ОТЗЫВ официального оппонента, доктора биологических наук Бершицкого Сергея Юрьевича

ОТЗЫВ
официального оппонента, доктора биологических наук Бершицкого Сергея Юрьевича
на диссертационную работу Вятчина Ильи Геннадьевича на тему:
«Механизм Са2+-регуляции тонких нитей запирательных мышц двустворчатых моллюсков
на примере мидии Crenomytilus grayanus»,
представленную на соискание учёной степени кандидата биологических наук
по специальности 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология.
Актуальность темы выполненной работы. Диссертационная работа И.Г. Вятчина
посвящена интересной проблеме – исследованию механизма кальциевой регуляции работы
запирательных мышц. С момента публикации в 1954 году в одном номере журнала Nature
двух статей (A. Huxley, R. Niedergerke и H. Huxley, J. Hanson), давших экспериментальную
основу сформулированной вскоре теории скользящих нитей – базовому механизму работы
мышц, интерес к проблеме мышечного сокращения и, в целом, к работе молекулярного
миозинового мотора не иссяк. За прошедшие годы были детально, до молекулярного
уровня, исследованы многие структуры сократительного аппарата мышц, цикл
преобразования энергии гидролиза АТФ в механическую работу, обеспечивающий
сокращение, и сам механизм генерации силы молекулой миозина. Однако, что касается
молекулярных механизмов регуляции взаимодействия миозина с актином, то этот вопрос
ещё далек от разрешения и внимание многих исследователей сегодня смещается именно в
эту сторону. Проблема состоит в том, что один и тот же механизм акто-миозиновго
взаимодействия работает не только в мышце и не только в скелетной, но также во всех
живых клетках и многих органах, осуществляя разные функции. Следовательно, регуляция
его работы должна соответствовать каждой конкретной функции, и это предполагает
множественность механизмов и способов регуляции. Функция запирательной мышцы
уникальна: в течение долгого времени она способна находиться в максимально
сокращённом состоянии, достигая при этом максимальной жёсткости. Это состояние
поддерживается без затрат энергии, то есть, фактически, соответствует ригору, но при этом
оно обратимо, и, следовательно, существует механизм, который может им управлять.
Работа И.Г. Вятчина, направлена на выяснение природы регуляции запирательных мышц
и, таким образом, её актуальность и современность не вызывают сомнений.
Новизна исследования, полученных результатов и выводов диссертации. По поводу
механизма регуляции функции запирательной мышцы двустворчатых моллюсков
существуют разные точки зрения: согласно одной из них регуляторный механизм
ассоциирован с толстой, миозиновой, нитью, по второй – с тонкой, актиновой. Есть также
мнение, что в регуляции могут участвовать оба механизма. Единого мнения на этот счёт до
сих пор нет.
В ходе работы по поиску возможного механизма регуляции диссертант выявил, что в
составе тонких нитей запирательной мышцы мидии имеется комплекс актин-связывающих
белков. Используя современные методы идентификации состава белков, включая
иммуноферментный анализ и масс-спектрометрию, он показал соответствие найденных
белков тропонину теплокровных, а затем доказал это совпадением их функциональных
свойств. В работе обнаружено, что регуляторные свойства тропомиозина мидии и его
1
взаимодействие с актином заметно отличаются от таковых в случае использования в
актомиозиновых моделях миозина кролика вместо миозина мидии.
Очень интересной находкой является обнаружение двукратного превышения количества
тропомиозина по отношению к тропонину. Все эти результаты являются безусловно
новыми, ранее никем не показанными, что и подтверждает новизну работы.
Диссертация И.Г. Вятчина довольно компактна. Она изложена на 117 страницах, содержит
17 рисунков и 1 таблицу. Диссертация состоит из общего введения, четырёх глав,
включающих обзор литературы, описание материалов и методов исследования, глав
результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы из
245 публикаций.
Обзор литературы. Диссертация предваряется обширным обзором литературы,
составляющим почти половину её объёма, а список обсуждаемых публикаций содержит 245
работ. Обзор состоит из 4 разделов, в которых изложены современные данные об основных
белках в составе толстых и тонких нитей сократительного аппарата запирательных мышц.
Рассматривается обширный материал о регуляции запирательных мышц, а также все
известные к настоящему времени теории механизма запирательного сокращения.
