018218 B1 018218 B1 (11) 018218

Евразийское
патентное
ведомство
(19)
(11)
018218
(13)
B1
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45)
Дата публикации и выдачи патента
2013.06.28
(21)
Номер заявки
200700660
(22)
(51) Int. Cl. A61K 35/34 (2006.01)
A61K 47/00 (2006.01)
A23B 4/00 (2006.01)
C12N 13/00 (2006.01)
C12N 5/07 (2010.01)
Дата подачи заявки
2004.09.17
(54)
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЯСНЫХ ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ НЕЧЕЛОВЕЧЕСКОГО
ПРОИСХОЖДЕНИЯ IN VITRO И ПРОДУКТЫ, ПОЛУЧЕННЫЕ ЭТИМ СПОСОБОМ
018218
Изобретение относится к способу получения мясных продуктов питания нечеловеческого
происхождения in vitro и мясным продуктам питания нечеловеческого происхождения, полученным
этим способом. Способ получения мясных продуктов питания нечеловеческого происхождения
in vitro включает культивирование нечеловеческих мышечных клеток с нечеловеческими
адипоцитами или без них ex vivo с последующим посевом их на структуру подложки и
выращиванием с получением мясного продукта или культивирование нечеловеческих хрящевых
клеток ex vivo, затем посев их на структуру подложки и культивирование с нечеловеческими
мышечными клетками или нечеловеческими мышечными клетками и адипоцитами на структуре
подложки или вокруг нее с последующим выращиванием их с получением мясного продукта.
Мясной продукт питания нечеловеческого происхождения, полученный способом по изобретению,
включает нечеловеческие мышечные клетки и одну или более нечеловеческих клеток, выбранных
из группы, состоящей из адипоцитов и клеток хряща, выращенных ex vivo.
B1
B1
(57)
018218
(56) WO-A1-9931223
(43) 2007.10.26
US-B1-6592623
(86) PCT/US2004/030558
US-B1-6709860
(87) WO 2006/041429 2006.04.20
US-B1-6379962
(71)(72)(73) Заявитель, изобретатель и патентовладелец:
US-A-5746649
ВЕЙН ДЖОН (US)
US-A-5863531
GRIMALDI et al. Trans-Differentiation of
(74) Представитель:
Myoblasts to Adipoblasts: Triggering Effects of
Дементьев В.Н. (RU)
Fatty Acids and Thiazolidinediones. Prostaglandins,
Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 1997, vol. 57,
No. 1, pages 71-75, entire document
018218
Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к получению и заготовке мясных продуктов питания. В частности, оно относится к мясным продуктам питания, полученным методом рекомбинантной ДНК (генной
инженерии).
Предпосылки создания изобретения
Мясные продукты, такие как говядина, свинина, баранина, мясо птицы или рыба, являются желательными продуктами питания. Мясные продукты в настоящее время получают из целых животных, что
является в высшей степени неэффективным методом получения, так как значительная часть всего производимого сельским хозяйством зерна потребляется скорее животными, нежели человеком. В Соединённых Штатах, например, в корм скоту идёт около 70% всей пшеницы, кукурузы и других получаемых
зерновых. Кроме того, чтобы получить один фунт говядины, тысячи фунтов воды требуются животным
для питья и для того, чтобы вырастить пищу для скота. При этом во всём мире, по некоторым подсчётам,
свыше 800 миллионов человек не имеют полноценного питания, а 50000 человек умирают от голода каждый день.
Современные методы получения мяса также являются вредными для окружающей среды. Леса сокращаются со скоростью около 500 квадратных футов леса на каждый фунт выращенной говядины. Подобным же образом, современные методы добычи морской флоры и фауны становятся настолько эффективными, что рыбные запасы истощаются. Виды, бывшие когда-то обычными, сейчас подвергаются
опасности или вымирают.
Современные усилия учёных по решению этих проблем сосредоточены на повышении эффективности разведения или выращивания скота. Например, гормоны роста использовались для того, чтобы поголовье росло быстрее и, следовательно, потребляло меньше зерновых и воды. Гормоны роста обычно инъецируют животному, но также разработаны новые способы введения гормона роста методами генной
инженерии, например трансгенные методы или клонирование целого животного. Тем не менее, современные методы получения мяса требуют воды, зерновых и земли для разведения скота.
Другая проблема современных методов получения мяса относится к загрязнению пищи. Каждый
год в среднем у каждого американца бывает приступ тошноты, а 9000 человек умирают от того, что они
съели. Современные методы контроля правительственных организаций за загрязнением в пище заключаются в проверке мяса в процессе переработки. Однако USDA (Министерство сельского хозяйства
США) и FDA (Управление по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами США)
редко контролируют фермерские хозяйства, где возникают патогены, так как они не имеют распорядительных полномочий в отношении этих хозяйств. Тем не менее, за исключением Е.coli 0156: Н7, опасные
бактерии по закону считаются "присущими" сырому мясу (собственными бактериями сырого мяса). Однако "собственные бактерии" двух родов - рода кампилобактер и рода сальмонелла - ответственны за
80% всех болезней и за 75% всех смертей, вызванных потреблением мяса и птицы.
