В январе 2012 года проведена аспирация врожденной катаракты левого глаза с имплантацией ИОЛ. В послеоперационном периоде проведена стандартная противовоспалительная терапия. ПВР не отмечалась. В мае 2012 года проведена аспирация врожденной катаракты правого глаза с имплантацией ИОЛ. В послеоперационном периоде проведена стандартная противовоспалительная терапия. ПВР не отмечалась. Был рассчитан коэффициент К6. К6 = 5,06 + 0,19*0 + 0,30*0 + 0,20*0 + 0,4*0 + 0,25*0 + 0,56*0 + 0,02*1 0,02*17,5 - 5,43*0,48 – 0,11*10,61 + 0,003*247,17 – 0,009*179,09 = 0,07 Прогностический коэффициент К6 составил 0,07, что меньше уровня cut off = 0,63 и соответствует благоприятному течению раннего послеоперационного периода. Пример 7. Пациент С., 12 лет. Диагноз: Врожденная заднекапсулярная катаракта левого глаза, миопия слабой степени левого глаза. 145 В ноябре 2012 года проведена аспирация врожденной катаракты левого глаза с имплантацией ИОЛ + задняя капсуотомия с передней витрэктомией. В 1-е сутки послеоперационного периода возникла воспалительная реакция 1-ой степени. К стандартной противовоспалительной терапии в раннем послеоперационном периоде был добавлен форсаж раствора дексаметазона 0,1% 2 раза в день. На 3-и сутки ПВР купировалась. Был расчитан коэффициент К6. К6 = 5,06 + 0,19*0 + 0,30*0 + 0,20*0 + 0,4*0 + 0,25*1 – 0,02*16,5 – 5,43*0,42 0,11*10,18 + 0,003*162,75 – 0,009*147,02 = 0,75 Прогностический коэффициент К6 составил 0,75, что больше уровня cut off = 0,63 и соответствует развитию ПВР. Таким образом, прогностическая информативность анамнестических сведений у детей 6-14-ти лет выше, чем у детей 2-5-ти лет. Тем не менее, значимость анамнестических данных для достоверного прогноза развития ПВР у детей 6-14-ти лет с врожденными катарактами является недостаточной. Для улучшения прогностических коэффициентов, кроме анамнестических данных, в активность качестве СДГ скрининговой в общей методики, популяции необходимо учитывать лимфоцитов (методом цитоморфоденситометрии). Увеличение точности прогноза ПВР возможно при учете показателей реактивности иммунной системы. Наиболее информативными иммунологическими показателями для детей 2-5-ти лет являются: относительное количество цитотоксических Т-лимфоцитов и активность СДГ в популяции активированных Т-лимфоцитов; для детей 6-14ти лет – абсолютное количество Th17-лимфоцитов и активность СДГ в популяции Т-лимфоцитов. На основании наиболее информативных показателей и прогностических моделей были созданы алгоритмы пошагового действия, позволяющие прогнозировать развитие ПВР у детей 2-5-ти и 6-14-ти лет. Использование полученных алгоритмов у детей с врожденными катарактами является актуальным – позволяет определить риск развития ПВР 146 с целью обоснованного и своевременного назначения профилактической противовоспалительной терапии. 147 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Врожденная катаракта занимает 3-е место в структуре инвалидности детей по офтальмопатологии [53]. Высокая частота низких зрительных функций у детей с данной патологией обусловлена не только развитием амблиопии, вследствие несвоевременного хирургического лечения, но и высокой частотой воспалительных осложнений в раннем послеоперационном периоде, что является одной из причин вторичной катаракты, вторичной глаукомы и помутнения передних отделов стекловидного тела, требующих повторных хирургических вмешательств [20, 21, 37, 44, 49, 107, 160, 191]. Несвоевременное лечение ранних и поздних послеоперационных осложнений часто сопровождается необратимым снижением зрения [3, 20, 21, 37, 44, 107]. К причинам высокой частоты возникновения воспалительных реакций можно отнести незрелость гемато-офтальмического барьера, технику экстракции катаракты и особенности иммунной системы детского возраста [76, 114]. Необходимость прогнозирования воспалительных осложнений в различные сроки послеоперационного периода у детей с врожденными катарактами определила интерес к изучению общего и местного иммунного статуса данной категории пациентов [15, 30, 60, 77, 93]. Тем не менее, изучение иммунологических показателей в сыворотке крови, слезе и внутриглазной жидкости часто выявляло значительный разброс исследуемых величин у детей, что снижало их прогностическую ценность [30, 41]. В последние годы появились исследования, указывающие на информативность изучения основных и малых популяций лимфоцитов с целью прогнозировании течения заболевания, развития осложнений и эффекта терапии [58, 87, 88, 106, 117, 177, 233, 246, 250, 276]. Именно поэтому, особое внимание уделяется исследованию различных популяций лимфоцитов, в том числе, и в офтальмопатологии [5, 9-12, 36, 52, 183]. Исследование популяционного состава лимфоцитов позволяет не только прогнозировать течение заболевания, 148 но и увеличить терапевтическую и экономическую эффективность лечения путем персонифицированного подхода к каждому пациенту [58, 87]. В настоящее время определен ряд показателей, обладающих прогностической значимостью в характеристике течения послеоперационного периода у пациентов с катарактами. К клинико-анамнестическим факторам прогнозирования осложненного течения послеоперационного периода относят повторное хирургическое вмешательство, наличие травмы, глаукомы на оперируемом глазу [52]. Прогностические возможности лабораторных показателей оценены при определении уровней S-антигена сетчатки, роговичных, увеальных и хрусталиковых антител, различных комбинаций цитокинов [30, 38, 41, 50, 82]. Перечисленные подходы содержат ряд ограничений. В частности, не всегда применимы у пациентов детского возраста с врожденными катарактами и исключают возможность подбора патогенетически обоснованной, эффективной терапии в случае развития послеоперационных воспалительных осложнений. Целью данного исследования явилась разработка критериев прогноза возникновения послеоперационных воспалительных реакций у детей с врожденными катарактами. Для решения поставленных задач было обследовано 106 пациентов (114 глаз) с врожденными катарактами в возрасте от 2-х до 14-ти лет. Всем детям проведена операция: аспирация врожденной катаракты с имплантацией ИОЛ Acrysof SA60AT (Alcon, США). У всех пациентов до операции изучен анамнез в соответствии с рекомендациями Мешковой Р.Я. [57] и Хватовой А.В. [90], произведен забор венозной крови для выполнения исследования иммунофенотипа лимфоцитов периферической крови и определения активности сукцинатдегидрогеназы в популяциях лимфоцитов, как маркера интенсивности энергетических процессов в них. В зависимости от течения раннего послеоперационного периода все дети, вошедшие в исследование, были поделены на две группы – группа детей без признаков воспалительной реакции в раннем послеоперационном периоде 149 (Группа 1) и дети с 1-й степенью воспалительной реакции в раннем послеоперационном периоде (Группа 2). Оценку воспалительной реакции проводили биомикроскопически по классификации Сергиенко Н.М. и Веселовской З.Ф. (1985) с учетом дополнений Азнабаева Р.А. с соавт. (2009), которая используется в хирургии катаракт у детей [3, 72]. Критериями включения детей в Группу 2 с наличием воспалительной реакции в раннем послеоперационном периоде были выбраны следующие показатели: слабо выраженная гиперемия конъюнктивы, незначительный отек эпителия верхней трети роговицы и в зоне парацентезов, полностью исчезающий к 3-5-м суткам. В Группу 1 были отнесены пациенты, у которых данные признаки отсутствовали. У пациентов обеих групп не отмечали феномена Тиндаля, отложения преципитатов на поверхности ИОЛ, передних и задних синехий, изменения формы зрачка, выпадения фибрина в передней камере, помутнений в передних отделах стекловидного тела. Первый этап исследования включал оценку клинико-анамнестических показателей до операции с целью выявления значимых параметров в прогнозе развития ПВР. Последующий анализ полученных результатов выявил наиболее информативные прогностические показатели воспалительной реакции у детей с врожденными катарактами в раннем послеоперационном периоде, а именно: у детей 2-5-ти лет - сумма баллов инфекционного синдрома 4 и более; у детей 6-14-ти лет – сумма баллов аллергического синдрома 1 и более, наличие токсикоза I-ой половины беременности, сумма баллов инфекционного синдрома 3 и более. Выявление данных признаков обосновывает необходимость тщательного иммунологического обследования. На втором этапе работы была произведена оценка абсолютного и относительного количества периферической крови: следующих Т-лимфоцитов популяций лимфоцитов (CD3+CD45+), Т-хелперов (CD3+CD4+CD45+), цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3+CD8+CD45+), Влимфоцитов (CD3-CD19+CD45+), 150 NK-клеток (CD3-CD16+CD56+), активированных Т-лимфоцитов (CD3+HLA-DR+), (CD4+CD25+CD127low), лимфоцитов (CD4+CD25+CD127high), регуляторных активированных Th2-лимфоцитов Т- Т-хелперов (CD3+CD4+CD294+), Th17- лимфоцитов (CD3+CD4+CD161+), B1-лимфоцитов (CD3-CD19+CD5+CD45+), B2-лимфоцитов (CD3-CD19+CD5-CD45+). Для оценки интенсивности энергетических процессов в этих популяциях определяли активность СДГ иммуноцитохимическим методом с использованием проточной цитофлуориметрии. Учитывая наличие второго перекреста в лейкоцитарной формуле у детей в возрасте 5-ти лет, определяющего изменение количественных характеристик лейкоцитов и лимфоцитов, оценку всех исследуемых показателей производили отдельно у детей 2-5-ти и 6-14-ти лет. Изучение количественного состава основных популяций лимфоцитов периферической крови у детей 2-5ти лет Группы 2 выявило достоверное снижение относительного количества Тлимфоцитов, цитотоксических Т-лимфоцитов и активированных Т-хелперов; абсолютного и относительного количества активированных Т-лимфоцитов; а также увеличение иммунорегуляторного индекса (CD4+/CD8+), абсолютного количества NK-клеток, абсолютного и относительного количества Влимфоцитов. Выявленное снижение относительного количества Т-лимфоцитов соотносится с данными Балашовой Л.М. с соавт. [10], выявившей снижение относительного количества Т-лимфоцитов, Т-хелперов, регуляторных Тклеток, увеличение иммунорегуляторного индекса (CD4/CD8), а также увеличение количества В1-лимфоцитов, тенденцию к увеличению NK-клеток и тенденцию к снижению цитотоксических Т-лимфоцитов у детей с ретинопатией недоношенных III-V стадии в возрасте 1,5-6-ти месяцев по сравнению с доношенными здоровыми детьми. Уменьшение количества цитотоксических Т-лимфоцитов и активированных Т-хелперов является неблагоприятным специфического признаком, так иммунитета, а как свидетельствует увеличение 151 количества о снижении NK-клеток характеризует усиление неспецифического иммунного ответа. Увеличение доли эффекторных клеток, обеспечивающих неспецифический иммунный ответ, может свидетельствовать о незрелости иммунной системы и развитии гиперергической реакции в ответ на любое воздействие. Увеличение количества В-лимфоцитов отмечалось, преимущественно за счет популяции В2-лимфоцитов, что совпадает с данными Зурочки А.