Получение стабильной культуры хондроцитов с целью

■В:
хондральные и остеохондральны е переломы хряща ко­
ленного сустава превалирую т над другими типами по­
вреж дений, что о б усло в ле н о высокой э ла сти чностью
менисков и крестообразных связок коленного сустава в
сравнении с прочностью эпифизарны х костно-хрящ евых
структур в детском и подростковом возрасте. Среди па­
циентов старш их возрастны х групп наблю дается иная
ситуация: вторичная хондром аляция зн ачи тельно пре­
обладает над хондральными и остеохондральны м и пе­
реломами.
3. Установление типа повреждения с учетом предло­
женной нами классификации позволяет точно докумен­
тировать результаты и вы бирать наиболее рациональ­
ную м етодику лечения внутрисуставного повреждения
хряща.
4. Своевременная точная диагностика травм атичес­
кой внутрисуставной патологии хряща коленного суста­
ва позволяет снизить частоту развития вторичных по­
Оригинальные научные статьи f a
вреждений и прогрессирования вторичного гонартроза [5].
5.
Наиболее информативным методом обследования,
позволяющим установить достоверный диагноз при внут­
рисуставной патологии коленного сустава, на сегодняш­
ний день является артроскопия.
Литература
1. Ding, С., Cicuttini, F., Scott, F., Cooley, H., Boon, С., Jones,
G. Natural history of knee cartilage defects and factors affecting
change. Arch intern med 2006; 166: 651-658.
2. Hope, P.G. Arthroscopy in children. Journal of the Royal
Society of Medicine 1991; 84: 29-31.
3. Oeppen, R.S., Connolly, S.A., Bencardino, J.T., Jaramillo, D.
Acute injury of the articular cartilage and subchondral bone: a
common but unrecognized lesion in the immature knee. AJR
2004; 182: 111 - 117.
4. Outerbridge, R.E. The etiology of chondromalacia patellae.
The Journal of Bone and Joint Surgery 1961; 43 B: 752-757.
5. Rubin, D.A., Harner, C.D., Costello, J.M. Treatable Chondral
Injuries in the Knee. AJR 2000; 174: 1099-1106.
В.Л. Горанов2, Ю.А. Горанова2, А.А. Арабей2, С.И. Третъяк
О. Л. Эйсмонт2, Е.Д. Белоенко2
ПОЛУЧЕНИЕ СТАБИЛЬНОЙ КУЛЬТУРЫ ХОНДРОЦИТОВ С ЦЕЛЬЮ
ПРИМЕНЕНИЯ В ЛЕЧЕНИИ ДЕФЕКТОВ СУСТАВНОГО ХРЯЩА
Белорусский государственный медицинский университет1,
Белорусский Н И И травматологии и ортопедии2
Данное исследование посвящено отработке методических подходов по выделению хондроцитов из взрослой и
фетальной хрящевых тканей и поддержанию полученных клеток в виде монослойной культуры. Доказано, что
добавление ряда ростовых факторов, таких как инсулин, трансферрин, селенит, фактор роста фибробластов, трансформирующий фактор роста, в культуральную среду позволяет сохранить хондроцитарный фено­
тип клеток в тпечение длительного промежутка времени без признаков дедифференцировки. Использование
стабилизированного полипептидного матрикса обеспечивает равномерное распределение хондроцитов в трех­
мерном пространстве и воспроизведение их хрящеподобной организации.
ля лечения суставных дефектов в травматологии
было предложено множество подходов, связанных с
оперативными вмешательствами в области сустава (абра­
зивная хондропластика, микропереломы субхондральной
кости и др.) которые, однако, до сих пор не могут обеспе­
чить стабильную клиническую ремиссию. В результате
этого многих ученых заинтересовал вопрос о возм ож но­
сти тр а н сп ла н та ц и и а уто ло ги чн ы х хо н д р о ц и то в в о б ­
ласть хондрального дефекта.
Впервые аутогенные хондроциты для замещения де­
фектов суставного хряща использовал Бриттберг в 1968
году [4]. При этом в область суставного дефекта были
введены культивированны е хондроциты в составе сус­
пензии. У больш инства пациентов было зарегистриро­
вано восстановление ф ункции сустава, при этом у 12
пациентов из 22 в биоптатах из области тр ансплан татации бы ла обнар уж ена ги а ли н о п о д о б н а я хрящ евая
репарация.
