Отдел структурной биохимии белка МЕХАНИЗМ ПОДАВЛЕНИЯ
advertisement
Отдел структурной биохимии белка МЕХАНИЗМ ПОДАВЛЕНИЯ АГРЕГАЦИИ БЕЛКОВ АЛЬФА-КРИСТАЛЛИНОМ Курганов Б.И., Маркосян К.А., Чеботарева Н.А., Голуб Н.В., Еронина Т.Б., Гурвиц Б.Я., Бумагина З.М., Артемова Н.В., Клейменов С.Ю. Муранов К.О.*, Полянский Н.Б.*, Островский М.А.*, Шолух М.В.**, Касилович Н.В.**, Асриянц Р.А.***, Муронец В.И.***, Налетова И.Н.***, Юдин И.К.**** Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН * Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, ** Белорусский государственный университет, Минск, *** Институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского государственного университета имени М.В. Ломоносова **** Институт проблем нефти и газа РАН Московского На основании изучения кинетики агрегации белков в присутствии альфа-кристаллина (представителя семейства малых белков теплового шока) с использованием метода динамического светорассеяния предложен механизм защитного действия альфа-кристаллина. Образующиеся первоначально комплексы денатурированного белка с альфа-кристаллином не молекул способны к агрегации. Протекающее во времени перераспределение денатурированного белка на поверхности частицы альфа-кристаллина приводит к зарождению центров агрегации, которые представляют собой ядра, формирующиеся из денатурированных молекул (гетерогенная нуклеация). Подобные трансформированные комплексы альфакристаллина с денатурированным белком агрегируют в кинетическом режиме, при котором вероятность слипания частиц при столкновении меньше единицы. Взаимодействие олигомерных белков (димерной митохондриальной аспартатаминотрансферазы, димерной гликогенфосфорилазы b и тетрамерной глицеральдегид3-фосфатдегидрогеназы из скелетных мышц кролика) с альфа-кристаллином при повышенных температурах изучено с использованием методов измерения ферментативной активности, дифференциальной сканирующей калориметрии и аналитического ультрацентрифугирования. Обнаруженная дестабилизация изученных белков в присутствии альфа-кристаллина объяснена в рамках схемы, допускающей комплексоообразование диссоциированных форм альфакристаллина с интермедиатами разворачивания белков. Список опубликованных работ 1. Meremyanin, A.V., Eronina, T.B., Chebotareva, N.A., Kurganov, B.I. “Kinetics of thermal aggregation of glycogen phosphorylase b from rabbit skeletal muscle. Mechanism of protective action of alpha-crystallin”. Biopolymers, 2008, v. 88, No. 2, p. 124-134. (IF = 2.823) 2. Golub, N.V., Markossian, K.A., Kasilovich, N.V., Sholukh, M.V., Kurganov, B.I. “Thermal inactivation, denaturation and aggregation of mitochondrial aspartate aminotransferase”, Biophysical Chemistry, 2008, v. 135, No. 1-3, p. 125-131. (IF = 2.362) 3. Golub, N.V., Markossian, K.A., Sholukh, M.V., Muranov, K.O., Kurganov, B.I. “Study of kinetics of thermal aggregation of mitochondrial aspartate aminotransferase by dynamic light scattering: protective effect of alpha-crystallin”, European Biophysics Journal, 2009, v. 38, No. 5, p. 547-556. (IF = 2.409) 4. Markossian, K.A., Golub, N.V., Kleymenov, S.Yu., Muranov, K.O., Sholukh, M.V., Kurganov, B.I. “Effect of alpha-crystallin on thermostability of mitochondrial aspartate aminotransferase”, International Journal of Biological Macromolecules, 2009, v. 44, No. 5, p. 441-446. (IF = 1.867) 5. Markossian, K.A., Yudin, I.K., Kurganov, B.I. “Mechanism of suppression of protein aggregation by alpha-crystallin”, International Journal of Molecular Sciences, 2009, v. 10, No. 3, p. 1314-1345. (IF = 0.978) 6. Чеботарева Н.А., Курганов Б.И., Асриянц Р.А., Муранов К.О., Островский М.А. «Роль термоиндуцированной диссоциации во взаимодействии олигомерных шаперонов и олигомерных белковых субстратов», Доклады Академии наук, 2009, т. 428, № 3, с. 403-406. 7. Bumagina, Z.M., Gurvits, B.Ya., Artemova, N.V., Muranov, K.O., Yudin, I.K., Kurganov, B.I. “Mechanism of suppression of dithiothreitol-induced aggregation of bovine alpha-lactalbumin by alpha-crystallin”, Biophysical Chemistry, 2010, v. 146, No. 2-3, p. 108-117. (IF = 2.362) 8. Markossian, K.A., Golub, N.V., Chebotareva, N.A., Asryants, R.A., Naletova, I.N., Muronetz, V.I., Muranov, K.O., Kurganov, B.I. “Comparative analysis of the effects of alphacrystallin and GroEL on the kinetics of thermal aggregation of rabbit muscle glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase”, The Protein Journal, 2010, v. 29, No. 1, p. 11–25. (IF = 0.940) Лаборатория инженерной энзимологии МЕХАНИЗМЫ ИНДУКЦИИ СИНТЕЗА МЕХАНО-РОСТОВОГО ФАКТОРА В.А.Фуралев, И.В.Кравченко, Е.С.Лисицина, В.П.Хотченков, В.О.Попов Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН Механо-ростовой фактор (МРФ) представляет собой продукт альтернативного сплайсинга гена инсулино-подобного фактора роста 1, стимулирующий деление миобластов и повышающий мышечную массу экспериментальных животных. Экспрессия МРФ резко возрастает при повреждении мышечной ткани и при мышечных нагрузках. Механизм его действия остаётся неизвестным, хотя показано, что МРФ действует через иные, чем ИПФР-1, рецепторы. Целью данной работы было изучение регуляции синтеза МРФ в культурах миобластов и дифференцированных миотуб. В ходе работы было изучено влияние на синтез МРФ различных факторов клеточного стресса, аналогов вторичных мессенджеров, а также белков скелетных мышц, освобождающихся при повреждении этой ткани. Было показано, что из различных факторов клеточного стресса только гипертермия и понижение рН повышают экспрессию МРФ как на уровне мРНК, так и на белковом уровне, причем эффект наблюдался и в миобластах, и в дифференцированных миотубах. Стимуляция достигалась при значениях рН и toC, наблюдающихся в процессе интенсивного мышечного сокращения, из чего следует, что гипертермия и понижение рН могут служить факторами, активирующими выработку МРФ in vivo и тем самым способствующими мышечному росту. Гидрокортизон блокировал эффект стимуляции экспрессии МРФ. Ни один из остальных испытанных факторов клеточного стресса (гипоксия, гипероксия, гиперосмос, обработка ЛПС) не стимулировал синтез МРФ. Было также изучено влияние на синтез МРФ различных аналогов вторичных мессенджеров. Из испытанных соединений только дибутирил-цАМФ, активатор аденилатциклазы форсколин и активатор протеинкиназы С форбол-миристоил-ацетат стимулировали экспрессию данного ростового фактора в человеческих миобластах и миотубах, в то время как активатор синтеза супероксид-иона LY-83583 и кальциевый ионофор А23187 ингибировали экспрессию МРФ. Дибутирил-цАМФ и форболовый эфир стимулировали экспрессию МРФ с различной кинетикой, а