В. с соавт. [36], описывающих увеличение данной популяции как неблагоприятный признак в прогнозе развития иммунорегуляторного симпатической индекса офтальмии. (CD4/CD8) в данной Увеличение группе является закономерным и обусловлено уменьшением относительного количества цитотоксических Т-лимфоцитов. Для выявления наиболее информативных показателей в прогнозировании ПВР у детей 2-5-ти лет был проведен ROCанализ данных иммунофенотипа лимфоцитов периферической крови и иммуноцитохимического информативными исследования показателями до оказались: операции. Наиболее относительное количество цитотоксических Т-лимфоцитов и иммунорегуляторный индекс (CD4/CD8), что соответствовало очень хорошему качеству прогностической модели (AUC=0,8-0,9, p<0,05). Уменьшение относительного количества цитотоксических Т-клеток менее 26,43% (ДЧ=83,3%, ДС=80,0%, p<0,05) и увеличение иммунорегуляторного индекса более 1,24 усл. ед. (ДЧ=91,7%, ДС=50,0%, p<0,05) позволяет прогнозировать развитие ПВР. При исследовании количественного состава основных популяций лимфоцитов периферической крови у детей 6-14-ти лет в Группе 2 выявлено достоверное уменьшение абсолютного и относительного количества NKклеток; увеличение относительного и абсолютного количества Th17лимфоцитов, увеличение относительного количества В2-лимфоцитов по сравнению с Группой 1. Уменьшение относительного и абсолютного количества NK-клеток свидетельствует о снижении роли неспецифического иммунного ответа у детей 6-14-ти лет. Увеличение относительного количества 152 В2-лимфоцитов может свидетельствовать об инициировании Т-клеточного ответа. В2-лимфоциты обеспечивают адаптивный иммунный ответ, распознают специфические иммуноглобулиновые рецепторы и запускают синтез антител. Проведение ROC-анализа выявило наиболее информативный иммунологический показатель в прогнозировании ПВР у детей 6-14-ти лет – абсолютное количество Th17-лимфоцитов. Определение абсолютного количества Тh17-лимфоцитов соответствовало очень хорошему качеству прогностической модели (AUC=0,887 (0,801-0,972), p<0,05). Увеличение абсолютного количества Th17-лимфоцитов более 190 клеток/мкл (ДЧ=85,7%, ДС=85,3%, p<0,05) позволяет прогнозировать развитие ПВР у детей 6-14-ти лет. Th17-лимфоциты – эффекторные клетки, увеличение количества которых может свидетельствовать о наличии в организме очагов деструкции ткани, обусловленных, в том числе, воспалительным процессом, а также о вероятности развития гиперергического ответа при любом хирургическом вмешательстве. Прогностическая значимость количественных характеристик малых популяций Т-лимфоцитов в развитии ПВР у детей с врожденными катарактами впервые определена в представленной работе. Единичные работы о регуляторных Т-клетках при ретинопатии недоношенных и глаукоме у детей свидетельствуют о значимости низких концентраций этих клеток как маркера неблагоприятного течения исследованных процессов [9-11]. В то же время, Зурочка А.В. (2012) характеризует активацию регуляторных Т-клеток – как неблагоприятный признак развития симпатической офтальмии [36]. В данном исследовании достоверных отличий относительного и абсолютного количества Т-регуляторных клеток между пациентами Группы 1 и Группы 2 выявлено не было. Следующий этап работы представлен оценкой функциональной активности лимфоцитов, характеризующейся интенсивностью их энергетического обмена. Ранее показана роль митохондриальной дисфункции в патогенезе глаукомной 153 оптиконейропатии, эндотелиальной дистрофии Фукса, двусторонней прогрессирующей врожденной катаракты, в прогнозировании прозрачного приживления трансплантата [27, 45, 61, 83, 130, 159, 182]. Выявление прямых и косвенных признаков оксидативного стресса в лимфоцитах периферической крови позволяет прогнозировать течение воспалительных заболеваний кишечника [58], аппендикулярного перитонита у детей [66], исход рекератопластики [45]. На основании вышеизложенного, в данной работе оценивалась активность основного маркерного фермента митохондрий – сукцинатдегидрогеназы у детей с врожденными катарактами до проведения операции с целью прогнозирования течения раннего послеоперационного периода. СДГ участвует в формировании электронно-транспортной цепи и цикле Кребса. Сукцинатдегидрогеназа в цикле Кребса катализирует окисление янтарной кислоты в фумаровую, в результате чего происходит восстановление окисленной формы флавинадениндинуклеотида (FAD) до FADH2. В дыхательной электронно-транспортной цепи СДГ является ферментным комплексом, участвующим в переносе водорода от сукцината на убихинон [58]. Вследствие этой реакции происходит окисление восстановленной формы флавинадениндинуклеотида (FADH2) и образуется основной источник энергии в клетке – аденозинтрифосфат (АТФ) [58, 226]. Именно поэтому функционирование СДГ митохондрий характеризует энергетический обмен в клетке. Метод количественного цитохимического определения активности фермента СДГ в общей популяции лимфоцитов периферической крови выявил достоверное снижение ее у детей Группы 2 до операции. На основании проведенного ROC-анализа выявлены наиболее прогностически значимые показатели активности СДГ в общей популяции лимфоцитов. У детей 2-5-ти лет наиболее информативными при исследовании активности СДГ являются площадь гранул ферментативной реакции, интегральная оптическая плотность 154 гранул и процент клеток с кластерами; у детей 6-14-ти лет – интегральная оптическая плотность гранул. Определение площади гранул ферментативной реакции у детей 2-5-ти лет соответствовало отличному качеству модели (AUC=0,955 (0,896-0,999), p<0,05), интегральной оптической плотности гранул и процента клеток с кластерами – очень хорошему качеству модели (AUC=0,8-0,9, p<0,05). Уменьшение площади гранул ферментативной реакции менее 11,7 усл. ед. (ДЧ=90,9%, ДС=87,5%, p<0,05), ИОП гранул менее 859 усл. ед. (ДЧ=81,8%, ДС=87,5%, p<0,05) и процента клеток с кластерами менее 90,8% (ДЧ=90,8%, ДС=81,8%, p<0,05) позволяет прогнозировать развитие ПВР. У детей 6-14-ти лет наиболее значимым показателем является интегральная оптическая плотность гранул (AUC=0,816 (0,685-0,946), p<0,05), что соответствует очень хорошему качеству прогностической модели. Снижение ИОП гранул менее 906 усл. ед. (ДЧ=80,0%, ДС=87,5%, p<0,05) позволяет прогнозировать развитие ПВР. Полученные результаты согласуются с данными Писаревой И.В. [66], выявившей снижение активности СДГ, как неблагоприятный признак в течении аппендикулярного перитонита. В исследовании Комаха Ю.А. [45] депрессия активности СДГ рассматривается как один из факторов, снижающих вероятность прозрачного приживления трансплантата при рекератопластике. представленной работе, также Результаты, свидетельствуют, что полученные низкий в уровень активности СДГ в общей популяции лимфоцитов является неблагоприятным прогностическим признаком развития ПВР у детей разного возраста с врожденными катарактами. Детальный анализ показал, что степень снижения активности СДГ зависит от субпопуляции лимфоцитов. Так, у детей 2-5-ти лет достоверное снижение активности СДГ в Группе 2 выявлено в популяциях Т-лимфоцитов (Тхелперов, активированных Т-лимфоцитов), при этом активность СДГ в Влимфоцитах и NK-клетках не отличалась 155 от показателей детей с благоприятным течением раннего послеоперационного периода. Изучение митохондриальной активности у детей 6-14-ти лет с наличием ПВР (Группа 2) показало, что снижение активности СДГ в общей популяции лимфоцитов происходит за счет снижения активности в популяции Т-лимфоцитов (Тхелперах, цитотоксических Т-лимфоцитах, активированных Т-лимфоцитах, регуляторных Т-клетках, активированных Т-хелперах, Th17-лимфоцитах), NKклеток; при этом активность сукцинатдегидрогеназы в В-лимфоцитах не отличалась от показателей детей с благоприятным течением послеоперационного периода (Группа 1). Согласно данным литературы, митохондриальная дисфункция и оксидативный стресс играют важную роль в развитии офтальмопатологии [27, 45, 61, 83, 130, 159, 182]. Метаболическая функция митохондриального аппарата клетки обеспечивается деятельностью его ферментных систем. Снижение активности сукцинатдегидрогеназы приводит к митохондриальной дисфункции, в результате чего происходит накопление активных форм кислорода в клетке, оказывающих повреждающее действие на ядерную и митохондриальную ДНК, что еще сильнее нарушает функции ферментных систем митохондрий и приводит к выраженным нарушениям в самой клетке [58, 138, 206, 264]. Таким образом, снижение активности СДГ в популяциях лимфоцитов у детей позволяет выявить изменения на субпопуляционном воспалительной реакции. уровне Снижение и прогнозировать активности СДГ в развитие популяциях лимфоцитов на фоне увеличения их абсолютного и относительного количества, может свидетельствовать о функциональной неполноценности данных популяций [58]. Учитывая различную эффективность купирования воспаления в послеоперационном периоде у детей с врожденными катарактами, в данной работе проведены эксперименты in vitro по определению чувствительности поверхностных рецепторов лимфоцитов (CD) к наиболее часто используемому в комплексной профилактике и терапии послеоперационных воспалительных 156 реакций глюкокортикостероидному препарату дексаметазону [56]. Оценен эффект воздействия различных концентраций, времени экспозиции раствора дексаметазона на количественный состав, уровень экспрессии поверхностных маркеров популяций Т-, В-лимфоцитов, NK-клеток и их функциональную активность. Известно, что стероидные рецепторы находятся как на поверхности клетки, так и внутри нее – на мембране митохондрий. Согласно данным литературы, терапевтические дозы кортикостероидов, введенные фенотипирования лимфоцитов моноклональными в реакцию антителами, снижают эффективность взаимодействия кластеров дифференцировки Т-лимфоцитов с диагностическими флюоресцирующими антителами [66]. Кроме того, описано, что глюкокортикостероиды взаимодействуют со стероидными рецепторами митохондрий и ядра лимфоцитов, стимулируя ядерную и митохондриальную транскрипцию генов, кодирующих синтез ферментов дыхательной цепи[217, 218, 232]. Эти взаимодействия приводят к ускорению процессов окислительного фосфорилирования и апоптоза, происходящих в митохондриях. Гормонозависимость и гормонорезистентность рецепторного аппарата клетки особенностями определяются [232]. его Возможно, индивидуальными именно наличием генетическими индивидуальной гормонорезистентности обусловлено отсутствие противовоспалительного эффекта дексаметазона даже при применении максимальных терапевтических доз данного препарата. В результате проведенных экспериментов обнаружено, что эффект воздействия определяется дозой препарата. Выявлено достоверное снижение уровня экспрессии поверхностного маркера CD45 и относительного количества общей популяции лимфоцитов в цельной крови при применении максимальной концентрации дексаметазона. При исследовании влияния дексаметазона на популяции Т-лимфоцитов периферической крови выявлено достоверное снижение уровня экспрессии 157 поверхностных маркеров Т-лимфоцитов (CD3), Т-хелперов (CD4), цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8), регуляторных Т-клеток (CD25, CD127low), активированных Т-хелперов (CD25, CD127high) и увеличение относительного количества Т-лимфоцитов при повышении дозы препарата (p<0,05). Полученные результаты согласуются с данными исследований, которые показали, что терапевтические дозы кортикостероидов (кортизола, дексаметазона), введенные в реакцию фенотипирования лимфоцитов моноклональными антителами, снижают эффективность взаимодействия с кластерами дифференцировки CD3, CD4, CD8, CD25 [67, 128, 196, 213]. Кроме того, существуют данные, что дексаметазон в терапевтической дозе вызывает уменьшение популяции регуляторных Т-клеток (CD127low), но ингибирование данной популяции при одинаковой дозе препарата менее выражено, чем популяций Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток [213]. В проведенных нами экспериментах было получено, что применение терапевтической дозы дексаметазона не вызывает достоверных изменений экспрессии маркера CD127low на поверхности регуляторных Т-клеток и только использование максимальной концентрации дексаметазона приводит к достоверному снижению его уровня экспрессии. В представленной работе впервые исследовано влияние дексаметазона (CD127high): выявлено достоверное на активированные снижение Т-хелперы уровня экспрессии активированных Т-хелперов при воздействии максимальной концентрации препарата. Необходимо отметить, что уровень экспрессии поверхностного маркера CD161 и относительное количество Th17-лимфоцитов под действием дексаметазона достоверно не изменялись (p>0,05) даже при значительном увеличении концентрации. Эти данные свидетельствуют о меньшей чувствительности Th17-лимфоцитов, чем других популяций Т-лимфоцитов, к дексаметазону. Результаты проведенных экспериментов совпадают с данными исследований по стероид-резистентной бронхиальной астме: для пациентов со 158 стероид-резистентной бронхиальной астмой характерно высокое содержание Th17-лимфоцитов в мокроте и периферической крови [190, 197]. На основании полученных результатов можно предположить, что увеличение количества Th17-лимфоцитов в периферической крови у детей с врожденными катарактами будет являться не только фактором риска развития ПВР, но и будет сопровождаться низким эффектом дексаметазона при лечении развившихся осложнений. В представленном исследовании