Последующие исследования культуры хондроцитов и
сама процедура тр ан спла н та ц и и подняли новые про­
блемы: сохранение фенотипа хондроцитов в течение про­
должительного культивирования монослоя [3], риск утеч­
ки хондроцитов со стороны несущей поверхности в слу­
чае их тр ансплан та ц ии в виде суспензии и проблем а
равномерного распределения клеток в трехмерном про­
странстве дефекта [7].
Коллаген, фибриновый клей, альгинат и агароза ока­
Д
за лись многообещающими носителями для поддерж а­
ния фенотипа хондроцитов [8]. В одном из исследова­
ний было доказано что человеческие хондроциты куль­
тивируемые в коллагене, сохраняют свой фенотип и син­
те зи р ую т м атриксны й х о н д р о и ти н -6 -с ул ь ф а т а та кж е
равномерно распределяю тся в трехмерном простран­
стве без риска утечки перевиваемых клеток [3].
Кроме того, как уже указы валось выше, для сохране­
ния ф ен отипа хо н д р о ц и то в важным является подбор
дифференцировочны х агентов и факторов, способству­
ющих более бы стром у росту культуры и ее ста б и ли за ­
ции.
Ц елью наш его исследован ия яв и ла сь разр а б отка
подходов к выделению и обогащению культуры хондро­
цитов с последующ ей дифф еренцировкой в полноцен­
ную хрящеподобную структуру.
М атериал и методы
Исследования проводилось на базе ЦНИЛ БГМУ. Для
изучения характера пролиферативны х и м орфогистотипических процессов в культуре клеток использовались
фрагменты хрящевой ткани, взятые из организма экс­
периментальных животны х и фрагменты хряща, получен­
ные в ходе эндопротезирования суставов в клинике, а
та кж е фрагменты ф ета льн ого хряща плодов кроликов.
Все м анипуляции проводили в стерильны х условиях с
оценкой жизнеспособности полученных клеток непосред­
ственно перед ферментацией.
35
fa
Оригинальные научные статьи
Рис.З. М орфология хондроцитов,
полученны х из ф е та льн ы х тканей.
Ув.400Х.
Рис.1. Монослой хондроцитарной
культуры, полученной из суставного
хряща взрослого животного. Ув.200Х
Рис.2. Свежая культура фетальных
хондроцитов на 9 день культивирова­
ния. Ув. 100Х.
Рис.4. Накопление клеточных эле­
ментов в составе коллагена после 2-3
пассажа. Ув. 200Х
Рис.5. Гистологическая окраска фрагмента полипептидного матрикса с хондроцитами: А - альциановый синий, Б - сафронин-О. Ув. 400Х.
В последую щ ие сутки на губку осторож но наслаивали
Для получения культуры клеток хондроцитов исполь­
тонкий слой свежей культуральной среды по мере изме­
зовали методику K.F.AImqvist et al., 2001 с модификаци­
нения pH последней, смену среды не производили. К уль­
ями [1]. Получение клеточных культур из взрослы х тк а ­
тивировали при 37°С и 5% С 0 2.
ней проводилось по стандартной методике, а ф е та ль ­
ные хрящевые фрагменты ферментировали в более ща­
Гнстологическая окраска. Иммуногистохимический
анализ. Для выявления сульфатированных протеогликадящ их усло виях с сокращением времени инкубации в
нов в экстрацеллюлярном матриксе культивируемых хон­
ф ерм ентативны х растворах.
дроцитов использовали краситель альциановы й синий
К ульти ви ровани е хо н др о ц и тов в составе к о л л а ге ­
[5]. Было осуществлено иммуногистохимическое окраши­
нового ге ля. При достижении конфлю энтного монослоя
вание клеток на наличие продукции коллагена II типа [2].
хондроциты снимали с поверхности культуральных ф ла ­
Р е зульта ты и обсуж де н ие
конов (7-10 сутки) с помощью специ ального шпателя,
ресуспензировали в среде F-12 с 5% фетальной бычьей
К ультивирование суспензии единичных хондроцитов
показало, что культура, получаемая из ф етальны х хря­
сывороткой и антибиотиками, центрифугировали 4 мин
щевых тканей, обладает более высокой пролиф ератив­
при 800rpm, заклю чали в состав коллагенового покры­
ной способностью, чем культура из зрелы х тканей. Фе­
тия, предварительно оценив ж изнеспособность клеток
в те сте с тр ипан овы м синим (0,4% ) в ко н ц е н тр а ц и и
тальная культура более стабильна, не требует д ли те ль­
ного времени размножения клеток и обладает низкой
1*106кл/м л. Коллагеновый гель готовили в соответствии
степенью дедифференцировки, претерпевая несколько
с методикой Jin Lu et al. [6]. Культура инкубировалась
пассаж ей.
