Иммунологические предикторы эффективности терапии
advertisement
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ЗДОРОВЬЯ ДЕТЕЙ» РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НА ПРАВАХ РУКОПИСИ Мирошкина Любовь Владимировна Иммунологические предикторы эффективности терапии блокаторами фактора некроза опухоли альфа у детей с воспалительными заболеваниями кишечника 14.03.10 –Клиническая лабораторная диагностика Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор С.В. Петричук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор А.С. Потапов Москва - 2014 2 Оглавление ВВЕДЕНИЕ ...................................................................................................................... 4 ГЛАВА 1. Современные подходы к диагностике и терапии воспалительных заболеваний кишечника у детей (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) ...................................... 15 1.1. Особенности этиологии, патогенеза и клинические проявления воспалительных заболеваний кишечника у детей .................................................. 15 1.2. Диагностика воспалительных заболеваний кишечника .................................. 19 1.3. Принципы лечения воспалительных заболеваний кишечника ................... 22 1.4. Особенности цитокинового профиля при воспалительных заболеваниях кишечника ................................................................................................................... 24 1.5. Патогенетическая роль и информативность исследования клеточного иммунитета при воспалительных заболеваниях кишечника у детей ................... 27 1.6. Диагностика митохондриальной дисфункции при воспалительных заболеваниях кишечника у детей ............................................................................. 31 ГЛАВА 2. Объем и методы исследования .................................................................. 37 2.1. Клинико-лабораторная характеристика обследованных больных ................ 37 2.2. Метод мультиплексного количественного определения цитокинов с использованием проточной цитометрии ................................................................. 41 2.3. Иммуноцитохимический метод определения митохондриальной активности лимфоцитов................................................................................................................. 47 2.4. Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови методом проточной цитофлуориметрии ................................................................................. 53 2.5. Исследование содержания антител к гликопротеину 2 методом твердофазного иммуноферментного анализа. ........................................................ 56 2.6. Статистические методы исследования ............................................................. 58 3 ГЛАВА 3. Результаты исследования ........................................................................... 59 3.1. Цитокиновый профиль как предиктор эффективности терапии блокаторами фактора некроза опухоли альфа у детей с ВЗК ...................................................... 59 3.2. Оценка состояния Т- и В-клеточного звена иммунитета в прогнозе эффективности биологической терапии у детей с ВЗК ......................................... 70 3.3. Динамика иммунологических показателей у пациентов с ВЗК в процессе лечения инфликсимабом ........................................................................................... 84 3.4. Лабораторные маркеры своевременного назначения биологической терапии у детей с ВЗК. ........................................................................................................... 105 3.5. Критерии прогнозирования эффективности блокаторов TNF-α у пациентов с ВЗК .......................................................................................................................... 124 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ........................................................................................................... 139 ВЫВОДЫ ..................................................................................................................... 163 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ..................................................................... 165 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ......................................................................................... 166 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................... 167 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность Болезнь Крона и язвенный колит, объединенные понятием воспалительные заболевания кишечника, в настоящее время являются одной из самых актуальных проблем детской рецидивирующий гастроэнтерологии характер течения во всем ВЗК, мире. высокий Хронический риск оперативных вмешательств, наличие серьезных осложнений обуславливают потребность в разработке новых диагностических подходов и методов лечения болезни Крона и язвенного колита. Этиопатогенез ВЗК до конца не известен, тем не менее ясно, что хроническое толерантности воспаление является результатом к предрасположенных комменсальной лиц микрофлоре [153,117,146]. потери иммунологической кишечника Ключевым у генетически патофизиологическим фактором развития аберрантного иммунного ответа на микробиоту кишечника является гиперпродукция провоспалительных цитокинов активированными дендритными клетками и макрофагами. антигенпрезентирующими клетками Нарушение является синтеза цитокинов триггерным фактором для формирования аутоагрессивных и эффекторных Т-лимфоцитов, что в сочетании с активацией T-хелперов 17 (Th17) и подавлением регуляторных Т-клеток (Treg) приводит к развитию хронического неспецифического воспаления в стенке кишки [43,153]. Выявление высоких концентрации провоспалительных цитокинов, главным образом TNF-α, в биоптатах кишечника пациентов с ВЗК позволило разработать патогенетическую стратегию лечения данных заболеваний – биологическую терапию, включающую применение моноклональных антител, селективно блокирующие TNF-α [92,127,150]. Внедрение биологических препаратов в схему лечения ВЗК позволило значительно увеличить долю пациентов, достигающих стабильной ремиссии в короткие сроки [6,7,68]. Однако у 30% пациентов не удается добиться снижения активности заболевания на фоне применения блокаторов TNF-α, у 10% больных 5 развиваются серьезные инфекционные осложнения, кроме того применение биологических препаратов ассоциировано с развитием острых аллергических реакций, представляющих угрозу для жизни пациента [115,142,153]. Наиболее актуальной проблемой при лечении пациентов с ВЗК биологическими препаратами является потеря чувствительности к терапии. К числу причин вызывающих развитие толерантности к селективным блокаторам TNF-α, относят выработку собственных антител к препарату, а также вовлечение TNF-α-независимых путей патогенеза ВЗК. Персонифицированный подход к выбору биологического препарата и подбору режима дозирования является важнейшим условием успешного применения генно-инженерных препаратов [25,26]. Потребность в разработке прогностических критериев эффективности биологической терапии обусловлена, прежде всего, необходимостью выявления доклинических признаков недостаточного терапевтического ответа у конкретного пациента. Ранний прогноз недостаточной эффективности биологической терапии позволяет провести своевременную коррекцию схемы лечения, тем самым существенно снизить риск экстренных хирургических вмешательств и серьезных осложнений ВЗК. Кроме того, увеличение клинической эффективности биологической терапии у детей с ВЗК позволяет существенно повысить экономическую эффективность лечения данных заболеваний. В связи с особенностями иммунопатогенеза ВЗК и высокой специфичностью биологической терапии в качестве предикторов эффективности блокаторов TNF-α у детей с ВЗК представляется актуальным изучение ряда иммунологических показателей. Имеются данные о прогностической значимости определения содержания ряда цитокинов до начала лечения инфликсимабом у взрослых пациентов с ВЗК. Так в работах Ogawa K и др. 2012, Antonio Di Sabatino и др. 2010 в качестве предикторов эффективности биологической терапии выбраны сывороточные концентрации IL-23, IL-17А, IFN-γ и IL-6, TGF-β до начала лечения инфликсимабом [79,132]. 6 Принимая во внимание, что одним из центральных звеньев патогенеза ВЗК является потеря иммунологической толерантности организма, в настоящее время активно изучается диагностическая и прогностическая значимость определения маркеров аутоиммунного воспаления у пациентов с БК и ЯК. В настоящее время выявлена информативность определения антител к Saccharomyces cerevisiae, антинейтрофильных антител в отношении прогноза эффективности биологической терапии у взрослых пациентов с ВЗК. Показана значимость определения антител к экзокринной части поджелудочной железы, антител к гликопротеину 2 (anti-GP2) у пациентов с ВЗК в оценке воспалительной активности заболевания [60,147]. Исследование содержания и функциональной активности популяций лимфоцитов, играющих важную патогенетическую роль в развитии ВЗК, прежде всего Th17-лимфоцитов, регуляторных Т-лимфоцитов, активированных Тхелперов, выявило диагностическую значимость данных показателей при оценке воспалительной активности заболевания [71,79,157]. Интенсивно изучается роль популяций В-лимфоцитов и информативность их определения при ВЗК [81,88,126]. Единичные работы посвящены анализу прогностической значимости определения показателей клеточного иммунитета при ВЗК. Так, в настоящее время показана информативность определения количества циркулирующих регуляторных Т-лимфоцитов в прогнозе эффективности инфликсимаба у взрослых пациентов с БК [79]. Современные представления о патогенезе ВЗК диктуют необходимость использования новых методов диагностики, направленных на изучение процессов, происходящих на клеточном и субклеточном уровне. В настоящее время получены убедительные доказательства роли митохондриальной дисфункции в патогенезе ВЗК [47,73,110,144,155]. Выявление прямых и косвенных признаков оксидативного стресса в клетках слизистой оболочки кишки и лейкоцитарных инфильтратах непосредственно свидетельствует о нарушении нормальной работы митохондриального аппарата у пациентов с ВЗК [73,144,151,155,160]. Ключевым ферментом, отражающим активность клеточного 7 дыхания, является сукцинатдегидрогеназа (СДГ). Фермент прочно фиксирован на внутренней мембране митохондрий и обладает уникальным свойством: с одной стороны СДГ является II комплексом дыхательной цепи митохондрий, в то же время фермент катализирует реакцию окисления сукцината в фумарат в цикле Кребса [176]. Особенность функционирования и локализация СДГ позволило разработать диагностический подход к оценке интенсивности работы митохондриального аппарата на основе определения активности данного фермента [22, 30]. Диагностическая значимость определения СДГ при разных патологиях показана во многих работах [2,11,14,16,19,22,30,31,32,111,149,151].Выявлена информативность определения активности СДГ в периферических лимфоцитах при ВЗК и других патологиях ЖКТ у детей [13,19,24,111]. Таким образом, оценка иммунологических параметров, в частности определение популяций цитокинового лимфоцитов профиля, и их исследование функциональной состояния активности различных является перспективным в связи с потенциальной возможностью выявления новых лабораторных маркеров активности заболевания и прогноза эффективности биологической терапии. Цель исследования Разработать лабораторные критерии прогноза эффективности терапии блокаторами фактора некроза опухоли альфа у детей с ВЗК. Задачи исследования 1. Выявить особенности цитокинового профиля у детей с ВЗК при различной эффективности биологической терапии. 2. Определить информативность митохондриальной активности показателей популяций клеточного лимфоцитов иммунитета в и прогнозе эффективности терапии блокаторами фактора некроза опухоли альфа у детей с ВЗК. 8 3. Оценить динамику иммунологических показателей у детей с ВЗК в течение первого года биологической терапии 4. Выявить лабораторные предикторы своевременного назначения биологической терапии у детей с ВЗК 5. Разработать многопараметрический алгоритм прогнозирования эффективности биологической терапии у детей с ВЗК на основании лабораторных показателей Научная новизна Впервые оценено значение содержания широкого спектра циркулирующих цитокинов (IL-1β, IL-2, IL-8, IFN-γ, TNF-α, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL17A, IL-21, IL-22, IL-23, TGF-β) в прогнозе эффективности биологической терапии у детей с ВЗК. Определены пороговые уровни концентраций TNF-α, IL-4, IFN-γ, IL-12p70, TGF-β, позволяющие с высокой точностью прогнозировать эффективность терапии инфликсимабом у детей с ВЗК. Показана информативность комплексной оценки состояния Т- и Вклеточного звена иммунитета у пациентов с ВЗК в прогнозе эффективности биологической терапии. Выявлена прогностическая значимость определения исходного содержания В-лимфоцитов, Th17-лимфоцитов, активированных Т- хелперов у детей с ВЗК при оценке эффективности биологической терапии. Исследована активность сукцинатдегидрогеназы в основных и малых популяциях лимфоцитов у детей с ВЗК и доказана информативность определения активности СДГ в популяции Treg лимфоцитов, Т-хелперах и В1-лимфоцитах в прогнозе эффективности инфликсимаба у детей с ВЗК. Проведено длительное, более одного года, динамическое наблюдение расширенного цитокинового профиля, данных иммунофенотипа лимфоцитов, показателей митохондриальной активности популяций лимфоцитов периферической крови и содержания anti-GP2 антител у детей с ВЗК, имеющих различный терапевтический ответ на инфликсимаб. 9 Впервые на основании патогенетически значимых иммунологических показателей разработана комплексная модель прогнозирования эффективности блокаторов TNF-α у детей с ВЗК. Теоретическая и практическая значимость В работе показана значимость определения концентрации TNF-α у детей с ВЗК до начала лечения препаратами, селективно блокирующими TNF-α, позволяющая персонифицировать подбор тактики лечения. Доказана информативность комплексной оценки состояния клеточного иммунитета у пациентов с ВЗК до начала биологической терапии с целью прогнозирования ее эффективности и проведения своевременной коррекции. Выявлена значимость определения СДГ в популяциях Treg лимфоцитов, Т-хелперах и В1-лимфоцитах периферической крови при оценке эффективности терапии инфликсимабом. Исследованы закономерности изменения цитокинового количественных характеристик и митохондриальной активности профиля, популяций лимфоцитов периферической крови, содержания anti-GP2 антител на фоне биологической терапии, позволяющие оценить характер влияния блокаторов TNF-α на лабораторные иммунологические показатели у детей с разным эффектом терапии. В работе продемонстрированы объективные доказательства необходимости раннего назначения биологической терапии у детей с ВЗК с целью повышения ее эффективности. Разработан эффективности многопараметрический биологической терапии алгоритм у детей с прогнозирования ВЗК, позволяющий персонифицировано подходить к выбору тактики лечения и, тем самым, существенно улучшить качество жизни пациента. 10 Положения, выносимые на защиту 1. Выявлено, что определение концентрации TNF-α в плазме до начала биологической терапии у детей с ВЗК позволяет прогнозировать эффективность лечения в течение первого года. 2. Показано, что оценка количественных показателей основных и малых популяций лимфоцитов и их митохондриальной активности является информативной в прогнозе эффективности биологической терапии у детей с ВЗК. 3. Установлено, что с увеличением длительности заболевания наблюдается снижение концентрации про- и противовоспалительных цитокинов, снижение митохондриальной активности основных популяций лимфоцитов, снижение содержания NK-клеток, нарастание титра antiGP2 антител. 4. Разработан комплексный прогностический коэффициент, позволяющий с высокой вероятностью (97%) прогнозировать эффективность биологической терапии селективными блокаторами TNF-α у детей с ВЗК. Методология исследования Использованные автором современные аналитические методы и системный подход, обеспечивающие достоверность и обоснованность полученных результатов, полностью соответствуют принципам доказательной медицины. Научная работа проводилась с соблюдением всех правил научных исследований и основывалась на принципах биоэтики. Теоретическая и методологическая основа работы состояла в поиске и анализе фундаментальных и прикладных исследований по изучаемой проблеме, подтверждающих предположение об информативности исследования иммунологических показателей в прогнозе эффективности биологической терапии ВЗК у детей. Для реализации поставленной цели были использованы клинические и лабораторные методы исследования, позволяющие объективно оценить диагностическую и прогностическую значимость иммунологических параметров в анализе эффективности терапии блокаторами TNF-α у детей с ВЗК. 11 Выполнен сбор и систематизация материалов исследования, проведен адекватный статистический анализ данных, позволяющий сделать обоснованные выводы. Соответствие диссертации области исследования Область диссертационного исследования Мирошкиной Л.В. совершенствование методов прогнозирования эффективности включает терапии блокаторами TNF-α на основе комплексной оценки лабораторных показателей для оптимизации проводимой терапии и соответствует формуле специальности 14.03.10 «Клиническая лабораторная диагностика». Соответствие диссертации Паспорту научной специальности В соответствии с Паспортом специальности 14.03.10 – «Клиническая лабораторная диагностика» (медицинские науки), представленная Мирошкиной Л.В. диссертационная работа, является исследованием информативности лабораторных параметров в прогнозе эффективности терапии блокатором TNF-α у детей с ВЗК. Разработан многопараметрический алгоритм прогнозирования эффекта биологической терапии у детей с ВЗК, позволяющий персонифицировано подходить к выбору тактики лечения и значительно увеличить эффективность терапии инфликсимабом. (п.1 Лабораторные исследования для диагностики и заболеваний, характеристики тяжести, периода и срока болезни, прогноза, контроля за лечением иммунокорригирующей и его терапии, п.7 результатами, Методы п.4.Мониторинг лабораторной диагностики. Определение диагностической информативности лабораторных тестов и их колебаний). Показана информативность определения иммунологических и цитохимических показателей в прогнозе эффективности биологической терапии у детей с ВЗК (п.3. Цитохимические маркеры клеток, их особенности. Морфологические и цитохимические изменения клеток биожидкостей при воспалительных и иммунных патологических процессах, п. 4 Иммунологические исследования, п.7 Методы лабораторной диагностики. Определение 12 диагностической информативности лабораторных тестов и их колебаний). Проведен динамический анализ иммунологических показателей в течение первого года биологической терапии, а также изменение иммунологических и цитохимических параметров в зависимости от длительности терапии и чувствительности к базисной патогенетической терапии (п.2. Лабораторные показатели, их соотношение в различных заболеваниях и зависимость от степени поражения органов, систем и клеток, течения патологического процесса). Личный вклад автора Автором проанализированы современные данные литературы по теме диссертации, сформулированы цели и задачи работы, выбраны методы и подходы, отвечающие реализации поставленных задач. Автором выполнен сбор и обработка клинических данных, проведены оценка концентрации мультиплексным методом циркулирующих с цитокинов использованием количественным проточной цитометрии, иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови, определение активности сукцинатдегидрогеназы в популяциях лимфоцитов иммуноцитохимическим методом, исследование содержания anti-GP2 антител, осуществлена статистическая обработка полученных данных и их описание. Автором самостоятельно написан текст диссертации и автореферата. Реализация результатов работы С 2012г. в практику гастроэнтерологического отделения с гепатологической группой НИИ Педиатрии им. Г.Н. Сперанского и отделения восстановительного лечения детей с болезнями органов пищеварения НИИ профилактической педиатрии и восстановительного лечения ФГБУ «Научный центр здоровья детей» РАМН г. Москвы внедрены методы оценки прогноза эффективности терапии блокаторами TNF-α у детей с ВЗК. Определение прогностического коэффициента К, учитывающего исходную плазменную концентрацию TNF-α, относительное содержание Th17-лимфоцитов (% от CD3+CD4+) и активность СДГ в популяции 13 Treg лимфоцитов периферической крови, предложено использовать при оценке прогноза эффективности инфликсимаба у детей с ВЗК до начала лечения, а также для мониторинга активности заболевания в процессе лечения. Комплексная оценка определение состояния клеточного иммунитета, включающая количественных характеристик и митохондриальной активности основных и малых популяций лимфоцитов периферической крови, внедрена в качестве дополнительного диагностического исследования при оценке активности заболевания у детей с ВЗК. Получено положительное решение о заявке на получение патента «Способ прогнозирования эффекта терапии инфликсимабом у детей с болезнью Крона» (от 11.07.2013 входящий № 047833, рег.№ 2013132028). Апробация работы Апробация работы состоялась на совместном заседании лабораторного отдела, гастроэнтерологического отделения с гепатологической группой НИИ Педиатрии им. Г.Н.Сперанского, а также НИИ Профилактической педиатрии ФГБУ «Научный центр здоровья детей» РАМН, ФГБУН Московский научноисследовательский Г.Н.Габричевского, институт ФГБУН эпидемиологии Институт и молекулярной микробиологии биологии им. им. В.А. Энгельгардта РАН, кафедры Клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России, ФГБУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН 23 декабря 2013 года. Основные положения диссертации были доложены на научно-практических конференциях: 4th European Congress of paediatricians – Europaediatrics-2009 (Москва, 2009), XVI Российская Гастроэнтерологическая Неделя (Москва, 2010), XVII Всероссийская научно-практическая конференция «Интеграция в лабораторной медицине» (Москва, 2012), III Российская конференция с международным участием «Проблемы нарушения клеточной энергетики Митохондриальная патология» (Москва, 2012), XVIII Российская Гастроэнтерологическая Неделя (Москва, 2012), 8th Congress of ECCO 14 Inflammatory Bowel Diseases (Vienna, Austria, 2013), Congress of pediatrics - ICP 2013 (Melbourne, Australia, 2013), Объединенный иммунологический форум (Нижний Новгород, 2013), XVII форум «Национальные дни лабораторной медицины (Москва, 2013), 38th FEBS Congress (Санкт-Петербург, 2013), 9th Congress of ECCO Inflammatory Bowel Diseases (Copenhagen, Denmark 2014). По материалам исследования опубликовано 22 печатные работы, в том числе 4 статьи в журналах, входящих в перечень изданий, рекомендованных ВАК. Объем и структура диссертации Диссертация иллюстрирована изложена на 182 страницах машинописного текста, 47 таблицами и 55 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов, главы, посвящѐнной результатам собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Список литературы содержит 181 источник (42 отечественных и 139 зарубежных). 15 ГЛАВА 1. Современные подходы к диагностике и терапии воспалительных заболеваний кишечника у детей (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 1.1. Особенности этиологии, патогенеза и клинические проявления воспалительных заболеваний кишечника у детей Воспалительные заболевания кишечника у детей Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), к которым, согласно МКБ10 (Класс ХI), относятся болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК) представляют собой хронические, рецидивирующие неинфекционные заболевания желудочнокишечного тракта, приводящее к необратимому нарушению его структуры и функции [40]. Примерно у 30% пациентов манифестация ВЗК происходит до достижения 18-летнего возраста [7]. В детском возрасте ВЗК отличаются тяжестью течения, большим количеством осложнений, негативным влиянием на рост и развитие организма [42]. Нозологии включенные, в ВЗК, различаются глубиной, распространенностью и локализацией воспалительного процесса. БК характеризуется трансмуральным гранулематозным воспалением с сегментарным поражением ЖКТ [5]. Воспалительный процесс при БК локализуется преимущественно в кишечнике, однако может поражаться любой отдел пищеварительного тракта. ЯК представляет собой диффузное воспаление слизистой оболочки толстой кишки с ее язвенно-деструктивными повреждением. Характерной особенностью ЯК является инициация воспалительного процесса в прямой кишке с последующим распространением в проксимальном направлении толстой кишки [21,39,97]. В настоящее время парадигма деления ВЗК на БК и ЯК подвергается сомнению, в виду распространенности промежуточных патологических форм. Так, утверждается о существовании множества подтипов ВЗК, патогенетически отличающихся механизму и фенотипически [54,130,177]. по ведущему иммунологическому соответствующих разным формам патологии 16 Эпидемиология Распространенность ВЗК в различных странах варьирует в широких пределах, наибольшая частота встречаемости наблюдается в северной Европе и северной Америке. По данным эпидемиологических исследований последних лет частота ЯК в мире колеблется от 30 до 240 на 100 тыс. населения, в России составляет 22,3 на 100 тыс. Распространенность БК в мире варьирует от 10 до 150 на 100 тыс. населения, в России –3,5 на 100 тыс. населения [21,41,56]. Распространенность ВЗК среди детского населения в мире составляет 2,26,8 на 100 тыс. населения. У детей младше 10 лет чаще встречается ЯК, чем БК, при этом отмечается тенденция к неуклонному росту со значительным "омоложением" обеих патологий [42,56]. Гендерное распределение отражает бόльшую распространенность БК среди мальчиков, в случае ЯК частота встречаемости у детей обоих полов одинакова. Этиология и патогенез ВЗК Этиопатогенез ВЗК в настоящего времени до конца не известен, тем не менее, очевидно, что развитие хронического воспаления происходит в результате срыва толерантности иммунной системы к микробиоте кишечника под действием триггерных факторов. Несостоятельность эпителиального барьера кишечника приводит к тесному контакту антигенпрезентирующик клеток (АПК) с бактериальными антигенами микрофлоры, ограниченному в норме рядом защитных факторов [1,5,116, 146,153]. Активация АПК сопровождается мощным выбросом провоспалительных цитокинов (TNF-α, IL-1β, IL-6, IFN-γ и др.), которые привлекают в очаг нейтрофилы и Т-лимфоциты [43]. Инициация Тклеточного ответа при ВЗК характеризуется синтезом расширенного спектра провоспалительных цитокинов, интенсивной пролиферацией активированных Тхелперов и Th17-лимфоцитов, что в сочетании с подавлением функций регуляторных Т-лимфоцитов и ингибированием продукции противовоспалительных медиаторов ведет к последующей активации АПК и потенцированию воспалительного процесса [43,153]. 17 Значимую роль в развитии неконтролируемого хронического воспаления при ВЗК играет генетическая предрасположенность индивида [58,116]. В пользу наследственных факторов свидетельствует частое выявление болезни у однояйцевых близнецов и родных братьев [133]. Примерно в 20 % пациентов с ВЗК имеются близкие родственники, страдающие данными заболеванием. К настоящему времени существует ассоциированных с развитием ВЗК. целый ряд генов-кандидатов Наиболее изученным являются гены, регулирующие работу иммунной системы, например, локус гена NOD2/CARD15 – IBD1 (16 хромосома). У пациентов с БК выявлена повышенная частота мутаций данного гена, кодирующего синтез NOD2, секретируемого антимикробного цитозольного пептида в макрофагах, нейтрофилах, дендритных клетках. Наличие в структуре данного белка лейцин-богатых повторов облегчает распознавание мурамил-дипептида – пептидогликанового компонента бактериальной стенки – и, тем самым, позволяет индуцировать адекватный иммунный ответ [63,103,181]. Показана роль врожденных дефектов фагоцитарной системы нейтрофилов, системы компонента комплемента в патогенезе ВЗК [21,179]. Признание существенного вклада патологии врожденного иммунитета в развитии БК и ЯК послужило основой для возникновения альтернативного взгляда на этиологию ВЗК – рассмотрение данной нозологии как формы врожденного иммунодефицита [178]. Другая иммунологическая теория ассоциирует возникновение ВЗК с развитием аутоиммунных процессов, приводящих к перекрѐстным реакциям с клетками кишечного эпителия. В пользу данной теории свидетельствует обнаружение высоких титров аутоантител в биологических материалах, полученных от больных с ВЗК, например антинейтрофильных антител, антител к Saccharomyces cerevisiae, антител к экзокринной части поджелудочной железы, антител к гликопротеину 2(anti-GP2), антитела к бокаловидным клеткам [60,147]. Иным направлением этиологического поиска стало исследование роли оксидативного стресса в развитии хронического воспаления при БК и ЯК. К 18 данным, подтверждающим наличие оксидативного стресса у пациентов с ВЗК, относят снижение активности ферментов дыхательной цепи в клетках слизистой оболочки кишки, обнаружение высоких концентраций активных форм кислорода и продуктов их окисления в различных биологических материалах (сыворотка и плазма крови, слюна, материалы биопсии), полученных от пациентов с ВЗК , обнаружение дефицита антиоксидантов, таких как витамин С, витамин Е, βкаротин, глутатион [102,119,144,160,169]. Выявлены случаи сочетания генетически-доказанной первичной митохондриальной недостаточности и БК [143]. Таким образом, в настоящее время активно обсуждается ведущая этиологическая роль митохондриальной дисфункции и оксидативного стресса в формировании патогенетического каскада ВЗК. К триггерам, инициирующим развитие ВЗК у генетически предрасположенных лиц, относят главным образом, факторы, активирующие работу иммунной системы: инфекционные заболевания, вакцинация, инсоляции, а также прочие внешние факторы – курение, погрешности в диете[21]. Клинические проявления Клинические симптомы при ВЗК включают общевоспалительные симптомы, кишечные симптомы и внекишечные проявления. К симптомам общего воспаления относят лихорадку, слабость, отсутствие аппетита. Кишечные симптомы при ВЗК выражены в наибольшей степени и отличаются своим разнообразием. У пациентов наблюдаются абдоминальные боли, снижение массы тела, нарушение стула в виде его учащения, изменения консистенции, наличия патологических примесей. В целом доминирование того или иного симптома определяется локализацией поражения ЖКТ. Внекишечные проявления возникающие при ВЗК, весьма многообразны, и могут включать в себя поражения кожи (узловатая (иридоциклиты, анкилозирующий эритема, увеиты), гангренозная пиодермия), опорно-двигательного спондилит), тяжелые аппарата поражения склерозирующий холангит) и другие [39,50,80]. органов печени зрения (моноартриты, (первичный 19 1.2. Диагностика воспалительных заболеваний кишечника Диагноз «воспалительные заболевания кишечника» устанавливается на основании характерной клинической картины заболевания, данных лабораторных анализов, результатов эндоскопического, рентгенологического и гистологического исследований [27,28] (Рис.1.1.1). Рис.1.1.1 Диагностический алгоритм обследования пациентов с ВЗК Важным этапом при постановке диагноза «воспалительные заболевания кишечника» является тщательный сбор анамнеза, позволяющий выявить наследственную предрасположенность к заболеванию, и подробное физикальное обследование, демонстрирующее выраженность клинических симптомов и наличие внекишечных осложнений [5,43,50]. Лабораторные исследования включают проведение гемограммы, биохимического анализа крови, коагулограммы, клинического анализа мочи, серологических исследований крови, микробиологических исследований кала, копрограммы, исследование содержания кальпротектина в кале [27,28,170]. У 20 больных с ВЗК выявляют характерные воспалительные изменения в стандартных лабораторных анализах, диагностируют дефицит микронутриентов, гипопротеинемию, нарушения водно-электролитного баланса. Исследование кала также подтверждает наличие активного воспалительного процесса, синдромов мальабсорбции и мальдигестии. Концентрация кальпротектина в кале коррелирует с тяжестью состояния и эндоскопической активностью ВЗК. Микробиологическое исследование кала у пациентов с ВЗК направлено но косвенную оценку состава микробиоты кишечника. Наиболее информативными лабораторным показателям тяжести состояния пациентов с ВЗК считают концентрацию C-реактивного белка, СОЭ, содержание кальпротектина в кале; несколько меньшей информативностью обладают количество лейкоцитов, тромбоцитов, гематокрит, концентрации фибриногена и альбумина в крови [158,161,166,170]. Данные лабораторных анализов позволяют оценить степень активности воспалительного процесса и вычислить значение международных индексов активности заболевания. В педиатрической практике используется два индекса активности ВЗК: PCDAI (Pediatric Crohn's Disease Activity Index) – педиатрический индекс активности болезни Крона и PUCAI (Pediatric Ulcerative Colitis Activity Index – педиатрический индекс активности язвенного колита. Индексы включают в себя оценку клинических симптомов, таких как выраженность абдоминального синдрома, характер нарушения стула, наличие осложнений, степень снижение рост-массовых показателей и др., и учитывают следующие лабораторные показатели: СОЭ, гематокрит, сывороточная концентрация альбумина. Шкалы являются количественными, что делает удобным использование индексов при динамическом наблюдении пациентов с ВЗК [100,166]. Рентгенологическая диагностика ВЗК оценивает протяженность и характер поражения кишечника, вовлечение в процесс разных отделов ЖКТ, наличие глубоких язв-трещин, внутренних свищей, ретроперитонеальных абсцессов, стенозов и др. [5, 42,128]. 21 Решающую роль в постановке окончательного диагноза играют эндоскопические и гистологические данные, которые напрямую отражающие характер поражения кишечной стенки [62]. Патологический процесс при БК чаще всего локализуется в илеоцекальной области (терминальный илеит), хотя может располагаться в любом отделе пищеварительного тракта. В подслизистой оболочке кишки формируются инфильтраты, которые в сочетании с глубокими язвами и эрозиями создают характерный рельеф слизистой оболочки, так называемый "рельеф булыжной мостовой", выявляемый при проведении колоноскопии. Кроме выявления язвенно-деструктивного поражения стенки кишки, эндоскопические методы исследования позволяет диагностировать наличие свищевых ходов и стенозов, образующихся в виду рубцовых изменений. При ЯК воспалительный процесс ограничивается пределами толстой кишки и характеризуется поражением только слизистой оболочки. Эндоскопическое исследование выявляет полнокровие слизистой оболочки с утолщением и сглаженностью складок и выраженной контактной кровоточивостью, наличие псевдополипов [62, 104, 117, 128]. Гистологическое исследование материалов биопсии является «золотым стандартом» диагностики ВЗК, так как позволяет выявить признаки хронического воспаления – лимфоплазмоцитарную инфильтрацию и атрофию слизистой оболочки, дистрофию и атрофию покровного эпителия – даже у больных, не имеющих клинических, эндоскопических и рентгенологических признаков заболевания [21,41]. Гистологическая картина при БК характеризуется также выраженной инфильтрацией собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы лимфоидными клетками, наличием васкулита и гранулем, состоящих из скоплений лимфоцитов, в центре которых находятся гигантские клетки типа Пирогова–Лангханса. При ЯК выявляется воспалительное повреждение в пределах слизистой оболочки: отек собственной пластинки, кровоизлияния и инфильтрация слизистой оболочки лимфоцитами, нейтрофилами и эозинофилам, уплощение поверхностного эпителия, существенное уменьшение 22 числа бокаловидных клеток, деструкция крипт, формирование крипт-абсцессов [96, 104,114]. Таким образом, существующий алгоритм диагностики ВЗК является многоступенчатым и позволяет оценить активности воспалительного процесса на всех уровнях поражения. Однако современные диагностические подходы оставляют неразрешенной проблему диссоциации клинических, эндоскопических и гистологических данных: клиническая активность заболевания не соответствует гистологической в 70%, а эндоскопическая – в 50% случаев [5,41]. Крайне низкий уровень преемственности данных, получаемых при клинико-лабораторном, эндоскопическом и гистологическом исследованиях, ставит проблему разработки новых диагностических подходов на одно из первых мест при изучении данных патологий. 