достоверных изменений уровня экспрессии поверхностного В-клеточного маркера CD19 выявлено не было изза большого разброса значений (p>0,05), но обнаружено достоверное снижение относительного количества В-лимфоцитов при воздействии дексаметазона (p<0,05). Полученные результаты согласуются с данными исследования, показавшего снижение количества В-лимфоцитов под влиянием дексаметазона и выявившего опосредованное влияние глюкокортикостероидов на В-лимфоциты за счет ингибирования индукции цитидиндезаминазы – основного регулятора генов, кодирующих синтез иммуноглобулинов [116]. Считается, что эффект дексаметазона на NK-клетки является проапоптотическим и антипролиферативным, что способствует снижению абсолютного количества клеток данной популяции при глюкокортикостероидной терапии [195]. В данном исследовании выявлено достоверное снижение уровня экспрессии поверхностных маркеров CD16 и CD56 (p<0,05) при оценке влияния дексаметазона на популяцию NK-клеток; при этом снижения относительного количества NK-клеток не выявлено (p>0,05). Увеличение относительного количества общей популяции Т-лимфоцитов и Th17-лимфоцитов может быть обусловлено уменьшения относительного количества В-лимфоцитов. В данной работе впервые исследовалось воздействие различных доз дексаметазона на функциональную активность популяций лимфоцитов 159 периферической крови. Выявлено, что степень изменений активности СДГ зависит от дозы и времени воздействия дексаметазона, а также определяется видом популяции. Получено достоверное снижение активности СДГ в Тлимфоцитах при воздействии концентрации, соответствующей терапевтической дозе препарата, в течении 1-го часа (p<0,05). Это снижение происходит за счет уменьшения активности в цитотоксических Т-лимфоцитах и активированных Т-хелперах. При этом достоверных изменений активности СДГ в популяциях Т-хелперов, Th17-лимфоцитов, регуляторных Т-клеток выявлено не было (p>0,05). Активность СДГ в популяциях В-лимфоцитов и NK-клеток также достоверно не изменялась (p>0,05). При увеличении времени экспозиции до 3-х часов выявлено дальнейшее снижение активности в общей популяции Т-лимфоцитов. Это снижение происходит за счет сохранения сниженной активности в популяциях цитотоксических дополнительного регуляторных Т-лимфоцитов, снижения Т-клеток. активированных активности Достоверных в популяциях изменений Т-хелперов Т-хелперов активности СДГ и и в популяциях В-лимфоцитов, NK-клеток, Th17-лимфоцитов при времени экспозиции 3 часа выявлено не было (p>0,05). Учитывая принадлежность Тлимфоцитов, цитотоксических Т-лимфоцитов, Т-хелперов и активированных Т-хелперов к клеткам-эффекторам, снижение в них энергетических процессов является патогенетически обоснованным противовоспалительным эффектом дексаметазона. Таким образом, в проведенных экспериментах получено, что действие дексаметазона направлено преимущественно на популяции Т-лимфоцитов, вызывая снижение экспрессии основных мембранных рецепторов, а также активности СДГ, как показателя аэробного процесса образования АТФ в клетках. К действию дексаметазона менее устойчивы популяции NK-клеток, у которых при воздействии препарата происходит снижение экспрессии основных мембранных рецепторов, но нет снижения активности СДГ. 160 Наиболее устойчивы к действию дексаметазона популяции В-лимфоцитов и Th17-лимфоцитов, у которых при воздействии препарата не происходит изменения уровня экспрессии и активности СДГ. Увеличение количества Th17-лимфоцитов, вероятно, обеспечит менее выраженный эффект противовоспалительной терапии при использовании дексаметазона в качестве базового препарата. Увеличение популяции Th17-лимфоцитов в периферической крови свидетельствует о наличии в организме очагов воспаления с деструкцией ткани и аутоиммунными расстройствами [40, 117, 177, 246]. Поэтому при обнаружении у пациентов повышенного уровня Th17лимфоцитов можно предположить наличие очагов воспаления, требующих санации. На основании полученных данных, возможно рекомендовать использование дексаметазона в качестве профилактического средства за 3-4 дня до операции и в послеоперационном периоде в качестве базовой терапии раннего послеоперационного периода у детей с врожденными катарактами. Анализ клинических результатов течения раннего послеоперационного периода показал, что у большинства детей отмечалась ПВР 0-й и 1-й степени. В представленной работе выявлена тенденция увеличения частоты встречаемости послеоперационной воспалительной реакции у детей 2-5-ти лет в сравнении с детьми 6-14-ти лет, что согласуется с данными других исследователей [34, 52, 112, 127, 145, 166, 199]. Подробный анализ величины исходной остроты зрения, формы катаракты, рефракции, сопутствующей офтальмологической патологии, не вызывающей значительных изменений анатомо-топографических особенностей глаза, и симметричности поражения не выявил влияния данных параметров на увеличение частоты ПВР. У всех детей в послеоперационном периоде отмечалось повышение остроты зрения. Тем не менее, у пациентов с односторонними катарактами острота зрения с коррекцией после операции не превышала 0,3, у детей с двусторонними врожденными катарактами острота зрения с коррекцией в послеоперационном 161 периоде могла составлять до 1,0, что согласуется с ранее известными данными [34]. Во всех случаях тактика хирургического вмешательства определялась клинической формой катаракты и состоянием задней капсулы хрусталика. Так, при наличии помутнения задней капсулы хрусталика всем детям одномоментно с аспирацией врожденной катаракты выполнялась 25G задняя капсулотомия с передней витрэктомией с целью исключения необходимости повторных хирургических вмешательств. Изучение влияния расширения объема хирургического вмешательства (25G задней капсулотомии и передней витрэктомии) не выявило достоверного увеличения ПВР (p>0,05). Полученные данные не согласуются с существующем ранее мнением об увеличении частоты послеоперационных осложнений при выполнении первичного заднего капсулорексиса [167] и согласуются с точкой зрения исследователей, рекомендующих проведение первичного заднего капсулорексиса или задней капсулотомии в сочетании с передней витрэктомией одномоментно с проведением аспирации катаракты в качестве безопасного метода профилактики развития вторичной катаракты всем детям до 6-ти лет [102, 141, 143, 147, 157, 168, 180, 205]. Все вышесказанное позволяет рекомендовать одномоментное проведение аспирации врожденной катаракты с имплантацией ИОЛ в сочетании с 25G задней капсулотомией и передней витрэктомией при обнаружении помутнения задней капсулы. Известные способы прогнозирования ПВР у детей с врожденными катарактами, включающие анализ отдельных клинико-анамнестических и лабораторных параметров, которые, однако, не обладают достаточно высокой диагностической чувствительностью [3-4, 30, 41, 46, 50, 77, 90, 92, 183]. Финальным этапом работы явилось создание алгоритмов пошагового действия в выявлении риска развития послеоперационной воспалительной реакции на основании комплекса отдельных анамнестических и клинико-лабораторных показателей и построения математических моделей у детей 2-5-ти и 6-14-ти лет. 162 Анализ комплекса анамнестических сведений, цитохимических и иммунологических показателей, представляющих высокую информативность в прогнозировании ПВР, методом множественной пошаговой регрессии позволил построить математические модели для расчета прогностических коэффициентов у детей 2-5-ти лет (модели К1 - К3) и для детей 6-14-ти лет (модели К4 - К6). На основании полученных моделей были предложены алгоритмы пошагового действия в выявлении риска развития ПВР у детей разного возраста. Анализ полученных результатов выявил, что как у детей 2-5-ти лет, так и у детей 6-14-ти лет информативность анамнестических сведений является недостаточной для прогнозирования ПВР. Для улучшения прогностических коэффициентов, кроме анамнестических данных необходимо учитывать уровень активности СДГ в общей популяции лимфоцитов. На данном этапе активность СДГ в лимфоцитах можно определить скрининговым методом световой микроскопии с цитоморфоденситометрией. В случае неблагоприятного прогноза необходимо учитывать показатели реактивности иммунной системы, такие как относительное количество цитотоксических Тлимфоцитов, абсолютное количество Th17-лимфоцитов, активность СДГ в популяциях Т-лимфоцитов и активированных Т-лимфоцитов. Наибольшая прогностическая ценность отмечена у моделей К3 (коэффициент корреляции R3=0,93) для детей 2-5-ти лет и К6 (коэффициент корреляции R6=0,95) для детей 6-14-ти лет, включающих комплексную оценку анамнестических данных, показателей клеточного иммунитета и активности СДГ в популяциях лимфоцитов периферической крови. Алгоритм пошагового действия в выявлении риска развития послеоперационной воспалительной реакции у детей 2-5-ти лет включает два этапа. На первом этапе определяется сумма баллов инфекционного синдрома, включающего наличие в анамнезе длительного субфебрилитета или лихорадки, хронических инфекций ЛОР-органов, бронхитов и пневмоний, 163 частых ОРВИ, наличие ОРВИ за 1 месяц и менее до операции, наличие в анамнезе кори, краснухи, ветряной оспы, эпидемического паротита, коклюша, патологических реакций на прививки, а также грибковых инфекций кожи, слизистых оболочек, ногтей; паразитарных инфекций, инфекций ротовой полости (кариеса, стоматита), герпеса различной локализации, лимфаденитов, урогенитальных инфекций (цистита, вульвита, пиелонефрита), дисбиоза кишечника, оппортунистических инфекций, сепсиса; и активность СДГ (площадь гранул) в общей популяции лимфоцитов периферической крови. Если сумма баллов инфекционного синдрома < 4-х и активность СДГ (площадь гранул) в общей популяции лимфоцитов – более 11,7 усл. ед., то у детей можно прогнозировать низкий риск развития ПВР. Если сумма баллов инфекционного синдрома < 4-х, а активность СДГ в общей популяции лимфоцитов (площадь гранул) менее 11,7 усл. ед., необходимо выполнение второго этапа (шаг 2). Если сумма баллов инфекционного синдрома ≥ 4-х, то также необходимо выполнение второго этапа (шаг 2). На втором этапе рассчитывается коэффициент прогноза К3, включающий суммарную оценку анамнестических сведений (наличие патологических реакций на прививки, сумму баллов инфекционного синдрома), данных цитоморфоденситометрии (площадь гранул ферментативной активности СДГ в общей популяции лимфоцитов), а также результатов иммунологического обследования (относительное количество цитотоксических Т-лимфоцитов и активность СДГ в популяции активированных Т-лимфоцитов). Коэффициент К3 < 0,33 позволяет прогнозировать ареактивное течение раннего послеоперационного периода у детей с врожденными катарактами (ДЧ=90,0%, ДС=87,5%, p<0,05). При величине К3 ≥0,33 можно прогнозировать развитие ПВР у детей 2-5-ти лет. Алгоритм пошагового действия в выявлении риска развития послеоперационной воспалительной реакции у детей 6-14-ти лет также включает два этапа. На первом этапе у пациентов на основании 164 анамнестических сведений определяется коэффициент прогноза К4, учитывающий сумму баллов аллергического синдрома, частые ОРВИ, наличие в анамнезе бактериальных инфекций кожи и подкожно-жировой клетчатки, лимфаденитов, оппортунистических инфекций, а также наличия токсикоза Iой половины беременности. Если полученный коэффициент К4 < 0,35, а активность СДГ (ИОП) в общей популяции лимфоцитов > 905 усл. ед., можно прогнозировать низкий риск развития ПВР. Если К4 < 0,35, а активность СДГ (ИОП) в общей популяции лимфоцитов < 905 усл. ед., то необходимо выполнение второго этапа алгоритма – расчет коэффициента К6. Если К4 ≥ 0,35, то также необходимо выполнение 2-го этапа исследования – определение абсолютного количества Th17-лимфоцитов и активности СДГ в общей популяции лимфоцитов и в популяции Т-лимфоцитов с целью расчета прогностического коэффициента К6. Значение коэффициента К6 < 0,63 позволяет прогнозировать ареактивное течение раннего послеоперационного периода (ДЧ=96,7%, ДС=90,3%, p<0,05). Величина коэффициента К6 ≥ 0,63 позволяет прогнозировать развитие ПВР и определяет необходимость предоперационной подготовки у детей 6-14-ти лет. Таким образом, в представленной работе выполнены все поставленные задачи