По имеющимся сведениям, в птицепромышленности, например, разрешается проверять позитивную
реакцию на сальмонеллу у 25% цыплят-бройлеров и 45% куриного фарша. По оценкам Центра контроля
заболеваний, кампилобактером инфицировано 70-90% всех цыплят. Инфицирование кампилобактером
вызывает крамп, кровавую диарею и лихорадку. Каждый год в Соединённых Штатах заражение кампилобактером является причиной 800 смертей. Инфекции кампилобактера могут также вызвать синдром
Гийена-Барре, болезнь, которая требует интенсивного лечения в течение нескольких недель. Заболеваемость и смерть, вызванные действием этих бактерий, могут повыситься с появлением штаммов, более
устойчивых к антибиотикам. Это заставило некоторых учёных поставить под сомнение продолжительное
применение антибиотиков в качестве пищевой добавки для скота.
Следовательно, существует необходимость в получении мясных продуктов питания, более эффективный, безопасный и более здоровый, чем современные методы.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к полученным генной инженерией из тканей мясным продуктам
питания нечеловеческого происхождения и способам получения таких мясных продуктов. В одном варианте изобретения способ получения мясных продуктов питания нечеловеческого происхождения in vitro
включает стадии совместного культивирования нечеловеческих мышечных клеток и нечеловеческих
адипоцитов ех vivo; посева нечеловеческих мышечных клеток и нечеловеческих адипоцитов на структуру подложки и выращивания мышечных клеток и нечеловеческих адипоцитов с получением мясного
продукта. Во втором варианте изобретения способ получения мясных продуктов питания нечеловеческого происхождения in vitro включает стадии культивирования нечеловеческих мышечных стволовых клеток ex vivo; посева нечеловеческих мышечных стволовых клеток на структуру подложки; обработки нечеловеческих мышечных стволовых клеток жирными кислотами с трансдифференцировкой нечеловеческих мышечных стволовых клеток в адипоциты и выращивания клеток с получением мясного продукта.
В третьем варианте изобретения способ получения мясных продуктов питания нечеловеческого происхождения in vitro включает стадии культивирования нечеловеческих хрящевых клеток ex vivo; посева
нечеловеческих хрящевых клеток на структуру подложки; культивирования а) нечеловеческих мышечных клеток или b) нечеловеческих мышечных клеток и адипоцитов с нечеловеческими хрящевыми клет-1-
018218
ками на структуре подложки или вокруг нее и выращивания нечеловеческих мышечных клеток или нечеловеческих мышечных клеток и адипоцитов с получением мясного продукта. В предпочтительном варианте изобретения получаемый мясной продукт практически не содержит никаких микробных или паразитарных загрязнений. Другой вариант изобретения относится к мясному продукту питания нечеловеческого происхождения, полученному способом по изобретению и включающему нечеловеческие мышечные клетки и одну или более нечеловеческих клеток, выбранных из группы, состоящей из адипоцитов и клеток хряща, выращенных ex vivo. В другом варианте изобретения мясной продукт содержит мышечные клетки, которые подвергались воздействию электрического тока или тока осцилляции для придания мясному продукту текстуры, которая более сходна с естественным мясом.
Общее описание предпочтительных вариантов изобретения
Как правило, мясные продукты получают из мышечных тканей животных. Продавцы мяса отделяют
соответствующие куски мяса, птицы, баранины, рыбы или свинины, чтобы продать в виде стейка, цыплячьих грудок, бараньих отбивных, филе рыбы, свиных отбивных и т.п. Мясные продукты также включают продукты переработки мяса, такие как мясной фарш, из которого можно приготовить мясные фрикадельки (тефтели), котлеты для гамбургера, рыбные тефтели, колбасу, салями, болонскую копчёную
колбасу, ветчину и т.д. Мясные продукты также могут включать мышечные ткани или мясо, в которое
можно делать приправленным или сушёным, например вяленое мясо.