1.3. Принципы лечения воспалительных заболеваний кишечника Лечение детей с ВЗК включает в себя консервативный и хирургический подходы и определяется характером течения заболевания, возрастом ребенка, локализацией воспалительного процесса и пр. Базисная патогенетическая терапия ВЗК включает три группы лекарственных препаратов: препараты 5–аминосалициловой кислоты (5–АСК), кортикостероидные гормоны (ГКС), и иммуносупрессоры. Для лечения ВЗК с легким течением применяет 5–АСК (сульфасалазин, месалазин), антибактериальные препараты. При тяжелом и среднетяжелом течение заболевания используют ГКС (преднизолон и его метилированные аналоги, гидрокортизон, будесонид) и препараты с цитостатическим действием (азатиоприн, метотрексат) [3,4,21,56]. Несмотря на выраженное противоспалительное и иммуносупрессивное действие, у 30% пациентов с ВЗК применение базисной патогенетической терапии, включающей использование ГКС и цитостатиков, не дает должного эффекта [70,125, 154,159]. Существующие представления о сдвиге цитокинового баланса в сторону гиперпродукции провоспалительных цитокинов, как о ключевом 23 патофизиологическом факторе развития аберрантного иммунного ответа послужило основой для внедрения селективных блокаторов TNF-α в терапию ВЗК [40,92,116,127,146,153]. Применение блокаторов TNF-α (инфликсимаб) позволило значительно увеличить долю пациентов, достигающих стабильной ремиссии в короткие сроки, однако у трети пациентов не наблюдается стойкого эффекта от инфликсимаба, в виду потери чувствительности к препарату, кроме того биологических препаратов ассоциировано с развитием серьезных инфекционных осложнений и острых аллергических реакций, представляющих угрозу для жизни пациента [132,142,153]. К числу причин, вызывающих развитие толерантности к блокаторам TNF-α, относят выработку антител к препарату, а также вовлечение TNF-α-независимых путей патогенеза ВЗК [17,51,132,181]. Потребность в разработке прогностических критериев эффективности биологической терапии обусловлена, прежде всего, необходимостью выявления доклинических признаков недостаточного терапевтического ответа у конкретного пациента. Ранний прогноз недостаточной эффективности биологической терапии позволяет провести своевременную коррекцию схемы лечения, тем самым существенно снизить риск серьезных осложнений ВЗК и повысить клиническую и экономическую эффективность лечения. Известные терапии способы прогнозирования эффективности биологической у пациентов с ВЗК включают анализ клинических, лабораторных, эндоскопических и фармакокинетических данных. В качестве предикторов, как правило, используются показатели, коррелирующие с воспалительной активностью заболевания. К клиникоанамнестическим предикторам относят продолжительность заболевания, форму патологии, наличие у пациента в анамнезе хирургического вмешательства по поводу осложнений ВЗК [134,172]. Прогностические возможности лабораторных тестов показаны на примере определение сывороточного содержания антинейтрофильных антител [165]. В настоящее время широко изучается способы прогнозирования эффективности фармакокинетических параметров, инфликсимаба, таких как основанные остаточная на оценке сывороточная 24 концентрация инфликсимаба и определение уровня антител к препарату [123]. Перечисленные прогностические параметры обладают рядом ограничений, т.к. не позволяют оценить прогноз биологической терапии до ее начала, исключают возможность построения прогноза в динамике лечения и разрабатывались для взрослых пациентов с ВЗК. Таким образом, в настоящее время не выявлены информативные показатели, позволяющие с высокой точностью прогнозировать эффективность биологической терапии у детей на начальных этапах лечения. 1.4. Особенности цитокинового профиля при воспалительных заболеваниях кишечника Цитокины являются ключевыми сигнальными молекулами, регулирующими работу интестинальной иммунной системы и обеспечивающие поддержание так называемого «контролируемого воспаления» в кишечнике [153]. Важную роль в формировании интестинального барьера играют IL-12 , IL-1β, TNF-α, IFN-γ, TGFβ, IL-17, IL-22, IL-23. Цитокиновый баланс слизистой оболочки кишечника строго регулируется клетками иммунной системы, прежде всего макрофагами собственной пластинки, дендритными клетками и Т-лимфоцитами. У пациентов с ВЗК наблюдается сдвиг естественного баланса цитокинов, приводящий к потере иммунологической толерантности к комменсальной микрофлоре кишечника. В основе развития аберрантного иммунного ответа на микробиоту лежит гиперпродукция провоспалительных цитокинов (TNF-α, IL-1β, IL-8, IL-6, IL-12) активированными дендритными клетками и макрофагами слизистой оболочки [116,153]. Нарушение синтеза цитокинов антигенпрезентирующими клетками является триггерным фактором для формирования аутоагрессивных и эффекторных Т-лимфоцитов, что в сочетании с активацией Th17-лимфоцитов и подавлением Treg лимфоцитов приводит к формированию воспалительного лимфоцитарно-плазмоцитарного инфильтрата и гранулем [43,146,153]. Многочисленные экспериментальные и клинические данные свидетельствуют, что иммунопатогенеза БК и ЯК отличаются между собой 25 уровнем дифференцировки и активации Т-клеточного звена иммунитета [40], однако новейшие исследования ставят под сомнение парадигму о делении ВЗК на две нозологические формы. Обсуждается существование множества подтипов воспалительных заболеваний кишечника, отличающихся по ведущему патогенетическому механизму и, соответственно, реализующихся в различные фенотипические формы патологии. Согласно такому представлению ВЗК следует дифференцировать по глубине и степени поражения слизистой оболочки кишечника, преобладающему фенотипу, а также наличию внекишечных проявления [130]. В настоящее время известно, что цитокиновый профиль пациентов с БК и ЯК характеризуется гиперпродукцией провоспалительных цитокинов (TNF-α, IL1β, IL-12, IL-6,INF-γ, IL-23) на фоне снижения синтеза иммуносупрессивных цитокинов, например IL-10 и TGF-β. Экспериментально показано, что синтетическая активность Т-лимфоцитов, полученных из слизистой оболочки толстой кишки пациентов с ЯК, характеризуется увеличением продукции IL-5, IL4, IL-13, что типично для Тh2-опосредованного иммунного ответа [92]. Доминирующим типом иммунного ответа при БК считается Th1-опосредованный ответ, сопряженный с гиперпродукцией IL-2, IFN-γ, IL-12, IL-15, IL-23 [92,127,146,153]. В последнее время продуцирующих его Th17-лимфоцитов активно изучается роль IL-17 и в патогенезе ВЗК. Согласно данным исследований содержание Th17-лимфоцитов в стенке кишки пациентов с БК значительно увеличено – это приводит к увеличению синтеза IL-17, который в свою очередь является мощным хемоаттрактантом для нейтрофилов и индуктором синтеза IL-6 и TNF-α [92]. Особенности цитокинового профиля у детей с ВЗК были показаны в работе Pak и др. (2012), выявивших, наблюдается гиперпродукция что у детей с БК, так же как у взрослых, TNF-α и IL-4 CD4+ Т-лимфоцитами периферической крови, при этом концентрации продуцируемых цитокинов у взрослых в два раза превосходила таковую у детей. Полученные данные 26 позволили авторам предположить вовлечение альтернативных патогенетических путей при развитии ВЗК в детском возрасте [135]. Диагностическая значимость цитокинового профиля в оценке тяжести состояния пациентов с ВЗК в настоящее время активно изучается. Показаны корреляции сывороточной концентрации IL-8, IL-6 лабораторной и IL-22 с клинико- и эндоскопической активностью ВЗК, содержанием TGF-β и наличием фиброза у пациентов с БК и др. [130]. Особый интерес представляет оценка информативности определения концентрации TNF-α в рамках поисках новых лабораторных маркеров активности воспалительного процесса. Изучению данного вопроса посвящено множество научных работ, данные которых зачастую противоречат друг другу [64,113,129,141]. В ряде исследований показана значимая зависимость между клинико-эндоскопической активностью заболевания и содержанием TNF-α в сыворотке пациентов с БК [64,141]. Данные других исследований не подтверждают увеличение концентрации TNF-α у пациентов с ВЗК в период обострение по сравнению с ремиссией заболевания, в том числе на фоне применения инфликсимаба [113,129]. Сравнение концентрации циркулирующих цитокинов у пациентов с ВЗК и условно здоровых людей в настоящий момент не дало однозначного представления о характере сдвига лабораторных показателей при БК и ЯК. Большая часть исследователей выявили значительное увеличение содержания провоспалительных цитокинов на фоне снижения концентраций противовоспалительных медиаторов в сыворотке пациентов с ВЗК по сравнению с нормальными значениями, что отражает изменения баланса цитокинов в очаге поражения ЖКТ [79,85,108]. Некоторые ученые не подтверждают изменения концентрации циркулирующих цитокинов у пациентов с ВЗК по сравнению со здоровыми людьми [101,132]. Информативность динамики концентрации циркулирующих цитокинов, как предикторов эффективности биологической терапии блокаторами TNF-α у взрослых пациентов, показана в исследовании японских ученых - Kotara Ogawa др.(2012) , выявивших, что значительное увеличение концентрации IL-23, IL- 27 17А,IFN-γ и IL-6 до начала терапии является прогностически неблагоприятным фактором в отношении ответа на терапию инфликсимабом. Концентрация TNF-α до начала биологической терапии в группах пациентов со стойким и нестойким эффектом от инфликсимаба значимо превышала сывороточную концентрацию данного цитокина у здоровых людей, но статистически не отличалась между собой. Любопытно, что в процессе лечения концентрация TNF-α не только не уменьшалась, но даже увеличивалась, при этом клинико-лабораторные показатели воспалительной активности улучшались. При сравнении групп пациентов со стабильным и нестабильным эффектом инфликсимаба авторами отмечена тенденция к развитию стойкого положительного ответа на препарат у пациентов с исходно более высоким содержанием TNF-α [132]. Другим эффективности направлением биологической диагностического терапии является поиска предикторов изучение содержания противовоспалительных цитокинов в сыворотке пациентов с разным ответом на инфликсимаб. Так в работе Antonio Di Sabationo др.(2010) показано значительное увеличение концентрации TGF-β в сыворотке пациентов с нестабильным ответом на препарат, которое расценивается авторами как результат массовой миграции Treg лимфоцитов из слизистой оболочки кишки в периферическое кровообращение [79]. Таким образом, оценка цитокинового профиля у детей с ВЗК является чрезвычайно актуальной в связи с потенциальной возможностью выявления новых лабораторных маркеров активности заболевания и прогноза эффективности лечения. 1.5. Патогенетическая роль и информативность исследования клеточного иммунитета при воспалительных заболеваниях кишечника у детей Этиопатогенез хронического воспаления при ВЗК обусловлен дисрегуляцией нормального иммунного ответа на комменсальную микрофлору кишечника. В физиологических условиях тесное взаимодействие клеток врожденного и адаптивного иммунитета ограничивает развитие 28 неконтролируемого воспаления при контакте с бактериальными антигенами собственной микробиоты [17,168]. Показано, что мутации, приводящие к частичной потери функциональной активности клеток врожденного иммунитета, приводят к гиперпродукции провоспалительных медиаторов и накоплению активированных Т-лимфоцитов в стенке кишки при ВЗК. У пациентов с БК выявлено повышенная частота мутаций гена антимикробного цитозольного пептида NOD2, секретируемого в макрофагах, нейтрофилах, дендритных клетках. Показана роль врожденных дефектов фагоцитирующей системы нейтрофилов, системы компонента комплемента в патогенезе ВЗК [167,179]. Признание существенного вклада патологии врожденного иммунитета в развитии БК и ЯК послужило основой для возникновения альтернативного взгляда на этиологию ВЗК – рассмотрение данной нозологии как формы врожденного иммуннодефицита [179]. Однако существующие в настоящее время факты не оставляют сомнений в том, что ключевую роль в формировании воспалительной реакции при ВЗК играют именно клетки адаптивного иммунитета. Иммуногистохимическое исследование поврежденных участков кишечника, полученных от пациентов с ВЗК, выявило массивную инфильтрацию стенки кишки активированными Т-хелперами [74,87,174]. Миграция лимфоцитов происходит под действием мощного выброса хемоаттрактантов в зоне воспаления, экспрессией молекул адгезии на эндотелиоцитах и интегринов на Тлимфоцитах. Накопления активированных Т-хелперов обусловлено их интенсивной пролиферацией на фоне снижения восприимчивости к сигналам апоптоза. К факторам, ингибирующим апоптотическую гибель Т-лимфоцитов при ВЗК, относят повышенную продукцию IL-2, IL-17, IL-15, IL-6 и др.[127]. Несколько лет назад была установлена особая роль Th17-лимфоцитов и Treg лимфоцитов в патогенезе ВЗК [49,87]. Согласно данным исследований, содержание Th17-лимфоцитов в стенке кишки пациентов с БК значительно увеличено, вследствие чего наблюдается гиперпродукция IL-17A,IL-17F, IL-22, 29 IL-21, IL-26. действием, Цитокины семейства IL-17 обладают провоспалительным являясь мощными хемоаттрактантоми для нейтрофилов и индукторами синтеза IL-6 и TNF-α [92]. Дифференцировка Th17-лимфоцитов происходит при участии IL-1α, IL-6,IL-21,IL-23, TGF-β,IL-12. Большая часть данных цитокинов продуцируется АПК при контакте с бактериальными антигенами [17,156]. Таким образом, порочный патологический круг замыкается дефект интестинального барьера приводит к гиперпродукции провоспалительных цитокинов клетками врожденного иммунитета (макрофагами и АПК), это влечет за собой усиление Т-клеточного ответа с последующим мощным выбросом расширенного спектра провоспалительных медиаторов, которые в свою очередь приводят к привлечению и активации других клеток врожденного иммунитета (прежде всего, нейтрофилов). Treg лимфоциты в настоящее время расцениваются как ключевая популяция, контролирующая состояние Т-клеточного гомеостаза и модулирующая иммунный ответ на аутоантигены в физиологических условиях. Снижение функциональной активности циркулирующих Treg лимфоцитов было показано у пациентов с ревматоидным артритом, псориазом, системной красной волчанкой и рассеянным склерозом [46,86,164,173]. В кишечнике именно Treg лимфоциты играют решающую роль в поддержании толерантности к собственной микробиоте. У иммунологической пациентов с ВЗК выявляется увеличенное содержание Treg лимфоцитов в собственной пластинке слизистой оболочки воспаленного сегмента кишки. Показано, что у детей, страдающих ВЗК, содержания Treg лимфоцитов в очаге воспаления значительно превышает таковое у взрослых, причем данная особенность выявлялась у всех пациентов вне зависимости от получаемой терапии [140]. Диагностическая значимость количественной оценки циркулирующих Treg лимфоцитов в настоящее время активно изучается [140,157,124]. У взрослых пациентов с ВЗК выявлено снижение количества Treg лимфоцитов в дебюте заболевания и последующих обострениях, в то время как стадия ремиссии характеризовалась увеличенным содержанием Treg лимфоцитов в крови 30 [66,124,71]. Любопытно отметить, что корреляции между содержания Treg лимфоцитов в периферической крови и биоптатах пораженного участка кишки описываются частью авторов как прямые, другой частью исследователей показана обратная зависимость [124]. Стадия обострения ВЗК у взрослых пациентов также характеризуется увеличением содержания циркулирующих эффекторных Тлимфоцитов и активированных Т-клеток. Оценка численности периферических Treg лимфоцитов у детей с ВЗК выявила увеличение содержания данных клеток, по сравнению с нормальными значениями у всех пациентов вне зависимости от стадии заболевания [71,124]. Определение численности других популяций лимфоцитов периферической крови у детей с ВЗК выявило увеличенное содержание активированных Тхелперов (CD3+CD4+CD25+) и Т-клеток памяти (CD4+CD45RO+) на фоне снижения численности NK-лимфоцитов вне зависимости от стадии заболевания. Показано, что стадия обострения у детей с ВЗК характеризуется снижением количества Th1-лимфоцитов (CD4+CXCR3+), а то время как в стадии ремиссии наблюдается нормализация данного показателя [71]. Применение биологической терапии, несомненно, оказывает сильное влияние на соотношение популяций лимфоцитов. Показано, что использование инфликсимаба у пациентов с ревматоидным артритом ассоциировано с увеличением содержания цитотоксических Т-лимфоцитов, активированных Тхелперов, циркулирующих Treg лимфоцитов и снижением численности NKклеток в периферической крови [69,86]. Динамическая оценка иммунофенотипа у детей с ВЗК, получающих инфликсимаб выявила постепенное увеличение содержания Th1-лимфоцитов, активированных Т-хелперов и Treg-лимфоцитов к окончанию индукционного курса терапии (6 недель). Предполагается, что увеличение количества циркулирующих Th1-лимфоцитов и активированных Тхелперов обусловлено ингибированием инфликсимабом хоминга Т-лимфоцитов в пораженный участок слизистой кишки [45,89].Увеличение численности Treg лимфоцитов на фоне лечения инфликсимабом предположительно объясняется резистентностью данной популяции к инфликсимаб-индуцированному апоптозу, 31 который был экспериментально доказан на выделенных из периферической крови и материалов биопсии Treg лимфоцитах у детей с ВЗК [45,71,89,145]. Прогностическая значимости определения численности популяций лимфоцитов у детей с ВЗК изучена недостаточно. Единичные работы посвящены поиску прогностических маркеров эффективности биологической терапии у взрослых пациентов. Так в работе Antonio Di Sabatino и др (2010) показано, что у пациентов с БК, имеющих минимальный терапевтический ответ на инфликсимаб наблюдается исходное увеличение численности Treg лимфоцитов [79]. Таким образом, оценка количественных характеристик популяций лимфоцитов у пациентов с ВЗК является чрезвычайно актуальной, в связи с предполагаемой диагностической и прогностической значимостью. 1.6. Диагностика митохондриальной дисфункции при воспалительных заболеваниях кишечника у детей Митохондриальная дисфункция при воспалительных заболеваниях кишечника Современные представления о физиологических механизмах, регулирующих жизнедеятельность клетки, диктуют необходимость рассмотрения патологических процессов с точки зрения нарушения внутриклеточных молекулярных взаимодействий. Согласно данным литературы, митохондриальная дисфункция и оксидативный стресс играют важную роль в патогенезе ВЗК [47,144,155,160]. Снижение активности ферментов дыхательной цепи (II, III, IV комплекса) в материалах биопсии, полученных от пациентов с ВЗК, было показано во многих исследованиях [155,160,169]. Нарушение работы любого участка дыхательной цепи приводит к образованию активных форм кислорода (АФК). В настоящее время доказано, что АФК непосредственно включаются в сигнальные пути клетки, оказывая значительное влияние на все биологические процессы, происходящие в физиологических и патологических условиях. Характер влияния АФК определяется прежде всего их содержанием в клетке: незначительное повышение 32 АФК приводит к гипоксической адаптации с помощью HIF1α-опосредованной регуляции, умеренное увеличение концентрации АФК приводит к формированию воспалительного ответа, значительное превышение содержания АФК в клетке приводит к формированию пор в мембранах митохондрий, активации ATG-4 гена с последующей аутофагией и апоптозом [120]. A.Phillip West и др. (2011) показали, что АФК индуцируют выработку провоспалительных цитокинов в клетках иммунной системы посредством активации RIG-I-подобных рецепторов, митоген активируемых протеинкиназ и инфламмосом [175]. Несколько лет назад был обнаружен механизм индукции синтеза АФК цитокином TNF-α, при этом последний оказывает стимулирующее действие на Ca2+-зависимый путь выработки АФК [72,175]. В физиологических условиях данное взаимодействие носит защитный характер, так как небольшие концентрации АФК способствуют отщеплению TNFα рецептора-1, переводит его в растворенную форму, тем самым снижая тяжесть нарушения микроциркуляции в очаге воспаления [72]. Показано значительное увеличение выработки АФК при рассеянном склерозе, ревматоидном артрите, диабете [67,91,94,120]. Обнаружение высоких концентраций АФК и продуктов их окисления в различных биоматериалах (сыворотка и плазма крови, слюна, материалы биопсии), полученных от пациентов с ВЗК, свидетельствует о выраженном нарушении процессов энергетического обмена при данных патологиях [102,119,160,144]. АФК оказывают плейотропное действие на патогенез ВЗК: показана индукция фосфорилирования NF-κB с последующей выработкой TNF-α, IL-8, IL1-β и др. под влиянием АФК, выявлен хемотаксис нейтрофилов и моноцитов, роллинг лейкоцитов, активация Т-лимфоцитов под воздействием пероксид радикала [47,110,120,175]. Кроме того, аккумуляция АФК в митохондрии приводит к повреждению ядерной и митохондриальной ДНК, что еще больше усугубляет нарушение нормальной работы ферментативных систем [160,163]. Снижение активности митохондриальных ферментов также ассоциировано с неполным катаболизмом поступающих высокомолекулярных соединений, а 33 значит синтезом недостаточного количества АТФ. Принимая во внимание, что ВЗК сопровождаются ярко выраженной нехваткой нутриентов и потерями питательных веществ через поврежденный энтеральный барьер, недостаточность энергетических ресурсов клеток существенно влияет на реализацию репаративных функций организма [22,38,71,108]. В модельном эксперименте ЯК было показано резкое снижение репаративных способностей поврежденной слизистой кишечника при сниженной концентрации АТФ [73]. Важным фактором формирования оксидативного стресса у пациентов с ВЗК является дефицита антиоксидантов, таких как витамин С, витамин Е, β-каротин, глутатион [47,102,110]. В связи с вышеизложенным в настоящее активно обсуждается ведущая этиологическая роль оксидативного стресса в патогенетическом каскаде ВЗК. Сукцинатдегидрогеназа как маркерный фермент митохондрий В настоящее время определяющая роль митохондриального аппарата в успешной реализации биологических функции клетки не вызывает сомнений [22,30,175]. Ферментативные системы митохондрий обеспечивают протекания основополагающих путей метаболизма: фосфорилирования. Ключевым цикла ферментом, Кребса и отражающим окислительного функциональную активность митохондриального аппарата клетки, является сукцинатдегидрогеназа [22,30,151]. Сукцинатдегидрогеназа (СДГ) фермент цикла Кребса и компонент электронтранспортной дыхательной цепи (комплекс II), прочно связанный с внутренней мембраной митохондрий. Название фермента по международной классификации: Сукцинат: хинон-оксидоредуктаза EC 1.3.5.1 Фумаратдегидрогеназа, Фумаратредуктаза, (Комплекс II, Сукцинатдегидрогеназа) СДГ относится к классу убихинон-восстанавливающих ферментов. В состав фермента входит 4 субъединицы: флавопротеид (SDHA, 70 kDa), субъединица, содержащая FeS кластеры (SDHB,30 kDa) и гидрофобные субъединицы (SDHC, 14,2 kDa и SDHD, 12,8 kDa) за счет которых комплекс крепится на внутренней митохондриальной мембране [44,55]. Все компоненты комплекса кодируются 34 ядерным геномом: SDHA(5p15), SDHB (1p35-p36.1), SDHC (1q21) и SDHD (11q23) [149]. В цикле Кребса СДГ катализирует реакцию окисления янтарной кислоты в фумаровую (Рис 1.6.1.). Нормальная работа комплекса субъединиц СДГ в рамках цикла Кребса обеспечивает правильное протекание центрального метаболического пути углерода, входящего в состав всех основных классов биологических молекул. Рис 1.6.1. Схема ферментативной реакции, катализируемой СДГ, в цикле Кребса. В дыхательной цепи СДГ участвует в переносе водорода от сукцината на убихинон. (Рис 1.6.2.) Рис 1.6.2. Схема ферментативной реакции, катализируемой СДГ, в дыхательной электронтранспортной цепи. Полноценное функционирование СДГ в дыхательной цепи переноса электронов обеспечивает достаточную выработку основного источника метаболической энергии клетки в форме аденозинтрифосфата (АТФ). Активность СДГ определяется прежде всего концентрационным градиентом субстрата и продукта ферментативной специфических ферментативной активности факторов реакции, осуществляется [151]. Так кроме того посредством показано что регуляция множества наличие агентов, фосфорилирующих SDHA- субъединицу СДГ, приводит к значительному 35 снижению ферментативной активности фермента. Каталитическая активность также регулируется концентрационным градиентом промежуточных соединений цикла Кребса. Например, увеличение содержания оксалоацетата оказывает ингибирующее действие на активность СДГ. К недавно открытым факторам относятся специфические регуляторные факторы СДГ – белки Tcm62, Flx1, SDHAF1 и SDHAF2, участвующие в сборке ферментативного комплекса, транспортировке и связывании флавинадениндинуклеотид контроле термостабильности и др. [151]. Таким образом, СДГ является маркерным ферментом митохондрий, отражающим интенсивность энергетического обмена клетки. Сложная система регуляции работы фермента позволяет предположить высокую информативность определения активности СДГ в диагностике митохондриальной дисфункции. Диагностическая значимость определения активности СДГ при воспалительных заболеваниях кишечника у детей Диагностическая значимость определения СДГ показана для заболеваний практически все систем органов. Выявлена информативность исследования активности СДГ при аллергических патологиях (бронхиальной астме, атопическом дерматите), болезнях нервной системы (рассеянном склерозе, ночном энурезе, перинатальном поражении центральной нервной системы), сердечно-сосудистых заболеваниях (кардиомиопатиях), болезнях обмена у детей (гликогенозах, сахарном хирургических диабете, болезни патологиях Вильсона, фенилкетонуриии), у детей [2,8,9,10,11,12,14,16,19,20,22,23,32,33,38,65,111]. В экспериментальных и клинических исследованиях показаны корреляции между активностью митохондриальных дегидрогеназ лимфоцитов крови и функциональным состоянием клеток внутренних органов. Впервые корреляция между активностью СДГ лимфоцитов периферической крови и активностью данного фермента в клетках слизистой оболочки кишечника при болезни Гиршпрунга и слизистой оболочки желудка при хронических гастритах у детей 36 была показана в работе Сусловой Г.Ф. (1991) [29]. Показана информативность определения активности СДГ у детей с хроническими запорами. При этом более тяжелое течение заболевания соответствовало значительному снижению активности СДГ в лимфоцитах периферической крови [24]. Исследование активности митохондриальных ферментов лимфоцитов у детей с БК выявило существенное снижение активности СДГ у всех обследованных пациентов, однако наибольшее снижение митохондриальной активности наблюдалось у больных с выраженной воспалительной активностью БК [13]. Из выше изложенного следует, что определение активности СДГ лимфоцитов имеет диагностическое значение в оценке тяжести состояния пациентов с ВЗК и может рассматриваться как вероятный предиктор эффективности лечения. Таким образом, оценка цитокинового профиля, анализ состояния клеточного иммунитета и определение митохондриальной активности популяций лимфоцитов у детей с ВЗК является чрезвычайно актуальной в связи с потенциальной возможностью выявления новых лабораторных маркеров активности заболевания и прогноза эффективности биологической терапии. 37 ГЛАВА 2. Объем и методы исследования 2.1. Клинико-лабораторная характеристика обследованных больных Исследование проводилось в период с 2008 по 2013 год в лаборатории цитохимии (заведующая лабораторией - докт. биол. наук, проф. С.В. Петричук) и гастроэнтерологическом отделении с гепатологической группой (заведующий отделением - докт. мед. наук, проф. А.С.Потапов) ФГБУ «Научный центр здоровья детей» РАМН (директор – академик РАН проф., А.А. Баранов). Для решения поставленных задач было обследовано 100 детей с ВЗК в возрасте от 10 до 17,9 лет (55 мальчиков и 45 девочек). Болезнь Крона была диагностирована у 67 детей, 33 ребенка страдали язвенным колитом. Диагнозы устанавливались на основании анамнестических, клинико-лабораторных, эндоскопических и гистологических данных. Длительность заболевания на момент обследования варьировала от 1 месяца до 13 лет и в среднем составила 4 года. Все пациенты комплексно обследовались в динамике заболевания на фоне проводимого лечения от 1 до 27 раз. Длительность наблюдений составила от 1 месяца до 5 лет. Контрольную группу составили 45 практически здоровых детей (25 мальчиков и 20девочек) в возрасте от 12 до 16 лет. Клиническую активность ВЗК определяли согласно международным рекомендациям, используя педиатрический индекс активности болезни Крона (Pediatric Crohn's Disease Activity Index – PCDAI) и педиатрический индекс активности язвенного колита PUCAI (Pediatric Ulcerative Colitis Activity Index). При подсчете PCDAI и PUCAI учитывались физикальные данные (выраженность кишечных симптомов, нарушение общего самочувствия, наличие внекишечных проявлений и др.), а также ряд лабораторных показателей (гематокрит, СОЭ, сывороточное содержание альбумина) [100,166]. Эндоскопическая активность заболевания оценивалась с помощью простого эндоскопического индекса БК (Simple Endoscopic Score for Crohn’s Disease) - SES- 38 CD и эндоскопического индекса активности ЯК по Рахмилевич (Rachmilewitz endoscopic activity index – EAI) [104,117]. Эндоскопические методы исследования проводились в эндоскопическом отделении НЦЗД РАМН (зав. - д.м.н. А.А.Шавров). Эзофагогастродуоденоскопию проводили с использованием гибких эзофагогастродуоденоскопов GIF-10 и GIF40 (Olympus, Япония). Колоноскопия с забором биопсийного материала слизистой оболочки из всех отделов тонкой и толстой кишки (лестничная биопсия) проводилась фиброскопами EC-410 HI и EC-485 ZW (Fujinon, США). Колоноскопия проводилась под общим обезболиванием или с применением анальгетических и седативных препаратов. Некоторым пациентам, с целью верификации диагноза была выполнена видеокапсульная эндоскопия (ВЭК) желудочно-кишечного тракта с помощью диагностической системы GivenR Imaging Ltd (США). Гистологические исследования биоптатов кишечника выполнялись в патологоанатомической лаборатории НЦЗД РАМН (зав.-д.м.н., проф. А.Г.Талалаев) и в патоморфологической лаборатории ФГБУ «Государственный научный центр колопроктологии» Министерства здравоохранения РФ д.м.н., проф. Л.Л.Капуллер). Критерии исключения пациента из исследования: 1. Возраст пациента менее 10 лет 2. Острый или хронический инфекционный процесс 3. Наличие хронических иммуноопосредованных заболеваний (другие аутоиммунные заболевания, иммунодефициты и т.п.) 4. Наличие болезней обмена веществ 5. Наличие первичной митохондриальной патологии 6. Форма патологии с преимущественным поражением верхних отделов ЖКТ (зав.- 39 7. Формы заболевания, осложненные развитием первичного-склерозирующего холангита Клиническая характеристика пациентов представлена в таблице 2.1. Таблица 2.1 Клинические данные пациентов с ВЗК, вошедших в исследование Признак Диагноз Локализация воспалительного процесса при БК Локализация воспалительного процесса при ЯК Болезнь Крона N=67 Язвенный колит N=33 Тонкая кишка (илеит) N=19 Толстая кишка (панколит) N=7 Илеоколит N=41 Панколит N=23 Левосторонний колит N=10 Воспалительная N=37 Свищевая N=8 Стенозирующая N=9 Смешанная N=13 Обострение N=53 (PCDAI≥30) (320 образца) Форма БК Неполная ремиссия Активность заболевания при БК (30>PCDAI>10) Клинико-лабораторная ремиссия (PCDAI≤10) N=36 (219 образца) N=17 (102 образца) Обострение N=20 (PUCAI≥70) (85 образцов) Неполная ремиссия Активность заболевания при ЯК Количество обследованных больных (70<PUCAI<30) Клинико-лабораторная ремиссия (PUCAI≤30) N=19 (119 образцов) N=9 (49 образцов) 40 Все больные, вошедшие в исследование, получали патогенетическую и симптоматическую терапию в соответствии с существующими стандартами лечения. Распределение пациентов согласно получаемой терапии представлено в таблице 2.2 Таблица 2.2 Распределение пациентов в соответствии с терапевтическим анамнезом Количество больных Терапия Противовоспалительные препараты (производные 5-аминосалициловой кислоты) Цитостатики (азатиоприн) ГКС в анамнезе (преднизолон, метипред) Местные ГКС (будесонид) Биологические препараты (инфликсимаб) ГКС на момент начала биологической терапии БК ЯК N=67 N=33 N=67 N=33 N=39 N=33 N=9 N=0 N=49 N=21 N=16 N=7 В связи с особенностями иммунопатогенеза ВЗК у всех пациентов определяли цитокиновый профиль, лимфоцитов периферической крови, проводили иммунофенотипирование иммуноцитохимическое исследования основных и малых популяций лимфоцитов периферической крови, а также оценивали сывороточную концентрацию анти-GP2 антител (Таб. 2.3). Таблица 2.3 Данные по количеству проведенных лабораторных исследований Вид исследования Оценка цитокинового профиля Иммуноцитохимическое исследование лимфоцитов периферической крови Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови Оценка содержания анти-GP2 антител Количество образцов Болезнь Крона Язвенный колит Контрольная группа Всего 349 131 20 500 410 128 45 583 427 138 45 610 113 47 20 180 41 Оценка цитокинового профиля, иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови и иммуноцитохимическое исследование проводилось в лаборатории цитохимии НЦЗД РАМН (зав.- д.б.н., проф. С.В. Петричук). Клиническое и биохимическое исследование крови было выполнено в центральной клинико-диагностической лаборатории НЦЗД РАМН (зав.- д.м.н. Е.Л. Семикина), анализ кала на кальпротектин, определение содержания антиGP2 антител проводились в лаборатории экспериментальной иммунологии и вирусологии НЦЗД РАМН (зав.-д.м.н. Н.А.Маянский). Биологические образцы были получены с использованием системы для взятия венозной крови BD Vacutainer®. Исследование выбранных лабораторных параметров в динамике биологической терапии проводилась непосредственно перед инфузией препарата и на следующие сутки после. Исследование проведено в соответствии с этическими нормами и Правилами клинической практики РФ. При обследовании детей было получено информированное добровольное согласие родителей на медицинское вмешательство. 