при 37°С и 5% С 0 2 со сменой культуральной среды F-12,
Полученные данные подтверждаю т
содержащей L-аскорбиновую кислоту
(50мкг/мл), 10% фетальную бычью сы­
то, что наибольшим потенциалом раз­
вития обладаю т культуры хондроцитов,
воротку, L-глутамин (2 мМ) и антибио­
полученные на основе прогениторных
тики (пенициллина 100МЕ/мл, стреп­
фетальны х клеток. В то ж е время клет­
томицина 100 мг/мл) через сутки.
ки зрелой хрящевой ткани относитель­
К ульти ви р ова н и е хо н др о ц и то в в
но стабильны при культивировании в
составе п о ли п е п ти дно го (ж е л а ти н о ­
составе кластеризованной культуры.
в о го ) м атрикса. Хондроциты на ста ­
Заключение культур клеток в состав
дии конфлю энтной культуры снимали
коллагена и поли пеп тидн ого м атрик­
с поверхности культуральны х ф ла ко ­
нов как описано выше. После оценки
са способствовало сохранению фено­
типа хондроцитов и их равномерному
ж и зн е сп о со б н о сти кле то к в те с те с
р а сп р е д е ле н и ю в тр е хм е р н о м п р о ­
трипановым синим (0,4%) клетки ре­
суспензировали в культуральной сре­
странстве. Однако в дальнейш ем ста­
Рис.6. Иммуногистохимическая ви­
де (1*106кл/м л) и помещали в состав
ло понятно, что коллагеновый матрикс
зуализация коллагена 2-го типа с по­
фрагмента (1 см3, И=200мкм) стериль­
р а ци он а льн е е и с п о л ь зо в а ть для на­
мощью пероксидазной метки в соста­
ной пористой полипептидной м атри­
копления культуры хондроцитов, из-за
ве хондроцитарной ткани. Ув. 400Х.
цы, стабилизированной альбумином.
его способности стим улировать бы ст­
36
■■■■
в
Оригинальные научные статьи f t
рый рост хондроцитов, а полипептидный матрикс - для
2. Было установлено, что кроме коллагена, полипеп­
дальнейш его создания трехмерной структуры, в которой
тидный матрикс более приемлем для образования хря­
клетки равномерно распределяются по всей толще.
щеподобных структур. Хондроциты равномерно распре­
Первые 6 суток культивирования хондроцитов в со­
деляются в нем, стабильны и не проявляют склонность к
ставе полипептидной пластины отмечалось разнообра­
дедифференцировке, а синтезирую т полноценный экстзие гистом орф ологической картины с формированием
рацеллю лярный матрикс - новую хрящеподобную ткань.
хондроподобных одиночных мелких очагов. К 10 - 14 сут­
3. Для поддержания стабильности культуры опр а в­
кам происходила окончательная дифференцировка кле­
дано использование ростовых факторов и добавок (ас­
ток в составе пластины с образованием гиалиноподобкорбиновая ки слота , инсулин, трансф еррин, селенит,
ных хрящевых скоплений величиной до 2мм.
фактор роста ф и бр областов, трансформ ирую щ ий рос­
Параллельный анализ образцов пластины, содерж а­
товой фактор), которые способствую т быстрому росту и
щей хондроциты , окраш енных различными кр а си те ля­
пролиферации культуры , а такж е сохранению ста б и ль­
ми позволяет убедиться в развитии полноценной хондного фенотипа.
рогенной дифференцировки клеток в специализирован­
Литература
ные тканевые фрагменты.
1. Almqvist, KF, Wang, L et al. Culture of chondrocytes in alginate
Кроме того, иммуногистохимический анализ показал
surrounded by fibrin gel: characteristics of the cells over a period of
наличие коллагена 2 -го типа в матриксе сконструиро­
eight weeks // Ann Rheum Dis - 2001; 60:781-790.
ванных тканей, заклю ченного в лакунах клеток (рис.6).
2. Baragi, V.M., Renkiewicz, R. R., Jordan, H., Bonadio, J.,
Таким образом, было установлено, что полипептид­
Hartman, J. W., Roessler, B. J. Transplantation of Transduced
ный матрикс оказался более эффективным для образо­
Chondrocytes Protects Articular Cartilage from Interleukin 1Induced E xtracellular M atrix Degradation // The Journal of
вания хрящеподобных структур, чем коллагеновый. Хон­
Clinical Investigation - 1995; 96(5): 2454-2460.
