013132 Изобретение относится к твердой лекарственной ... щей итраконазол.

013132
Изобретение относится к твердой лекарственной форме для вагинального применения, включающей итраконазол.
Фоновые заболевания шейки матки занимают одно из ведущих мест в структуре гинекологических
заболеваний. Актуальность изучения данной патологии обусловлена не только высокой частотой и развитием ее у женщин молодого возраста, но и недостаточной эффективностью существующих методов
лечения. Этиология и патогенез эрозий шейки матки до сих пор до конца неясны, несмотря на большое
количество исследований по данной проблеме. При этом ведущим этиопатогенетическим фактором считают наличие воспаления, нарушение баланса половых гормонов, перенесенные травмы шейки матки.
Большое значение придается также грибковым поражениям эпителия влагалища и шейки матки, причем
грибковая инфекция является важным фактором персистенции воспаления.
В настоящее время существуют консервативные и хирургические методы лечения эрозий. Хирургические методы лечения отличаются высокой эффективностью, но, как правило, являются травматичными с высоким процентом послеоперационных осложнений. Медикаментозные методы лечения заболеваний шейки матки не всегда являются эффективными, что требует внедрения новых препаратов.
Итраконазол - бистриазольное производное из группы противогрибковых средств. Обладает противогрибковой активностью. Препарат активен в отношении дерматофитов (Trichophyton spp., Microsporum
spp., Epidermophyton floccosum), дрожжевых грибов, в том числе Candida spp. (включая C.albicans,
C.glabrata, C.krusei), плесневых грибов (Cryptococcus neoformans, Aspergillus spp., Histoplasma spp., Paracoccidioides brasiliensis, Sporothrix schenckii, Fonsecaea spp., Cladosporium spp., Blastomyces dermatitidis) и
др.
Новый препарат применяется для лечения вульвовагинального кандидоза.
Из патента RU 2216323 известна противогрибковая композиция для перорального введения, включающая полученную расплавом смесь итраконазола и фосфорной кислоты, фармацевтически приемлемый носитель и поверхностно-активное вещество.
Из патента США № 7262170 известна композиция для вагинального использования, включающая
эффективное количество смеси аминокислот, эффективное количество противогрибкового агента, в частности итраконазола, достаточное количество кислоты или щелочи для регулирования pH и один или
более фармацевтических носителей.
Данный патент является наиболее близким аналогом заявленного изобретения.
Задачей настоящего изобретения является создание высокоэффективного противогрибкового средства на основе доступных ингредиентов, удобного в применении, с простой технологией получения.
Задача решается за счет создания твердой лекарственной формы для вагинального применения,
включающей итраконазол и фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, такие как, например, наполнитель, солюбилизатор, связующее и смазывающее вещество.
В предпочтительном варианте наполнитель выбирается из группы, включающей магния карбонат
основной, микрокристаллическую целлюлозу, крахмал картофельный, примогран, сахар молочный,
крахмал кукурузный, сахарозу, глюкозу, сорбит, маннит, солюбилизатор выбирается из группы, включающей натрий лаурилсульфат, карбонат кальция, карбонат натрия, полипласдон, кросповидон, примогель, примелозу, никотинамид, полисорбат, полиоксиэтиленгидрогенизированное касторовое масло,
макрогол, полиоксиэтиленсорбитанмонолаурат, этиловые эфиры жирных кислот касторового масла,
кальциевую соль кроскармелозы, этоксилированный изостеариловый спирт, связующее выбирается из
группы, включающей поливинилпирролидон, желатин, поливиниловый спирт, этил целлюлозу, метилцеллюлозу, аравийскую камедь, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, поливиниловый эфир, трагакант, шеллак, блок-сополимер полипропиленгликоля-полиоксиэтилена, мегулумин,
пектин, декстрин, смазывающее вещество выбирается из группы, включающей тальк, магния стеарат,
кальция стеарат, цинка стеарат, полиэтиленгликоль, натрия стеарин фумарат, стеариновую кислоту и
отвержденное растительное масло.
В предпочтительном варианте лекарственная форма по изобретению включает итраконазол, крахмал картофельный, сахар молочный, поливинилпирролидон, натрийлаурилсульфат, тальк и магния стеарат предпочтительно в следующих соотношениях:
-1-
013132
В предпочтительном варианте лекарственная форма по изобретению содержит (мас.%):
Лекарственная форма по изобретению может быть выполнена в форме таблетки, суппозитория, мази, эмульсии, спрея и т.д. Наиболее приемлемыми являются форма таблетки и суппозитория.
Предпочтительно в случае изготовления средства в форме таблетки, масса таблетки составляет
1.8 г, где количества входящих ингредиентов составляют:
Таблетки круглые, плоскоцилиндрические или тороидальной формы белого или почти белого цвета
могут быть получены стандартными средствами и методами, известными специалисту в данной области
техники. Просеянные и взвешенные ингредиенты смешивают, увлажняют раствором поливинилпирролидона, перемешивают для равномерного распределения влаги и гранулируют. Гранулы высушивают,
размалывают, опудривают, перемешивают до однородной массы и таблетируют.
Изучение специфической фармакологической активности на модели эрозии шейки матки
Эксперименты проводили на белых беспородных крысах-самках массой 180-200 г. Коагуляцию влагалищной порции матки проводили с помощью повышенной температуры. Для этого в стальной емкости
двухлитрового объема нагревалась до кипения вода, в которую опускали медный стержень диаметром 22.5 мм и доводили его до температуры 100°С. В ходе эксперимента емкость с кипящей водой находилась
на включенной плитке постоянно.