2.2. Метод мультиплексного количественного определения цитокинов с использованием проточной цитометрии Определение концентрации циркулирующих мультиплексным количественным методом с цитокинов проводилось использованием проточной цитофлуориметрии. Биологические образцы (плазму крови) получали методом центрифугирования цельной крови и хранили при температуре -70°С. Мультиплексный анализ предназначен для одновременного количественного определения концентрации нескольких аналитов (цитокинов) в одном биологическом образце. 42 Принцип метода Мультиплексный метод количественного определения цитокинов основан на принципе иммуноанализа типа «сэндвич», в котором антитела к соответствующему аналиту связаны с поверхностью микрочастиц (микросферы). В методике используются 2 типа микрочастиц, отличающихся по размеру: популяция А - 5,5 мкм , популяция В - 4,4 мкм. Разделение частиц по размерам осуществляется по прямому светорассеянию. Частицы типа A и типа B также различаются по интенсивности флуоресценции, что позволяет разделить частицы типа A на 11 популяций, а частицы типа B на 9 (длина волны испускания – 690нм, длина волны возбуждения – 488 нм, аргоновый лазер). Это позволяет легко идентифицировать популяции микрочастиц на проточном цитометре (Рис 2.1). Принцип метода флуоресцентных частиц Микросферы являются твѐрдой фазой иммунохимической реакции. Они покрыты антителами, специфичными к каждому из аналитов, детектируемых в мультиплексной системе. При инкубации смеси микросфер с биообразцами происходит специфическое связывание аналита с АТ, прикрепленными к флуоресцентным частицам. К смеси добавляются вторичные антитела, конъюгированные с биотином, которые специфически аналитом, удерживаемым на взаимодействуют поверхности с микросфер первичными антителами. Биотиновые метки проявляются флуоресцентным конъюгатом (стрептавидин-фикоэритрин), формируется флуоресцентный сигнал. 43 44 Рис 2.1. Этапы выполнения мультиплексного количественного метода определения концентрации цитокинов – фиксация результатов анализа на проточном цитофлуориметре (выделение регионов микрочастиц, снятие показателей интенсивности флюоресценции по каналам FL2, FL4) 45 Использование данной методики обладает рядом преимуществ. Преимущества метода одновременный анализ нескольких цитокинов (до 20) в одном образце; многократное уменьшение объема исследуемого материала; увеличение воспроизводимости результатов; возможность самостоятельного формирования диагностических панелей; упрощенный анализ результатов, благодаря применению программного обеспечения (BMS FlowCytomix Pro); снижение стоимости исследования и трудозатрат. Протокол исследования соответствовал инструкции производителя (BenderMed Systems GmbH, Германия). В работе использовался наборы реагентов FlowCytomix Human Th1/Th2 11plex (BMS810FF), Human IL-13 FlowCytomix Simplex (BMS8231FF), Human IL-17A FlowCytomix Simplex (BMS82017FF), Human IL-23 FlowCytomix Simplex (BMS82023FF), Human IL-22 FlowCytomix Simplex (BMS82047FF), Human TGF-beta1 FlowCytomix Simplex (BMS8249FF). Для анализа использовался лазерный проточный цитометр CYTOMICS FC 500 (Beckman Coulter, США) (Табл.2.4). Таблица 2.4 Исследуемая панель цитокинов FlowCytomix Human Th1/Th2 11plex FlowCytomix Human Simplex IL-1β IL-4 IL-13 IL-2 IL-5 IL-22 IL-8 IL-6 IL-23 IFN-γ IL-10 TGF-β TNF-α, TNF-β IL-12р70 IL-17A 46 Полученные данные обрабатывали с использованием программного обеспечения FlowCytomix Pro v 6.0 (BenderMed Systems GmbH,Германия) (Рис. 2.2, Рис.2.3). Рис.2.2 Этапы обработки результатов мультиплексного анализа с использованием программного обеспечения FlowCytomix Pro v 6.0 Оценка содержания популяций микросфер соответствующих искомому аналиту, по параметрам флуоресценции. Ось абсцисс интенсивность флуоресценции по каналу FL2 (575nm), отражающая концентрацию изучаемого аналита. Ось ординат – интенсивность флуоресценции по FL4 (675nm), позволяющая дифференцировать популяции микросфер для соответствующего аналита. 47 Рис 2.3 Бланк результатов анализа цитокинового профиля мультиплексным количественным методом с использованием проточной цитофлуориметрии. Определение цитокинового профиля мультиплексным количественным методом с использованием проточной цитофлуориметрии проведено в 500 биологических образцах, в каждом образце определяли концентрацию от 11 до 16 аналитов (245 образцов по 11 аналитов, 255 образца по 16 аналитов). 2.3. Иммуноцитохимический метод определения митохондриальной активности лимфоцитов Митохондриальную активность лимфоцитов периферической крови определяли иммуноцитохимическим методом с использованием проточной цитофлуориметрии. Иммуноцитохимический метод объединяет диагностические возможности иммуфенотипирования лимфоцитов и количественного цитохимического анализа и позволяет определить активность митохондриальных дегидрогеназ в разных популяциях лимфоцитов [18]. В работе проводилось иммуноцитохимическое исследование активности СДГ как наиболее информативного показателя митохондриальной активности клетки. 48 Принцип метода Иммуноцитохимический метод основывается на измерении показателей активности СДГ в лимфоцитах с помощью инкубации пермеабилизированных клеток лимфоконцентрата в среде, состоящей из специфичного для данного фермента субстрата – янтарно-кислого натрия, фосфатного буфера, п- нитротетразолия фиолетового и трилона-Б. В процессе ферментативной реакции пнитротетразолий фиолетовый восстанавливается с образованием нерастворимых в воде круглых гранул формазана (Рис 2.4). Анализ результата цитохимической реакции проводится с помощью проточного цитометра, показатель митохондриальной активности в выделенных популяциях определяют по приросту коэффициента бокового светорассеяния в процентах после проведения цитохимической реакции (Рис 2.5). Преимущества метода возможность определения митохондриальной активности основных и малых популяций лимфоцитов, возможность одновременного проведения иммунофенотипирования лимфоцитов и определение их функциональной активности увеличение воспроизводимости результатов, возможность диагностических панелей самостоятельного формирования 49 Рис. 2.4. Принцип определения активности СДГ иммуноцитохимическим методом: в процессе ферментативной реакции окисления специфического для СДГ субстрата янтарной кислоты, - содержащейся в инкубационном буфере, п-нитротетразолий фиолетовый восстанавливается с образованием нерастворимых в воде круглых гранул формазана. Гранулярность клетки увеличивается, что приводит к увеличению коэффициента бокового светорассеяния. 1 . 50 2 . 51 3 . 5 4 . 6 . SS = 175±0,36 SS = 330±0,75 Рис. 2.5. Выполнение иммуноцитохимического исследования на проточном цитометре . Выделение лимфоцитарного региона до (1) и после (2) проведения цитохимической реакции Выделение популяции по параметрам флуоресценции до (3) и после (4) Распределение клеток по коэффициенту бокового светорассеивания (SS) до (5) и после (6) Активность оценивали отношением А =(SS цитохимия /SS стандарт) *100%. Протокол исследования Иммуноцитохимическое исследование лимфоцитов проводилось согласно рекомендациям разработчиков [18]. Активность СДГ исследовали в 7 основных и 6 малых популяциях лимфоцитов, полученных из периферической крови пациентов (Табл. 2.5). Таблица 2.5 Диагностическая панель иммуноцитохимического исследования Популяция лимфоцитов Фенотип клетки 52 Общая популяция лимфоцитов CD45+CD14- Основные популяции лимфоцитов Т-лимфоциты CD3+CD45+ В-лимфоциты CD3-CD19+ CD45+ Т-хелперы СD3+CD4+CD45+ Цитотоксические Т-лимфоциты CD3+CD8+CD45+ NK-клетки CD3-CD16+СD56+ Активированные Т-лимфоциты СD3+HLA-DR+ NKT-лимфоциты CD3+CD16+CD56+ Популяции Т-лимфоцитов Th2-лимфоциты CD3+CD4+CD294+ Регуляторные Т-лимфоциты CD4+CD25+CD127low Активированные Т-хелперы CD4+CD25+CD127high Th17-лимфоциты CD3+CD4+CD161+ Популяции В-лимфоцитов В1-лимфоциты CD3-CD19+CD5+ В2-лимфоциты CD3-CD19+CD5- Определение активности СДГ проводилось с использованием готовых наборов фирмы «МНПК Химтехмаш» (Россия). Для идентификации популяций лимфоцитов использовали моноклональные антитела с флуоресцентной меткой фирм Beckman Coulter (США) и Becton Dickinson (США) (Табл.2.6). Исследование проводили на проточном лазерном цитофлуориметре CYTOMICS FC 500 (Beckman Coulter, США). Анализ и выделение основных и малых популяций лимфоцитов проводился согласно методом последовательного существующим рекомендациям [36,37]. гейтирования согласно 53 Математическую обработку цитометрических данных проводили при помощи программы CXP. v2.2. В работе выполнен анализ 583 образцов крови, включающий определение численности 13 популяций лимфоцитов и активности СДГ в них. 2.4. Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови методом проточной цитофлуориметрии Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови проводилось методом многоцветной проточной цитофлуориметрии на приборе CYTOMICS FC 500 (Beckman Coulter, США) Принцип метода Метод проточной цитофлуориметрии основан на регистрации сигналов флуоресценции и светорассеяния от каждой отдельной клетки в дисперсной среде (клеточной суспензии). флуоресцирующими Суспензия клеток, моноклональными предварительно антителами, меченная специфически связывающимися с определѐнными компонентами клеток, под давлением подается в проточную ячейку. Благодаря гидродинамической фокусировке создаются условия ламинарного потока без перемешивания суспензии клеток: клетки выстраиваются друг за другом, занимая в проточной ячейке строго определѐнное положение относительно луча света. В момент пересечения клеткой луча детекторы фиксируют несколько оптических параметров: рассеяние под малыми углами (1°-10°) (FSL) - прямое рассеяние под углом 90° (SSL) - боковое интенсивность флуоресценции флуоресценции (FL1 – FL5). по нескольким каналам 54 Измерение этих характеристик позволяет определить размеры клеток (FSL), гранулярность их цитоплазмы (SSL), популяционный состав клеточной суспензии по наличию или отсутствию определѐнных клеточных маркеров. Преимущества метода высокая воспроизводимость и точность метода за счет большой выборки анализируемых объектов высокая скорость измерения измерение параметров редко встречающихся клеток возможность сортировки клеток по любым комбинациям детектируемых параметров Протокол исследования Подготовка клеток периферической крови для многоцветного анализа проводилась в соответствии со стандартизованной технологией [35,36]. Пробоподготовка включала в себя инкубирование цельной крови (антикоагулянт – Этилендиаминтетрауксусная кислота) с моноклональными антителами, с последующим лизисом эритроцитов и фиксацией клеток на автоматической станции пробоподготовки TQ-PREP™ (Beckman Coulter, США). Выделение минорных популяций лимфоцитов осуществлялось с использованием стратегии последовательного гейтирования. В работе исследовали количественные характеристики 7 основных и 6 малых популяциях лимфоцитов, полученных из периферической крови пациентов (Табл. 2.5). Таблица 2.6 Панель моноклональных антител для анализа основных и малых популяций лимфоцитов периферической крови пациентов с ВЗК Исследуемые популяции FITC PE PerCP / PC5 PC7 Т-лимфоциты, Т-хелперы, цитотоксические Т-лимфоциты CD4 CD8 CD3 CD45 В-лимфоциты, В1-, В2- клетки CD3 CD19 CD45 CD5 55 NK-клетки, NKT-лимфоциты CD3 CD(16+56) CD45 - Активированные Т-лимфоциты HLA-DR CD19 CD3 CD45 Th2-лимфоциты CD4 CD294 CD3 CD45 Активированные Т-хелперы Treg лимфоциты CD4 CD127 CD45 CD25 Th17-лимфоциты CD4 CD161 CD3 CD45 Иммунофенотипирование проводилось на проточном лазерном цитофлуориметре CYTOMICS FC 500 (Beckman Coulter, США) с использованием следующих меченных флуорохромами моноклональных антител производства Beckman Coulter (США): CD4-FITC, CD3-FITC ,HLA-DR –FITC, CD8-PE, CD19PE, CD(16+56)-PE, CD294-PE, CD127-PE, CD161-PE, CD3- PerCP, CD45PerCP,CD45PE-Cy5,CD45 PE-Cy7, CD25 PE-Cy7(Табл.2.6). Пробподготовки на автоматической станции TQ-PREP™ (Beckman Coulter, США) проводилась с использованием набора реагентов ImmunoPrep Reagent System (Beckman Coulter, США). Количественный анализ основных и малых популяций лимфоцитов проводился согласно существующим рекомендациям [37] (Рис. 2.6, 2.7). 56 Рис. 2.6 Гистограмма распределение лимфоцитов периферической крови при количественном анализе популяций В-лимфоцитов: В1-клеток (CD5+CD19+) - квадрант D2, В2-лимфоцитов (CD5-CD19+) - квадрант D4. Результат логического поэтапного гейтирования по СD45. Рис. 2.7 Гистограмма распределение лимфоцитов периферической крови при количественном анализе популяций Th17–лимфоцитов (CD4+CD161+СD3+CD45+) – квадрант D2. Результат логического поэтапного гейтирования по СD45 и CD3. В работе выполнен анализ 610 образцов крови, включающий определение численности 13 популяций лимфоцитов. 2.5. Исследование содержания антител к гликопротеину 2 методом твердофазного иммуноферментного анализа. Определение концентрации антител IgA и IgG к гликопротеину 2 (anti-GP2 IgA и anti-GP2 IgG) проводилось у 83 детей с ВЗК с использованием метода твердофазного иммуноферментного анализа. Принцип метода Метода твердофазного иммуноферментного анализа основан на принципе иммуноанализа типа «сэндвич», в котором на твердой фазе планшета для микротитрования иммобилизован антиген, с которым взаимодействуют 57 присутствующие в сыворотке специфические антитела. Полученный комплекс «антиген-антител» метят вторичными IgG антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена («конъюгат»), которые специфически связываются с фиксированными человеческими антителами комплекса. Для детектирования результатов реакции добавляют специфический для фермента субстрат (3,3’5,5’тетраметилбензидин). Результатом ферментативной реакции является образование окрашенного продукта окисления. Интенсивность окрашивания, т.е. оптическая плотность, раствора прямо пропорциональна количеству связанных специфических антител. Результат оценивается спектрофотометрически (длина волны 450нм) с использованием калибровочной кривой (Рис.2.8). Рис. 2.8 Принцип метода твердофазного иммуноферментного анализа Преимущества метода высокая чувствительность метода, позволяющая выявлять концентрации до 0,05 нг/мл. возможностью использования минимальных объемов биоматериала; стабильностью всех реагентов при хранении, необходимых для проведения ИФА; возможностью автоматизации всех этапов реакции снижение стоимости исследования и трудозатрат. Оценка содержания anti-GP2 IgG и anti-GP2 IgA проводилось с использованием диагностических наборов фирмы Medipan Generic Assay GmbH 58 (Dahlewits/Berlin, Германия). Протокол исследования соответствовал инструкции производителя (MEDIPAN GmbH, Dahlewits/Berlin, Германия). Промывка лунок микропланшета выполнялась с помощью промывателя TECAN HydroFlexTM(Швейцария/Австрия). микропланшетного Обработка результатов иммуноферментного анализа производилась с помощью микропланшетного фотометра TECAN Sunrise TM (Швейцария / Австрия). Полученные данные обрабатывали с использованием программного обеспечения Magellan TM V 6.5 (TECAN, Швейцария / Австрия). В работе выполнен анализ 180 сывороток крови, включающий определение концентрации IgG и IgA аутоантител к гликопротеину 2. 2.6. Статистические методы исследования Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью программы «Statistica 6.0» («StatSoft Inc.», США). При сопоставлении групп по количественному признаку применяли непараметрический критерий МаннаУитни. Различия считали статистически значимыми при p<0,05. Анализ диагностической и прогностической значимости исследуемых параметров, а также оценку уровня пороговых значений показателей осуществляли методом характеристических кривых (receiver operator characteristic, ROC-анализ) с использование программы «SPSS 16.0» («SPSS: An IBM Company», США). 59 ГЛАВА 3. Результаты исследования 3.1. Цитокиновый профиль как предиктор эффективности терапии блокаторами фактора некроза опухоли альфа у детей с ВЗК В зависимости от терапевтического ответа на инфликсимаб все пациенты, вошедшие в исследование, были поделены на две группы – группа детей со стойким положительным эффектом препарата и пациенты с нестабильным эффектом биологической терапии. Критериями включения пациента в группу со стойким положительным эффектом инфликсимаба (Группа 1) были выбраны следующие показатели: клинико-эндоскопическая ремиссия заболевания либо минимальная степень воспалительной активности (PCDIA≤10, PUCAI≤30, SES-CD≤6, EAC≤4) в течение года применения биологической терапии по стандартной схеме введения (5мг/кг 0-2-6 недель, далее каждые 8 недель). В группу с недостаточным эффектом инфликсимаба (Группа 2) были отнесены пациенты с клинико-лабораторными и эндоскопическими признаками активного воспаления (PCDIA>10, PUCAI>30, SES-CD>6, EAC>4) через год терапии блокаторами фактора некроза опухоли альфа по стандартной схеме введения; пациенты, достигшие ремиссии при увеличении стандартной дозировки препарата и/или сокращениями интервалов между инфузиями менее 8 недель, а также дети, развившие острую аллергическую реакцию на введение препарата. Степень воспалительной активности заболевания на момент начала биологической терапии оценивали с помощью клинического и эндоскопического индексов активности. Значения индексов у пациентов Группы 1 и Группа 2 статистически не различались между собой (p>0,05) (Табл.3.1.1). Таблица 3.1.1. Индексы воспалительной активности у пациентов Группы 1 и Группы 2 до начала терапии Индексы активности Группы 1, (Me, LQ-HQ) Группа 2, (Me, LQ-HQ) 38 (25-50) 46(29-63) PCDIA 11 (6-12) 12(9-13) SES-CD 70(35-70) 60(40-75) PUCAI 10(10-10) 10(9-10) EAC 60 Данные стандартных лабораторных критериев воспаления, применяемых для оценки воспалительной активности ВЗК до начала биологической терапии, не выявили значимых различий между Группой 1 и Группой 2 (p>0,05) (Табл. 3.1.2). Таблица 3.1.2. Данные стандартных лабораторных исследований у пациентов обеих групп да начала терапии. Лабораторный Референсный Группа 1 Группа 2 (Me, LQ-HQ) (Me, LQ-HQ) параметр интервал 113(100-128) 107(92-120) 120-140 Гемоглобин, г/л 34,3(29,7-38,9) 34,2(30,3-37,7) 37-49 Гематокрит, % 11,4(8,9-14,3) 10,7(7,7-14,0) 5,5-8,7 Лейкоциты, 109/л 64,2(51,1-73,5) 70,3(56,7-78,4) 43-65 Нейтрофилы, % 9 398(338-519) 453(387-550) 130-450 Тромбоциты, 10 /л 26(19-41) 26(16-35) 0-10 СОЭ, мм/ч 61,5(57,0-68,0) 63,0(57,0-71,0) 60-80 Общий белок, г/л 32,5(29,0-35,0) 28,5(25,0-35,0) 32-45 Альбумин, г/л Сывороточное железо, 5,8(3,8-7,5) 4,5(2,6-6,0) 11,6-31,6 ммоль/л 34,2(4,8-66,5) 36,0(18,4-84,1) 0-5 СРБ, мг/л 5,9(3,6-8,0) 5,1(4,4-6,2) 2-4 Фибриноген, г/л Для определения диагностических и прогностических возможностей цитокинового профиля у детей с ВЗК содержание цитокинов оценивали в зависимости от диагноза и терапевтического ответа на инфликсимаб. Сопоставление содержания цитокинов не выявило значимых различий у детей с БК и ЯК (Табл. 3.1.3.). Таблица 3.1.3. Плазменное содержание цитокинов у пациентов с БК и ЯК до начала терапии Цитокин Концентрация цитокина до начала терапии, пг/мл (Me, LQ-HQ) Болезнь Крона IL-12p70 IFN-γ IL-2 IL-10 IL-8 IL-6 IL-4 IL-5 IL-1β TNF-α TNF-β IL-23 1,6 (1,5-54,3) 5,6(1,4-54,1) 46,9(10,0-243,4) 3,7(1,3-53,6) 60,1(0,0-224,2) 2,2(1,0-38,9) 27,0(15,0-1203,0) 4,7(1,5-92,2) 2,0(2,0-55,2) 16,4(0,5-52,8) 2,2(1,7-2,4) 100,9(0,0-521,7) Язвенный колит 1,5 (1,5-28,1) 6,3(1,4-67,0) 69,6(10,0,-324,5) 8,4(1,3-74,7) 109,1(0,0-278,3) 2,4(1,2-57,6) 32,0(15,0-1395,0) 3,8(1,3-212,1) 2,0(2,0-50,6) 28,3(0,8-87,4) 2,0(2,0-2,4) 134,5(20,0-534,7) 61 IL-17А IL-22 IL-13 TGF-β 146,9(2,1-401,7) 35,8(10,0-202,4) 4,2(4,1-151,4) 17091(8900-26254) 178,0(3,0-404,5) 39,7(10,0-332,1) 4,2(4,0-196,4) 8147(5931-24813) Сравнение цитокинового профиля пациентов со стойким положительным эффектом от инфликсимаба (Группа 1) и контрольной группой выявило значительное увеличение концентраций большинства исследуемых цитокинов в Группе 1, исключение составили IL-13, IL-22 и TGF-β. Содержание TGF-β было снижено у пациентов со стойким эффектом терапии по сравнению с контрольной группой, концентрации IL-13 и IL-22 не отличались между сравниваемыми группами (Рис.3.1.1). Сопоставление концентраций цитокинов у пациентов с недостаточным эффектом от инфликсимаба (Группа 2) и контрольной группой выявило увеличение содержания IL-8, IL-2 и снижение концентрации TGF-β у пациентов Группы 2, при этом степень снижения была более выражена, чем в Группе 1 (Рис.3.1.1). Рис. 3.1.1 Концентрация TGF-β у пациентов со стойким положительным (Группа 1) и нестабильным (Группа 2) эффектом инфликсимаба и детей контрольной группы. 62 Анализ цитокинового профиля пациентов в зависимости от эффективности биологической терапии до ее начала выявил значимое превышение концентраций большинства исследуемых цитокинов у пациентов со стойким положительным эффектом от инфликсимаба (Группа 1) по сравнению с пациентами с недостаточным эффектом препарата (Группа 2) (Табл.3.1.4., Рис.3.1.2). Таблица 3.1.4. Исходные плазменные концентрации цитокинов у пациентов со стойким эффектом от инфликсимаба (Группы 1) и детей с минимальным эффектом препарата (Группы 2) Цитокин Концентрация цитокина до начала терапии, пг/мл (Me, LQ-HQ) IL-12p70 Группа 1 стойкий положительный эффект 1,6 (1,5-97,9) * Группа 2 нестабильный эффект 1,1 (1,0-1,5) * IFN-γ 19,3 (1,4-184,3) * 1,6 (1,4-1,6) * IL-2 110,3 (15,0-396,8) * 15,0 (10,0-196,34) * IL-10 13,5 (1,9-123,5) * 1,9 (1,5-10,9) * IL-8 156,0 (0,5-386,5) * 0,5 (0,5-123,9) * IL-6 4,3 (0,8-56,9) * 1,2 (1,0-1,2) * IL-4 58,7 (15,0-1197,5) * 15,0 (13,0-20,0) * IL-5 59,8 (1,6-277,6) * 1,4 (1,0-71,6) * IL-1β 2,2 (1,9-72,5) * 2,0 (1,9-2,2) * TNF-α 14,4 (0,0-82,3) * 0,7 (0,5-1,1) * TNF-β 2,0 (1,7-2,4) 2,4 (2,0-2,4) IL-23 36,0 (20,0-375,2) 21,0 (10,0-205,8) IL-17А 90,8 (2,1-402,4) 42,9 (1,0-387,8) IL-22 36,0 (12,0-37,0) 35,0 (10,0-35,0) IL-13 4,5 (3,0-4,5) 4,2 (3,0-4,5) TGF-β 24267,7(8305,3-35335,0) * 12174,7(7685,1- 18250) * *p<0,01 при сравнении Группы 1 и Группы 2, тест Манн-Уитни 63 64 Рис 3.1.2 Концентрации исследуемых цитокинов у пациентов со стойким (Группа 1) и нестойким (Группа 2) эффектом инфликсимаба до начала биологической терапии. Цитокиновый профиль пациентов после индукционного курса характеризовался превышением концентраций IL-12р70, IFN-γ, IL-10, IL-4, IL-5, IL-6 и TNF-α у детей Группы 1 по сравнению с детьми Группы 2. Оценка содержания цитокинов после 1 года терапии выявила достоверное увеличение содержания IL-8 и IL12-p70 у пациентов со стойким положительным эффектом от инфликсимаба по сравнению с детьми с нестабильным эффектом препарата (Табл.3.1.5). 65 Таблица 3.1.5. Плазменные концентрации цитокинов у пациентов со стойким (Группы 1) и нестабильным (Группы 2) эффектом инфликсимаба после индукционного курса и 1 года терапии Концентрация цитокина, пг/мл (Me, LQ-HQ) Цитокин Группа 1 стойкий положительный эффект Индукционный курс IL-12p70 IFN-γ IL-2 IL-10 IL-8 IL-6 IL-4 IL-5 IL-1β TNF-α TNF-β IL-23 IL-17А IL-22 IL-13 TGF-β 1,7 (1,5-97,9) * 29,0 (1,6-123,2) * 29,4 (15,0-107,0) 10,3 (1,9-108,8) * 142,5 (0,5-385,5) 1,2 (1,2-42,1)* 126,3 (17,0-1626,5) * 40,5 (1,6-269,8) * 2,2 (2,0-8,1) 2,9 (0,8-62,0)* 2,0 (1,7-2,4) 21,7 (20,3-286,1) 206,4 (2,1-406,0) 35,0 (10,0-40,0) 4,5 (4,2-5,3) 15390 (6945-23282) 1 год терапии 1,8 (1,7-94,7) * 53,7 (1,0-105,7) 0,0 (0,0-303,6) 2,0 (1,4-57,8) 196,5 (0,0-338,8) * 1,0 (1,0-47,0) 78,5 (17,0-1340,9) 28,4 (1,6-212,2) 2,0 (2,0-3,1) 1,7 (0,8-38,8) 2,1 (1,3-2,3) 33,4 (21,7-118,5) 57,0 (2,0-341,0) 12,0 (10,0-25,0) 4,2 (3,0-4,2) 21194 (4151-26044) *p<0,05 при сравнении Группы 1 и Группы 2, тест Манн-Уитни Группа 2 нестабильный эффект Индукционный курс 1,5 (1,3-2,0) * 1,6 (1,0-2,3) * 15,0 (10,0-86,1) 2,8 (1,5-3,0) * 109,6 (0,5-397,7) 1,1 (1,0-4,8)* 27,3 (15,0-51,7) * 1,6 (1,0-76,8) * 2,0 (2,0-4,8) 0,8 (0,5-2,0) * 2,4 (2,0-9,6) 20,6 (20,0-220,8) 102,0 (1,7-680,9) 28,0 (10,0-35,0) 4,2 (3,0-5,1) 9532 (4757- 29205) 1 год терапии 1,0 (1,0-1,5) * 1,3 (1,0-67,4) 13,0 (10,0-72,2) 1,9 (1,5-12,3) 1,5 (0,5-64,7) * 1,0 (1,0-17,3) 18,4 (16,0-142,5) 1,4 (1,0-57,8) 1,8 (1,2-2,4) 1,1 (0,8-15,9) 2,0 (1,7-9,3) 17,3 (14,4-21,9) 17,7 (1,0-235,0) 14,0 (10,0-28,0) 4,0 (2,8-4,6) 12073 (5070-24669) 66 При анализе цитокинового профиля у пациентов с ВЗК была отмечена однонаправленность изменений концентраций исследуемых цитокинов вне зависимости от эффекта терапии и ее длительности. Методом множественной пошаговой регрессии был показан высокий уровень корреляций между концентрациями цитокинов (Рис.3.1.3). Так, например, коэффициент корреляции для зависимости TNF-α=f (IL-6, IL-5, IL-8, IL-22, IL12p70, IL-10, IL-13, IFN-γ) был равен 0,924. Рис 3.1.3. Корреляция концентрации TNF-α и концентрации исследуемых цитокинов у пациентов с ВЗК. Таким образом, было показано, что цитокиновый профиль пациентов со стойким положительным эффектом биологической терапии характеризовался исходно более высоким содержанием как про- так и противовоспалительных цитокинов по сравнению с пациентами, имеющими нестабильный эффект инфликсимаба и контрольной группой. В течение года терапии концентрации большинства циркулирующих цитокинов у пациентов со стабильным эффектом препарата плавно снижались, не достигая при этом уровня цитокинов пациентов с нестабильным эффектом инфликсимаба. 67 Для выявления наиболее информативного показателя цитокинового профиля в прогнозировании эффективности биологической терапии был проведен ROC-анализа полученных данных (Табл.3.1.6.). Определение исходного содержания TNF-α, IL-4, IFN-γ, IL-12p70 соответствовало высокой вероятности правильного прогноза эффективности биологической терапии у детей с ВЗК (интервал AUC 0,8-0,9) (Рис.3.1.4, Рис. 3.1.5). Оценка содержания IL-5, IL-1β, IL-10, TGF-β, IL-8, IL-6, IL-2 характеризовалась хорошей прогностическим качеством модели (интервал AUC 0,7-0,8). Вероятность правильного прогноза эффективности терапии на основе определения исходных концентраций IL-17А, IL-23, IL-13, TNF-β, IL-22 не превышала вероятности случайных событий. Таблица 3.1.6 ROC-анализ исходных концентраций цитокинов у детей с ВЗК до начала лечения для прогноза эффективности биологической терапии Цитокин TNF-α IL-4 IFN-γ IL-12p70 IL-5 IL-1β IL-10 TGF-β IL-8 IL-6 IL-2 Площадь под ROC-кривой AUC(CI),p<0,05 0,840 (0,747-0,933) 0,826 (0,734-0,918) 0,820 (0,724-0,916) 0,803 (0,701-0,904) 0,746 (0,641-0,851) 0,741 (0,634-0,847) 0,727 (0,618-0,836) 0,726 (0,600-0,862) 0,720 (0,614-0,827) 0,720 (0,609-0,830) 0,712 (0,603-0,821) 68 Рис. 3.1.4 ROC-анализ концентрации TNF-α до начала лечения инфликсимабом для прогноза эффективности препарата (AUC 0,840) Рис.3.1.5 ROC-анализ концентрации IL-4 (AUC 0,826) и TGF-β (AUC =0,726) до начала лечения инфликсимабом для прогноза эффективности препарата 69 Для определения уровня порогового значения концентрации цитокинов (cut-off) были выбраны показатели цитокинового профиля, обладающие наибольшей прогностической значимостью – содержание TNF-α, IL-4, IFN-γ, IL12p70. Принимая во внимание, разнонаправленность изменений концентраций TGF-β относительно остальных цитокинов, пороговое значение концентрации было определено также и для данного цитокина (Табл. 3.1.7). При выборе уровня cut-off учитывалась важность прогнозирования нестабильного ответа на биологическую терапию, что соответствовало большему значению специфичности Таблица 3.1.7 Уровень порогового значения, чувствительность и специфичность наиболее информативных показателей цитокинового профиля в прогнозе эффективности терапии инфликсимабом у детей с ВЗК Пороговое значение Чувствительность Специфичность Цитокин концентрации, пг/мл TNF-α 8,7 67% 98% IL-4 107,4 67% 88% IFN-γ 17,5 67% 95% IL-12p70 8,7 61% 98% 24100 60% 88% TGF-β Таким образом, исследование цитокинового профиля у пациентов с ВЗК до начала биологической терапии, позволяет с высокой долей вероятности правильно прогнозировать эффективность лечения, при этом наибольшую прогностическую ценность имеет определение содержания TNF-α. плазменной концентрации TNF-α менее чем 8,7пг/мл Снижение с вероятностью 98% соответствует прогнозу минимального терапевтического ответа на инфликсимаб в течение года. 70 3.2. Оценка состояния Т- и В-клеточного звена иммунитета в прогнозе эффективности биологической терапии у детей с ВЗК Для определения диагностических и прогностических возможностей показателей Т- и В-клеточного иммунитета у детей с ВЗК, получающих инфликсимаб, проводилось иммунофенотипирование и исследование митохондриальной активности основных и минорных популяций лимфоцитов периферической крови в следующие временные интервалы - до первого введения инфликсимаба, после индукционного курса (6 недель) и через 1 год биологической терапии (52 недели). Исследование численности основных популяций лимфоцитов периферической крови у детей с ВЗК выявило значимое снижение количества Влимфоцитов и NK-клеток на фоне увеличения содержания активированных Тлимфоцитов у пациентов Группы 1 и Группы 2 по сравнению с контрольной группой (Табл. 3.2.1, Рис. 3.2.1). Таблица 3.2.1 Содержание основных популяций у детей с ВЗК до начала биологической терапии Содержание клеток Популяции лимфоцитов Относительное значение,% Абсолютное значение, кл/мкл (Me, LQ-HQ) Группа 1 Группа 2 Контрольная группа Т-лимфоциты (CD3+CD45+) 76,5(71,2-84,6),% 1699(1398-2522) 79,8(75,0-84,7) 1605(1080-2495) 72,7(66,-79,8) 1717(1340-1951) Т-хелперы (CD3+CD4+CD45+) 47,6 (39,4-52,0) 1012(801-1401) 49,6(42,3-52,8) 950(660-1493) 43,2(37,4-45,8) 957(823-1105) Цитотоксические Т-лимфоциты (CD3+CD8+СD45+) 25,2(22,8-32,2) 583(460-870) 28,4(22,6-34,8) 548(401-952) 25,9(22,5-30,8) 678(468-759) 14,6(7,7-20,5)* 339(163-550)* 11,1(7,2-15,6)* 246(122-436)* 15,1(13,3-18,1) 351(293-402) 6,1(3,8-12,7) 159(85-320) 7,5(5,8-14,4) 181(126-233) 5,0(3,6-7,0) 113(70-145) В-лимфоциты (CD3+CD19+СD45+) Активированные Тлимфоциты (CD3+HLA-DR+) 71 NK-клетки (CD3+CD16+CD56) 6,4(4,1-9,2) 155(101-239) 7,7(2,7-12,3) 144(41-235) 15,7(12,0-18,3) 297(187-424) NKT-лимфоциты (CD3+CD56+) Иммунорегуляторный индекс (CD4+/CD8+) 1,9(1,1-3,9) 55 (29-81) 2,8(1,5-4,7) 52(31-96) 1,9(1,4-2,8) 41(30-53) 1,9(1,4-2,1) 1,7(1,3-2,3) 1,5(1,3-1,8) * p<0,05 при сравнении Группы 1 и Группы 2, тест Манн-Уитни Выделенным шрифтом отмечены достоверные (р<0,05) изменения по сравнению с контрольной группой Сравнение лимфоцитов количественных характеристик основных популяций между детьми групп наблюдения выявило сниженное содержание исходного числа В-лимфоцитов у пациентов с недостаточным эффектом инфликсимаба по сравнению с детьми со стойким положительным эффектом от терапии (Рис. 3.2.1). Рис. 3.2.1 Содержание В-лимфоцитов и NK-клеток у пациентов со стойким положительным (Группа 1) и нестабильным (Группа 2) эффектом инфликсимаба и детей контрольной группы. Оценка митохондриальной активности основных популяций лимфоцитов периферической крови у детей с нестабильным эффектом препарата по сравнению с контрольной группой выявила снижение активности СДГ в общей популяции Тлимфоцитов, Т-хелперах и цитотоксических Т-лимфоцитах. Митохондриальная активность лимфоцитов периферической крови у детей со стойким положительным эффектом препарата характеризовалась увеличением активности в популяции В-лимфоцитов по сравнению с группой здоровых детей (Табл.3.2.2). 72 Таблица 3.2.2 Активность СДГ популяций лимфоцитов у детей с ВЗК до начала биологической терапии Популяции лимфоцитов Активность СДГ, у.е. (Me, LQ-HQ) Группа 1 Группа 2 Т-лимфоциты (CD3+CD45+) Т-хелперы (CD3+CD4+CD45+) Цитотоксические Т-лимфоциты (CD3+CD8+СD45+) В-лимфоциты (CD3+CD19+СD45+) Активированные Тлимфоциты (CD3+HLA-DR+) NK-клетки (CD3+CD16+CD56) 203,2* (190,6-210,7) 203,3* (188,6-212,1) 192,5* (180,7-206,4) 191,8* (179,0-210,0) Контрольная группа 198,0 (193,5-204,2) 201 (188,7-205,8) 200,7 (188,9-211,2) 190,7 (178,9-208,6) 198,4 (193,2-207,3) 157,9* (148,6-164,9) 150,6* (139,6-163,6) 150,6 (144,0-153,9) 186,5 (175,7-192,9) 183,0 (172,4-191,5) 185,7 (176,8-191,1) 184,5 (172,0-194,1) 183,4 (174,3-192,9) 180,7 (176,1-190,8) NKT-лимфоциты (CD3+CD56+) 193,5 (182,6-206,0) 189,4 (180,4-203,2) 191,1 (183,7-201,1) *p<0,05 при сравнении Группы 1 и Группы 2, тест Манн-Уитни Выделенным шрифтом отмечены достоверные (р<0,05) изменения по сравнению с контрольной группой Сравнение активности СДГ у детей групп наблюдения выявила значимое увеличение активности фермента в общей популяции Т-лимфоцитов, Т-хелперах и В-клетках у детей из Группы 1 по сравнению с пациентами Группы 2. (Рис 3.2.2) 73 Рис. 3.2.2 Активность СДГ в популяции Т-лимфоцитов у пациентов со стойким положительным (Группа 1) и нестабильным (Группа 2) эффектом инфликсимаба и детей контрольной группы. Исследование минорных популяций периферических лимфоцитов у детей с ВЗК до начала терапии инфликсимабом выявило увеличенное содержание активированных Т–хелперов, Th17-лимфоцитов и Th2-лимфоцитов у пациентов Группы 1 и Группы 2 по сравнению с контрольной группой. Количество Treg лимфоцитов у детей групп наблюдения также значимо превышало показатели контрольной группы. (Табл. 3.2.3) Сравнение количественных характеристик минорных популяций лимфоцитов у детей групп наблюдения выявило увеличение содержания активированных Т-хелперов, Th17-лимфоцитов, Treg лимфоцитов и Th2- лимфоцитов у пациентов с минимальным терапевтическим ответом на инфликсимаб (Рис. 3.2.3, Рис.3.2.4). Таблица 3.2.3 Содержание минорных популяций у детей с ВЗК до начала биологической терапии Содержание клеток Популяции лимфоцитов Th2-лимфоциты (CD3+CD4+CD294+) Treg лимфоциты (CD4+CD25+CD127low) Активированные Т-хелперы (CD4+CD25+CD127high) Th17-лимфоциты (CD3+CD4+CD161+) Относительное значение, % от ЛФ (% от СD4+) Абсолютное значение, кл/мкл Контрольная Группа 1 Группа 2 группа (Me, LQ-HQ) (Me, LQ-HQ) (Me, LQ-HQ) 0,6(0,4-0,8)* 0,8(0,5-1,1)* 0,6(0,4-0,8) 1,9(0,9-2,2) 1,1(0,9-1,8)* 2,0(1,0-2,4)* 12(9-19)* 3,9 (2,5-4,4)* 7,5 (6,4-9,3)* 18 (12-30)* 4,4(3,1-5,7)* 9,3(6,7-10,7)* 9(8-15) 3,3(3,1-3,8) 7,8(6,9-9,2) 77(56-110) 5,7 (4,5-8,9)* 13,2 (10,2-18,6)* 82(59-149) 8,3(5,3-11,3)* 17,3(12,7-22,7)* 63(50,0-76,5) 4,1(3,5-4,6) 10,0(8,4-11,5) 127(84-236) 8,2 (7,3-9,5)* 16,9 (13,8-21,3)* 174(116-241) 11,2(7,4-15,0)* 21,5(18,8-29,3)* 83 (70-91) 7,4(5,7-8,4) 16,0(13,9-18,6) 202(132-243)* 238(179-294)* 157(138-172) *p<0,05 при сравнении Группы 1 и Группы 2, тест Манн-Уитни Выделенным шрифтом отмечены достоверные (р<0,05) изменения по сравнению с контрольной группой 74 Исследование митохондриальной активности минорных популяций лимфоцитов у детей с ВЗК выявило значимое снижение активности СДГ в популяциях Th17-лимфоцитов у пациентов Группы 1 и Группы 2 по сравнению с контрольной группой (Табл. 3.2.4, Рис. 3.2.3). Таблица 3.2.4 Активность СДГ минорных популяций лимфоцитов у пациентов до начала биологической терапии и у детей контрольной группы Активность СДГ, у.