Автореферат Нестерова А[1].В.
advertisement
На правах рукописи Нестеров Аркадий Витальевич ОСОБЕННОСТИ РЕГЕНЕРАЦИИ КОСТНОЙ ТКАНИ ЧЕРЕПА ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ НАНОСТРУКТУРИРОВАННЫХ ИМПЛАНТОВ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) 14.05.03 – патологическая анатомия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2010 г. Работа выполнена на кафедре патологии медицинского факультета Национального исследовательского университета Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Белгородский государственный университет" Научный руководитель: Доктор медицинских наук, профессор Павлова Татьяна Васильевна Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор Ягубов Аркадий Сергеевич Доктор медицинских наук, профессор Михайлева Людмила Михайловна ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико- стоматологический университет» Министерства Здравоохранения и Социального развития Российской Федерации Защита диссертации состоится «_______ » ____________________________ 2010 г. в _________ часов на заседании диссертационного совета Д 212. 203. 06 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Российский университет дружбы народов" по адресу:117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу:117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6. Автореферат разослан «_______ » ____________________ 2010 г. Ученый секретарь диссертационного совета Дроздова Галина Александровна доктор медицинских наук, профессор 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность научного исследования Проблемы, приводящие к необходимости пластики черепа сложны и многообразны. Одно из первых мест в этом вопросе занимает травматизм. Частота черепно-мозговой травмы составляет от 1,8 до 5,4 случаев на 1000 человек населения и, по данным ВОЗ, имеет тенденцию к увеличению в среднем 2% в год, соответственно растет и необходимость в хирургических вмешательствах (Шукри А.А., 2006). Необходимость оперативных вмешательств по поводу новообразований головного мозга по-прежнему остается актуальной (Atlas S.W. et al., 1996; Bauman G. et al., 1999). Ежегодно в мире 1 из 5000 человек заболевает опухолью головного мозга (Kleihues P. et al., 2000; Olson J.D. et al. 2000; Struikmans H. et al., 1998). Особое значение в последнее десятилетие приобрели операции по поводу сосудистой патологии. По данным Всемирной федерации неврологических обществ, ежегодно в мире регистрируется не менее 15 млн. инсультов. В России заболеваемость инсультом составляет более 450 000 новых инсультов в год. Современные подходы к лечению инсультов диктуют также необходимость хирургических вмешательств (Верещагин Н.В., 2001; Чехонацкий А.А., 2009). Вопросы транспланталологии, как и поиск имплантов, сложны и многообразны. Среди имплантов особое значение играет применение аутотрансплантов (Goldberg V.M. et.al., 1991, Lin Y. et al 2007). Помимо целостной кости применяются производные костной ткани, лишенной живых клеточных элементов (Bodner L., 1998; Froum S.J. el al., 1998; Hagino Т. el al., 1999; Torricelli P., el al. 1998). Широкое применение нашли аллотрансплантанты. (Никольский В.Ю., 2006, Рыбаков П.А., 2006). На современном этапе развития медицины большое внимание, как в 3 теории, так и в практике, уделяется ксенотрансплантантам. Однако нахождение инородных тел в тканях не может быть безразличным для реципиента, что диктует поиск новых материалов (Gomoll A.H. et al. 2008; Kannan R.Y., 2007; Lee K.W. et al 2008; Raghunath J. et al 2009). При этом к наиболее распространенным материалам с четко выраженной опорной функцией относятся искусственный и натуральный гидроксиапатит (ГА), биокерамика, полигликолевая кислота, а также коллагеновые белки в различных сочетаниях между собой (Cui Y. et al. 2009; Schneider O.D. et al., 2008). Особо перспективным является использование биокомпозитных материалов на основе коллаген-ГАП-декстрановых компонентов, нанесенных на металлическую подложку в связи с выполнением титаном каркасной и протективной функций (El-Ghannam A., 2007; Tanaka K., 2002). Однако имеющиеся материалы нуждаются в дальнейших разработках, а при их получении – в широких экспериментальных исследованиях на стадии доклинических испытаний. Особое поле деятельности представляют собой малоизученные способы реконструкции черепа вследствие оперативных вмешательств и травматических повреждений. При этом одной из важнейших проблем после внедрения трансплантанта является регенерация костной ткани (Графова Г.Я., 2004; Одинцова И.А., 2003, 2004; Хилова Ю.