их эффект был аддитивным, что предполагает различные механизмы их действия. Были также исследованы белки, освобождающиеся из поврежденной мышечной ткани и стимулирующие синтез МРФ в миобластах и миотубах мыши. Ранее было показано, что таким эффектом обладает миофибриллярная фракция мышечного гомогената. В ходе данного исследования было установлено, что два белка миофибрилл – титин и миомезин – обладают способностью стимулировать экспрессию белка и мРНК МРФ. Выводы: 1) из всех изученных факторов клеточного стресса только гипертермия и понижение рН стимулировали экспрессию МРФ в миобластах и миотубах 2) аналоги цАМФ и активаторы протеинкиназы С обладают способностью стимулировать синтез МРФ в миобластах и миотубах, тогда как активаторы выработки ВФК и кальциевый ионофор ингибируют его экспрессию 3) миофибриллярные белки титин и миомезин активируют синтез МРФ в миобластах и миотубах Kravchenko IV, Furalyov VA, Khotchenkov VP, Popov VO. Hyperthermia and acidification stimulate mechano-growth factor synthesis in murine myoblasts and myotubes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2008. v. 375, p. 271-274. Лаборатория регуляции биосинтеза белка ВЫЯВЛЕНИЕ ФАКТОРА ТРАНСКРИПЦИИ Xvent-2 В РАННЕМ РАЗВИТИИ Xenopus laevis Е.С.Пшенникова, А.С.Воронина Институт биохимии им. А.Н. Баха лаборатория регуляции биосинтеза белка. Российской академии наук, Москва 119071, Считается, что фактор транскрипции Xvent-2 появляется в зародышах шпорцевой лягушки после начала работы зиготного генома, на стадии поздней бластулы. Такой вывод сделан лишь на основе выявления в зародышах мРНК Xvent-2. Мы впервые получили рекомбинантный белок Xvent-2 и иммунную сыворотку к нему. Это дало возможность определить содержание белка Xvent-2 на разных стадиях раннего развития зародышей Xenopus laevis. Оказалось, что Xvent-2 присутствует как в яйце, так и в зародышах всех стадий развития, от дробления до начала спонтанных движений (стадия 26). Подтверждены ранние выводы других авторов, что мРНК Xvent-2 отсутствует в зародышах до стадии поздней бластулы. Количество этой мРНК нарастает, достигая максимума на стадии ранней нейрулы (стадии12-15), и затем понижается. Количество же белка Xvent-2 остается постоянным, примерно 150 пг на зародыш. Сделан вывод, что белок Xvent-2 запасается в яйце, и регуляция его количества в дальнейшем не зависит от количества соответствующей мРНК. Е.С.Пшенникова, А.С.Воронина 2008. Выявление фактора транскрипции Xvent-2 в раннем развитии Xenopus laevis. Молекулярная биология, , 42, N 6, 1012–1017. Лаборатория биохимии азотфиксации и метаболизма азота ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА И АЗОТА С ДИНИТРОЗИЛЬНЫМИ КОМПЛЕКСАМИ ЖЕЛЕЗА, АССОЦИИРОВАННЫМИ С ГЕМОГЛОБИНОМ Шумаев К.Б.*, Космачевская О.В.*, Кивилев К.В.*, Топунов А.Ф.*, Тимошин А.А.**, ***Ванин А.Ф. * Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН ** Российский кардиологический научно-производственный комплекс *** Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН Оксид азота (NO) является регулятором многих процессов в живых организмах. Гемоглобин (Hb) может связывать NO тремя способами. Это: связывание NO как гемового лиганда; образование S-нитрозогемоглобина при нитрозилировании SH-группы цистеина, а также образование динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ), связанных с сульфгидрильной группой Cys93 субъединицы гемоглобина. ДНКЖ и Sнитрозотиолы являются важнейшими метаболическими формами NO в организме. Нами было исследовано действие активных форм кислорода и азота (супероксида, пероксинитрита и гидропероксидов) на ДНКЖ, ассоциированные с гемоглобином (HbДНКЖ). Деструкция HbДНКЖ происходила под действием всех этих соединений, а также при ферментативной генерации супероксида. При снижении концентрации кислорода разрушение HbДНКЖ шло с меньшей скоростью, при этом появлялась нитрозилированная по железу гема R-форма гемоглобина (FeII-NO). Нами было впервые показано, что ДНКЖ защищают белок, с которым они связаны, от окислительной модификации и HbДНКЖ более устойчивы к действию пероксинитрита, чем комплексы, связанные с альбумином. Таким образом, можно сделать вывод, что ДНКЖ, связанные с гемоглобином, являются важными антиоксидантами, а их взаимодействие с активными формами кислорода и азота необходимо для регуляции транспорта и утилизации NO в кровеносной системе. Нами было также показано изменение процесса связывания гемоглобина с гемовыми и белковыми лигандами (в том числе с производными NO) при модификации Hb гликированием, что важно для объяснения особенностей функционирования гемоглобинов при карбонильном стрессе. Опубликованные и направленные в печать статьи и патенты Shumaev K.B., Kosmachevskaya O.V., Timoshin A.A., Vanin A.F., Topunov A.F. Dinitrosyl iron complexes bound with haemoglobin as markers of oxidative stress. // Methods in Enzymology. 2008. V.436. Globins and Other Nitric Oxide-Reactive Proteins. P.441-457. Космачевская О.В., Шумаев К.Б., Кивилев К.В., Топунов А.Ф. Изменение структурнофункциональных свойств легоглобина, гемоглобина и миоглобина при модификации гликированием. // Вестник новых медицинских технологий. 2009. Т.16. № 1. С. 92-93. Kosmachevskaya O.V., Shumaev K.B., Topunov A.F. Interaction of S-nitrosoglutathione with methemoglobin at the conditions modeling carbonyl stress. // Healph. 2010. (in press) Лаборатория биохимии хлоропластов ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ СТРЕССОВЫХ БЕЛКОВ ХЛОРОПЛАСТОВ ELIP1 И ELIP2 С ПОМОЩЬЮ GUN МУТАНТОВ ARABIDOPSIS THALIANA: РЕТРОГРАДНЫЕ СИГНАЛЫ О.В. Осипенкова, О.В. Ермохина, Г.Г. Белкина, С.Г. Фаттахов*, М.С. Одинцова, Н.