е. (Me, LQ-HQ) Популяции лимфоцитов Группа 1 Группа 2 Контрольные значения Th2-лимфоциты (CD3+CD4+CD294+) 199,4 (186,8-208,5) 194,3 (177,1-206,9) 194,5(186,6-202,7) Treg лимфоциты (CD4+CD25+CD127low) Активированные Т-хелперы (CD4+CD25+CD127high) Th17-лимфоциты (CD3+CD4+CD161+) 210,5 (195,2-219,5)* 197,9 (186,3-210,3)* 203,7(195,7-211,2) 210,6 (193,4-218,6) 201,1 (186,4-213,2) 198,8(192,7-208,0) 188,0(179,8-201,5) 187,2(173,3-195,9) 191,0(186,1-200,7) *p<0,05 при сравнении Группы 1 и Группы 2, тест Манн-Уитни Выделенным шрифтом отмечены достоверные (р<0,05) изменения по сравнению с контрольной группой Рис. 3.2.3 Содержание Тh17-лимфоцитов и активность СДГ в них у пациентов со стойким положительным (Группа 1) и нестабильным (Группа 2) эффектом инфликсимаба и детей контрольной группы. Сравнение активности СДГ у детей в зависимости от эффекта биологической терапии показало значимое исходное увеличение активности СДГ 75 в популяции Treg лимфоцитов у детей со стойким эффектом от инфликсимаба (Табл. 3.2.4, Рис. 3.2.4). Рис. 3.2.4 Содержание Treg лимфоцитов и активированных Т-хелперов, активность СДГ в данных популяциях у пациентов со стойким положительным (Группа 1) и нестабильным (Группа 2) эффектом инфликсимаба и детей контрольной группы. Анализ популяционного состава В-лимфоцитов у детей с ВЗК показал значимое снижение численности В1-клеток на фоне увеличенного содержания В2-клеток у пациентов Группы 1 и Группы 2 по сравнению с контрольной группой. Сравнение соотношений популяций В-лимфоцитов в группах наблюдения показало значимое увеличение доли В1-клеток в общей популяции CD3СD19+лимфоцитов у пациентов Группы 2, при этом у детей из Группы 1 было выявлено достоверное увеличение содержания В2-клеток по сравнению с пациентами Группы 2. (Табл. 3.2.5) 76 Таблица 3.2.5 Содержание популяций В-лимфоцитов у пациентов из Группы 1 и Группы 2 до начала биологической терапии и детей контрольной группы Содержание клеток Популяции В-лимфоцитов В1-лимфоциты (CD3-CD19+CD5+) В2-лимфоциты (CD3-CD19+CD5-) Относительное значение, % от ЛФ (% от СD19+) Абсолютное значение, кл/мкл Контрольная Группа 1 Группа 2 группа, (Me, LQ-HQ) (Me, LQ-HQ) (Me, LQ-HQ) 4,3(3,1-7,2) 2,2(1,0-3,6) 2,2(1,1-4,0) 32,3(25,0-40,1) 13,5(9,7-19,9)* 18,6(12,6-24,1)* 36,7(22,3-101,3) 14,9(7,1-18,1)* 86,5(80,1-90,3)* 40,2(19,8-101,8) 9,0(6,0-12,0)* 81,4(75,9-87,4)* 111(74-155) 8,9(8,0-10,5) 67,8(53,6-77,5) 300,1(169,7-444,6)* 184,8(97,4-321,2)* 171(145-220) *p<0,05 при сравнении Группы 1 и Группы 2, тест Манн-Уитни Выделенным шрифтом отмечены достоверные (р<0,05) изменения по сравнению с контрольной группой Исследование митохондриальной активности популяций В-лимфоцитов показало увеличение активности В1-лимфоцитов у детей с ВЗК по сравнению с группой здоровых детей. Активность СДГ в популяции В2-лимфоцитов была увеличена у пациентов со стабильным эффектом инфликсимаба относительно контрольной группы. (Табл. 3.2.6) Таблица 3.2.6 Активность СДГ популяций В-лимфоцитов у пациентов со стойким (Группы 1) и нестойким (Группы 2) эффектом инфликсимаба до начала терапии Популяции лимфоцитов Активность СДГ, у.е. (Me, LQ-HQ) Группа 1 Группа 2 Контрольная группа В1-лимфоциты (CD3-CD19+CD5+) 183,2(170,9-202,9)* 173,2(155,9-187,7)* 160,7(154,1-172,8) В2-лимфоциты (CD3-CD19+CD5-) 154,5(144,9-159,8) 147,2(135,4-160,2) 144,8(139,3-150,0) *p<0,05 при сравнении Группы 1 и Группы 2, тест Манн-Уитни Выделенным шрифтом отмечены достоверные (р<0,05) изменения по сравнению с контрольной группой 77 Оценка активности СДГ у пациентов с разным эффектом инфликсимаба выявила значимое увеличение активности фермента в популяции В1-лимфоцитов у пациентов со стойким эффектом препарата по сравнению с детьми, имеющими нестабильный эффект терапии (Рис. 3.2.5). Рис. 3.2.5 Содержание и активность СДГ в популяциях В-лимфоцитов у пациентов со стойким положительным (Группа 1) и нестабильным (Группа 2) эффектом инфликсимаба и детей контрольной группы. Таким образом, у всех пациентов с ВЗК наблюдалось исходное снижение содержания В-лимфоцитов, наиболее выраженное у пациентов с нестабильным эффектом терапии блокаторами TNF-α. Митохондриальная активность Влимфоцитов была существенно выше у пациентов со стойким положительным ответом на инфликсимаб, по сравнению с детьми, имеющими нестабильный эффект терапии и контрольной группой. Исследование популяций В-лимфоцитов выявило значительное снижение исходного количества В1-лимфоцитов на фоне 78 увеличения содержания В2-лимфоцитов у всех детей с ВЗК по сравнению с контрольной группой, при этом у пациентов с нестабильным эффектом инфликсимаба наблюдались большее содержание В1-клеток и меньшее число В2-лифоцитов, чем у пациентов со стойким положительным ответом на терапию. Активность СДГ в популяции В1-лимфоцитов была значительно увеличена у пациентов двух групп до начала терапии по сравнению с контрольной группой, при этом наиболее выраженное изменение было выявлено в группе пациентов со стойким эффектом инфликсимаба. Исходная митохондриальная активность в популяции В2-лимфоцитов также была выше у пациентов со стойким положительным ответом на терапию по сравнению с контрольной группой и превышала таковые значения в группе с нестойким ответом на препарат. Исходное содержание Т-лимфоцитов соответствовало значениям контрольной группы и не отличалось между группами наблюдения, увеличение относительного количества Т-лимфоцитов имело перераспределительный характер и было наиболее выраженно у пациентов с нестабильным эффектом лечения. была Митохондриальная активность основных популяций Т-лимфоцитов существенно снижена у пациентов с нестабильным эффектом инфликсимаба, при этом у детей со стойким положительным ответом на препарат активность СДГ соответствовала нормальным значениям. Анализ популяций Т-лимфоцитов выявил существенное увеличение содержания активированных Т-хелперов, Th17-лимфоцитов, Treg лимфоцитов и Th2-лимфоцитов у всех пациентов с ВЗК до начала терапии вне зависимости от ее эффективности. Группа пациентов с минимальным терапевтическим ответом на инфликсимаб характеризовалась увеличением активированных Т-хелперов, Th17-лимфоцитов, исходного содержания Treg лимфоцитов и Th2- лимфоцитов по сравнению с пациентами со стойкой эффективностью препарата. Митохондриальная активность большинства минорных популяций Т-лимфоцитов соответствовала нормальным значениям, за исключением популяции Th17лимфоцитов, активность которых была снижена у всех детей, достигая минимальных значений у пациентов с нестабильным эффектом инфликсимаба. 79 Группа пациентов со стойким положительным ответом на биологическую терапию характеризовалась исходно более высокой активностью СДГ в популяции Treg по сравнению с пациентами, имеющими нестабильный эффект инфликсимаба. Все дети с ВЗК до начала терапии имели повышенное содержание активированных Т-лимфоцитов и NKT-лимфоцитов на фоне сниженного количества NK-клеток, при сохранении нормальной митохондриальной активности данных популяций Для выявления наиболее информативных показателей в прогнозировании эффективности терапии блокаторами TNF-α был проведен ROC-анализа данных иммуноцитохимического исследования и иммунофенотипа лимфоцитов периферической крови до начала лечения. Определение исходного содержания Th17-лимфоцитов, активности СДГ в популяции Treg лимфоцитов, Т-хелперах и В1-лимфоцитах соответствовало высокой вероятности правильного прогноза эффективности биологической терапии у детей с ВЗК (интервал AUC 0,8-0,9; p<0,05) (Рис. 3.2.6). Th17-лимфоциты, % от CD3+CD4+ АUC=0,844 Активность СДГ в популяции В1лимфоцитов, у.е. AUC=0,804 80 Активность СДГ в популяции Активность СДГ в популяции Т-хелперов, у.е. Treg лимфоцитах, у.е. AUC=0,811 AUC=0,820 Рис 3.2.6. ROC-анализ активности СДГ и количественных характеристик популяций лимфоцитов в прогнозе эффективности биологический терапии у детей с ВЗК. Оценка исходного содержания активированных Т-хелперов (%CD3+CD4+) и показателей активности СДГ в них, относительного количества В-лимфоцитов и активности СДГ в них, определение активности СДГ в популяциях Т-лимфоцитов, Th17-лимфоцитов, цитотоксических Т-лимфоцитов, В2-лимфоцитах, активированных Т-хелперах и активированных Т-лимфоцитах характеризовалась хорошим прогностическим качеством модели (интервал AUC 0,7-0,8; p<0,05) (Табл. 3.2.7, Табл. 3.2.8). Анализ прогностических моделей, построенных на измерении активности СДГ и количества NK-клеток, оценке абсолютного содержания В-лимфоцитов, соотношение популяций В1- и В2-лимфоцитов (% от CD19+), определении количества активированных Т-хелперов (% от ЛФ), Тreg лимфоцитов, активированных Т-лимфоцитов выявил средний уровень прогностической модели AUC(0,6-0,7; p<0,05). Вероятность правильного прогноза эффективности терапии инфликсимабом на основе определения количественных характеристик и митохондриальной активности других популяций лимфоцитов не превышала вероятности случайных событий. 81 Таблица 3.2.7 ROC-анализ количественных характеристик лимфоцитов периферической крови у детей с ВЗК до начала лечения для прогноза эффективности биологической терапии Популяции лимфоцитов Th17-лимфоциты, % CD4+ Th17-лимфоциты, %ЛФ Активированные Т-хелперы, % от СD4+ В-лимфоциты, % от ЛФ В1-лимфоциты, % от CD19+ В2-лимфоциты, % от CD19+ NK-клетки, % ЛФ Активированные Т-хелперы, % от ЛФ В-лимфоциты, кл/мкл Тreg лимфоциты, % от СD4+ Т-хелперы, % от ЛФ Активированные Т-лимфоциты, % ЛФ Тreg лимфоциты, % от ЛФ Площадь под ROC-кривой AUC(CI),p<0,05 0,844 (0,748-0,940) 0,787 (0,623-0,852) 0,728 (0,634-0,823) 0,723 (0,623-0,823) 0,683 (0,576-0,789) 0,683 (0,576-0,789) 0,668 (0,567-0,769) 0,650 (0,508-0,723) 0,650 (0,547-0,753) 0,645 (0,541-0,749) 0,619 (0,514-0,724) 0,616 (0,508-0,723) 0,600 (0,501-0,704) Таблица 3.2.8 ROC-анализ показателей иммуноцитохимического исследования лимфоцитов периферической крови у детей с ВЗК до начала лечения в прогнозе эффективности биологической терапии Активность СДГ Тreg лимфоциты Т-хелперы В1-лимфоциты Т-лимфоциты Th17-лимфоциты Цитотоксические Т-лимфоциты В-лимфоциты В2-лимфоциты Активированные Т-хелперы Активированные Т-лимфоциты NK-клетки Площадь под ROC-кривой AUC(CI), p<0,05 0,820 (0,743-0,896) 0,811 (0,734-0,889) 0,804 (0,720-0,889) 0,770 (0,684-0,855) 0,749 (0,638-0,861) 0,745 (0,655-0,835) 0,740 (0,647-0,832) 0,738 (0,641-0,834) 0,727 (0,633-0,820) 0,704 (0,608-0,800) 0,646 (0,543-0,750) 82 Сопоставление иммунофенотипирования прогностических и показателей возможностей данных митохондриальной активности лимфоцитов периферической крови выявило бόльшую информативность определения активности СДГ в популяциях лимфоцитов (Рис.3.2.7). Рис 3.2.7 ROC-анализ показателя митохондриальной активности Treg лимфоцитов (AUC = 0,820, p<0,05) и их относительного количества (AUC=0,600, p<0,05) в прогнозе эффективности биологической терапии у детей с ВЗК Уровень порогового значения (cut-off) был определен для наиболее значимых иммунологических показателей – относительного содержания Th17лимфоцитов (% от CD3+CD4+), активности СДГ в популяциях Тreg лимфоцитов, Т-хелперах и В1-лимфоцитах (Табл. 3.2.9). При выборе уровня cut-off учитывалась важность прогнозирования нестабильного ответа на терапию блокаторами TNF-α, что соответствовало бόльшему значению специфичности. 83 Таблица 3.2.9 Пороговое значение, чувствительность и специфичность наиболее информативных показателей иммунофенотипа и иммуноцитохимического исследования в прогнозе эффективности биологической терапии детей с ВЗК Пороговое значение Чувствительность Специфичность 18,6 70% 87% 207 67% 88% Активность СДГ в Т-хелперах, у.е. 197 70% 79% Активность СДГ в В1-лимфоцитах, у.е. 177 65% 76% Показатель Количество Th17-лимфоцитов, % CD4+ Активность СДГ в Тreg лимфоцитах, у.е. Таким образом, иммуноцитохимическое исследование и иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови у пациентов с ВЗК имеют прогностическую значимость и позволяют с высокой вероятностью правильно прогнозировать эффект лечения. Наиболее значимыми является определение: относительного количества Тh17-лимфоцитов до начала терапии исходной активности СДГ в популяции Treg лимфоцитов исходной активности СДГ в популяции Т-хелперов исходной активности СДГ в популяции В1-лимфоцитов. Значение относительного CD3+CD4+лимфоцитов), количества превышающее Тh17-лимфоцитов 18,6%, позволяет (% от прогнозировать нестабильный эффект от инфликсимаба с вероятностью 87%. Снижение митохондриальной активности Treg лимфоцитов ниже 207 у.е. соответствует прогнозу минимального терапевтического ответа на препарат с вероятностью 88%. Вероятность правильного прогноза эффективности биологической терапии, построенного на исследовании исходной активности СДГ в популяции Т-хелперов составила 79%, при этом снижение митохондриальной активности в данной популяции менее чем 197 у.е. является предиктором нестабильности терапевтического ответа. Значение исходной активности СДГ в популяции В1лимфоцитов ниже 177 у.е. соответствует прогнозу терапевтического ответа на инфликсимаб с вероятностью 75%. минимального 84 3.3. Динамика иммунологических показателей у пациентов с ВЗК в процессе лечения инфликсимабом Для оценки влияния биологической терапии на популяционный состав лимфоцитов и их иммуноцитохимических функциональное состояние показателей данных и проводился анализ иммунофенотипирования лимфоцитов периферической крови у пациентов с ВЗК в следующие временные интервалы: до начала терапии инфликсимабом, после проведения индукционного курса терапии (3 инфузии – 6 недель) и через год лечения (8-9 инфузий – 52 недели). Анализ количественных характеристик основных популяций лимфоцитов после индукционного курса выявил последующее снижение числа В-лимфоцитов и NK-клеток у всех пациентов с ВЗК по сравнению с контрольной группой (Табл. 3.3.1). Группа пациентов с нестабильным эффектом от инфликсимаба характеризовалась снижением количества цитотоксических Т-лимфоцитов и увеличением значения иммунорегуляторного индекса. Особенностью соотношения основных популяции в группе со стойким положительным эффектом от препарата явилось увеличение общего числа Т-лимфоцитов, цитотоксических Т-лимфоцитов, активированных Т-лимфоцитов и NKT-клеток по сравнению с пациентами с нестабильным ответом на препарат. Относительное содержание Тхелперов было достоверно выше у пациентов Группы 2, значение иммунорегуляторного индекса в данной группе также превышало показатели Группы 1 (Табл. 3.3.1). К году терапии у всех пациентов с ВЗК сохранялось снижение количества В-лимфоцитов и NK-клеток на фоне увеличенного содержания активированных Тклеток. Группа детей с нестабильным эффектом инфликсимаба характеризовалась сниженным количеством Т-хелперов, на фоне повышенного содержания цитотоксических Т-лимфоцитов. У пациентов со стойким положительным эффектом на препарат наблюдалось увеличение численности популяции Тхелперов и повышение значения иммунорегуляторного индекса (Табл. 3.3.1). 85 Таблица 3.3.1 Содержание основных популяций лимфоцитов у детей с ВЗК в течение первого года биологической терапии Содержание клеток Относительное значение,% Абсолютное значение, кл/мкл (Me, LQ-HQ) Популяции лимфоцитов До терапии Инд.курс 1 год терапии Гр.1 76,5(71,2-84,6),% 1699(1398-2522) 81,7(77,1-88,4) 1852(1446-2093)* 84,3(75,8-89,4)* 1835(1550-2247) Гр.2 79,8(75,0-84,7) 1605(1080-2495) 86,2(73,0-90,4) 1268(1026-1766)* 88,0(82,6-94,1)* 1483(1257-1882) Т-хелперы (CD3+CD4+ CD45+) Гр.1 47,6 (39,4-52,0) 1012(801-1401) 49,4(44,3-54,2)* 1132(850-1271) 53,2(44,8-56,0) 1125(960-1353)* Гр.2 49,6(42,3-52,8) 950(660-1493) 52,6(51,2-59,7) * 896(728-1092) 49,2(45,1-57,8) 857(649-1156)* Цитоток. Тлимфоциты Гр.1 25,2(22,8-32,2) 583(460-870) 28,9(26,3-33,2)* 633(553-789) * 27,4(24,9-28,8)* 594(544-756) (CD3+CD8+ СD45+) Гр.2 28,4(22,6-34,8) 548(401-952) 27,6(17,5-30,5)* 445(239-655) * 35,9(26,7-40,1)* 571(485-730) В-лимфоциты (CD3+CD19+ СD45+) Гр.1 17,0(7,7-20,5)* 349(163-550)* 12,7(7,0-18,2) 220(139-436) 12,7(7,7-19,6)* 230(148-587)* Гр.2 11,1(7,2-15,6)* 246(122-436)* 11,6(7,9-16,3) 202(90-348) 4,9(3,2-11,8)* 108(56-202)* Акт. Тлимфоциты (CD3+HLADR+) Гр.1 6,1(3,8-12,7) 159(85-320) 9,3(4,4-17,5) 186(98-377) * 6,5(4,5-12,6) 171(93-283) Гр.2 7,5(5,8-14,4) 181(126-233) 5,4(3,5-9,4) 86(57-139) * 10,0(6,7-14,4) 150(124-263) NK-клетки (CD3+CD16+ CD56) Гр.1 NKТлимфоциты (CD3+CD56+) Гр.1 6,4(4,1-9,2) 155(101-239) 7,7(2,7-12,3) 144(41-235) 1,9(1,1-3,9) 55 (29-81) 2,8(1,5-4,7) 52(31-96) 3,6(2,4-6,5) 89(53-142) 2,2(1,1-8,7) 56(15-112) 3,2(1,6-4,3) 70(33-112) * 2,2(1,6-3,0) 38(24-49) * 3,4(2,9-5,7) 72(49-113) 4,2(2,1-8,5) 64(38-148) 1,8(1,2-2,9) 45(29-82) 2,1(1,1-5,7) 39(24-83) Иммунорегул. индекс (CD4+/CD8+) Гр.1 1,9(1,4-2,1) 1,6(1,4-2,0)* 1,9(1,8-2,1)* Гр.2 1,7(1,3-2,3) 2,1(1,7-3,0) * 1,5(1,2-2,0)* Т-лимфоциты (CD3+CD45+) Гр.2 Гр.2 Контрольная группа 72,7(66,-79,8) 1717 (13401951) 43,2(37,4-45,8) 957(823-1105) 25,9(22,5-30,8) 678(468-759) 15,1(13,3-18,1) 351(293-402) 5,0(3,6-7,0) 113(70-145) 15,7(12,0-18,3) 297(187-424) 1,9(1,4-2,8) 41(30-53) 1,5(1,3-1,8) * p<0,05 при сравнении Группы 1 и Группы 2, тест Манн-Уитни Выделенным (р<0,05) и выделенным подчеркнутым (р<0,01) шрифтом отмечены достоверные изменения по сравнению с контрольной группой 86 Активность СДГ в основных популяциях лимфоцитов периферической крови у детей с ВЗК после индукционного курса терапии соответствовала показателям контрольной группы. Сравнение митохондриальной активности лимфоцитов у пациентов с разным эффектом биологической терапии выявило значимое увеличение активности СДГ в популяции NK-клеток у детей с нестойким эффектом от инфликсимаба по сравнению с группой пациентов со стабильным ответом на препарат (Табл. 3.3.2). Исследование активности СДГ в основных популяциях лимфоцитов через 1 год терапии выявило увеличение активности в популяции NK-клеток и NKTлимфоцитах у всех пациентов с ВЗК по сравнению с контрольной группой. Группа детей со стойким положительным ответом на препарат также характеризовалась повышением митохондриальной активности в популяциях Влимфоцитов и активированных Т-лимфоцитах по сравнению с контрольной группой. Активность СДГ в популяции Т-хелперов в данной группе пациентов значимо превышала показатели активности в группе детей с нестабильным эффектом инфликсимаба (Табл. 3.3.2). Таблица 3.3.2 Активность СДГ основных популяций лимфоцитов у пациентов с ВЗК в течение первого года биологической терапии Активность СДГ, у.е. (Me, LQ-HQ) Популяции лимфоцитов Т-лимфоциты (CD3+CD45+) Гр.1 Т-хелперы (CD3+CD4+ CD45+) Гр.1 Цитоток. Тлимфоциты Гр.1 Гр.2 Гр.2 (CD3+CD8+ СD45+) Гр.2 В-лимфоциты (CD3+CD19+ СD45+) Гр.1 Гр.2 До терапии Инд.курс 1 год терапии 203,2* (190,6-210,7) 192,5* (180,7-206,4) 203,3* (188,6-212,1) 191,8* (179,0-210,0) 200,7 (188,9-211,2) 190,7 (178,9-208,6) 157,9* (148,6-164,9) 150,6* (139,6-163,6) 199,2 (185,3-213,3) 198,2 (189,7-217,5) 196,2 (184,1-215,0) 196,0 (188,9-214,7) 198,4 (186,8-212,0) 201,6 (191,6-218,6) 146,4 (138,5-162,1) 141,3 (136,4-167,1) 209,4 (197,6-216,1) 200,0 (178,7-215,9) 208,1* (194,5-214,6) 188,8* (168,3-210,3) 209,2 (198,9-216,9) 204,8 (191,7-225,6) 155,1 (147,4-165,5) 146,7 (138,2-168,0) Контрольная группа 198,0 (193,5-204,2) 201 (188,7-205,8) 198,4 (193,2-207,3) 150,6 (144,0-153,9) 87 Акт. Тлимфоциты (CD3+HLADR+) NK-клетки (CD3+CD16+ CD56) Гр.1 NKТлимфоциты (CD3+CD56+) Гр.1 Гр.2 Гр.1 Гр.2 Гр.2 186,5 (175,7-192,9) 183,0 (172,4-191,5) 182,9 (171,8-199,3) 182,5 (171,8-198,0) 192,2 (182,9-202,8) 189,4 (173,1-206,6) 184,5 (172,0-194,1) 183,4 (174,3-192,9) 193,5 (182,6-206,0) 189,4 (180,4-203,2) 187,3* (141,5-205,8) 202,9* (169,2-218,5) 194,1 (179,3-206,1) 189,5 (180,5-206,6) 194,5 (181,8-204,6) 197,8 (176,7-212,3) 200,0 (190,5-210,7) 211,6 (190,0-226,0) 185,7 (176,8-191,1) 180,7 (176,1-190,8) 191,1 (183,7-201,1) * p<0,05 при сравнении Группы 1 и Группы 2, тест Манн-Уитни Выделенным шрифтом отмечены достоверные (р<0,05) изменения по сравнению с контрольной группой Таким образом, оценка основных популяций лимфоцитов выявила исходное снижение содержания В-лимфоцитов у всех пациентов с ВЗК, наиболее выраженное у детей с нестабильным эффектом биологической терапии. Динамическое наблюдение продемонстрировало постепенное снижение количества В-лимфоцитов в данной группе пациентов. Так к году терапии инфликсимабом степень снижения достигла 30% от контрольных значений и 44% от исходных показателей. В группе пациентов со стойким эффектом терапии наблюдалось снижение количества В-клеток на 25% от исходного к концу индукционного курса с последующим сохранением данных показателей в течение года терапии (Рис. 3.3.1). нестойкий эффект В-лимфоциты, % 19 стойкий эффект 17 15 13 11 нижняя граница референсного интервала 9 7 5 до 1 инфузии инд.курс 1 год терапии Рис. 3.3.1 Изменение относительного содержания В-лимфоцитов (%) у пациентов с нестойким и стойким положительным эффектом биологической терапии в течение 1 года 88 К году терапии у пациентов с нестойким эффектом инфликсимаба снижение относительного содержания В-лимфоцитов менее 12% (референсный интервал 12%-22%) наблюдалось в 55% случаев (Рис. 3.3.2). Рис.3.3.2 Распределение пациентов с нестойким эффектом инфликсимаба по относительному содержанию В-лимфоцитов (%) к году терапии Исходная митохондриальная активность В-лимфоцитов была существенно выше у пациентов со стойким положительным ответом на терапию, по сравнению с детьми, имеющими нестабильный эффект препарата, и контрольной группой. После индукционного курса активность СДГ в популяции В-лимфоцитов не отличалась между пациентами двух групп, а также от контрольной группы. К году лечения митохондриальная активность В-лимфоцитов в группе пациентов со стойким положительным эффектом от инфликсимаба возрастала и достоверно превышала значения контрольной группы и группы пациентов, имеющих минимальный терапевтический ответ на препарат. Все дети с ВЗК до начала терапии имели сниженное содержание NK-клеток, при сохранении неизмененной митохондриальной активности в данной популяции. В процессе лечения наблюдалось постепенное снижение количества NK-клеток, достигающее к году терапии показателей, соответствующих 25% от контрольных значений. Митохондриальная активности популяции NK-клеток 89 увеличивалась к году терапии у всех пациентов с ВЗК независимо от эффекта инфликсимаба (Рис 3.3.3). Рис.3.3.3 Изменение относительного содержания NK-клеток (%) и динамика активности СДГ в них у пациентов со стойким положительным (Группа1) и нестойким эффектом (Группа 2) от биологической терапии в течение 1 года лечения. Абсолютное содержание Т-лимфоцитов исходно не отличалось у пациентов групп наблюдения и контрольной группы. После индукционного курса наблюдалось снижение количества Т-лимфоцитов у пациентов с нестабильным эффектом биологической терапии с последующей нормализацией показателей. Исходное увеличение и последующий рост относительного содержания Т- лимфоцитов, наиболее выраженные у пациентов Группы 2, носило перераспределительный характер. Митохондриальная активность в популяции Т-лимфоцитов до начала лечения была существенно снижена у пациентов с нестабильным эффектом инфликсимаба, при этом у детей со стойким положительным ответом на препарат активность СДГ соответствовала нормальным значениям. После индукционного курса и в течение 1 года терапии наблюдалась нормализация показателей активности у пациентов двух групп, при этом у пациентов со стойким положительным эффектом инфликсимаба выявлены более высокие значения активности СДГ. 90 Исходное количество Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов не отличалось у пациентов с разным эффектом инфликсимаба, а так же контрольной группы. Последующее наблюдение выявило постепенное увеличение численности популяции Т-хелперов у пациентов со стабильным эффектом препарата; к концу года лечения количество Т-хелперов превышало контрольные значения на 23%. У пациентов с нестойким эффектом терапии наблюдалось скачкообразное увеличение относительного содержания Т-хелперов после индукционного курса, превышающее контрольные значения и показатели Группы 1. К концу первого года биологической терапии количество Т-хелперов в данной группе снижалось, не отличаясь от показателей контрольной группы и уступая таковым значениям в группе пациентов со стойким эффектом терапии. Содержание цитотоксических Т-лимфоцитов у пациентов со стойким эффектом биологической терапии увеличивалось к концу индукционного курса, однако к году терапии не отличалось от исходных показателей и контрольных значений (Рис.3.3.4). Группа пациентов с нестабильным эффектом инфликсимаба характеризовалась снижением содержания цитотоксических Т-лимфоцитов после индукционного курса, а к году терапии наблюдалось увеличение численности данной популяции, достигающее 30% от исходного количества (Рис.3.3.4). Рис. 3.3.4 Содержание Т-хелперов(%) и цитотоксических Т-лимфоцитов (%) у пациентов с нестойким и стойким эффектом инфликсимаба до 1 инфузии препарата и через 1 год лечения 91 Активность СДГ в популяции Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитах исходно была снижена у пациентов с нестойким эффектом биологической терапии по сравнению с контрольной группой и группой пациентов со стойким положительным ответом на инфликсимаб. В течение 1 года терапии наблюдалась нормализация показателей митохондриальной активности у всех пациентов, при этом у пациентов со стойким положительным эффектом препарата выявлены более высокие значения активности СДГ. У всех детей с ВЗК вне зависимости от эффективности инфликсимаба наблюдалось исходное увеличение содержания активированных Т-лимфоцитов относительно контрольной группы. После индукционного курса был выявлен рост численности данной популяции у пациентов со стойким положительным эффектом препарата, снижающийся к году терапии до исходных значений. В группе пациентов с нестабильным эффектом инфликсимаба в течение первого года терапии наблюдалось увеличение относительного количества активированных Т-лимфоцитов, превышающее контрольные значения в два раза к 52 неделе лечения. Митохондриальная активность в данной популяции до начала лечения и к концу индукционного курса не отличалась у пациентов с разным эффектом терапии и контрольной группы. После 1 года лечения выявлено увеличение активности СДГ в популяции активированных Т-лимфоцитов у пациентов со стойким эффектом инфликсимаба по сравнению с контрольной группой. Анализ количественных характеристик минорных популяций лимфоцитов выявил значимое увеличение содержания активированных Т-хелперов, Treg лимфоцитов, Th17-лимфоцитов и Th2-лимфоцитов у всех детей с ВЗК как до начала терапии, так и после индукционного курса инфликсимаба; увеличение численности данных популяций было наиболее выражено в группе пациентов с нестабильным эффектом биологической терапии (Табл. 3.3.3). В течение первого года терапии в группе пациентов с нестойким эффектом от инфликсимаба сохранялось повышенное содержание активированных Тхелперов и Th17-лимфоцитов. У пациентов со стойким положительным эффектом 92 от инфликсимаба также выявлено увеличенное количество активированных Тхелперов, при этом наблюдалось постепенное увеличение численности популяции Treg лимфоцитов с нормализацией содержания Th17-лимфоцитов к концу года лечения (Табл.3.3.3). Таблица 3.3.3 Содержание минорных популяций лимфоцитов у детей Группы 1 и Группы 2 в течение первого года биологической терапии и у детей контрольной группы Содержание клеток Популяции лимфоцитов До терапии Инд.курс 1 год терапии Контрольная группа 0,6(0,4-0,8)* 1,1(0,9-1,8)* 0,9(0,6-1,0) 1,8(1,3-2,1) 0,7(0,5-0,9) 1,2(1,0-1,8) 0,6(0,4-0,8) 1,9(0,9-2,2) 12(9-19)* 0,8(0,5-1,1)* 2,0(1,0-2,4)* 19(14-26) 0,9(0,5-1,9) 2,0(0,9-2,9) 14(10-20) 0,7(0,4-1,3) 1,6(0,8-2,3) 9(8-15) Гр.2 Гр.1 18 (12-30)* 3,9 (2,5-4,4)* 7,5 (6,4-9,3)* 19(8-24) 4,3(3,7-5,1)* 9,2(7,3-10,2) 17(6-25) 4,5(3,4-6,0) 9,2(7,2-10,5) Гр.2 77(56-110) 4,4(3,1-5,7)* 9,3(6,7-10,7)* 95(69-121) 5,1 (4,4-6,4)* 8,7(8,1-9,8) 100(78-135)* 4,3(3,4-5,8) 9,4(7,6-10,2) Гр.1 82(59-149) 5,7 (4,5-8,9)* 13,2 (10,2-18,6)* 85(71-128) 5,4(4,4-6,6)* 10,9(8,9-14,1)* 78(49-103)* 6,1(5,1-6,6) 11,0(10,0-17,1) Гр.2 127(84-236) 8,3(5,3-11,3)* 17,3(12,7-22,7)* 128(101-142) * 8,9(6,2-11,1)* 16,1(11,8-21,0)* 130(111-174) 6,5(4,5-8,2) 13,4(9,1-17,2) Гр.1 174(116-241) 8,2 (7,3-9,5)* 16,9 (13,8-21,3)* 172(116-194)* 10,8(9,9-12,5)* 24,6(19,9-27,3) 113(81-152) 7,0(5,6-9,1)* 18,0(11,8-20,3)* Гр.2 202(132-243)* 11,2(7,4-15,0)* 21,5(18,8-29,3)* 228(189-275) 16,1(11,5-20,6)* 28,2(24,2-30,8) 179(126-225)* 11,8(9,8-14,3)* 22,4(19,2-30,8)* 238(179-294)* 253(184-280) 218(148-256)* Гр.1 Th2-лимфоциты (CD3+CD4+ CD294+) Treg лимфоциты (CD4+CD25+ CD127low) Активир. Т-хелперы (CD4+CD25+ CD127high) Th17-лимфоциты (CD3+CD4+ CD161+) Относительное значение,% Абсолютное значение, кл/мкл (Me, LQ-HQ) 3,3(3,1-3,8) 7,8(6,9-9,2) 63,2(50,0-76,5) 4,1(3,5-4,6) 10,0(8,4-11,5) 83 (70-91) 7,4(5,7-8,4) 16,0(13,9-18,6) 157(138-172) * p<0,05 при сравнении Группы 1 и Группы 2, тест Манн-Уитни Выделенным шрифтом отмечены достоверные (р<0,05) изменения по сравнению с контрольной группой 93 Митохондриальная активность минорных популяций лимфоцитов у детей c ВЗК после индукционного курса терапии не отличалось между группами наблюдения, а также от показателей контрольной группы (Табл. 3.3.4). Исследование активности СДГ минорных популяций лимфоцитов после первого года биологической терапии выявило значимое увеличение активности Treg лимфоцитов у пациентов со стойким положительным эффектом от инфликсимаба по сравнению с контрольной группой и группой пациентов с нестабильным ответом на препарат. Кроме того у пациентов со стойким эффектом биологической терапии наблюдалось увеличение митохондриальной активности в популяции активированных Т-хелперов. (Табл. 3.3.4) Таблица 3.3.4 Активность СДГ минорных популяций лимфоцитов у пациентов с ВЗК в течение первого года биологической терапии Активность СДГ, у.е. (Me, LQ-HQ) Популяции лимфоцитов До терапии Инд.курс 1 год терапии Гр.1 199,4 (186,8-208,5) 194,3 (177,1-206,9) 210,5* (195,2-219,5) 197,9* (186,3-210,3) 210,6 (193,4-218,6) 201,1 (186,4-213,2) 188,0 (179,8-201,5) 187,2 (173,3-195,9) 190,5 (180,5-210,5) 192,4 (175,4-201,0) 199,4 (190,5-226,4) 200,0 (193,5-212,1) 204,4 (187,1-225,1) 202,4 (190,9-211,3) 193,3 (175,3-207,6) 185,7 (181,2-197,0) 199,1 (188,4-210,0) 197,0 (193,4-213,7) 213,1* (204,8-222,2) 197,4* (175,4-217,2) 211,8 (202,6-224,3) 207,7 (183,5-231,1) 190,8 (185,1-206,5) 191,7 (178,4-206,7) Th2-лимфоциты (CD3+CD4+ CD294+) Treg лимфоциты (CD4+CD25+ CD127low) Активир. Т-хелперы (CD4+CD25+ CD127high) Th17-лимфоциты (CD3+CD4+ CD161+) Гр.2 Гр.1 Гр.2 Гр.1 Гр.2 Гр.1 Гр.2 Контрольна я группа 194,5 (186,6-202,7) 203,7 (195,7-211,2) 198,8 (192,7-208,0) 191,0 (186,1-200,7) * p<0,05 при сравнении Группы 1 и Группы 2, тест Манн-Уитни Выделенным шрифтом отмечены достоверные (р<0,05) изменения по сравнению с контрольной группой Таким образом, у всех детей с ВЗК наблюдалось исходное увеличение содержания активированных Т-хелперов, Th17-лимфоцитов и Treg лимфоцитов, наиболее выраженное у пациентов с нестабильным эффектом инфликсимаба. После индукционного курса терапии в группе пациентов с нестабильным эффектом инфликсимаба наблюдалось увеличение относительного количества 94 активированных Т-хелперов (% от CD3+), при сохранении исходного содержания Treg лимфоцитов. Группа пациентов со стойким положительным эффектом биологической терапии характеризовалась увеличение содержания Treg лимфоцитов инфликсимаба на фоне снижения относительного содержания активированных Т-хелперов. К году лечения содержание активированных Тхелперов было сопоставимо у пациентов обеих групп и достоверно превышало Активированные Т-лхелперы, Treg лимфоциты, %СD3+CD4+ таковые в контрольной группе (Рис.3.3.5, Рис.3.3.6). Treg лимфоциты акт.T-хелперы 18,4 16,5 18 14,5 12,1 14 10 13,7 13,3 9,2 9,1 7,8 8,8 9,3 8,9 6 2 до 1 инфузии Группа 1 инд.курс Группа1 1год терапии до 1 инфузии Группа 1 Группа 2 инд.курс Группа 2 1 год терапии Группа 2 Рис. 3.3.5 Изменение относительного содержания активированных Т-хелперов (%) и Treg лимфоцитов (%) у пациентов с нестойким и стойким положительным эффектом биологической терапии в течение года лечения(M±m). Динамика содержания Treg лимфоцитов отличалась у пациентов с разным эффектом инфликсимаба. У пациентов со стойким терапевтическим ответом на препарат наблюдалось увеличение численности данной популяции, превышающей исходные показатели на 30% и контрольные значения на 36%. Группа пациентов с нестабильным эффектом от препарата характеризовалась снижением содержания Treg лимфоцитов, достигая к году терапии показателей контрольной группы (Рис.3.3.6). 95 Рис.3.3.6 Изменение содержания Th17-лимфоцитов и Treg лимфоцитов у пациентов со стойким положительным (Группа1) и нестойким эффектом (Группа 2) от биологической терапии в течение первого года Митохондриальная активность минорных популяций лимфоцитов характеризовалась исходным увеличением активности в популяции Treg лимфоцитов в группе пациентов со стойким эффектом инфликсимаба с последующим ростом активности к концу года терапии. В группе детей с нестойким эффектом инфликсимаба наблюдалась нормальная активность СДГ до начала терапии, с незначительным увеличением активности СДГ после индукционного курса и последующим ее снижением до исходного уровня к году лечения (Рис 3.3.7). стойкий эффект Активность СДГ в популяции Treg лимфоцитов,у.е. 220 нестойкий эффект 215 210 205 200 195 190 185 до 1 инфузии инд.курс 1 год терапии Рис. 3.3.7 Изменение активности СДГ в популяции Treg лимфоцитов у пациентов с нестойким и стойким положительным эффектом инфликсимаба в течение 1 года терапии 96 Активность СДГ в популяции активированных Т-хелперов до начала терапии и к концу индукционного курса не отличалась у пациентов с разным эффектом биологической терапии и от контрольной группы, однако, у пациентов со стойким положительным ответом на инфликсимаб наблюдалась тенденция к более высоким показателям активности. К году терапии выявлено увеличение митохондриальной активности в популяции активированных Т-хелперов выше контрольных значений у пациентов со стойким эффектом инфликсимаба. Анализ содержания Th17-лимфоцитов до начала терапии выявил значимое увеличение их количества у всех пациентов с ВЗК вне зависимости от эффекта биологической терапии. После индукционного курса наблюдалось рост численности данной популяции у пациентов обеих групп. У детей со стойким эффектом инфликсимаба прирост относительного количества Th17-лимфоцитов составил 30%, у пациентов с нестабильным эффектом терапии – 43% от исходного значения. После 1 года лечения инфликсимабом выявлено снижение содержания Th17-лимфоцитов у пациентов обеих групп, при этом у детей со стабильным положительным ответом на препарат относительное количество Th17-лимфоцитов достигало контрольных значений, в то время как у пациентов с нестабильным эффектом терапии содержание данных клеток достоверно превышало значения Th17 лимфоциты, % от CD3+CD4+ контрольной группы и детей Группы 1 (Рис.3.3.8). стойкий эффект 30 25,7 26 нестойкий эффект 26,8 25,1 24,6 22 18,2 17,5 18 14 10 до 1 инфузии инд.курс 1 год терапии Рис.3.3.8 Содержание Th17-лимфоцитов (%) у пациентов с нестойким и стойким положительным эффектом биологической терапии в течение 1 года (M±m) 97 Митохондриальная активность популяции Th17-лимфоцитов была снижена у всех детей, достигая минимальных значений у пациентов с нестабильным эффектом от инфликсимаба. После индукционного курса и в течение первого года терапии активности СДГ в данной популяции соответствовала контрольным значениям и не отличалась у пациентов двух групп. Индивидуальный анализ содержания Th17-лимфоцитов в течение года лечения инфликсимабом представлен на рисунке 3.3.10. У пациента с нестойким эффектом терапии наблюдается исходно увеличенное количество данных клеток без существенной положительной динамики в процессе лечения. Содержание Th17-лимфоцитов у пациента со стойким эффектом инфликсимаба до начала терапии значительно ниже, чем у больного с нестабильным эффектом, при этом количество данных клеток остается относительно постоянным в течение года 60 50 Пациент В. (нестойкий эффект) 40 30 20 Пациент И. (стойкий эффект) 10 до по 7 сл е 7 до по 6 сл е 6 до по 5 сл е 5 до по 4 сл е 4 до по 3 сл е 3 до по 2 сл е 2 0 до по 1 сл е 1 Th17-лимфоциты, % от CD3+CD4+ лечения (Рис. 3.3.9). инфузии Рис.3.3.9 Индивидуальный анализ содержания Th17-лимфоцитов у пациента с нестойким эффектом инфликсимаба (верхняя кривая) и пациента со стойким положительным ответом на препарат (нижняя кривая) в течение 1 года терапии. Изучение количественных характеристик популяций В-лимфоцитов выявило снижение абсолютного содержания В1-клеток на фоне увеличения численности В2-лимфоцитов у всех детей с ВЗК по сравнению с контрольной группой, как до начала лечения, так и после индукционного курса терапии (Табл. 3.3.5). 