В одном варианте настоящее изобретение включает способ получения мясных продуктов, которые
можно использовать для потребления. Способ может включать культивирование мышечных стволовых
клеток in vitro и возможность дифференцировки этих клеток в специфические типы мышечных клеток,
такие как клетки скелетных мышц и клетки гладких мышц, ex vivo. Мышечные клетки могут быть мышечными клетками любых отличных от человека животных, которые идут в пищу человеку, таких как
млекопитающие (например, крупный рогатый скот, буйволы, свиньи, овцы, козы и т.д.), птицы (например, цыплята, утки, индейки, фазаны и т.д.), рыба (например, рыба-сабля, лосось, тунец, морской окунь,
форель, сом (зубатка) и т.д.), беспозвоночные (омар, краб, креветки, двустворчатые моллюски, устрицы,
мидии, морские ежи и т.д.), рептилии (например, змеи, аллигаторы, черепахи и т.д.) и земноводные (например, лягушачьи лапки). Предпочтительно мышечные клетки получают из плюрипотентных эмбриональных мезенхимальных стволовых клеток, которые дают мышечные клетки, жировые клетки, клетки
костей и клетки хряща. Мышечные клетки могут также образовываться из тотипотентных эмбриональных стволовых клеток, таких как клетки на стадии бластоцисты, оплодотворённые яйца, плацента или
пупочный канатик этих животных.
Мышечные клетки можно вырастить в культуре в мышечные ткани, которые связаны со структурой
подложки, такой как двух- или трёхмерная структура клеточного каркаса или подложки. Мышечные
клетки можно выращивать на двухмерной структуре подложки, такой как образующиеся в чашке Петри
несколько слоев клеток, которые можно собрать и переработать для потребления. Другие примеры подложки с двухмерной структурой могут включать пористые мембраны, которые способствуют диффузии
питательных веществ из культуральной среды на одной стороне мембраны на другую сторону, где прикреплены клетки. В таких условиях культивирования дополнительные слои клеток можно получать экспозицией клеток с культуральными средами с обеих сторон мембраны, т.е. клетки получают питательные
вещества диффузией с одной стороны мембраны, а также из культуральных сред, покрывающих клетки,
растущие на мембране.
Мышечные клетки можно также выращивать на подложке с трёхмерной структурой, вокруг или
внутри неё. Структуру подложки при желании можно сделать различных размеров, очертаний и форм,
чтобы создать очертания и форму для выращивания мышечных клеток и уподобить различным типам
мышечных тканей, таким как стейк, вырезка, рулька, куриная грудка, куриная ножка, бараньи отбивные,
рыбное филе, хвост омара и т.п. Конструкцию подложки можно сделать из природных или синтетических биоматериалов, которые предпочтительно являются нетоксическими, так чтобы они не навредили
при проглатывании. Природные биоматериалы могут включать, например, коллаген, фибронектин, ламинин или другие внеклеточные матрицы. Синтетические биоматериалы могут включать, например,
гидроксиапатит, альгинат, полигликолевую кислоту, полимолочную кислоту или их сополимеры. Структура подложки может быть в виде твёрдой или полутвёрдой конструкции.
Для того чтобы достичь оптимального роста клеток и тканей, структура подложки предпочтительно
имеет высокую пористость, чтобы создать максимальную площадь поверхности, к которой прикреплены
клетки. Трёхмерная структура подложки может быть также формованной, чтобы включить разветвлённую сосудистую сеть, обеспечивая доставку питательных веществ в клетки и возвращая метаболиты из
клеток во внутренней массе мясного продукта. В этом конкретном варианте изобретения разветвлённая
сосудистая сеть может быть съедобна за счёт использования нетоксических натуральных или синтетических биоматериалов, указанных выше. Кроме того, структура подложки может также включать адгезивные пептиды, молекулы клеточной адгезии или другие факторы роста, ковалентной или нековалентной
связью ассоциированные со структурой подложки. Примеры пептидов включают последовательности,
такие как Arg-Gly-Asp или Arg-Glu-Asp-Val. Niklason, L., et al., Advances in Tissue Engineering of Blood
Vessels and Other Tissues, Transplant Immunology. 5(4):303-306 (1997).
-2-
018218
С другой стороны, условия культивирования этих мышечных клеток могут включать статические
условия, перемешивание или динамические условия проточного культивирования. Для увеличения продукции предпочтительным методом является использование биореактора, который даёт больший объём
клеток и даёт возможность лучше контролировать поток питательных веществ, газов, метаболитов и регуляторных молекул. Кроме того, биореакторы могут обеспечить физические и механические импульсы,
такие как сжатие, для того, чтобы стимулировать клетки продуцировать специфические биомолекулы.
Vacanti, J., et al., Tissue Engineering: The Design and Fabrication of Living Replacement Devices for Surgical
Reconstruction and Transplantation, Lancet. 354 Suppl. 1, pSI32-34 (1999).
В другом варианте изобретения мясные продукты из мышечных клеток, выращенных ex vivo, могут
включать жировые клетки также любого отличного от человека животного. Более жирное мясо обычно
вкуснее, но при более высоком содержании жира возникает больший риск вредных последствий для здоровья, таких как сердечное заболевание. Поэтому отношение мышечных клеток к жировым клеткам
можно регулировать in vitro, чтобы получать мясные продукты с оптимальным вкусовым эффектом и
оптимальным воздействием на здоровье. Регулировать можно, контролируя соотношение мышечных и
жировых клеток, которые изначально засевают в культуре, и/или изменяя, при желании, концентрации и
соотношение факторов роста или факторов дифференцировки, которые действуют на мышечные клетки
или жировые клетки.