Крысу перед нанесением ожога наркотизировали кетамином в дозе 30 мг/кг внутримышечно. Во
влагалище вводили стеклянную воронку с внешним диаметром 6 мм и внутренним диаметром 3.5 мм.
Край воронки оплавляли во избежание дополнительной травматизации животного. Во внутреннюю часть
воронки вводили разогретый до 100°С медный стержень и через отверстие в цилиндрической части воронки вызывали ожог шейки матки. Контакт стержня и шейки матки длился 2-3 с. Манипуляцию проводили быстро во избежание потери температуры стержня. После ожога в это же отверстие вводили 2 капли 5% водного раствора едкого натра для изменения кислотной среды влагалища и суспензию Candida
albicans (1 мл) в мальтозном бульоне плотностью 108 KOE/мл для развития грибковой инфекции. Лечение начинали через сутки; при этом препарат вносился во влагалище в объеме 3 капель курсом 7 дней
(одну таблетку итраконазола разводили в 5 мл дистиллированной воды до образования устойчивой суспензии).
Отмечали динамику регенерации и гистологическую картину. Кроме этого, в периферической крови общепринятыми способами определяли показатели выраженности воспалительных процессов: количество лейкоцитов, содержание лимфоцитов и нейтрофилов, СОЭ, СРБ и фибриноген.
Для гистологического исследования крыс умерщвляли декапитацией в динамике и после окончания
эксперимента. Контрольных крыс умерщвляли тем же способом.
Шейку матки фиксировали в 10% формалине и после спиртовой проводки заливали в парафин. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином. Срезы изучали под биологическим микроскопом МБИ-6.
Обработка данных выполнялась с помощью простого сравнения средних по t-критерию Стьюдента.
Результаты исследования
Наблюдение за течением эрозивно-воспалительного процесса у животных без лечения показало, что
макроскопически слизистая оболочка влагалищной части шейки матки была темно-красной, отечной,
местами с изъязвлениями.
Гистологически у крыс с ожогом слизистой наблюдались некробиоз эпителия, отек и инфильтрация
полиморфно-ядерными лейкоцитами подслизистого слоя. Клеточные границы эпителия влагалищной
части матки были неразличимыми, ядра пикнотичными и деформированными. Местами эпителий отсутствовал.
Макроскопически слизистая оболочка шейки матки была бледно-розовой и не отличалась от контроля.
-2-
013132
При гистологическом исследовании шейки матки у крыс после аппликации итраконазола наблюдалась полная эпителизация поверхности эрозии. Эпителий, покрывающий слизистую шейки, был многослойным плоским неороговевающим. Воспалительная инфильтрация в подслизистом слое отсутствовала.
В подслизистом слое были видны коллагеновые соединительнотканные волокна и единичные полиморфно-ядерные лейкоциты и капилляры.
Морфологические данные подтверждались результатами гематологических исследований (табл. 1).
Таблица 1
Влияние препарата «Итраконазол» на показатели воспалительного процесса
в крови крыс с эрозией шейки матки, M±m
* Р<0.05 по отношению к контролю I и опытным группам.
Данные табл. 1 свидетельствуют о купировании воспалительного процесса в тканях влагалища и
шейки матки под влиянием препарата итраконазол.
Кроме этого, производился посев отделяемого влагалища на кровяной агар, среду Чистовича, Сабуро, Эндо и мальтозный агар. При этом выявлялся рост стафилококков, грамотрицательных палочек и
грибов (табл. 2).
Таблица 2
Результаты посевов влагалищных выделений
Использованы следующие обозначения:
+++ - сплошной рост;
++ - рост в пределах 100 колоний;
+ - рост единичных колоний;
- - отсутствие роста.
Исследование воздействия препарата «Итраконазол» на культуру грибов
В ходе проведенного исследования изучалось воздействие препарата «Итраконазол» на культуру
грибов.
Тест-культуру выращивали в соответствующих питательных средах: Candida albicans - в мальтозном бульоне в течение 24 ч при 37°С. Из жидких культур готовили стандартные суспензии плотностью
103-108 KOE/мл и наносили по 100 мкл на поверхность аналогичных агаровых сред, содержащих 0.0250.5% субстанции итраконазола. Посевы инкубировали при 37°С в течение 5 суток, просматривая ежедневно, после чего производили подсчет колоний. Результаты выражали в lgKOE/мл (табл. 3).
В случаях отсутствия роста колоний считали, что 100 мкл пробы содержит менее 1 колонии, т.е.
менее 10 колоний в 1 мл. Соответственно lgKOE/МА=I правильно представлять, как lgKOE/мл<1.
-3-
013132
Таблица 3
Выживаемость микроорганизмов в присутствии итраконазола в зависимости
от концентрации субстанции и плотности микробной популяции
Результаты свидетельствуют о том, что итраконазол обладает выраженной противогрибковой активностью.
Проведенные исследования свидетельствуют о высокой эффективности нового препарата «Итраконазол» при эрозивно-воспалительных заболеваниях шейки матки грибковой этиологии.
Изучение фармакокинетики
Материалы и методы.
Постановка исследования.
Исследования проведены на 6 кроликах-самках породы Шиншилла массой 3.08±0.10 кг. Животные
содержались в стандартных клетках при 12-часовом режиме освещения и свободном доступе к корму и
воде.
Длительность карантина (акклиматизационного периода) животных составляла четырнадцать дней.
В течение карантина проводили ежедневный осмотр каждого животного (поведение и общее состояние),
дважды в день кролики наблюдались в клетках.