исследования. Проведенный анализ выявил наиболее информативные анамнестические данные в прогнозе развития ПВР у детей с врожденными катарактами, позволил оценить необходимость изучения субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови и показал важность оценки функциональной активности лимфоцитов по интенсивности энергетических процессов (активность СДГ). Наиболее значимыми анамнестическими показателями в прогнозе ПВР являются сумма баллов инфекционного синдрома, сумма баллов аллергического синдрома, а также наличие токсикоза I-ой половины беременности. Выявлено увеличение вероятности развития послеоперационной воспалительной реакции у детей при снижении активности СДГ в общей популяции лимфоцитов. Показано, что для прогноза 165 ПВР необходимо исследование популяций Т-хелперов, цитотоксических Тлимфоцитов и Th17-лимфоцитов. В ходе проведенных в работе экспериментов in vitro по изучению эффекта воздействия глюкокортикостероидного препарата дексаметазон на Т-, В-лимфоциты, NK-клетки и интенсивность энергетических процессов в них выявлено дозозависимое снижение уровня экспрессии поверхностных маркеров эффекторных клеток (общей популяции лимфоцитов, Т-лимфоцитов, Т-хелперов, цитотоксических Т-лимфоцитов, активированных популяциях Т-хелперов, Т-лимфоцитов, регуляторных Т-хелперов и Т-клеток, NK-клеток). активированных В Т-хелперов выявлено снижение активности СДГ в зависимости от времени воздействия препарата. Обнаружена устойчивость поверхностных рецепторов Th17- и Влимфоцитов к действию дексаметазона, при этом активность СДГ в этих популяциях лимфоцитов остается на исходном уровне. Полученные данные позволяют рекомендовать применение дексаметазона в качестве базовой противовоспалительной терапии у детей при популяций, чувствительных к действию увеличении количества препарата, и, возможно, свидетельствуют о низком противовоспалительном эффекте дексаметазона при исходном повышении Th17- и В-лимфоцитов в периферической крови у детей. Кроме того, изучение клинических особенностей течения интраоперационного, раннего послеоперационного периода и формирования воспалительных реакций у детей разного возраста после выполнения аспирации катаракты целесообразности с имплантацией одномоментного ИОЛ выполнения свидетельствуют аспирации о врожденной катаракты с имплантацией ИОЛ в сочетании с 25G задней капсулотомией и передней витрэктомией у детей с наличием помутнения задней капсулы. На основании наиболее информативных анамнестических и клинико- лабораторных данных разработаны алгоритмы прогноза формирования ПВР у детей разного возраста. Использование полученных алгоритмов является 166 актуальным и позволяет рекомендовать их для широкого применения у детей с врожденными катарактами перед проведением хирургического лечения. 167 ВЫВОДЫ 1. Информативность анамнестических факторов в прогнозе развития послеоперационной воспалительной реакции у детей с врожденными катарактами зависит от возраста пациента: для детей 2-5-ти лет наиболее значимым фактором риска является сумма баллов инфекционного синдрома ≥ 4-х (ДЧ=69,2%, ДС=80,0%, p<0,05); для детей 6-14-ти лет факторами риска являются - наличие токсикоза I-ой половины беременности, сумма баллов аллергического синдрома ≥1-му (ДЧ=76,9%, ДС=60,0%, p<0,05), сумма баллов инфекционного синдрома ≥3-м (ДЧ=76,9%, ДС=46,7%, p<0,05). 2. Иммунологическими факторами риска развития воспалительной реакции раннего послеоперационного периода для детей 2-5-ти лет являются: относительное содержание цитотоксических Т-лимфоцитов менее 26,4% (ДЧ=83,3%, ДС=80,0%, p<0,05), увеличение иммунорегуляторного индекса более 1,24 (ДЧ=91,7%, ДС=50,0%, p<0,05); для детей 6-14-ти лет увеличение содержания Th17-лимфоцитов более 190 кл/мкл (ДЧ=85,7%, ДС=85,3%, p<0,05). 3. Снижение активности сукцинатдегидрогеназы в общей популяции лимфоцитов: у детей в возрасте 2-5-ти лет – уменьшение площади гранул менее 11,7 усл. ед. (ДЧ=90,9%, ДС=87,5%, p<0,05), а у детей в возрасте 6-14ти лет – снижение интегральной оптической плотности менее 906 усл. ед. (ДЧ=80,0%, ДС=77,5%, p<0,05) является фактором риска развития послеоперационной воспалительной реакции у детей с врожденными катарактами. 4. Эффект воздействия дексаметазона на уровень экспрессии поверхностных рецепторов лимфоцитов и интенсивность энергетических процессов в них в экспериментах in vitro определяется дозой и временем экспозиции препарата. Выявлено снижение уровня экспрессии поверхностных маркеров общей популяции лимфоцитов (CD45), Т-лимфоцитов (CD3), Т-хелперов (CD4), цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8), 168 NK-клеток (CD16 и CD56), активированных Т-хелперов и регуляторных Т-клеток (CD25, CD127), прогрессирующее с увеличением концентрации препарата (p<0,05); при этом уровень экспрессии маркеров В-лимфоцитов (CD19) и Th17-лимфоцитов (CD161) не изменялся. При воздействии на клетки концентрации дексаметазона, соответствующей терапевтической дозе, выявлено снижение активности сукцинатдегидрогеназы в общей популяции лимфоцитов, в популяциях Т-лимфоцитов, Т-хелперов, цитотоксических Т-лимфоцитов, регуляторных Т-клеток и активированных Т-хелперов (p<0,05), при этом активность СДГ в популяции Th17-лимфоцитов, в В-лимфоцитах и NKклетках не изменялась. 5. Частота развития послеоперационной воспалительной реакции не зависит от исходного состояния глаз: остроты зрения, формы катаракты, наличия аметропии слабой степени, сопутствующей офтальмологической патологии, не оказывающей значительное влияние на анатомо-топографические особенности структур глаза. Тактика лечения с расширением хирургического вмешательства в отношении задней капсулы (25G задней капсулотомии в сочетании с передней витрэктомией) не увеличивает вероятность развития послеоперационной воспалительной реакции. 6. Для детей в возрасте 2-5-ти лет с врожденными катарактами разработан алгоритм, включающий оценку суммы баллов инфекционного синдрома, реакций на прививки, относительное количество цитотоксических Тлимфоцитов, активность СДГ в общей популяции лимфоцитов и в популяции активированных прогнозировать Т-лимфоцитов, развитие позволяющий послеоперационной с вероятностью воспалительной 90% реакции (ДЧ=90,0%, ДС=87,5%, p<0,05). 7. Для детей в возрасте 6-14-ти лет с врожденными катарактами разработан алгоритм, включающий оценку наличия в анамнезе частых ОРВИ, бактериальных лимфаденитов, инфекций кожи и оппортунистических 169 подкожно-жировой инфекций, суммы клетчатки, баллов аллергического синдрома, токсикоза I-ой половины беременности, реакций на прививки, а также количество Th17-лимфоцитов, активность СДГ в общей популяции лимфоцитов и в популяции Т-лимфоцитов, позволяющий с вероятностью 97% прогнозировать развитие воспалительной реакции (ДЧ=96,7%, ДС=90,3%, p<0,05). 170 послеоперационной Практические рекомендации 1. Перед проведением хирургического лечения врожденной катаракты у детей необходимо комплексное анамнестическое исследование с определением суммы баллов инфекционного и аллергического синдромов: сумма баллов инфекционного синдрома ≥ 4-х у детей 2-5-ти лет; сумма баллов инфекционного синдрома ≥ 3-м и сумма баллов аллергического синдрома ≥1го у детей 6-14-ти лет свидетельствует о риске развития ПВР. 2. Пациентам, после исследования анамнестических сведений и выявления групп риска по развитию послеоперационной воспалительной реакции, необходимо иммунологическое обследование с определением количественных показателей Т-хелперов, цитотоксических Т-лимфоцитов и Th17-лимфоцитов, а также уровня активности СДГ в общей популяции лимфоцитов, популяциях Т-лимфоцитов и активированных Т-лимфоцитов. 3. Пациентам 2-14-ти лет с врожденными катарактами, при наличии исходного помутнения задней капсулы, рекомендуется выполнять одномоментное выполнение аспирации врожденной катаракты с имплантацией ИОЛ в сочетании с 25G задней капсулотомией с передней витрэктомией. 4. При выявлении воспалительной высокого реакции, на риска основании развития послеоперационной разработанных пошаговых алгоритмов, у детей с врожденными катарактами необходима дополнительная предоперационная подготовка. 171 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1.Агатова М.Д. Особенности клиники и микрохирургического лечения двусторонней врожденной катаракты у детей с микрофтальмом и микрокорнеа: Дис …канд.мед.наук. - М., 1988. – 204 c. 2.Азнабаев М.Т., послеоперационной Гизатуллина М.А., Оренбуркина экссудативно-воспалительной О.И. реакции в Лечение хирургии осложненных катаракт//Клин. офтальмол. – 2006. – Т.7, №3. – С.113-115. 3.Азнабаев Р.А., Бикбов М.М., Абсалямов М.Ш. и др. Вторичная имплантация заднекамерных интраокулярных линз у детей. – Уфа, 2009. – 120 с. 4. Архипова Л.Т., Леванова О.Г., Архипова М.М. Показатели уровня метаболитов оксида азота в слезной жидкости и их прогностическая роль в развитии ранних воспалительных реакций после повторных внутриглазных хирургических вмешательств//Вестник офтальмологии. – 2012. - №2. – С. 3740. 5.Архипова Л.Т., Леванова О.Г., Чупров А.Д., Зайцева Г.А. Клиникоиммунологические факторы прогнозирования ранней экссудативной реакции после экстракции сенильной катаракты с имплантацией эластичных интраокулярных линз//Вестник офтальмологии. – 1999.- №2. – С. 25-27. 6.Астахов С.Ю., Вохмяков А.В. Эндофтальмит: профилактика, диагностика, лечение//Офтальмологические ведомости. - 2008. – Т.1, №1. – С. 35-45. 7.Астахов Ю.С., Даль Г.А., Егоров Е.А., Ставицкая Т.В. Опыт применения Декса-гентамицина для профилактики воспалительных процессов после экстракции катаракты//Клиническая офтальмология. – 2001. – Т.2, №3. – С. 116-117. 8. Баиров Г.А. Неотложная хирургия детей: руководство для врачей –Л., Медицина, 1983. – 408 с. 9.Балашова Л.М., Быковская С.Н., Кузнецова Ю.Д. и др. Исследование показателей клеточного иммунитета у взрослых и больных ретинопатией недоношенных на фоне анестезиологического пособия//Пролиферативный 172 синдром в офтальмологии/Сборник научных трудов VII международной научно-практической конференции. – М.: Легпроминформ. – 2012. – С. 155158. 10.Балашова Л.М., Быковская С.Н., Кузнецова Ю.Д. и др. Количественные и функциональные нарушения показателей клеточного иммунитета у больных ретинопатией недоношенных//Российский общенациональный офтальмологический форум, 5-й: Сб. науч. тр./Под ред. В.В. Нероева. – М.: «Апрель», 2012. – Т.2. – С. 558-562. 11.Балашова Л.М., Быковская С.Н., Кузнецова Ю.Д. и др. Количественные и функциональные нарушения показателей клеточного иммунитета у взрослых, соматически здоровых детей и больных ретинопатией недоношенных// Пролиферативный синдром в офтальмологии/Сборник научных трудов VII международной научно-практической конференции. – М.: Легпроминформ. – 2012. – С. 149-151. 12.Балашова Л.М., Быковская С.Н., Кузнецова Ю.Д. и др. Нарушения показателей клеточного иммунитета у взрослых, соматически здоровых детей и детей, больных офтальмологии/Сборник глаукомой//Пролиферативный научных трудов VII синдром международной в научно- практической конференции. – М.: Легпроминформ. – 2012. – С. 152-154. 13.Баранова Н.И., Ащина Л.А., Орлова Е.А. Цитокиновый профиль и показатели Т-клеток у больных аутоиммунной формой хронической крапивницы//Иммунопатология, аллергология, инфектология. – 2012. - №4. – С.61-65. 14.Белькова А.Г. Факторы риска развития экссудативной реакции и фиброза задней капсулы после экстракции катаракты с имплантацией искусственного хрусталика//Вестник офтальмологии. – 2001. - №6. – С.7-9. 15.Бикбов М.М., Шевчук Н.Е., Мальханов В.Б. Цитокины в клинической офтальмологии. – Уфа:ГУ Уфимский научно-исследовательский институт глазных болезней АН РБ, 2008. – 152 с. 173 Н.Ф. 16.Боброва Оптимизация классификации врожденных катаракт//Офтальмологический журнал. – 2010. - №5. – С. 74-82. 17.Брискин Б.С., Хачатрян Н.Н., Савченко З.И. и др. Прогнозирование течения хирургических инфекций у больных пожилого и старческого возраста//Хирургия. – 2007. – №6. – С. 40-46. 18. Быков В.Л. Цитология и общая гистология (функциональная морфология клеток и тканей человека). – СПб.: СОТИС, 1999. – 520 с. 19.Быковская Т.Н. Значение иммунологических факторов в патогенезе двусторонних и односторонних увеитов: Автореф. дис. ...канд.мед.