В другом варианте изобретения хрящ из хондроцитов может сначала образовывать нижерасположенный слой подложки или формировать структуру вместе со структурой подложки. Затем мышечные
клетки или жировые клетки или и те и другие, можно засевать на слой хондроцитов. Взаимодействие
мышечных клеток и хондроцитов может далее обеспечивать необходимые регуляторные сигналы, необходимые для образования ткани. Примеры мясных продуктов, содержащих мышечные и хрящевые клетки, включают куриные грудки или свиную грудинку.
В предпочтительном варианте изобретения для культивирования мышечных клеток можно применять асептические методы, при этом получают мясные продукты, практически не содержащие вредных
микробов, таких как бактерии, грибки, вирусы, прионы, простейшие или их комбинацию. Вредные микробы могут включать патогенные микроорганизмы, такие как сальмонелла, кампилобактер, Е.coli
0156:H7 и т.д., кроме того, мышечные клетки, выращенные в культуре, могут практически не содержать
паразитов, таких как ленточные черви, которые инфицируют мышцы целых животных и которые переносятся человеку с мясом, подвергнутым недостаточной тепловой обработке. Асептические методы
можно также использовать при упаковке мясных продуктов, когда они сходят с биологической линии
получения. Такую гарантию качества можно контролировать стандартными анализами на микроорганизмы или химические вещества, уже известные в уровне техники. "Практически не содержат (свободны)" означает, что концентрация микробов или паразитов ниже клинически значимого уровня примесей,
т.е. ниже уровня, при котором попадание внутрь приведёт к заболеванию или неблагоприятно подействует на здоровье.
В другом предпочтительном варианте изобретения мясной продукт, полученный из мышечных клеток, выращенных ex vivo, можно подвергать действию электрического тока или тока осцилляции. В отличие от мышечных тканей целого животного, мышечные ткани, выращенные ex vivo или in vitro, никогда не выполняли физические действия (например, никогда не использовались для движения ног). Поэтому воздействие на мышечные клетки, мышечную ткань или мясные продукты in vitro электрического
тока или тока осцилляции может имитировать упражнение (физическое действие) и увеличить сходство
структуры мяса, выращенного ex vivo, и мяса целых животных. Электрический ток и ток осцилляции
могут также повысить скорость роста мышечных клеток ex vivo. Электрический ток или ток осцилляции
можно прилагать к мышечным стволовым клеткам или к мышечным клеткам после их дифференцировки
из стволовых клеток.
В другом варианте изобретения для повышения питательной ценности мяса можно добавлять другие питательные вещества, такие как витамины, которые обычно отсутствуют в мясных продуктах, полученных от целого животного. Это можно осуществлять либо непосредственно добавляя питательные вещества в среду для выращивания, либо методами генной инженерии (рекомбинантной ДНК). Например,
ген или гены ферментов, отвечающих за биосинтез конкретного витамина, такого как витамин D, А или
различных комплексов витамина В, можно трансфецировать в культивируемые мышечные клетки для
продуцирования конкретного витамина.
В другом варианте изобретения методами генетики можно также вводить в мышечные клетки регуляторные факторы, факторы роста или другие генные продукты. Эти факторы, известные как миогенные
регуляторные факторы ("MRF"), могут стимулировать и регулировать рост мышц in vivo, но обычно не
могут продуцироваться в мышечных клетках in vivo или in vitro. Таким образом, экспрессирующие миогенные регуляторные факторы в культивируемых мышечных клетках могут повысить продукцию мышечных клеток in vitro.
В другом варианте изобретения мясные продукты, полученные из мышечных клеток in vitro, могут
включать различные продукты переработки мясных продуктов. Эти продукты переработки можно приготовить, например, измельчая или разрезая мышечные ткани, выращенные in vitro и смешанные с соот-3-
018218
ветствующими приправами, получая мясные и рыбные фрикадельки, котлеты для гамбургера и т.д. Продукты переработки можно приготовить из слоев мышечных клеток, разрезанных или приправленных
специями, например вяленое мясо, ветчину, колбасу Болонья, салями и т.д. Таким образом, мясные продукты по настоящему изобретению можно использовать для получения любого продукта, ведущего происхождение из мяса животного.
Нижеприведённые примеры иллюстрируют, как специалист в данной области техники может применять настоящее изобретение для получения мясных продуктов in vitro. Методы биологии клетки, культивирования клеток и иммуногистохимии, не представленные подробно в данном описании, уже достаточно полно представлены в научной литературе.
