БОЛЕЗНИ ПЕЧЕНИ И ЖЕЛЧНЫХ ПУТЕЙ
advertisement
БОЛЕЗНИ ПЕЧЕНИ ЭКСПЕРИМЕНТА ЛЬНАЯ И ЖЕЛЧНЫХ ПУТЕЙ ГАСТРОЭНТЕРОЛОГИЯ diseases of liver and biliary tracts experimental gastroenterology ДИНАМИКА УЛЬТРАСТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ПЕРИТОНИТЕ Ашрафов Р. А. 1, Лычкова А. Э. 2 1. Центр лазерной хирургии, Москва 2 ГБУЗ ЦНИИ гастроэнтерологии Департамента здравоохранения г. Москвы Лычкова Алла Эдуардовна Тел. 8 (962) 965 – 4923 E-mail: lychkova@mail.ru РЕЗЮМЕ В эксперименте на крысах линии Вистар исследовали ультраструктурные нарушения клеток печени в различные стадии перитонита. Методами световой и электронной микроскопии показано, что в реактивной фазе экспериментального перитонита развиваются дистрофические изменения гепатоцитов и эндотелиоцитов синусоидов. Эти обратимые изменения объяснены адаптационной реакцией клеток на процессы воспаления и интоксикации. В токсической и особенно в терминальной фазе перитонита в субмикроскопической архитектонике гепатоцитов, клеток Купфера и эндотелиоцитов синусоидных капилляров наряду с дистрофическими изменениями появляются деструктивные нарушения органелл клеток, приобретшие необратимый характер. Предложенная модель позволила выявить характерные для разных стадий этого заболевания ультраструктурно-функциональные нарушения клеток печени. Ключевые слова: перитонит; гепатоциты; клетки Купфера и эндотелиоциты; ультраструктура SUMMARY In the experiment on Wistar rats by methods of light and electron microscopy an ultrastructural disorders of the liver cells in various stages of peritonitis were investigated. It was shown that the reactive phase of experimental peritonitis associates with dystrophic changes of the hepatocytes and the endotheliocytes of sinusoids. These reversible changes are explained by an adaptive response of cells to inflammation. In the toxic and especially in the terminal stages of peritonitis in submicroscopical architectonics of the hepatocytes, Kupffer cells and sinusoidal endotheliocytes, along with dystrophic changes appear destructive violations of organelles of hepatic cells that acquired an irreversible character. The proposed model let description of ultrastructural and functional disorders of the liver cells at different stages of peritonitis. оздание модели перитонита [1, 2], возможно, более полно отражающей фазы клинического течения перитонита, является актуальной задачей и позволит глубже подойти к вопросам пато- и морфогенеза данного заболевания. В острой фазе экспериментального перитонита первоначально наблюдали увеличение уровня интерлейкина ИЛ-6 с последующим нарушением иммунного ответа и увеличением уровня ФНО-α, а также числа миелоидных супрессорных клеток [3]. Однако динамика ультраструктурных нарушений клеток печени при перитоните изучена недостаточно. Цель работы — исследование нарушений ультраструктуры клеток печени в динамике при экспериментальном перитоните. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Опыты выполнены на крысах линии Вистар массой 300 – 320 г (n = 20). В условиях хирургической стадии эфирного наркоза проводили лапаротомию, лигировали рудиментарный отросток длиной 5 – 7 мм толстой кишки. Петлю кишки опускали в брюшную полость, и рану ушивали. После операции крыс 75 С E XPER I ME NTA L & CLI N ICA L GASTROE NTEROLOGY ГАСТРОЭНТЕРОЛОГИЯ 76 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ №12 /2013 выводили из опыта и осуществляли забор материала в виде 5-мм образца печени на 1-е (n = 5), 2-е (n = 5) и 3-и сутки (n = 5). Группу контроля составили 5 животных. Для электронно-микроскопического исследования образцы ткани фиксировали в 1%-ном буферном растворе четырехокиси осмия при температуре +4 °С в течение 2,5 – 3 часов. Образцы ткани промывали в буферном растворе, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, заключали в смесь эпоксидных смол (эпонар) и полимеризовали в термостате при температуре 60 °С в течение двух суток. Ультратонкие срезы изготавливали на ультрамикротоме УМТП-6, контрастировали цитратом свинца и исследовали под электронным микроскопом ЭМВ-100 БР при ускоряющем напряжении 75 кВ. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В течение 24 часов после моделирования перитонита на ультраструктурном уровне наблюдались дистрофические изменения гепатоцитов (рис. 21-а), клеток Купфера и эндотелиоцитов синусоидальных капилляров. Матрикс ядер гепатоцитов подвергался умеренному просветлению, ядерная мембрана несколько разрыхлялась, однако сохраняла типичную структуру. Перинуклеарные пространства были умеренно неравномерно расширенными. Гранулярный эндоплазматический ретикулум подвергался умеренной вакуолизации. Его цистерны приобретали вид электронно-прозрачных вакуолей различной формы и размеров. На мембранах эндоплазматической сети обнаруживали довольно многочисленные рибосомы. Количество свободных рибосом и полисом в цитоплазме гепатоцитов значительно снижено. Обнаруживали гипертрофию пластинчатого комплекса Гольджи, мембраны которого были окружены крупными и мелкими электронно-прозрачными вакуолями. Вблизи от пластинчатого комплекса Гольджи встречались многочисленные первичные лизосомы. Функциональная активность клеток Купфера была повышена (рис. 3 1-б). Эндотелиоциты синусоидных капилляров дистрофически изменены (рис. 4 1-в): цитоплазматическая мембрана умеренно разрыхлена, цитоплазма клетки, матрикс ядра и митохондрий набухший и просветленный. В токсической фазе развития перитонита (на 2-е сутки) наблюдались два типа изменений ультраструктурной архитектоники гепатоцитов. Ультраструктура одной группы гепатоцитов находилась в стадии функционального напряжения. Гепатоциты другой группы претерпевали дистрофические и деструктивные нарушения (рис. 5 2а). Матрикс ядра становился электронно-прозрачным, гранулы хроматина концентрировались преимущественно по периферии ядра. Ядерная мембрана имела очаговые деструкции. Цитолемма существенно разрыхлена и частично разрушена. Межклеточные пространства увеличены. Цистерны гранулярного эндоплазматического ретикулума были очень сильно расширены, и их содержимое выглядело электронно-прозрачным. На мембранах гранулярной эндоплазматической сети уменьшается количество связанных с ними рибосом. Снижается также и количество свободно лежащих в цитоплазме рибосом. Пластинчатый цитоплазматический комплекс Гольджи редуцируется, вблизи него, кроме первичных лизосом, часто обнаруживаются аутофагосомы и мелкие капепьки липидов. О высокой функциональной активности клеток Купфера свидетельствовали хорошо развитый гранулярный эндоплазматический ретикулум, многочисленные рибосомы и полисомы, гипертрофированный пластинчатый комплекс Гольджи, многочисленные первичные и вторичные лизосомы (рис. 7 2-б). Цитоплазма эндотелиоцитов синусоидных капилляров была сильно набухшей (рис. 8 2-в). Гиалоплазма была существенно просветлена и обладала очень низкой электронной плотностью. Матрикс ядер эндотелиоцитов был значительно просветлен, особенно в центральной его части. Хроматин ядра располагался в основном вдоль ядерной мембраны. Последняя имела множественные очаги лизиса. Мембраны отдельных ядер имели глубокие и мелкие инвагинации. Перинуклеарные пространства были сильно расширены. Цитоплазматическая мембрана выглядела очагово разрушенной. Через участки ее лизиса можно было наблюдать выход цитоплазматических органелл, фрагментов мембранных структур и детрита в просвет синусоида. На третьи сутки эксперимента развивается терминальная фаза перитонита, характеризующаяся тотальным распадом цитоплазматических органелл гепатоцитов. Гранулы хроматина расположены по периферии вдоль ядерной мембраны. Отдельные участки кариолеммы имели зоны лизиса. Перинуклеарные пространства большинства гепатоцитов были существенно расширены (рис. 10 3-а). Гранулярная эндоплазматическая сеть вакуолизирована, ее мембраны местами фрагментированы с небольшим количеством рибосом (рис. 13, 3-б). Обнаруживали гиперплазию гладкой эндоплазматическои сети, в зоне которой присутствовали