1Азербайджанск Азербайджанск Азербайджанскaя

ANNALS OF AGRARIAN SCIENCE, vol. 9, no. 4, 2011
ИЗВЕСТИЯ АГРАРНОЙ НАУКИ, Том 9, Ном. 4, 2011
-----------------------------------------------------------------------------------------------------VETERINARY SCIENCE AND ANIMAL HUSBANDRY
ВЕТЕРИНАРИЯ И ЗООТЕХНИЯ
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА МЕТОДОВ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ
ДИАГНОСТИМКИ НЬЮКАСЛСКОЙ БОЛЕЗНИ
Ш.К. Зейналова1, Э.М. Агаева2
Азербайджанскaaя республиканская ветеринарная лаборатория
1Азербайджанск
8-й м-н, ул. Сани Ахундова, кв. 3129, Баку, Az1018, Азербайджан; [email protected]
2
Кафедра микробиологии и иммунологии Азербайджанского медицинского университета
ул. Бакиханова 23, Баку, Аз 1009, Азербайджан; [email protected]
Поступила в редакцию: 15.06.11; одобрена к печати: 12.09.11
Авторами статьи были проведены вирусологические и микробиологические
реакции, для обнаружения вируса Ньюкаслской болезни среди птиц.
ВВЕДЕНИЕ
Одной из распространенных опасных заболеваний птиц является болезнь Ньюкасла.
Проблема борьбы с Ньюкаслской болезнью остается крайне актуальной как в
индустриальных, так и в развивающихся странах [1-3].
Так, в Азербайджане индекс летальности от этой болезни в 2006 году составил 80%, а в
последующие годы наблюдалось снижение данной инфекции.
Многие авторы причинами возникновения и распространения Ньюкаслской болезни
считают миграцию дикой, энзоотической птицы, перемещение спортивных голубей,
передвижение людей и техники, бесконтрольную реализацию птицеводческой продукции, а
также способность вируса долгое время персистировать в организме восприимчивых птиц.
Постоянная опасность Ньюкаслской болезни связана с циркуляцией в природе
висцеротропных штаммов возбудителя [1,4].
Вирус болезни Ньюкасла относиться к семейству парамиксовирусы, роду
парамиксовирус – семейство РНК-содержащих вирусов, размеры 120-300 нм, окружен
оболочкой с гликопротеиновыми шипами. Под оболочкой находится спиральный
нуклеокапсид, состоящий из нефрагментированной линейной однонитевой минус РНК,
связанной с белками: нуклеопротеином (NP), полимеразой – фосфопротеином (P), и большим
(L) белком. Нуклеокапсид ассоциирован с матриксным белком, расположенным под
оболочкой вириона. Оболочка вириона содержит шипы – два гликопротеина: белок слияния F
(F- от английского fusion), вызывающий слияние мембран вируса и клетки; прикрепительный
белок (гемагглютинин, нейраминидаза(HN) или (G) белок.
Репродукция парамиксовирусов инициируется связыванием HN, Н или G- белка на
оболочке вириона с сиаловой кислотой на поверхности клетки. F- белок обеспечивает
слияние оболочки вируса с плазматической мембраной клетки. Вирионы проникают в клетку
без образования эндосом. Парамиксовирусы индуцируют слияние клеток, образуя
поликарионы – синцитий.
1
РНК- полимераза вносится в клетку с нуклеокапсидом вируса. Транскрипция, синтез
белка и репликация генома происходят в цитоплазме клетки хозяина. Геном
транскрибируется в отдельные РНК и полноценную плюс – матрицу для геномной РНК.
Новые геномы взаимодействует с L-, N- и NP- белками, образуя нуклеокапсиды, которые
связываются с М-белком и окружаются оболочкой из модифицированной плазмалеммы
клетки. Вирионы входят из клетки почкованием.(4,5).
Вирус устойчив во внешней среде, агглютинирует куриные эритроциты,
репродуцируется в куриных эмбрионах.