П. Юрина Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, *Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова КНЦ РАН Ретроградные пластидные сигналы координируют экспрессию ядерного и органелльного геномов и влияют на экспрессию ядерных генов белков хлоропластов в зависимости от функционального состояния этих органелл. Была изучена экспрессия ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP1 и ELIP2 у gun и hy мутантов, имеющих нарушения в передаче пластидного сигнала. Было обнаружено, что ретроградные пластидные сигналы, зависящие от HY1, HY2 и GUN4 белков (но не GUN5), влияют на экспрессию генов ELIP1 и ELIP2, негативно регулируя их экспрессию. Экспрессия генов ELIP, Lhcb2 и HEMA1 зависит от интенсивности освещения: увеличение интенсивности освещения приводит к повышению экспрессии генов ELIP1 и ELIP2 и снижению экспрессии генов Lhcb и HEMA1. На экспрессию генов HEMA2 и ChlH интенсивность освещения не влияет. Исследования gun мутантов Arabidopsis с помощью ингибиторного анализа (норфлуразон, дипиридил) и экзогенного добавления Mg-Proto указывают на участие тетрапирролов в ретроградной регуляции экспрессии ядерных генов пластидных белков ELIP. Отсутствие корреляции между содержанием Mg-Proto и Mg-ProtoMe, с одной стороны, и уровнем транскриптов генов ELIP, с другой, указывает на то, что эти предшественники биосинтеза тетрапирролов, по-видимому, не являются сигнальными молекулами, индуцирующими пластидный сигнал. Обнаружена обратная зависимость между содержанием хлорофилла и экспрессией генов ELIP, что указывает на возможное участие белков ELIP в регуляции биосинтеза хлорофилла и/или защите хлоропластов от фотоокисления. Кроме пластидных сигналов на экспрессию ядерных генов ELIP действуют сигналы, индуцируемые гормонами и углеводами. Действие регуляторов роста растений с разным механизмом действия (абсцизовая кислота и мелафен) приводит к активации экспрессии генов ELIP на свету. Углеводы подавляют экспрессию генов ELIP. По-видимому, в клетках существует сложная сигнальная сеть, регулирующая координированную экспрессию ядерных генов, при этом различные пластидные сигналы могут взаимодействовать с другими сигнальными системами клетки и ингибировать (или активировать) транскрипцию ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP1 и ELIP2. Публикации 1.Осипенкова О.В., Ермохина О.В., Белкина Г.Г., Фаттахов С.Г., Юрина Н.П. Влияние мелафена на экспрессию генов белков светового стресса хлоропластов Elip1 и Elip2 у ячменя. Прикладная биохимия и микробиология. 2008. Т.44. №6. С. 701-708. 2.Юрина Н.П., Одинцова М.С. Сигнальные системы митохондрий. Ретроградная регуляция у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Генетика. 2008. Т.44. №11. С.1445-1452. 3.Юрина Н. П., Одинцова М.С. Сигнальные системы митохондрий. Ретроградная регуляция у растений. Физиология растений. 2010. V. 57. №1. С.9-20. (Сдана в печать в 2008г.). 4.Осипенкова О. В., Одинцова М.С., Юрина Н. П. Влияние световой, гормональной и углеводной сигнальных систем на экспрессию генов ELIP у gun- мутантов Arabidopsis thaliana. Прикладная биохимия и микробиология. 2010. В печати. Лаборатория физической биохимии ДЕТЕКЦИЯ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ ОПУХОЛЕЙ ЖИВОТНЫХ МЕТОДОМ ДИФФУЗНОЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ТОМОГРАФИИ И.Г.Меерович1, Л.Р.Арсланбаева1, В.В.Жердева1, А.П.Савицкий1, А.Г.Орлова2, В.А.Каменский2, В.И.Плеханов2, И.И.Фикс2, И.В.Турчин2, М.В.Ширманова3, Е.М.Трещалина4, Н.В.Андронова4, О.С.Бурова4, Д.В.Соколова4, А.Ю.Барышников4 1 Учреждение РАН Институт биохимии им. А.Н.Баха, Москва, Учреждение РАН Институт прикладной физики, Нижний Новгород, 3 ННГУ им. Н.И.Лобачевского, Нижний Новгород 4 НИИ ЭДиТО ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 2 Наиболее перспективной областью применения клеточных маркеров на основе цветных флуоресцирующих белков является экспериментальная онкология, где они позволяют вести в режиме реального времени непрерывный неинвазивный визуальный мониторинг роста и распространения опухоли и ответа на лекарственную терапию. Применение флуоресцирующих белков со спектром эмиссии в красно-оранжевой области позволяет увеличивать глубину визуализации сигнала в связи с минимизацией фонового сигнала и светорассеяния. Целью данной работы являлась разработка методики мониторинга флуоресцирующих опухолей лабораторных животных при помощи диффузионной флуоресцентной томографии (ДФТ). Флуоресцирующие опухолевые клеточные линии были получены при помощи плазмид, кодирующих биосинтез красных флуоресцирующих белков, путем липосомальной трасфекции исходных клеточных линий, с последующей селекцией и клонированием. Полученные линии были охарактеризованы в сравнении с исходными клеточными линиями. Были разработаны методики получения флуоресцирующих опухолей лабораторных животных (мышей линии Nu) путем инокуляции мышам флуоресцирующих клеток. При помощи разработанных в ИПФ РАН диффузных флуоресцентных томографов показана способность метода ДФТ детектировать флуоресцирующие клетки в организме животного и проводить прижизненный неинвазивный мониторинг развития флуоресцирующих опухолей. Публикации 1) I.V. Turchin, V.A. Kamensky, V.I. Plehanov, A.G. Orlova, M.S. Kleshnin, I.I. Fiks, M.V. Shirmanova, I.G. Meerovich, L.R. Arslanbaeva, V.V. Jerdeva, A.P. Savitsky. “Fluorescence diffuse tomography for detection of red fluorescent protein expressed tumors in small animals” Journal of Biomedical Optics V. 13 (4), 2008, pp. 41310-1-41310-10. Лаборатория биохимии фитоиммунитета МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ, ОБЛАДАЮЩИХ ДВОЙНЫМ ЭФФЕКТОМ – РЕГУЛЯЦИИ РОСТА И ИММУНИТЕТА РАСТЕНИЙ Н.Л.Буза*, Е.А.Буланцева*, А.С.Евсюнина*, А.А.Криницына*, Н.П.Кораблева*, Э.П.Ладыженская*, Т.А.Платонова*, М.А.Проценко*, А.О.Ружицкий*, А.С.Торопкина*, Н.Ф.Лагутина**, А.В.Амелин***, Г.А.Борзенкова***, В.И.Толубеева***, Е.А.Чекалин**, Нгуен Тьен Тханг**** *Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН ** Московское отделение Всесоюзного Института Растениеводства *** Орловский Государственный Аграрный Университет **** Институт тропической биологии ВАНТ, Вьетнам, Хошимин Цель работы заключалась в изучении механизмов действия физиологически активных эндогенных (фитогормоны) и синтетических соединений, участвующих в регуляции роста и иммунитета растени, а также в определении биологических параметров использования перспективных физиологически активных веществ нового поколения для разработки биотехнологии регуляции роста растений и их устойчивости к фитопатогенам. В 2008 – 2009 гг было показано, что: - мишенью действия стрессового фитогормона жасмоновой кислоты являются клетки стержневой меристемы апексов клубней картофеля, внутренняя мембранная система пластид и цитоплазматическая мембрана клеток; - жасмоновая кислота и синтетический биорегулятор мелафен влияют на активность Са +2 , Mg+2 АТФ-азы цитоплазматической мембраны. Действие мелафена зависит от присутствия стрессовых фитогормонов абсцизовой и жасмоновой кислот, а также от физиологического состояния органа (покой или рост); - под влиянием антиоксиданта астаксантина изменяется интенсивность образования фитогормона этилена, скорость созревания и старения плодов яблони и бананов. Ткани плодов на разных стадиях созревания отличаются по содержанию белкового ингибитора полигалактуроназы (БИПГ) – важного компонента системы защитных реакций клетки против фитопатогенов. Определено действие БИПГ на полигалактуроназу, выделенную из разных фитопатогенных микроорганизмов; - выявлены биологические параметры применения астаксантина на практике, которые будут использованы при разработке биотехнологии регуляции созревания, старения и иммунитета плодов яблони и банана при хранении; - показана перспективность использования биорегуляторов для положительной коррекции роста и развития трансгенных растений с встроенными генами дефензина и тауматина, повышающими устойчивость картофеля к фитопатогенным микрорганизмам, а также для повышения репродукционной способности современных морфогенотипов гороха. Публикации по теме доклада: 1. Проценко М.