Пример I.
Данный пример иллюстрирует выделение плюрипотентных мезенхимальных стволовых клеток с
целью применения при получении мясных продуктов in vitro. Мезенхимальные стволовые клетки превращаются в мышечные клетки (миоциты), клетки жировой ткани (адипоциты), клетки костной ткани
(остеоциты) и клетки хряща (хрондоциты). Мезенхимальные стволовые клетки можно иссекать и выделить из эмбриональных тканей эмбриона любого отличного от человека животного. У крупного рогатого
скота, например, эмбриональные мезенхимальные ткани, богатые плюрипотентными мышечными стволовыми клетками, предпочтительно выделяют из эмбрионов на 30-40 день или ранее. После иссечения
эмбриональные ткани можно разрезать на маленькие кусочки размером примерно 1×1 мм, в фосфатносолевом буферном растворе ("PBS") рН 7,45. От 5 до 10 кусочков разрезанной ткани можно инкубировать в 300 мкл 0,25% раствора трипсина и 0.1% раствора EDTA в PBS в течение 30 мин при 37°C и при
осторожном перемешивании. Затем ткани можно оставить выпадать на дно пробирки под действием силы тяжести или при осторожном центрифугировании. Супернатант, содержащий раствор трипсин/EDTA,
можно затем отсосать и заменить на 300 мкл 0,1% раствора коллагеназы в PBS на время от 10 до 30 мин
при 37°C. При желании, можно повторить несколько циклов расщепления коллагеназой. В зависимости
от вязкости раствора, так как ДНК выделяется из повреждённых клеток, между циклами к раствору коллагеназы можно добавить 40 мкл ДНКазы I в виде раствора 1 мг/мл в PBS.
Реакцию можно прервать, добавляя среду, такую как DMEM или среда Хэма (Ham) F-12 или обе, в
соотношении 1:1 (Life Technologies, Rockville, Maryland), которая дополнена 10 мМ Hepes, 2 мМ
L-глутамина (Sigma-Aldrich), 10-20% термоинактивированной фетальной телячьей или бычьей сывороткой (Hyclone Laboratories, Logan, Utah), пенициллином 100 Ед./мл и стрептомицином 100 нг/мл ("полная
среда"). Клетки можно полностью диссоциировать, осторожно набирая ткани в пипетку и спуская их, а
затем отмывая клетки в полной среде один или два раза с применением центрифуги. Затем клетки можно
поместить в чашку Петри подходящего размера, которая может быть покрыта плёнкой натуральных
биоматериалов (например, коллагена, фибронектина, ламинина или другими внеклеточными матрицами)
или синтетических биоматериалов (например, гидроксиапатита, альгината, полигликолевой кислоты,
полимолочной кислоты или их сополимеров) или и тем и другим, и можно выращивать при 37°C и уравновешивать с помощью 5% CO2.
Пример II.
После выделения мезенхимальных стволовых клеток их можно обогащать миобластами или мышечными стволовыми клетками в культуре. Сначала клетки можно по отдельности поместить в различные чашки Петри после диссоциации и отмывания, описанных в примере I. В чашке Петри диаметром
60 мм клетки можно сначала инкубировать в полной среде в течение 2-4 ч. В течение этого времени эпителиальные клетки стремятся быстро прикрепиться к чашке Петри, тогда как миобласты остаются в супернатанте. Затем супернатант можно собирать, а миобласты можно поместить в другую чашку Петри,
покрытую плёнкой натуральных или синтетических биоматериалов таким образом, как описано в примере I. Миобласты можно обогащать, дополняя среду для выращивания факторами роста, такими как фактор роста скелетных мышц, простагландин F2α ("PGF2α") и инсулиноподобный фактор роста I ("IGF-I").
Далее, миобласты можно дифференцировать в специфические миоциты или мышечные клетки,
культивируя миобласты в полной среде или в минимальных средах (например, полная среда минус фетальная телячья сыворотка), дополненных специфическими мышечными факторами роста или дифференцировки, такими как PGF2α, в концентрациях от 24 до 28 пг/мл, и инсулином 10-6-10-5 М. Для более
близкой имитации in vivo мышечных клеток, которые обычно иннервируют нейроны, культуральную
среду можно также дополнить соответствующими нейротрансмиттерами, такими как ацетилхолин.
Пример III.
Или же миобласты можно обогащать при использовании тотипотентных эмбриональных стволовых
клеток. Тотипотентные клетки могут быть получены из in vitro оплодотворённых яиц животного при использовании методов оплодотворения in vitro, из стволовых клеток, присутствующих в пупочных канатиках или плаценте, или из эмбриональных стволовых (ЭС, ES) клеток, выделенных из клеток на стадии
бластоцисты. Клетки ES можно, например, собирать, осторожно диссоциируют с помощью трипсина и
культивируют in vitro с рекомбинантным фактором, ингибирующим лейкемию (Chemocon, San Diego,
CA), и фидерными клетками, такими как эмбриональные фибробласты с блоком роста. Эти тотипотент-4-
018218
ные клетки можно обрабатывать факторами роста, такими как PGF2α или IGF, для индукции дифференцировки клеток в миобласты.