98 Сравнение содержания популяций В-лимфоцитов у детей с разным эффектом инфликсимаба выявило значимое увеличение доли В1-клеток в общей популяции В-лимфоцитов у пациентов Группы 2, при этом у детей из Группы 1 показано достоверное увеличение содержания В2-клеток до начала лечения и после индукционного курса (Табл. 3.3.5). К концу первого года терапии наблюдалось еще большее снижение абсолютного содержания В1-клеток при постепенном увеличении доли данной популяции в общем количестве В-клеток у пациентов с ВЗК по сравнению с контрольной группой; изменения были наиболее выражены в группе пациентов с нестабильным ответом на инфликсимаб. Кроме того, в данной группе пациентов отмечалось существенное снижение количества В2-лимфоцитов: абсолютное количество В2-клеток практически в три раза уступало нормальным значениям. Численность В2-лимфоцитов в группе пациентов со стабильным ответом на биологическую терапию соответствовал показателям контрольной группы к концу первого года лечения (Табл.3.3.5). Таблица 3.3.5 Содержание популяций В-лимфоцитов у пациентов с ВЗК в течение первого года биологической терапии Содержание клеток Относительное значение, % от ЛФ (% от СD19+) Абсолютное значение, кл/мкл Популяции лимфоцитов В1-лимфоциты (CD3-CD19+ CD5+) До терапии Гр.1 2,2(1,0-3,6) Гр.2 В2-лимфоциты (CD3-CD19+ CD5-) Инд.курс 1 год терапии Контрольная группа 13,5(9,7-19,9)* 2,2(1,4-3,7) 1,5(1,1-8,3) 19,1(15,9-24,1)* 21,0(11,7-38,4) 4,3(3,1-7,2) 32,3(25,0-40,1) 38(22,3-101,3) 2,2(1,1-4,0) 18,6(12,6-24,1)* 53(24-79) 36(24-252) 3,8(1,3-4,6) 1,4(1,1-2,2) 25,5(19,8-35,1)* 34,0(16,6-43,8) 111(74-155) 40,2(19,8-101,8) 61(16-82) 27(17-155) 9,7(5,2-15,0) 8,8(6,1-12,5)* 80,9(76,0-84,1)* 79,0(61,6-88,3) Гр.1 14,9(7,1-18,1)* 86,5(80,1-90,3)* 81,4(75,9-87,4)* 178(101-358) 218(118-282)* 8,9(6,2-11,6) 3,5(1,8-8,2)* 74,5(64,9-80,2)* 66,0(56,2-83,4) 184,8(97,4-321,2)* 123(73-275) 300,1(169,7-444,6)* Гр.2 9,0(6,0-12,0)* 8,9(8,0-10,5) 67,8(53,6-77,5) 171(145-220) 60(36-146)* * p<0,05 при сравнении Группы 1 и Группы 2, тест Манн-Уитни Выделенным шрифтом отмечены достоверные (р<0,05) изменения по сравнению с контрольной группой 99 Исследование митохондриальной активности популяций В-лимфоцитов выявило исходное увеличение активности СДГ в популяции В1-лимфоцитов у всех детей с ВЗК по сравнению с контрольной группой, наиболее выраженное у детей со стойким эффектом биологической терапии. Данная группа пациентов, кроме того, характеризовалась увеличением активности СДГ в популяции В2лимфоцитов по сравнению с контрольной группой. Анализ активности СДГ после индукционного курса не выявил достоверных различий между группами наблюдения и контрольной группой. (Табл. 3.3.6). К году терапии наблюдалось значимое увеличение активности СДГ в популяциях В1- и В2-лимфоцитов у пациентов со стойким эффектом от инфликсимаба по сравнению с контрольной группой и группой пациентов, имеющих нестабильный ответ на биологическую терапию (Табл. 3.3.6). Таблица 3.3.6 Активность СДГ популяций В-лимфоцитов у пациентов с ВЗК в течение первого года биологической терапии Активность СДГ, у.е. (Me, LQ-HQ) Популяции лимфоцитов В1-лимфоциты (CD3-CD19+ CD5+) Гр.1 В2-лимфоциты (CD3-CD19+ CD5-) Гр.1 Гр.2 Гр.2 До терапии Инд. курс 1 год терапии 183,2 (170,9-202,9)* 173,2 (155,9-187,7)* 154,5 (144,9-159,8) 147,2 (135,4-160,2) 164,4 (153,4-184,4) 162,1 (146,0-188,3) 142,3 (135,4-157,7) 139,8 (132,4-159,5) 172,0 (162,0-184,7) 163,9 (144,8-194,7) 154,6 (143,9-162,8) 146,3 (130,3-162,5) Контрольная группа 160,7 (154,1-172,8) 144,8 (139,3-150,0) *p<0,05 при сравнении Группы 1 и Группы 2, тест Манн-Уитни Выделенным шрифтом отмечены достоверные (р<0,05) изменения по сравнению с контрольной группой Таким образом, исследование количественных характеристик и митохондриальной активности популяций В-лимфоцитов выявило существенное снижение исходного абсолютного количества В1-лимфоцитов на фоне увеличения содержания В2-лимфоцитов у всех детей с ВЗК по сравнению с контрольной группой. У пациентов с нестабильным эффектом инфликсимаба наблюдались достоверно большее содержание В1-клеток и меньшее число В2-лифоцитов, чем у пациентов со стойким положительным ответом на терапию. 100 Последующее наблюдение показало постепенное нарастание дисбаланса в количественном соотношении популяций В-лимфоцитов у пациентов с нестойким эффектом инфликсимаба в течение 1 года терапии. Прирост относительного количеств В1-лимфоцитов (%от CD19+) у пациентов данной группы составил 37% после индукционного курса, а к году терапии был равен 83% по отношению к исходным показателям. Относительное содержание В2-лимфоцитов к концу индукционного курс снизилось на 7%, а к году терапии на 22% от исходного. Динамика численности популяций В-лимфоцитов у пациентов со стойким эффектом биологической терапии также характеризовалась постепенным нарастанием относительного количества В1-клеток. После индукционного курса прирост составил 40% от исходного, однако к году терапии наблюдалось снижение темпов роста количества В1-лимфоцитов – прирост по отношению к исходному количеству составил 55% от исходных показателей. В отличие от пациентов с нестабильным эффектом терапии, относительное количество В2лимфоцитов у детей со стойким положительным терапевтическим ответом на инфликсимаб оставалось в течение 1 года постоянным (Рис.3.3.10). В1-лимфоциты, % от CD3-СD19+ 40 нестойкий эффект стойкий эффект 35 30 25 20 15 10 до 1 инфузии инд.курс 1 год терапии Рис.3.3.10 Изменение относительного содержания В1-лимфоцитов(%) у пациентов с нестойким и стойким положительным эффектом биологической терапии в течение 1 года Активность СДГ в популяции В1-лимфоцитов до начала терапии была значительно увеличена у пациентов групп наблюдения по сравнению с 101 контрольной группой, при этом наиболее выраженное изменение было выявлено в группе пациентов со стойким эффектом инфликсимаба. Исходная митохондриальная активность в популяции В2-лимфоцитов также была выше у пациентов со стойким положительным ответом на терапию, по сравнению с контрольной группой, и превышала таковые значения в группе детей с нестойким ответом на препарат. После индукционного курса наблюдалось снижение митохондриальной активности в обеих популяциях В-лимфоцитов у всех детей с ВЗК вне зависимости от эффекта инфликсимаба. К году терапии активность СДГ в популяции В1- и В2- лимфоцитах возрастала в группе пациентов со стабильным эффектом инфликсимаба, а в группе с нестойким эффектом препарата не изменялась. Клинический пример №1 Пациент В., 14 лет Диагноз: Болезнь Крона толстой и тонкой кишки, свищевая форма, гормонорезистентная форма заболевания. В связи с неэффективностью системной ГКС-терапии (PCDAI=75, SESCD=12) ребенку назначена биологическая терапия блокаторами TNF-α – препарат инфликсимаб, доза - 5 мг/кг, по схеме 0-2-6-8 недель с последующим введением препарата каждые 8 недель. После индукционного курса биологической терапии диагностирована неполная клинико-лабораторная ремиссия заболевания (PCDAI=15),однако согласно данным эндоскопии у ребенка не наблюдалось снижение воспалительной активности на фоне проводимой терапии (SES-CD=12). Начиная с четвертой инфузии инфликсимаба, доза препарата повышена до 10 мг/кг. В течение последующих госпитализаций состояние ребенка с признаками минимальной положительной динамики в виде улучшения общего самочувствия. По данным лабораторных анализов и физикального осмотра сохранялась высокая воспалительная активность заболевания. К концу года терапии проведено 102 комплексное обследование, выявившее высокую клинико-эндоскопическую воспалительную активность заболевания (PCDAI=75, SES-CD=12). Анализ содержания В1-лимфоцитов выявил неуклонный рост численности данной популяции с 10% до 60% (относительно CD3-CD19+ лимфоцитов), что в два раза превышало нормальные значения. Митохондриальная активность В1лимфоцитов была исходно повышена у данного пациента и сохранялась на 80 240 70 200 60 160 50 40 120 30 80 20 40 10 B1-ЛФ СДГ 0 д по о 1 сл е 1 до по 2 сл е 2 до по 3 сл е 3 до по 4 сл е 4 до по 5 сл е 5 до по 6 сл е 6 до по 7 сл е 7 0 Активность СДГ, усл.ед. B1-лимфоциты, % от CD3-CD19+ высоком уровне в течение года наблюдений (Рис. 3.3.11). Рис.3.3.11 Индивидуальный анализ содержания В1-лимфоцитов и активности СДГ у пациента с нестойким эффектом инфликсимаба в течение 1 года терапии. Клинический пример №2 Пациент Г., 14 лет Диагноз: Болезнь Крона толстой и тонкой кишки, воспалительная форма, гормонорезистентная форма заболевания. В связи с неэффективностью системной ГКС-терапии (PCDAI=40, SESCD=12) ребенку назначена биологическая терапия блокаторами TNF-α – препарат инфликсимаб, доза - 5 мг/кг, по схеме 0-2-6-8 недель с последующим введением препарата каждые 8 недель. После индукционного курса биологической терапии диагностирована клинико-лабораторная ремиссия заболевания (PCDAI=10), по данным эндоскопического исследования у ребенка наблюдалось снижение воспалительной активности на фоне применения инфликсимаба (SES-CD=6). 103 Состояние ребенка оставалось стабильным в течение года биологической терапии. Комплексное обследование после 8 инфузий (1 год) инфликсимаба в дозе 5мг/кг подтвердило клинико-лабораторную и эндоскопическую ремиссию заболевания (PCDAI=0, SES-CD=0). Анализ содержания В1-лимфоцитов выявил незначительный рост численности данной популяции с 10% до 20% (относительно CD3-CD19+ лимфоцитов), митохондриальная активность В1-лимфоцитов была исходно повышена у данного пациента, однако в течение года наблюдений показатели 80 70 240 200 60 50 40 30 160 120 80 20 10 B1-ЛФ СДГ 0 д по о 1 сл е 1 до по 2 сл е 2 до по 3 сл е 3 до по 4 сл е 4 до по 5 сл е 5 до по 6 сл е 6 до по 7 сл е 7 0 40 Активность СДГ, усл.ед. B1-лимфоциты, % от CD3-CD19- активности оставались относительно стабильными (Рис. 3.3.12). Рис.3.3.12 Индивидуальный анализ содержания В1-лимфоцитов и активности СДГ у пациента со стойким положительным эффектом инфликсимаба в течение 1 года терапии. Таким образом, у всех пациентов с ВЗК на фоне применения биологической терапии наблюдалось постепенное снижение количества В-лимфоцитов и NKклеток, причем у пациентов с нестабильным эффектом терапии данные изменения выражены в большей степени. Динамическое наблюдение популяционного состава В-лимфоцитов выявило существенный рост относительного количества В1-клеток, наиболее выраженное у пациентов с нестабильным эффектом терапии. Сравнение содержания активированных Т-хелперов и Th17-лимфоцитов в группах пациентов с разным эффектом инфликсимаба выявило значительное увеличение относительного количества данных клеток у детей с нестойким эффектом 104 препарата на всех этапах лечения. При этом у пациентов со стойким ответом на биологическую терапию наблюдался рост численности популяции Treg лимфоцитов в течение первого года терапии. Митохондриальная активность популяций лимфоцитов у пациентов со стойким положительным ответом на инфликсимаб была достоверно выше на протяжении первого года биологической терапии по сравнению с пациентами с нестабильным эффектом препарата. 105 3.4. Лабораторные маркеры своевременного назначения биологической терапии у детей с ВЗК. Основными показаниями к назначению биологической терапии у детей с ВЗК являются выявление резистентности или развитие зависимости от стероидной терапии. Согласно данным литературы у трети пациентов с ВЗК не наблюдается стойкой клинико-эндоскопической ремиссии на фоне приема ГКС [70,154]. Точные механизмы формирования гормонозависимости и гормонорезистентности не известны, предполагается наличие генетическидетерминированных дефектов рецепторного аппарата, нарушение метаболизма стероидов, а также ингибирование цитокинами (IL-2, IL-4) каскада стероидиндуцированных сигнальных путей [70]. Поиск маркеров-предикторов гормонозависимости и гормонорезистентности является важным разделом исследований ВЗК в связи с внедрением новой стратегии лечения ВЗК, так называемого «нисходящего метода» («Top-down») терапии, подразумевающей раннее назначение иммуносупрессивных препаратов [3,78,119]. В РФ существующий протокол лечения ВЗК содержит указание на назначение биологических препаратов только после выявления у пациента гормонозависимости или гормонорезистентности, то есть по противоположному, «восходящему» («Step up») методу [4,6,7,119]. По данным литературы раннее назначение селективных блокаторов TNF-α позволяет существенно повысить эффективность лечения [3,78]. информативности В связи с этим актуальным иммунологических показателей в является оценка качестве маркеров своевременного назначения биологических препаратов у детей с ВЗК. Для выявления особенностей цитокинового профиля, иммунофенотипа лимфоцитов и данных иммуноцитохимического анализа у пациентов с ВЗК в зависимости от чувствительности к ГКС терапии были обследованы две группы пациентов, сопоставимые по активности заболевания и поло-возрастным 106 характеристикам. В одну группу (Группа 3) вошли 32 пациента с ВЗК, чувствительные к стероидной терапии. Другую группу (Группа 4) составили 46 детей с ВЗК, которым была назначена биологическая терапия в связи с гормонорезистентностью или развитием гормонозависимости. Исследование уровня кальпротектина, С-реактивного белка и СОЭ у пациентов двух групп не выявило значимых различий между детьми, устойчивыми к ГКС терапии, и пациентами, чувствительными к кортикостероидам (Табл. 3.4.1). Таблица 3.4.1 Данные стандартных лабораторных исследований у пациентов, чувствительных к ГКС терапии (Группа 3), и у детей, устойчивых к действию стероидов (Группа 4) Лабораторный параметр Кальпротектин, СОЭ, мм/ч СРБ, мг/л Группа 3 Группа 4 (Me, LQ-HQ) (Me, LQ-HQ) 943(300-1725) 15(9-24) 4,2(1,8-26,5) 770(101-1545) 12(7-21) 8,7(4,0-23,3) Референсный интервал Менее 30 0-10 0-5 Оценка цитокинового профиля не выявила достоверных различий между пациентами Группы 3 и Группы 4 (Табл. 3.4.2) . Таблица 3.4.2. Цитокиновый профиль у пациентов, чувствительных к ГКС терапии (Группа 3), и у детей, устойчивых к действию стероидов (Группа 4) Цитокин Концентрация цитокина до начала терапии, пг/мл (Me, LQ-HQ) IL-12p70 IFN-γ IL-2 IL-10 IL-8 Группа 3 (ГКС терапия) 1,5(1,3-1,5) 1,6(1,4-1,6) 5,0(3,0-12,0) 1,9(1,3-1,9) 0,7(0,5-41,4) Группа 4 (Биологическая терапия) 1,5(1,4-1,5) 1,5(1,4-1,6) 15,0(10,0-129,6) 1,9(1,5-6,7) 0,9(0,5-212,2) IL-6 1,2(1,0-1,2) 1,1(1,0-1,2) IL-4 15,0(15,0-20,0) 16,0(15,0-20,0) IL-5 1,6(1,3-1,6) 1,6(1,4-51,9) IL-1β 2,2(1,9-2,2) 2,0(2,0-2,2) TNF-α 0,8(0,5-1,1) 0,9(0,8-1,1) TNF-β 2,0(1,7-2,4) 2,4(1,7-2,4) IL-23 273,3(21,0-473,1) 89,9(20,0-894,2) IL-17А 235,0(1,7-404,1) 138,8(2,0-607,1) IL-22 35,0(10,0-301,3) 35,(28,0-35,0) 107 IL-13 92,1(4,2-184,5) 4,2(3,0-4,5) TGF-β 10423(3773-221024) 13895 (7685-24813) Сравнение количественных характеристик основных и малых популяций лимфоцитов также не выявило значимых различий между пациентами, чувствительными к ГКС и больными, устойчивыми к стероидной терапии (Табл. 3.4.3). Таблица 3.4.3 Содержание основных популяций лимфоцитов у пациентов, чувствительных к ГКС терапии (Группа 3), и у детей, устойчивых к действию стероидов (Группа 4) Содержание клеток Популяции лимфоцитов Относительное значение,% Абсолютное значение, кл/мкл (Me, LQ-HQ) Группа 1 (ГКС терапия) Группа 2 (Биологическая терапия ) Т-лимфоциты (CD3+CD45+) 80,6(72,9-84,7) 1428(1239-2029) 77,0(72,4-85,0) 1461(1156-1968) Т-хелперы (CD3+CD4+CD45+) 49,2(42,0-56,3) 891(708-1277) 47,1(38,9-52,1) 865(718-1189) Цитотоксические Т-лимфоциты (CD3+CD8+СD45+) 25,7(21,0-33,5) 513(401-636) 25,7(22,0-34,2) 488(390-883) В-лимфоциты (CD3+CD19+СD45+) 11,1(5,9-18,3) 260(97-493) 13,9(8,6-18,5) 270(153-436) Активированные Т-лимфоциты (CD3+HLA-DR+) 7,2(5,3-14,4) 165(124-258) 6,6(3,9-12,8) 154(70-231) NK-клетки (CD3+CD16+CD56) 6,8(3,4-13,9) 134(75-249) 7,5(2,4-11,9) 146(41-217) NKT-лимфоциты (CD3+CD56+) 2,0(0,8-4,8) 44(19-81) 2,1(1,4-3,2) 38,8(23,3-73,8) Иммунорегуляторный индекс (CD4+/CD8+) 1,98(1,4-2,3) 1,8(1,2-2,2) Оценка митохондриальной активности основных популяций лимфоцитов периферической крови у детей групп наблюдения выявила значимое снижение активности СДГ в общей популяции Т-хелперов у детей Группы 3 по сравнению с пациентами Группы 4 (Табл. 3.4.4, Рис.3.4.1). 108 Таблица 3.4.4 Активность СДГ основных популяций лимфоцитов у пациентов, чувствительных к ГКС терапии (Группа 3), и у детей, устойчивых к действию стероидов (Группа 4) Популяции лимфоцитов Т-лимфоциты (CD3+CD45+) Т-хелперы (CD3+CD4+CD45+) Цитотоксические Т-лимфоциты (CD3+CD8+СD45+) В-лимфоциты (CD3+CD19+СD45+) Активированные Т-лимфоциты (CD3+HLA-DR+) NK-клетки (CD3+CD16+CD56) NKT-лимфоциты (CD3+CD56+) Активность СДГ, у.е. (Me, LQ-HQ) Группа 3 (ГКС терапия) 179,6 (164,5-194,2) 178,6 * (160,4-191,7) Группа 4 (Биологическая терапия) 190,3 (174,1-202,8) 188,9 * (174,7-203,9) 179,7 (168,9-195,2) 190,2 (177,4-201,4) 139,4 (126,3-160,6) 149,6 (132,9-158,6) 174,9 (163,0-187,2) 179,8 (166,7-189,5) 170,3 (153,0-185,9) 183,1 (164,9-191,5) 178,2 (160,0-197,5) 183,8 (172,2-196,0) * p<0,05 при сравнении Группы 3 и Группы 4, тест Манн-Уитни 109 Рис. 3.4.1.Активность СДГ в популяции Т-хелперов у пациентов, чувствительных к ГКС терапии (Группа 3), и у детей, устойчивых к действию стероидов (Группа 4) Количественные характеристики минорных популяций периферических лимфоцитов не отличалось у пациентов, чувствительных к ГКС-терапии и детей, устойчивых к действию стероидов (Табл. 3.4.5). Таблица 3.4.5 Содержание минорных популяций лимфоцитов у пациентов, чувствительных к ГКС терапии (Группа 3), и у детей, устойчивых к действию стероидов (Группа 4) Содержание клеток Популяции лимфоцитов Th2-лимфоциты (CD3+CD4+CD294+) Тreg-лимфоциты (CD4+CD25+CD127low) Активированные Т-хелперы (CD4+CD25+CD127high) Th17-лимфоциты (CD3+CD4+CD161+) Относительное значение, % от ЛФ (% от СD4+) Абсолютное значение, кл/мкл Группа 3 Группа 4 (Me, LQ-HQ) (Me, LQ-HQ) 0,7(0,3-0,9) 0,5(0,4-0,9) 1,2(0,7-1,7) 1,1(0,8-1,9) 12(8-17) 4,0(3,7-5,0) 8,6(7,4-9,3) 11(7-17) 4,1(2,7-5,4) 9,1(6,7-11,0) 74(65-108) 5,3(4,1-7,8) 11,5(7,5-18,6) 73(56-110) 5,5(4,2-8,4) 12,7(9,3-17,6) 108(74-159) 7,3(5,4-11,3) 15,5(12,3-25,5) 107(77-155) 7,9(5,9-10,8) 16,4(12,4-25,6) 163(121-246) 158(114-187) Оценка активности СДГ минорных популяций Т-лимфоцитов также не выявила значимых различий при сравнении двух групп (Табл. 3.4.6). Таблица 3.4.6 Активность СДГ минорных популяций лимфоцитов у пациентов, чувствительных к ГКС терапии (Группа 3), и у детей, устойчивых к действию стероидов (Группа 4) Популяции лимфоцитов Th2-лимфоциты (CD3+CD4+CD294+) Тreg-лимфоциты (CD4+CD25+CD127low) Активированные Т-хелперы (CD4+CD25+CD127high) Активность СДГ, у.е. (Me, LQ-HQ) Группа 3 (ГКС терапия) Группа 4 (Биологическая терапия) 177,3(165,2-200,5) 186,2(174,3-204,4) 186,0(163,6-200,4) 194,6(184,4-209,7) 183,4(171,1-207,4) 193,6(182,7-211,4) 110 Th17-лимфоциты (CD3+CD4+CD161+) Исследование 172,1(156,1-190,5) распределения 182,6(170,4-189,8) популяций В-лимфоцитов у детей, чувствительных и резистентных к ГКС терапии, не выявило значимых различий между содержанием В1- и В2-лимфоцитов (Табл. 3.4.7). Таблица 3.4.7 Содержание популяций В-лимфоцитов у пациентов, чувствительных к ГКС терапии (Группа 3), и у детей, устойчивых к действию стероидов (Группа 4) Популяции В-лимфоцитов В1-лимфоциты (CD3-CD19+CD5+) В2-лимфоциты (CD3-CD19+CD5-) Содержание клеток Относительное значение, % от ЛФ (% от СD19+) Абсолютное значение, кл/мкл Группа 3 (Me, LQ-HQ) 2,1(1,0-3,8) 21,0(9,1-21,8) Группа 4 (Me, LQ-HQ) 2,2(1,0-3,4) 13,7(10,7-27,2) 57(22-88) 10,9(7,8-14,3) 79,3(78,4-90,9) 37(21-84) 9,0(6,4-15,8) 86,3(72,8-89,3) 219(107-321) 185(106-340) Анализ митохондриальной активности популяций В-лимфоцитов выявил значимое увеличение активности СДГ в популяции В1-клеток у детей Группы 4 по сравнению с детьми из Группы 3 (Табл. 3.4.8, Рис.3.4.2). Таблица 3.4.8 Активность СДГ популяций В-лимфоцитов у пациентов, чувствительных к ГКС терапии (Группа 3), и у детей, устойчивых к действию стероидов (Группа 4) Популяции лимфоцитов Активность СДГ, у.е. (Me, LQ-HQ) Группа 3 (ГКС терапия) Группа 4 (Биологическая терапия) В1-лимфоциты (CD3-CD19+CD5+) 159,5(137,0-173,8)* 175,8(153,8-190,6)* В2-лимфоциты (CD3-CD19+CD5-) 135,4(124,1-152,6) 145,9(127,6-155,6) *p<0,05 при сравнении Группы 3 и Группы 4, тест Манн-Уитни 111 Рис 3.4.2 Активность СДГ в популяции В1-лимфоцитов у пациентов, чувствительных к ГКС терапии (Группа 3), и у детей, устойчивых к действию стероидов (Группа 4) Таким образом, у детей с гормонозависимой или гормонорезистентной формой заболевания наблюдалась более высокая митохондриальная активность в популяции Т-хелперов и В1-клетках по сравнению с пациентами с ВЗК, чувствительными к ГКС-терапии. Согласно существующим протоколам лечения ВЗК биологическая терапия назначается после подтверждения неэффективности системной ГКС-терапии и цитостатической терапии [3,4]. Как правило, к моменту начала биологической терапии в анамнезе пациентов констатируются длительные курсы приема стероидов. состояние ГКС-терапия, несомненно, оказывает значительное влияние на иммунной системы. Кроме диагностируются побочные эффекты после того у большинства больных продолжительного приема ГКС- препаратов. Показано, что длительные курсы иммуносупрессивной терапии у детей с ВЗК меняет естественных ход патологического процесса [48,76,154]. В связи с вышеизложенным, следующим этапом работы явился анализ иммунологических показателей в зависимости от длительности болезни. Для исключения влияние инфликсимаба на состояние клеточного и гуморального иммунитета поставленная задача реализовывалась на выборке пациентов, не 112 получавших биологическую терапию. Было проанализировано 34 пациента с длительностью заболевания менее 2 лет, 32 пациента с длительностью от 2 до 5 лет и 19 пациентов с длительности болезни больше 5 лет. Оценка цитокинового профиля у детей с разной длительностью заболевания выявила постепенное снижение концентрации большинства цитокинов с увеличением длительности заболевания (Табл.3.4.9) Таблица 3.4.9. Цитокиновый профиль у пациентов с ВЗК при разной продолжительности заболевания Концентрация цитокина, пг/мл (Me, LQ-HQ) Продолжительность болезни Цитокин < 2 лет IL-12p70 IFN-γ IL-2 IL-10 IL-8 IL-6 IL-4 IL-5 IL-1β TNF-α TNF-β IL-23 IL-17А IL-22 IL-13 TGF-β 2-5 года 1,7(1,5-1,7)* 1,6(1,6-86,2)* 15,0(10,0-226,4)* 1,9(1,5-53,9)* 0,7(0,5-265,4) 1,2(1,0-13,3)* 20,0(15,0-344,4)* 1,6(1,3-173,4)* 2,2(2,0-39,4)* 1,1(0,5-23,9)* 2,4(1,7-2,4) 20,0(20,0-339,9) 53,1(1,7-442,9) 28,0(10,0-35,0) 4,2(3,0-4,5) 15949 (9531-26143)* >5 лет 1,5(1,5-1,7) 1,6(1,4-33,4) 15,0(1,4-217,9) 1,9(1,5-12,3) 47,8(0,0-262,0) 1,2(1,0-7,5) 20,0(17,0-161,5) 1,5(1,3-95,1) 2,0(1,9-7,3) 1,0(0,5-7,8) 2,2(1,7-2,4) 21,0(17,0-473,1) 52,8(1,7-526,6) 29,0(15,0-35,0) 4,2(4,2-4,5) 12346 (5415-23119) 1,2(1,0-1,5)* 1,6(1,4-1,6)* 15,0(10,0-15,0)* 1,7(1,5-1,9)* 0,7(0,5-155,1) 1,2(1,0-1,2)* 17,1(15,0-20,0)* 1,4(1,3-1,6)* 2,2(1,8-2,4)* 0,7(0,5-1,1)* 2,0(1,7-2,4) 18,2(17,0-332,4) 42,9(2,1-408,3) 30,0(10,0-35,0) 4,0(3,0-4,0) 8988 (4471-22782)* *p<0,05 при сравнении групп с продолжительностью болезни менее 2 лет и более 5 лет, тест Манн-Уитни Планомерное снижение концентраций наблюдалось как для провоспалительных, так и для противовоспалительных цитокинов (Рис. 3.4.3, Рис. 3.4.4). 113 Рис.3.4.3 Динамика плазменного содержания TNF-α у пациентов с ВЗК при разной длительности заболевания. Рис.3.4.4 Динамика плазменного содержания TGF-β у пациентов с ВЗК при разной длительности заболевания. Оценка динамики снижение количества (Табл.3.4.10, Рис.3.4.5). показателей иммунофенотипа выявила значимое NK-клеток с увеличением длительности заболевания 114 Таблица 3.4.10 Содержание основных популяций лимфоцитов у детей с ВЗК при разной продолжительности болезни Содержание клеток Популяции лимфоцитов Относительное значение,% Абсолютное значение, кл/мкл (Me, LQ-HQ) Продолжительность болезни < 2 лет 2-5 года >5 лет Т-лимфоциты (CD3+CD45+) 80,4(72,0-84,1) 1235(1025-1652) 80,4(77,0-85,4) 1507(1152-1983) 77,9(72,4-82,6) 1346(1223-1468) Т-хелперы (CD3+CD4+CD45+) 47,6(41,8-50,7) 810(582-1086) 44,5(37,9-52,2) 752(519-1206) 48,9(43,5-51,9) 882(832-94) Цитотоксические Т-лимфоциты (CD3+CD8+СD45+) 26,4(23,3-34,5) 448(343-572) 34,0(25,2-41,9) 608(435-970) 24,2(23,1-28,5) 438(400-540) 10,2(4,8-17,8) 163(62-313) 7,1(5,6-10,1) 125(74-290) 14,8(10,4-20,0) 279(158-423) Активированные Тлимфоциты (CD3+HLA-DR+) 6,9(5,3-15,5) 159(72-250) 11,9(7,2-24,1) 257(146-415) 3,2(2,6-8,0) 70(44-150) NK-клетки (CD3+CD16+CD56) 10,8(5,8-14,3)* 193(88-262) * 9,3(5,3-14,7) 176(113-261) 5,5(3,0-7,7)* 104(49-180) * NKT-лимфоциты (CD3+CD56+) 1,8(1,2-4,8) 31(19-78) 3,0(2,2-5,7) 76(27-101) 2,4(1,2-3,7) 40(29-69) Иммунорегуляторный индекс (CD4+/CD8+) 1,8(1,2-2,3) 1,3(0,8-2,2) 1,8(1,7-2,2) В-лимфоциты (CD3+CD19+СD45+) *p<0,05 при сравнении групп с продолжительностью болезни менее 2 лет и более 5 лет, тест Манн-Уитни 115 Рис 3.4.5 Динамика относительного содержания NK-клеток у пациентов с ВЗК с увеличением длительности заболевания. Анализ динамики митохондриальной активности лимфоцитов у детей с ВЗК выявил значимое снижение активности СДГ в общей популяции Т-лимфоцитов, в популяции Т-хелперов, активированных Т-клетках, В-лимфоцитах и NKT-клетках с увеличением длительности заболевания (Табл. 3.4.11, Рис 3.4.6, Рис 3.4.7). Таблица 3.4.11 Активность СДГ основных популяций лимфоцитов у детей с ВЗК при разной продолжительности болезни Популяции лимфоцитов Т-лимфоциты (CD3+CD45+) Т-хелперы (CD3+CD4+CD45+) Цитотоксические Т-лимфоциты (CD3+CD8+СD45+) В-лимфоциты (CD3+CD19+СD45+) Активированные Т-лимфоциты (CD3+HLA-DR+) NK-клетки (CD3+CD16+CD56) NKT-лимфоциты (CD3+CD56+) Активность СДГ, у.е. (Me, LQ-HQ) Продолжительность болезни < 2 лет 2-5 года >5 лет 193,9* 190,8 179,0* (180,7-209,1) (173,5-200,0) (168,8-190,6) 191,4 * 187,7 173,7* (178,8-210,0) (168,9-201,8) (167,7-187,8) 190,5 (178,6-205,0) 191,3 (176,5-197,2) 180,7 (167,1-189,0) 157,9* (138,3-164,9) 153,9 (139,2-157,6) 129,4* (125,2-140,7) 187,1* (173,7-194,6) 177,5 (167,7-187,1) 176,7* (161,0-183,2) 185,1 (175,0-200,0) 190,4* (181,9-202,8) 180,9 (168,2-186,3) 183,5 (177,0-196,0) 185,9 (176,9-195,1) 168,1* (164,6-181,1) *p<0,05 при сравнении групп с продолжительностью болезни менее 2 лет и более 5 лет, тест Манн-Уитни 116 Рис 3.4.6 Динамика активности СДГ в популяции Т-хелперов у пациентов с ВЗК с увеличением длительности заболевания. Рис 3.4.7 Динамика активности СДГ в популяции B1-лимфоцитов у пациентов с ВЗК с увеличением длительности заболевания. Оценки численности минорных популяций в зависимости от длительности заболевания выявила значимое снижение относительного количества активированных Т-хелперов у пациентов, болеющих более пяти лет (Табл. 3.4.12). 117 Таблица 3.4.12 Содержание минорных популяций лимфоцитов у детей с ВЗК при разной продолжительности болезни Содержание клеток Популяции лимфоцитов Th2-лимфоциты (CD3+CD4+CD294+) Treg лимфоциты (CD4+CD25+CD127low) Активированные Т-хелперы (CD4+CD25+CD127high) Th17-лимфоциты (CD3+CD4+CD161+) Относительное значение, % от ЛФ (% от СD4+) Абсолютное значение, кл/мкл Продолжительность болезни < 2 лет 2-5 года >5 лет 0,6(0,4-1,0) 1,4(0,8-2,4) 0,6(0,5-0,8) 1,3(1,0-1,8) 0,6(0,4-0,9) 1,0(0,7-1,9) 11(6-16) 4,5(3,3-4,9) 8,7(6,7-11,1) 12,1(9,6-22,9) 3,2(2,4-4,7) 8,0(6,3-10,0) 9(7-14) 4,5(4,0-7,6) 9,1(7,6-12,3) 68(52-82) 7,4(5,2-9,0) 14,8(11,8-19,6)* 62(41-113) 5,7(4,3-10,4) 15,8(10,7-23,5) 80(71-117) 4,7(3,9-7,6) 10,2(8,1-13,5)* 116(92-149) 9,8(7,2-12,2) 21,1(16,4-28,1) 116(80-195) 8,4(6,0-12,1) 23,5(15,6-27,7) 88(67-137) 7,4(4,7-9,5) 14,3(8,2-20,3) 170(130-246) 150(117-224) 135(78-179) *p<0,05 при сравнении групп с продолжительностью болезни менее 2 лет и более 5 лет, тест Манн-Уитни Митохондриальная активность минорных популяций лимфоцитов не различалась у пациентов с разной длительностью заболевания (Табл. 3.4.13). Таблица 3.4.13 Активность СДГ минорных популяций лимфоцитов у детей с ВЗК при разной продолжительности болезни Популяции лимфоцитов Th2-лимфоциты (CD3+CD4+CD294+) Тreg-лимфоциты (CD4+CD25+CD127low) Активированные Т-хелперы (CD4+CD25+CD127high) Th17-лимфоциты (CD3+CD4+CD161+) Активность СДГ, у.е. (Me, LQ-HQ) Продолжительность болезни < 2 лет 2-5 года >5 лет 196,9 174,7 182,7 (181,1-209,5) (166,5-197,7) (177,3-200,7) 197,0 (187,4-214,7) 191,5 (173,5-209,5) 194,0 (170,9-200,4) 205,0 (182,7-216,6) 193,0 (180,0-208,9) 192,9 (183,6-196,4) 189,6 (173,8-192,1) 177,0 (168,1-186,9) 175,4 (169,5-188,4) 118 Исследование популяций В-лимфоцитов и активности СДГ в них не выявило достоверных различий у пациентов при разной продолжительности заболевания (Табл.3.4.14, Табл.3.4.15). Таблица 3.4.14 Содержание популяций В-лимфоцитов у детей с ВЗК при разной продолжительности болезни Популяции В-лимфоцитов В1-лимфоциты (CD3-CD19+CD5+) В2-лимфоциты (CD3-CD19+CD5-) Содержание клеток Относительное значение, % от ЛФ (% от СD19+) Абсолютное значение, кл/мкл Продолжительность болезни < 2 лет 2-5 года >5 лет 2,1(1,1-2,8) 1,3(0,8-2,5) 1,9(0,9-5,0) 14,7(9,9-21,8) 18,8(12,1-24,5) 10,9(5,3-33,8) 32(19-70) 11,9(6,4-16,6) 85,3(78,2-90,2) 21(14-57) 6,3(4,0-8,0) 81,3(75,5-88,0) 37(13-94) 13,9(9,5-18,9) 89,1(66,2-94,7) 198(107-328) 103(53-223) 227(131-321) *p<0,05 при сравнении Группы 1 и Группы 2, тест Манн-Уитни Выделенным шрифтом отмечены достоверные (р<0,05) изменения по сравнению с контрольной группой Таблица 3.4.15 Активность СДГ популяций В- лимфоцитов у детей с ВЗК при разной продолжительности болезни Активность СДГ, у.е. (Me, LQ-HQ) Популяции лимфоцитов < 2 лет Продолжительность болезни 2-5 года >5 лет В1-лимфоциты (CD3-CD19+CD5+) 176,3(163,1-189,5) 172,1 (165,1-183,9) 157,5(142,2-190,6) В2-лимфоциты (CD3-CD19+CD5-) 146,9(134,3-159,5) 145,9 (132,7-153,0) 135,4(118,9-153,9) *p<0,05 при сравнении Группы 1 и Группы 2, тест Манн-Уитни Выделенным шрифтом отмечены достоверные (р<0,05) изменения по сравнению с контрольной группой Таким образом, можно сделать вывод, что с увеличением длительности заболевания происходит снижение митохондриальной активности в основных популяциях лимфоцитов (в Т-хелперах, В-лимфоцитах), наиболее выраженное у пациентов с продолжительностью заболевания более 5 лет. Естественное течение болезни характеризовалось почти двукратным снижением содержания NK- клеток за три года болезни. С увеличением длительности заболевания наблюдалось снижение содержания активированных Т-хелперов периферической крови. 119 Согласно полученным данным, нестойкий эффект биологической терапии определяется сниженной митохондриальной активности в основных популяциях лимфоцитов, низкими показателями содержания циркулирующих цитокинов, значительным снижением количества NK-клеток. В связи с нарастанием аналогичных изменений c увеличении длительности заболевания, можно утверждать, что раннее назначение биологической терапии способствует улучшению прогноза эффективности лечения и повышению качества жизни пациента. Одними из факторов, приводящих в ранней потере ответа на инфликсимаб, является выработка антител к препарату, в виду активации гуморального иммунитета [115]. Подтверждением вовлечения В-клеточного звена иммунитета в развитие воспалительной реакции при ВЗК является обнаружение в сыворотке больных cerevisiae, высоких титров аутоантител, например, антител к Saccharomyces антинейтрофильных антител, антител к экзокринной части поджелудочной железы, антител к гликопротеину [60,75,147]. Показано, что титры аутоантител коррелируют с фенотипом болезни, локализацией воспалительного очага, эндоскопической активностью заболевания [60,147,165]. Таким образом, имеющиеся данные позволяют предположить диагностическую значимость определения аутоантител для оценки стадии ВЗК у детей и прогнозирования эффективности лечения. Анализ содержания аутоантител к гликопротеину 2 (anti-GP2) проводился у 55 детей с БК и 28 детей с ЯК от одного до семи раз в процессе лечения, 31 пациент получал биологическую терапию. Исследование включало сравнение содержания anti-GP2 антител в зависимости от эффективности биологической терапии и продолжительности болезни. Оценка содержания anti-GP2 IgG у пациентов с разной длительностью заболевания выявила значимое увеличение уровня аутоантител у пациентов, страдающих ВЗК более 5 лет (р<0,05) (Рис. 3.4.8). 120 Рис.3.4.8 Уровень anti-GP2 IgG у пациентов с ВЗК при разной длительности заболевания Исследование взаимосвязи уровня anti-GP2 IgG и IgA и эффекта биологической терапии проводили у 31 ребенка с ВЗК в течение индукционного курса терапии (6 недель). Выявлено, что у пациентов с нестабильным эффектом инфликсимаба наблюдались исходно более высокие титры IgА аутоантител к рецептору GP2 по сравнению с детьми со стойким положительным ответом на препарат (p<0,05) (Рис.3.4.9). Рис.3.4.9 Исходный уровень anti-GP2 IgА у пациентов с ВЗК при разном эффекте биологической терапии (6 недель), 0- нестойкий эффект терапии, 1 – стойкий эффект инфликсимаба. 121 Клинический пример №1 Пациент П. 13 лет. Диагноз: Болезнь Крона тонкой и толстой кишки, смешанная форма (открытый свищ перианальной области, стеноз толстой кишки в области селезеночного угла), высокая степень активности, обострение (PCDAI =70, SES-CD=13). Биологическая терапия назначена в связи с нарастанием воспалительной активности, формированием гормонозависимости и наличием системного остеопороза. Первое введение инфликсимаба произведено в дозе 5 мг/кг, далее по схеме 0-2-6-8 недель с последующим переходом на 1 инфузию/8 недель. Несмотря на проводимую комплексную терапию, у ребенка не наблюдалось снижения эндоскопической активности воспаления (SES-CD=13), при незначительном снижении клинической активности заболевания (PCDAI=32,5). Повышение дозы инфликсимаба до 10мг/кг не дало положительного эффекта. Анализ исходного уровня anti-GP2 IgG и IgA выявил значимое повышение титра аутоантител. В процессе биологической терапии наблюдался неуклонный рост содержания аутоантител к гликопротеину-2, что соответствовало прогнозу минимального терапевтического ответа на инфликсимаб (Рис. 3.4.10). Рис. 3.4.10 Динамика содержания anti-GP2 IgG и IgA у пациента с нестойким эффектом от инфликсимаба в процессе лечения 122 Клинический пример №2 Пациент Б. 11 лет. Диагноз: Болезнь Крона толстой кишки, воспалительная форма, умеренной степени активности, обострение (PCDAI=37,5; SES-CD=13). Биологическая терапия назначена в связи неэффективностью комбинированной противовоспалительной и иммуносупрессивной терапии, развитие гормонозависимости. Ребенку была начата терапия инфликсимабом в дозе 5 мг/кг, далее по схеме 0-2-6-8 недель с последующим переходом на 1 инфузию /8 недель. После проведения первых инфузий состояние ребенка с положительной динамикой в виде улучшения общего самочувствия и нормализации показателей гемограммы, прибавки в весе. Комплексное обследование по окончании индукционного курса выявило клинико-лабораторную ремиссию заболевания (PCDAI=5) и снижение воспалительной активности по данным эндоскопического исследования (SES-CD=6). Анализ исходного уровня anti-GP2 IgG и IgA не выявил повышения титра аутоантител. В процессе биологической терапии значительного увеличения уровня anti-GP2 IgG и IgA не наблюдалось, что соответствовало благоприятному прогнозу эффективности терапии (Рис. 3.4.11). 25 20 15 IgA AGP2, U/ml IgG AGP2, U/ml 10 5 0 1 2 3 4 5 инфузии Рис. 3.4.11 Динамика содержания anti-GP2 IgG и IgA у пациента со стойким эффектом инфликсимаба. 