А., Буза Н.Л., Криницына А.А., Буланцева Е.А., Кораблева Н.П. // Биохимия, 2008, № 10, с.13171328. 2. Платонова Т.А., Ладыженская Э.П., Евсюнина А.С., Лагутина Н.Ф., Кораблева Н.П. // Прикладная биохимия и микробиология, 2008, т. 44, №4, с. 468-475. 3. Ладыженская Э.П., Кораблева Н.П. // Прикладная биохимия и микробиология, 2008, т. 44, № 6, с. 747-751. 4. Буланцева Е.А., Нгуен Тьен Тханг, Ружицкий А.О., Проценко М.А., Кораблева Н.П. // Прикладная биохимия и микробиология, 2009, том 45, № 1, с. 104 – 108. 5. Платонова Т.А., Евсюнина А.С., Кораблева Н.П. // Прикладная биохимия и микробиология, 2009, т. 45, № 3 , с. 354-360. 6. Ладыженская Э.П., Платонова Т.А., Евсюнина А.С., Кораблева Н.П. // Агрохимия, 2009, № 9, с. 32 – 37. 7. Платонова Т. А., Евсюнина А.С., Кораблева Н.П. // Агрохимия, 2009, № 7, с.44-47 8. Платонова Т.А., Ладыженская Э.П. Евсюнина А.С., Кораблева Н.П. // Агро XXI, 2009, № 10-12 , с. 46 – 48. 9. Амелин А.В., Кораблева Н.П., Проценко М.А., Борзенкова Г.А., Толубеева В.И., Чекалин Е.А. // Сборник «Вестник ОрелГАУ», 2008, №3 (12), стр. 11-14. 10. Панарина В.И., Амелин А.В., Кораблева Н.П., Проценко М.А. // Сборник «Вестник ОрелГАУ», 2009, № 6 (21) стр. 44–47. Сдано в печать: 1. Проценко М.А., Буланцева Е.А., Кораблева Н.П. Белковый ингибитор полигалактуроназы в сочных плодах растений при созревании и инфекциях. // Физиология растений. 2. Платонова Т. А., Ладыженская Э.П., Евсюнина Э.П., Кораблева Н.П. Действие мелафена на ростовые процессы в апикальных меристемах клубней картофеля // Сельскохозяйственная биология. 3. Ладыженская Э.П., Кораблева Н.П.. Действие мелафена на АТФ-зависимое накопление кальция в везикулах плазмалеммы из клеток клубней картофеля // Прикладная биохимия и микробиология. 4. Ладыженская Э.П., Кораблева Н.П. Взаимодействие регуляторов роста при контроле транспорта кальция через плазмалемму клеток клубней картофеля. // Прикладная биохимия и микробиология. 5. Платонова Т.А., Евсюнина А.С., Кораблева Н.П. Изучение пластидного аппарата клеток апикальных меристем клубней картофеля при регуляции ростовых процессов с помощью жасмоновой кислоты // Прикладная биохимия и микробиология. 6. Проценко М А., Буланцева Е.А., Нгуен Тьен Тханг, Кораблева. Н. П. Белковый ингибитор полигалактуроназы в сочных плодах растений. // Вестник Академии Наук и Технологий Вьетнама. Хошимин. Лаборатория биохимии фитоиммунитета ПОИСК НОВЫХ ЭЛИСИТОРОВ, ИНДУЦИРУЮЩИХ УСТОЙЧИВОСТЬ КАРТОФЕЛЯ К БОЛЕЗНЯМ И СТИМУЛИРУЮЩИХ РАНЕВУЮ РЕПАРАЦИЮ ЕГО КЛУБНЕЙ О.Л.Озерецковская*, А.А.Львова** Н.И.Васюкова*, Г.И.Чаленко*, Н.Г.Герасимова*, А.Н.Левов**, * Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН ** Центр «Биоинженерия» РАН Тип патогенна или стресса определяет характер активирования различных сигнальных систем растений для создания оптимального набора защитных механизмов. Известно, что салициловя кислота (СК) участвует в сигналинге устойчивости растений к биотрофным патогенам, к числу которых принадлежит возбудитель фитофтороза картофеля, однако ингибирует репарационную способность клубней залечивать механические поранения. Задачей настоящей работы явился поиск новых элиситоров на основе производных хитозана с салициловой кислотой или ее фрагментами, индуцирующих как устойчивость картофеля к возбудителю фитофтороза, так и стимулирование процессов раневой репарации его клубней. В соавторстве с сотрудниками Центра «Биоинженения» РАН синтезированы и испытаны на элиситорную активность 7 производных хитозана, из числа которых только N-(2гидрокси-3-метоксибензил)-N-пиридоксхитозан обладал двойным эффектом: защищал картофель от возбудителя фитофтороза, а также стимулировал залечивание механических поранений клубней существенно лучше, чем исходных хитозан. Проведенная работа делает целесообразным поиск новых элиситоров среди производных хитозана. Список опубликованных и сданных в печать статей: 1. Озерецковская О.Л.,Васюкова Н.И., Чаленко Г.И.,Герасимова Н.Г., Ревина Т.А., Валуева Т.А. Индуцирование элиситорами процесса раневой репарации клубней картофеля // Доклады РАН. 2008. Т. 423. 1. С. 129-132 2. Васюкова Н.И., Чаленко Г.И., Герасимова Н.Г., Валуева Т.А., Озерецковская О.Л. Активизация защитных свойств элиситоров с помощью системных сигнальных молекул при взаимодействии картофеля и возбудителя фитофтороза // Прикл. биохимия и микробиол. 2008. ТТ.44. №2. С. 336-340 3. Озерецковская О.Л.,Васюкова Н.И.,Герасимова Н.Г.,Чаленко Г.И., Львова А.А.,Левов А.Н., Ильина А.В., Варламов В.П., Тарчевский И.А. Индуцирование устойчивости картофеля производными хитозана. // Докл. РАН, 2009, т.427, №3, С.423-425. 4. Васюкова Н.И., Озерецковская О.Л. Жасмонат-зависимая защитная сигнализация в тканях растений. // Физиология растений. 2009, Т.56, №5, С.643-653. 5. Озерецковская О.Л., Васюкова Н.И., Чаленко Г.И., Герасимова Н.Г., Ревина Т.А.,Валуева Т.А. Процесс раневой репарации и индуцированная устойчивость клубней картофеля.// Прикл. биохимия и микробиол. 2009, Т.45, №2, С.220-224. 6. Васюкова Н.И., Зиновьева С.В., Удалова Ж.В., Герасимова Н.Г., Озерецковская О.Л., Сонин Н.Д. Жасмоновая кислота и устойчивость томатов к галловой нематоде. // Докл. РАН. 2009, Т.428, №3, С.420-422. 7. Васюкова Н.И., Озерецковская О.Л., Чаленко Г.И., Герасимова Н.Г., Львова А.А., Ильина А.В., Левов А.Н., Варламов В.П., Тарчевский И.А. Иммуномодулирующая активность производных хитозана с салициловой кислотой и ее фрагментами. // Прикл. биохимия и микробиол. 2009. . (принято к печати) 8. Чаленко Г.И., Герасимова Н.Г., Васюкова Н.И., Озерецковская О.Л., Коваленко Л.В., Фолманис Г.Э. Воздействие наночастиц металлов на процессы прорастания и репарации клубней картофеля. // Перспективные материалы. 2009. (принято к печати) Лаборатория эволюционной биохимии МОДЕЛИРОВАНИЕ АБИОГЕННОГО СИНТЕЗА АТФ Т.А.Телегина, М.П.Колесников, Ю.Л.Вечтомова, Т.А.Людникова, М.С.