2∆I

in vitro модели
для оценки проницаемости
гематоэнцефалического барьера
2012 г.
Методы оценки проницаемости ГЭБ:
 in vivo - опыты на живых организмах,
 in vitro - эксперименты вне организма, в т.ч. на
клеточных культурах,
 in silico - моделирование процесса на компьютере.
2
Идеальная модель ГЭБ:
-плотные контакты между соседними клетками эндотелия,
-незначительная межклеточная диффузия между клетками эндотелия,
+
+
-
-селективная и асимметричная проницаемость физиологически важными ионами (Na , K , Cl ),
-функциональное выражение механизмов транспорта (гексоз, аминокислот и др. ),
-экспрессия ферментов метаболизма лекарств,
-отражение факторов, влияющих на рост и дифференцировку клеток эндотелия,
-реагирование на модуляторы и на стимулы, влияющие на целостность и функции ГЭБ,
-возможность воспроизводить эффекты физиологических и патофизиологических стимулов
(гипертоническая болезнь, воспаление и т.д.), которые влияют на ГЭБ в естественных
условиях,
-удобная, масштабируемая и экономически эффективная.
3
Классификация методов
используемая модель ГЭБ:
метод получения результатов:
капилляры
головного мозга
конфокальная микроскопия
эпителиальные
клетки
измерение концентрации вещества
по обе стороны от барьера
мембраны
жидкостная хроматография
4
Капилляры мозгового вещества
Выделение
капилляров
Флуоресцентная
метка
Конфокальная
микроскопия
«+» Основное преимущество обеспечение структурных и
клеточных характеристик и свойств
Позволяет оценить:
•активный транспорт,
•переносчики,
•локализация в капилляре,
•влияние других веществ
на проницаемость
Интенсивность
флуоресценции
Xenobiotic efflux pumps in isolated fish brain capillaries.
David S. Miller and . 282:R191-R198, 2002 Am J Physiol
Regul Integr Comp Physiol
«—» трудоемкая изоляция,
ограниченная жизнеспособность сосудистого эндотелия.
5
Эндотелиальные клетки сосудов мозга
Transwell
Донорный отсек
Микропористая
мембрана
Акцепторный отсек
«+»
• относительно недорогой,
•довольно
высокая
пропускная
способность;
•искусственная среда позволяет
изучать ГЭБ без дополнительных
переменных;
•можно изучать ответ конкретной
ткани / органа.
«—»
в ходе дифференцировки клетки
могут изменяться, как и их
свойства.
6
Культуры клеток
Монокультуры, выращенные из капиляров
крыс, мышей, крупного рогатого скота,
свиней, приматов или человеческого мозга.
(Macaca Irus)
+ перициты + астроциты.
(Wistar rat)
Caco-2 - эпителиальные раковые клетки
толстой кишки человека.
Контроль качества монослоев (~ целостность монослоя):
o трансэндотелиальное электрическое сопротивление (TEER), Ом/см2,
o проницаемость для гидрофильных маркеров (14С-сахароза).
7
PAMPA
(parallel artificial membrane permeability assay)
Пассивная диффузия
Позволяет оценить:
Донор
пассивный транспорт,
влияние примесей на проницаемость
«+»
Наименее дорогой метод
Акцептор
«—»
Не учитывает активный транспорт
и метаболические превращения
8
IAM хроматография
(immobilized artificial membrane)
Применение:
 очистка биологических веществ,
монослой
карбоксильных
фосфолипидов
IAM.PC.DD2 колонка
Regis Technologies, Inc.
 нековалентная иммобилизация,
 разделение мембранных белков,
 оценка проницаемости мембран малыми
препаратами и измерение их липофильности.
Инертный
носитель
Ограничения метода:
• поверхность IAM имеет ограниченную способность к латеральной диффузии,
которая происходит на клеточном уровне в естественных условиях,
• монослой — может не отражать диффузию через физиологический бислой
мембраны,
• IAM-поверхности не могут имитировать активный транспорт или метаболизм
препарата, который обычно происходит в ГЭБ.
9
Расчет коэффициента проницаемости P
Кажущаяся проницаемость (см/с) (PAMPA,
http://www.cyprotex.com/admepk/in-vitropermeability/pampa/):
P=Vd*Va/[(Vd+Va)*S*t] –ln(1-Cd/Ce),
Кажущаяся проницаемость (см/с)
(эндотелиальные клетки,
http://www.pharmacocell.co.jp/en/products/bb
btest_e.html):
где Vd и Va – объемы донорного и
акцепторного отсека, см3,
S – поверхность мембраны, см2,
t – время инкубации, мин,
Cd– концентрация вещества в донорном
отсеке, мг/мл,
Ce – равновесная концентрация вещества в
суммарном объеме отсеков, мг/мл.
P = Va* ∆Сa/(S*Cd*∆t),
Проницаемость по флуоресцеину натрия
(D.Montermini et al. 2002), мкм/с:
Проницаемость по IAM (http://www.registech.com/
InfoPages/IamInfo/IamCareAndUse.html):
Коэффициент емкости (фактор удерживания):
PS = r (dIf /dt)0/2∆If0,
где ∆If0 - увеличение интенсивности
флуоресценции при заполнении просвета
сосуда флуоресцентным перфузатом, ед,
(dIf /dt)0 - начальная скорость роста
интенсивности флуоресценции после того,
как раствор заполняет просвет и начинает
накапливаться в тканях, ед/с,
r - радиус сосуда, мкм.
где Va – объем акцепторного отсека, см3,
Ca– концентрация вещества в акцепторном
отсеке, мг/мл,
Cd– концентрация вещества в донорном
отсеке, мг/мл,
S – поверхность мембраны, см2,
t – время инкубации, мин.
k=(Tr-To)/To,
где Tr – время
удерживания, c,
To – мертвое время,
время прохождения
несорбируемого
вещества), с.
•Все модели применимы для проверки способности веществ
преодолеть ГЭБ
•Конкретную модель стоит выбирать исходя из конкретных
задач
Живой организм
Капилляры
Клетки эндотелия
Мембраны
11
Спасибо за внимание
12