123 Таким образом, полученные данные показывают информативность определения anti-GP2 IgG и IgA до начала биологической терапии в прогнозе эффективности лечения. Проведенный анализ демонстрирует, что нестойкий эффект биологической терапии у пациентов с ВЗК, ассоциирован с исходно высокими титрами аутоантител к гликопротеину 2, нарастающему в процессе лечения. Повышение уровня anti-GP2 IgG и IgA с увеличением длительности заболевания свидетельствует в пользу раннего назначения биологических препаратов в связи с большей вероятностью положительного ответа на терапию. 124 3.5. Критерии прогнозирования эффективности блокаторов TNF-α у пациентов с ВЗК Известны различные способы прогнозирования эффективности биологической терапии у пациентов с ВЗК, включающие анализ клинических, лабораторных, эндоскопических и фармакокинетических данных. Существующие подходы к разработке прогностических критериев условно делятся на две группы: ретроспективная оценка предполагаемых прогностических параметров и динамическое исследование клинико-лабораторных показателей. Ретроспективная оценка предполагаемых прогностических параметров проводится, как правило, до назначения биологической терапии и включает в себя детальное исследование клинико-анамнестических данных. Влияние длительности заболевания на прогноз эффективности инфликсимаба у детей с БК было показано в работе Vermeire S и др. (2002) [172]. Согласно полученным результатам, меньшая длительность заболевания является прогностически благоприятным фактором в отношении эффективности препарата. Анализ взаимосвязи фенотипа болезни с эффектом биологической терапии показал, что у пациентов со стенозирующей формой патологии наблюдается минимальный терапевтический ответ на инфликсимаб [172]. Исследование эндоскопических данных у пациентов с разным эффектом биологической терапии выявило, что наличие изолированного колита является предиктором бόльшей эффективности инфликсимаба по сравнению с другими локализациями воспалительного процесса [51]. Наиболее важным анамнестическим фактором, негативно влияющим на прогноз эффективности биологической терапии, считается наличие у пациента в прошлом хирургического вмешательства по поводу основного заболевания [134]. Как правило, необходимость оперативного лечения возникает при формировании стеноза кишечника. Таким образом, предположения прогностической значимости данного фактора согласуется с концепцией худшего прогноза эффективности 125 консервативных методов лечения, в частности биологической терапии, при стенозирующей форме заболевания. Известен прогностический способ оценки эффективности инфликсимаба, включающий анализ полиморфизма апоптотических генов [98]. Способ включает определение апоптотического фармакогенетического индекса - API, вычисляемого на основании выявления в генотипе пациента от одного до трех однонуклеотидных полиморфизмов – Fas ligand-843 C/T; Fas-670G/A; Caspase 93 C/T и при значении API≤1 предполагают минимальный терапевтический ответ на инфликсимаб, при API=2 прогнозируют умеренный ответ на биологическую терапию, при API=3 ожидают стойкий положительный эффект от введения инфликсимаба. Авторы способа рекомендуют использовать апоптотический фармакогенетический индекс в комбинации с клиническими прогностическими параметрами. Прогностические возможности лабораторных тестов были показаны на примере определение цитоплазматических сывороточного антител Выявление у пациента методом содержания непрямой антинейтрофильных иммунофлюоресценции. атипичного варианта свечения антинейтрофильных антител соответствует прогнозу минимального терапевтического ответа на инфликсимабом [165]. В настоящее прогнозирования время широко эффективности изучается инфликсимаба, способы мониторинга основанные на и оценке фармакокинетических параметров. Наиболее изученным из таким показателей является - остаточная концентрация инфликсимаба в сыворотке крови. Согласно данным исследований, у пациентов с ВЗК, имеющих значение остаточной концентрации инфликсимаба более 1,40 мкг/мл не ранее чем после 6 введений препарата, прогнозируют стойкий положительный эффект от инфликсимаба [123]. Вышеперечисленные способы прогнозирования эффективности биологической терапии обладают рядом ограничений. Ретроспективные способы исключают возможность построения прогноза в динамике лечения. Генетический анализ позволяет прогнозировать эффект терапии лишь однократно. Определение 126 уровня остаточной концентрации инфликсимаба ограничены во временном интервале, так как не позволяют оценить прогноз биологической терапии до начала введений препарата. Оценка содержания антинейтрофильных цитоплазматических антител не позволяет оценить краткосрочную динамику прогноза в связи с длительной циркуляцией данных антител в системном кровотоке. Таким образом, в настоящее время не создана комплексная диагностическая модель, позволяющая надежно прогнозировать эффект биологической терапии до начала лечения. Проведенное динамическое исследование иммунологических показателей у детей с ВЗК, получающих терапию блокаторами TNF-α, выявило ряд лабораторных маркеров, демонстрирующих высокую прогностическую значимость в отношении эффекта инфликсимаба. На основании полученных результатов был создан ряд прогностических моделей эффективности биологической терапии у детей с ВЗК. 1. Прогностическая модель для определения эффективности биологической терапии у детей с ВЗК, основанная на определении цитокинового профиля Методом множественной пошаговой регрессии было получено уравнение зависимости эффекта биологической терапии от исходного плазменного содержания IL-10, IL-8, IL-4, TNF-α, TNF-β. К1= 0,006 -0,003*(IL-10)+0,0007*(IL-8)+0,0002*(IL-4)+0,006*(TNF-α)-0,0002*(TNF-β); Достоверность коэффициентов регрессии представлена в таблице 3.5.1 Таблица 3.5.1 Регрессионные коэффициенты и уровень достоверности для уравнения расчета прогностического коэффициента – K1 Регрессионный Стандартная t-критерий P Параметр коэффициент ошибка Свободный член 0,005554 0,030240 0,18 0,855014 IL-10, пг/мл -0,003296 0,000837 -3,93 0,000252 IL-8, пг/мл 0,000664 0,000138 4,80 0,000015 IL-4, пг/мл 0,000188 0,000035 5,43 0,000002 TNF-α, пг/мл 0,006004 0,001021 5,88 0,000000 TNF- , пг/мл -0,000239 0,000101 -2,37 0,021470 127 Множественный коэффициент корреляции для данной модели составил R=0,71 (Рис.3.5.1). Согласно полученному уравнению, чем больше исходная концентрация TNF-α, тем выше значение прогностического коэффициента, а значит лучше прогноз эффективности биологической терапии. Рис. 3.5.1 Соответствие наблюдаемого эффекта терапии и эффекта, предсказанного по уравнению регрессии К1 на основании данных цитокинового профиля да начала терапии 2. Прогностическая модель для определения эффективности биологической терапии у детей с ВЗК, основанная на определение митохондриальной активности популяций лимфоцитов Методом множественной пошаговой регрессии было получено уравнение зависимости эффекта биологической терапии от исходной активности СДГ в популяциях Т-лимфоцитов (Т-ЛФ), Тreg лимфоцитов (Тreg), активированных Тхелперов (акт. Th) и В2-лимфоцитов (В2-ЛФ). К2= -0,1+0,023*СДГ(Treg)-0,027*СДГ(В2-ЛФ)+0,021*СДГ(Т-ЛФ)-0,020*СДГ(акт.Тh); Регрессионные коэффициенты и уровень достоверности для уравнения расчета прогностического коэффициента K2 представлены в таблице 3.5.2. 128 Таблица 3.5.2 Уравнение регрессии для определения эффекта терапии по уровню активности СДГ в популяциях лимфоцитов Регрессионный Стандартная t-критерий P Параметр коэффициент ошибка Свободный член -0,101605 0,834634 -0,12 0,904213 Активность СДГ в 0,023418 0,006284 3,73 0,001172 Treg лимфоцитах, у.е. Активность СДГ в -0,026847 0,008764 -3,06 0,005691 В2-лимфоцитах, у.е. Активность СДГ в 0,021365 0,006671 3,20 0,004108 Т-лимфоцитах, у.е. Активность СДГ в активированных -0,018889 0,005536 -3,41 0,002499 Т-хелперах, у.е. Множественный коэффициент корреляции для данной модели был равен R=0,70 (Рис.3.5.2). Согласно данному уравнению, чем больше активность СДГ в популяции Treg лимфоцитов, тем больше значение прогностического коэффициента К2, что соответствует лучшему прогнозу эффективности лечения. Рис. 3.5.2 Соответствие наблюдаемого эффекта терапии и эффекта, предсказанного по уравнению регрессии К2 на основании исходных иммуноцитохимических показателей. 129 3. Прогностическая модель для определения эффективности биологической терапии у детей с ВЗК, основанная на оценке популяционного состава лимфоцитов и их митохондриальной активности На основании показателей иммуноцитохимического анализа и данных иммунофенотипа лимфоцитов периферической крови методом множественной пошаговой регрессии было получено математическое уравнение для расчета прогностического коэффициента эффективности инфликсимаба на основании активности СДГ в популяциях Т-лимфоцитов (Т-ЛФ), В2-лимфоцитов (В2-ЛФ), активированных Т-хелперов (акт.Th), Th17-лимфоцитов (Th17) и относительного содержания Treg лимфоцитов (Treg), активированных Т-хелперов и Th17лимфоцитов. К3=3,033 - 0,015*СДГ(В2-ЛФ) + 0,024*СДГ(Т-ЛФ) - 0,049*(Treg) - 0,016*(акт.Th) 0,010*СДГ(акт.Th) - 0,020*(Th17) – 0,007*СДГ(Th17); Достоверность коэффициентов регрессии представлена в таблице 3.5.3 Таблица 3.5.3 Регрессионные коэффициенты и уровень достоверности для уравнения расчета прогностического коэффициента – K3 Регрессионный Стандартная t-критерий P Параметр коэффициент ошибка Свободный член 3,033013 0,552314 5,49 0,000001 Активность СДГ -0,015085 0,004863 -3,10 0,003031 в В2-лимфоцитах, у.е. Активность СДГ в 0,023836 0,004132 5,77 0,000000 Т-лимфоцитах, у.е. T reg, % от CD3+CD4+ -0,048892 0,022617 -2,16 0,035002 Активированные Tхелперы, % от -0,016468 0,007875 -2,09 0,041161 CD3+CD4+ Активность СДГ в активированных Т-0,009993 0,003147 -3,17 0,002456 хелперах, у.е. Th17 лимфоциты, % от -0,019587 0,006845 -2,86 0,005953 CD3+CD4+ Активность СДГ в -0,006861 0,002737 -2,51 0,015155 Th17 лимфоцитах, у.е. 130 Множественный коэффициент корреляции для данной модели составил R=0,74 (Рис.3.5.3). Рис. 3.5.3 Соответствие наблюдаемого эффекта терапии и эффекта, предсказанного по уравнению регрессии К3 на основании исходных иммуноцитохимических показателей и данных иммунофенотипа лимфоцитов периферической крови. Согласно полученному уравнению, чем выше количество Th17- лимфоцитов, тем меньше прогностический коэффициент, и, соответственно, ниже вероятность стойкого эффекта биологической терапии. Сравнение прогностической значимости предложенных моделей позволило выбрать наиболее значимые иммунологические показатели для построения комплексной прогностической модели оценки эффективности биологической терапии у детей с ВЗК (Рис. 3.5.4). 131 TNF-α Модель 1 Цитокиновый профиль Модель 2 Митохондриальная активность популяций лимфоцитов К СДГ (Treg) Интегральный прогностический коэффициент Модель 3 Соотношение популяций и митохондриальная активность лимфоцитов Th17 Рис.3.5.4. Принцип построения комплексной прогностической эффективности терапии блокаторами TNF-α у детей с ВЗК модели для оценки На основании цитохимических и иммунологических показателей методом множественной пошаговой регрессии было получено математическое уравнение для расчета прогностического коэффициента эффективности инфликсимаба: K= 0,282 + 0,0038*СДГ(Treg) - 0,0229*(Th17) + 0,0016*(TNF-α); где СДГ(Treg) – активность сукцинатдегидрогеназы в регуляторных Тлимфоцитах, где (Th17) – относительное количество Th17-лимфоцитов от CD3+CD4+ , (TNF-α) – плазменная концентрация TNF-α. Регрессионные коэффициенты и уровень достоверности для уравнения расчета прогностического коэффициента К представлены в таблице 3.5.4 132 Таблица 3.5.4 Регрессионные коэффициенты и уровень достоверности для уравнения расчета прогностического коэффициента – K Коэффициент Стандартная t-критерий P Параметр уравнения регрессии ошибка Свободный член 0,2820 0,1832 1,5388 0,1293 Активность СДГ в Тreg 0,0038 лимфоцитах, у.е. Содержание Th17-лимфоцитов, % от CD3+CD4+) Концентрация TNF-α, пг/мл 0,0009 3,9923 0,0002 -0,0229 0,0036 -6,3140 0,0001 0,0016 0,0004 3,9893 0,0002 Множественный коэффициент корреляции был равен R=0,91 (Рис. 3.5.5). Коэффициент определения равен R2*100%=83%, что означает, что 83% изменчивости прогностического коэффициента определяется показателями, вошедшими в уравнение. Несомненно, существуют дополнительные факторы, определяющие 17% изменчивости К. Рис. 3.5.5 Соответствие наблюдаемого эффекта терапии и эффекта, предсказанного по уравнению регрессии К. 133 Для проверки информативности коэффициента К был проведен ROC-анализ полученных данных, прогностической который модели продемонстрировал (AUC=0,935(0,878-0,993), отличное p<0,05) качество (Рис.3.5.6). Диагностическая значимость определения прогностического коэффициента К существенно превышала значимость отдельных показателей, вошедших в регрессионное уравнение (Рис.3.5.7). Оптимальное разделение пациентов на детей со стойким положительным эффектом и нестабильным ответом на инфликсимаб наблюдалось при значениях прогностического коэффициента К=0,6 (89% чувствительности и 90% специфичность). Рис.3.5.6 ROC-анализ коэффициента К до начала лечения для прогноза эффективности биологической терапии 134 Рис.3.5.7 Сравнительный ROC-анализ коэффициента К и содержания TNF-α до начала лечения для прогноза эффективности биологической терапии Клинические примеры Пример 1. Больной Г., 12 лет. Диагноз: Болезнь Крона толстой и тонкой кишки, воспалительная форма, болен с ноября 2006 года. С 2008г наблюдался в отделении гастроэнтерологии с диагнозом БК, терминальный илеит, правосторонний колит, высокая степень активности, стадия обострения (PCDIA=30). Принимая во внимание сохраняющуюся высокую активность на фоне противовоспалительной и иммуносупрессивной терапии, формирование гормонозависимости, была начата биологическая терапия инфликсимабом в дозе 5 мг/кг по схеме 0-2-6-8 недель, далее каждые 8 недель. После первых инфузий препарата отмечено значительное улучшение самочувствия и аппетита, прибавка в весе, отсутствие болей в животе и нормализация стула (PCDAI=10). Объективно, наблюдалась положительная динамика показателей гемограммы и биохимического анализа крови. В течение года лечения состояние ребенка стабильное, диагностирована минимальная 135 воспалительная активность (PCDAI=0). По данным проведенной колоноскопии через год после начала терапии блокатором TNF-α визуализировался изолированный рубцовый баугенит (SES-CD=0), гистологическое исследование слизистой оболочки кишечника свидетельствовало об умеренно выраженном хроническом неспецифическом воспалении. На основании этих результатов можно говорить о формировании ремиссии болезни Крона через год после начала биологической терапии. Прогностические коэффициенты эффективности инфликсимаба при первой, второй, четвертой инфузиях препарата составили К1=1,0; К2 =0,85; К4 =0,88. Данные значения (К>0,6) соответствовали прогнозу стойкого положительного терапевтического ответа на инфликсимаб, что подтверждалось улучшению клинико-лабораторных и эндоскопических показателей. Прогностический коэффициент эффективности более чем через год биологической терапии (девятая инфузия препарата) был равен К9 =0,81 , что свидетельствовало о сохраняющемся прогнозе стойкого положительного эффекта от препарата. Динамика прогностического коэффициента эффективности инфликсимаба у данного пациента со стойким положительным эффектом представлена на рисунке 3.5.8. Рис 3.5.8 Динамика прогностического коэффициента положительным эффектом от инфликсимаба К у больного со стойким 136 Пример 2. Больная В., 14 лет. Диагноз: Болезнь Крона толстой и тонкой кишки, свищевая форм; больна с июля 2008 года. С марта 2011г. девочка наблюдается в гастроэнтерологическом отделении с диагнозом: БК, высокая степень активности, панколит, свищевая форма: свищи аноректальной области, ректовагинальный свищ, непрерывно-рецидивирующее течение. Учитывая высокую воспалительную активность (PCDAI=75, SESCD=12), свищевую форму БК, была назначена биологическая терапия инфликсимабом в дозе 5 мг/кг по схеме 0-2-6-8 недель, далее каждые 8 недель. На фоне проведенного индукционного курса отмечалась умеренная положительная динамика в виде нормализации стула, улучшения самочувствия и аппетита, прибавки в весе (PCDAI=15). Однако по результатом эндоскопического исследования у ребенка сохранялся эрозивно-язвенный панколит высокой степени активности (SES-CD=12). В связи с недостаточной эффективностью комбинированной противовоспалительной, иммуносупрессивной и биологической терапии, начиная с 4-ой инфузии, доза инфликсимаба была повышена с 5мг/кг до 10 мг/кг по прежней схеме введения (каждые 8 недель). На фоне проводимой терапии отмечалась умеренная положительная динамика в виде купирования воспалительных проявлений в области ануса, снижение лабораторной активности заболевания, однако полной ремиссии БК не наблюдалось. При контрольной госпитализации через год после начала биологической терапии у девочки наблюдалось значительное ухудшение состояния: лихорадка, выраженная слабость, повторная рвота, жидкий стул. При обследовании у ребенка отмечалась высокая лабораторная и эндоскопическая активность БК (PCDAI=75, SES-CD=12). Учитывая неэффективность консервативной терапии, девочке была проведена операция: лапароскопически ассоциированная тотальная колэктомия. Прогностические коэффициенты эффективности инфликсимаба при первой, второй, третьей инфузиях препарата составили К1= -0,26; К2= -0,10; К3= 0,14. Данные значения (К<0,6) соответствовали прогнозу минимального терапевтического ответа от введения инфликсимаба, что подтверждалось 137 сохраняющейся высокой клинико-лабораторной и эндоскопической активностью воспалительного процесса. Увеличение дозы инфликсимаба было проведено по клинико-эндоскопическим показаниям при шестом введении препарата, однако, улучшение клинического состояния и снижения воспалительной активности не наблюдалось. Прогностический коэффициент эффективности при шестом введении инфликсимаба составлял К6 = - 0,07, что соответствовало прогнозу минимальной эффективности препарата. Через 10 месяцев биологической терапии (седьмая инфузия препарата) значение составило прогностического К7=-0,16, что коэффициента эффективности соответствовало инфликсимаба прогнозу минимального терапевтического ответа на введение инфликсимаба. У ребенка наблюдались клинико-лабораторные воспалительного и процесса, эндоскопическое что явилось признаки показаниями выраженного к проведению хирургического вмешательства по поводу основного заболевания. Динамика прогностического коэффициента эффективности инфликсимаба у данного пациента с минимальным терапевтическим ответом от введения инфликсимаба представлена рисунке 3.5.9. Рис 3.5.9 Динамика прогностического коэффициента у больного с нестойким эффектом инфликсимаба 138 Таким образом, на основании полученных данных наиболее информативные иммунологические показатели были объединены в интегральный прогностический коэффициент К, позволяющий с вероятностью 94% правильно прогнозировать эффект биологической терапии до ее начала. Оптимальное разделение пациентов на группы с стойким и нестойким эффектом инфликсимаба наблюдалось при значения К=0,6 (89% диагностическая чувствительность и 90% диагностическая специфичность). Использование способа прогнозирования эффективности инфликсимаба у детей с ВЗК позволяет прогнозировать долгосрочный, не менее 1 года, эффект терапии инфликсимабом на любом этапе терапии, учитывает индивидуальную реакцию пациента на введение препарата и является особенно актуальным в случаях недостаточной эффективности биологической терапии, требующей коррекции схемы введения инфликсимаба. 139 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Воспалительные заболевания кишечника, которые в настоящее время включают болезнь Крона и язвенный колит, являются рецидивирующими поражением патологиями, желудочно-кишечного распространенности. структуры и ВЗК функции характеризующимися тракта сопровождаются различных отделов различной хроническими воспалительным глубины необратимыми ЖКТ, и нарушениями ведущими к ранней инвалидизации больного [40]. Особенностями ВЗК у детей являются тяжелое течение, многообразие и неспецифичность клинических симптомов, частое наличие внекишечных проявлений, высокий риск оперативных вмешательств [42]. У 30% пациентов, страдающих ВЗК, дебют заболевания происходит в возрасте до 18 лет, что приводит к необходимости назначения длительной иммуносупрессивной терапии в период интенсивного роста организма и активного формирования иммунной системы [5,7]. Этиотропной терапии ВЗК в настоящее время не существует, в виду неясности точных механизмов этиопатогенеза данных заболеваний. Тем не менее, существующие представления о сдвиге цитокинового баланса в сторону гиперпродукции провоспалительных патофизиологическом факторе медиаторов, как о ключевом развития аберрантного иммунного ответа, послужило основой для внедрения селективных блокаторов TNF-α в терапию ВЗК [40,92,116,127,146,153]. Применение блокаторов TNF-α (инфликсимаб) позволяет значительно увеличить долю пациентов, достигающих стабильной ремиссии в короткие сроки, однако у трети пациентов не наблюдается стойкого ответа на препарат, кроме того применение биологических препаратов ассоциировано с развитием серьезных инфекционных осложнений и острых аллергических реакций, представляющих угрозу для жизни пациента[153]. Показано, что более чем у 50% пациентов эффективности терапии инфликсимабом значительно снижается уже к концу первого года лечения[68]. 140 Среди причин, вызывающих развитие толерантности к терапии блокаторами TNFα относят выработку антител к препаратам и вовлечение альтернативных, TNF-α независимых, патогенетических путей [17,51,132,181]. Персонифицированный выбор терапии, основанный на выявлении особенностей иммунопатогенеза ВЗК у конкретного индивида, коррекция схемы введения блокатора TNF-α на доклинической стадии обострения заболевания позволит значительно увеличить терапевтическую и экономическую эффективность терапии [26]. Выявление новых маркеров-предикторов эффективности терапии блокаторами TNF-α у пациентов с ВЗК является одной из приоритетных направлений изучения данной патологии. В настоящее время выявлен ряд показателей, обладающих прогностической значимостью в отношении эффективности биологической терапии. К клиникоанамнестическим предикторам относят продолжительность заболевания, форму патологии, наличие у пациента в анамнезе хирургического вмешательства по поводу осложнений ВЗК [134,172]. Прогностические возможности лабораторных тестов показаны на примере определение сывороточного содержания антинейтрофильных антител, изучаются способы мониторинга и прогнозирования эффективности инфликсимаба, основанные на оценке фармакокинетических параметров [123,165]. Перечисленные прогностические подходы обладают рядом ограничений, например не позволяют оценить прогноз биологической терапии до ее начала, исключают возможность построения прогноза в динамике лечения и разрабатывались для взрослых пациентов с ВЗК. Целью данного исследования явилась разработка прогностических критериев эффективности терапии блокаторами TNF-α у детей с ВЗК. Для решения поставленных задач было обследовано 100 пациентов с ВЗК (67 с БК, 33 с ЯК) в возрасте от 10 до 17,9 лет в динамике заболевания. Из всех пациентов, вошедших в исследование, 70-ти детям (49 пациентов с БК и 21 пациент с ЯК), в виду неэффективности проводимого лечения, была назначена биологическая терапия препаратом – инфликсимаб. 30 пациентов получали стандартную базисную терапию. Эффект биологической терапии оценивали через год лечения 141 по клинико-эндоскопической активности заболевания. Контрольную группу составили 45 относительно здоровых детей в возрасте от 12 до 17,9 лет. В качестве потенциальных маркеров-предикторов эффективности биологической терапии при ВЗК были выбраны лабораторные показатели, отражающие состояние патогенетически значимых звеньев иммунной системы. Анализ цитокинового профиля включал исследование плазменной концентрации цитокинов, играющих важную роль в развитии ВЗК. В настоящее время известно, что баланс цитокинов у пациентов с ВЗК характеризуется гиперпродукцией провоспалительных цитокинов (TNF-α, IL-1β, IL-12, IL-6,INF-γ, IL-23) на фоне снижения синтеза иммуносупрессивных цитокинов, например IL10 и TGF-β [84,92,130,162]. Показаны корреляции между сывороточной концентрацией IL-8, IL-17A и IL-22 и клинико-лабораторной и эндоскопической активностью ВЗК, содержанием TGF-β и наличием фиброза у пациентов с БК [130,132,146,153]. В представляемой работе анализировали содержание следующих циркулирующих цитокинов: IL-1β, IL-2, IL-8, IFN-γ, TNFα, TNF-β, IL-4, IL-5,IL-6, IL-10, IL-12р70, IL-13, IL-22, IL-23, TGF- . Исследование состояния Т- и определение содержания основных В-клеточного иммунитета включало и малых популяций лимфоцитов периферической крови и исследовании их функциональной активности. Согласно современной концепции патогенеза ВЗК в развитие хронического неспецифического воспаления вовлекаются как клетки врожденного иммунитета, так и клетки адаптивного иммунитета [17]. Нарушение антигенпрезентирующими клетками служит синтеза цитокинов триггерным фактором для формирования аутоагрессивных и эффекторных Т-лимфоцитов, что приводит к активации и росту численности Th17-лимфоцитов и подавлением регуляторных Т-клеток [43,153]. В работе оценивали абсолютное и относительное количество следующих популяций циркулирующих лимфоцитов: Т- лимфоцитов(CD3+CD45+), Т-хелперов (СD3+CD4+CD45+), цитотоксических Тлимфоцитов (CD3+CD8+CD45+), В-лимфоцитов (CD3-CD19+ CD45+), NK-клеток (CD3-CD16+СD56+), NKT-лимфоцитов (CD3+CD16+CD56+), активированных Т- 142 лимфоцитов активированных (СD3+HLA-DR+), Т-хелперов (CD3+CD4+CD294+), Th2-лимфоцитов (CD4+CD25+CD127high), Treg лимфоцитов (CD4+CD25+CD127low), Th17-лимфоцитов (CD3+CD4+CD161+) В1-лимфоцитов (CD3-CD19+CD5+) , В2-клеток (CD3-CD19+CD5-). Оценка функциональной активности лимфоцитов включала исследование интенсивности их энергетического обмена. В настоящее время получены убедительные доказательства роли митохондриальной дисфункции в патогенезе ВЗК [47,73,110,144,155]. Выявление прямых и косвенных оксидативного стресса в клетках слизистой оболочки и признаков лейкоцитарных инфильтратах стенки кишки непосредственно свидетельствует о нарушение нормальной работы митохондриального аппарата при данной патологии [73,144,160]. Снижение активности ферментов дыхательной цепи (II, III, IV комплекса) в материалах биопсии, полученных от пациентов с ВЗК, было показано в исследованиях Santhanam S. и др. (2012), Sifroni K. и др. (2010) [155,160]. На основании вышеизложенного, в представляемой работе оценивали активность маркерного фермента митохондрий – сукцинатдегидрогеназы – в основных и малых популяциях лимфоцитов у детей с ВЗК в динамике заболевания на фоне специфической терапии. В зависимости от терапевтического ответа на инфликсимаб все пациенты, вошедшие в исследование, были поделены на две группы – группа детей со стойким положительным эффектом препарата и пациенты с нестабильным эффектом биологической терапии. Критериями включения пациента в группу со стойким положительным эффектом инфликсимаба были выбраны следующие показатели: клиникоэндоскопическая ремиссия заболевания либо минимальная степень воспалительной активности в течение года применения биологической терапии по стандартной схеме введения (5мг/кг 0-2-6-8 недель, далее каждые 8 недель). В группу с недостаточным эффектом инфликсимаба были отнесены пациенты с клинико-лабораторными и эндоскопическими признаками активного воспаления через год биологической терапии по стандартной схеме введения; пациенты, 143 достигшие ремиссии при увеличении стандартной дозировки препарата и/или сокращениями интервалов между инфузиями менее 8 недель, а также дети, развившие острую аллергическую реакцию на препарат. Сравнение данных гемограммы, биохимического анализа крови, а также выбранных иммунологических показателей не выявило значимых различий между пациентами с БК и ЯК. В связи с этим при дальнейшем формировании групп пациентов с БК и ЯК объединяли в зависимости от особенностей течения заболевания. Подобный подход находит все большее распространение в исследованиях ВЗК в виду пересмотра многими авторами классического деления данной патологии на две нозологические формы [54,130,177]. Так утверждается о существовании множества подтипов ВЗК, патогенетически отличающихся по ведущему иммунологическому механизму и фенотипически соответствующих разным формам патологии [54,130]. Первый этап исследования включал оценку выбранных иммунологических показателей до начала биологической терапии с целью определения значимых лабораторных параметров в прогнозе эффективности инфликсимаба у детей с ВЗК. Степень клинической и эндоскопической активности заболевания, а также данные стандартных лабораторных исследований исходно не отличались у пациентов со стойким и нестойким эффектом инфликсимаба. Аналогичные данные были получены у взрослых пациентов [132]. Оценка цитокинового профиля в зависимости от эффективности биологической терапии выявила исходно более высокое содержание как про-, так и противовоспалительных цитокинов у пациентов со стойким эффектом инфликсимаба по сравнению с пациентами, имеющими нестабильный эффект от препарата и контрольной группой. Наибольшее отличие концентраций при сравнении групп пациентов наблюдалось для TNF-α, IL-4, IFN-γ, TGF-β, IL-12p70, IL-10, IL-1β, IL-8, IL-2, IL-6, IL-5. TNF-α и IFN-γ – ключевые провоспалительные цитокины, потенцирующие действие друг друга и индуцирующие синтез как истинно провоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-6, IL-8 и др.), так и регуляторных медиаторов, например IL- 144 10 и TGF-β, по принципу «обратной отрицательной связи». Увеличение содержания TNF-α, IFN-γ и других провоспалительных цитокинов полностью согласуется с существующей концепцией патогенеза ВЗК [99,130,132,153,162] IL-10 и TGF-β – противовоспалительные цитокины, IL-4 – является биологическим антагонистом IFN-γ, увеличение их продукции может рассматриваться как компенсаторная реакция, направленная на подавление воспалительного процесса. В работе Fina и др. (2008) было показано значительное увеличение содержания IL-10 в слизистой оболочке пациентов с НЯК [92]. В исследовании Pak и др. (2012) продемонстрировано увеличение концентрации циркулирующего IL-4 у детей с БК, не получающих патогенетической терапии [135]. TGF-β – важнейший противоспалительный цитокин, регулирующий интенсивность иммунологических реакций и играющий ключевую роль в подавлении аутоиммунного воспаления [57,95,109,130].Содержание TGF-β было снижено у детей с ВЗК по сравнению с контрольной группой, при этом в группе пациентов с нестабильным эффектом терапии концентрации цитокина была значимо ниже, чем у пациентов со стойким эффектом инфликсимаба. Снижение сывороточной концентрации TGF-β у взрослых пациентов с ВЗК было показано в работе Ebert и др. (2008) [85]. Среди причин, вызывающих снижение содержания данного цитокина, называются дефекты его нормальной белковой структуры TGF-β, в виду мутаций кодирующего гена, преобладание синтеза нетипичных изоформ TGF-β2 TGF-β3, обнаружение аутоантител к TGF-β в сыворотке больных с ВЗК [85,130,148,153] . Таким образом, согласно полученным данным, у детей со стойким положительным эффектом от биологической терапии наблюдалось повышение содержания провоспалительных цитокинов на фоне высоких концентраций их биологических антагонистов, имеющих противоспалительное действие. С учетом специфичности проводимой терапии, высокая эффективность применения блокаторов TNF-α у пациентов с повышенным плазменным содержанием данного 145 цитокина логично объясняется его ведущей патогенетической ролью в развитии заболевания. В течение года терапии концентрации циркулирующих цитокинов у пациентов со стабильным эффектом инфликсимаба плавно снижались, не достигая при этом уровня цитокинов пациентов с нестабильным эффектом препарата. Снижение концентрации провоспалительных цитокинов и их антагонистов объясняется снижением воспалительной активности заболевания у детей, имеющих положительный терапевтический ответ на инфликсимаб. К концу года лечения содержание IL-8 и IL-12p70 у пациентов данной группы превышало показатели пациентов с нестабильным эффектом терапии, что укладываются в концепцию существования «цитокинового генотипа», отражающего наследственную предрасположенность индивида к гипер- и гипо- секреции тех или иных цитокинов [15,90,136]. Согласно данной концепции индивид имеет генетически обусловленную склонность к повышению или понижению синтеза определенных цитокинов, вне зависимости от физиологической потребности и их функциональной реализации. Влияние «цитокинового генотипа» на эффективность базисной терапии была показана у пациентов с ревматоидным артритом [15]. Для выявления наиболее информативного показателя цитокинового профиля в прогнозировании эффекта биологической терапии был проведен ROCанализа полученных данных. Определение исходного содержания TNF-α, IL-4, IFN-γ, IL-12p70 соответствовало высокой вероятности правильного прогноза эффективности биологической терапии у детей с ВЗК (интервал AUC 0,8-0,9; p<0,05). Оценка содержания IL-5, IL-1β, IL-10, TGF-β, IL-8, IL-6, IL-2 характеризовалась хорошим прогностическим качеством модели (интервал AUC 0,7-0,8; p<0,05). Наибольшую прогностическую ценность имело определение содержания TNF-α до начала терапии. Снижение плазменной концентрации TNFα менее чем 8,7пг/мл с вероятностью 98% соответствовало прогнозу минимального терапевтического ответа на инфликсимаб в течение года (ДЧ=67%, ДС= 98%, p<0,05) . 146 Следующим этапом работы явилось определение информативности количественных характеристик и показателей функционального состояния Т- и Вклеточного иммунитета в прогнозе эффективности терапии блокаторами TNF-α у детей с ВЗК. Количественная оценка основных популяций лимфоцитов периферической крови выявила исходное снижение содержания В-лимфоцитов и NK-клеток у всех детей с ВЗК, наиболее выраженное в группе пациентов с нестойким эффектом биологической терапии. Полученные результаты не противоречат данным литературы. Снижение количества периферических NK-клеток у детей с БК, не получающих специфическую терапию, было показано в работе Cseh A. и др.