Пример IV.
Миобласты или миоциты (дифференцированные мышечные клетки) можно идентифицировать
стандартными методами иммуногистохимии или in situ гибридизации. Коротко говоря, миобласты или
миоциты, выращенные в культуре, можно перенести на предметные стёкла, покрытые подходящей внеклеточной матрицей, описанной выше. Эти клетки можно выращивать до заданного количества и заданной дифференцировки в описанных выше условиях. После достаточного периода роста и дифференцировки клетки можно фиксировать 4% формальдегидом. Если следует использовать маркёры или нуклеотидные зонды внутриклеточных антител, клеточные мембраны можно пермеабилизовать с помощью 1%
NP-40 или Тритона-Х. Антитела к маркёрам, специфическим к миобластам или миоцитам, таким как
миозин, титин, альфа-актинин, выпускаемым Sigma, можно использовать для идентификации клеток
стандартными методами иммуногистохимии с флуоресцентными маркёрами. Или же для гибридизации
in situ можно также использовать зонды одноцепочечной РНК или ДНК для этих маркёров.
Кроме того, когда мышечные клетки прикреплены к трёхмерной структуре подложки, описанной
ниже, их можно быстро заморозить, изготовить срезы и идентифицировать, используя антительные маркёры, такие как антитела к миозину, титину, 12101, тропонину Т, альфа-актинину от фирмы Sigma.
Пример V.
Двух- или трёхмерные каркасы или подложки можно изготовить из натуральных биоматериалов
(например, каллагена, фибронектина, ламинина или другой внеклеточной матрицы) или синтетических
биоматериалов (например, плёнкой гидроксиапатита, альгината, полигликолевой кислоты, полимолочной кислоты или их сополимеров) или и тем и другим. Предпочтительно трёхмерные структуры создают
с разветвлёнными путями, по которым питательные вещества и культуральные среды достигают внутренней массы образующихся мышечных тканей. Примеры материалов и методов создания этих каркасов
приводятся в патенте США 5686091, озаглавленном "Biodegradable Foams For Cell Transplantation"; патенте США 5863984, озаглавленном "Biostable Porous Material Comprising Composite Biopolymers"; патенте США 5770417, озаглавленном "Three-Dimensional Fibrous Scaffold Containing Attached Cells for
Producing Vascularized Tissue in vivo", и патенте США 5916265, озаглавленном "Method of Producing a
Biological Extracellular Matrix for Use as a Cell Seeding Scaffold and Implant." Эти патенты вводятся в данное описание ссылкой во всей полноте.
Структуру подложки предпочтительно "лепят" различных размеров, очертаний и форм, которые
способствуют росту мышечных тканей, сходных с различными мясными продуктами, такими как стейк,
вырезка, рулька, куриная грудка, куриная ножка, бараньи отбивные, рыбное филе, хвост омара и т.п.
Пример VI.
Адипоциты, хондроциты и остеобласты, - все способны образовываться дифференцировкой плюрипотентных мезенхимальных стволовых клеток или тотипотентных эмбриональных стволовых клеток.
Стволовые клетки можно выделять, как описано в примере I или III. Стволовые клетки можно культивировать в DMEM, или в среде Хэма F-12, или в обеих при соотношении 1:1. Среда может быть дополнена
тиреоидным гормоном, трансферрином, инсулином, а также другими факторами роста, такими как инсулиноподобный фактор роста (IGF), основной фактор роста фибробластов и гормон роста.
Для адипоцитов дифференцировку можно проводить обработкой стволовых клеток морфогенетическими белками кости ("BMP"), такими как ВМР-4 и ВМР-2, которые, как известно, индуцируют коммитирование в адипоцитарную линию дифференцировки. Ahrens et al., Expression of human bone
morphogenetic proteins-2 or -4 in murine mesenchymal progenitor C3H10T1/2 cells induces differentiation into
distinct mesenchymal cell lineages, DNA Cell Biol., 12:871-880 (1993); Wang et al., Bone Morphogenetic
protein-2 causes commitment and differentiation in C3H10T1/2 and 3T3 cells, Growth Factors. 9:57 (1993).
Помимо BMP, дифференцировку адипоцитов можно повысить с помощью агониста рецептора, активированного пролифератором пероксисомы гамма (PPAR гамма), такого как BRL49653 (розиглитазон).
Sottile and Seuwen, Bone morphogenetic protein-2 stimulates adipogenic differentiation of mesenchymal precursor cells in synergy with BRL 496539 (rosiglitzaone), FEBS Lett., 475(3):201-204 (2000).