К., 2004). Анализ посттравматического остеогистогенеза, проведенный на различных структурных уровнях, выбор средств и способов, оптимизирующих регенерацию костной ткани, представляется перспективным с позиции общих закономерностей гистогенеза. Цель работы: изучение способов улучшения регенерации костной ткани черепа на экспериментальной модели при применении различных видов наноимплантов. Задачи исследования: 1. Провести сравнительную характеристику регенерации при использовании различных видов имплантов с целью выбора 4 оптимальных нанобиокомпозитов. 2. Изучить комплекса влияние на коллаген-гидроксиаппатитно-декстранового морфогенез регенерации плоских костей при применении нанокомпозиционных имплантов. 3. Определить динамику макро- и микроэлементного состава в матриксной кости и вновь образованной ткани с использованием аппаратных комплексов сканирующей и атомно-силовой микроскопий. 4. Выявить морфофункциональные особенности вновь образованной костной ткани при использовании биокомпозитов. Научная новизна исследования На различных структурных уровнях изучен морфогенез регенерации костной ткани черепа при применении композита из нанотитана Grey с пескоструйной обработкой без покрытия, с одним слоем покрытия (композиционный препарат, в высокомолекулярный декстран), с состав которого входил желатин и двумя слоями покрытия (1-желатин, декстран, 2- гидроксиапатит, коллаген, декстран). В динамике проведено сопоставление макро- и микроэлементного состава с морфологической картиной репаративных процессов. Практическая значимость Полученные экспериментальные данные могут быть в дальнейшем использованы в следующих отраслях практического здравоохранения: нейрохирургии, травматологии-ортопедии, стоматологии, пластической и эстетической хирургии. Положения, выносимые на защиту 1. Выраженность регенераторных процессов находилась в прямой зависимости от вида импланта. Так, толщина вновь образованной ткани при сроке экспозиции 9 недель в ½ радиуса от центра импланта составляла в группе ложнооперированных – 450,09±28,7 µm и носила неравномерный характер с наличием дефекта заполнения; в группе с наноимплантом без 5 покрытия - 497,08±29,51 µm; в группе с наноимплантом с одним слоем покрытия – 687,0±20,03 µm и группе с наноимплантом, покрытым двумя слоями, – 905,0±9,62 µm. В группах с нанотитаном отмечалась большая равномерность вновь образованной ткани, дефект заполнения отсутствовал. В контрольной группе к 9 неделям выявлено постепенное заполнение дефекта сначала грубоволокнистой, а затем и молодой костной тканью от периферии к центру. 2. По мере выраженности регенерации костной ткани при экспозиции 12 недель прогрессирует содержание отдельных макро- и микроэлементов во вновь образованной ткани над имплантом, особенно в группе с нанобиокомпозитом с двумя слоями покрытия и составляет: кальция: 2-я группа - 20,99±0,05, 3-я группа - 526,19±1,32, 4-я группа - 966,46±2,42; фосфора: 10,79±0,03 (2), 328,69±0,82 (3), 603,00±1,50 (4); натрия - 1,17±0,01 (2), 4,13±0,01 (3), 7,52±0,02 (4); магния - 7,04±0,02 (2), 15,08±0,04 (3), 24,81±0,06 (4). 3. На сроках экспозиции 14 недель вновь образованная костная ткань над и под имплантом покрыта надкостницей, морфологически вновь образованная костная ткань имеет идентичную с матриксной костью структуру. Апробация работы Результаты сделанные на диссертационного конференциях: исследования "Актуальные вошли вопросы в доклады, патологической анатомии" // Материалы III съезда Российского общества патологоанатомов (Самара, 2009), Сборник тезисов Всероссийской школы-семинара для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы» (Белгород, 2008), Сборник тезисов Всероссийской школысеминара для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы» (Белгород, 2009), а также на расширенном заседании кафедры патологии (Белгород, 2010). По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 1 в зарубежной печати, 6 4 публикации представлены в изданиях, включенных в утвержденный «Перечень периодических изданий», рекомендованных ВАК РФ. Объем и структура диссертации Материал диссертации представлен на 155 страницах. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа содержит 60 рисунков и 11 таблиц. Список литературы включает 418 отечественных и 268 иностранных авторов. Материалы и методы исследования Эксперимент выполняли на 130 крысах-самцах линии "Вистар" массой 200-250 грамм из питомника РАМН «Столбовая» Московской области. Все процедуры содержания животных, проведения манипуляций и тестирования полученных данных проводились в соответствии со стандартами ISO 109931-2003 и ГОСТ Р ИСО 10993.2-2006. Для последующего эксперимента животные были разделены на 4 группы: Ложнооперированные животные (контрольная группа) – 25 1. особей. Животные, которым был имлантирован композит из нанотитана 2. Grey с пескоструйной обработкой без покрытия) – 35 особей. Животные, которым имплантирован композит из нанотитана 3. с Grey пескоструйной (композиционный препарат, обработкой в состав с одним которого слоем входил покрытия желатин и высокомолекулярный декстран) – 35 особей. 