По нашим данным и данных других исследователей Ньюкаслской болезнью болеют индейки,
цесарки, куры всех возрастов, дикие перелетные птицы. Инкубационный период составляет
5-15 дней. Наблюдается затрудненное дыхание, угнетенное состояние, общая слабость,
дрожание мышц, боль в шейных мышцах и опистотонус. Иногда паралич крыльев и
конечностей. Смертность достигала 90%, а при подостром течении – повышенная
возбудимость, расстройство нервной системы. (1,4).
Диагноз на Ньюкаслскую болезнь ставили на основании эпизоотологических данных,
клинической картины, патологоанотомических изменений и результатов лабораторных
исследований; окончательный – при выделении вируса Ньюкаслской болезни на куриных
эмбрионах.
Из серологических реакций применяли РЗГА. Положительным считался титр антител <
1: 16.Однако на современном этапе развития науки наиболее достоверным является ПЦР и
ИФА.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ
Пробы сыворотки крови и внутренние органы кур, диких уток и цыплят разных
возрастов были получены из Гилязинского, Билесуварского и других птицеводческих
предприятий Азербайджана. Материалы также поступали из частных хозяйств, разных
районов (Тар-Тар, Абшерон, Бейлеган). Золотой стандарт для выявления вирусов болезни
Ньюкасла заключается в изоляции яйцеклетки методом инокуляции подозреваемых образцов
в 9-11 дневные эмбрионированные куриные яйца через аллантоис. Образцы получали из
гомогената ткани и мазков из дыхательных путей или выводного отверстия. Вирусная
изоляция выполнялась в соответствии с протоколом Международного Эпизоотического Бюро
(МЭБ) и Европейскими стандартами (ЕС, 94/2005).
После изоляции вируса предварительно проводили реакцию Гемагглютинации с
использованием 1%-ной суспензии куриных эритроцитов. При положительных случаях
проводили реакцию РЗГА, при этом использовали специфическую сыворотку или антиген
которую получали из Референс лаборатории OIE- IzSVE (Радова, Италия).
Учет и интерпретацию результатов реакции осуществляли визуально. За титр
принимали последнее разведение сыворотки, дающее полную задержку гемагглютинации.
Титр сыворотки < 1:8, образец считается отрицательным, а когда титр > 1:16, положительный.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Табл. Резулътаты анализа, полученные в реакции РЗГА
Название района Вид птицы
Исмаилы
Тар-тар
Дикая птица
Домашняя птица
Внутренние
органы
Мозг,
трахея,
легкие
и
кишечник
кровь
Титр в РЗГА
сыворотка
1:32,1:64
1:256
2
Бинагади
Домашняя птица
Мозг,
трахея,
легкие
и
кишечник
Птицефабрика
“Горадил”
Гобустан
Хачмаз
Птицефабрика
“Шамкир”
Абшерон
Джалилабад
Домашняя птица
сыворотка
1:128, 1:512
Домашняя птица
Домашняя птица
Домашняя птица
сыворотка
сыворотка
сыворотка
1:128, 1:512,1:256
1:32, 1:64
1:32, 1:64
Домашняя птица
Дикая птица
сыворотка
сыворотка
1:32, 1:64
1:32,1:64
1:32,1:64
Все пробы крови оказались положительными, наиболее высокий титр антител
наблюдали в пробах сыворотки крови, полученной из Гобустана.
При проведении ИФА применяли набор FLOCKSCREEN НБ - ЕЛИЗА кит - быстрый,
простой и чувствительный метод для выявления антител в сыворотке птиц или яичном
желтке.
Микротитерные плашки наслоены не вирулентным антигеном. Разведенные образцы
остаются в лунках и образуют комплекс антител с антигеном. Не связанный материал
промывается и добавляется коньюгат, который соединяется с комплексом.
Не связанный коньюгат промывается и добавляется ПМП субстрат. Цвет зависит от
присутствующего комплекса в сыворотке.
