ИССЛЕДОВАНИЕ АКТИВАЦИИ ЛИМФОЦИТОВ МЕТОДОМ

ИССЛЕДОВАНИЕ АКТИВАЦИИ ЛИМФОЦИТОВ МЕТОДОМ
КОГЕРЕНТНОЙ ФАЗОВОЙ МИКРОСКОПИИ
*Игнатьев П.С., *Тычинский В.П.,. **Вышенская Т.В., ***Метелин В.Б., ***Василенко И.А.
*МИРЭА, ** МГУ им. М.В.Ломоносова, ***МОНИКИ им. Владимирского
[email protected]
Предложен новый метод исследования активации лимфоцитов, основанный
морфометрических параметров клетки методом когерентной фазовой микроскопии.
показали, что активация лимфоцитов приводит к изменению структуры ядрышка и
снижению рефрактерности клетки. Обсуждается возможность биофизической
полученных результатов.
на измерении
Исследования
значительному
интерпретации
Введение
Исследование структурных особенностей и функциональной полноценности
циркулирующих клеток крови имеет большое значение при решении вопросов
патогенеза, диагностики, оценки тяжести различных патологических состояний и
эффективности проводимой терапии. Поэтому мы предполагаем, что изучение
живых цитообъектов с использованием нового метода когерентной фазовой
микроскопии (КФМ) [1] позволит получить максимально объективные данные и
повысит информативность анализа, что, несомненно, является актуальной и
перспективной задачей.
В проведенных ранее клинических испытаниях методом КФМ было
показано, что статистические распределения Т-лимфоцитов по фазовой толщине и
рефрактерности сильно различаются в зависимости от вида патологического
процесса и пациентов [2,3]. Хорошо известно, что активация ядрышек лимфоцитов
отражает иммунные нарушения в организме [4].
Проведенные в настоящей работе исследования активации лимфоцитов
здоровых доноров методом КФМ позволили выявить изменения фазовых
параметров клеток, связанные непосредственно с их активацией. В будущем эти
результаты позволят повысить качество диагностики морфофункционального
состояния лимфоцитов методом КФМ и позволят оценить количественно и
качественно изменения клеток с учетом их особенностей в различных стадиях
клеточного цикла.
Материалы и методы
Активацию лимфоцитов вызывали добавлением фитогемагглютенина (ФГА)
в концентрации 2 мкг/мл. Суспензию выдерживали в термостате при температуре
37ºС. Для приготовления образцов отбирали пробы по 3-4 мкл и помещали на
полированную кремниевую подложку 25*25 мм. Чтобы избежать деформации
клеток и высыхания образца между кремниевой подложкой и покровным стеклом
помещали спейсер толщиной 15 мкм. Для предотвращения активации лимфоцитов
излучением HeNe лазера [1] измерения образцов проводились не более 30 мин с
контролируемой во времени экспозицией. Измерения проводили на живых
одиночных лимфоцитах при комнатной температуре.
Результаты
Исследования образцов с покоящимися лимфоцитами показали, что на их
топограммах надежно идентифицированы ядро, ядрышко и цитоплазма (см. Рис.1).
65
Рис. 1. Топограмма (a) и фазовый профиль (b) лимфоцита.
В частности, из Рис.1 видно, что ядрышко лимфоцита имеет форму, близкую
к кольцевой с внешним диаметром 2 мкм и внутренним 0.9±0,1. На рис 1b показан
фазовый профиль лимфоцита с максимальной фазовой толщиной 250 нм.
Для оценки морфофункционального состояния лимфоцита использовался
параметр, называемый рефрактерностью [1], равный разнице среднего показателя
преломления клетки и показателя преломления окружающей среды. В сферическом
приближении (считая лимфоцит сферой) рефрактерность можно определить как
отношение фазовой толщины клетки к ее диаметру.
Лимфоциты в норме имели фазовую высоту 300 нм, диаметр 5,5±0,5 мкм и
их гистограмма рефрактерности имела максимумом при 0,06 (См. Рис 2а).
Рис.2. Гистограммы распределения рефрактерности лимфоцитов в норме (а) и
через 24 часа после добавления ФГА (b).
Активация лимфоцитов происходила в несколько стадий и занимала
несколько суток. Измерения лимфоцитов проводились через 1, 2 и 24 часа после их
активации ФГА.
Характерное фазовое изображение (топограмма) и профиль лимфоцита
после 24 ч активации приведены на Рис.3.
66
Рис. 3. Топограмма (а) и фазовый профиль (b), активированного лимфоцита
Активация в течение 1-2 ч. cущественно не изменила фазовую высоту и
рефрактерность (данные не приводятся). Через 24 ч. после начала активации
снижению фазовая высота части клеток снизилась до 100-150 нм, а диаметр
увеличился до 7,0±0,5 мкм; в гистограмме рефрактерности появилась фракция с
значениями меньше 0,04 -0,02 (см Рис 2b).
На топограмме активированного лимфоцита Рис. 3 видно, что ядрышко
увеличивается в диаметре и теряет кольцевую форму. Сравнение с данными
электронной микроскопии [5]
позволяет утверждать, что в центре кольца
находится фибриллярный центр, окруженный плотным фибриллярным и
гранулярным компонентом.
Выводы. Активация лимфоцитов в норме приводит к значительному
снижению фазовой высоты ( до 150-200 нм) и рефрактерности до 0,04-0,02.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (07-04-080473)
1. В.П. Тычинский, Возможен ли диалог с клеткой?, УФН, 2007 ,177(5)
2. Кардашова З.З., Лезвинская Е.М., Метелин В.Б. Современный взгляд на
диагностику и лечение эритродермических вариантов злокачественных лимфом
кожи. Лечащий врач, 2007(9), стр.22-25.
3. Ватазин А.В., Валов А.Л., Василенко И.А., Метелин В.Б. Параметры
иммунокомпетентных клеток как критерий ранней диагностики отторжения
ренального трансплантата. Вопросы современной клинической медицины, Пенза,
ПГУ, 2006, стр.58-59.
4.. Korcakova L., Pekarek J., Rovensky J., Trnavsky K., Lukac J. Lymphocyte
nucleolar activation as a marker of autoimmune disorders. Immunology, 1976m 31, 803805.
5. Kysela K., Philimonenko A., Philimonnenko, Janacek J., Kahic M., Hozak P.
Nuclear distribution of actin and myosin I depends on transcriptional activety of the cell.
Histochem/ Cell Biol. 2005, 124, 347-358.
INVESTIGATION OF LYMPHOCYTE ACTIVATION BY COHERENT
PHASE MICROSCOPY METHOD
*Ignatiev P.S., *Tychinsky V.P., **Vyshenskaya T.V., ***Metelin V.B., ***Vasilenko I.A.
*Moscow state institute for radioengineering electronics and automation, **Moscow state
university, ***Moscow Regional Scientific Research Clinical Institute,
[email protected]
A new method of investigation of lymphocyte activation based on measurement of cell morphometric
parameters by Coherent Phase Microscopy is proposed. The investigations demonstrate that mitogenic
stimulation of human blood lymphocytes causes changes in nucleolus structure and essentially decreasing
its refract
67