В некоторых ситуациях можно даже индуцировать трансдифференцировку миобластов в адипобласты (предшественники адипоцитов), обрабатывая миобластные клетки или сателлитные клетки мышц
длинноцепными жирными кислотами ("LCFA") или тиазолидиндионами или тем и другим. Grimaldi et al.,
Trans-differentiation of myoblasts to adipoblasts: triggering effects of fatty acids and thiazolidinediones,
Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids, 57(1):71-75 (1997); Teboul et al., Thiazolidinediones and fatty acids
convert myogenic cells into adipose-like cells, J. Biol. Chem. 270(47):28183-28187 (1995). Эти материалы
вводятся в данное описание ссылкой во всей полноте.
Таким образом, мясные продукты с заданным количественным содержанием жира можно получать,
засевая и совместно культивируя мышечные клетки и адипоциты в определённом соотношении. Или ж,
стволовые клетки можно оставлять дифференцироваться сначала в миобласты, а затем, позднее, при желании, можно добавлять LCFA или тиазолидиндионы в различных концентрациях и с различным време-5-
018218
нем экспозиции для трансдифференцировки миобластов в адипоциты. Кроме того, рост мышечных клеток и жировых клеток можно регулировать, контролируя концентрацию факторов роста и дифференцировки. Например, если в конечном мясном продукте требуется меньше жировых клеток, то в культуру
можно добавлять меньшие концентрации BMP факторов, тогда как для промотирования роста мышечных клеток можно добавлять более высокие концентрации PGF2α и/или инсулина.
Пример VII.
Хондроциты, или хрящевые клетки, также можно выделять из коленного сустава или грудной клетки. Используя методы, аналогичные описанным в примере I, ткань, иссечённую из коленного сустава или
грудной клетки, можно измельчить, расщепить коллагеназой и отмыть полной средой. Затем клетки
можно выращивать отдельно, чтобы повысить чистоту хондроцитов.
Известно, что хондроциты дифференцируются в ответ на механическое воздействие. Поэтому
предпочтительно клетки можно подвергать стрессу в потоке со сдвигом, как описано в патенте США
5928945, озаглавленном "Application of Shear Flow Stress to Produce Cartilage".
Сначала первый слой клеток подложки в трёхмерном каркасе могут образовывать хондроциты. Затем на слой хондроцитов можно засевать миобластные или адипоцитные клетки и выращивать до нужного размера. Слой хондроцитов сам по себе может обеспечить дополнительную адгезию или факторы роста мышечных клеток.
Пример VIII.
Мышечные клетки, выращенные in vitro, отличаются от мышечных клеток, выращенных in vivo,
тем, что in vivo клетки используются при тренировке или при движениях тела. Как и мышцы, используемые in vivo, мышечные клетки в конечностях сокращаются и расслабляются в соответствии с движением
конечностей. Следовательно, для того чтобы наиболее похоже имитировать рост мышечных клеток in
vivo, клетки, выращенные in vitro, можно подвергнуть действию электрического тока или тока осцилляции либо действию пульсирующего электрического тока или тока осцилляции, для того чтобы вызвать
сокращение мышечных клеток. Для подачи слабого тока электроды можно погружать в культуральные
среды. Или же структуру подложки можно покрывать плёнкой токопроводящих материалов. Примеры
материалов, проводящих электрический ток, и способ нанесения их на подложку описаны в патенте
США 5843741, озаглавленном "Method for Altering the Differentiation of Anchorage Dependent Cells on an
Electrically Conducting Polymer".
Представленные примеры иллюстрируют методы получения мясных продуктов ех vivo. Они предлагаются только в качестве примеров, а не для ограничения изобретения этими примерами. Понятно, что
модификация и объединение вышеприведённых примеров не являются отступлением от сущности изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения мясных продуктов питания нечеловеческого происхождения in vitro, включающий следующие стадии:
совместное культивирование нечеловеческих мышечных клеток и нечеловеческих адипоцитов ex
vivo;
посев нечеловеческих мышечных клеток и нечеловеческих адипоцитов на структуру подложки и
выращивание мышечных клеток и нечеловеческих адипоцитов с получением мясного продукта нечеловеческого происхождения.
2. Способ по п.1, в котором нечеловеческие мышечные клетки происходят из нечеловеческих плюрипотентных эмбриональных мезенхимальных стволовых клеток или нечеловеческих тотипотентных
эмбриональных стволовых клеток.
3. Способ по п.1, в котором стадия выращивания нечеловеческих мышечных клеток включает выращивание нечеловеческих мышечных стволовых клеток и дифференцировку нечеловеческих мышечных
стволовых клеток в различные типы нечеловеческих мышечных клеток.