Крицкий Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва, Россия; Учитывая ключевую роль АТФ в метаболизме, моделирование синтеза этой молекулы составляет важнейшую задачу исследований происхождения и эволюции биосферы (Программа Президиума РАН № 15). В химическом (и биохимическом) отношении синтез АТФ состоит из двух основных этапов: (1) образование нуклеотида АМФ, и (2) его фосфорилирование до АТФ. В работе показано, что АМФ может абиогенно образовываться из соединений – предшественников этого соединения в клетке: глицина, глутамина, аспарагиновой кислоты, формиата, бикарбоната, фосфата и рибозы при температуре около 90о С. Для выяснения путей абиогенного синтеза АТФ разработаны модели, конвертирующие энергию фотонов в энергию макроэргических фосфоангидридных связей АТФ. Основная модель базируется на активности протеиноидных микросфер – продуктов термоконденсации смеси аминокислот. Модель конвертирует в АТФ до 35-40% исходного АДФ и проявляет субстратную специфичность. Было показано, что в составе этих микросфер содержатся абиогенные фотохимически активные пигменты. Проведена спектральная характеристика протеиноидных микросфер с целью идентификации химической природы пигментов, участвующих в фотофосфорилировании в качестве фотосенсибилизаторов. Определён спектр действия в видимой и УФ областях синтеза АТФ в протеиноидной модели. Спектр имеет два максимума активности около 450 и 375 нм и минимум около 400 нм, что согласуется со спектрами поглощения флавинов. Дополнительно выявлена фотофосфорилирующая активность в области поглощения 340 нм, которая, повидимому, связана с присутствием птеридиновых пигментов в составе протеиноидов. Преимущественное образование флавиновых или птеридиновых пигментов зависит от состава аминокислотных субстратов. Сравнительное изучение двух типов протеиноидов показало, что процесс фотофосфорилирования в модели сенсибилизируют как флавиновые, так и птеридиновые пигменты абиогенной природы. Таким образом, в условиях абиогенной среды могли образовываться достаточно сложные прототипы метаболической системы, способные к эффективному синтезу АТФ. Публикации 1. Kolesnikov M.P., Telegina T.A., Lyudnikova T.A., Kritsky M.S. Abiogenic photophosphoryation of ADP to ATP sensitized by flavoproteinoid microspheres // Origins of Life and Evolution of the Biosphere. 2008 V. 38. № 2. P. 243-255. Телегина Т.А., Колесников М.П., Вечтомова Ю.Л. Фотоактивируемые матрицы в процессах предбиологической эволюции. Химия высоких энергий, 2010, Т.44, № 2. Лаборатория молекулярных основ биотрансформаций СОЗДАНИЕ, КИНЕТИЧЕСКОЕ И СПЕКТРАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ «ХИМИЧЕСКИХ МУТАНТОВ» ЛАККАЗЫ, МОДИФИЦИРОВАННЫХ РУТЕНИЕВЫМИ КОМПЛЕКСАМИ Т.В. Федорова1, А.С. Вилесов1, С.А. Курзеев1,2, Е.В. Степанова1, Е.О. Ландесман1, О.В. Королева1, Е.А. Черкашин1, К.М. Поляков1,3, Б.В. Строкопытов3, Christian Bukh4, Morten J. Bjerrum4, Igor V. Kurnikov5, Alexander D. Ryabov5, Victor S. Lamzin6 1 Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова 3 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН 4 Department of Basic Sciences and Environment, University of Copenhagen, Denmark 5 Department of Chemistry, Carnegie Mellon University, Pennsylvania, USA 6 European Molecular Biology Laboratory (EMBL), Hamburg, Germany 2 Исследована реакционная способность лакказы из Coriolus hirsutus по отношению к ацидокомплексам RuII, в том числе цис-[RuCl2(LL)2], [RuCO3(LL)2], цис-[RuCO3-(bquin)2] (LL = 2,2'-бипиридин (bpy) и 1,10-фенантролин (phen); bquin = 2,2'-бихинолин), а также циклометаллированным производным комплексов RuII 2-фенилпиридина и 4-(2-толил)пиридина [Ru(o-C6H4-2-py)(phen)2]PF6 (1), [Ru(o-C6H3-p-R-2-py)(bpy)(MeCN)2]PF6 (2), и [Ru(o-C6H3-p-R-2-py)(phen)(MeCN)2]PF6 (3) (R = H (a), Me (b)). Как ацидокомплексы, так и циклометаллированные комплексы RuII легко окисляются в присутствии лакказы в соответствующие комплексы RuIII, однако существенно отличаются по своей реакционной способности и кинетика такого окисления описывается различными уравнениями. Предложен кинетический механизм реакции. Проведено математическое моделирование возможного взаимодействия между 2,2'-бипиридиновым аналогом комплекса 1 и молекулой лакказы методом Монте Карло симуляции с использованием решенной 3 D (pdb код 3fpx) из фермента лакказы из Coriolus hirsutus (= Trametes hirsuta). Проведена модификация лакказы, продуцируемой грибом Coriolus hirsutus рутениевыми комплексами [Ru(o-C6H4-2-py)(phen)(MeCN)2]PF6 и Ru(bpy)2CO3 в аэробных и анаэробных условиях. Количество координационно связанных комплексов на молекулу фермента не зависело от содержания кислорода в среде и составляло в случае [Ru(o-C6H4-2py)(phen)(MeCN)2]PF6 – 5 молекул, а Ru(bpy)2CO3 - 3 молекулы. Исследованы рН-профиль ферментативной активности, термостабильность, каталитические и биоэлектрокаталитические характеристики модифицированной лакказы. Показано, что при координационной модификации хотя бы одна молекула рутениевого комплекса координировалась вблизи активного центра Т1 лакказы и принимала непосредственное участие в катализе, увеличивая его эффективность. Kurzeev S.A., Vilesov A.S., Fedorova T.V., Stepanova E.V., Koroleva O.V., Bukh C., Bjerrum M.J., Kurnikov I.V., Ryabov A.D. Kinetic and Theoretical Comprehension of Diverse Rate Laws and Reactivity Gaps in Coriolus hirsutus Laccase-Catalyzed Oxidation of Acido and Cyclometalated RuII Complexes. Biochemistry, 2009, 48 (21), pp 4519–4527. Polyakov K.M., Fedorova T.V., Stepanova E.V., Cherkashin E.A., Kurzeev S.A., Strokopytov B.V., Lamzin V.S. and Koroleva O.V. Structure of native laccase from Trametes hirsuta at 1.8 A resolution. Acta Crystallographica Section D, V. 65, Part 6 (June 2009) P. 611-617. Федорова Т.В., Вилесов А.С., Курзеев С.А., Степанова Е.В., Ландесман Е.О., Королева О.В. Создание новой системы фермент–редокс-медиатор на основе грибной лакказы и координационных комплексов рутения. Прикладная биохимия и микробиология, 2006, т. 42, № 6, с. 629-637. Лаборатория биомедицинских исследований ПРОТЕОМНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ БЕЛКОВ ПРИ РАКЕ ПРОСТАТЫ И ФОРМИРОВАНИЕ МНОГОУРОВНЕВОЙ БАЗЫ ДАННЫХ «ПРОТЕОМИКА РАКА ПРОСТАТЫ 2009 С.С.Шишкин1, Л.И.Ковалёв1, М.А.Ковалёва1, Е.В.Герасимов1, Л.С.Ерёмина1, И.Н.Крахмалёва1, К.В.Лисицкая1, А.А.Макаров1, И.Ю.Торопыгин2, В.Е.Охриц3, О.Б.Лоран3, Н.К.Дзеранов4, А.А.Викторов1, Э.Г.Садыхов1, В.О.