4. Животные, которым имплантирован биокомпозит из нанотитана Grey с пескоструйной обработкой с двумя слоями покрытия (1-желатин, декстран, 2- гидроксиапатит, коллаген, декстран) – 35 особей. Для изучения регенераторно-репаративных процессов в ране использовались импланты из наноструктурированного титана в форме дисков диаметром 5,1±0,11 мм, толщиной 0,7±0,11 мм, изготовленные в Уфимском 7 государственном авиационном техническом университете. Поверхность дисков была подвергнута пескоструйной обработке. На стерильные титановые диски наносили первый слой покрытия, который состоял из 10% медицинского желатина и 10% высокомолекулярного декстрана, растворенных в 50мМ фосфатном буфере. После этого диски высушивали в стерильных условиях, обрабатывали 0,2% раствором глутарового альдегида и снова высушивали. Затем наносили 2-й слой покрытия, состоящий из 10% гидроксиапатита и 0,25% коллагена. В контрольной группе (ложнооперированные) животные оперировались без введения импланта. Для вводного наркоза использовался диэтиловый эфир. Производилась трефинация черепа инструментарием из набора для оказания нейрохирургической помощи новорожденным. Место выполнения трефинации – середина теменных костей. Для нанесения первичного отверстия использовалась копьевидная фреза с последующим увеличением диаметра до необходимого корончатой фрезой. Гемостаз выполнялся тампонадой стерильными салфетками, смоченными 3% раствором перекиси водорода. В условиях «сухой» раны в костный дефект укладывался имплант без жесткой фиксации. Рана ушивалась наглухо узловыми шелковыми швами через все слои мягких покровов головы и надкостницу. Для изучения регенераторных особенностей костной ткани черепа животных при введении нанокомпозитов и бионанокомпозитов испытуемых выводили из опыта посредством декапитации в условиях передозировки эфирного наркоза, в вечернее время, через следующие промежутки времени: • 1 неделя – 20 животных (по 5 из каждой группы) • 2 недели – 20 животных (по 5 из каждой группы); • 4недели – 20 животных (по 5 из каждой группы); • 6 недель – 20 животных (по 5 из каждой группы); • 9 недель – 20 животных (по 5 из каждой группы); • 12 недель – 15 животных (по 5 из каждой группы); • 14 недель – 15 животных (по 5 из каждой группы). 8 При аутопсии было проведено макроскопическое описание с использованием бинокулярной лупы и фотографирование. Для исследования методом световой микроскопии препараты фиксировались в растворе 10 % забуференного формалина с последующим приготовлением парафиновых блоков. С каждого блока делались серийные срезы толщиной 5 мкм на ротационном микротоме Leica RM2135. Срезы окрашивались гематоксолином и эозином и подвергались исследованию в световом микроскопе «Topic-T» Ceti при помощи цветной одноматричной видеокамеры «Baumer1»; проведен морфометрический анализ; использована программа обработки изображения «Видео-Тест Размер». Для растровой электронной микроскопии изучаемые пробы опускали в 37° фиксирующую смесь: 2% глутаральдегид на 0,15 М фосфатном буфере с рН 7,2-7,4. Затем просматривали в растровом микроскопе FE1 Quanta 200 3D, а также FE1 Quanta 600 FEG. Элементный анализ был сделан с использованием детектора для регистрации спектров характеристического рентгеновского излучения фирмы EPAX, детекторы интегрированы с растровым электронным микроскопом Quanta 600 FEG. Микроэлементный анализ основан на возникновении непрерывного флюоресцентного излучения при бомбардировке исследуемых образцов пучком первичных рентгеновских лучей. Проводилось изучение следующих макро- и микроэлементов: углерода, кислорода, фосфора, кальция, азота, натрия, магния, железа, алюминия и серы. Для изучения образцов при помощи зондовой микроскопии, после предварительного просмотра срезов в световой микроскоп, выбирались необходимые парафиновые блоки. После целевого просмотра проводилась съемка и морфометрический анализ. Зондовая сканирующая микроскопия проведена на сканирующем зондовом микроскопе в режимах постоянного или прерывистого контактов на приборе «Ntegra-Aura» (Компания НТ-МДТ, г. Зеленоград, Россия) с использованием коммерческих Si или SiN кантилеверов (NSG01, NT-MDT, Россия) в условиях атмосферы и низкого 9 вакуума. Обработку и построение АСМ-изображений проводили при помощи программного обеспечения «NOVA» (НТ-МДТ, Россия) и «ImageAnalysis» (НТ-МДТ, Россия). Для изучения регенераторных особенностей костной ткани выбраны флюоресцентный краситель – родамин. Обработка препаратов производилась на микроскопе "Микмед-6", вариант 11. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Было показано, что у ложнооперированных животных ширина демаркационной зоны составила: 1,3±0,4, (1 неделя), 1,5±0,23 (2), 1,0±0,11 (4) мм. Диаметр послеоперационного дефекта: 5,1±0,3, 5,3±0,15, 3,7±0,1, 2,5±0,05, 2,3±0,3, 2,0±0,3. Через неделю после операции определялись незначительные в зоне операции костной ткани некротизированные участки. Выявлены скопления как лимфоидных клеток, так и эритроцитов. Определялись нити фибрина. Гаверсовы каналы в костной ткани полнокровны. Начинала формироваться грануляционная ткань. К четырем неделям содержание лимфоидных элементов уменьшалось. Наблюдались лишь очаговые скопления эритроцитов при отсутствии некротизированных участков. Продолжала формироваться грануляционная ткань. Наряду с нею формировался каркас из эластичных и коллагеновых волокон, который постепенно заполнял костный дефект. Через 9 недель была выявлена крайне неоднородная ткань, основу которой составляла грубоволокнистая, с хорошо сформированными волокнами коллагена, с начавшими формироваться кровеносными сосудами. Такая ткань больше была выражена на участках со здоровой тканью, где фрагментарно наблюдалась юная, плохо сформировавшаяся костная ткань, не содержащая сосудов. Помимо грубоволокнистой соединительной ткани в отдельных участках еще сохранились фрагменты аргирофильных волокон. В центральной части вновь формирующейся 10 мезенхимальной ткани наблюдались островки остеогенеза. При использовании следующие особенности. люминесцентной Так, наиболее микроскопии интенсивное выявлены окрашивание наблюдалось по краю кости в месте оперативного вмешательства. Помимо этого, положительная реакция была выявлена в участке вновь образованной мезенхимальной ткани в непосредственной близости от матриксовой кости. Кроме того, такая же реакция была выражена в начинающих формироваться волокнах в зоне дефекта костной ткани, что свидетельствовало о повышенной концентрации ионов кальция. При электронно-микроскопическом исследовании нами была выявлена следующая картина. Так, к первой неделе после операции в непосредственной близости от костной ткани наблюдались скопления эритроцитов и отдельных клеток лимфоидного ряда. Выявлены отдельные, хотя и незначительные, фрагменты ткани с явлениями деструкции. Хорошо просматривались фибробласты и начинающие формироваться вокруг них коллагеновые волокна. Через месяц после операции картина значительно менялась. Так, края дефекта стали сглаженными. Вокруг был сформирован плотный слой фиброзной ткани с хорошо просматривающимися фибробластами и фиброцитами. Этот слой был неодинаковым по ширине и высоте. В Гаверсовых каналах, прилежащих к костной ткани, по-прежнему выявлялось полнокровие. При изучении формирующейся костной ткани к 9 неделям выявлено заполнение дефекта сначала грубоволокнистой, а затем и молодой костной тканью от периферии к центру. Постепенно здесь начинали формироваться кровеносные сосуды. При изучении формирующейся костной ткани, прилежащей к твердой мозговой оболочке, видно, что ткань лучше структурирована, чем в других участках, с хорошо сформировавшимися сосудами, содержит преимущественно грубоволокнистые волокна и участки юной костной ткани. 11 При изучении регенерации костной ткани в опытных группах с различными видами наноимплантов (1-2 недели экспозиции) показано, что ширина ободка демаркационной зоны воспаления составляла через неделю 1,4±0,4 (1-я группа), 1,6±0,35 (2), 1,8±0,33 (3), а через 2 недели – 1,8±0,29 (мм), 2,1±0,25, 2,2±0,22 мм соответственно. Демаркационная зона воспаления на следующих сроках экспозиции не наблюдалась. Причем полнокровие и отек больше были выражены в группах с внедрением импланта без покрытия. К четвертой неделе гиперемия и отек были выражены в меньшей степени, чем при недельной экспозиции. На следующих сроках экспозиции воспалительная реакция не отмечалась. В матриксной кости было отмечено, что Гаверсовы каналы остеонов расширены вследствие остеокластической резорбции, содержали большое количество клеточных элементов и заполненных кровью сосудов. Выявлялись остатки гематомы с волокнами фибрина, которые были подвержены организации за счет прорастания в них фибробластических элементов. Через 6 недель экспозиции матриксная кость не изменена. Гаверсовы каналы умеренно полнокровны вплоть до сроков 12 недель. Происходит дальнейшее разрастание хрящевой ткани и сосудов. Связь между