В целом, обзор литературы производит хорошее впечатление. Он написан ясным языком,
содержит ссылки на публикации последних лет, читается с интересом и наглядно
свидетельствует о том, что диссертант хорошо ориентируется в имеющейся литературе по
рассматриваемым вопросам. В тексте имеются мелкие неточности, которые, впрочем, не
влияют на понимание сути рассматриваемой тематики, но главное, обзор полностью
выполняет свою основную функцию – готовит читателя к последующему восприятию
результатов работы.
Во второй главе достаточно подробно описаны методы получения белков из мышц кролика
и мидии, анализа количественного содержания и выяснения первичной структуры белков
сократительного аппарата запирательной мышцы мидии. Изложена также методика
формирования актомиозиновых моделей, состоящих из мышечных белков разных
животных, и измерения их АТФазной активности.
Главы 3 и 4 диссертации представляют собой описание полученных результатов и их
обсуждение. Наиболее значимым результатом работы является обнаружение кальцийсвязывающих белков в составе тонких нитей запирательной мышцы моллюска и
идентификация их структуры и функциональных свойств как соответствующих
субъединицам тропонина теплокровных.
Весьма любопытными выглядят результаты по различию эффектов тропомиозинов мидии
и кролика на АТФазную активность актомиозина и зависимость ингибирующей
способности тропомиозина мидии от ионной силы. Эти результаты указывают на
существенные различия молекулярной структуры двух тропомиозинов и, соответственно,
разную аффинность к филаментарному актину. Мне кажется, было бы интересно
попытаться интерпретировать результаты с такой точки зрения, проверив это
экспериментально и, может быть, промоделировать взаимодействие кристаллической
структуры тропомиозина мидии, имеющейся в белковой базе PDB, с актиновой нитью с
помощью компьютерного молекулярного докинга или программ молекулярной динамики.
2
Интригующим, но экспериментально доказанным, выглядит результат о том, что
количество тропонина в запирательной мышце вдвое меньше количества тропомиозина,
что при этом не снижает его регуляторную способность.
И, конечно же, полученные в работе И.Г. Вятчина результаты являются аргументом в
пользу тропонин-тропомиозинового, или тонконитевого, механизма регуляции сокращения
запирательных мышц двустворчатых. То есть доказано, что этот механизм принципиально
такой же, как в скелетных мышцах позвоночных.
Диссертация
завершается
заключением,
экспериментальные подходы и результаты.
в
котором
кратко
резюмируются
Степень обоснованности научных положений, выводов и рекомендаций,
сформулированных в диссертации. Подводя итог, отмечаю, что рецензируемая
диссертационная работа представляет собой полноценное завершенное исследование,
раскрывающее один из механизмов регуляции сократительной функции мышц.
Выводы, сделанные в диссертации, логично следуют из результатов исследования и вполне
убедительно обоснованы. Основные материалы диссертации достаточно полно отражены в
двух статьях в международных научных журналах и доложены на одной российской
конференции и двух международных симпозиумах. Представленный автореферат
полностью соответствует содержанию диссертации.
При всех очевидных достоинствах диссертации, она не лишена некоторых недочетов.
Некоторое сожаление вызывает отсутствие в обзоре литературы иллюстраций, которые
могли бы помочь читателю в понимании материала, а в ряде случаев были бы полезны
самому автору при описании структурных элементов сократительного и регуляторного
аппаратов мышц. Актомиозиновые модели, состоящие из саркомерных белков разных
животных, автор называет «гибридными». Правильней, по-моему, было бы использовать
общепринятый для таких ситуаций термин «химерные», поскольку «гибридные» обычно
относится к генетическим конструкциям. Более детально, на мой взгляд, следовало бы
изложить вывод 3, раскрыв понятие уровня кальциевой регуляции. Представляется, что
развёрнутая формулировка вывода помогла бы лучшему его восприятию.
Кроме того, у меня есть несколько уточняющих вопросов к диссертанту:
1. На электрофореграмме белкового состава тонких нитей на рис. 2 (стр. 62) есть полоса,
названная «Тропомиозин, 50 кД». Что это за «тропомиозин», вес которого в полтора
раза больше тропомиозина? Вы это показали, но никак не обсуждаете.
2. Рис. 5 (стр. 66). Почему в присутствии Са2+ и тропомиозина актомиозиновая АТФаза
падает с ростом Ca2+-чувствительной фракции тонких нитей?
3. Почему Вы используете термин «природный» F-актин, а не просто F-актин? В чём
разница?
Однако, мелкие недочеты и вопросы, возникшие при ознакомлении с диссертацией, никоим
образом не снижают достоинств работы.
3
4