Попов1 1 Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва; НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН, Москва; 3 Российская медицинская академия постдипломного образования, Москва; 4 НИИ урологии Росздрава, Москва 2 В соответствии с общей стратегией протеомных исследований и с задачами, поставленными в Гос. контрактах 8/3-373-08 и 8/3-375-08 (Сроки исполнения: 09.200808.2009) проведено комплексное изучение белков тканей предстательной железы (ПЖ) человека, поиск биомаркеров рака ПЖ и сформирована многоуровневая база данных «Протеомика рака простаты 2009». Белки исследовали в биопсийных образцах и операционных материалах, полученных от больных со злокачественными (n=60) и доброкачественными (n=37) опухолями ПЖ, а также в культивируемых раковых клетках (LNCap, А-204) и в нормальных миобластах человека (контроль). Для изучения белков применяли комплекс протеомных технологий (двумерный электрофорез по О’Фарреллу, модификации NEPHGE, IEF, IGP, а также MALDI-TOF массспектрометрия и др.). Анализ изображений проводили с помощью программы MELANIE, а построение базы данных - с использованием программы MapThis! Molly Pinguin Software, пакета программного обеспечения Mozilla Firefox и других программных средств. Выполненные исследования обеспечили построение синтетических двумерных карт белков из образцов тканей ПЖ, культивируемых клеток LNCap, рабдомиосаркомы и нормальных миобластов человека, а также масс-спектрометрическую идентификацию 234 белков. Среди идентифицированных белков оказались 17 потенциальных белковых маркеров рака ПЖ, в частности Dj-1, представители белковых семейств аннексинов, S100 и некоторые другие белки, включая новые белки PRO2675 и PRO2044. На основе полученных результатов сформирована и размещена на сайте Института биохимии им. А.Н. Баха РАН многоуровневая компьютерная база данных «Протеомика рака простаты 2009», пригодная к дальнейшему расширению и использованию при разработках методов биохимической диагностики рака ПЖ. Публикации Глава в коллективной монографии: Shishkin S.S., Kovalev L.I., Krakhmaleva I.N., Kovaleva M.A., Eremina L.S., Popov V.O. Biomedical aspects in investigations of biochemical polymorphism of actins and some actin-binding proteins. In: “Molecular Polymorphism of Man: Structural and Functional Individual Multiformity of Biomacromolecules”. Ed. by S.D. Varfolomeev, G.E. Zaikov. 2010. (2 п.л.) Статьи в журналах: 1. Шишкин С.С., Дзеранов Н.К., Тотров К.И., Казаченко А.В., Ковалев Л.И., Еремина Л.С., Ковалева М.А., Торопыгин И.Ю. Клинико-биохимическое исследование диагностической значимости панели из 10 потенциальных белковых маркеров рака простаты. Урология, 2009, №1, 56-58. 2. Макаров А.А., Ковалев Л.И., Ковалева М.А., Торопыгин И.Ю., Шишкин С.С. Изучение изменений белкового профиля в дифференцирующихся миобластах человека. Онтогенез. 2009. т.39. №2. С.112-119 (Russian Journal of Developmental Biology, 2009, Vol. 39, No.2, pp. 83–89.) 3. Ковалева М.А., Ковалев Л.И., Еремина Л.С., Макаров А.А., Буракова М.В., Торопыгин И.Ю., Серебрякова М.В, Шишкин С.С., Арчаков А.И. Определение «аминокислотных конфликтов» и аминокислотных замен в первичных структурах 41 белка человека протеомными технологиями. Биомедицинская химия. 2008. т.54. №4. С420-434. Патент: 1. Ковалев Л.И., Шишкин С.С., Еремина Л.С., Ковалева М.А., Дзеранов Н.К., Казаченко А.В., Тотров К.И. Маркер рака предстательной железы. Патент на изобретение №2360924. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10 июля 2009г. Опубликовано: 10.07.2009, Бюл., №19. С.1-7 Информационно-методические письма: 1. Шишкин С.С., Ковалев Л.И., Ковалева М.А., Крахмалева И.Н., Еремина Л.С., Лисицкая К.В., Дзеранов Н.К., Ощепков В.Н., Кешишев Н.Г., Тотров К.И. Рак простаты и современные протеомнобиотехнологические подходы к его молекулярной диагностике. (Информационно-методическое письмо). М. Из-во ООО «Оригинальная компания (www.pechatay.ru) 2009. 1-36. 2. Шишкин С.С., Ковалев Л.И.. Ковалева М.А., Крахмалева И.Н., Еремина Л.С., Макаров А.А., Лисицкая К.В., Лоран О.Б. Велиев Е.И., Охриц В.Е. Проблемы ранней диагностики рака простаты и возможности применения новых потенциальных биомаркеров. (Информационно-методическое письмо). М. Из-во ООО «Оригинальная компания (www.pechatay.ru) 2009. 1-45 Лаборатория биохимии стрессов микроорганизмов В ПОИСКАХ НОВЫХ АНТИТУБЕРКУЛЕЗНЫХ СОЕДИНЕНИЙ Салина Е.Г.*, Демина Г.Р. *, Макаров В.А. *, Никитушкин В.Д. *, Рябова О.Б. *, Вострокнутова Г.Н. *, Шлеева М.О. *, Гончаренко А.В. *, Капрельянц А.С. *, Kana B.D.**, Gordhan B.G. **, Downing K.J. **, Mizrahi V. **, S. Cole*** * Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН ** *- MRC/NHLS/WITS Molecular Mycobacteriology Research Unit DST/NRF Centre of Excellence for Biomedical TB Research National Health Laboratory Service ,Johannesburg, South Africa *** EPFL, Lausanne, Zwitzerland В настоящее время остро ощущается недостаток современных лекарственных средств для лечения туберкулеза, поскольку все более широкое распространение получают резистентные к имеющимся лекарственным препаратам формы возбудителя туберкулеза. При этом совершенно отсутствуют специализированные лекарственные средства, направленные против латентной формы туберкулеза, которой инфицировано около 30% населения Земли. Поэтому вопрос поиска новых, ранее неиспользуемых мишеней в клетке M. tuberculosis является особенно актуальным. В лаборатории биохимии стрессов было найдено, что белки семейства Rpf, представляющие собой литические трансгликозилазы, являются важным фактором реактивации покоящихся форм ряда актинобактерий, и, в частности, бактерии M. tuberculosis, содержащей пять Rpf-подобных белков. С помощью мутагенеза методом аллельного обмена были созданы штаммы M. tuberculosis с четырьмя делетированными rpf-подобными генами. Характер роста таких штаммов in vitro не отличался от роста штамма дикого типа, однако клетки мутантных штаммов оказались неспособными к реактивации из покоящегося состояния. Кроме того, данные мутантные штаммы отличались низкой вирулентностью в модельных экспериментах in vivo на мышах. Следовательно, белки семейства Rpf представляют собой перспективную мишень для разработки новых антитуберкулезных препаратов. Был проведен скрининг соединений класса нитрофенилтиоцианатов (НФТ), подавляющих прорастание спор грибов и являющихся ингибиторами гидролаз клеточной стенки. Ряд этих соединений ингибировал ферментативную (пептилдогликангидролазную) активность рекомбинантного белка Rpf и подавлял рост бактерии M. luteus, содержащий единственный ген Rpf, существенный для роста. Кроме того, данные соединения снижали долю реактивировавшихся из состояния покоя клеток M. smegmatis и существенно увеличивали время реверсии покоящихся клеток M. tuberculosis в метаболически активное состояние. Было обнаружено, что другая группа низкомолекулярных химических соединений класса бензотиазинонов была эффективна против ряда микобактерий, в том числе M. tuberculosis, с действующей концентрацией 1 нг/мл. Мишенью для этих соединений в клетке является декапренилфосфорил-β-D-рибозо-2’-эпимераза, принимающая участие в синтезе арабинанов клеточной стенки. В настоящее время бензотиазиноны являются наиболее перспективными новыми соединениями антитуберкулезной направленности и в данной момент проводятся углубленные доклинические исследования 1. Bavesh D. Kana , Bhavna G. Gordhan, Katrina J. Downing, Nackmoon Sung, Galina Vostroktunova, Edith E. Machowski, Liana Tsenova, Michael Young, Arseny Kaprelyants, Gilla Kaplan, Valerie Mizrahi. The resuscitation-promoting factors of Mycobacterium tuberculosis are required for virulence and resuscitation from dormancy but are collectively dispensable for growth in vitro. Molecular Microbiology (2008), v.67, p.672-684. 