композитом и имплантом во всех группах была уже более прочной, но все же лучше проявлялась в группах с покрытием, особенно с двумя слоями, чем без него. При 7 дневной экспозиции у всех животных просвет между костной тканью и композитом заполнялся соединительной тканью. Следует отметить, что в группе № 2 эта связь была более рыхлой и наиболее полноценно она была выполнена в группе № 4. Граница между волокнистым и клеточным слоями не определялась. Между композитом и материнской костью было выражено полнокровие, особенно четко определяемое во 2-й группе. Наблюдались фрагменты с диапедезными кровоизлияниями. Здесь же в большей степени, чем в 3-й и 4-й группах, были выявлены клетки лимфоидного ряда. Ткань была преимущественно 12 рыхловолокнистая соединительная. Вновь образованная ткань более равномерно нарастала на имплант в группе № 4 (рис. 1). Через 2 недели между тканью и композитом просматривалась хорошо сформированная соединительная ткань, богатая полнокровными сосудами, что особенно ярко было выражено в группе № 4. Связь между композитом и имплантом во всех группах была уже более прочной, но все же лучше проявлялась в группах с покрытием, особенно с двумя слоями, чем без него. К 30 суткам между матриксной костью и имплантом формируется сложный симбиоз из нескольких видов тканей: это фиброзная ткань, которая как бы является основой для располагающейся среди нее островков хрящевой ткани, которая более выражена в группах 3 и 4, а также жировая ткань. Здесь определяются уже и вновь образованные сосуды. Между композитом и матриксной костью было выражено определяемое во 2-й группе. полнокровие, особенно четко Наблюдались фрагменты с диапедезными кровоизлияниями. Через 9-12 недель между имплантом и матриксной костью наблюдается формирование костной ткани с развитием Гаверсовых каналов, которые на этой стадии меньшего размера и полнокровны. Остеобласты располагаются в полостях и хорошо выражены. Через неделю покрытия импланта вновь образованной тканью импланта в группе № 2 не наблюдалось. Во 3 группе составляло 1,0±0,2х0,4±0,1 мм, в 4 - 2,0±0,3х0,4±0,08. Через 2 недели эти показатели составляли: 0,8±0,2х0,2±0,05, 1,5±0,2х0,6±0,03 и 2,4±0,3х0,8±0,01 мм соответственно. К 4 неделям покрытие составляло во 2 группе – 1,4±0,23х3,5±0,11, 3 - 1,8±0,2х3,8±0,1, 4 - 2,2±0,16х4,5±0,08. При экспозиции 6 недель покрытие импланта было следующим: 2 группа - 1,8±0,21х3,8±0,1, 3 - 2,1±0,25х4,2±0,08, 4 - 2,6±0,3х4,5±0,05. На сроках экспозиции свыше 9 недель имплант полностью покрыт вновь образованной тканью по всей поверхности. 13 Рис. 1. Фрагмент костной ткани черепа крысы (теменная область) с композитом из нанотитана Grey с пескоструйной обработкой с двумя слоями покрытия: 1- желатин, декстран, 2- гидроксиапатит, коллаген, декстран без покрытия. 7 дней экспозиции. Биокомпозит окружен ровным слоем рыхлой соединительной ткани (указано стрелкой), шириной 45,0±5,0 µм, равномерной по толщине 11,0±0,5 µм, с начинающейся формироваться мезенхимальной тканью над имплантом. Атомносиловая сканирующая лаборатория. При изучении ткани над имплантом с помощью атомносиловой микроскопии было показано, что при использовании биокомпозитов формировалась ровная зона мезенхимальной ткани, заполняющей дефект между костной тканью и композитом и равномерно прикрывающей последний, формирующая своеобразный купол над ним толщиной до 11,0±0,5 µм. При использовании же композитов без покрытия слой вновь образованной ткани был неравномерным, 5,0±1,5 µм, и наблюдались лишь отдельные фрагменты формирования ткани над имплантом. 14 Ободок соединительной ткани по периферии импланта составил через неделю 160,0 ±35,0, 170,0 ±24,0, 180,0 ±16,0 µm; а через 2 недели -180,0 ±30,0, 190,0 ±20,0 и 200,0 ±10,0. Размер вновь образованной ткани: 56±20,0, 70,0±10,0, 80,0±7,0, а через 2 недели -90±15,0, 95,0±7,0, 100,0±5,0. При изучении регенерирущей костной ткани с помощью атомносиловой микроскопии было показано, что к 30 дням вновь сформированная фиброзная и хрящевая ткань начинала распределяться более равномерным слоем. Перепад рельефа в 4 группе определялся до 1,5±1,5 µm, а во 2 – 6,0±2,2 µm, в 3 группе – 3,2±2,0 µm. Наиболее равномерно она заполняла дефект все же в 4-й группе. К 30 дням фиброзная ткань в группах №№ 3,4 в виде ободка наблюдалась на импланте. Постепенно (быстрее в группе № 4) в ней обнаруживались неравномерной величины поля хрящевой ткани, которые переходят в сеть костных трабекул. Пролиферация хондробластов продолжается до 30 суток. Остеобласты располагались как поодиночке, так и попарно. К 30 суткам после операции хрящ достигал определенной степени зрелости, в нем происходили процессы