наук. - М., 2000. – 27 c. 20.Васильев А.В., Егоров В.В., Смолякова Г.П. Характеристика экссудативнопролиферативных осложнений после аспирации врожденной катаракты с имплантацией ИОЛ у детей различного периода раннего детства//Офтальмохирургия. – 2010. - №6. - С. 18-20. 21.Васильев А.В., Егоров В.В., Смолякова Г.П. и др. Анализ частоты и структуры осложнений в отдаленном периоде после аспирации врожденной катаракты с имплантацией ИОЛ у детей различного возраста периода раннего детства//Российская педиатрическая офтальмология. – 2011. - №1. – С.34-41. 22.Варданян И.Р. Клинико-иммунологическая характеристика и лечение больных с ожогами глаз и послеожоговыми бельмами роговицы: Автореф. дис. ... канд.мед.наук. - М., 2000. – 23 c. 23.Виноградова Т.В., Сухоруков В.С., Клейменова Н.В. и др. Влияние биоэнергетических нарушений на функцию иммунокомпетентных клеток при различных заболеваниях в детском возрасте//Российский вестник перинатологии и педиатрии. – 2012. – Т.4, №2. – С.119-125. 24.Влодавец Д.В. Клиническое значение митохондриальных изменений, обоснование применения энерготропной терапии и оценка ее эффективности при врожденных миопатиях у детей: Автореф.дис. …канд.мед.наук. - М., 2009. – 26 с. 174 25.Глазные болезни: Учебник/Под ред. В.Г. Копаевой. – М.: Медицина, 2002. – 560 с. 26.Денисова Е.В., Слепова О.С., Катаргина Л.А. и др. Возможности прогнозирования пролиферативных осложнений у детей с эндогенными увеитами//Аллергология и клиническая иммунология: междисплицинарные проблемы. Труды национальной конференции. - М., 2008. - С. 84-85. 27.Джавришвили Г.В. Современные аспекты хирургического лечения ожоговых бельм: Автореф.дис. …докт.мед.наук. - М., 2004. – 50 с. 28.Джанашия К.П., Куликова О.Д., Измайлова Т.Д. и др. Атопический дерматит и полисистемная митохондриальная недостаточность//Детская больница. – 2011. - №4. – С. 20-25. 29.Егиян Н.С. Комбинированная лазерно-инструментальная экстракция врожденных катаракт у детей: Дис. …канд.мед.наук. - М., 2004. – 217 с. 30.Егоров В.В., Васильев А.В., Смолякова Г.П. Клинико-иммунологический анализ развития вторичной катаракты у детей раннего возраста после аспирации врожденной катаракты с имплантацией ИОЛ//Российская педиатрическая офтальмология. – 2009. - №4. – С.29-33. 31.Жукова О.Б. Молекулярные механизмы нарушения апоптоза лимфоцитов при хронической вирусной инфекции//Бюллетень сибирской медицины. – 2006. – №3. – С.19-26. 32.Зайдуллин И.С., Азнабаев Р.А., Абсалямов М.Ш. «Способ профилактики осложнений при удалении катаракты у детей». Патент РФ на изобретение № 2331397 от 20.08.2008. 33.Зайцева О.В. Клинико-иммунологические критерии диагностики и прогнозирования течения оптического неврита при рассеянном склерозе: Автореф. дис. ... канд.мед.наук. - М., 2001. – 24 с. 34.Зрительные функции и их коррекция у детей//Под ред. Э.С. Аветисова, Т.П. Кащенко, А.М. Шамшиновой. – М.: ОАО «Изд-во «Медицина», 2005. – 872 с. 175 35.Зубарева Л.Н. Интраокулярная коррекция в хирургии катаракт у детей: дис. …д-ра мед. наук (в форме научного доклада). - М., 1993. – 50 с. 36.Зурочка А.В., Марачева Н.М., Панова И.Е. и др. Изучение уровня регуляторных Т-клеток и субпопуляций В-лимфоцитов у пациентов с различными вариантами клинического течения хронического посттравматического увеита при проникающем ранении глазного яблока и с симпатической офтальмией//Российский иммунологический журнал. – 2012. – Т.6, №4. – С. 388-394. 37.Избранные лекции по детской офтальмологии//Под ред. В.В. Нероева. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. – 184 с. 38.Иошин И.Э. Внекапсульная фиксация ИОЛ при патологии хрусталика в осложненных случаях: Автореф. дис. …докт.мед.наук. – М., 1998. – 44 с. 39.Камышный А.М., Гриневич И.В., Деген А.С. и др. ТН17-клетки и их роль в развитии аутоиммунных заболеваний//Запорожский медицинский журнал. – 2011. – Т.13. - №6. – С.81-87. 40.Кетлинский С.А. Тh17 – новая линия дифференцировки Т-хелперов: обзор данных//Цитокины и воспаление. – 2009. – №2. – С. 3–15. 41.Кинзябулатова О. Ю. Оптимизация результатов интраокулярной коррекции афакии после удаления врожденной катаракты у детей дошкольного возраста: Автореф. дис. …канд.мед.наук. - Уфа, 2004. -26 с. 42.Ковалевский Е.И. Болезни глаз при общих заболеваниях у детей. – М.: Медицина, 2003. – 288 с. 43.Ковалькова Д.А., Ченцова О.Б. Экссудативные иридоциклиты и эндофтальмиты, развивающиеся после экстракции катаракты и имплантации ИОЛ//Вестник офтальмологии. – 2008. - №4. – С.58-61. 44.Кононов Л.Б. Особенности хирургической тактики и результаты имплантации ИОЛ у детей первого года жизни с врожденными катарактами: Дис. …канд.мед.наук. - М., 2010. – 101 с. 176 45.Комах Ю.А. Клинико-цитохимические аспекты прогнозирования и профилактики помутнения трансплантата после рекератопластики: Дис. …канд.мед.наук. - М., 1995. – 107 с. 46.Кочергин С.А., Чернакова Г.М., Клещева Е.А. и др. Некоторые аспекты офтальмоиммунологии//Цитокины и воспаление. – 2012.- Т.11, №1. – С. 26-32. 47.Кравченко Н.П., Олейник Е.К. Система регуляторных Т-клеток и аутоиммунные процессы//Труды Карельского научного центра Российской академии наук. – 2013. - №3. – С.18-30. 48.Круглова Т.Б. Клинико-функциональные и иммунологические аспекты хирургического лечения врожденных катаракт и их осложнений: дис. …д-ра мед. наук (в форме научного доклада). - М., 1996. – 55 с. 49.Круглова Т.Б., Кононов Л.Б. Пролиферативные реакции после экстракции врожденных катаракт с имплантацией ИОЛ у детей первого года жизни//Российская педиатрическая офтальмология. – 2009. - №3. – С.8-9. Т.Б., Слепова иммунологические подходы 50.Круглова О.С., к Хватова пред- и А.В. и др. Клинико- послеоперационной терапии врожденных катаракт//Методические рекомендации. - М., 1995. – 12 с. 51.Кузнецова И.С. Прогнозирование и ранняя диагностика прогрессирования пролиферативной витреоретинопатии после успешного хирургического лечения регматогенной отслойки сетчатки: Автореф. дис. …канд.мед.наук. М., 2012. – 26 c. 52.Леванова О.Г. Послеоперационные осложнения при повторной глазной хирургии: клиника, патогенез, лечение, профилактика: Автореф.дис. …докт.мед.наук. - М., 2010. – 44 с. 53.Либман Е.С., Рязанов Д.П., Калеева Э.В. Инвалидность вследствие нарушения зрения в России//Общенациональный офтальмологический форум, 5-й: Сб.науч.тр. / Под ред. В.В. Нероева. – М.: Апрель, 2012. – Т.2. – С. 797798. 177 54.Максимов В.Ю., Федорищева Л.Е. Факторы риска в развитии послеоперационного увеита у больных с артифакией//Клин.офтальмол. – 2004. – Т.5, №3. – С.125-127. 55.Мальцев Э.В., Вит В.В. Врожденная и наследственная патология в практике офтальмолога//Офтальмол. журн. – 1993. - №4. – С.193-195. 56.Малюгин Б.Э., Шпак А.А., Морозова Т.А. Фармакологическое сопровождение современной хирургии катаракты//М., 2011. – 28 с. 57.Мешкова Р.Я., Ковальчук Л.В., Коновалова М.И. Клиника, диагностика, лечение некоторых форм иммунодефицитов и аллергических заболеваний с основами организации службы клинической иммунологии//Смоленск: «Полиграмма», 1995. – 176 с. 58.Мирошкина Л.В. Иммунологические предикторы эффективности терапии блокаторами фактора некроза опухоли альфа у детей с воспалительными заболеваниями кишечника: Дис …канд.мед.наук. – М., 2014. – 185 с. 59.Нарциссов Р.П. Цитохимия ферментов лейкоцитов в педиатрии: Дис …д-ра мед.наук. – М., 1970. – 378 с. 60.Нероев В.В., Теплинская Л.Е., Судовская Т.В. Клинико-иммунологические исследования в прогнозировании послеоперационного периода у детей при экстракции врожденной катаракты//Российская педиатрическая офтальмология. – 2009. - №1. – С.13-15. 61.Никитин Д.Н. Митохондриальная дисфункция как патогенетическое звено глаукомного процесса (экспериментальное исследование): Автореф. дис. ...канд.мед.наук. - СПб., 2013 – 22 с. 62.Офтальмология: учебник//Под ред. Е.И. Сидоренко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2013. – 640 с. 63.Петричук С.В., Измайлова Т.Д., Радыгина Т.В. Способ измерения митохондриальной активности лимфоцитов. Патент РФ №2302635 от 28.12.2007 178 64.Петричук С.В., Шищенко В.М., Духова З.Н. Цитоморфометрический метод в оценке функциональной активности митохондрий лимфоцитов в норме и при патологии//Материалы Всероссийского рабочего совещания «Митохондрии в патологии». - 2001. – С.19-20. 65.Петричук С.В., Шищенко В.М., Духова З.Н. и др. Диагностические и прогностические возможности клинической цитохимии.–М.–2005.–74с. 66.Писарева И.В. Изменения активности внутриклеточных ферментов лимфоцитов при аппендикулярном перитоните у детей: Дис …канд.мед.наук. – М., 2007. – 115 с. 67.Полетаева А.В. Иммуномодулирующее влияние гормонов на фенотипическую структуру лимфоцитов в условиях «IN VITRO»: Автореф. дис … канд.биол. наук. – Архангельск, 2010. – 16 с. 68.Разик Саид. Профилактика прогрессирования пролиферативной витреоретинопатии после операций по поводу регматогенной отслойки сетчатки: Дис. …канд.мед.наук. – М., 2005. -132. 69.Садрисламова Л. Ф. Роль клинико-функциональных и иммунологических факторов в течении контузионной травмы глаза: Автореф. дис. ...канд.мед.наук. - М., 1998 – 25 с. 70.Селькова М.С. Цитофлуориметрический анализ содержания цитотоксических клеток у пациентов с хроническим гепатитом С//Журнал инфектологии. – 2013. – Т.5. - №1. – С. 69-74. 71.Семенова Г.Ф., Бомбардирова Е.П., Измайлова Т.Д. и др. Обоснование и эффективность энерготропной терапии у новорожденных детей с церебральной ишемией [Электронный ресурс] / Medline / Педиатрия. Электронный журнал. – 2013.- Т.- 14. – С.633-646. 72.Сергиенко Н.М., Веселовская З.Ф. Особенности клиники и послеоперационного ведения больных после экстракции катаракты с имплантацией искусственного хрусталика//Офтальмол. журнал. -1985.-№7.-С. 415-417. 179 73.Сидоренко Е.И. Избранные лекции по офтальмологии. – М.: ГЭОТАРМедиа, 2013. – 191 с. 74.Сидоренко Е.И., Кудрявцева Е.А., Лобанова И.В. Отдаленные результаты хирургического лечения врожденных односторонних катаракт//Российская педиатрическая офтальмология. – 2007. - №3. – С.27-31. 75.Слепова О. С., Захарова Г.Ю., Разик Саид. Нарушения иммунорегуляции при регматогенных отслойках сетчатки различной тяжести//Современные возможности в диагностике и лечении витреоретинальной патологии. Сборник трудов научно-практической конференции. - М., 2004. - С. 311-314. 76.Стефани Д.В., Вельтищев Ю.Е. Клиническая иммунология и иммунопатология: Руководство для врачей. – М.: Медицина, 1996. – 384 с. 77.Судовская Т.В. Разработка системы медицинской реабилитации детей с односторонними врожденными катарактами: Дис. …докт.мед.наук. – М., 2011. – 315 c. 78.Сухоруков В.С. К разработке рациональных основ энерготропной терапии//Рациональная фармакотерапия. – 2007. – №2. – С.40-47. 79.Сухоруков В.С. Нарушение клеточного энергообмена у детей//Российский вестник перинатологии и педиатрии. – 2002. – Т.47, №5. – С.44-50. 80.Сухоруков В.С., Нарциссов Р.П., Петричук С.В. Сравнительная диагностическая ценность анализа скелетной мышцы и лимфоцитов при митохондриальных болезнях//Арх.патол. – 2000. – Т.62, №2. – С.19-21. 81.Тахчиди Х.П., Бессарабов А.Н., Пантелеев E.H. Параметризованный схематичный стандартный глаз для решения вычислительных задач офтальмологии (II часть)//Офтальмохирургия. –2007. – № 1. – С. 59-69. 82.Толчинская А.И. Прогноз, профилактика и лечение осложнений артифакии в хирургии осложненных катаракт: Дис. ...докт.мед.наук. - М., 2002. – 349 с. 83.Тонаева Х.Д. Лимбальная сотрансплантация в профилактике отторжения донорских роговиц при кератопластике высокого риска: Дис. …канд.мед.наук. - М., 2014 – 138 с. 180 84.Тыртышная Г.В., Парохонский А.П. Взаимосвязь нарушений иммунной и эндокринной систем при аутоиммунной патологии//Современные наукоемкие технологии. – 2007. - №2. - С. 80-81. 85.Федоров С.Н., Малюгин Б.Э., Багров С.Н. и др. «Фармацевтическая композиция для медикаментозного расширения зрачка в офтальмологии». Патент РФ на изобретение № 2148404 от 05.10.2000. 86.Хайдуков С.В. Многоцветный анализ в проточной цитометрии для медикобиологических исследований: дис. …д-ра мед. наук (в форме научного доклада). – С-Пб., 2008. – 52 с. 87.Хайдуков С.В., Зурочка А.В. Цитометрический анализ субпопуляций Тхелперов (Th1, Th2, Treg, Th17, Т-хелперы активированные)//Медицинская иммунология. – 2011. – Т.13, №1. – С. 7-16. 