2. Demina G.R., Makarov V.A., Nikitushkin, V.D., Ryabova O.B., Vostroknutova G.N., Salina E.G., Shleeva M.O., Goncharenko A.V., Kaprelyants A.S.. Finding of the Low Molecular Weight Inhibitors of Resuscitation Promoting Factor Enzymatic and Resuscitation Activity. (2009) PLOS ONE, 4(12):e8174. Лаборатория биотехнологии ферментов ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ ГЕТЕРОЛОГИЧНОЙ БЕТА-ГЛЮКОЗИДАЗЫ ГРИБА PENICILLIUM VERRUCULOSUM, СВОЙСТВА И ОСАХАРИВАЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ О.Г.Короткова1, М.В.Семенова1, В.В.Морозова2, И.Н.Зоров1,2, Л.М.Соколова3, Т.М.Бубнова3, О.Н.Окунев3, А.П.Синицын1,2 Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН МГУ им. М.В. Ломоносова ИБФМ РАН, Пущино Существующие продуценты целлюлаз (в первую очередь грибы рода Trichoderma) практически не синтезируют β-глюкозидазу (целлобиазу), что приводит к заметному увеличению (до 50% и выше) содержания целлобиозы в составе продуктов гидролиза целлюлозы. Кроме того, целлобиоза является ингибитором целлобиогидролаз, что негативно сказывается на результатах ферментативного гидролиза целлюлозосодержащего сырья. Поэтому повышение уровня экспрессии целевых белков, в частности β-глюкозидазу, является одной из основных задач при получении промышленных штаммов-продуцентов. Были выделены и изучены индивидуальные гомогенные β-глюкозидазы из ферментных препаратов грибов Penicillium verruculosum, Chrysosporium luchnowense, Trichoderma reesei, Aspergillus foetidis, Aspergillus niger. Было показано, что β-глюкозидазы грибов Penicillium, Chrysosporium и Trichoderma являются экзо-β-глюканазами, обладающими β-глюкозидазной активностью, а β-глюкозидазы Aspergillus представляют собой «истинные» целлобиазы и проявляют наибольшую удельную активность по отношению к целлобиозе, поэтому в качестве кандидата для клонирования нами была выбрана β-глюкозидаза гриба A. niger. На основе регуляторных участков гена целлобиогидролазы I гриба P.verruculosum методами генной инженерии был создан универсальный вектор pPrCBHI, позволяющий экспрессировать целевые гены в штамме-реципиенте P.verruculosum. Ген β-глюкозидазы A.niger был клонирован в вектор pPrCBHI. Скрининг клонов на целевую активность показал увеличение продукции β-глюкозидазы в 20-100 раз в зависимости от типа трансформантов по сравнению с исходным штаммом-реципиентом. Было показано, что применение ферментных препаратов с увеличенной β-глюкозидазной активностью совместно с целлюлазными препаратами T.reesei и P.verruculosum приводит к почти 3-х кратному увеличению выхода глюкозы при осахаривании природного сырья. Кроме того, для повышения количества секретируемого целевого белка была создана система экспрессии в P.verruculosum с использованием конститутативных гистоновых промоторов. Экспрессия целевого белка – глюкозидазы A.niger – увеличилась 2,5 раза, при этом собственный целлюлазный комплекс гриба P.verruculosum полностью сохранился. Применение ферментных препаратов, полученных с помощью рекомбинантного продуцента P.verruculosum с увеличенной продукцией β-глюкозидазы для осахаривания микрокристаллической целлюлозы и измельченной сосновой древесины обеспечивало увеличение выхода глюкозы на 20-30% по сравнению с ферментным препаратом на основе исходного штамма этого гриба. О.Г. Короткова, М.В. Семенова, В.В. Морозова, И.Н, Зоров, Л.М. Соколова, Т.М. Бубнова, О.Н.Окунев, А.П. Синицын «Выделение и свойства грибных β-глюкозидаз». Биохимия, 2009, том 74, вып.5, стр. 699-709 Синицын А.П., Окунев О.Н., Черноглазов В.М., Синицына О.А., Попов В.О. Штамм мицелиального гриба Penicillium verruculosum- продуцент комплекса целлюлаз, ксиланаз и ксилоглюканаз и способ получения ферментного препарата комплекса целлюлаз, ксиланаз и ксилоглюканаз для гидролиза целлюлозы и гемицеллюлозы. Патент RU2361918 (C1), Дата публикации 20.07.2009 Лаборатория фотобиохимии НАНОЧАСТИЦЫ СЕРЕБРА В R-ФИКОЭРИТРИНЕ, РАСТИТЕЛЬНОМ ПИГМЕНТЕ БЕЛКОВОЙ ПРИРОДЫ Бекасова О.Д.*, Бреховских А.А.*, Ревина А.А.**, Дубинчук В.Т.*** * Институт биохимии им.А.Н,Баха РАН ** Ин-т физической химии РАН, *** Институт Минерального сырья и природных ресурсов Металлические наночастицы малых размеров (до 10 нм), называемые квантовыми точками, проявляют новые физико-химические свойства, когда большинство атомов наночастицы образуют ее поверхность. Наночастицы Ag0 размером 3х6 нм с отклонением ±0,5х2 нм, получены и стабилизированы в водном растворе R-фикоэритрина. Обнаружено, что к характерным особенностям квантовых точек Ag0 в R-фикоэритрине относятся высокая интенсивность флуоресценции и положение основного максимума излучения при 575 нм. В связи с необычными флуоресцентными свойствами и использованием наночастиц серебра в современных технологиях, проведено сравнительное исследование оптических свойств наночастиц Ag0, локализованных в наноканалах R-фикоэритрина, методами конфокальной флуоресцентной микроскопии, абсорбционной и флуоресцентной спектроскопии в жидкой и твердой фазах. Показана зависимость оптических свойств наночастиц Ag0 от фазового состояния как на уровне отдельной наночастицы, так и при их большом скоплении. Обнаружены особенности в воздействии ультрафиолета на наночастицы Ag0 в деионизованной воде и в твердых тонких пленках на стеклах. Публикации: 1. Бекасова О.Д., Бреховских А.А., Ревина А.А., Дубинчук В.Т. Получение и оптические свойства наночастиц серебра в белковой матрице – R-фикоэритрине // Неорган. материалы. 2008. Т. 44. № 8. С. 947- 953. 2. О.Д. Бекасова, А.Л. Русанов. Динамика флуоресценции наночастицы серебра в молекуле R-фикоэритрина // Доклады РАН. 2010. Т.430. №2. С. 208-211. 3. О.Д. Бекасова. Оптические свойства наночастиц серебра в молекулах R-фикоэритрина в водных растворах и пленках // Неорган. материалы (в печати). Лаборатория химической энзимологии ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ МАТРИЧНЫЙ СИНТЕЗ ЭЛЕКТРОПРОВОДЯЩЕГО ПОЛИАНИЛИНА А.