Постановка опытов.
Препарат вводили вагинально с утра натощак. Стандартное питание животные получали через 2 ч
после начала эксперимента. Приведенная доза, в пересчете на субстанцию итраконазола, составила около
65.0±1.03 мг/кг.
Кровь отбирали из краевой вены уха кролика через определенные интервалы времени: 0.5; 1.0; 2.0;
4.0; 6.0; 8.0; 12.0; 18.0; 24.0 и 32.0 ч после введения препарата.
Пробы крови центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин, отбирали по 3.0 мл плазмы, замораживали и хранили при -20°С до анализа.
Количественное определение итраконазола в плазме крови проводилось согласно описанному ниже
методу. Расчет фармакокинетических показателей выполняли индивидуально для каждого животного.
Методика количественного определения итраконазола в плазме крови
Анализ содержания итраконазола в плазме крови производился по специально разработанной методике количественного определения с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии с
предварительной экстракцией из биоматериала. Для проведения хроматографического анализа и экстракции препарата из взятых проб использовали следующие реактивы и органические растворители: ацетонитрил, триметилпентан, дихлорметан, 0.1 N раствор NaOH, 0.02 М раствор K2H2PO4 фосфорная кислота, дистиллированная и деионизованная вода.
Аппаратурное обеспечение.
Центрифугирование образцов проводили на центрифуге ОПн - 8 УХЛ 4.2 (Россия). Анализ проб с
целью определения концентрации итраконазола в образцах плазмы крови осуществляли методом ВЭЖХ
на жидкостном хроматографе "Altex" (США) с флюориметрическим детектором с переменной длиной
волны.
Хроматографические характеристики методики количественного определения итраконазола в плазме крови экспериментальных животных представлены в табл. 4.
Таблица 4
Хроматографические характеристики методики количественного
определения итраконазола в плазме крови
Подготовка проб.
Во все образцы плазмы крови в объеме 3 мл добавляли 200 мкл 0.1 N раствора NaOH, встряхивали,
затем экстрагировали итраконазол 10 мл смеси триметилпентана и дихлорметана (3/2), центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин и отбирали верхний слой. Упаривали, добавляли 150 мкл элюента и
-4-
013132
100 мкл вводили в хроматограф.
Условия ВЭЖХ-анализа.
Количественное определение итраконазола проводили методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе, "Altex" (США), с флюориметрическим детектором с переменной длиной волны, рабочая длина волны
возбуждения - 260 нм, испускания - 365 нм. Колонка: Spheresorb ODS, С 18, 5 мкм (4.6×250 мм). Элюент
состоял из смеси ацетонитрила и водного раствора, содержащего 0.02 М K2H2PO4, подкисленного фосфорной кислотой до pH 3. Соотношение ацетонитрил/буфер 1/1. Скорость элюирования равнялась
1.0 мл/мин. Хроматографирование проводили при комнатной температуре (22-24°С). Перед хроматографированием подвижную фазу дегазировали и фильтровали. Объем вводимой в хроматограф пробы составлял 100 мкл. Время удерживания итраконазола в данных условиях 8.6 мин.
Аналогично проводили анализ проб плазмы крови с внесенными стандартными количествами итраконазола: 10.0, 50.0, 100.0, 250.0, 500.0, 750.0 и 1000.0 нг/мл.
Установлена линейная зависимость между концентрацией итраконазола и высотой хроматографического пика в диапазоне 10.0-1000.0 нг/мл. Концентрацию лекарственного вещества в пробах определяли по калибровочному графику.
Минимальная чувствительность метода анализа составила 10.0 нг/мл плазмы крови.
Метрологическая характеристика.
Достоверность результатов количественного определения итраконазола в плазме крови экспериментальных животных оценивали, рассчитывая метрологические характеристики данной методики по
результатам 5 параллельных измерений концентраций в трех образцах плазмы крови, которые представлены в табл. 5.
Таблица 5
Метрологические характеристики методики количественного
определения итраконазола в плазме крови
Как следует из данных табл. 5, показатель, характеризующий точность методики (относительная
погрешность среднего значения), составляет 14.23, 8.46 и 5.85%. Показатель, характеризующий воспроизводимость методики - стандартное отклонение - составляет 6.23, 18.35 и 25.34 для концентрации итраконазола 10.0, 100.0 и 500.0 нг/мл соответственно. Содержание препарата в пробах находится в рассчитанных доверительных границах, а методика количественного определения итраконазола в плазме крови
не зависит от систематических ошибок.
Методика оценки фармакокинетических показателей
Для описания фармакокинетики препарата в плазме крови были привлечены следующие показатели
Показатели Tmax, Cmax и β оцениваются из вида кривой концентрации. Исходные формулы для расчета остальных показателей следующие:
где D - введенная доза препарата.
Расчет показателей выполнялся модельно-независимым способом с помощью метода интегральных
моментов. Используемый метод не опирается ни на какие предположения о внутренних механизмах, ле-5-
013132
жащих в основе кинетики препаратов, кроме самых общих, и в этом смысле является наиболее устойчивым.
Для расчета использовалась оригинальная программа, разработанная в Институте токсикологии.
Результаты исследования
Концентрации итраконазола в плазме крови
Результаты измерения концентрации итраконазола в плазме крови кроликов при вагинальном введении препарата «Итраконазол» индивидуально для каждого животного представлены в табл. 6.