88.Хайдуков С.В., Зурочка А.В., Тотолян Арег А. и др. Основные и малые популяции лимфоцитов периферической крови человека и их нормативные значения (методом многоцветного цитометрического анализа)//Медицинская иммунология. – 2009. - №2-3, стр. 227-238. 89.Хватова А.В. Заболевания хрусталика у детей. – Л.: Медицина, 1982. – 200 с. 90.Хватова А.В., Зайцева Н.С., Круглова Т.Б. Воспалительные осложнения после экстракции врожденных катаракт у детей (клинико-лабораторное обследование, профилактика и лечение)//Методические рекомендации. – М., 1984. – 20 с. 91.Хватова А.В., Круглова Т.Б., Кононов Л.Б. и др. Наш опыт первичной имплантации гибких ИОЛ у детей младшего возраста с врожденными катарактами//Детская офтальмология. Итоги и перспективы: Сборник науч.статей. – М., 2006. – С.68-70. 92.Хватова А.В., Круглова Т.Б., Слепова О.С. Особенности патогенеза врожденных катаракт и течения послеоперационного периода у детей с 181 различными состояниями тканеспецифического аутоиммунитета// Информационное письмо – М., 1995. – 11 с. 93.Хватова А.В., Круглова Т.Б., Слепова О.С. и др. Способ прогнозирования и дифференцированный подход к лечению вторичной катаракты (фиброз задней капсулы хрусталика) у детей//Методические рекомендации. – М., 1997. – 5 с. 94.Хлебникова О.В. Клинические особенности наследственных катаракт у детей: Дис. …канд.мед.наук. - М., 1985. – 154 с. 95.Хлебникова О.В. Наследственные формы катаракт у детей//Тезисы докладов III Всесоюзной конференции по актуальным вопросам детской офтальмологии. – 23-24 января 1989 года, Суздаль. – М., 1989. – С.93-94. 96.Царегородцев А.Д., Сухоруков В.С. Митохондриальная медицина – проблемы и задачи//Российский вестник перинатологии и педиатрии. – 2012. – Т.4 , № 2. – С.4-13. 97.Цимбалова Е.Г., Потапов А.С., Шищенко В.М. и др. Ферментный статус лимфоцитов при воспалительных заболеваниях кишечника у детей// Материалы III Российского Конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии». - М., 2004. - С.617. 98.Черешнев В.А., Гусев Е.Ю. Иммунологические и патофизиологические механизмы системного воспаления//Медицинская иммунология. – 2012. – Т.14, №1-2. – С. 9-20. 99.Чугунова О.Л., Шумихина М.В., Думова С.В. и др. Особенности патогенеза, диагностики и течения инфекций органов мочевой системы у новорожденных и детей раннего возраста, возможности терапевтической коррекции//Вестник современной клинической медицины. – 2013. – Т.6, №6. – С.119-128. 100.Щербина А.Ю., Пашанов Е.Д. Иммунология детского возраста/В кн.: Практическое руководство по детским болезням под ред. Коколиной В.Ф., Румянцева А.Г. – Медпрактика-М, М., 2006. – С.66. 182 101.Abbas A.K., Murphy K.M., Sher A. Functional diversity of helper Tlymphocytes//Nature. – 1996. Vol.-383. - №6603. - P.787-793. 102.Ahmadieh H., Javadi M.A., Ahmady M. et al. Primary capsulectomy, anterior vitrectomy, lensectomy, and posterior chamber lens implantation in children: limbal versus pars plana//J Cataract Refract Surg. – 1999. - Vol.25. - №6. - P.768–775. 103. Ahn J.H., Kim W.S. Surgical techniques and postoperative complications in pediatric cataract surgery//J Korean Ophthalmol Soc. – 2006. – Vol.47. – №7. – P.1049–1056. 104.Aguilera-Aguirre L., Bacsi A., Saavedra-Molina A. et al. Mitochondrial Dysfunction Increases Allergic Airway//Inflammation The Journal of Immunology. - 2009 - Vol. 183. - № 8. – P.5379-5387. 105. Alkawas A.A., Hamdy A.M., Shahien E.A. Intraoperative intravitreal injection of triamcinolone acetonide for cataract extraction in patients with uveitis//Ocul Immunol Inflamm. – 2010. – Vol.18. – №5. – P.402-407. 106.Alonso-Arias R., Suarez-Alvavez B., Lopez-Vazquez A. et al. CD127low Expression in CD4+CD25high T Cells as Immune Biomarker of Renal Function in Transplant Patients//Transplantation. – 2009. – Vol.88. - №3. – P.85-93. 107.Althomali T. Management of congenital cataract//Saudi J Health Sci. – 2012. – Vol.1 - №3. – P.115-121. 108.Apple D.J., Ram J., Foster A. et al. Elimination of cataract blindness: a global perspective entering the new millennium//Surv Ophthalmol. – 2000. - Vol.45. – P.1196. 109.Argento C., Badoza D., Ugrin C. Optic capture of the AcrySof intraocular lens in pediatric cataract surgery//J Cataract Refract Surg. – 2001. – Vol.27. - №10. – P.1638-42. 110.Attarzadeh H. Air bubble and Viscoelastic agents in production of posterior capsular opacity and pigment deposition over the intraocular lens//J Res Med Sci. – 2006. – Vol.11. – P.111–112. 183 111.Bannale S.G., Pundarikaksha H.P., Sowbhagya H.N. A Prospective, Open-label Study to Compare the Efficacy and the Safety of Topical Loteprednol Etabonate and Topical Flurbiprofen Sodium in Patients with Post-Operative Inflammation after Cataract Extraction//J Clin Diagn Res. – 2012. – Vol.6. – №9. – P.1499-1503. 112.Bar-Sela S.M., Har-Noy N.B., Spierer A. Secondary membrane formation after cataract surgery with primary intraocular lens implantation in children//Int Ophthalmol. – 2014. – Vol.43. - №4. – P.767-772. 113.Barry J.S., Ewings P., Gibbon C. et al. Refractive outcomes after cataract surgery with primary lens implantation in infants //Br J Ophthalmol. – 2006. – Vol.90. - №11. - P.1386-1389. 114.Bayramlar H., Totan Y., Borazan M. Heparin in the intraocular irrigating solution in pediatric cataract surgery//J Cataract Refract Surg. – 2004. - Vol.30. №10. - P.2163–2169. 115.Beby F., Morle L., Michon L. et al. [The genetics of hereditary cataract]//J Fr Ophtalmol. - 2003. - Vol.26. - №4. - P.400-408. 116.Benko A.L., Olsen N.J., Kovacs W.J. Glucocorticoid inhibition of activationinduced cytidine deaminase expression in human B lymphocytes//Mol Cell Endocrinol. – 2014. – Vol.382. - №2. – P.881-887. 117.Bettelli E., Carrier Y., Gao W. et al. Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector Th17 and regulatory T-cells//Nature. – 2006. №7090. - Vol. 441. – P.235-238. 118.Birch, E. E., Stager, D. R. The critical period for surgical treatment of dense congenital unilateral cataract//Invest Ophthalmol. – 1996. - Vol. 37. - №8. - P.1532– 1538. 119.Birinci H. Surgical results of triamcinolone assisted pars plana vitrectomy combined with phacoemulsification in diabetic patients//Open Ophthalmol J. – 2008. – Vol.2. – P.5-8. 120.Bluestone J., Mackay C., O’Shea J. et al. The functional plasticity of T-cell subsets //Nat. Rev. Immunol. – 2009. – Vol. 9. - №11. - P. 811–816. 184 121.Borghol-Kassar R., Menezo-Rozalén J.L., Harto-Castaño M.A., Desco-Esteban M.C. Assessment of intra-operative techniques to prevent visual axis opacification in congenital cataract surgery//Arch. Soc. Esp. Oftalmol. - 2012. – Vol.87. - №10. – P.315-319. 122.Brady K.M., Alkinson C.S., Kilty L.A. et al. Cataract surgery and intraocular lens implantation in children//Am J Ophthalmol. - 1995. - Vol.120. - №1. - P.1-9. 123.Brar G.S., Ram J., Pandav S.S. et al. Postoperative complications and visual results in uniocular pediatric traumatic cataract//Ophthalmic Surg Laser 2001. Vol.32. - №3. - P.233-238. 124.Brennan L.A., Kantorow M. Mitochondrial function and redox control in the aging eye: role of MsrA and other repair systems in cataract and macula degenerations//Exp. Eye Res. – 2009. - Vol.88. - №2. – P.195-203. 125.Caça I., Sahin A., Cingü A.K. et al. Effect of low molecular weight heparin (enoxaparin) on congenital cataract surgery//Int J Ophthalmol. - 2012. - Vol.5. - №5. – P.596-599. 126.Chak M., Wade A., Rahi J.S. Long-term visual acuity and its predictors after surgery for congenital cataract: findings of the British congenital cataract study//Invest Ophthalmol Vis Sci. – 2006. – Vol.47. - №10. – P.4262–4269. 127.Chee S.P., Ti S.E., Sivakumar M. et al. Postoperative inflammation: Extracapsular cataract extraction versus phacoemulsification//J Cataract Refract Surg. - 1999. – Vol.25. - №9. – P.1280–1285. 128.Chen X., Gan Y., Li W. et al. The interaction between mesenchymal stem cells and steroids during inflammation//Cell Death and Disease. – 2014. – Vol.5. – P.112. 129.Cinel I., Opal S.M. Molecular Biology of Inflammation and Sepsis: A Primer// Crit Care Med. – 2009. – Vol.37. - №1. –P.291-304. 130.Ciulla T.A., North K., Mccabe O et al. Bilateral infantile cataractogenesis in a patient with deficiency of complex I, a mitochondrial electron transport chain enzyme//J. Pediatr. Ophthalmol. Strabismus. - 1995. - Vol.32. - №6. – P. 378-382. 185 131.Collison L.W., Workman C.J., Kuo T.T. et al. The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function//Nature. – 2007. - Vol.450. - №7169. - P. 566-569. 132.Dada T. Intracameral heparin in pediatric cataract surgery//J Cataract Refract Surg. – 2003. – Vol.29. – №6. – P.1056. 133.Dada T., Dada V.K., Sharma N. et al. Primary posterior capsulorhexis with optic capture and intracameral heparin in paediatric cataract surgery//Clin Experiment Ophthalmol. – 2000. – Vol.28. - №5. - P.361–363. 134.Demirci G., Karabas L., Maral H. et al. Effect of air bubble on inflammation after cataract surgery in rabbit eyes//Indian J Ophthalmol. – 2013. Vol.61. - №7. – P.343-348. 135.Dixit N.V., Shah S.K., Vasavada V. et al. Outcomes of cataract surgery and intraocular lens implantation with and without intracameral triamcinolone in pediatric eyes//J Cataract Refract Surg. – 2010. – Vol.36 – №9. – P.1494-1498. 136.Dotan A., Kaiserman I., Kremer I. et al. Intracameral recombinant tissue plasminogen activator (r-tPA) for refractory toxic anterior segment syndrome//Br J Ophthalmol. – 2014. – Vol.98. – №2. – P.252-255. 137.Dowler J., Hykin P.G. Cataract surgery in diabetes//Curr Opin Ophthalmol. 2001. - Vol.12. - №3.– P.175–178. 138.Duchen M. R. Mitochondria in health and disease: perspectives on a new mitochondrial biology//Mol. Aspects Med. – 2004. - Vol. 25. - №4.– P.365 – 451. 139.Eckstein M., Vijayalakshmi P., Killerdar M. et al. Aetiology of childhood cataract in south India//Br J Ophthalmol. – 1996. - Vol.80. - №7. – P.628-632. 140.El-Harazi S.M., Feldman R.M., Ruiz R.S. et al. Consensual inflammation following ocular surgery//Ophthalmic Surg Lasers. – 1999. – Vol.30. - №4. - P.254– 259. 141.Ellis FJ. Management of pediatric cataract and lens opacities//Curr Opin Ophthalmol. – 2002. – Vol.13. - №1. - P.33–37. 186 142.Elston J. S., Timms C. Clinical evidence for the onset of the sensitive period in infancy//Br. J.Ophthalmol. - 1992. – Vol.76. - №6. – P.327–328. 143.Er H., Doganay S., Evereklioglu C. et al. Retrospective comparison of surgical techniques to prevent secondary opacification in pediatric cataracts//J Pediatr Ophthalmol Strabismus. – 2000. - Vol.37. - №5. – P.294–298; 144.Eriksen J.R., Bronsard A., Mosha M. et al. Predictors of poor follow-up in children that had cataract surgery//Ophthalmic Epidemiol. – 2006. – Vol.13. - №4.– P.237-43. 145.Fan S.P.D., Yip W.K., Christopher B.Y. et al. Updates on the surgical management of pediatric cataract with primary intraocular lens implantation//Annal Acad Med. – 2006. – Vol.35. - P.564-570. 146.Fany A., Keita C.T., Adjorlolo A.C. et al. Accessibilité à l’intervention chirurgicale de la cataracte dans les pays en développement nos résultats des 6 derniers mois CHU de Treichville–Abidjan–Cote d’Ivoire//Médecine d’Afrique Noire. – 2001. – Vol.48. – P.26–29. 147.Fenton S., O'Keefe M. Primary posterior capsulorhexis without anterior vitrectomy in pediatric cataract surgery: longer term outcome//J Cataract Refract Surg. – 1999. – Vol.25. - №6. –P.763–767. 148.Flitcroft D. I., Knight-Nanan D., Bowell R. et al. Intraocular lenses in children: changes in axial length, corneal curvature, and refraction//Br. J. Ophthalmol. - 1999. – Vol.83. - №3. – P.265–269. 149.Forrester J.V., Xu H. Good news-bad news: the Yin and Yang of immune privilege in the eye//Front Immunol. – 2012. – Vol.3. - №338. – P.1-18. 150.Gilbert C., Foster A. Childhood blindness in the context of VISION 2020 - The right to sight//Bull World Health Organ. – 2001. - Vol.79. - №3. – P.227-232. 151.Gimbel H.V. Posterior continuous curvilinear capsulorhexis and optic capture of the intraocular lens to prevent secondary opacification in pediatric cataract surgery//J Cataract Refract Surg. –1997. - Vol.23. -№1. - P.652–656. 