Результаты ИФА учитывали с помощью спектрофотометра «БИОТЕК». Сыворотки с
титром ниже 1:400 считали отрицательным, 1:400-1:1528- низкоположительными, выше
1:1528 – положительными.
Для подтверждения полученных результатов образцы, полученные из внутренних
органов, мазки и т.д. исследовали в полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Сравнительный анализ данных РЗГА и ИФА свидетельствует о положительной корреляции
результатов, полученных с помощью этих двух методов.
Полимеразная цепная реакция в реальном времени – отличается от других реакций
высокой чувствительностью и специфичностью. В отличие от вирусологического метода за
короткое время дает возможность, получит достоверный ответ.
В Реал-Тайм ПЦР для обнаружения синтеза используют флюарисцирующие зонды.
Экстракция РНК:
Рибонуклеиновую кислоту выделяли из разных образцов (крови, органов, ткани,
фекалий, мазков и т.д.), полученных от инфицированных животных. РНК отделяли от
остальных компонентов (например: другие органические вещества и т.д.)
Для экстракция РНК использовали следующие наборы
Qiagen RNeasy кит (мазки)
Qiagen QIAmp вирус РНК мини кит (чистые органы)
ПЦР в режиме реального времени следит за повышением излучаемой
флюоресценции в каждом цикле реакции. Результаты ПЦР в режиме реального времени
визуально просматривали на амплификационном графике:
Интерпретацию результатов проводили по графику. Как видно из схемы, пробы
поднялись между 20-25 циклами, что указывает на положительные результаты в четырех
пробах. Негативные пробы представлены прямыми горизонтальными линиями, из-за
отсутствия флюоресценции.
3
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Сравнительная оценка методов микробиологической диагностики Ньюкаслской болезни
показала специфичность и корреляцию всех методов исследования (РЗГА, ИФА, ПЦР).
Однако наиболее ускоренным, чувствительным и специфическим методом диагностики
болезни Ньюкасла является ПЦР.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Агаева Э.М., Зейналова. Ш.К. Болезнь Ньюкасла в Азербайджане, эпизоотология //
Аграрная наука Азербайджана2, стр. , 2011, c. 130-133. Agayeva E.M Zeynalova., Sh,K, Newcastle
Disease in Azerbaijan, Epizootology // Agrarnaia Nauka Azerbaijana, 2, 2011,pp130-133 (in
Russian).
2. Старов С.К. Болезнь Ньюкасла: ее форма, проявление и диагностика //
Животноводство России, 2, 2002, c.32-33. Starov S.K. Newcastle Disease: it's Form, Development
and Diagnostics // Jivotnovodstvo Rosii, 2, 2002, pp. 32-33 (in Russian).
3. Alexander DJ. Newcastle Disease Virus - An Avian Paramyxovirus. In: Newcastle Disease,
Alexander DJ ed. // Kluwer Academic Publishers: Boston, MA, 1988, pp 11-22.
4. Сюрин В.Н, Белоусов Р. В, Фомин Н. Б и др. Диагностика вирусных болезней
животных // “Агропромиздат”, M., 1991, 527 c. Syurin V.N., Belousov P.Y., Fomin N.B. Virus
Disease Diagnostics of Animals // “Agropromizdat”, Moscow, 1991, 527 pp. (in Rusian).
5. CEC Council Directive 92/66/EEC of 1992 Introducing Community Measures for the
Control of Newcastle Disease // Official Journal of the European Communities, 1992, 260 pp.
COMPARATIVE ASSESSMENT OF MICROBIAL ANALYSIS
IN DIAGNOSIS OF NEWCASTLE
NEWCASTLE DISEASE
Sh.K.Zeynalova, E.M.Agayeva
The detection of specific antibodies to Newcastle disease virus is a routine activity of avian virology
laboratories. Generally speaking, serological assays are carried out to evaluate the immune response
following vaccine administration or to detect seroconversion following natural infection. We used
quantative assay is the HI test, ELISA, PCR and virus isolation in embryonated eggs.
4