После введения препарата итраконазол начинал проникать в системный кровоток примерно через
30 мин, достигал максимального уровня к 1.5-2 ч (около 218.75±14.63 нг/мл), после чего препарат постепенно выводился из организма и через 32 ч после введения определялся в плазме крови в минимальных
количествах (30.50±1.65 нг/мл). Разброс индивидуальных значений умеренный: коэффициент вариации
CV составил 7-25%.
Таблица 6
Концентрации итраконазола в плазме крови кроликов (нг/мл)
при вагинальном введении препарата «Итраконазол» в дозе 65.0 мг/кг.
Форма кривой изменения зависимости концентрации итраконазола в плазме крови от времени демонстрирует постепенное нарастание до максимальной концентрации, после чего следует относительно
плавное снижение концентрации по простому экспоненциальному закону.
Фармакокинетические показатели
Расчет фармакокинетических показателей выполнен модельно-независимым (прямым) способом на
основе метода интегральных моментов. Рассчитанные значения показателей приведены в табл. 7.
Таблица 7
Полученные оценки позволяют сделать ряд выводов о фармакокинетике итраконазола при вагинальном способе введения препарата «Итраконазол».
Концентрация итраконазола начинает определяться в системном кровотоке через 30 мин. Наибольшая концентрация итраконазола в плазме крови отмечается с 1.83 ч после введения препарата
(221.23±14.43 нг/мл). Последующее снижение концентрации характеризуется временем половинного
убывания порядка 10 ч (10.67±0.47 ч). Общее среднее время присутствия препарата в организме - показатель MRT - составляет порядка 14 ч (14.20±0.34 ч).
Величина кажущегося стационарного объема распределения - показатель Vss - составляет
-6-
013132
256.21±13.45 мл/кг. Значение данного показателя может указывать на то, что препарат довольно умеренно распределяется в периферические структуры, ограничиваясь, по-видимому, в основном водной фазой.
В целом, полученные в настоящем исследовании значения фармакокинетических параметров находятся в соответствии с литературными данными о фармакокинетике пероральных форм итраконазолсодержащих препаратов.
Согласно литературным данным при пероральном введении кроликам итраконазола в аналогичной
дозе AUG∞, составляет порядка 20000 чнг/мл, а Cmax - порядка 1000 нг/мл. Сравнение данных параметров
с параметрами, полученными в данном исследовании, позволяет приблизительно охарактеризовать относительную биодоступность итраконазола при вагинальном введении. Показатель относительной биодоступности при вагинальном введении итраконазола, определяемый как соотношения значений AUG∞ и
Cmax, составляет порядка 20% по отношению к пероральному введению данного препарата. Это небольшое значение. Оно может указывать на то, что около 80% итраконазола находится в месте введения,
обеспечивая высокую местную концентрацию препарата и, соответственно, около 20% оказывает системное действие.
Результаты исследования фармакокинетики препарата «Итраконазол» показали максимальный уровень концентрации итраконазола в пределах 221.23±14.43 нг/мл в крови экспериментальных животных
достигается через 1.83±0.17 ч после перорального введения препарата в дозе 65.0 мг/кг.
Общее среднее время присутствия препарата в организме - показатель MRT - составляет 14.20±0.34 ч.
Период полувыведения препарата T1/2 составил 10.67±0.47 ч.
Относительная биодоступность препарата составляет 20% по отношению к пероральному введению, что свидетельствует о создании эффективных местных концентраций и невысокой системной биодоступности итраконазола при вагинальном введении.
Свидетельств о накоплении препарата в организме и возможности кумуляции исследованиями не
выявлено.
Исследование острой токсичности
Для определения показателей острой токсичности препарата у крыс использовались группы по 5
животных одного пола. Кроме того, имелись аналогичные по численности группы контрольных животных каждого пола. Животные распределялись по группам случайным образом. В качестве критерия приемлемости рандомизации считали отсутствие внешних признаков заболеваний и гомогенность групп по
массе тела (±20%).
При исследовании на крысах большую таблетку разрезали бритвой на полоски меньшего размера,
удобные для вагинального введения. Введения препарата осуществляли на протяжении 12 ч с интервалами в 1 ч.
Контрольным животным вагинально вводились аналогичные по размеру полоски, состоящие из
твердого жира, тип А.
Крысы наблюдались 14 дней. Регистрировали клинические симптомы интоксикации, показатели
общего состояния.
Кроме этого, таблетки вводились внутрижелудочно. Для этого их растворяли в теплой воде до образования устойчивой взвеси молочного цвета. Введение осуществляли через металлический атравматичный зонд, погружая его до желудка. Контрольным животным вводили дистиллированную воду.
Дозирование осуществлялось на общую массу препарата.
Через 14 дней животные всех экспериментальных групп были подвергнуты эвтаназии - передозировкой эфира и подвергнуты патоморфологическому исследованию.
Кроме этого, взвесь из таблеток ввели в желудок через резиновый зонд в дозе 20 г/кг двум собакам
(самцу и самке).
Токсикометрия и переносимость
Ни в одной из групп гибели животных не отмечалось вплоть до доз 15 г/кг (каждой крысе за сутки
вагинально (самкам) или внутрижелудочно (самкам и самцам) было введено суммарно почти по 2 полных таблетки). Не отмечалось и каких-либо признаков негативного воздействия препарата за исключением гиподинамии и диареи. Во все дни наблюдения по общему состоянию и поведению опытные животные не отличались от контрольных.
Динамика массы тела во всех группах оставалась нормальной. В табл. 8 и 9 приведены данные по
измерению массы тела у контрольной группы и у животных, получивших препарат в дозах 1 г/кг и более.