4. Способ по любому из пп.1-3, дополнительно включающий воздействие на нечеловеческие мышечные клетки и нечеловеческие адипоциты электрического или осциллирующего тока, которое придает
нечеловеческому мясному продукту текстуру, которая более сходна с естественным мясом.
5. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий добавление питательных веществ для включения в состав нечеловеческих мясных продуктов.
6. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором нечеловеческие мышечные клетки
происходят из животных, выбранных из группы, состоящей из млекопитающих, птиц, рыб, беспозвоночных, рептилий и земноводных.
7. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором нечеловеческий мясной продукт, по
существу, свободен от вредных микробных загрязнений.
8. Способ получения мясных продуктов питания нечеловеческого происхождения in vitro, включающий следующие стадии:
культивирование нечеловеческих мышечных стволовых клеток ex vivo;
-6-
018218
посев нечеловеческих мышечных стволовых клеток на структуру подложки;
обработка нечеловеческих мышечных стволовых клеток жирными кислотами с трансдифференцировкой нечеловеческих мышечных стволовых клеток в адипоциты и
выращивание клеток с получением мясного продукта нечеловеческого происхождения.
9. Способ получения мясных продуктов питания нечеловеческого происхождения in vitro, включающий следующие стадии:
культивирование нечеловеческих хрящевых клеток ex vivo;
посев нечеловеческих хрящевых клеток на структуру подложки;
культивирование а) нечеловеческих мышечных клеток или b) нечеловеческих мышечных клеток и
адипоцитов с нечеловеческими хрящевыми клетками на структуре подложки или вокруг нее и
выращивание нечеловеческих мышечных клеток или нечеловеческих мышечных клеток и адипоцитов с получением мясного продукта нечеловеческого происхождения.
10. Способ по п.9, в котором нечеловеческие хрящевые клетки подвергают воздействию механического усилия, предпочтительно усилию потока сдвига.
11. Способ по п.1, в котором структура подложки представляет собой:
(a) двухмерную структуру подложки или
(b) трехмерную структуру подложки.
12. Способ по п.1, в котором структура подложки изготовлена из природного или синтетического
биоматериала, который безопасен для проглатывания.
13. Способ по п.1, в котором структура подложки содержит хрящ как слой подложки, происходящий из хондроцитов.
14. Мясной продукт питания нечеловеческого происхождения, полученный способом по любому из
пп.1-13, включающий нечеловеческие мышечные клетки и одну или более нечеловеческих клеток, выбранных из группы, состоящей из адипоцитов и клеток хряща, выращенных ex vivo.
15. Мясной продукт питания нечеловеческого происхождения по п.14, дополнительно включающий
структуру подложки, где нечеловеческие мышечные клетки и одна или более нечеловеческих клеток,
выбранных из группы, состоящей из адипоцитов и клеток хряща, прикреплены к структуре подложки.
16. Мясной продукт питания нечеловеческого происхождения по п.14 или 15, где нечеловеческие
мышечные клетки представляют собой клетки скелетных мышц.
17. Мясной продукт питания нечеловеческого происхождения по любому из пп.14-16, который
практически не содержит вредных микробных загрязнений.
18. Мясной продукт питания нечеловеческого происхождения по любому из пп.14-17, в котором
нечеловеческие мышечные клетки происходят из плюрипотентных эмбриональных мезенхимальных
стволовых клеток или нечеловеческих тотипотентных эмбриональных стволовых клеток.
19. Мясной продукт питания нечеловеческого происхождения по любому из пп.14-18, где нечеловеческие мышечные клетки были подвергнуты воздействию электрического тока для придания указанному нечеловеческому мясному продукту текстуры, которая более сходна с естественным мясом.
20. Мясной продукт питания нечеловеческого происхождения по п.14, включающий нечеловеческие адипоциты, выращенные ex vivo, где нечеловеческие адипоциты а) являются трансдифференцированными из нечеловеческих миобластов или b) происходят из плюрипотентных мезенхимальных стволовых клеток или тотипотентных эмбриональных стволовых клеток.
21. Мясной продукт питания нечеловеческого происхождения по п.14, включающий нечеловеческие хрящевые клетки, выращенные ex vivo, причем нечеловеческие хрящевые клетки располагаются
между структурой подложки и нечеловеческими мышечными клетками.
22. Мясной продукт питания нечеловеческого происхождения по п.14 или 15, где нечеловеческие
мышечные клетки происходят из животных, выбранных из группы, состоящей из млекопитающих, птиц,
рыб, беспозвоночных, рептилий и земноводных.
23. Мясной продукт питания нечеловеческого происхождения по п.14, включающий нечеловеческие хрящевые клетки, выращенные ex vivo, причем нечеловеческие хрящевые клетки были подвергнуты
воздействию механического усилия, предпочтительно усилию потока сдвига.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
-7-