дегенерации, образовывались полости разрушения, то есть наблюдался типичный процесс эндохондрального окостенения. Врастая в хрящевую ткань, комплекс сосудистой почки разрушал ее, периваскулярные клетки дифференцировались в остеобласты и откладывали костное вещество на стенках полостей резорбции. К 6 неделям начинала формироваться зрелая костная ткань в виде островков. В этой костной ткани балки расположены хаотично, и они вытесняли хрящевую ткань. Наиболее четко этот процесс прослеживался к 6 неделям экспозиции, особенно при наличии биокомпозитов. Вновь образованная ткань снаружи начинала покрываться надкостницей, которая была хорошо контурирована и утолщена. Остеобласты клеточного слоя лежали преимущественно однорядно, последовательно, без больших промежутков между клетками. Компактное вещество костной ткани матриксовой кости имело обычное строение. 15 Слои костной ткани, образовавшиеся на этом этапе экспозиции, имели свои канальцы, соединенные с лежащими ниже слоями. Их толщина составляла: 56±19,71; 70,0±8,83; 80,0±6,45. Следует отметить, что при внедрении импланта без покрытия, вновь образованная ткань плохо взаимодействовала с имплантом, тогда как при наличии покрытия, особенно с двумя слоями, наблюдалось более прочное их сращение. Фиброзная ткань покрывала имплант. По периферии импланта определялись фиброзный и остеогенный слои надкостницы. Вновь образованная ткань развивалась с двух сторон импланта. Со стороны твердой мозговой оболочки ее слой имел более неровную поверхность. Поверхность над имплантом к 9 неделям была заполнена тканью. Граница между старой и новообразованной костной костью визуализировалась только под микроскопом. Выявлена компактная кость с грубоволокнистыми костными трабекулами, фрагменты пластинчатой кости. Отмечено формирование зрелой пластинчатой из губчатой кости. Наблюдалась инвазия сосудов в область импланта с формированием сосудистой сети, наличием эритроцитов. Фиброзная ткань не выражена. Наблюдался плотный ободок соединительной ткани по периферии импланта во всех опытных группах. Выявлены новообразованные остеоны. Расстояние между центром импланта и вновь образованной тканью через 9 недель составляло 450,09±28,7, 380,12±20,08, 300,02±9,98 µm. Через 12 недель оно соответственно уменьшалось, особенно в группе 4, и составляло 187,69±28,24, 150,08±19,87, 98,84±8,9 µm. При экспозиции 9 недель при ультрамикроскопическом изучении определено соединение имплантата с костью. Толщина вновь образованной ткани над центом композита составляла при 9 недельной экспозиции 497,08±29,51, 687,0±20,03, 905,0±9,62 µm; а при 12 недельной - 1167,0±29,1, 1284,0±19,92, 1396,0±8,34, прогрессировала к дальнейшим срокам (рис. 2). При экспозиции 9 недель при ультрамикроскопическом изучении 16 определено соединение имплантата с костью. Наблюдалось формирование Гаверсовых каналов. Был выявлен активный остеогенез, наличие остеогенных клеток – остеобластов. Намечена сосудистая сеть. Выявлены процессы реваскуляризациии в виде отдельных эндотелиоцитов в сети коллагеновых волокон. Центры кальцификации новообразованных костных трабекул в эндостальной части появлялись через 7 суток с момента операции и особенно были развиты к 14 суткам, что подтверждалось с помощью микрои макроэлементного анализа и люминесцентной микроскопии. Так, с помощью люминесцентной микроскопии было показано, что окраска родаминовым красным, хорошо отображающая клетки с высокой метаболической активностью, наиболее выражена в зоне по периферии костной ткани и во вновь образованной волокнистой ткани, что особенно четко проявлялось в следующей последовательности групп: 2, 3, 4, а также увеличивалось по мере роста экспозиции регенерации. При экспозиции 9-12 недель было выявлено наиболее активное свечение во вновь образованной ткани над имплантом, а также на границе с матриксной и регенерирующей костной тканью. Наиболее хорошо это выражено в группе с биокомпозитами. 17 Рис. 2. Фрагмент костной ткани черепа крысы (теменная область) с композитом из нанотитана Grey с пескоструйной обработкой с двумя слоями покрытия: 1- желатин, декстран, 2- гидроксиапатит, коллаген, декстран. Экспозиция 14 недель. Вновь образованная ткань покрыта надкостницей (указано стрелкой). Равномерна по толщине. По периферии сливается с матриксной костью. РЭМ. Ув. х 200 При изучении микроэлементного состав было показано, что к 14 дням прогрессивно увеличивается содержание натрия в группах 3 (1,01±0,01), а, особенно, 4 (2,33±0,01). Содержание магния также максимально в 4-й группе (9,69±0,02). Помимо этого, здесь отмечено максимальное количество фосфора (36,97±0,09), кальция (30,35±0,08). На сроке экспозиции 