-7-
013132
Таблица 8
Динамика массы тела крыс (г) после в/ж введения препарата «Итраконазол»
в дозах 1000 мг/кг и более (M±m)
Таблица 9
Динамика массы тела крыс-самок (г) после вагинального введения
препарата «Итраконазол» в дозах 1000 мг/кг и более (М±m)
Из таблиц видно, что у экспериментальных животных в течение 2 недель после введения препарата
наблюдалось незначительное увеличение массы тела, носящее недостоверный характер. Состояние животных и их поведение в целом соответствовали нормальным и не отличались от таковых у контрольных
крыс.
После окончания эксперимента животные были подвергнуты эвтаназии.
Данные вскрытия (некропсии)
По данным вскрытия и макроскопического исследования изучаемых органов различий между группами животных не установлено.
Шерсть была блестящей, опрятного вида. Очагов облысения не наблюдалось. Выделения из естественных отверстий отсутствовали. Передние и задние конечности изменений не представляли. Деформации конечностей не наблюдалось. Зубы были сохранены. Видимые слизистые оболочки были бледными,
блестящими, гладкими. Молочные железы самок без уплотнений на ощупь. Половые органы самцов правильно выражены. При осмотре грудной и брюшной полостей нарушений в положении внутренних органов не отмечалось. Листки плевры, перикарда и брюшины были тонкими, блестящими, гладкими.
Подчелюстные лимфатические узлы и слюнные железы имели округлую или овальную форму,
гладкую поверхность, слегка желтоватый или розоватый цвет.
Щитовидная железа плотно прилежала к гортани. Консистенция ее была умеренно плотной. Величина и форма отклонений от нормы не представляли. Поверхность разреза была однородной розоватой
окраски.
Тимус имел треугольную форму, беловатый цвет и умеренно плотную консистенцию.
Диаметр аорты был равномерным на всем протяжении. Интима аорты была гладкой, блестящей, беловатой окраски.
Величина и форма сердца изменений не представляли. Мышца сердца была умеренно плотной, равномерно коричневатой окраски. Клапаны сердца были тонкими, гладкими, блестящими.
Легкие спадались при вскрытии грудной клетки. Их величина и форма изменений не представляли.
Поверхность легких имела однородную бледно-розовую окраску. Ткань легких была пушистой на
ощупь. Просвет трахеи и крупных бронхов был широким, слизистая оболочка - блестящей, бледнорозовой, гладкой.
Слизистая пищевода была блестящей, гладкой, бледного цвета. Величина и форма желудка изменений не представляли. Его просвет был заполнен пищевым содержимым. Просвет 12-перстной кишки изменений не представлял, слизистая кишки была блестящей, гладкой, бледно-розовой. Слизистая оболочка тонкой кишки была также бледно-розовой, блестящей, гладкой. Слизистая оболочка толстой кишки
имела слегка сероватый оттенок, была гладкой, блестящей.
-8-
013132
Форма и величина печени изменений не представляли. Поверхность печени была гладкой, однородной темно-красной окраски. Ткань печени на разрезе была темно-красной. Капсула печени была тонкой,
прозрачной. Консистенция печени имела обычную плотность.
Форма поджелудочной железы изменений не представляла. Железа имела дольчатое строение,
бледно-розовую окраску и умеренно плотную консистенцию.
Размеры и форма селезенки изменений не представляли. Поверхность селезенки имела однородную
темно-вишневую окраску, была гладкой. Консистенция селезенки была умеренно плотной. На разрезе
органа выделялись сероватые мелкоклеточные фолликулы.
Величина и форма почек также не представляли изменений. Капсула почек легко снималась. Поверхность была гладкой, однородно коричневато-сероватого цвета. На разрезе органа хорошо различимы
корковое и мозговое вещество. Консистенция почек была умеренно плотной.
Надпочечники имели округлую форму, беловато-желтую окраску и умеренно плотную консистенцию. На разрезе отчетливо выделялось темно-коричневое мозговое вещество.
Мочевой пузырь был заполнен прозрачной, светлой мочой. Слизистая оболочка мочевого пузыря
была гладкой, блестящей, бледной окраски.
Яичники имели неровную зернистую поверхность, темно-красный цвет и округлую форму. Тело
матки было умеренно плотным, имело обычные размеры, темно-красный цвет. Гиперемий, эрозий, кровоизлияний, свидетельствующих о раздражающем действии препарата на стенки влагалища у самок, не
наблюдалось.
Яички самцов были умеренно плотными, беловатого цвета, обычных размеров.
Оболочки головного мозга были тонкими, прозрачными. Вещество мозга было чуть плотноватым
на ощупь, поверхность мозга была гладкой. На фронтальных размерах расширения желудочков не наблюдалось.
Таблица 10
Массовые коэффициенты (мг/100 г веса тела) внутренних органов белых крыс
при в/ж введении препарата «Итраконазол» (дозы 1000 мг/кг и более)
Таблица 11
Массовые коэффициенты (мг/100 г веса тела) внутренних органов белых крыс
при интравагинальном введении препарата «Итраконазол» (дозы 1000 мг/кг и более)
-9-
013132
Таким образом, результаты токсикометрии, данные наблюдений за экспериментальными животными после острого применения, а также данные патоморфологических исследований позволяют отнести
вагинальные таблетки «Итраконазол» к классу практически нетоксичных лекарственных веществ.