отдельные гранулы гликогена. Пластинчатый комплекс Гольджи был редуцирован и представлен в большинстве гепатоцитов в виде единичных гладких мембран, окруженных крупными электронно-прозрачными вакуолями. В непосредственной близости от них локализовались мелкие первичные лизосомы. Отмечалось большое количество аутофагосом с деструктивно измененными органеллами и фрагментами мембран. Многие гепатоциты имели тяжелые поражения, характерные для агонизирующих клеток: запустевание цитоплазмы, наличие огромных Рис. 1-в. Ультраструктура эндотелиоцитов синусоидных капилляров печени крыс через 24 часа после моделирования перитонита. Ув. × 42 000. Контрастирование цитратом свинца. Рис. 2-а. Ультраструктура гепатоцитов печени крыс на вторые сутки моделирования перитонита. Ув. × 26 000. Контрастирование цитратом свинца Рис. 2-б. Ультраструктура клеток Купфера печени крыс на вторые сутки моделирования перитонита. Ув. × 48 000. Контрастирование цитратом свинца Рис. 2-в. Ультраструктура эндотелиоцитов синусоидных капилляров печени крыс на вторые сутки моделирования перитонита. Ув. × 52 000. Контрастирование цитратом свинца электронно-прозрачных вакуолей в перинуклеарной зоне, которые оттесняли от ядра другие органеллы, почти тотально подвергнутые аутолизису. Эндотелиоциты синусоидных капилляров также деструктивно изменены (рис. 20 3-в): ядерная мембрана была очагово лизирована, митохондрии — сильно набухшие, матрикс их элекронно-прозрачен, количество крист уменьшено. В отдельных эндотелиоцитах появлялись огромные вакуоли. Клетки Купфера находились в состоянии функциональной активности (рис. 21 3-г): гранулярный эндоплазматический ретикулум у значительного количества клеток находился в стадии гиперплазии, увеличивалось число рибосом, полисом и количество аутофагосом в зоне гипертрофированного комплекса Гольджи. Однако встречались и клетки с деструктивно измененными органеллами и участками лизиса цитолеммы. Предложенная модель перитонита позволила выявить характерные для разных стадий этого заболевания структурно-функциональные нарушения клеток печени. В частности, в гепатоцитах experimental gastroenterology экспериментальная гастроэнтерология Рис. 1-б. Ультраструктура клеток Купфера печени крыс через 24 часа после моделирования перитонита. Ув. × 30 000. Контрастирование цитратом свинца 77 Рис. 1-а. Ультраструктура гепатоцитов печени крыс через 24 часа после моделирования перитонита. Ув. × 18 000. Контрастирование цитратом свинца E XPER I ME NTA L & CLI N ICA L GASTROE NTEROLOGY ГАСТРОЭНТЕРОЛОГИЯ Рис. 3-б. Ультраструктура гепатоцитов печени крыс на третьи сутки моделирования перитонита. Ув. × 46 000. Контрастирование цитратом свинца Рис. 3-в. Ультраструктура эндотелиоцитов синусоидных капилляров печени крыс на вторые сутки моделирования перитонита. Ув. × 52 000. Контрастирование цитратом свинца Рис. 3-г. Ультраструктура клеток Купфера печени крыс на третьи сутки моделирования перитонита. Ув. × 45 000. Контрастирование цитратом свинца развиваются первоначально обратимые, а впоследствии и необратимые изменения. Эти изменения связаны с включением адаптационных изменений на внутриклеточном уровне в ответ на нарастание воспалительной реакции и интоксикации. В терминальной фазе перитонита развиваются как дистрофические, так и деструктивные нарушения клеток печени. ЛИТЕРАТУРА 1. Терентьев А. А., Порядин Г. В., Смирнов В. М. и др. Способ моделирования перитонита. Патент РФ № 2367029, 2008. 2. Новосельцев А. В., Чумаков П. А., Семенюк А. А., Кирсанов В. М. Способ моделирования перитонита у крыс. Патент РФ № 2376648, 2008. 78 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ №12 /2013 Рис. 3-а. Ультраструктура гепатоцитов печени крыс на третьи сутки моделирования перитонита. Ув. × 42 000. Контрастирование цитратом свинца 3. Barrera G., Landoni V., Martire-Greco D. et al. Model of polymicrobial peritonitis that induces the proinflammatory and immunosuppressive phases of sepsis // Infect. Immun. — 2011. — Vol. 79, № 3. — P. 1280 – 1288.