дроциты были равномерно распределены в трехмерном
3. Benya, PD, Shaffer, JD. Dedifferentiated chondrocytes re­
пространстве, не проявляли наклонности к дедифференexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in
цировке и синтезировали полноценны й экстр а це ллю agarose gels / / Cell-1982;30:215-24.
лярный матрикс.
4. Brittberg, M, Lindahl, A, Nilsson A, et al. Treatment of deep
Для того чтобы избежать дедифференцировки хондро­
cartilage defects in the knee with a utologous chondrocyte
цитов и стимулировать их пролиферацию мы протестиро­
transplantation // N Engl J Med-1994;331:889-95.
вали ряд вспомогательных веществ: аскорбиновая кисло­
5. Gigante, A., Bevilacqua, C., Zara, C., Travasi, М., Chillemi,
C. Autologous chondrocyte implantation: cells phenotype and
та, инсулин, трансферрин, селенит, фактор роста фибробproliferation analysis // Knee Surg, Sports Traumatol, Arthrosc
ластов (FGF), трансформирующий ростовой фактор (TGF).
- 2001; 9:254 - 258.
В нашем эксперим енте м аксим ально вы раженный
6. Jin Lu, Ya-Peng Gu, Xia Xu, Mei-Lian Liu, Ping Xie, Hui-Ping
эффект, позволивший полностью избеж ать дедифф ерен­
Song. Adult islets cultured in collagen gel transdifferentiate into
цировки, оказы вало сочетанное использование тр ан с­
du ct-like cells//W orld J G astroenterol-20 0 5 ; 11(22):3426формирующего ростового фактора, аскорбиновой кис­
3430.
лоты и трансферрина.
7. Katsube, K, Ochi, M, Uchio, Y, et al. Repair of a rticular
cartilage defects with cultured chondrocytes in atelokollagen
Вы воды
1.
Н аибольш им по те н ци а ло м р а зв и ти я о б ла д а ю т gel: comparison with cultured chondrocytes in suspension //
Arch Orthop Trauma Surg-2000;120:121-7.
культуры хондроцитов, полученные на основе прогени8. Wakitani, S, Kimura, T, Hirooka, A, et al. Repair of rabbit
торных фетальных клеток. В то же время клетки зрелой
articula r surfaces with a llog ra ft chondrocytes embedded in
хрящевой ткани относительно стабильны при культиви­
collagen gel // J Bone Joint Surg (Br)-1989; 71-B:74-80.
ровании в составе кластеризованной культуры.
Ю .Е. Копычев, А.П. Серяков, М.С. Завьялов, А.В.Смолин, В.А.Сукирко
РЕЗУЛЬТАТЫ ХИМИОЛУЧЕВОГО ЛЕЧЕНИЯ
БОЛЬНЫХ РАКОМ НОСОГЛОТКИ
Главный военный клинический госпиталь им. Н.Н. Бурденко, Москва, Россия
оздание онкологических отделений в военныхлечебных учреждениях диктует необходимость быстрого до­
ведения до специалистов новых прогрессивных методик ле­
чения злокачественных заболеваний, среди прикреплен­
ного контингента. Частота рака носоглотки на протяжении
последних лет остается практически стабильной, состав­
ляя 0,1-1% от числа всех злокачественных заболеваний,
около 2% - среди опухолей головы - шеи и 50% - среди
опухолей глотки. Мужчины болеют раком носоглотки в 2,5
раза чаще женщин. Пик заболеваемости приходится на воз­
раст 40-50 лет, хотя отмечается большое число заболевших
и в молодом возрасте [2, 5, 7].
Носоглотка граничит с основанием черепа с проходя­
щими черепно-мозговыми нервами и сосудами, глазница­
ми, полостью носа, околоносовыми пазухами, ротоглоткой,
С
крылонебной ямкой и евстахиевыми трубами. Слизистая
оболочка носоглотки характеризуется наличием в ней боль­
шого числа лимфоидных элементов, развитой сосудистой и
лимфатической сетью с обширными анастомозами. Разви­
вающиеся в этой зоне опухоли отличаются высокой биоло­
гической агрессивностью, быстрым распространением на
прилежащие ткани и органы, ранним регионарным метастазированием, возникающим почти у 80% больных, в 50%
случаев носящим двусторонний характер. Характерная осо­
бенность рака носоглотки - высокая частота отдаленного
метастазирования, достигающая 15-50%. Около 80% боль­
ных из-за поздних клинических проявлений и трудностей
диагностики, поступает на лечение, имея распространен­
ный опухолевый процесс (III - IV стадию). Вследствие чего
результаты проводимого лечения остаются неудовлетвори­
37