Исследование подострой и хронической токсичности
В опытах на крысах-самках препарат вводился интравагинально (и/в) в виде водной взвеси через
зонд ежедневно на протяжении 90 дней в 2 дозах: терапевтической - 60 мг/кг; и предполагаемой максимальной - 1200 мг/кг (в 20 раз большей терапевтической, не вызывает гибели крыс при однократном введении).
Промежуточная доза не использовалась, так как препарат был практически нетоксичным. Дозирование осуществляли на общую массу таблеток.
В опытах на негрызунах (беспородных собаках-самках) препарат применяли интравагинально в виде таблеток ежедневно на протяжении 90 дней в 2 дозах: терапевтической - 60 мг/кг и максимальной 6000 мг/кг. На максимальной дозе собака получала до 4 таблеток в сутки.
Выбор регистрируемых показателей в каждом случае определялся научной целесообразностью и
требованиями нормативных документов.
Исследования на крысах
Экспериментальная программа исследований включала следующие пункты.
Животные
крысы самки.
Путь введения
интравагинально.
Дозы
1 доза - 60 мг/кг;
2 доза - 1200 мг/кг.
Частота введения
1 раз в день в течение 90 дней.
Растворитель
дистиллированная вода.
Число животных
1 доза - 40 самок;
2 доза - 40 самок.
Общее количество - 120, из них 40 - контрольная группа.
Регистрируемые показатели
Влияние на массу тела белых крыс, потребление корма и воды
Влияние препарата на массу тела белых крыс, потребление корма и воды было изучено в течение 90
дней введения. Полученные результаты представлены в табл. 12-14.
- 10 -
013132
Как видно из таблиц, вес животных, получавших препарат, равномерно увеличивался на протяжении всего срока исследования как в контрольной, так и в опытных группах.
В эти же временные сроки через 2 ч после введения препарата для учета потребления воды и пищи
крысы высаживались в обменные клетки фирмы «Tecniplast Gazzada» на сутки.
Животные контрольной и опытных групп потребляли корм одинаково в течение всего времени наблюдения. Различий, связанных с уровнем дозирования, не наблюдалось.
Таблица 12
Влияние хронического вагинального введения препарата
«Итраконазол» на массу тела белых крыс (г, М±m)
Таблица 13
Влияние хронического вагинального введения препарата «Итраконазол»
на потребление корма белыми крысами (г/сутки, М±m)
Потребление воды несколько возрастало в течение эксперимента. При этом существенной разницы
исследуемых показателей в экспериментальных группах, по сравнению с контролем, не отмечалось.
Таблица 14
Влияние хронического вагинального введения препарата «Итраконазол»
на потребление воды белыми крысами (мл/сут, М±m)
Влияние на ректальную температуру
Данные измерения ректальной температуры крыс с помощью электрического медицинского термометра ТПЭМ-1 (допустимая основная погрешность от диапазона измеряемых температур ± 1%) представлены в табл. 15.
- 11 -
013132
Таблица 15
Влияние препарата «Итраконазол» на температуру тела белых крыс (°С, М±m)
Результаты измерения ректальной температуры свидетельствуют об отсутствии различий этого показателя у животных из опытных и контрольной групп.
Влияние на длительность гексеналового сна
Детоксицирующую функцию печени оценивали по продолжительности гексеналового сна. Эксперимент проводился в теплом и тихом помещении. Животное взвешивали и внутрибрюшинно вводили
раствор гексенала в дозе 90 мг/кг, растворитель - 0.9% раствор NaCl. Данные представлены в табл. 16.
Таблица 16
Влияние препарата «Итраконазол» на продолжительность гексеналового сна у белых крыс (мин, М±m)
Оказалось, что препарат не изменяет продолжительность гексеналового сна, т.е. не оказывает отрицательного влияния на детоксицирующую функцию печени.
Влияние на параметры функционального состояния почек
Анализы мочи и оценка функциональной активности почек по секреции фенол-красного проведены
в фоне через 30 и 90 дней после начала введения препарата. Полученные данные представлены в
табл. 17 и 18.
Таблица 17
Результаты анализа мочи у белых крыс при исследовании
хронической токсичности препарата «Итраконазол», М ± m
- 12 -
013132
- 13 -
013132
Таблица 18
Влияние препарата «Итраконазол» на секреторную функцию почек белых крыс
(количество выделенной краски в мг/100 г веса, М±m)
Как видно из таблиц, существенных изменений со стороны выделительной функции почек при введении препарата белым крысам не наблюдалось.
Влияние на показатели периферической крови
Гематологические исследования проводились до начала введения препарата и через 30 и 90 дней
после ежедневного введения во всех группах. Кровь получали пункцией хвостовой вены.
Статистическая обработка результатов проводилась по методам Стьюдента-Фишера. Полученные
данные представлены в табл. 19.
Таблица 19
Влияние препарата «Итраконазол» на показатели
периферической крови у белых крыс, М±m
- 14 -
013132
- 15 -
013132
При микроскопировании мазков лимфоциты имеют сильно пикнотическое ядро, иногда обнаруживается значительная азурофильная зернистость. Основная масса сегментоядерных клеток имеет нежную,
нейтрофильную, не вполне ясно выраженную зернистость в мазках. Ядра эозинофильных клеток образованы из рыхлого хроматинового вещества и имеют почти круглую форму. Ядра эозинофилов и нейтрофилов образуются по кольчатому типу, поэтому нередко встречаются кольцеобразные ядра у палочковидных форм. Моноциты сильно отличаются от лимфоцитов. Последние равны по величине двум эритроцитам, имеют большое бобовидное ядро и широкую протоплазматическую кайму, которая окрашивается в синий или фиолетовый цвет с нежной грануляцией. Кровяные пластинки лежат большими кучками.