6 недель кальцификация по-прежнему наблюдалась преимущественно в 3-й группе 18 (470,63±1,18), при 123,95±0,31 в 1-й и 114,5±0,29 – во 2. Увеличение содержания натрия во 2 (1,65±0,01) и 3 (3,49±0,01) группах (рис. 3 А). Появляется железо (4,07±0,01) (3,46±0,01) (3,04±0,01). Содержание фосфора в 3 группе также максимально и составляло 266,16±0,67. Содержание натрия прогрессивно возрастало, особенно при покрытии биокомпозитом: 12 недель 7,52±0,02. То же самое можно сказать о магнии: 24,81±0,06. Но особо следует отметить увеличение количества кальция: 966,46±2,42 (рис. 3 Б). Рис. 3 А. Динамика микроэлементного состава (магний, железо, натрий). Группа № 2 - нанотитан Grey с пескоструйной обработкой без покрытия). Группа № 3 - нанотитан Grey с пескоструйной обработкой с одним слоем покрытия (композиционный препарат, в состав которого входил желатин и высокомолекулярный декстран). Группа № 4 - нанотитан Grey с пескоструйной обработкой с двумя слоями покрытия (1-желатин, декстран, 2- гидроксиапатит, коллаген, декстран). 19 Рис. 3 Б. Динамика макроэлементного состава (фосфор¸ кальций). Группа № 2 - нанотитан Grey с пескоструйной обработкой без покрытия). Группа № 3 - нанотитан Grey с пескоструйной обработкой с одним слоем покрытия (композиционный препарат, в состав которого входил желатин и высокомолекулярный декстран). Группа № 4 - нанотитан Grey с пескоструйной обработкой с двумя слоями покрытия (1-желатин, декстран, 2- гидроксиапатит, коллаген, декстран). Таким образом, можно отметить, что регенерация плоских костей черепа осуществлялась в полном объеме лишь при наличии подложки из наноимпланта (группы №№ 2, 3, 4), но наиболее показательно в группе с нанокомпозитом. В контрольной группе (ложнооперированные животные) полное восстановление целостности костей свода черепа не происходило. 20 ВЫВОДЫ 1. При выполнении сравнительной характеристике в опытных группах установлено, что используемые нанобиокомпозиты в группе № 4 (нанотитан Grey с двумя слоями покрытия: 1 – желатин, декстран, 2 – гидроксиапатит, коллаген, декстран) значительно ускоряли процессы регенерации костной ткани черепа. 2. Наличие покрытия из коллаген-гидроксиаппатитно-декстранового соединения увеличивает скорость процессов регенерации за счет создания депо ионов кальция, фосфора и выполняет опорную функцию для вновь образованной ткани за счет коллаген-декстранового компонента. 3. Использование нанотитана в бионанокомпозитах позволяет снизить вероятность травматизации головного мозга до окончания этапа формирования аутокости. 4. Продолжительность фазы энхондрального окостенения уменьшается от группы с использованием нанотитана к группе с использованием нанобиокомпозитов. 5. Увеличение концентрации кальция, фосфора, натрия, магния во вновь образованной ткани на сроке 12 недель по сравнению с матриксовой костью свидетельствует об активных регенераторных процессах в зоне регенерации. 6. При использовании нанобиокомпозитов на сроке экспозиции 12 недель отмечается равномерность рельефа (верифицировано с помощью атомносиловой микроскопии) вновь образованной ткани, по сравнению с использованием нанотитана без покрытия и нанотитана с покрытием из желатина и высокомолекулярного декстрана. Практические рекомендации Полученные результаты, характеризующие эффективность нанобиоимплантов, могут быть рекомендованы для использования в практическом здравоохранении (нейрохирургия, травматология-ортопедия, 21 стоматология). Выявленные особенности морфогенеза костной ткани при применении различных видов имплантов, могут быть рекомендованы к изучению ряда доклинических и клинических дисциплин. В настоящее время данные исследования используются во время проведения практических занятий по предмету "Патологическая анатомия" у студентов медицинского факультета БелГУ. Разработанные модели дефектов костей свода черепа могут быть использованы при изучении процессов посттравматической регенерации, влияния на этот процесс различных материалов для пластики дефектов черепа. Список работ опубликованных по теме диссертации 1. Павлова Л.А., Марковская В.А., Павлов И.А., Мезенцев Ю.А., Нестеров А.В., Линьков Н.А. / Инновационные методы активации регенерации костной ткани при применении имплантов из титановых сплавов с покрытием из наногидроксиаппатита. // Сборник тезисов Всероссийской школы-семинара для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы».-Белгород.-2008.-С. 127-128. 2. Павлова Т.В., Павлова Л.А., Нестеров А.В., Мезенцев Ю.А., Павлов И.А., Линьков Н.А. / Применение биокомпозиционных материалов с нанопокрытием в нейротрансплантологии. // Актуальные вопросы патологической анатомии.- Т. №2.