И.Ярополов, Шумакович Г.П., Морозова О.В., Стрельцов А.В., Васильева И.С., Шлеев С.В., Архарова Н.А.**, Клечковская В.В. **, Староверова И.Н.***, Будашов И.А.****, Курочкин И.Н.***** * Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН ** Институт кристаллографии им. А.В.Шубникова РАН *** Московская академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина **** Институт биохимической физики РАН им. Н.М.Эмануэля ***** Химический факультет МГУ им. М.В.Ломоносова Рассмотрены различные варианты ферментативного матричного синтеза электропроводящего полианилина (ПАНИ) в водных растворах анионного ПАВ и отрицательно заряженного полиэлектролита. В качестве катализатора окислительной полимеризации анилина была использована высоко редокс-потенциальная грибная лакказа. Фермент обладал высокой операционной стабильностью при кислых значениях рН реакционной среды, необходимых для получения ПАНИ линейного строения. Полученные образцы электропроводящего полианилина были характеризованы методами УФ-видимой спектроскопии, инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье, термогравиметрического анализа. Показана высокая термостабильность ферментативно синтезированных образцов ПАНИ и высокая электрохимическая активность полимера. Методами атомно-силовой и просвечивающей электронной микроскопии найдены различия в морфологии наночастиц ПАНИ, синтезированных с использованием ПАВ и анионного полиэлектролита. Изучены антистатические и антикоррозионные свойства полученных образцов ПАНИ. Проведено сравнение химического и ферментативного матричного синтеза полианилина и показано различие в механизмах ферментативной и химической полимеризации мономера. Рассмотрены вопросы практического использования электропроводящих полимеров. Список публикаций по теме: 1. Ярополов А.И., Васильева И.С., Морозова О.В., Шумакович Г.П., Шлеев С.В. «Способ получения водной дисперсии интерполимерного комплекса электропроводящего полианилина и полисульфокислот» // Патент № 2318020 БИ №6 от 27.02.2008 г. 2. А.В.Стрельцов, Г.П.Шумакович, О.В.Морозова, М.А.Горбачева, А.И.Ярополов «Мицеллярный синтез электропроводящего полианилина с участием лакказы» // Прикладная биохимия и микробиология, 2008, Т. 44, № 3, С. 638-644. 3. Alexander V. Streltsov, Olga V. Morozova, Nataliya A. Arkharova, Vera V. Klechkovskaya, Irina N. Staroverova, Galina P. Shumakovich, Alexander I. Yaropolov «Synthesis and characterization of conducting polyaniline prepared by laccase-catalyzed method in sodium dodecylbenzenesulfonate micellar solutions» // Journal of Applied Polymer Science, 2009, V. 114, P. 928-934. 4. Galina P. Shumakovich, Irina S. Vasil’eva, Olga V. Morozova, Irina N. Staroverova, Igor A. Budashov, Ilya N. Kurochkin, Alexander I. Yaropolov «Enzymatic synthesis of conducting polyaniline–poly(2-acrylamido-2-methyl-1-propansulfonic acid) composite using laccase: structure and properties» // Journal of Applied Polymer Science, 2010, (accepted for publication). Лаборатория иммунобиохимии ЗАКОНОМЕРНОСТИ ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА НА ПРИМЕРЕ СОЗДАНИЯ ЭКСПРЕССНЫХ ТЕСТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ В МОЛОКЕ Дзантиев Б.Б.*, Бызова Н.А.*, Зверева Е.А. *, Жердев А.В. *, Еремин С.А. *,**, Грачев О.В. ***, Горбовский А.Д. ***, Свешников П.Г. **** * Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН ** МГУ им. М.В.Ломоносова *** ООО «Фармаблок» **** ВНЦ Молекулярной диагностики и лечения Проведенные работы направлены на изучение иммунохимических взаимодействий в неравновесных гетерогенных системах и разработку на их основе методов экспрессной иммунодетекции низкомолекулярных соединений. Объекты исследования – антибиотики (хлорамфеникол, стрептомицин, бета-лактамные антибиотики) и специфичные к ним антитела. Синтезированы конъюгаты антигенов с белковыми носителями разного состава, а также конъюгаты специфических антител с наночастицами коллоидного золота, различающиеся по диаметру носителя и поверхностной плотности иммобилизуемых антител. Методами электронной микроскопии определены размерные характеристики коллоидных носителей. С использованием биосенсорной системы Biacore измерены равновесные и кинетические константы иммунохимических взаимодействий с участием конъюгатов коллоидного золота. Охарактеризована степень сохранения конъюгатами иммунохимических свойств при разных режимах иммобилизации, определены зависимости между составом конъюгатов и их аффинностью. С использованием рефлектометрической регистрации изучена динамика формирования иммунных комплексов на мембранных носителях, охарактеризованы факторы (pH, ионная сила, наличие и концентрация детергентов), влияющие на иммунохимические процессы. Предложены способы направленного действия на пороговые уровни различения положительных и отрицательных проб в конкурентных системах мембранного иммуноанализа, с их использованием проведена оптимизация протоколов иммунохроматографии. Показано, что разработанные тест-системы позволяют контролировать превышение пороговых уровней концентрации хлорамфеникола и бета-лактамных антибиотиков 10 нг/мл, а стрептомицина – 500 нг/мл, что соответствует установленным уровням их предельно допустимого содержания в пищевой продукции. Иммунохроматографические системы апробированы для контроля антибиотиков в молоке и кисломолочной продукции. Показана полнота выявления целевых антигенов при сохранении продолжительности анализа, равной 10 минутам, и высокая степень корреляции с традиционными аналитическими методами. Изготовлены экспериментальные образцы тест-систем, подготовлена технологическая документация для их серийного производства. Разработанные методы прошли официальные приемочные испытания во ВНИИ молочной промышленности, на основании которых оформлено свидетельство о метрологической аттестации тест-систем. Экспрессность и методическая простота позволяют рассматривать разработанные тест-системы как эффективное средство для контроля качества молока и молочных продуктов. Статьи и патенты по тематике работы: Дзантиев Б.Б., Бызова Н.А., Зверева Е.А. Жердев А.В., Еремин С.А., Грачев О.В., Горбовский А.Д., Свешников П.Г. Способ иммунохроматографического определения антибиотиков в молоке и молочных продуктах. – Заявка на патент РФ № 2009105439 от 18 февраля 2009 г. Byzova N.A., Zvereva E.A., Zherdev A.V., Eremin S.A., Dzantiev B.B. Rapid pretreatment-free immunochromatographic assay of chloramphenicol in milk. – Talanta. Принято в печать; опубликовано в электронной версии журнала (doi:10.1016/j.talanta.2010.01.025).