При анализе лейкоцитарной формулы единственным заметным эффектом является незначительное
увеличение процентного числа плазматических клеток в крови животных опытных групп по сравнению с
контрольными. Этот эффект не обнаруживается простым сравнением средних по Стьюденту, но выявляется методом дисперсионного анализа и связан с фактором «введение препарата без учета дозы». Однако
этот эффект, являясь статистически достоверным при Р<0.95, не выводит данный показатель за пределы
физиологической нормы.
Следует отметить, что на 30 и 90 сутки исследования у подопытных животных не отмечалось патологических гематологических изменений.
Влияние на биохимические показатели крови
В табл. 20 представлены данные по влиянию исследуемого препарата на основные биохимические
показатели крови белых крыс.
- 16 -
013132
Таблица 20
Влияние препарата «Итраконазол» на основные биохимические показатели
периферической крови белых крыс (M±m)
- 17 -
013132
Как видно из представленных выше данных, препарат не оказывал негативного действия на биохимические показатели крови.
Данные макроскопического исследования внутренних органов
В разделе представлены обобщенные данные некропсии крыс всех исследованных групп, так как по
результатам макроскопического исследования изучаемых органов различий между группами не установлено.
Крысы правильного телосложения, удовлетворительного питания. При наружном осмотре выделений из естественных отверстий не обнаружено. Шерсть блестящая, опрятного вида, очагов облысения не
определяется. Зубы сохранены. Видимые слизистые оболочки бледной окраски, блестящие. Молочные
железы самок без уплотнений на ощупь, выделения из сосков отсутствовали.
Грудная и брюшная полости выпота не содержат. Положение внутренних органов грудной и брюшной полостей нарушений не представляет. Париетальный и висцеральный листки плевры и брюшины
тонкие, блестящие, гладкие.
Подчелюстные лимфатические узлы и слюнные железы овальной формы, бледно-желтого или розоватого цвета, с гладкой поверхностью, тонкой капсулой, не спаяны между собой и подлежащими тканями. Поверхность разреза однородной окраски.
Щитовидная железа красноватого цвета, обычной величины и формы, умеренно плотной консистенции.
Тимус треугольной формы, беловатого цвета, умеренно плотной консистенции, обычных размеров.
Интима аорты гладкая, блестящая, беловатого цвета. Диаметр аорты не изменен. Листки перикарда
тонкие, прозрачные, гладкие. Величина и форма сердца изменений не представляют. Левый желудочек
сокращен, в правом содержится незначительное количество темной жидкой крови. Клапаны сердца тонкие, блестящие, гладкие. Мышца сердца на разрезе однородной коричневатой окраски, умеренно плотная.
Просвет трахеи и крупных бронхов не изменен, слизистая оболочка блестящая, гладкая, бледного
цвета. Легкие воздушные, без уплотнений на ощупь, бледно-розовой окраски.
Слизистая пищевода блестящая, гладкая, бледного цвета. Желудок обычной величины и формы, заполнен пищевым содержимым. Слизистая оболочка безжелезистой части желудка складчатая, розоватая,
блестящая. Слизистая тела желудка складчатая, розоватая, блестящая. Слизистая оболочка тонкого кишечника бледно-розового цвета, блестящая, гладкая.
Форма и величина печени изменений не представляют. Поверхность печени гладкая, однородной
темно-красной окраски, капсула тонкая, прозрачная. Ткань печени на разрезе полнокровная, умеренно
плотная.
Поджелудочная железа плоской формы, бледно-розового цвета, дольчатая, умеренно плотной консистенции.
Селезенка обычной формы, темно-вишневого цвета, умеренно плотной консистенции. Поверхность
органа гладкая, капсула тонкая. На разрезе на темно-красном фоне селезенки видны мелкие сероватого
цвета фолликулы.
Величина и форма почек не изменены. Поверхность почек коричневатого цвета, гладкая, капсула
тонкая, прозрачная, легко снимаемая. На разрезе органа хорошо различимы корковое и мозговое вещество.
Надпочечники округлой формы, бледно-желтого цвета, с гладкой поверхностью, умеренно плотные. На разрезе четко выделяется темно окрашенное мозговое вещество.
Мочевой пузырь заполнен прозрачной мочой. Слизистая оболочка пузыря гладкая, блестящая,
бледной окраски.
Тело матки самок обычной плотности, величины и формы. Рога матки тонкие, слизистая - блестящая, бледная. Яичники темно-красного цвета, с неровной поверхностью, умеренно плотные. Слизистая
оболочка влагалища розового цвета, блестящая, гладкая, без признаков раздражения.
Оболочки головного мозга тонкие, прозрачные. Вещество мозга обычной плотности, поверхность
мозга гладкая. На фронтальных разрезах мозга отчетливо выделяются серое и белое вещество. Желудочки мозга обычной величины, расширения нет.
В табл. 21 представлены данные по массовым коэффициентам органов у белых крыс из всех экспериментальных групп.
- 18 -
013132
Таблица 21
Массовые коэффициенты (МК) органов у белых крыс
при введении препарата «Итраконазол» (М±m)
Из таблицы следует, что достоверных отличий величин массовых коэффициентов органов крыс
контрольной группы от опытных нет.