- Самара.- 2009.- С. 390-391. 3. Павлова Т.В., Мезенцев Ю.А., Павлова Л.А., Нестеров А.В., Колесников Д.А./Особенности регенерации костной ткани при введении коллагеново-гидроксиаппатиных нанокомпозитов.// Фундаментальные исследования №8.- 2009.- С 25-28. 4. Павлова Л.А., Нестеров А.В., Павлов И.А./Экспериментальное исследование наноструктурированного титана Grey при различных режимах обработки с различными видами покрытия, с внесением 22 дополнительных факторов роста BMP-2 в 7-дневной экспозиции.// Сборник тезисов Всероссийской школы-семинара для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы».- Белгород.- 2009.- С. 38-41 5. Павлова Л.А., Нестеров А.В., Бокова Е.Н., Немыкин О.Н., Павлова Т.В./Анализ структуры тяжелой черепно-мозговой травмы, тактики оперативного вмешательства и вариантов выполнения краниопластики.//Фундаментальные исследования №10.- 2009.- С. 25-27. 6. Павлова Л.А., Кривецкий В.В., Нестеров А.В., Колесников Д.А., Гончаров И.Ю., Павлова Т.В./Перспективы и риски создания и применения наноматериалов в нейрохирургии.// Актуальные вопросы фармакологии и фармации: сборник трудов межвузовской научной конференции, посвященной памяти профессора В.В. Пичугина и 75летию КГМУ. – Курск: ГОУ ВПО КГМУ Росздрава.- 2009.- С. 281-283. 7. Павлова Л.А., Кривецкий Т.В./Характеристика биокомпозитов, В.В., Нестеров репаративных содержащих процессов BMP-2 на А.В., при основе Павлова применении имплантов из наноструктурированного титана на ранних стадиях регенерации.// Системный анализ и управление в биомедицинских системах.-Т. 9.-№1.2010.- С. 200-203. 8. Павлова Л.А., Павлова Т.В., Нестеров А.В., Колесников Д.А., Гончаров И.Ю., Жерновой М.Г./Морфологический анализ костного дефекта при использовании импланта титана, обработанного пескоструйным методом с различными композитными покрытиями в динамике первого месяца регенерации.// Научные ведомости БелГУ № 4 (75).-2010.Выпуск 9.- С.58-63. 9. Павлова Л.А., Павлова Т.В., Нестеров А.В./Современные представления об остеоиндуктивных механизмах регенерации костной ткани. Обзор состояния проблемы.// Научные ведомости БелГУ № 10 (81).-2010.Выпуск 10.- С.5-11. 23 10. Павлова Т.В., Нестеров А.В., Павлова Л.А., Жерновой М.Г. /Черепномозговая травма у пациентов пожилого возраста и способы ее коррекции (клинико-экспериментальное исследование).// Научные ведомости БелГУ № 22 (93).-2010.- Выпуск 12/1.- С.78-82. 11. Павлова Т.В., Нестеров А.В., Павлова Л.А., Жерновой М.Г. /Особенности черепно-мозговой травмы у пациентов пожилого возраста и способы ее коррекции (клинико-экспериментальное исследование).// Геронтологический журнал им. В.Ф. Купревича № 2.-2010.- С.51-52. 12. Pavlova T.V., Pavlova L.A., Bokova E.N., Pavlov I.A., Nemikin O.N., Nesterov A.V./Craniocereberal trauma: structure, tactics of operative intervention (clinical and experimental research)// European Journal Of Natural History.- №4.- 2010.-P 4-7. Резюме Особенности регенерации костной ткани черепа при использовании наноструктурированных имплантов (экспериментальное исследование) Нестеров А. В. В работе проведен анализ особенностей регенерации костной ткани по результатам эксперимента на 130 крысах-самцах линии "Вистар". Для изучения регенераторно-репаративных процессов в ране использовались импланты из наноструктурированного титана с различными видами покрытия. В оперировались контрольной без использовались микроэлементный группе введения оптическая, анализ. (ложнооперированные) импланта. электронная, Установлено Для оценки животные результатов зондовая микроскопии, что использование нанобиокомпозитов в группе № 4 (нанотитан Grey с двумя слоями покрытия: 1 – желатин, декстран, 2 – гидроксиапатит, коллаген, декстран), значительно ускоряло процессы регенерации костной ткани черепа в отличии от использования нанотитана без покрытия. 24 Summary Features of the skull bone regeneration using nanostructured implants (experimental study) Nesterov A.V. The paper analyzes the features of bone tissue regeneration based on the results of the experiment on 130 male rats line "Vistar". To study the regenerative-reparative processes in the wound used in nano-structured titanium implants with different kinds of coverage. In the control group animals were operated without the introduction of the implant. To assess the results by using the optical, electronic, probe microscopy, trace analysis. It was established that the use of nanobiocomposites in group number 4 (nanotitan Grey with two coats: 1 - gelatin, dextran, 2 - hydroxyapatite, collagen, dextran), which greatly accelerates bone regeneration of the skull in contrast to the use nanotitan uncoated. 25