187 152.Gimbel H.V., DeBroff B.M. Posterior capsulorhexis with optic capture: maintaining a clear visual axis after pediatric cataract surgery//J Cataract Refract Surg. – 1994. – Vol.20. - №6. – P.658–664. 153.Gogate P.M., Sahasrabudhe M., Shah M. et al. Long term outcomes of bilateral congenital and developmental cataracts operated in Maharashtra, India. Miraj pediatric cataract study III//Indian J Ophthalmol. – 2014. – Vol.62. – №2. – P.186-195. 154.Gordon R.A., Donzis P.B. Refractive development of the human eye//Arch Ophthalmol.- 1985. - Vol.103. - №6. – P.785-789. 155.Green K., Brand M. D., Murphy M. P. Prevention of mitochondrial oxidative damage as a therapeutic strategy in diabetes//Diabetes. – 2004. - Vol. 53. - №1. P.110-118. 156.Guleria K., Sperling K., Singh D. et al. A novel mutation in the connexin 46 (GJA3) gene associated with autosomal dominant congenital cataract in an Indian family//Mol Vis. – 2007. - Vol.13. – P.1657-1665. 157.Guo S., Wagner R.S., Caputo A. Management of the anterior and posterior lens capsules and vitreous in pediatric cataract surgery//J Pediatric Ophthalmol Strabismus. – 2004. - Vol.41. - №6. – P.330–337. 158.Gupta A., Kekunnaya R., Ramappa M. et al. Safety profile of primary intraocular lens implantation in children below 2 years of age//Br J Ophthalmol. – 2011. – Vol.95. - №4. – P.477-480. 159.Gzarny P., Seda A., Wielgorski M. et al. Mutagenesis of mitochondrial DNA in Fuchs endothelial corneal dystrophy//Mutat Res. – 2014. - Vol.760. – P.42-47. 160.Harminder S. D., Richa A. Treatment of Post-operative Inflammation following Cataract Surgery – A Review//European Ophthalmic Review. – 2012. - Vol.6. - №2. –P.98–103. 161.Harty J.T., Tvinnereim A.R., White D.W. CD8+ T cell effector mechanisms in resistance to infection//Annu Rev Immunol. - 2000. – Vol.18. – P.275-308. 188 162.Hayat A.K., Abandan K.A. Topical diclofenac versus dexamethasone after strabismus surgeries - A blind randomized clinical trial on the anti-inflammatory effect and the ocular hypertensive response//Indian J Ophthalmol. – 2007. – Vol.55. - №4. - P.271–275. 163.Hosal B.M., Biglan A.W. Riskfactors for secondary membrane formation after removal of pediatric cataract//J Cataract Refract Surg. – 2002. - Vol.28. - №2. – P.302–309. 164.Huang H., Kim H.J., Chang E.J. et al. IL-17 stimulates the proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells: implications for born remodeling//Cell Death and Differention. – 2009. - Vol. 16. - №10. - P.1332-1343. 165.Hutchinson A.K., Wilson M.E., Saunders R.A. Outcomes and ocular growth rates after intraocular lens implantation in the first 2 years of life//J Cataract Refract Surg. – 1998. - Vol.24. - №6. – P.846-852. 166.Ilhan O., Coşkun M., Keskin U. et al. Dual approach using vitrectorhexis combined with anterior vitrectomy in pediatric cataract surgery//ISRN Ophthalmol. – 2013. - №124754. – P.1-5. 167.Jafarinasab M.R., Rabbanikhah Z., Karimian F., Javadi M.A. Lensectomy and PCIOL Implantation with versus without Posterior Capsulotomy and Anterior Vitrectomy for Pediatric Cataracts//J Ophthalmic Vis Res. – 2008. - Vol.3. - №1. – P.37-41. 168.Jensen A.A., Basti S., Greenwald M.J., Mets M.B. When may the posterior capsule be preserved in pediatric intraocular lens surgery?//Ophthalmology. – 2002. - Vol.109. - №2. – P.324–328. 169.Joseph N.S., Robyn A.P., Joyce E.J. Comparison of the efficacy and the safety of ketorolac Tromethaminen 0.5% and prednisolone acetate 1% after cataract surgeries//J Cataract Refract Surg. – 1999. – Vol.25. - №5. – P.699–704 170.Jurowski P., Goś R., Piasecka G. Nitric oxide levels in aqueous humor after lens extraction and poly (methyl methacrylate) and foldable acrylic intraocular lens 189 implantation in rabbit eyes// J Cataract Refract Surg. – 2002. – Vol.28. – №12. – P.2188–2192. 171.Karalezli A., Borazan M., Akova Y.A. Intracameral triamcinolone acetonide to control postoperative inflammation following cataract surgery with phacoemulsification//Acta Ophthalmol. – 2008. – Vol.86. – №2. – P.183-187. 172.Keech R.V., Tongue A.C., Scott W.E. Complications after surgery for congenital and infantile cataracts//Am J Ophthalmol. – 1989. – Vol.108. - №2. – P.136–141. 173.Kim K.H., Ahn K., Chung E.S. et al. Clinical outcomes of surgical techniques in congenital cataracts//Korean J. Ophthalmol. – 2008. – Vol.22. - №2. – P.87–91. 174.Knight-Nanan D., O'Keefe M., Bowell R. Outcome and complications of intraocular lenses in children with cataract//J Cataract Refract Surg. – 1996. Vol.22. - №6. – P.730-736. 175.Koch D.D., Kohnen T. Retrospective comparison of techniques to prevent secondary cataract formation after posterior chamber intraocular lens implantation in infants and children//J Cataract Refract Surg. – 1997. - Vol.23. – №1. – P.657– 663. 176.Koraszewska-Matuszewska B., Samochowiec-Donocik E., Pieczara E. et al. Heparin-surface-modified PMMA intraocular lenses in children in early and late follow-up//Klin Oczna. – 2003. – Vol.105. – №5. – P.273-276. 177.Korn T., Bettelli E., Oukka M. et al. IL-17 and Th17 Cells//Annu. Rev. Immunol. - 2009. – Vol. 27. – P.485-517. 178.Kruger A., Amon M., Abela-Formanek C. et al. Effect of heparin in the irrigation solution on postoperative inflammation and cellular reaction on the intraocular lens surface//J Cataract Refract Surg. – 2002. - Vol.28. – №1. – P.87–92. 179.Kugelberg M., Kugelberg U., Bobrova N. et al. After cataract in children having cataract surgery with or without anterior vitrectomy, implanted with a single-piece AcrySof IOL//J Cataract Refract Surg. – 2005. - Vol. 31. – №4. – P. 757-762. 190 180.Kugelberg M., Zetterström C. Pediatric cataract surgery with or without anterior vitrectomy//J Cataract Refract Surg. – 2002. – Vol.28. - №10. – P.1770–1773. 181.Lawani R., Pommier S., Roux L. et al. Magnitude et stratégies de prise en charge de la cataracte dans le monde//Med Trop. – 2007. – Vol.67. – №6 – P.644– 650. 182.Lee D., Shim M.S., Kim K.Y. et al. Coenzyme Q10 inhibits glutamate excitotoxicity and oxidative stress-mediated mitochondrial alteration in a mouse model of glaucoma//Invest Ophthalmol Vis Sci. – 2014. – Vol.55. – №2. – P.9931005. 183.Lewis A.C. Interleukin-6 in the pathogenesis of posterior capsule opacification and the potential role for interleukin-6 inhibition in the future of cataract surgery //Med Hypotheses. – 2013. – Vol.80. – №4. – P.466-474. 184.Li X., Fang P., Mai J. et al.Targeting mitochondrial reactive species oxygen as novel therapy for inflammatory diseases and cancers//J Hematol Oncol. – 2013. –Vol.6. – P.1-19. DOI: http://www.jhoonline.org/content/6/1/19 185.Libetta C., Esposito P., Sepe V. et al. Effects of different peritoneal dialysis fluids on the TH1/TH2 balance//Eur Cytokine Netw. – 2011. – Vol.22. – №1. – P.24-31. 186. Liu W., Putnam A.L., Zhou X. et al. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+Treg cells//J. Exp. Med. – 2006. – Vol.203. – №7. – P. 1701-1711. 187.Liu X., Luo Y., Zhou X. et al. Combined pars plana and limbal approach for removal of congenital cataracts//J Cataract Refract Surg. – 2012. – Vol.38. – №12. P.2066-2070. 188.Lloyd I.C., Ashworth J., Biswas S. et al. Advances in the management of congenital and infantile cataract//Eye (Lond). –2007. – Vol.21. – №10. – P.13011309. 189.Lundvall A., Kugelberg U. Outcome after treatment of congenital bilateral cataract//Acta Ophthalmol Scand. – 2002. – Vol.80. - №6. – P.593–597. 191 190.Ma J.-J., Lu N., Chen B. Regulatory effect of transcription factors RORγt on the Th17/Treg balances in pregnant asthma mice//Medical Journal of Chines People's Liberation Army. – 2012. – Vol.37. – №6. – P.460-467. 191.Maedel S., Hirnschall N., Chen Y.A. et al. Effect of heparin coating of a foldable intraocular lens on inflammation and capsular bag performance after cataract surgery //J Cataract Refract Surg. – 2013. – Vol.39. – №12. – P.18101817. 192.Magnusson G., Abrahamsson M., Sjostrand J. Changes in visual acuity from 4 to 12 years of age in children operated for bilateral congenital cataracts//Br J Ophthalmol. – 2002. – Vol.86.– №12. – P.1385–1389. 193.Manjoo S.R., Suneetha N., Reji K.T. et al. Topical diclofenac sodium for the treatment of postoperative inflammation//Drugs. – 2007. – Vol.67. – №9. – P.1291– 1308. 194.Mansour A.M., Ferguson E., Lucia H. et al. Vitreous replacement by gas as a therapeutic modality in bacterial endophthalmitis//Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. – 1991. – Vol.229. - №5. – P.468–472. 195.Maslanka T. Dexamethasone inhibits and meloxicam promotes proliferation of bovine NK cells//Immunopharmacol Immunotoxicol. – 2013. – Vol.35. - №2. – P.225-234. 196.Maslanka T. Effect of dexamethasone and meloxicam on counts of selected T lymphocyte subpopulations and NK cells incattle - In vivo investigations//Res Vet Sci. – 2014. – Vol.96. - №2. – P.338-346. 197.McKinley L., Alcorn J.F., Peterson A. TH17 cells mediate steroid- resistant airway inflammation and airway hyperresponsiveness in mice//J Immunol. – 2008. – Vol.181. - №6. – P.4089-4097. 198.Medawar P.B. Immunity to homologous grafted skin. III. The fate of skin homografts transplanted to the brain, to subcutaneous tissue, and to the anterior chamber of the eye//Br J Exp Pathol. – 1948. – Vol.29. - №1. – P.58-69. 192 199.Mehta J.S., Adams G.G. Recombinant tissue plasminogen activator following paediatric cataract surgery//Br J Ophthalmol. – 2000. – Vol.84. – №9. – P.983–986. 200.Menapace R. Posterior capsulorhexis combined with optic buttonholing: an alternative to standard in-the-bag implantation of sharp-edged intraocular lenses? A critical analysis of 1000 consecutive cases//Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. – 2008. –Vol.246. – №6. – P.-787-801. 201.Messina-Baas O.M., Gonzalez-Huerta L.M., Cuevas-Covarrubias S.A. Two affected siblings with nuclear cataract associated with a novel missense mutation in the CRYGD gene//Mol Vis. – 2006. – Vol.12. – P.995-1000. 202.Miyara M., Sakaguchi S. Natural regulatory T-cells: mechanisms of supression// Trends. Molecular. Medicine. – 2007. – Vol. 13. – №3. – P.108-116. 203.Monnet D., Labetoulle M., Lautier-Frau M. et al. Therapeutic strategy in delayed postoperative endophthalmitis: a report on 15 cases//J. Fr. Ophtha lmol – 2002. – Vol.25. – №6. – P.599-603. 204.Mosmann T., Cherwinski H., Bond M. et al. Two types of murine helper T-cell clone. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins //J. Immunol. – 1986. – Vol. 136. - №7. – P. 2348–2357. 205.Mullner-Eidenbock A., Amon M., Moser E. et al. Morphological and functional results of Acrysof intraocular lens implantation in children: prospective randomized study of age-related surgical management//J Cataract Refract Surg. – 2003. – Vol.29. - №2. – P.285–293. 206.Neustadt J., Pieczenik S.R. Medication-induced mitochondrial damage and disease//Mol. Nutr. Food Res. - 2008. – Vol.52. - №7. – P.780 – 788. 207.Ninomiya Y., Hirakita A., Hiraoka T. et all. Clinical features of endophthalmitis after cataract surgery evaluated by the presence of background factors//Nippon Ganca Gakkai Zasshi. – 2008. – Vol.112. - №6. – P.525-530. 208.Norn M.S. Corneal thickness after cataract extraction with air in the anterior chamber//Acta Ophthalmol (Copenh). – 1975. – Vol.53. - №5. – P.747–750. 193 209.O'Keefe M., Mulvihill A., Yeoh P.L. Visual outcome and complications of bilateral intraocular lens implantation in children//J Cataract Refract Surg. – 2000. – Vol.26. – P.1758-1764. 210.Oliveira M.L., Di Giovanni M.E., Porfírio Neto Jr. F. et al. Catarata congênita: aspectos diagnósticos, clínicos e cirúrgicos em pacientes submetidos a lensectomia// Arq Bras Oftalmol. – 2004. – Vol.67. – №6. – P.921-926. 211.Ozkurt YB, Taşkiran A, Erdogan N. et al. Effect of heparin in the intraocular irrigating solution on postoperative inflammation in the pediatric cataract surgery// Clin Ophthalmol. – 2009. – Vol.3. – P.363-365. 