Результаты гистологического исследования
Объекты фиксировали в 10-15% формалине или жидкости Карнуа и заливали в парафин. Головной
мозг фиксировали в 96% спирте и заливали в целлоидин или парафин. Срезы внутренних органов окрашивали гематоксилин-эозином и по Ван-Гизону, срезы головного мозга окрашивали по Нисслю. При
просмотре гистологических препаратов изучаемых органов контрольных животных и животных, получавших максимальную дозу препарата, различий между группами не обнаружено. Цитоархитектоника
коры больших полушарий головного мозга не нарушена, очагов выпадения нет. Сосуды мозговых оболочек умеренно полнокровные; кортикальные сосуды равномерного диаметра. Содержат единичные эритроциты. Признаки острого или хронического заболевания нейронов отсутствуют. Ядра нейронов светлые, ядерная мембрана тонкая, ядрышки четкие. В цитоплазме определяется достаточное количество
хроматофильной зернистости Ниссля: пылевидной в цитоплазме нейронов 2-3-го слоев и более крупной в цитоплазме нейронов 5-го слоя коры больших полушарий. Нейроны разных ядерных образований
среднего и продолговатого мозга содержат крупные глыбки тигроида. Ядра нервных и глиальных клеток
не изменены - ядерная мембрана тонкая, содержание хроматина нормальное, ядрышки четкие.
Клетки эндотелия внутренней оболочки аорты с четкими ядрами. Деструкции эластических волокон
средней оболочки нет.
Поперечная исчерченность миофибрилл во всех отделах сердца отчетливая, ядра кардиомицитов
содержат достаточное количество хроматина, ядерная оболочка тонкая. Очагов нарушений тинкториальных свойств цитоплазмы нет. Избыточного разрастания стромы (кардиофиброза) нет.
Эпителий гортани, трахеи, крупных бронхов не изменен, ядра четкие. Альвеолы всех долей легких
содержат воздух. Ядра альвеолярного эпителия четкие, цитоплазма оксифильная. Эпителий внутрилегочных бронхов без изменений. Острые воспалительные изменения легочной ткани отсутствовали.
Трабекулярное строение печени на срезах, полученных из объектов разных долей печени, нарушений не представляет. Границы гепатоцитов отчетливые, цитоплазма зернистая, слабо оксифильная. Очаговых нарушений тинкториальных свойств цитоплазмы нет. Ядра содержат четкие ядрышки и достаточное количество хроматина. Ядерная мембрана тонкая. Синусоиды печени полнокровные.
Капилляры клубочков и интерстициальной ткани почек полнокровные, цитоплазма эпителия проксимальных канальцев почек оксифильная, клеточные границы различимы, ядра нефроэпителия светлые,
четкие.
Сосуды коры и мозгового вещества надпочечников полнокровные. Все зоны коры надпочечников
отчетливо выражены, клеточные ядра содержат достаточное количество хроматина. Цитоплазма клеток
пучковой зоны вакуолизирована за счет содержания большого количества липидов. Клетки мозгового
вещества крупные, овальной формы, объединенные в гроздья и тяжи.
Лимфоретикулярные элементы лимфатических узлов и селезенки с четкими ядрами, деструкции
или атрофии фолликулов нет. В красной пульпе селезенки видны очаги кроветворения с единичными
мегакариоцитами.
Слизистая оболочка безжелезистой части желудка выстлана многослойным плоским эпителием,
клетки которого изменений не представляют. Покровный эпителий слизистой тела желудка образован
- 19 -
013132
слизистыми цилиндрическими клетками, дефектов эпителиальной выстилки нет. Главные и обкладочные
клетки желез тела желудка не изменены. Дефектов многослойного плоского неороговевающего эпителия
слизистой пищевода нет.
Дольчатое строение поджелудочной железы сохранено. Клетки островков Лангерганса содержат
светлые, четкие ядра, цитоплазма слабо оксифильная. Эпителиальные клетки внешнесекреторной части
железы базофильные, ядра, расположенные в средней части, четкие, с достаточным количеством хроматина. Сосуды стромы поджелудочной железы умеренно полнокровные.
Фолликулы щитовидной железы заполнены небольшим количеством оксифильного, слабовакуолизированного коллоида. Эпителий фолликул обычной высоты, ядра четкие. Сосуды стромы умеренно
полнокровные. Строение подчелюстных желез нарушений не представляет. Эпителиальные клетки концевых отделов и выводных протоков с четкими ядрами, деструкции клеток нет.
Тимус сохраняет выраженное дольчатое строение. Корковое вещество долек заполнено лимфоцитами и тимоцитами. Мозговое вещество тимуса содержит меньшее количество лимфоцитов, а также
светлые эпителиальные клетки, местами образующие концентрические фигуры и тельца Гассаля. Строма
тимуса умеренно полнокровная.
В корковом веществе яичников самок видны фолликулы разной величины и степени созревания.
Фолликулярный эпителий не изменен, ядра светлые, четкие, мозговое вещество яичников полнокровное.
Дефектов эпителия влагалища нет.
Полученные данные позволяют сделать вывод о высокой эффективности заявленной формы при вагинальном использовании.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Лекарственное средство для вагинального применения, включающее итраконазол, отличающееся
тем, что оно содержит следующие компоненты в количествах, мас.%:
2. Средство по п.1, отличающееся тем, что количества ингредиентов составляют, мас.%:
3. Средство по п.1, отличающееся тем, что оно выполнено в форме таблетки или суппозитория.
4. Средство по п.3, отличающееся тем, что таблетка включает
5. Способ лечения вульвовагинального кандидоза при помощи средства по любому из пп.1-4.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что вульвовагинальный кандидоз сопровождается эрозивновоспалительными процессами.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
- 20 -