(2010) [71]. К факторам, снижающим количество NK-клеток при ВЗК, относят, в первую очередь, прием цитостатиков. Pravven K. Yadav и др. (2011) описал азатиоприн- индуцированный апоптоз NK-клеток собственной пластинки у пациентов с ВЗК [178]. Снижение абсолютного содержания периферических Влимфоцитов у взрослых пациентов с ЯК и БК было показано в исследованиях Polese L. (2007) и Neil G.A. (2000) [131,137]. К предполагаемым факторам, приводящим к сокращению численности В-лимфоцитов, относят синтез индукторов апоптоза в очаге воспаления, действие глюкокортикостероидов и цитостатиков [88,126]. К приводит также снижению содержания циркулирующих В-клеток повышенный синтез высокоактивных хемоаттрактантов, привлекающих В-лимфоциты в очаг воспаления (Mishima Y.2009). Обратная зависимость между активностью заболевания и количеством В-лимфоцитов, выявленная препаратами у пациентов, получающих 5-аминосалициловой противовоспалительную кислоты, позволяет терапию предполагать доминирующее влияние естественных факторов патогенеза на сокращение численности В-лимфоцитов при данной патологии [131,137]. Таким образом, снижение содержания В-лимфоцитов и NK-клеток у детей с ВЗК происходит, под действием ряда факторов, влияющих на функционирование данных популяции – прием иммуносупрессивных и противовоспалительных препаратов, миграция 147 клеток в очаг поражения в виду повышенного локального синтеза хемоаттрактантов, а также воздействие индукторов апоптоза. Прогностическая значимость содержания NK-клеток и В-лимфоцитов в отношении эффективности терапии блокаторами TNF-α ВЗК показана впервые в представляемой работе. С учетом того, что группы пациентов с разным эффектом инфликсимаба были сопоставимы по активности воспалительного процесса и лекарственному анамнезу, снижение численности NK-клеток и В-лимфоцитов у пациентов с нестабильным эффектом инфликсимаба, вероятно, является следствием более тяжелого комплексного нарушения работы иммунной системы и подключением альтернативных путей патогенеза. Исследование популяций В-лимфоцитов выявило значительное снижение исходного содержания В1-лимфоцитов на фоне увеличения количества В2лимфоцитов у всех детей с ВЗК по сравнению с контрольной группой. При этом у пациентов с нестабильным эффектом инфликсимаба содержание В1-клеток наблюдались бόльшее и меньшее число В2-лифоцитов при сопоставлении с пациентами, имеющими стойкий ответом на терапию. Снижение содержания Влимфоцитов, а также количества В1-лимфоцитов (абсолютного и относительного), в периферической крови пациентов с БК было впервые показано Neil G.A. и др. (1992) [131]. Данная группа исследователей выявила также, что стадия обострения у взрослых пациентов с БК характеризуется бόльшим снижением содержания В-лимфоцитов и В1-клеток (абсолютного и относительного количества) по сравнению с ремиссией. Mishima Y. и др. (2009) подтвердили снижение содержания периферических В1-лимфоцитов у пациентов с БК и продемонстрировали еще бόльшую степень снижение численности данной популяции при ЯК [126]. В том же исследовании было показано выраженное супрессивное действие кортикостероидной терапии на В1- лимфоциты. Однако влияние факта приема кортикостероидов на полученные данные представляется маловероятным в виду сопоставимости групп по доле детей, получавших в анамнезе стероидные препараты. 148 Помимо воздействия лекарственных средств многие авторы связывают уменьшение численности В1-лимфоцитов с интенсивной выработкой специфических индукторов апоптоза в очаге воспаления [81,88,126]. Существует гипотеза, объясняющая снижения численности В1-лимфоцитов у пациентов с ВЗК, их массовой миграцией в зону воспаления под действием большого количества выделяющихся подкрепляется хемоаттрактантов [137]. Данное утверждение результатами исследований материалов биопсии, демонстрирующих массивную инфильтрацию слизистой оболочки кишечника В1лимфоцитами у взрослых пациентов с ВЗК [77,137]. Таким образом, можно предположить, что снижение содержания циркулирующих В1-лимфоцитов у детей с нестойким эффектом инфликсимаба связано с миграцией большого количества данных клеток в обширные очаг поражения и, вероятно, их последующей гибелью в связи с выделением специфических индукторов апоптоза. Данная гипотеза представляется наиболее вероятной в виду функциональной значимости В1-лимфоцитов. Установлено, что антитела, производимые В1-клетками, являются полиспецифичными и низкоаффинными, и используются в качестве «метки» погибших клеток для их лучшего распознавания и последующего уничтожения. Чем обширнее зона разрушения тканей кишечника, тем большее количество В1-лимфоцитов привлекается в слизистую оболочку для продукции антител [34]. Прогностическая значимость количественных характеристик популяций Тлимфоцитов в отношении эффективности биологической терапии у детей с ВЗК проведена впервые в представляемой работе. Единичные исследования, посвященные прогнозированию эффективности инфликсимаба у взрослых пациентов с БК на основе исходного содержания Treg лимфоцитов, выявили, что у пациентов с БК, имеющих минимальный терапевтический ответ на инфликсимаб, наблюдается исходное увеличение численности Treg лимфоцитов [79]. Анализ популяционного состава Т-лимфоцитов выявил существенное увеличение исходного содержания активированных Т-лимфоцитов, активированных Т-хелперов, Th17-лимфоцитов, Treg лимфоцитов у всех 149 пациентов с ВЗК по сравнению с контрольной группой. При этом у детей с нестойким эффектом биологической терапии численность данных популяции была больше, чем у пациентов со стойким ответом на инфликсимаб. Согласно данным литературы у пациентов с ВЗК наблюдается массивная инфильтрация стенки кишки активированными Т-хелперами, Th17-лимфоцитами, Treg лимфоцитами [49,59, 74,87,124, 174]. Миграция лимфоцитов происходит под действием мощного выброса хемоаттрактантов в зоне воспаления, экспрессией молекул адгезии на эндотелиоцитах и интегринов на Т-лимфоцитах. Накопление активированных Т-хелперов кроме того обусловлено их интенсивной пролиферацией на фоне снижения восприимчивости к сигналам апоптоза [127]. Исследования популяций циркулирующих Т-лимфоцитов выявили повышение количества эффекторных Т-лимфоцитов и активированных Т-клеток на фоне сниженного числа Treg лимфоцитов у взрослых пациентов с ВЗК в период обострения заболевания [66,124]. Снижение численности Treg лимфоцитов объясняется их повышенной миграцией в очаг повреждения с целью подавления воспалительного процесса [145,157]. В работе Cseh A. (2010) показано увеличение содержание циркулирующих активированных Т-хелперов и Treg лимфоцитов у детей с ВЗК вне зависимости от стадии заболевания, что связывается с различиями в патогенезе ВЗК у детей и взрослых, а также повышенной функциональной активности тимуса в детском возрасте [71,112,140]. Таким образом, увеличение численности активированных Т-хелперов, Th17-лимфоцитов в периферической крови детей с ВЗК является следствием их активной пролиферации в очаге воспаления на фоне формирования апоптотической резистентности. Увеличенное содержание Treg лимфоцитов обусловлено компенсаторной адаптационной реакцией иммунной системы, направленной на подавление воспалительного ответа. Определение функционального состояния популяций лимфоцитов выявило исходное снижение активности маркерного митохондриального фермента СДГ в основных популяциях Т-лимфоцитов (T-хелперов, цитотоксических лимфоцитов) у пациентов с нестабильным эффектом от Т- инфликсимаба по 150 сравнению с детьми, имевшими стойким ответ на препарат, и контрольной группой. Активность СДГ основных популяций лимфоцитов в группе детей со стойким положительным эффектом терапии соответствовала значениям контрольной группы. Оценка митохондриальной активности малых популяций Т-лимфоцитов выявила снижение активности СДГ в популяции Th17-лимфоцитов у всех пациентов с ВЗК, однако наиболее выраженные изменения наблюдались у детей с нестабильным эффектом биологической терапии. Группа пациентов со стойким ответом на инфликсимаб характеризовалась исходно более высокой активностью СДГ в популяции Treg по сравнению с пациентами, имеющими нестабильный эффект терапии. Таким образом, особенностью функционального состояния лимфоцитов периферической крови пациентов с нестойким эффектом биологической терапии явилось исходное снижение митохондриальной активности в популяции Тлимфоцитов. Характерной чертой энергетического обмена лимфоцитов у пациентов со стойким положительным ответом на биологическую терапию явилась бόльшая активность СДГ в популяции Treg лимфоцитов по сравнению с группой детей, имевших нестабильный ответ на инфликсимаб. Согласно данным литературы митохондриальная дисфункция и оксидативный стресс играют важную роль в патогенезе ВЗК [47,144,160]. Работа митохондриального аппарата определяется интенсивностью работы его ферментативных систем. Снижение активности ферментов дыхательной цепи, в том числе СДГ, в клетках слизистой оболочки кишки у пациентов с ЯК было показано в работах Karla G. Sifroni и др. (2010) и Vanderborght M. и др.(2004) [160,169]. Нарушение каталитической активности ферментов дыхательной цепи и, следовательно, нормального фосфорилирования образованию приводит большого протекания к количества неполному активных процессов метаболизму форм окислительного кислорода кислорода и [73,155]. Обнаружение высоких концентраций активных форм кислорода и продуктов их окисления в различных биоматериалах (сыворотка и плазма крови, слюна, 151 материалы биопсии), полученных от пациентов с ВЗК, свидетельствует о выраженном нарушении процессов энергетического обмена при данных патологиях [102,119, 144,160]. АФК оказывают плейотропное действие на патогенез ВЗК: показана индукция фосфорилирования NF-κB с последующей выработкой TNF-α, IL-8, IL1-β и др. под влиянием АФК [47,120,175], выявлен хемотаксис нейтрофилов и моноцитов, роллинг лейкоцитов, активация Тлимфоцитов под воздействием пероксид радикала [47,110,120]. Кроме того, аккумуляция АФК в митохондрии приводит к повреждению ядерной и митохондриальной ДНК, что еще больше усугубляет нарушение нормальной работы ферментативных систем (Karla G. Sifroni 2010, Suematsu N. 2003). С учетом выявления у пациентов с ВЗК дефицита антиоксидантов, таких как витамин С, витамин Е, β-каротин, глутатион, в настоящее активно обсуждается ведущая этиологическая роль оксидативного стресса в патогенетическом каскаде ВЗК [47,102,110]. Снижение активности митохондриальных ферментов ассоциировано с неполным катаболизмом поступающих высокомолекулярных соединений, а значит синтезом недостаточного количества АТФ. Принимая во внимание, что ВЗК сопровождаются ярко выраженной нехваткой нутриентов и потерями питательных веществ через поврежденный энтеральный барьер, недостаточность энергетических ресурсов клеток существенно влияет на реализацию защитных функций организма [158,161,170]. В экспериментальной модели ЯК было показано резкое снижение репаративных способностей поврежденной слизистой кишечника в условиях недостаточного содержания АТФ [73]. Таким образом, выявление сниженной активности СДГ в популяциях Тлимфоцитов у детей с ВЗК согласуется с существующей концепцией о важной роли оксидативного стресса и митохондриальной дисфункции в патогенезе ВЗК. Бόльшее снижение активности СДГ в популяциях T-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов у пациентов с нестойким эффектом инфликсимаба объясняется значительным нарушением энергетического обмена клеток, в виду выраженной воспалительной активности заболевания. Снижение активности фермента в 152 популяции Th17-лимфоцитов на фоне значительного увеличения их количества у пациентов с нестабильным эффектом инфликсимаба свидетельствует о функциональной неполноценности данной популяции. Примечательно, что исходная митохондриальная активность Treg лимфоцитов у пациентов со стойким эффектом инфликсимаба значимо превышала показатели детей с нестабильным ответом на препарат. С учетом решающей патогенетической роли Treg лимфоцитов при ВЗК, функциональная состоятельность данной популяции является необходимым факторов высокой эффективности биологической терапии. Исследование активности СДГ в популяциях В-лимфоцитов до начала биологической терапии выявил существенное повышение митохондриальной активности у пациентов со стойким положительным ответом на терапию, по сравнению с детьми, имеющими нестабильный эффект от препарата и контрольной группой. Активность СДГ в популяции В1-лимфоцитов была значительно увеличена у пациентов обеих групп до начала терапии по сравнению с контрольной группой, при этом наиболее выраженное изменение было выявлено в группе пациентов со стойким эффектом инфликсимаба. Исходная митохондриальная активность в популяции В2-лимфоцитов также была выше у пациентов со стойким положительным ответом на терапию, по сравнению с контрольной группой и превышала значения группы с нестойким ответом на препарат. При сравнении митохондриальной активности В-лимфоцитов в группах наблюдения статистически значимым явилось увеличение активности СДГ в общей популяции В-лимфоцитов и ярко выраженное увеличение активности фермента в популяции В1-клеток у детей со стойким положительным ответом на препарат. Таким образом, анализ функционального состояния В-лимфоцитов выявил исходное увеличение активности СДГ в общей популяции В-лимфоцитов у пациентов со стойким эффектом биологической терапии, что может свидетельствовать о компенсаторной реакции организма на выраженное снижение численности данных клеток. Увеличенная активность СДГ в популяции В1-лимфоцитов у детей со стойким эффектом инфликсимаба является 153 отражением их адекватной функциональной активацией в соответствии с повышенной потребностью в удалении разрушенных тканей кишечника. Для выявления наиболее информативных показателей в прогнозировании эффективности биологической терапии был проведен ROC-анализа данных иммунофенотипа и иммуноцитохимического исследования до начала лечения. Определение исходного содержания Th17-лимфоцитов, активности СДГ в популяции Treg лимфоцитов, Т-хелперах и В1-лимфоцитах соответствовало высокой вероятности правильного прогноза эффективности биологической терапии у детей с ВЗК (интервал AUC 0,8-0,9; p<0,05). Оценка исходного содержания активированных Т-хелперов, В-лимфоцитов и показателей активности СДГ в них, определение активности СДГ в популяциях Тлимфоцитов, Th17-лимфоцитов, цитотоксических Т-лимфоцитов, В2-лимфоцитах, активированных Т-хелперах и активированных Т-лимфоцитах характеризовалась хорошим прогностическим качеством модели (интервал AUC 0,7-0,8; p<0,05). Наиболее значимым явилось определение: • относительного количества Тh17-лимфоцитов до начала терапии • исходной активности СДГ в популяции Treg лимфоцитов • исходной активности СДГ в популяции Т-хелперов • исходной активности СДГ в популяции В1-лимфоцитов. Информативность теоритически полученных предполагаемой показателей значимости, так как соответствуют отражают своей состояние патогенетически значимых звеньев иммунной системы при ВЗК. Значение относительного количества CD3+CD4+лимфоцитов), превышающее 18,6%, нестабильный эффект инфликсимаба с Тh17-лимфоцитов (% от позволило прогнозировать вероятностью 87%. Снижение митохондриальной активности Treg лимфоцитов ниже 207 у.е. соответствовало прогнозу минимального терапевтического ответа на препарат с вероятностью 88%. Вероятность правильного прогноза эффективности биологической терапии, построенного на исследовании исходной активности СДГ в популяции Тхелперов, составила 79%, при этом снижение митохондриальной активности в 154 данной популяции менее чем 197 у.е. является предиктором нестабильности терапевтического ответа. Значение исходной активности СДГ в популяции В1лимфоцитов ниже 177 у.е. соответствует прогнозу минимального терапевтического ответа на инфликсимаб с вероятностью 75%. Динамическое наблюдение выбранных иммунологических показателей проводилось в течение первого года биологической терапии. Оценка количественных характеристик основных популяций лимфоцитов выявила постепенное снижение содержания В-лимфоцитов и NK-клеток на фоне биологической терапии, наиболее выраженное у пациентов с нестабильным эффектом инфликсимаба. С учетом исходного снижения численности данных популяций, дефицит клеток к году терапии достигал значительной степени. Так, количество NK-клеток у всех пациентов с ВЗК вне зависимости от эффекта инфликсимаба к году терапии составляло 25% от контрольных значений. Постепенное снижение численности циркулирующих NK-клеток на фоне приема инфликсимаба было показано при ВЗК и ревматоидном артрите у взрослых пациентов [69]. Исследование Fercolj I. (2006) выявило снижение количества NKклеток в слизистой оболочке кишки при БК у взрослых пациентов под действием блокаторов TNF-α предположительно, [89]. Уменьшение объясняется численности повышенной данной экспрессией популяции, мембранно- ассоциированной формы TNF-α на NK-клетках, ее связыванием инфликсимабом, вызывающее блокирование стимулирующих сигналов и последующую гибель клетки [69,93]. Снижение относительного содержания (референсный интервал 12%-22%) обследованных детей. В В-лимфоцитов менее 12% к году терапии наблюдалось у 55 % настоящее время ряд исследователей продемонстрировали снижение количества циркулирующих В-клеток памяти и плазматических клеток у взрослых пациентов с ревматоидным артритом, получающим инфликсимаб [107]. Множество экспериментальных работ подтверждают подавление В-клеточного иммунного ответа под действием блокаторов TNF-α [106,107,152]. Данный эффект, предположительно, объясняется 155 блокированием аутокринного стимулирующего влияния TNF-α на В-лимфоциты под действием инфликсимаба, а также подавлением функциональной активности Т-лимфоцитов, дендритных клеток, играющих значимую роль в пролиферации Влимфоцитов [61,107,152]. Динамическое наблюдение популяционного состава В-лимфоцитов выявило существенный рост относительного количества В1-клеток, наиболее выраженное у пациентов с нестабильным эффектом терапии. Увеличение численности популяции В1-лимфоцитов на фоне терапии инфликсимабом было показано у взрослых пациентов с ревматоидным артритом, системной красной волчанкой, синдромом Шегрена [106]. Нарастание пула В1-лимфоцитов признается некоторыми авторами причиной формирования резистентности к инфликсимабу [126]. Таким образом, у всех пациентов с ВЗК на фоне применения биологической терапии наблюдалось постепенное снижение количества В-лимфоцитов и NKклеток, причем у пациентов с нестабильным эффектом терапии данные изменения выражены в большей степени. Вероятно, подобное снижение численности связано с блокировкой инфликсимабом аутокринного стимулирующего влияния TNF-α на развитие В-лимфоцитов и NК-клеток. Динамическое наблюдение популяционного состава В-лимфоцитов выявило существенный рост относительного количества В1-клеток, наиболее выраженное у пациентов с нестабильным эффектом терапии, что связано с наличием обширных очагов разрушения тканей, а также нарастающей активацией врожденного иммунитета при прогрессировании заболевания. Исходное количество Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов не отличалось у пациентов с разным эффектом инфликсимаба, а так же от контрольной группы. Последующее наблюдение выявило постепенное увеличение количества Т-хелперов в течение года терапии (прирост на 23%) у детей со стабильным эффектом препарата при сохранении нормального количества цитотоксических Т-лимфоцитов. У пациентов с нестойким эффектом биологической терапии наблюдалась обратная динамика: к концу 1 года терапии 156 количество Т-хелперов снижалось, не отличаясь от контрольных значений и уступая таковым значениям в группе пациентов со стойким эффектом терапии, при этом содержание цитотоксических Т-лимфоцитов увеличивалось на 30% по отношению к исходному. популяций лимфоцитов Оценка выявила количественных сохранение характеристик повышенного малых содержания активированных Т-хелперов и Th17-лимфоцитов у детей с нестойким эффектом биологической терапии на протяжении первого года биологической терапии. У пациентов со стойким положительным эффектом от инфликсимаба также выявлено увеличенное количество активированных Т-хелперов, при этом наблюдалось постепенное увеличение численности популяции Treg лимфоцитов с нормализацией содержания Th17-лимфоцитов к концу года лечения Полученные результаты согласуются с данными литературы. Показано, что применение инфликсимаба у пациентов с ревматоидным артритом ассоциировано с увеличением содержания цитотоксических Т-лимфоцитов, активированных Тхелперов, Treg лимфоцитов в периферической крови [45]. Исследование данных иммунофенотипирования Т-лимфоцитов у детей с ВЗК после индукционного курса терапии (6 недель) выявило постепенное увеличение содержания Th1лимфоцитов и активированных Т-хелперов [89]. Предполагается, что увеличение количества циркулирующих обусловлено Th17-лимфоцитов и активированных Т-хелперов ингибированием инфликсимабом хоминга Т-лимфоцитов в пораженном участке слизистой оболочки кишки [45,89]. Анализ динамики функционального состояния лимфоцитов на фоне лечения инфликсимабом выявил достоверное повышение митохондриальной активности в популяции Т-хелперов, В-лимфоцитах и Treg лимфоцитах у пациентов со стойким положительным ответом на препарат по сравнению с пациентами с нестабильным эффектом препарата к концу первого года биологической терапии. В целом, группа пациентов со стойким эффектом от инфликсимаба характеризовалась нормальной или умеренно повышенной активностью СДГ в основных и малых популяциях лимфоцитов на всех этапах лечения. 157 Точный характер влияния инфликсимаба на активность митохондриальных ферментов в настоящее время не известен, однако имеются данные об ингибирующем эффекте инфликсимаба на оксидативный стресс [105,118]. Исследование Y. Kageyama и др (2008), включающее динамическую оценку концентрации продуктов окисления липидов, окисления ДНК и т.д., в биологических жидкостях (сыворотка, моча) пациентов с ревматоидным артритом до начала лечения и в течение первого полугодия биологической терапии, продемонстрировало содержания существенное снижение маркеров оксидативного стресса уже после первых инфузий инфликсимаба [105]. Lemarechal и др. (2006) показали снижение концентрации маркеров окисления белков (карбонил-связанных пептидов) под действием инфликсимаба у пациентов с ревматоидным артрит [118]. Неизученным остается влияние инфликсимаба на процессы синтеза антиоксидантов, снижение содержания которых играет критическую роль в подавлении оксидативного стресса у пациентов с ВЗК. Таким образом, сохранение нормальной активности СДГ лимфоцитов или ее умеренное увеличение в течение года биологической терапии у пациентов со стойким положительных нормальной работе эффектом от митохондриального инфликсимаба аппарата, свидетельствует позволяющей о избежать митохондриальной дисфункции и развития оксидативного стресса в лимфоцитах, что соответствует более благоприятному течению ВЗК. Следующим этапом работы явилось сравнение показателей между группами пациентов, получающих иммунологических разные виды терапии. Одну группу составили дети с ВЗК, имеющие хороший эффект базисной патогенетической терапии, в другую вошли пациенты, имеющие показания к биологической терапии в связи с гормонозависимостью или гормонорезистентностью. Исследование цитокинового профиля и показателей клеточного иммунитета в группе пациентов, имеющих показания к назначению инфликсимаба, проводилось до первой инфузии препарата. Данные цитокинового профиля и количественные характеристики основных и малых популяций лимфоцитов были сопоставимы у пациентов, имевших 158 хороший эффект базисной патогенетической терапии и детьми с гормонозависимостью или гормонорезистентностью. Статистически значимым при сравнении двух групп явилось различие показателей митохондриальной активности лимфоцитов периферической крови. Так было выявлено снижение активности СДГ в популяции Т-хелперов у пациентов, чувствительных к ГКС, на фоне повышения активности СДГ в В1-клетках у детей с гормонозависимой или гормонорезистентной формой заболевания. Полученные данные объясняются особенностями воздействия глюкокортикоидов на работу митохондрии. Согласно данным литературы кортикостероиды могут оказывать разнообразное влияние на митохондриальный аппарат клетки [138,139,180]. Плейотропность гормонального воздействия обусловлена экспрессией собственных стероидных рецепторов на митохондриальной мембране и наличием целого ряда сигнальных белков, регулирующих работу митохондрий [139,82,83]. Характер влияния стероидов на активность ферментов дыхательной цепи определяется, прежде всего, типом клетки и зависит от дозы, способа введения препарата, длительности терапии, алиментарных факторов и др. [139,180]. Действие кортикостероидов на лимфоциты связано с подавлением их функциональной активности, что является основанием для назначения данной группы препаратов в качестве противовоспалительных средств. В частности при ВЗК кортикостероидная терапия назначаются при неэффективности препаратов 5аминосалициловой кислоты и позволяют в короткие сроки добиться ремиссии заболевания у большей части пациентов [3,68]. Однако у трети больных не наблюдается стойкой клинико-эндоскопической ремиссии на фоне приема ГКС Механизмы [70,154]. формирования гормонозависимости и гормонорезистентности не известны, предполагается наличие генетическидетерминированных дефектов рецепторного аппарата, нарушение метаболизма стероидов, а также ингибирование цитокинами каскада стероид- индуцированных сигнальных путей [70]. Таким образом, снижение митохондриальной активности в основных популяциях лимфоцитов у детей с ВЗК, чувствительных к ГКС-терапии, 159 свидетельствует о реализации искомого эффекта кортикостероидов на функциональную активность лимфоцитов, чего не наблюдается у пациентов, имеющих гормонозависимость или гормонорезистентность. Подобный феномен объясняется, вероятно, нарушением этапов взаимодействия кортикостероидов с клеткой (нарушение связывания с рецепторами, нарушение метаболизма, наличие ингибиторов и пр.). Согласно существующим протоколам лечения ВЗК биологическая терапия назначается после подтверждения неэффективности системной ГКС-терапии и цитостатической терапии. Как правило, к этому моменту у пациентов в анамнезе констатируются длительные курсы приема стероидов, которые, несомненно, оказывает значительное влияние на состояние иммунной системы и меняет естественных ход патологического процесса [76,154]. Показано, что с увеличением длительности заболевания усиливается тяжесть течения ВЗК, кроме того увеличивается количество осложнений, в том числе требующих хирургического вмешательства и представляющих опасность для жизни пациента [48,50,80]. В связи с вышеизложенным, следующим этапом работы явился анализ изменения выбранных иммунологических показателей в зависимости от длительности болезни. Для исключения влияние инфликсимаба на состояние клеточного и гуморального иммунитета поставленная задача реализовывалась на выборке пациентов, не получающих биологическую терапию. Оценка цитокинового профиля у детей с разной длительностью заболевания выявила достоверное постепенное снижение концентрации цитокинов с увеличением длительности заболевания. Анализ активности СДГ в лимфоцитах периферической крови показал, что с увеличением длительности заболевания происходит снижение митохондриальной активности в популяции Т-хелперов и В-лимфоцитах, наиболее выраженное после пятилетней продолжительности болезни. Естественное течение относительного содержания болезни характеризовалось снижением NK-клеток (практически в 2 раза за три года 160 болезни), кроме того наблюдалось снижение численности активированных Тхелперов в периферической крови. С учетом блокаторами ранее TNF-α изложенных определяется данных исходно нестойкий сниженной эффект терапии митохондриальной активностью в основных популяциях лимфоцитов, низкими показателями содержания циркулирующих цитокинов, значительно сниженным количеством NK-клеток. длительности В связи с нарастанием аналогичных изменений при увеличении заболевания, можно утверждать, что раннее назначение биологической терапии способствует улучшению прогноза эффективности лечения и повышению качества жизни пациента. Одними из предполагаемых факторов, приводящих в ранней потере ответа на инфликсимаб, является выработка антител к препарату, в виду активации гуморального иммунитета. Подтверждением вовлечения В-клеточного звена иммунитета в развитие воспалительной реакции при ВЗК является обнаружение в сыворотке больных высоких титров аутоантител, например, антител к Saccharomyces cerevisiae, антинейтрофильных антител, антител к экзокринной части поджелудочной железы, антител к гликопротеину 2 у пациентов с ВЗК [60,75,147]. Существуют данные показывающие, что титры аутоантител коррелируют с фенотипом болезни, локализацией воспалительного очага, эндоскопической активностью заболевания [60,147]. Это позволило предположить диагностическую значимость определения аутоантител для прогнозирования эффективности лечения. Оценка содержания anti-GP2 IgG у пациентов с разной длительностью заболевания выявила значимое увеличение уровня аутоантител у пациентов, страдающих БК более 5 лет. Анализ титра антител к гликопротеину-2 в зависимости от эффективности биологической терапии выявил, что нестойкий эффект терапии блокаторами TNF-α у пациентов с ВЗК, ассоциирован с исходно высокими титрами anti-GP2 антител, нарастающими в процессе лечения. Повышение уровня anti-GP2 IgG и IgA с увеличением длительности заболевания 161 свидетельствует в пользу раннего назначения биологических препаратов в связи с большей вероятностью положительного ответа на терапию. Согласно полученным результатам, своевременное назначение биологической терапии у детей с ВЗК препятствует прогрессированию заболевания и тем самым позволяет значительно увеличить эффективность лечения. Полученные данные согласуются с внедрением новой стратегии лечения ВЗК, так называемого «нисходящего метода» («Top-down») подразумевающего раннее назначение блокаторов TNF-α и терапии, позволяющего значительно улучшить качество жизни пациента [52,78]. Таким образом, в результате исследования был выявлен ряд иммунологических маркеров, позволяющих с высокой долей вероятности правильно прогнозировать эффективность терапии блокаторами TNF-α у детей с ВЗК. Финальным этапом работы явилось построение комплексной модели прогноза эффективности инфликсимаба у детей с ВЗК. Известны различные способы прогнозирования эффективности биологической терапии у пациентов с ВЗК, включающие анализ клинических, лабораторных, эндоскопических и фармакокинетических [51,123,134,172,171]. Существующие модели данных ограничиваются краткосрочным прогнозом эффективности терапии (не более 6 месяцев) проводятся в процессе биологической терапии и касаются взрослых пациентов. Таким образом, в настоящее время не создана комплексная диагностическая модель, позволяющая надежно оценить прогноз биологической терапии до начала лечения. На основании цитохимических и иммунологических показателей, демонстрирующих высокую прогностическую значимость в отношении эффекта инфликсимаба у детей с ВЗК, методом множественной пошаговой регрессии было получено математическое уравнение для расчета прогностического коэффициента эффективности инфликсимаба K: K= 0,282 + 0,0038*СДГ(Treg) - 0,0229*(Th17) + 0,0016*(TNF-α), где СДГ(Treg) – активность сукцинатдегидрогеназы в регуляторных Т-лимфоцитах, 162 (Th17) – относительное количество Th17-лимфоцитов от CD3+CD4+ , (TNF-α) – плазменная концентрация TNF-α. Множественный коэффициент корреляции был равен R=0,91. Для проверки информативности коэффициента К был проведен ROCанализ, который продемонстрировал отличное качество прогностической модели (AUC=0,935(0,878-0,993); p<0,05). Диагностическая значимость определения прогностического коэффициента К существенно превышала значимость отдельных показателей, вошедших в регрессионное уравнение. Оптимальное разделение пациентов на детей со стойким положительным эффектом и нестабильным ответом на инфликсимаб наблюдалось при значениях прогностического коэффициента К=0,6 (89% диагностическая чувствительность и 90% диагностическая специфичность, p<0,05). Таким образом, на основании полученных данных наиболее информативные иммунологические показатели были объединены в интегральный прогностический коэффициент, позволяющий с вероятностью 94% правильно прогнозировать эффект биологической терапии до ее начала. Использование данного способа позволяет прогнозировать долгосрочный, не менее 1 года, эффект терапии инфликсимабом у детей с ВЗК на любом этапе лечения и является особенно актуальным в случаях недостаточной эффективности биологической терапии, требующей коррекции схемы введения инфликсимаба. 163 ВЫВОДЫ 1. У пациентов со стойким положительным эффектом терапии блокаторами TNFα выявлено более высокое исходное содержание TNF-α, IL-4, IFN-γ, TGF-β, IL12p70, IL-10, IL-1β, IL-8, IL-2, IL-6, IL-5 в плазме по сравнению с пациентами, имеющими нестойкий эффект терапии (p<0,01). Исходная концентрация TNF-α менее 8,7 пг/мл позволяет прогнозировать минимальный терапевтический ответ на инфликсимаб в течение года лечения (ДЧ=67%, ДС= 98%, p<0,05). 2. Наиболее информативными показателями Т- и В-клеточного звена иммунитета в прогнозе минимального терапевтического ответа на инфликсимаб являются: содержание Th17-лимфоцитов, превышающее 18,6% от CD3+CD4+ лимфоцитов (ДЧ=70%, ДС=87%, p<0,05), активность СДГ Treg лимфоцитов менее 207 у.е. (ДЧ=67%, ДС=88%, p<0,05), активность СДГ в популяции Т-хелперов менее чем 197 у.е. (ДЧ=70%, ДС=79%, p<0,05), активность СДГ в популяции В1лимфоцитов менее 177 у.е. (ДЧ=65%, ДС=75%,p<0,05)до начала лечения. 3. В течение года биологической терапии у детей со стойким эффектом инфликсимаба наблюдалось снижение концентрации TNF-α, IL-2, IL-10, IL-6, IL5, при этом к концу года лечения содержание IL-8 и IL-12p70 у пациентов данной группы превышало показатели пациентов с нестабильным эффектом терапии (p<0,05). 4. На фоне применения инфликсимаба в течение года у всех пациентов наблюдалось снижение количества В-лимфоцитов и NK-клеток, наиболее выраженное у детей с нестабильным эффектом препарата (p<0,01), при этом содержание активированных Т-хелперов и Th17-лимфоцитов в данной группе было значительно увеличено на всех этапах лечения (p<0,05). 5. Активность СДГ в популяциях Т-хелперов, В-лимфоцитов, NK-клеток, Treg лимфоцитов, активированных Т-хелперов была достоверно выше у пациентов со стойким положительным ответом на инфликсимаб на протяжении первого года биологической терапии (p<0,05). 164 6. С увеличением длительности заболевания у пациентов с ВЗК наблюдается снижение концентраций провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, снижение активности СДГ в Т-хелперах и В-лимфоцитах, снижение содержания NK-клеток, нарастание титра anti-GP2 IgG и IgA, что соответствует прогнозу нестойкого эффекта биологической терапии. 7. Разработан интегральный коэффициент, включающий оценку относительного количества Th17-лимфоцитов (% от CD3+CD4+ лимфоцитов), активность СДГ в популяции Treg лимфоцитов, плазменную концентрацию TNFα, позволяющий с вероятностью 94% (ДЧ=89%, ДС=90%, p<0,05) прогнозировать эффективность биологической терапии у детей с ВЗК до ее начала. 165 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Детям с ВЗК, имеющим гормонозависимую или гормонорезистентную форму патологии, необходимо определение содержания TNF-α при назначении терапии блокаторами TNF-α. 2. При назначении инфликсимаба всем детям с ВЗК следуют определять содержание Th17-лимфоцитов, оценивать активность сукцинатдегидрогеназы в популяциях Т-хелперов, регуляторных Т-лимфоцитах и в В1-клетках, что позволит прогнозировать эффект биологической терапии и персонифицировано подходить к выбору тактики лечения. 3. Пациентам с ВЗК, получающим блокаторы TNF-α, необходимо определять цитокиновый профиль, проводить иммуноцитохимическое исследование и иммунофенотипирование популяций лимфоцитов при каждом эпизоде обострения заболевания с целью верификации степени активности воспалительного процесса. 4. Детям с ВЗК рекомендуется определять титр антител к гликопротеину 2 до начала терапии инфликсимабом и в динамике лечения для оценки эффективности препарата и своевременной коррекции терапевтической схемы. 