212.Paganelli F., Cardillo J.A., Melo L.A. Jr. et al. A single intraoperative subtenon's capsule injection of triamcinolone and ciprofloxacin in a controlled-release system for cataract surgery//Invest Ophthalmol Vis Sci. – 2009. – Vol.50. – №7. – P.3041-3047. 213.Pandolfi J., Baz P., Fernandez P. et al. Regulatory and effector T-cells are differentially modulated by Dexamethasone//Clin Immunol. – 2013. – Vol.149. №3. – P.400-410. 214.Park S.J., Shin J.H., Jeong J.I. et al. Down-regulation of mortalin exacerbates Aβ-mediated mitochondrial fragmentation and dysfunction//J Biol Chem. – 2014. – Vol.289. – №4. – P.2195-2204. 215.Pavesion C.E., Decory H.H. The treatment of the ocular inflammatory conditions with Loteprednol etabonate//Brit J Ophthalmol. – 2008. – Vol.92. – №4. – P.455–459. 216.Plager D.A., Yang S., Neely D. et al. Complications in the first year following cataract surgery with and without IOL in infants and older children//J AAPOS. – 2002. – Vol.6. - №1. – P.9–14. 217.Psarra A.-M. G., Sekeris C.E. Glucocorticoid receptors and other nuclear transcription factors in mitochondria and possible function//BBA – Bioenergetics. – 2009. – Vol.1787. - №5. – P.431-436. 194 218. Psarra A.-M. G., Sekeris C.E. Nuclear receptors and other nuclear transcription factors in mitochondria: Regulatory molecules in a new environment//BBA – Moleculae Cell Research. – 2008. – Vol.1783. – №1. - P.1-11. 219.Rabiah P.K. Frequency and predictors of glaucoma after pediatric cataract surgery//Am J Ophthalmol. – 2004. – Vol.137. - №1. – P.30–37. 220.Rahi J.S., Dezateux C. National cross sectional study of detection of congenital and infantile cataract in the United Kingdom: role of childhood screening and surveillance//The British Congenital Cataract Interest Group. BMJ. – 1999. – Vol.318. – №7180. – P.362-365. 221.Rahi J.S., Scripathi S., Gilbert C. et al. Childhood blindness in India: causes in 1318 blind school students in nine states//Eye (Lond). – 1995. – Vol.9. – №5. – P.545-550. 222.Raina U.K., Gupta V., Arora R. et al. Posterior continuous curvilinear capsulorhexis with and without optic capture of the posterior chamber intraocular lens in the absence of vitrectomy//J Pediatr Ophthalmol Strabismus. – 2002. – Vol.39. – №5. – P.278–287. 223.Ram J., Brar G.S., Kaushik S. et al. Role of posterior capsulotomy with vitrectomy and intraocular lens design and material in reducing posterior capsule opacification after pediatric cataract surgery//J Cataract Refract Surg. – 2003. – Vol.29. - №8. – P.1579–1584. 224. Ram J., Brar G.S., Kaushik S. et al. Primary intraocular lens implantation in the first two years of life: safety profile and visual results//Indian J Ophthalmol. – 2007. – Vol.55. – №3. – P.185-189. 225.Randrianotahina H.C., Nkumbe H.E. Pediatric cataract surgery in Madagascar// Niger J Clin Pract. – 2014. – Vol.17. - №1. – P.14-17. 226.Rumelt S., Stolovich C., Segal Z.I. et al. Intraoperative enoxaparin minimizes inflammatory reaction after pediatric cataract surgery//Am J Ophthalmol. – 2006. – Vol.141. – №3. – P.433–437. 195 227.Rutter J., Winge D.R., Schiffman J.D. Succinate dehydrogenase – Assembly, regulation and role in human disease//Mitochondrion.– 2010. – Vol.10. – №4. – P.393-401. 228.Santana А., Waiswo М. The genetic and molecular basis of congenital cataract// Arq. Bras. Oftalmol. – 2011. - Vol.74. – №2 – Р. 136-142. 229.Saucillo D.C., Gerriets V.A, Sheng J. et al. Leptin metabolically licenses T-cells for activation to link nutrition and immunity//J Immunol. – 2014. – Vol.192. – №1. – P.136-144. 230.Schaefer A.M., Taylor R.W., Turnbull D.M. et al. The epidemiology of mitochondrial disorders- past, present and future//Biochim Biophys Acta. – 2004. – Vol.40. – № 2–3. – P.115-120. 231.Scheffler I.E. A century of mitochondrial research: achievements and perspectives//Mitochondrion. – 2001. – Vol.1. - №1. – P.3-31. 232.Scheller K., Sekeris C.E. The effects of steroid hormones on the transcription of genes encoding enzymes of oxydative phosphorylation//Exp. Physiol. – 2003. – Vol.88. - №1. – P.129-140. 233.Seddiki N.V., Santner-Nanan B., Martinson J. et al. Expression of interleukin (IL)-2 and IL-7 receptors discriminates between human regulatory and activated T cells // J. Exp. Med. – 2006. – Vol.203. - №7. – P.1693-1700. 234.Shamrani M., Turkmani S. Update of intraocular lens implantation in children// Saudi J Ophthalmol. – 2012. – Vol.26. – №3. – P.271-275. 235.Shevach E.M. Immunology: regulating suppresion//Sciens. – 2008. – Vol.322. – №5899. – P. 202-203. 236.Sim D.A., Wong R., Griffiths M.F.P. Injecting an air bubble at the end of sutureless cataract surgery to prevent inflow of ocular surface fluid//Eye. – 2007. – Vol.21. – №11. – P.1444-1445. 237.Simaroj P., Sinsawad P., Lekhanont K. Effects of intracameral triamcinolone and gentamicin injections following cataract surgery//J. Med. Assoc. Thai. – 2011. – Vol.94. – №7. – P.819-825. 196 238.Solebo A. L., Russell-Eggitt I., Nischal K. K. et al. Cataract surgery and primary intraocular lens implantation in children ≤ 2 years old in the UK and Ireland: finding of national surveys//Br. J. Ophthalmol. – 2009. – Vol. 93. – №11. – P.1495-1498. 239.Soon-Phaik C., Seng-Ei T., Meenakshi S. et al. The postoperative inflammation: extracapsular cataract extraction versus phacoemulsification//J Cataract Refract Surg. – 1995. – Vol.25. – №9. – P.1280-1285. 240.Streilein J.W. Ocular immune privilege: the eye takes a dim but practical view of immunity and inflammation//Journal of Leukocyte Biology – 2003. – Vol.74. – №2. – P.179-185. 241.Suematsu N., Tsutsui H., Wen J. et al. Oxidative stress mediates tumor necrosis factor-alpha-induced mito chondrial DNA damage and dysfunction in cardiac myocytes//Circulation. – 2003. – Vol.107. – №10. – P.1418-1423. 242.Sullivan B.M., Juedes A., Szabo S.J. et al. Antigen-driven effector CD8 T cell function regulated by T-bet// PNAS. – 2003. – Vol. 100. – №26. – P.15818–15823. 244.Tan W.P., Mai X.D., Wu B.Q. et al. [Expression of transcription factors Tbet/GATA-3 mRNA and its effect on Tc1/Tc2 balance in asthmatic children]// Zhonghua Er Ke Za Zhi. – 2007. – Vol.45. – №4. – P.284-287. 244. Taylor AW. Ocular immune privileg//Eye. – 2009. – Vol.23. - №10. – P.18851889. 245.Taylor D.,Wright K.W., Amaya L. et al. Should we aggressively treat unilateral congenital cataracts?//Br. J. Ophthalmol. – 2001. – Vol.85. – №9. – P.1120-1126. 246.Tesmer L.A., Lundy K., Sarkar S. et al. Th17 cells in human disease// Immunological Reviews. – 2008. – Vol.223. – №1. – P.87-113. 247.Vaamonde-Garcı´a С., Riveiro-Naveira R.R., Valca´rcel-Ares M.N. et al. Mitochondrial Dysfunction Increases Inflammatory Responsiveness to Cytokines in Normal Human Chondrocytes//Arthritis & Rheumatism. – 2012. – Vol. 64. – №9. – P.2927-2936. 197 248.Vankayalapati R., Klucar P., Wizel B. et al. NK Cells Regulate CD8 + T Cell Effector Function in Response to an Intracellular Pathogen// J Immunol. – 2004. – Vol.172. – №1.– P.130-137. 249.Van Bergen N.J., Chakrabarti R., O’Neill E.C. et al. Mitochondrial disorders and the eye//Eye and Brain. – 2011. – Vol.3. – P.29-47. 250.Van den Brandt J., Fischer H., Walter L. et al. Type 1 diabetes in BioBreeding rats is critically linked to an imbalance between Th17 and regulatory T cells and an altered TCR receptoire//J.Immunol. – 2010. – Vol. 441. – P. 2285-2294. 251.Van der Giezen M., Tovar J. Degenerate mitochondria//EMBO Rep. – 2005. – Vol.40. - №6. – P.525–530. 252.Van Horn D.L., Edelhauser H.F., Aaberg T.M. et al. In vivo effects of air and sulfur hexafluoride gas on rabbit corneal endothelium//Invest Ophthalmol. – 1972. – Vol.11. - №12. – P.1028-1036. 253.Vasavada A., Chauhan H. Intraocular lens implantation in infants with congenital cataracts// J Cataract Refract Surg. – 1994. – Vol.20. – P.592-598. 254.Vasavada A., Desai J. Primary posterior capsulorhexis with and without anterior vitrectomy in congenital cataracts//J Cataract Refract Surg. – 1997. – Vol.23. – №1. – P.645-651. 255.Vasavada V.A., Praveen M.R., Shah S.K. et al. Anti-inflammatory effect of low-molecular-weight heparin in pediatric cataract surgery: a randomized clinical trial// Am J Ophthalmol. – 2012. – Vol.154. – №2. – P.252-258. 256.Vasavada A, Trivedi RH, Singh R. Necessity of vitrectomy when optic capture is performed in children older than 5 years//J Cataract Refract Surg. – 2001. – Vol.27. - №8. – P.1185–1193. 257.Ventura M.C., Ventura B.V., Ventura C.V. et al. Outcomes of congenital cataract surgery: Intraoperative intracameral triamcinolone injection versus postoperative oral prednisolone//J Cataract Refract Surg. – 2014. – Vol.40. – №4. – P.601-608. 198 258.Ventura M.C., Sampaio V.V., Ventura B.V et al. Congenital cataract surgery with intraocular lens implantation in microphthalmic eyes: visual outcomes and complications//Arq Bras Oftalmol. – 2013. – Vol.76. – №4. - P.240-243. 259.Vianna L.M., Freitas L.L., Nosé W. et al. Intracapsular dexamethasone implant in patients undergoing phacoemulsification and intraocular lens implantation//Arq Bras Oftalmol. – 2013. – Vol.76. – №4. – P.226-228. 260.Vishwanath M., Cheong-Leen R., Taylor D. et al. Is early surgery for congenital cataract a risk factor for glaucoma?//Br. J. Ophthalmol. - 2004. – V.88. - №7. – P.905–910. 261.Wallace D.C. A mitochondrial paradigm of metabolic and degenerative diseases, aging, and cancer: A dawn for evolu tionary medicine//Annu. Rev. Genet. – 2005. – Vol.39. – P.359-407. 262.Wang B., Dong N., Xu B. et al. Efficacy and safety of intracameral triamcinolone acetonide to control postoperative inflammation after phacotrabeculectomy//J Cataract Refract Surg. – 2013. – Vol.39. – №11. – P.16911697. 263.Watts P., Abdolell M., Levin A.V. Complications in infants undergoing surgery for congenital cataract in the first 12 weeks of life: Is early surgery better?//J AAPOS. – 2003. – Vol.7. - №2. – P.81–85. 264.Wei Y. H., Lu C. Y., Lee H. C. et at. Oxidative damage and mutation to mitochondrial DNA and age dependent decline of mitochondrial respiratory function//Ann. N. Y. Acad. Sci. – 1998. – Vol.854. – P.155 – 170. 265.Wilson M.E., Bartholomew L.R., Trivedi R.H. Pediatric cataract surgery and intraocular lens implantation: Practice styles and preferences of the 2001 ASCRS and AAPOS memberships//J Cataract Refract Surg. – 2003. – Vol.29. - №9. – P.1811-1820. 266.Wilson M.E., Pandey S.K., Thakur J. Paediatric cataract blindness in the developing world: surgical techniques and intraocular lenses in the new millennium//Br J Ophthalmol. – 2003. – Vol.87. - №1. –P.14–19. 199 267.Wilson M.E., Peterseim M.W., Englert J.A. et al. Pseudophakia and polypseudophakia in the first year of life//J AAPOS. – 2001. – Vol.5. - №4. – P.238–245. 268.Wilson M.E. Jr., Trivedi R.H. Low molecular-weight heparin in the intraocular irrigating solution in pediatric cataract and intraocular lens surgery//Am J Ophthalmol. – 2006. – Vol.141. – №3. – P.537-538. 269.Won T.J., Kim B., Song D.S. et al. Modulation of Th1/Th2 balance by Lactobacillus strains isolated from Kimchi via stimulation of macrophage cell line J774A.1 in vitro//J Food Sci. – 2011. – Vol.76. - №2. – P.55-61. 270.Yorston D. Surgery for congenital cataract//Community Eye Health. – 2004. Vol.17. - №50. – P.23-25. 271.Yorston D., Wood M., Foster A. Results of cataract surgery in young children in East Africa//Br J Ophthalmol. – 2001. – Vol.85. - №3. – P.267–271. 272.Zetterström C. Update on pediatric cataract surgery//J Cataract Refract Surg . – 2007. - Vol.2. - №2. - P.49-51. 273.Zetterström C., Kugelberg U., Oscarson C. Cataract surgery in children with capsulorhexis of anterior and posterior capsules and heparin-surface-modified intraocular lenses//J Cataract Refract Surg. – 1994. - Vol.20. - №6. – P.599–601. 274.Zetterström C., Lundvall A., Kugelberg M. Cataracts in children//J Cataract Refract Surg. - 2005. – Vol.31. - №4. – P.824–840. 275.Zhao G, Zhou S, Davie A, Su Q. Effects of moderate and high intensity exercise on T1/T2 balance//Exerc Immunol Rev. – 2012. – Vol.18. – P.98-114. 276.Zou W., Restifo N.P. TH17 cells in tumour immunity and immunotherapy// Nature Reviews Immunology. – 2010. – Vol.10. - №4. – P. 248-256. 200