166 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АПК – антигенпрезентирующая клетка АТФ - аденозинтрифосфат АФК – активные формы кислорода БК – болезнь Крона ВЗК – воспалительные заболевания кишечника ГКС – глюкокортикостероиды ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ДС – диагностическая специфичность ДЧ – диагностическая чувствительность ЖКТ – желудочно-кишечный тракт МКБ – международная классификация болезней СДГ – сукцинатдегидрогеназа СОЭ – скорость оседания эритроцитов ЯК – язвенный колит anti-GP2 – антитела к гликопротеину 2 EAC – эндоскопический индекс активности язвенного колита IL – интерлейкин IFN – интерферон NK – натуральные киллеры PCDIA – международный педиатрический индекс активности болезни Крона PUCAI – международный педиатрический индекс активности язвенного колита SES-CD – эндоскопический индекс активности болезни Крона Th17 лимфоциты– Т-хелперы 17 Тreg лимфоциты – регуляторные Т-лимфоциты TNF – фактор некроза опухоли TGF – трансформирующий фактор роста 5–АСК – 5–аминосалициловая кислота 167 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Алиева Э.И. Дифференциальная диагностика заболеваний толстой кишки у детей: Автореф. дисс. …д–ра мед. наук.– М.,2003 – 27с. 2. Балаболкин И.И., Петричук С.В., Капустина Е.Ю. и др. Влияние аллерген– специфической иммунотерапии на активность митохондриальных ферментов лимфоцитов у детей с атопической бронхиальной астмой //Вопросы практической педиатрии.–2012.–Т.7, №6.–С.8-13 3. Белоусова Е.А. Европейский консенсус по лечению болезни Крона //Российский медицинский журнал.– 2012.– №15.– С.741-747 4. Белоусова Е.А. Рекомендации по диагностике и лечению болезни Крона // Фарматека.–2009.–№13.– С.38-44 5. Белоусова Е.А. Язвенный колит и болезнь Крона.– Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2002.– 128 с. 6. Белоусова Е.А., Морозова Н.А., Великанов Е.В. и др. Инфликсимаб при язвенном колите: обзор исследований и собственные результаты //Фарматека.–2011.–№2.– С.72-77 7. Белоусова Е.А., Морозова Н.А., Никитина Н.В. Инфликсимаб (Ремикейд) в лечении рефрактерных форм болезни Крона // Российский медицинский журнал.– 2005.– Т.7, № 1.– С. 28-32 8. Джанашия К. П., Куликова О.Д., Измайлова Т. Д. и др. Атопический дерматит и полисистемная митохондриальная недостаточность //Детская больница: научно–практический журнал.– 2011.– Т.4.– С. 20-25 9. Измайлова Т.Д., Закиров Р.Ш., Петричук С.В. и др. Активность митохондриальных дегидрогеназ лимфоцитов периферической крови у детей с тяжѐлой механической травмой// Медицинский вестник Северного Кавказа.–2010.– №3.–С.89-90 10.Измайлова Т.Д., Фѐдорова Н.В., Петричук С.В. и др. Митохондриальные нарушения у детей с хронической сердечной недостаточностью и методы их коррекции // Российский педиатрический журнал.–2012.– №5.– С.23-27 168 11. Капустина Е.Ю. Активность митохондриальных ферментов лимфоцитов периферической крови у детей с респираторными и кожными проявлениями аллергии // Автореф. дисс. … канд. мед. наук.– М., 2006.–26с. 12.Качегура Л.В., Борзенок С.А., Комах Ю.А.и др. Клинико– иммунологические особенности послеоперационного периода у детей с врожденными катарактами // Журнал для практикующих врачей. Практическая медицина. Офтальмология.–2013.–Т.70, №1–3.–С.13-18 13.Климова С.В. Клиническое значение активности митохондриальных ферментов лимфоцитов при воспалительных заболеваниях кишечника у детей: Автореф. дисс. …канд. мед.наук.–М.,2010.–26c. 14.Комах Ю.А., Борзенок С.А., Петричук С.В. и др. Иммуноцитохимический мониторинг при Цитоморфометрия сложных в офтальмологических медицине и биологии: операциях// фундаментальные и прикладные аспекты: сборник статей.– М.–2012.– С.55-56 15.Коненков В.И., использования Зонова Е.В., Леонова генотипирования Ю.Б. и цитокинов др. с Возможность регулирующей воспалительной активностью в качестве биологических маркеров прогноза эффективности терапии ревматоидного артрита// Научно-практическая ревматология.– 2010.– Т.5.–С.19-26 16.Ломинадзе Г.Г., Семенова Г.Ф., Цитоморфоденситометрическое Петричук исследование С.В. и др. активности митохондриальных дегидрогеназ лимфоцитов при рассеянном склерозе у детей // Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты: сборник статей.– М.– 2012.– С. 78-80 17.Маянская И.В., Маянский А.Н. Неиммунные и иммунные механизмы, участвующие в развитии хронических воспалительных заболеваний кишечника// Вопросы диагностики в педиатрии.– 2013.–Т.5, №4.– С.14-23 18.Пат. 2302635 Российская Федерация, МПК G01 N 33/53, G01 N 33/50 Способ измерения митохондриальной активности лимфоцитов [Текст] /Петричук С.В., Измайлова Т.Д., Радыгина Т.В.; заявитель и 169 патентообладатель Государственное учреждение Научный центр здоровья детей РАМН. – №2005141145/15; заявл. 28.12.2005; опубл. 10.07.2007, Бюл. № 19. – 9 с. 19.Писарева И.В. Изменения активности внутриклеточных ферментов лимфоцитов при аппендикулярном перитоните у детей// Автореф. дисс. … канд. мед. наук.– М., 2007.–26c. 20.Писарева И.В., Карасева О.В., Петричук С.В. и др. Ферментный статус лимфоцитов крови у детей с острой хирургической патологией брюшной полости // Сборник материалов IV Российского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии».– М.– 2005.– С. 359-360 21. Потапов. А.С. Цимбалова Е.Г. Клинические проявления и принципы терапии неспецифического язвенного колита у детей//Педиатрия и детская хирургия.– 2008.– Т.54, №4.– С. 7-11. 22. Петричук С.В., Шищенко В.М., Духова З.Н. и др. Диагностические и прогностические возможности клинической цитохимии.–М.–2005.–74с. 23. Семенова Г.Ф., Бомбардирова Е.П., Измайлова Т.Д. Обоснование и эффективность энерготропной церебральной ишемией терапии у новорожденных детей с [Электронный ресурс]. / Medline / Педиатрия. Электрон. журнал.– 2013.–№ 14.– С.633-646 24.Семенова Г.Ф., Комарова Е.В., Потапов А.С. и др. Информативность основного энергообмена митохондрий лимфоцитов периферической крови у детей с хроническими запорами.–2007.–Т. 6, №3 .–С.48-52 25.Свитич О.А., Власова А.В., Ганковская Л.В Роль генетических и иммунологических факторов в развитии системной красной волчанки // Лечение и профилактика.– 2013.–Т.7, № 3.–С.59-64 26.Свитич О.А., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В. и др. Аналитический подход в изучении противовирусного и иммуномодулирующего действия препаратов на модели герпесвирусной инфекции in vitro // Российский иммунологический журнал.– 2013.–Т. 7, № 4.– С.377-384 170 27.Стандарт специализированной медицинской помощи детям при болезни Крона (регионарном энтерите) [Электронный ресурс]// Приложение к приказу Министерства здравоохранения Российской Федерации от 7 ноября 2012 г. №646н.– Режим доступа: http://www.ros-med.info/standart- protocol/info.php?id=1511&action=standart 28.Стандарт специализированной медицинской помощи детям при язвенном (хроническом) [Электронный илеоколите ресурс] // (неспецифическом Приложение к язвенном приказу колите) Министерства здравоохранения Российской Федерации от 7 ноября 2012 г. № 646н. – Режим доступа: http://www.ros-med.info/standart- protocol/info.php?id=1509&action=standart 29. Суслова Г.Ф. Динамика ферментного статуса клеток и тканей при болезнях органов пищеварения. Автореф. дисс… докт. биол. наук. М., 1991; 31 с. 30.Сухоруков В.С. Очерки митохондриальной патологии.– М.: ИД «МЕДПРАКТИКА–М», 2011.– 288с. 31.Сухоруков В.С. Индивидуальные особенности тканевого энергообмена и их роль в развитии детских болезней//Российский вестник перинатологии и педиатрии.–2011.–Т.56, № 2.– С.4-11 32.Сухоруков В.С., Козлова Л.В., Алимова И.Л. Нарушения клеточной энергетики при сахарном диабете I типа у детей// Российский вестник перинатологии и педиатрии.– 2003.–№ 4.–С.35-39 33.Толмачева Е.Л. Нарушения энергетического обмена митохондрий и их коррекция при первичном ночном энурезе у детей // Автореф. дисс. … канд. мед. наук.– М., 2005 34. Топтыгина А.П., Семикина Е.Л., Копыльцова Е.А. и др. Возрастные особенности формирования гуморального звена иммунного ответа у детей//Медицинская иммунология.–2012.–Т.14,№4-5.– С.289-294 35.Хайдуков С.В. Подходы к стандартизации проточной цитометрии для иммунофенотипирования. Настройка цитометров и подготовка анализа//Медицинская иммунология.–2007.–Т.9, №6.–С.569-574 для 171 36.Хайдуков С. В, Байдун Л. А., Зурочка А. В. Стандартизованная технология "исследование субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови с применением Проблемы проточных стандартизации в цитофлюориметров-анализаторов// здравоохранении: Научно-практический рецензируемый журнал. - 2012. - № 5/6. - С. 28-44 37.Хайдуков С.В., Зурочка А.В., Тотолян А.А. и др. Основные и малые популяции лимфоцитов периферической крови человека и их нормативные значения. (методом проточного цитометрического анализа) //Медицинская иммунология. -2009.- Т.11,№2-3. – С. 227-238 38.Царегородцев А.Д., Сухоруков В.С. Митохондриальная медицина — проблемы и задачи // Российский вестник перинатологии и педиатрии.– 2012.–№ 4–2.–С. 5-14 39.Цимбалова Е.Г. Клинико-лабораторные проявления и критерии активности воспалительных заболеваний кишечника у детей: Автореф.дис….канд.мед.наук. - Москва, 2005. - 24с 40.Шумилов П.В. заболеваний Нерешенные кишечника у вопросы детей. Роль патогенеза воспалительных пристеночной микрофлоры кишечника // Педиатрическая фармакология.– 2010.– Т. 7, № 5.– С. 54-58. 41.Яблокова Е.А. Горелова А.В., Ратникова М.А. и др. Клинико– эндоскопически–морфологические диссоциации у детей с воспалительными заболеваниями кишечника [Электронный ресурс] // Consilium medicum / Педиатрия. Электрон. журнал.–2008.–№ 2.– Режим доступа: http:// con– med.ru/magazines/pediatry/215670/215650/ 42.Яблокова Е.А., Горелов А.В., Ратникова И.В. и др. Воспалительные заболевания кишечника у детей // Педиатрия.– 2006.– №5.– С. 99-102 43.Abraham C., Cho J. H. Inflammatory Bowel Disease//N Engl J Med.–2009.–Vol. 361.–P. 2066-2078 44.Ackrell B.A. Progress in understanding structure-function relationships in respiratory chain complex II // FEBS Lett.– 2000.–Vol.466, №1.–P.1-5 172 45.Aeberli D., Seitz M., Jüni P. et al. Increase of peripheral CXCR3 positive T lymphocytes upon treatment of RA patients with TNF-alpha inhibitors // Rheumatology (Oxford).–2005.–Vol.44, №2.–P.172-175 46.Alvarado-Sánchez B., Hernández-Castro B., Portales-Pérez D. et al. Regulatory T cells in patients with systemic lupus erythematosus // J Autoimmun.–2006.– Vol.27 –P.110-118 47.Alzoghaibi M.A. Concepts of oxidative stress and antioxidant defense in Crohn's disease // World J Gastroenterol.–2013.– Vol. 19, № 39.– P.6540-6547 48. Andres P.G., Friedman L.S. Epidemiology and the natural course of inflammatory bowel disease// Gastroenterol Clin North Am .–1999.–Vol. 28.– P.255-281 49. Annunziato F., Cosmi L., Santarlasci V. et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells //J Exp Med.–2007.–Vol.204, №8.–P.1849-1861 50. Antonioli D.A. Pediatric inflammatory bowel disease.//Pediatr Dev Pathol.– 2005.–Vol. 8.–P.2-19 51.Arnott I.D., Mcneill G., Satsangi J. An analysis of factors influencing short-term and sustained response to infliximab treatment for Crohn's disease// Aliment Pharmacol Ther.– 2003.– Vol.17, №12.–P.1451-1457 52. Baert F., Caprilli R., Angelucci E. Medical therapy for Crohn's disease: topdown or step-up?// Dig Dis.–2007.–Vol.25, №3.–P.260-266 53. Baldassano R.N., Piccoli D.A. Inflammatory bowel disease in pediatric and adolescent patients// Gastroenterol Clin North Am .–1999.–Vol. 28.–P.445-458 54.Bamias G., Nyce M.R., De La Rue S.A. et al. New concepts in the pathophysiology of inflammatory bowel disease // Ann Intern Med.– 2005.– Vol.143, №12.– P.895-904 55.Beinert H. Spectroscopy of succinate dehydrogenases, a historical perspective. Biochim. Biophys. Acta.–2002. – Vol.1553. №1–P. 7–22 56. Belousova E.A. Epidemiology of inflammatory bowel disease in Russia // Falk Symposium. – 2006.–31p. 173 57. Biancheri P., Giuffrida P., Docena G.H. et al. The role of transforming growth factor (TGF)-β in modulating the immune response and fibrogenesis in the gut// Cytokine Growth Factor Rev.– 2014.–Vol.25, №1.–P.45-55 58.Binder V. Genetic epidemiology of inflammatory bowel disease // Dig Dis. 1999.–Vol. 16.–P. 351-355 59. Bogaert S., Laukens D., Peeters H. et al. Differential mucosal expression of Th17-related genes between the inflamed colon and ileum of patients with inflammatory bowel disease //BMC Immunology.–2010.– Vol.11.–P.1-11 60.Bogdanos D.,Roggenbuck D., Reinhold D. et al. Pancreatic-specific autoantibodies to glycoprotein 2 mirror disease location and behaviour in younger patients with Crohn’s disease // BMC Gastroenterology.– 2012.–Vol. 12.– P.102 -111 61. Boussiotis V.A., Nadler L.M., Strominger J.L. et al. Tumor necrosis factor alpha is an autocrine growth factor for normal human B cells// Proc Natl Acad Sci USA.– 1994.–Vol.91, №15.–P.7007-7011 62.Bousvaros A., Antonioli D.A., Colletti R.B. et al. Differentiating ulcerative colitis from Crohn disease in children and young adults: report of a working group of the North American Society for Pediatric Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition and the Crohn's and Colitis Foundation of America // J Pediatr Gastroenterol Nutr.–2007.–Vol.44, №5.– P.653-674 63.Brant S.R., Picco M.F., Achkar J.P. et al. Defining complex contributions of NOD2/CARD15 gene mutations, age at onset, and tobacco use on Crohn's disease phenotypes// Inflamm Bowel Dis.–2003.–Vol.9, №5.– P.281-289 64.Breese E.J., Michie C.A., Nicholls S.W. et al. Tumor necrosis factor-alpha producing cells in the intestinal mucosa of children with inflammatory bowel disease. Gastroenterology.–1994.– Vol.106.–P. 1455-1466 65.Bushueva T.V., Kurbatova O.V., Semenova G.F et al. Features of cellular immunity and intracellular enzyme activity in PKU patients// J. of Inherited Metabolic Disease .–2013.–Vol. 36. Suppl. 2.– Abstracts of 12 International Congress of inborn errors of metabolism.– P.122 174 66.Chamouard P., Monneaux F., Richert Z. et al., Diminution of Circulating CD4+CD25 high T cells in naïve Crohn's disease// Dig Dis Sci.–2009.–Vol.54.– P.2084–2093 67.Chen J., Gusdon A.M., Thayer T.C. et al. Role of increased ROS dissipation in prevention of T1D // Ann N Y Acad Sci. 2008.–Vol.1150.–P.157-166 68. Colombel J.F., Sandborn W.J., Reinisch W. et al. SONIC Study Group. Infliximab, azathioprine, or combination therapy for Crohn's disease// N Engl J Med.–2010.–362.–P.1383–1395 69. Coulthard L.R., Geiler J., Mathews R.J. et al. Differential effects of infliximab on absolute circulating blood leucocyte counts of innate immune cells in early and late rheumatoid arthritis patients//Clin Exp Immunol.– 2012.–Vol.170, №1.– P.36-46 70.Creed T.J., Probert C.S. Review article: steroid resistance in inflammatory bowel disease - mechanisms and therapeutic strategies//Aliment Pharmacol Ther.– 2007.– Vol.25, №2.– P.111-122 71.Cseh A., Vasarhelyi B., Molnar K. et al. Immune phenotype in children with therapy naïve remitted and relapsed Crohn’s disease//World J Gastroenterol.– 2010.–Vol.16, №47.– P.6001-6009 72.Dada L.A., Sznajder J. I.. Mitochondrial Ca2+ and ROS take center stage to orchestrate TNF-α–mediated inflammatory responses//J Clin Invest.–2011.– Vol.121, №5.–P.1683–1685 73.Damiani C.R., Benetton C.A., Stoffel C. et al. Oxidative stress and metabolism in animal model of colitis induced by dextran sulfate sodium //J Gastroenterol Hepatol.–2007.–Vol.22, №11.–P.1846-1851 74. Danese S. Immune and nonimmune components orchestrate the pathogenesis of inflammatory bowel disease //Am J Physiol Gastrointest.– Liver Physiol.–2011.– Vol. 300.–P.716-722 75.De Beéck K.O., Vermeire S., Rutgeerts P. et al.Antibodies to GP2, the major zymogen granule membrane glycoprotein, in inflammatory bowel diseases // Gut.–2012.–Vol.61.–P.162-164 175 76. De Iudicibus S., Franca R., Martelossi S. et al. Molecular mechanism of glucocorticoid resistance in inflammatory bowel disease// World J Gastroenterol.–2011.–Vol. 17, №9.–P.1095-1108 77. Defendenti C., Sarzi-Puttini P., Grosso S. et al. B Lymphocyte intestinal homing in inflammatory bowel disease // BMC Immunology.– 2011.–Vol. 12.–P.71-76 78. D'Haens G., Baert F., Van Assche G. Early combined immunosuppression or conventional management in patients with newly diagnosed Crohn's disease: an open randomised trial// Lancet.–2008.–Vol. 371, №9613.–P.660-667 79.Di Sabatino A., Biancheri P., Piconese S. et al. Peripheral regulatory T cells and serum transforming growth factor-β: relationship with clinical response to infliximab in Crohn's disease// Inflamm Bowel Dis.–2010.–Vol.16, №11.– P.1891-1897 80. Diefenbach K.A., Breuer C.K. Pediatric inflammatory bowel disease // World J Gastroenterol.–2006.–Vol.12.–P.3204-3212 81. Distelhorst C.W. Recent insights into the mechanism of glucocorticosteroidinduced apoptosis //Cell Death Differ.–2002.– Vol.9, №1.– P.6-19 82. Du J., McEwen B., Manji H.K. Glucocorticoid receptors modulate mitochondrial function// Commun Integr Biol.–2009.–Vol.2, №4.– P.350-352 83. Du J., Wang Y., Hunter R. et al. Dynamic regulation of mitochondrial function by glucocorticoids// Proc Natl Acad Sci USA.– 2009.–Vol.106.–P.3543–3548 84. Ebert E.C. Infliximab and the TNF-alpha system// Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol.–2009.–Vol.296, №3.–P.612-620 85. Ebert E.C., Panja A., Das K.M. et al. Patients with inflammatory bowel disease may have a transforming growth factor-beta-, interleukin (IL)-2- or IL-10deficient state induced by intrinsic neutralizing antibodies// Clin Exp Immunol.– 2009.–Vol.155, №1.– P.65-71 86.Ehrenstein M.R., Evans J.G., Singh A.J. et al. Compromised function of regulatory T cells in rheumatoid arthritis and reversal by anti-TNF alpha therapy //J Exp Med.–2004.–Vol.200, №3.–P.277-285 176 87. Elgbratt K., Kurlberg G., Hahn-Zohric M. et al. Rapid migration of thymic emigrants to the colonic mucosa in ulcerative colitis patients// Clin Exp Immunol.–Nov 2010.–Vol.162, №2.–P.325-336 88.El-Hodhod M. A., Aly R. H., Youssef S. R. et al. Enhanced blood lymphocytes apoptosis in children with inflammatory bowel disease// ISRN Gastroenterology.– Vol.2013.–P.415-417 89. Ferkolj I., Ihan A., Markovic S. et al. Infliximab reduces the number of activated mucosal lymphocytes in patients with Crohn's disease//J Gastrointestin Liver Dis.– 2006.–Vol.15, №3.–P.231-235 90. Fernandez-Real J.M., Vendrell J., Richart C. et al. Platelet count and interleukin 6 gene polymorphism in healthy subjects //BMC Med Genet.–2001.–Vol. 2.–P.6 91.Filippin L.I.,Vercelino R.M., Xavier R.M. Redox signaling and the inflammatory response in rheumatoid arthritis // Clin Exp Immunol.–2008.–Vol.152.–P.415422 92.Fina D., Pallone F. What is the role of cytokines and chemokines in IBD? // Inflammatory Bowel Disease.–2008.– Vol.14, №2.–P.117-118 93. Geiler J., Buch M., McDermott M.F. Anti-TNF treatment in rheumatoid arthritis// Curr Pharm Des.–2011.–Vol.17.–P.3141–3154 94.Gilgun-Sherki Y., Melamed E., Offen D. The role of oxidative stress in the pathogenesis of multiple sclerosis: the need for effective antioxidant therapy // J Neurol.–2004.–Vol. 251.–P.261-268 95. Gorelik L., Flavell R.A. Transforming growth factor-beta in T-cell biology//Nat Rev Immunol.–2002.– Vol.2, №1.–P.46-53 96.Heresbach D., Alexandre J.L., Branger B.et al. Frequency and significance of granulomas in a cohort of incident cases of Crohn’s disease // Gut.– 2005.– Vol.54, №2.–P. 215–222 97.Heyman M.B., Krischner B.S., Gold B.D. et al. Children with early-onset IBD: analysis of Pediatric IBD consortium registry// J Pediatr.–2005.–Vol.146, №1.– P.35-40 177 98.Hlavaty T., Pierik M., Henckaerts L. et al. Polymorphisms in apoptosis genes predict response to infliximab therapy in luminal and fistulizing Crohn's disease// Aliment Pharmacol Ther.–2005.–Vol. 22, №7.– P. 613-626 99. Hoyer K.K., Dooms H., Barron L. et al. Interleukin-2 in the development and control of inflammatory disease//Immunol Rev.–2008.– Vol. 226.–P.19-28 100.Hyams J., Markowitz J., Otley A. et al. Evaluation of the pediatric crohn disease activity index: a prospective multicenter experience// J Pediatr Gastroenterol Nutr.–2005.–Vol. 41,№4.–P.416-421 101. Hyams J.S., Treem W.R., Eddy E. et al. Tumor necrosis factor-alpha is not elevated in children with inflammatory bowel disease // J Pediatr Gastroenterol Nutr.– 1991.– Vol.12, №2.–P.233-236 102. Jahanshahi G., Motavasel V., Rezaie A. et al. Alterations in antioxidant power and levels of epidermal growth factor and nitric oxide in saliva of patients with inflammatory bowel diseases // Dig Dis Sci.– 2004.–Vol.49, №11-12– P.1752-1757 103.Jakubowska-Burek L., Kaczmarek E., Hoppe-Golebiewska J. et al. Genotyping of CARD15/NOD2, ATG16L1 and IL23R Genes in Polish Crohn’s Disease (CD) Patients – Are They Related to the Localization of the Disease and ExtraIntestinal Symptoms? // Crohn's Disease, Dr. Sami Karoui (Ed), ISBN: 978-953307-811-3.– Rijeka: InTech, 2012.–P.39-58 104.Jevon G. P., Madhur R. Endoscopic and Histologic Findings in Pediatric Inflammatory Bowel Disease // Gastroenterol Hepatol.–2010.–Vol.6, №3.–P.174180 105.Kageyama Y., Takahashi M., Ichikawa T. et al. Reduction of oxidative stress marker levels by anti-TNF-alpha antibody, infliximab, in patients with rheumatoid arthritis//Clin Exp Rheumatol.–2008.–Vol.26, №1.–P.73-80 106.Karampetsou M.P., Andonopoulos A.P., Liossis S.N. Treatment with TNFα blockers induces phenotypical and functional aberrations in peripheral B cells// Clin Immunol.– 2011.–Vol.140, №1.–P.8-17 178 107.Kobie J.J., Zheng B., Bryk P. et al. Decreased influenza-specific B cell responses in rheumatoid arthritis patients treated with anti-tumor necrosis factor//Arthritis Res Ther.–2011.–Vol.13, №6.–P.209-220 108.Komatsu M., Kobayashi D., Saito K. et al. Tumor necrosis factor-alpha in serum of patients with inflammatory bowel disease as measured by a highly sensitive immuno-PCR // Clinical Chemistry.–2001–Vol.47, №7 –P.1297-1301 109.Kriegel M.A., Li M.O., Sanjabi S. et al. Transforming growth factor-beta: recent advances on its role in immune tolerance //Curr Rheumatol Rep.– 2006.–Vol. 8, №2.–P.138-144 110.Kruidenier L., Verspaget H.W. Review article: oxidative stress as a pathogenic factor in inflammatory bowel disease--radicals or ridiculous? // Aliment Pharmacol Ther.–2002.– Vol.16, №12.–P.1997-2015 111. Kurbatova O., Surkov A., Polyakova S. et al. Lymphocytes intercellular enzymes activity in children with hepatic form of glycogen storage disease// J. of Inherited Metabolic Disease .–2013.–Vol. 36. Suppl. 2.– Abstracts of 12 International Congress of inborn errors of metabolism.– P. 226 112.La Scaleia R., Morrone S., Stoppacciaro A. et al. Peripheral and intestinal CD4+ T cells with a regulatory phenotype in pediatric patients with inflammatory bowel disease//J Pediatr Gastroenterol Nutr.–2010.–Vol.51, №5.– P. 563-572 113.Lanfranchi GA, Tragnone A. Serum and faecal tumour necrosis factor-α as marker of intestinal inflammation// Lancet.–1992.– Vol.339, Iss.8800.– P. 1053 114. Le Berre N., Heresbach D., Kerbaol M. Histological discrimination of idiopathic inflammatory bowel disease from other types of colitis//J Clin Pathol.– 1995.–Vol.48, №8.–P.749-753 115.Lee L.Y., Sanderson J.D., Irving P.M. Anti-infliximab antibodies in inflammatory bowel disease: prevalence, infusion reactions, immunosuppression and response, a meta-analysis // Eur J Gastroenterol Hepatol.–2012.–Vol.24, №9.–P.1078-85 179 116.Lees C.W., Satsangi J. Genetics of Inflammatory Bowel Disease: Implications for Disease Pathogenesis and Natural History// Expert Review of Gastroenterology and Hepatology.– 2009.–Vol.3 №5.–P.513-534 117. Leighton J.A., Shen B., Baron T.H. et al. ASGE guideline: endoscopy in the diagnosis and treatment of inflammatory bowel disease // Gastrointest Endosc.– 2006.– Vol.63, №4.–P.558-565 118.Lemarechal H., Allanore Y., Chenevier-Gobeaux C. Serum protein oxidation in patients with rheumatoid arthritis and effects of infliximab therapy//Clin Chim Acta.–2006.–Vol.372, №1-2.–P.147-153 119.Levy E., Rizwan Y., Thibault L. et al. Altered lipid profile, lipoprotein composition, and oxidant and antioxidant status in pediatric Crohn’s disease // Am J Clin Nutr.– 2000.–Vol.71, №3.–P.807-815 120. Li X., Fang P., Mai J. Targeting mitochondrial reactive oxygen species as novel therapy for inflammatory diseases and cancers // J Hematol Oncol.–2013.– Vol.6.–P.1-19 121.MacDonald T.T. New Cytokine Targets in Inflammatory Bowel Disease// Gastroenterol Hepatol (NY).–2011.– Vol.7, №7.– 474-476 122.MacDonald T.T., Monteleone I., Fantini M.C. Regulation of homeostasis and inflammation in the intestine// Gastroenterology.– 2011.– Vol.140, №6.– 1768-17 75 123.Maser E. A, Villela R., Silverberg M.S. et al. Association of trough serum infliximab to clinical outcome after scheduled maintenance treatment for Crohn’s disease //Clinical Gastroenterology and Hepatology.– 2006.–Vol. 4, Issue 10.– Pages 1248-1254 124.Maul J., Loddenkemper C., Mundt P., et al. Peripheral and intestinal regulatory CD4+ CD25(high) T cells in inflammatory bowel disease// Gastroenterology.– 2005.–Vol.128.– P.1868–1878 125. Meier J., Sturm A. Top-down versus Step-Up: new strategies in the treatment of Crohn's disease // Z Gastroenterol.–2009.–Vol.47, №2.–P. 240-242 180 126.Mishima Y., Ishihara S., Amano Y.et al. Alterations of peripheral blood CD5+ B cells in inflammatory bowel disease//Scand J Gastroenterol.–2009.–Vol.44, №2.– P.172-179 127.Monteleone G., Fina D., Caruso R., Pallone F. New mediators of immunity and inflammation in inflammatory bowel disease // Current Opinion in Gastroenterol.–2006.– Vol.22, №4.–P. 361-364 128.Mosli M., Al Beshir M., Al-Judaibi B. et al. Advances in the diagnosis and management of inflammatory bowel disease: Challenges and uncertainties // Saudi J Gastroenterol.– 2014.–Vol.20, №2.–P.81-101 129.Murch S.H., Lamkin V.A., Savage M.O. et al. Serum concentrations of tumour necrosis factor alpha in childhood chronic inflammatory bowel disease// Clinical Chemistry.–1991–Vol.32,№8–P.913-917 130.Műzes G., Molnár B., Tulassay Z. et al. Changes of the cytokine profile in inflammatory bowel diseases // World J Gastroenterol.–2012.– Vol.18,№41.– P.5848-5861 131.Neil G.A., Summers R.W., Cheyne B.A. et al. CD5+ B cells are decreased in peripheral blood of patients with Crohn's disease//Dig Dis Sci.–1992.–Vol.37, №9.–P.1390-1395 132. Ogawa K., Matsumoto T., Esaki M. et al. Profiles of circulating cytokines in patients with Crohn's disease under maintenance therapy with infliximab // J Crohn’s Colitis.–2012.– Vol.6, №5.–P.529-535 133. Ogura Y., Bonen D.K., Inohara N. et al. A frameshift mutation in NOD2 associated with susceptibility to Crohn's disease//Nature.– 2001.–Vol.411, №6837.– P.603-606 134.Orlando A., Colombo E., Kohn A. et al. Infliximab in the treatment of Crohn's disease: predictors of response in an Italian multicentric open study// Dig Liver Dis.–2005.–Vol.37, №8.–P.577-583 135. Pak S., Holland N., Garnett E.A. et al. Cytokine profiles in peripheral blood of children and adults with Crohn disease// J Pediatr Gastroenterol Nutr.–2012.– Vol.54, №6.–P.769-775 181 136.Patiño-García A., Sotillo-Piñeiro E., Modesto C. et al. Screening of the human tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) gene promoter polymorphisms by PCR-DGGE analysis// Mutat Res.–1999.–Vol.406, №2-4.–P.121-125 137. Polese L., Boetto R., De Franchis G. et al. B1a lymphocytes in the rectal mucosa of ulcerative colitis patients// World J Gastroenterol.–2012.–Vol.18, №2.–P.144-149 138.Psarra A.M., Sekeris C.E. Glucocorticoid receptors and other nuclear transcription factors in mitochondria and possible functions// Biochim Biophys Acta.– 2009 .–Vol.1787, №5.–P.431-436 139.Psarra A.M., Sekeris C.E. Glucocorticoids induce mitochondrial gene transcription in HepG2 cells: role of the mitochondrial glucocorticoid receptor// Biochim Biophys Acta.– 2011.–Vol.1813, №10.–P.1814-1821 140.Reikvam D. H., Perminow G., Lyckander L.G. et al. Increase of regulatory T cells in ileal mucosa of untreated pediatric Crohn's disease patients// Scandinavian Journal of Gastroenterology.–2011.–Vol.46.– P.550-560 141.Reimund J-M., Wittersheim C., Dumont S. et al. Increased production of tumour necrosis factor-alpha, interleukin-1 beta, and interleukin-6 by morphologically normal intestinal biopsies from patients with Crohn's disease // Gut .–1996.– Vol.39.№5– P. 684-689 142.Remicade ®(Infliximab) Full prescribing information. – Horsham: Janssen Biotech, Inc., 2013.– 18p. 143.Restivo N.L., Srivastava M.D.,Schafer I.A. et al. Mitochondrial dysfunction in a patient with Crohn’s disease: possible role in pathogenesis // J Pediatr Gastroenterol Nutr.–2004.–Vol.38, №5.–P.534-538 144.Rezaie A., Parker R.D., Abdollahi M. Oxidative stress and pathogenesis of inflammatory bowel disease: an epiphenomenon or the cause?// Dig Dis Sci.– 2007.– Vol.52, №9.–P.2015-2021 145.Ricciardelli I., Lindley K.J., Londei M. et al. Anti tumour necrosis-alpha therapy increases the number of FOXP3 regulatory T cells in children affected by Crohn's disease // Immunology.–2008.–Vol. 125, № 2.–P.178-183 182 146.Roda G., Marocchi M., Sartini A. Cytokine networks in ulcerative colitis // Ulcers.–2011.–Vol.2011.– P.5 DOI: http://dx.doi.org/10.1155/2011/391787 147.Roggenbuck D., Reinhold D., Wex T. et al. Autoantibodies to GP2, the major zymogen granule membrane glycoprotein, are new markers in Crohn's disease // Clin Chim Acta.–2011.–Vol.412, №9-10.–P.718-724 148.Ruiz P.A., Shkoda A., Kim S.C. et al. IL-10 gene-deficient mice lack TGFbeta/Smad-mediated TLR2 degradation and fail to inhibit proinflammatory gene expression in intestinal epithelial cells under conditions of chronic inflammation //Ann N Y Acad Sci.–2006.–Vol.1072.–P.389-394 149.Rustin P. and Rotig A. Inborn errors of complex II – unusual human mitochondrial diseases // Biochim. Biophys. Acta.–2002.–Vol.1553, №1-2.–P. 117–122 150.Rutgeerts P., Vermeire S., Assche G. V. Mucosal healing in inflammatory bowel disease: impossible ideal or therapeutic target? // Gut.– 2007.– Vol. 56, №4.– P.453-455. 151.Rutter J., Winge D.R., Schiffman J.D. et al. Succinate dehydrogenase. Assembly regulation and role in human disease // Mitochondrion.–2010.–Vol.10.– P.393401 152.Salinas G.F., De Rycke L., Barendregt B. et al. Anti-TNF treatment blocks the induction of T cell-dependent humoral response// Ann Rheum Dis.–2013.– Vol.72, №6.–1037-1043 153.Sanchez-Muñoz F., Dominguez-Lopez A., Yamamoto-Furusho J.K. Role of cytokines in inflammatory bowel disease// World J Gastroenterol.–2008.– Vol.14, №27.– P.4280-4288 154.Sandborn WJ. Steroid-dependent Crohn's disease // Can J Gastroenterol.– 2000.– Vol.14, Suppl C.– P.17-22 155.Santhanam S., Rajamanickam S., Motamarry A. Mitochondrial electron transport chain complex dysfunction in the colonic mucosa in ulcerative colitis// Inflamm Bowel Dis.–2012.– Vol.18, №11.–P.2158-2168 183 156.Sarra M., Pallone F., Macdonald T.T. et al. IL-23/IL-17 axis in IBD// Inflamm Bowel Dis.–2010.–Vol.16, №10.–P.1808-1813 157.Saruta M., Yu Q.T., Fleshner P.R., Mantel P.Y. et al. Characterization of FOXP3+CD4+ regulatory T cells in Crohn's disease// Clin Immunol.–2007– Vol.125.–P.281–290 158.Schoepfer A.M., Beglinger C., Straumann A. Ulcerative colitis: correlation of the Rachmilewitz endoscopic activity index with fecal calprotectin, clinical activity, C-reactive protein, and blood leukocytes // Inflamm Bowel Dis.–2009.– Vol.15, №12.– P.1851-1858 159.Sidoroff M., Kolho K.L. Glucocorticoid sensitivity in inflammatory bowel disease //Ann Med.– 2012.– Vol.44, №6.– P.578-587 160.Sifroni K.G., Damiani C.R., Stoffel C. et al. Mitochondrial respiratory chain in the colonic mucosal of patients with ulcerative colitis// Mol Cell Biochem.– 2010.– Vol.342, № 1-2.–P.111-115 161.Sostegni R., Daperno M., Scaglione N. et al. Review article: Crohn's disease: monitoring disease activity // Aliment Pharmacol Ther.–2003.– Vol.17, Suppl 2.– P.11-17 162.Stevens C., Walz G., Singaram C.et al. Tumor necrosis factor-alpha, interleukin1 beta, interleukin-6 expression in inflammatory bowel disease // Digestive Disease and Science Journal .–1992.– Vol.37.–P. 818-826 163.Suematsu N., Tsutsui H., Wen J. et al. Oxidative stress mediates tumor necrosis factor-alpha-induced mitochondrial DNA damage and dysfunction in cardiac myocytes // Circulation.– 2003.–Vol.107, №10.– P.1418-1423 164.Sugiyama H., Gyulai R., Toichi E. et al. Dysfunctional blood and target tissue CD4+CD25high regulatory T cells in psoriasis: mechanism underlying unrestrained pathogenic effector T cell proliferation// J Immunol.–2005.– Vol.174.–P.164-173 165.Taylor K.D., Plevy S.E., Yang H. et.al. ANCA pattern and LTA haplotype relationship to clinical responses to anti-TNF antibody treatment in Crohn's disease// Gastroenterology.–2001.–Vol.120, №6.–P.1347-1355 184 166.Turner D., Travis S.P., Griffiths A.M. et al. Consensus for managing acute severe ulcerative colitis in children: a systematic review and joint statement from ECCO, ESPGHAN, and the Porto IBD Working Group of ESPGHAN // Am J Gastroenterol.–2011.– Vol.106, №4.–574-588 167.Van Lierop P. Role of the innate immune system in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. We have met the enemy and he is us.– Rotterdam: Optima Grafische Communicatie, 2010.–176p. 168.Van Lierop P.P., Samsom J.N., Escher J.C. et al. Role of the innate immune system in the pathogenesis of inflammatory bowel disease//J Pediatr Gastroenterol Nutr.–2009.–Vol.48, №2.–P.142-151. 169.Vanderborght M., Nassogne M.C., Hermans D. et al. Intractable ulcerative colitis of infancy in a child with mitochondrial respiratory chain disorder. J Pediatr Gastroenterol Nutr.–2004.– Vol.38, №3.–P.355-357 170.Vermeire S. Serologic Markers in the Diagnosis and Management of IBD // Gastroenterol Hepatol.– 2007.– Vol.3, №6.–P.424-426. 171.Vermeire S., Assche G. V., Rutgeerts P. Role of genetics in prediction of disease course and response to therapy // World J Gastroenterol.– 2010.– Vol.16, №21.– P. 2609-2615. 172. Vermeire S., Louis E., Carbonez A. et al. Demographic and clinical parameters influencing the short-term outcome of anti-tumor necrosis factor (Infliximab) treatment in Crohn's disease// J Gastroenterol.– 2002.–Vol.97, №9.–P.2357-2363 173.Viglietta V., Baecher-Allan C., Weiner H.L. et al. Loss of functional suppression by CD4+CD25+ regulatory T cells in patients with multiple sclerosis // J Exp Med.–2004.–Vol.199.–P.971-979 174.Voiglio E., Salle B., Lemaitre D. et al. Activation of T-lymphocytes in Crohn disease and in ulcerative hemorrhagic rectocolitis. Therapeutic implications// Pathol Biol (Paris).–1996.–Vol.44, №4.–P. 287-292 175.West A.P., Shadel G.S., Ghosh S. Mitochondria in innate immune responses // Nat Rev Immunol.– 2011.–Vol.11, №6.–P. 389-402 185 176.Wojtovich A.P., Smith C.O., Haynes C.M. et al. Physiological consequences of complex II inhibition for aging, disease, and the mKATP channel // Biochim Biophys Acta.–2013.–Vol.1827, №5.–P.598-611 177.Xavier R. J., Podolsky D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease // Nature.–2007.–Vol.448.– P.427-434 178.Yadav P.K., Chen C., Liu Z. Potential role of NK cells in the pathogenesis of inflammatory bowel disease//Journal of Biomedicine and Biotechnology.– 2011.–Vol. 2011.–P.6 179.Yamamoto-Furusho J.K., Korzenik J.R. Crohn’s disease: Innate immunodeficiency? //World J Gastroenterol.–2006.–Vol.12, №42.–P.6751-6755 180.You Y.N., Short K.R., Jourdan M. et al. The effect of high glucocorticoid administration and food restriction on rodent skeletal muscle mitochondrial function and protein metabolism// PLoS ONE.–2009.–Vol. 4, №4.–P.1-8 181.Zhang Y-Z., Li Y-Y. Inflammatory bowel disease: Pathogenesis// World J Gastroenterol.–2014.–Vol.20, №1.–P.91-99
